ES2295316T3 - Compuestos, metodos y composiciones utiles para el tratamiento de la infeccion por virus de la diarrea virica bovina (bvdv) e infeccion por virus de la hepatitis c (hcv). - Google Patents

Compuestos, metodos y composiciones utiles para el tratamiento de la infeccion por virus de la diarrea virica bovina (bvdv) e infeccion por virus de la hepatitis c (hcv). Download PDF

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Abstract

Compuesto según la Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo: en la que: X1 y X3 se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de O, S y NR9, en los que R9 es H o alquilo; X2 y X4 son, cada uno independientemente, CH o N; A se selecciona de entre el grupo que consiste de: R1, R2, R3 y R4 se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de los grupos H, alquilo, alcoxi, haluro, alquilhaluro, nitro y amino; R6 es H, alquilo o arilo; y R7 y R8 se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de H y alquilo.

Description

Compuestos, métodos y composiciones útiles para el tratamiento de la infección por virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) e infección por virus de la hepatitis C (HCV).
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica prioridad respecto a la solicitud provisional estadounidense nº 60/261.654, presentada el 13 de enero de 2001, la exposición de la cual se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad.
Declaración de apoyo gubernamental
La presente invención se llevó a cabo con apoyo gubernamental bajo los números de subvención K08 AI01728-01 y UOI-A133383 del National Institutes of Health. El gobierno de los Estados Unidos podría poseer determinados derechos en la presente invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al tratamiento de las infecciones por virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) y por virus de la hepatitis C (HCV).
Antecedentes de la invención
El virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) es un virus ARN con cubierta de una cadena de sentido positivo del género Pestivirus y de la familia Flaviviridae. Basándose en la presencia o ausencia de efecto citopático visible al infectar monocapas celulares susceptibles, se han identificado dos biotipos patogénicos de BVDV, denominadas citopáticas y no citopáticas (Perdrizet, J.A., en: B.P. Smith (editor), Large Animal Internal Medicine, primera edición (Mosby Press, St. Louis, 731-737, 1990). También se diferencia entre biotipos de BVDV (denominados biotipos I y II) basándose en determinadas secuencias de ARN vírico en la región 5' no traducida del genoma (Pellerin C. et al., Virology 203:260-268, 1994; J.F. Ridpath et al., Virology 205:66-74, 1994).
BVDV puede causar infección aguda en vacas, resultando en enfermedad respiratoria bovina, diarrea y pérdidas reproductivas severas. Los síntomas clínicos de la infección aguda por BVDV van desde la infección prácticamente indetectable a la infección severa. La infección de vacas y terneras puede resultar en problemas de fertilidad (por ejemplo periodos de celo irregulares), abortos, nacimientos prematuros o el nacimiento de terneros débiles o mal desarrollados). En algunos casos, puede producirse un daño temporal en el sistema inmunológico del animal, incluso cuando no resultan evidentes los síntomas clínicos. Además de la enfermedad causada por el virus mismo, los animales infectados son más susceptibles y resulta más probable que sufran otras enfermedades, tales como
neumonía.
Además de causar enfermedad aguda, BVDV también puede establecer infecciones persistentes (Potgieter, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11:501-520, 1995). Las infecciones persistentes por BVDV generalmente se establecen mediante infección in utero de un feto en desarrollo con un BVDV no citopático. Los animales resultantes nacen inmunotolerantes del BVDV particular por el que han sido infectados, y pueden liberar virus continuamente durante todo el periodo de vida del mismo. Aunque algunos animales infectados persistentemente muestran malformaciones congénitas debidas a la infección por BVDV, muchos animales persistentemente infectados por BVDV presentan una apariencia clínicamente normal (Baker, Rev. Sci. Tech. 9:25-41, 1990; Bielefeldt-Ohmann, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11:447-476, 1995). Los animales infectados persistentemente se cree que son los diseminadores principales de BVDV en la población vacuna.
Existen más de 140 vacunas contra BVDV disponibles comercialmente en los Estados Unidos (Bolin, Am. J. Vet. Res. 46:2476-2470, 1995). Por desgracia, la vacunación no proporciona una protección completa contra la infección por BVDV, debido a que algunas vacas vacunadas todavía resultan infectadas por el virus. En la actualidad, no existe cura conocida para la infección por BVDV. Por consiguiente, existe una necesidad de un tratamiento eficaz para la infección por BVDV.
La producción in vitro de embriones se ha convertido en una terapia útil para incrementar el rendimiento reproductor de animales y para tratar la infertilidad tanto de animales como de seres humanos. La producción in vitro de embriones bovinos podría permitir la transferencia mundial humana de material genético entre vacas limitando la transmisión de muchos patógenos. Sin embargo, los embriones bovinos producidos in vitro son vectores potenciales para la transmisión de BVDV (B. Avery et al., Vet. Rec. 132:660, 1993; A. Bielanski et al., Theriogenology 46:1467-1476, 1996; T. Tsuboi et al., Vet. Microbiol. 49:127-134, 1996; O. Zurovac et al., Theriogenology 41:841-853, 1994). Puede introducirse BVDV en el sistema de producción de embriones conjuntamente con gametos, suero, células somáticas, complejos de oocitos-cumulus (COCs), resultando en embriones o líneas celulares fertilizadas in vitro contaminadas (IVF) (K.V. Brock et al., J. Vet. Diagn. Invest. 3:99-100, 1991; C.R. Rossi et al., Am. J. Vet. Res. 41:1680-1681, 1980; P.J. Booth et al., J. Reprod. Fert. Abstr. Ser. Suppl. 9:28, 1992; M.D. Fray et al., Vet. Pathol. 35:253-259, 1998; R. Harasawa et al., Microbiol. Immunol. 39:979-985, 1995; T. Shin et al., Theriogenology 53:243, 2000). La asociación de BVDV no citopáticos con embriones de IVF transferidos puede causar la infección de receptores de embrión, la muerte embrionaria temprana, abortos o el nacimiento de progenie infectada persistentemente.
Existe un peligro análogo en la producción in vitro de embriones humanos. Se ha informado de la transmisión vírica a embriones humanos y a receptores de embrión a través del cultivo de embriones contaminados. La adición de un agente antivírico al medio de cultivo circundante a los embriones producidos in vitro podría impedir o reducir la transmisión de virus al embrión o al receptor de embrión (P.M. Grosheide et al., Vaccine 9:682-687, 1991; W.G. Quint et al., J. Clin. Microbiol. 32:1099-1100, 1994; H.C. van Os et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 165:152-159, 1991). Por consiguiente, un agente antivírico que pueda añadirse a sistemas de producción in vitro de embriones tanto animales como humanos podría presentar importantes aplicaciones.
La organización de la parte del genoma del BVDV que codifica las proteínas utilizadas en la replicación vírica es muy similar a la del virus de la hepatitis C humana (HCV), otro flavivirus (S.W. Behrens et al., J. Virol. 72:2364-2372, 1998). Se cree que más del 80% de los individuos infectados por HCV finalmente desarrollarán una forma crónica de la enfermedad. A medida que se desarrolla la enfermedad, resulta progresivamente dañado el hígado del sujeto infectado, con síntomas generalmente proporcionales a la cirrosis e insuficiencia hepática (por ejemplo ictericia, hinchazón abdominal y finalmente coma). El ciclo de enfermedad por infección hasta el daño hepático significativo puede tardar 20 años o más. La insuficiencia hepática debida a HCV en la actualidad es la causa principal de trasplantes de hígado en los Estados Unidos. Se sospecha que existen en la actualidad más de 5 millones de personas en los Estados Unidos que se encuentran infectadas por HCV, y quizás hasta 200 millones en todo el mundo, convirtiendo a la infección por HCV en una amenaza significativa para la salud pública.
No es seguro que resulte posible desarrollar una vacuna para la infección por HCV debido en parte a la elevada tasa de mutación del virus. El interferón recombinante alfa-2b (INTRON A®/Schering) ha demostrado ser efectivo en algunos casos de hepatitis C crónica. Sin embargo, se ha informado de que se produce la recaída en por lo menos la mitad de los respondedores tras interrumpir el tratamiento con interferón alfa-2b. Además, el interferón alfa-2b puede exacerbar el daño de los hepatocitos causado por la hepatitis activa crónica autoinmunológica (J.Y.N. Lau et al., Br. Med. J. 306:469-470, 1993). El análogo de nucleótido llamado ribavirina (VIRAZOLE®/ICN Pharmaceuticals) se ha demostrado que reduce las concentraciones de ARN vírico de la hepatitis C en un sujeto infectado, aunque a una tasa más lenta que el interferón alfa-2b. Al igual que con la infección por BVDV, existe una necesidad para un tratamiento efectivo para la infección por HCV.
N. Gelus et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, vol. 7, nº 6, 1997, páginas 1.089 a 1.096 da a conocer que los derivados difenilfurano biscatiónicos se han utilizado para investigar la unión de fármacos al ARN de TAR.
Además, existen publicaciones referidas a la utilización de compuestos difenilfurano tetracatiónicos (ver, por ejemplo, M. Zapp et al., Biochemistry, vol. 35, nº 42, 1996, páginas 13.689 a 13.696). Se dan a conocer derivados difenilfurano tetracatiónicos adicionales en E. de Clercq: Journal of Medicinal Chemistry, vol. 23, nº 7, 1980, páginas 787 a 795.
Sin embargo, no se da a conocer en las referencias anteriormente indicadas que los compuestos monocatiónicos (es decir, compuestos que presentan un solo sustituyente amidino o guanidino) podrían presentar una actividad antivírica in vivo. En particular, no se da a conocer que podría presentar una actividad contra el virus de la diarrea vírica bovina o contra cualquier otro elemento de la familia Flaviviridae de virus.
Descripción resumida de la invención
En vista de lo anteriormente expuesto, un aspecto de la invención se refiere a nuevos compuestos que resultan útiles en el tratamiento de elementos de la familia Flaviviridae de virus, tales como la infección por virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) y la infección por virus de la hepatitis C (HCV). Los compuestos de la presente invención presentarán la estructura según las fórmulas (I) y (II) siguiente:
1
en la que:
X_{1} y X_{3} se seleccionan independientemente, cada uno de ellos, de entre el grupo que consiste de O, S y NR_{9}, en la que R_{9} es H o alquilo;
X_{2} y X_{4} son, cada uno independientemente, CH o N;
A se selecciona de entre el grupo que consiste de:
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R_{1}, R_{2}, R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de H, grupos alquilo, alcoxi, haluro, alquilhaluro, nitro y amino.
R_{6} es H, alquilo o arilo; y
R_{7} y R_{8} se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de H y alquilo.
Entre los aspectos adicionales de la invención se incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto que presenta una estructura según las fórmulas (I) y (II) o una sal farmacéutica del mismo (es decir, un "compuesto activo"), en un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención resultan útiles en el tratamiento de infección por virus de enfermedad vírica bovina (BVDV) e infección por virus de la hepatitis C (HCV).
Determinados aspectos de la invención se refieren a la utilización de dichos compuestos para la preparación de un medicamento para tratar la infección por virus de la enfermedad vírica bovina (BVDV) en un sujeto que necesita dicho tratamiento.
Se describen adicionalmente procedimientos para tratar la infección por virus de la hepatitis C (HCV) en un sujeto que necesita dicho tratamiento. El procedimiento comprende administrar al sujeto un compuesto según las fórmulas (I) y (II) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en una cantidad efectiva para tratar la infección por virus de la hepatitis C (HCV).
Un aspecto adicional de la presente invención es la utilización de los compuestos activos descritos en la presente memoria para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infección por virus de la enfermedad vírica bovina (BVDV) en un sujeto que necesita de dicho tratamiento.
Lo anteriormente expuesto y otros aspectos de la presente invención se explican en detalle en la especificación proporcionada posteriormente.
Breve descripción de los dibujos
La fig. 1 ilustra cuatro esquemas químicos que resultan útiles en la síntesis de compuestos de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
A continuación, se describe la presente invención más completamente en lo sucesivo haciendo referencia a la especificación y dibujos adjuntos, en la que se muestran realizaciones preferentes de la invención. Sin embargo, la invención puede realizarse en muchas formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las realizaciones proporcionadas en la presente memoria. Por el contrario, estas realizaciones se proporcionan de manera que la presente exposición será exhaustiva y completa, y proporcionará completamente el alcance de la invención a los expertos en la materia.
La terminología utilizada en la descripción de la invención en la presente memoria es para el fin de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitativa de la invención. Tal como se utiliza en la descripción de la invención y reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" y "el" pretenden incluir también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A menos que se defina de otra manera, la totalidad e los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan el mismo significado entendido por un experto ordinario en la materia a la que pertenece la presente invención. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias citadas en la presente invención se incorporan como referencia en su totalidad.
Con respecto a los compuestos de las fórmulas (I) y (II) tal como se utilizan en la presente memoria, el término "alquilo" se refiere a cadenas hidrocarburo C_{1}-C_{10}, lineales, ramificadas o cíclicas, saturadas o insaturadas (es decir, alquenilo o alquinilo), incluyendo, por ejemplo, grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, octilo, etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, octenilo, butadienilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo, heptinilo y alenilo. El término "alquilo" incluye específicamente cadenas hidrocarburo cicloalquilo, que, tal como se utilizan en la presente invención, se refieren a grupos alquilo cíclico C_{3} a C_{6}, tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. En la presente invención, los alquilos preferentes son los alquilos inferiores. El término "alquilo inferior" se refiere a alquilo C_{1} a C_{4} lineal o ramificado, tal como metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, sec-butilo y terc-butilo.
El término "alquilo" también comprende alquilos sustituidos, que incluyen aminoalquilos, hidroalquilos, alquilos de oxígeno sustituido (es decir, grupos alcoxi) y alquilos sustituidos con halógenos (es decir, haluros de alquilo, polihaloalquilos). El término "aminoalquilo", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a alquilo C_{1} a C_{4} lineal o ramificado amino-sustituido, en el que el término "amino" se refiere al grupo NR'R'', y en el que R' y R'' se seleccionan independientemente de entre H o alquilo inferior tal como se ha definido anteriormente, es decir, -NH_{2}, -NHCH_{3}, -N(CH_{3})_{2}, etc. El término "alcoxi" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a alquilo C_{1} a C_{4} de oxígeno sustituido, es decir, -OCH_{3}. El término "alcoxi inferior", tal como se utiliza en la presente invención se refiere a alcoxi C_{1} a C_{4} lineal o ramificado, tal como metoxi, etoxi, propiloxi, butiloxi, isopropiloxi y t-butiloxi.
Los términos "halo" y "haluro" presentan su significado convencional y se refieren a los grupos fluoro, cloro, bromo y yodo. Entre los grupos halo preferentes se incluyen los grupos cloro, y entre los haluros de alquilo preferentes de la presente invención se incluyen CF_{3}. Los grupos "nitro", tal como se utilizan en la presente invención, presentan la estructura -NO_{2}.
El término "arilo" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a grupos aromáticos cíclicos C_{3} a C_{10}, tales como fenilo, naftilo y similares, e incluye específicamente grupos arilo sustituidos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, tolilo, fenilo sustituido y naftilo sustituido. Los grupos arilo pueden sustituirse con halo, amino, nitro y similares. Los anillos aromáticos heterocíclicos y los grupos aromáticos policíclicos también se encuentran incluidos en la presente definición de "arilo". Entre los ejemplos específicos de grupos arilo comprendidos en la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ciclopentadienilo, fenilo, furano, tiofeno, pirrol, pirano, piridina, imidazol, isotiazol, isoxazol, pirazol, pirazina, pirimidina y similares.
Los compuestos de la presente invención también resultan útiles en la forma de las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Entre dichas sales pueden incluirse, aunque sin limitarse a ellas, las sales gluconato, lactato, acetato, tartrato, citrato, fosfato, borato, nitrato, sulfato, hidrobromuro e hidroclórica de los compuestos. Se hace referencia a los compuestos de fórmulas (I) y (II) y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos como "compuestos activos" o "agentes activos".
Los compuestos representados por las fórmulas (I) y (II) pueden formarse mediante procedimientos sintéticos que se describen en los Ejemplos posteriormente, así como mediante determinados procedimientos conocidos de la técnica. Algunos de estos procedimientos conocidos se proporcionan posteriormente en los Ejemplos mediante descripción o referencia (la exposición de todos estos procedimientos se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad).
Se proporcionan ejemplos de compuestos útiles en la presente invención en la Tabla 1, posteriormente. En la Tabla 1, los grupos A son:
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TABLA 1 Compuestos seleccionados de la presente invención y compuestos adicionales 
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Las fórmulas de los compuestos proporcionados anteriormente son las siguientes:
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Tal como se ha indicado anteriormente, los compuestos, procedimientos y composiciones de la presente invención resultan útiles para tratar las infecciones por virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) y las infecciones por el virus de la hepatitis C (HCV). La expresión infección por virus de la diarrea vírica bovina se refiere a cualquier infección (por ejemplo aguda, latente o persistente) causada por un virus clasificado como virus de enfermedad vírica bovina (BVDV). Tal como se ha indicado anteriormente, BVDV es un virus ARN con cubierta de una cadena de sentido positivo del género Pestivirus y de la familia Flaviviridae. La expresión virus de enfermedad vírica bovina (BVDV), tal como se utiliza en la presente invención, abarca todas las cepas de BVDV y todos los serotipos y variantes del mismo, incluyendo las formas vivas, atenuadas, muertas o inactivadas de otra manera. El término BVDV incluye específicamente las cepas citopáticas y las cepas no citopáticas, y las cepas tanto de biotipo I como de biotipo II. La expresión "infección por virus de la hepatitis C (HCV)" incluye cualquier infección causada por el virus de la hepatitis C (HCV), que incluye todas las cepas, serotipos y variantes de HCV.
En una realización de la invención, se administra a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de fórmulas (I) a (VI), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Una cantidad "terapéuticamente eficaz" tal como se utiliza en la presente invención es una cantidad de un compuesto de fórmulas (I) a (VI) que resulta suficiente para aliviar (por ejemplo mitigar, disminuir, reducir) por lo menos uno de los síntomas asociados a la infección por BVDV o por HCV. No resulta necesario que la administración del compuesto elimine los síntomas de BVDV o de HCV, con la condición de que los beneficios de la administración del compuesto superen los perjuicios. De manera similar, los términos "tratar" y "tratamiento" con referencia a BVDV o HCV, tal como se utilizan en la presente invención, no pretenden referirse a que el sujeto aviar resulta necesariamente curado de BVDV o de HCV, o a que resultan eliminados todos los signos clínicos del mismo, sino únicamente que se consigue cierto alivio o mejora en la condición del sujeto al administrar el compuesto de fórmulas (I) a (VI).
Entre los sujetos adecuados de la presente invención se incluyen seres humanos y animales. En el caso de que el sujeto sea un animal, resultan preferentes los mamíferos, resultando particularmente preferentes los animales de granja (por ejemplo vacas, cerdos, ovejas, caballos) y primates (por ejemplo monos, simios). En realizaciones de la presente invención en las que se trata la BVD, resultan preferentes los sujetos bovinos (por ejemplo vacas, toros, terneros). En las realizaciones de la presente invención en las que se tratan las infecciones por HCV, los seres humanos son los sujetos preferentes. Los sujetos pueden ser adultos, adolescentes, juveniles, infantes o neonatos. En una realización de la invención, el sujeto es un embrión vivo y puede ser in utero o in vitro (en el caso de un embrión que se mantenga para la fertilización in vitro).
Pueden administrarse los compuestos y composiciones de la presente invención a los sujetos mediante cualquier medio adecuado. Son medios ejemplares la administración oral (por ejemplo en la forma de un líquido o sólido), la inyección intramuscular, la inyección subcutánea y la inyección intravenosa. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención comprenden compuestos activos de la invención en un portador farmacéuticamente aceptable. Entre las formulaciones farmacéuticas adecuadas se incluyen aquéllas adecuadas para la administración por inhalación, oral, rectal, tópica (incluyendo bucal, sublingual, dérmica, vaginal e intraocular), parenteral (incluyendo subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa e intraarticular) y transdérmica. La vía de administración más adecuadas en cualquier caso dado puede depender de la localización anatómica de la condición bajo tratamiento en el sujeto, de la naturaleza y severidad de la condición bajo tratamiento, y del compuesto activo particular que se está utilizando. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos de la técnica.
En los procedimientos de la presente invención en los que se lleva a cabo un tratamiento durante un procedimiento de fertilización in vitro (IVF), los compuestos pueden administrarse al embrión mediante la adición del compuesto activo, en una concentración adecuada, al medio en el que se obtiene el embrión.
En la preparación de un medicamento según la invención (la "formulación"), típicamente se mezclan compuestos activos o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos (los "compuestos activos") con, inter alia, un portador aceptable. El portador evidentemente debe ser aceptable en el sentido de ser compatible con cualquier otro ingrediente en la formulación y no debe resultar perjudicial para el paciente. El portador puede ser un sólido o un líquido, o ambos, y preferentemente se formula con el compuesto en forma de una formulación de dosis unitaria, por ejemplo una tableta, que puede contener entre 0,5% y 99% en peso de compuesto activo. Pueden incorporarse uno o más compuestos activos en las formulaciones de la invención, que pueden prepararse mediante cualquiera de las bien conocidas técnicas farmacéuticas, que consisten esencialmente de mezclar los componentes, opcionalmente incluyendo uno o más ingredientes terapéuticos accesorios.
Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden presentarse en unidades discretas, tales como cápsulas, cachets, pastillas o tabletas, conteniendo cada una cantidad predeterminada del compuesto activo; en forma de polvos o gránulos, de solución o de suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o en forma de una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite. Estas formulaciones pueden prepararse mediante cualquier procedimiento adecuado de farmacia, incluyendo la etapa de asociar el compuesto activo y un portador adecuado (que puede contener uno o más ingredientes accesorios, tal como se ha indicado anteriormente). En general, las formulaciones de la invención se preparan mezclando uniforme e íntimamente el compuesto activo con un portador líquido o sólido finamente dividido, o ambos, y después, si resulta necesario, conformando la mezcla resultante. Por ejemplo, puede prepararse una tableta mediante la compresión o moldeo de unos polvos o gránulos que contienen el compuesto activo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Pueden prepararse tabletas comprimidas mediante compresión, en una máquina adecuada, encontrándose el compuesto en una forma de flujo libre, tal como unos polvos o gránulos opcionalmente mezclador con un ligante, lubricante, diluyente inerte y/o agente o agentes activos en superficie/dispersantes. Pueden prepararse tabletas moldeadas mediante moldeo, en una máquina adecuada, humectando el compuesto en polvo con un ligante líquido inerte. Entre las formulaciones para la administración oral pueden incluirse opcionalmente recubrimientos entéricos conocidos de la técnica con el fin de evitar la degradación de la formulación en el estómago y proporcionar la liberación del fármaco en el intestino delgado.
Las formulaciones de la presente invención adecuadas para la administración parenteral comprenden soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas del compuesto activo, que preferentemente son isotónicas con la sangre del receptor pretendido. Estas preparaciones pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que provocan que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor pretendido. Entre las suspensiones estériles acuosas y no acuosas pueden incluirse agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes unidosis o multidosis, por ejemplo ampollas selladas y viales, y pueden almacenarse en un estado seco por congelación (liofilizado) que únicamente requiera la adición del portador líquido estéril, por ejemplo solución salina o agua para inyección inmediatamente antes de la utilización. Pueden prepararse soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas del tipo anteriormente descrito. Por ejemplo, en un aspecto de la presente invención se proporciona una composición estéril inyectable estable que comprende un compuesto de fórmula (I)-fórmula (VI), o una sal del mismo, en una forma de dosificación unitaria en un recipiente sellado. El compuesto o sal se proporciona en la forma de un liofilizado que resulta posible reconstituir con un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para formar una composición líquida adecuada para la inyección de la misma en un sujeto. La forma de dosificación unitaria típicamente comprende entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 10 gramos del compuesto o sal. Cuando el compuesto o sal es sustancialmente insoluble en agua, puede utilizarse una cantidad suficiente de agente emulsionante que sea fisiológicamente aceptable, en cantidad suficiente para emulsionar el compuesto o sal en un portador acuoso.
Además, la presente invención proporciona formulaciones liposómicas de los compuestos dados a conocer en la presente invención y sales de los mismos. La tecnología para formar suspensiones liposómicas es bien conocida de la técnica. En el caso de que el compuesto o sal del mismo sea una sal soluble en líquido acuoso, utilizando tecnología convencional de liposomas, dicho compuesto o sal del mismo puede incorporarse en vesículas lipídicas. En este caso, debido a la solubilidad e nagua del compuesto o sal, el compuesto o sal se combinará sustancialmente dentro del centro hidrofílico o núcleo de los liposomas. La capa de lípidos utilizada puede ser de cualquier composición convencional y puede contener colesterol o puede encontrarse libre de colesterol. En el caso de que el compuesto o sal de interés sea insoluble en agua, nuevamente utilizando tecnología convencional de formación de liposomas, la sal puede combinarse sustancialmente dentro de la capa lipídica hidrofóbica que forma la estructura del liposoma. En cualquiera de los dos casos, los liposomas que se producen pueden reducirse de tamaño, tal como mediante la utilización de técnicas estándares de sonicación y de homogeneización.
Evidentemente, las formulaciones liposómicas que contienen los compuestos farmacéuticamente activos identificados con los procedimientos descritos en la presente invención pueden liofilizarse para producir un liofilizado que puede reconstituirse con un portador farmacéuticamente aceptable, tal como agua, para regenerar una suspensión liposómica.
Además de los compuestos activos, las formulaciones farmacéuticas pueden contener otros aditivos, tales como aditivos de ajuste del pH. En particular, entre los agentes útiles de ajuste del pH se incluyen ácidos, tales como ácido hidroclórico; bases o tampones, tales como lactato sódico, acetato sódico, fosfato sódico, citrato sódico, borato sódico o gluconato sódico. Además, las composiciones pueden contener conservantes microbianos. Entre los conservantes microbianos se incluyen metilparabén, propilparabén y alcohol bencílico. El conservante microbiano típicamente se utiliza cuando la formulación se introduce en un vial diseñado para la utilización multidosis. Evidentemente, tal como se ha indicado, las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden liofilizarse utilizando técnicas bien conocidas de la técnica.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender compuestos de la presente invención en forma liofilizada. Alternativamente, las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender compuestos de la presente invención en un portador farmacéuticamente aceptable. Dichas formulaciones farmacéuticas generalmente se preparan mediante la mezcla de los compuestos indicados en la presente invención con un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables preferentemente son portadores líquidos, particularmente acuosos, la selección de los cuales es conocida de la técnica. Para el propósito de preparar dichas formulaciones, el compuesto puede mezclarse en una solución salina tamponada (por ejemplo de pH 6 a 8) o en medio de cultivo convencional. La formulación puede almacenarse en un recipiente de vidrio estéril sellado con un tapón de goma a través del cual pueden inyectarse líquidos y extraerse la formulación con una jeringa.
Con respecto a todos los procedimientos descritos en la presente invención, una dosis terapéuticamente eficaz de cualquier compuesto específico, la utilización del cual se encuentra comprendida dentro del alcance de la presente invención, puede variar en cierto grado de compuesto a compuesto y de sujeto a sujeto, y depende de la condición del sujeto y de la vía de administración. Puede utilizarse una dosis de entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal del sujeto, o de aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal del sujeto, o incluso de aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal del sujeto, para la inyección intravenosa o la administración oral.
La concentración del compuesto de la presente invención o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en una formulación de la presente invención puede ser determinada por un experto en la materia y varía de acuerdo con determinadas condiciones, incluyendo las características del sujeto bajo tratamiento (por ejemplo especie, edad y peso), la severidad y el tipo del virus infeccioso o la cepa contra la que se está vacunando el sujeto, la forma de dosificación que se utiliza, y similares.
Los compuestos de la presente invención pueden administrarse conjuntamente con otros compuestos antivíricos, tal como puede determinar el experto en la materia.
La presente invención se explica en más detalle en los Ejemplos siguientes. Estos ejemplos pretenden ser ilustrativos de la invención, y no deben interpretarse como limitativos de la misma.
Ejemplos 1 a 12
Síntesis de compuestos de la invención
En los Ejemplos siguientes, los números de compuesto (compuestos 2, 5, 5a, etc.) se refieren a compuestos con estructuras que se proporcionan en la fig. 1.
Ejemplo 1
Metodología general: síntesis y análisis químicos
Los puntos de fusión se determinaron con un aparato de punto de fusión capilar MEL-TEMP® 3.0 y no han sido corregidos. Los espectros de resonancia magnética nuclear de ^{1}H se registraron en un instrumento Varian Unity+300 o en un Varian VRX 400, con asignaciones de picos relativas a DMSO residual (2,49 ppm) o CHCl_{3} (7,24 ppm). Los espectros de masas se registraron en un espectrómetro VG Instruments 70-SE en el Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA. Los análisis elementales fueron llevados a cabo por Atlantic Microlab, Norcross, GA. Todos los compuestos finales se secaron in vacuo (bomba de aceite) a una temperatura de entre 50ºC y 60ºC durante por lo menos 36 horas previamente al análisis elemental. A menos que se indique lo contrario, todos los compuestos químicos reactivos y solventes (incluyendo los solventes anhidros) se obtuvieron de Aldrich Chemical Co., de Fisher Scientific o de Lancaster Synthesis, y se utilizaron tal como se recibieron. Se destilaron acetonitrilo (CaH_{2}), trietilamina (CaH_{2}) y etanol (Mg/I_{2}) del agente de secado indicado. Se prepararon 2,6-dimetil-4-nitrobromobenceno y S-(2-naftilmetil)trioacetimidato según la literatura (ver B.M. Wepster, Rec. Trav. Chim. 73:809-818, 1954; D.N. Kravtsov, J. Organometal. Chem. 36:227-237, 1972; B.G. Shearer et al., Tetrahedron Lett. 38:179-182, 1997).
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Ejemplo 2
(No según la invención)
Preparación de 2,5-bis(4-nitrofenil)furanos
Los procedimientos representativos siguientes son variaciones de un procedimiento general descrito previamente en A. Kumar et al., Heterocyclic Comm. 5:301-304, 1999.
2,5-bis(2-metil-4-nitrofenil)furano (compuesto 2b). A una solución de 2-bromo-5-nitrotolueno (4,32 g, 20 mmoles) y tetraquis(trifenilfosfina) paladio (0) (0,40 g), en 1,4-dioxano anhidro (50 ml), se añadió 2,5-bis(tri-n-butilestanil)furano (6,46 g, 10 mmoles) y la mezcla se calentó durante la noche bajo nitrógeno a una temperatura de entre 95ºC y 100ºC. La suspensión naranja resultante se diluyó con hexanos (15 ml), se enfrió hasta la temperatura ambiente, y se filtró, proporcionando, tras enjuagar con hexanos, un sólido naranja (3,10 g), p.f.: 241ºC a 243ºC. El producto se recristalizó a partir de DMF (100 ml), proporcionando un sólido esponjoso de color naranja brillante (2,87 g, 85%), p.f.: 242ºC a 243ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 2,69 (s, 6H), 7,31 (s, 2H), 8,12 (m, 4H), 8,23 (s, 2H), Anal. calculado para C_{18}H_{14}N_{2}O_{5} (338,31): C, H, N.
2,5-bis(4-nitrofenil)furano (compuesto 2a). Rendimiento: 88%; sólido esponjoso naranja; p.f.: 269ºC a 270ºC (no recristalizado), p.f. lit.: 270ºC a 272ºC, Ling, C. et al., J. Am. Chem. Soc. 116:8784-8792, 1994.
2,5-bis(2-metoxi-4-nitrofenil)furano (compuesto 2c). Rendimiento: 77%; sólido granular de color naranja brillante; p.f.: 308ºC a 310ºC (DMF). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 4,10 (s, 6H), 7,37 (s, 2H), 7,90 (s, 2H), 7,94 (d, 2H), 8,22 (d, 2H). Anal. calculado para C_{18}H_{14}N_{2}O_{7}\cdot0,1H_{2}O (372,11): C, H, N.
2,5-bis(2-cloro-4-nitrofenil)furano (compuesto 2d). Rendimiento: 71%; sólido esponjoso naranja; p.f.: 247ºC a 247,5ºC (DMF/MeOH). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 7,70 (s, 2H), 8,29 (dd, J=8,8, 2,2 Hz, 2H), 8,36 (d, J=8,8 Hz, 2H), 8,43 (d, J=2,2 Hz, 2H). Anal. calculado para C_{16}H_{8}Cl_{2}N_{2}O_{5} (379,15): C, H, N.
2,5-bis(4-nitro-2-trifluorometilfenil)furano (compuesto 2e). Rendimiento: 74%; espículas esponjosas doradas; p.f.: 158,5ºC a 159ºC (EtOH). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 7,8 (s, 2H), 8,24 (d, J=8,7 Hz, 2H), 8,57 (d, J=2,4 Hz, 2H), 8,62 (dd, J=8,6, 2,4 Hz, 2H). Anal. calculado para C_{18}H_{8}F_{6}N_{2}O_{5} (446,26): C, H, N.
2,3-bis(2,6-dimetil-4-nitrofenil)furano (compuesto 2f). Rendimiento: 65%; espículas amarillas; p.f.: 156,5ºC a 157,5ºC (DMF/E:OH/H_{2}O). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 2,34 (s, 12H), 6,85 (s, 2H), 8,04 (s, 4H). Anal. calculado para C_{20}H_{18}N_{3}O_{5} (366,36): C, H, N.
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Ejemplo 3
(No según la invención)
Preparación de 2,5-bis(4-aminofenil)furanos
Los procedimientos siguientes son representativos.
2,5-bis(4-amino-2-metilfenil)furano (compuesto 3b). A una suspensión del derivado bis nitro 2b (2,87 g) en EtOAc (90 ml) y EtOH seco (10 ml) se añadió Pd (al 10%)/C (0,40 g) y la mezcla se hidrogenó en un aparato Parr a una presión inicial de ~50 psi. Tras reducirse la incorporación de hidrógeno (generalmente tras 3 a 6 horas), la solución resultante se filtró sobre Celite y el filtrado amarillo pálido a incoloro se concentró in vacuo hasta prácticamente la sequedad, proporcionando, tras la dilución con hexanos, la diamina pura en forma de sólido amarillo pálido/verde (2,17 g, 91%), p.f.: 174ºC a 176ºC, que no requirió purificación. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 2,33 (s, 6H), 5,15 (br s, 4H), 6,42 (s, 2H), 6,46 (m, 4H), 7,35 (d, 2H). MS (EI): m/z 278 (M^{+}).
2,5-bis(4-aminofenil)furano (compuesto 3a). Rendimiento: 94%; sólido verde pálido/pardo; p.f.: 218ºC a 221ºC, p.f. lit^{46}: 213ºC a 216ºC. MS (EI): m/z 250 (M^{+}).
2,5-bis(4-amino-2-metoxifenil)furano (compuesto 3c). El aceite original se reconcentró con benceno, proporcionando un sólido amarillo/pardo que se trituró con éter. Rendimiento: 79%; p.f.: 201ºC a 202,5ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 3,80 (s, 6H), 5,25 (br s, 4H), 6,24 (dd, J=8,3, 2,0 Hz, 2H), 6,30 (d, J=1,9 Hz, 2H), 6,56 (s, 2H), 7,48 (d, J=8,4 Hz, 2H). MS (EI): m/z 310 (M^{+}).
2,5-bis(4-amino-2-trifluorometilfenil)furano (compuesto 3e). El aceite rojo original cristalizado a partir de EtOAc/
hexanos en dos etapas en forma de un sólido rojo/naranja. Rendimiento total: 81%; p.f. (etapa primera/principal): 89,5ºC a 91ºC; p.f. (segunda etapa): 91,5ºC a 92ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 5,79 (br s, 4H), 6,52 (s, 2H), 6,82 (dd, J=8,4, 2,4 Hz, 2H), 6,98 (d, J=2,2 Hz, 2H), 7,43 (d, J=8,4 Hz, 2H), MS (EI): m/z 383 (M^{+}).
2,5-bis(4-amino-2-clorofenil)furano (compuesto 3d). A una suspensión del derivado bis-nitro 2d correspondiente (1,22 g, 3,2 mmoles) en EtOH seco (100 ml) y DMSO (20 ml) se añadió SnCl_{2}\cdot2H_{2}O (5,80 g, 25,7 mmoles) y la mezcla se calentó bajo nitrógeno a 80ºC. Tras 4 a 5 horas, el TLC demostró que el material de partida se había consumido, y por lo tanto la mezcla se enfrió, se neutralizó con NaOH (aq.), y se extrajo con EtOAc. El extracto se lavó con agua, solución hipersalina, y después se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró. El aceite resultante se cristalizó a partir de benceno/hexano con concentración parcial, proporcionando un sólido de color marrón pálido (0,74 g, 71%), p.f.: 191,5ºC a 193ºC. No se investigó la hidrogenación catalítica. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 5,60 (br s, 4H), 6,61 (dd, J=8,6, 2,2 Hz, 2H), 6,68 (d, J=2,2 Hz, 2H), 6,82 (s, 2H), 7,56 (d, J=8,6 Hz, 2H). MS (EI): m/z 318 (M^{+}).
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Ejemplo 4
(No según la invención)
Preparación de derivados 2,5-bis(4-N,N'-di-BOC-guanidinofenil)furano
Los procedimientos siguientes son representativos.
2,5-bis(4-N,N'-di-BOC guanidinofenil)furano (compuesto 4a). A una solución a temperatura ambiente de 2,5-bis(4-aminofenil)furano (0,626 g, 2,5 mmoles) y 1,3-bis(terc-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudourea (1,56 g, 5,3 mmoles) en DMF anhidro se añadió trietilamina (1,59 g, 15,7 mmoles) seguido de cloruro de mercurio (II) (1,57 g, 5,8 mmoles) y la suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 22 horas. Tras diluir con CH_{2}Cl_{2} y solución de carbonato sódico, la suspensión se filtró sobre Celite y el filtrado se lavó bien con agua (3X) y finalmente con solución hipersalina. Tras secar (Na_{2}SO_{4}), el solvente se separó in vacuo y el residuo se diluyó con MeOH, proporcionando la bis-guanidina protegida con BOC en forma de un sólido amarillo pálido. El producto recogido se purificó mediante reprecipitación a partir de CH_{2}Cl_{2}/MeOH, proporcionando un sólido esponjoso amarillo (1,35 g, 68%), p.f. >400ºC dec. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 1,50 y 1,53 (2s, 36H), 6,65 (s, 2H), 7,66 (s, 8H), 10,38 (br s, 2H), 11,61 (br s, 2H).
2,5-bis(2-metil-4-N,N'-di-BOC guanidinofenil)furano (compuesto 4b). Sólido amarillo, p.f. >250ºC dec. Rendimiento: 62%. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 1,51 y 1,52 (2s, 36H), 2,53 (s, 6H), 6,60 (s, 2H), 7,40 (s, 2H), 7,62 (d, 2H), 7,74 (d, 2H), 10,34 (s, 2H), 11,62 (br s, 2H).
2,5-bis(2-metoxi-4-N,N'-di-BOC guanidinofenil)furano (compuesto 4c). Sólido amarillo, p.f. >300ºC dec. Rendimiento: 79%. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 1,50 y 1,53 (2s, 36H), 3,95 (s, 6H), 6,95 (s, 2H), 7,13 (d, 2H), 7,59 (s, 2H), 7,86 (d, 2H), 10,36 (s, 2H), 11,55 (br s, 2H).
2,5-bis(2-cloro-2-N,N'-di-BOC guanidinofenil)furano (compuesto 4d). Sólido amarillo pálido/pardo, p.f. >400ºC dec. Rendimiento: 63%. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 1,52 (s, 36H), 7,17 (s, 2H), 7,63 (dd, 2H), 7,79 (d, 2H), 7,88 (d, 2H), 10,43 (s, 2H), 11,59 (br s, 2H).
2,5-bis(2-trifluorometil-4-N,N'-di-BOC guanidinofenil)furano (compuesto 4e). Sólido naranja brillante. Rendimiento: 88%. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 1,51 y 1,53 (2s, 36H), 6,77 (s, 2H), 7,94 (s, 2H), 8,00 (d, 2H), 10,52 (s, 2H), 11,59 (br s, 2H).
2,5-bis(2,6-dimetil-4-N,N'-di-BOC guanidinofenil)furano (compuesto 4f). Sólido amarillo pálido/blanquecino, p.f. >300ºC dec. Rendimiento: 89%. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 1,51 y 1,53 (2s, 36H), 2,23 (s, 12H), 6,31 (s, 2H), 7,33 (s, 4H), 10,27 (s, 2H), 11,63 (br s, 2H).
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Ejemplo 5
Desprotección de N,N'-di-BOC guanidinas (no según la invención)
Los procedimientos siguientes son representativos, y se ilustran adicionalmente en la fig. 1.
Dihidrocloruro de 2,5-bis(4-guanidinofenil)furano (compuesto 5a). Una solución de la N,N'-diBOC guanidina correspondiente (1,19 g, 1,62 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (15 ml) se diluyó con EtOH seco (10 ml) y se saturó a temperatura de baño de agua helada con HCl anhidro. A continuación, la solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 a 3 días (tubo secador), con el producto en precipitación lenta (los tiempos de reacción más cortos generalmente proporcionaron una desprotección incompleta). La suspensión resultante se concentró hasta prácticamente la sequedad, introduciendo después el sólido en EtOH caliente. Tras filtrar para clarificar, la solución se concentró hasta prácticamente la sequedad, proporcionando una suspensión que se diluyó con éter y se recogió, rindiendo tras secar in vacuo a una temperatura de entre 50ºC y 60ºC durante 2 días, el dihidrocloruro de bis-guanidina en forma de un sólido blanquecino/pardo (0,66 g, cuantitativos), p.f. >300ºC dec. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 7,12 (s, 2H), 7,31 (d, 4H), 7,58 (br s, 8H), 7,86 (d, 4H), 10,09 (br s, 2H). MS (FAB, tioglicerol): m/z 335,3 (MH^{+}, 100). Anal. calculado para C_{18}H_{18}N_{6}O\cdot2HCl\cdot0,25EtOH (407,30): C, H, N.
Dihidrocloruro de 2,5-bis(4-guanidino-2-metilfenil)furano (compuesto 5b). Sólido pardo, p.f.: 265ºC a 271ºC dec. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 2,53 (s, 6H), 6,9 (s, 2H), 7,17 (m, 4H), 7,56 (br s, 8H), 7,82 (d, 2H), 10,06 (br s, 2H). MS (FAB, tioglicerol): m/z 363,3 (MH^{+}, 100). Anal. calculado para C_{20}H_{22}N_{6}O\cdot1,5H_{2}O\cdot0,66EtOH (496,93): C, H, N.
Dihidrocloruro de 2,5-bis(4-guanidino-2-metoxifenil)furano (compuesto 5c). Sólido marrón pálido. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 3,95 (s, 6H), 6,92 (dd, 2H), 6,99 (d, 2H), 7,02 (s, 2H), 7,58 (br s, 8H), 7,95 (d, 2H), 10,08 (br s, 2H). MS (EI): m/z 352 (M^{+} - NH_{2}CN, 38,0), 310 (100, 267 (38,9), 2s1 (8,8), 155 (18,7). Anal. calculado para C_{20}H_{22}N_{6}O_{3}\cdot2HCl\cdot1,0
H_{2}O\cdot0,33EtOH (500,57): C, H, N.
Dihidrocloruro de 2,5-bis(3-cloro-4-guanidinofenil)furano (compuesto 5d). Sólido pardo, p.f.: 300ºC a 304ºC dec. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 7,31 (s, 2H), 7,33 (d, 2H), 7,47 (s, 2H), 7,72 (br s, 8H), 8,04 (d, 2H). MS (DCl, amonio): m/z 365, 363, 361 (MH^{+}-NH_{2}CN, 8, 52, 78), 323, 321, 319 (11, 66, 100). Anal. calculado para C_{18}H_{16}Cl_{2}N_{6}O\cdot2HCl\cdot0,5H_{2}O (485,21): C, H, N, Cl.
Dihidrocloruro de 2,5-bis(4-guanidín-2-trifluorometilfenil)furano (compuesto 5e). Sólido naranja/rojo. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 6,99 (s, 2H), 7,63 (d, 2H), 7,69 (s, 2H), 7,79 (br s, 8H), 7,91 (d, 2H), 10,37 (br s, 2H). MS (Cl, isobutano): m/z 471 (MH^{+}, 14), 429 (100), 387 (19). Anal. calculado para C_{20}H_{16}F_{6}N_{6}O\cdot2HCl\cdot0,67EtOH (586,24): C, H, N.
Dihidrocloruro de 2,5-bis(4-guanidino-2,6-dimetilfenil)furano (compuesto 5f). Sólido blanquecino. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 2,20 (s, 12H), 6,56 (s, 2H), 7,01 (s, 4H), 7,57 (br s, 8H), 10,09 (br s, 2H). MS (FAB, tioglicerol): m/z 391,2 (MH^{+}, 100). Anal. calculado para C_{22}H_{26}N_{6}O\cdot2HCl\cdot0,5H_{2}O (472,41): C, H, N.
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Ejemplo 6
Preparación de 2-[5(6)-amidino-2-bencimidazoil]-5-(4-nitrofenil)furano
Una mezcla de 5-(4-nitrofenil)furfural (0,651 g, 0,003 moles), 4-amidino-1,2-fenilendiamina (0,614 g, 0,003 moles) y 1,4-benzoquinona (0,324 g, 0,003 moles) en 40 ml de etanol (bajo nitrógeno) se calentó bajo reflujo durante 8 horas. Se redujo el volumen de la mezcla de reacción a 20 ml bajo presión reducida, se enfrió, y el sólido resultante se recogió mediante filtración. El sólido se lavó con etanol frío y éter. El producto se secó, rindiendo la sal monohidrocloruro (0,8 g, 70%). La sal mono (0,65 g) se disolvió en 120 ml de etanol y se acidificó con etanol saturado en HCl y tras dejar reposar durante la noche en una nevera el sólido resultante se filtró, se lavó con éter y se secó durante 24 horas en un horno de vacío a 70ºC, rindiendo 0,6 g (85%), p.f.: 300ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 9,3 (br s, 2H), 9,09 (br s, 2H), 8,33 (d, J=7,6 Hz, H), 8,20 (d, J=7,6 Hz, 2H), 8,19 (s, 1H), 7,79 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,73 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,56 (d, J=3,6 Hz, 1H), 7,51 (d, J=3,6 Hz, 1H). RMN de ^{13}C (DMSO-d_{6}): 165,9, 152,6, 146,4, 145,4, 145,3, 141,6, 138,7, 134,7, 124,6, 124,0, 122,1, 121,5, 116,0, 114,6, 114,0, 111,9. FABMS m/e 348 (M^{+}+1). Anal. calculado para C_{18}H_{13}N_{5}O_{3}\cdot2HCl: C, 51,44; H, 3,59; N, 16,66. Observado: C, 51,24; H, 4,03; N, 16,92.
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Ejemplo 7
Preparación de 2-[5(6)-amidino-2-bencimidazoil]-5-(4-aminofenil)furano
El análogo nitro anteriormente indicado (0,5 g, 0,0013 moles) y 0,3 g de Pd al 10%/C en 130 ml de metanol se sometió a hidrogenación a 50 psi durante 4 horas. Se separó el catalizador mediante filtración sobre adyuvante de filtración y el solvente se separó bajo presión reducida. Se introdujo el sólido en HCl metanólico, se calentó en un baño de agua durante 0,5 horas y el solvente se eliminó bajo presión reducida. El residuo se trató con éter y el sólido se recogió mediante filtración y se secó bajo vacío a 75ºC durante 12 horas, rindiendo 0,44 g (73%), p.f.> 360ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}/D_{2}O): 8,07 (d, J=1,6 Hz, 1H), 7,74 (d, J=8,4 Hz, 2H), 7,66 (dd, J=1,6 y 8,4 Hz, 2H), 7,39 (d, J=3,6 Hz, 1H), 6,91 (d, J=3,6 Hz, 1H), 6,89 (d, J=8,4 Hz, 2H). RMN de ^{13}C (DMSO-d_{6}/D_{2}O): 166,2, 156,7, 145,8, 142,0, 141,0, 138,1, 126,2, 123,2, 122,3, 119,2, 116,6, 116,0, 115,1, 107,5. FABMS m/e 318 (M^{+}+1). Anal. calculado para C_{18}H_{15}N_{5}O\cdot3HCl\cdot2H_{2}O: C, 43,59; H, 6,09; N, 16,92. Observado: C, 43,71; H, 6,01; N, 16,81.
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Ejemplo 8
Preparación de 2-[5(6)-{2-imidazolinil}-2-bencimidazoil]-5-(4-nitrofenil)furano
Una mezcla de 5-(4-nitrofenil)furfural (0,434 g, 0,002 moles), hidrocloruro de 4-(2-imidazolinil)-1,2-fenilendiamina hidrato (0,461 g, 0,002 moles) y 1,4-benzoquinona (0,216 g, 0,002 moles) en 40 ml de etanol (bajo nitrógeno) se calentó bajo reflujo durante 8 horas. El volumen de la mezcla de reacción se redujo a 20 ml bajo presión reducida, se enfrió y el sólido resultante se recogió mediante filtración. El sólido se lavó con etanol frío y éter. El producto se secó, rindiendo 0,52 g (63%). El compuesto se disolvió en 200 ml de etanol y se acidificó con etanol saturado en HCl y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla se enfrió sobre hielo y el sólido se filtró, se lavó con éter y se secó durante 24 horas en un horno de vacío a 75ºC, rindiendo 0,51 g (90%), p.f.> 300ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}/D_{2}O): 8,31 (d, J=8,4 Hz, 2H), 8,30 (s, 1H), 8,15 (d, J=8,4 Hz, 2H), 7,81 (s, 2H), 7,52 (d, J=4,0 Hz, 1H), 7,46 (d, J=4,0 Hz, 1H), 4,03 (s, 4H). RMN de ^{13}C (DMSO-d_{6}/D_{2}O): 165,6, 153,1, 146,8, 145,7, 145,2, 134,7, 124,9, 124,2, 122,8, 116,9, 115,8, 115,1, 115,0, 112,1, 105,6, 104,7, 44,2. FABMS m/e 374 (M^{+}+1). Anal. calculado para C_{20}H_{15}N5O_{3}\cdot2HCl: C, 53,82; H, 3,88; N, 15,69. Observado: C, 53,94; H, 3,93; N, 15,84.
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Ejemplo 9
Preparación de 2-[5(6)-{2-imidazolinil}-2-bencimidazoil]-5-(4-aminofenil)furano
La sal mono-hidrocloruro del análogo nitro anteriormente indicado (0,5 g, 0,0013 moles) y 0,2 g de Pd al 10%/C en 130 ml de metanol se sometió a hidrogenación a 50 psi durante 4 horas. Se separó el catalizador mediante filtración sobre adyuvante de filtración, lavando con metanol caliente.
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Ejemplo 10
Preparación de 2-[5(6)-{N-isopropilamidino}-2-bencimidazoil]-5-(4-nitrofenil)furano
Una mezcla de 5-(4-nitrofenil)furfural (0,434 g, 0,002 moles), hidrocloruro de 4-N-isopropilamidino-1,2-fenilendiamina hidrato (0,493 g, 0,002 moles) y 1,4-benzoquinona (0,216 g, 0,002 moles) en 40 ml de etanol (bajo nitrógeno) se calentó bajo reflujo durante 6 horas. El volumen de la mezcla de reacción se redujo hasta aproximadamente 15 ml bajo presión reducida, la mezcla se enfrió y el sólido resultante se recogió mediante filtración, rindiendo la sal mono-hidrocloruro (0,66 g, 80%). La sal mono se disolvió en 100 ml de etanol y se acidificó con etanol saturado en HCl, y tras enfriar en un baño de hielo, el sólido resultante se filtró, se lavó con éter y se secó durante 24 horas en un horno de vacío a 75ºC, rindiendo 0,7 g (91%), p.f. >300ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}/D_{2}O): 8,26 (d, J=8,8 Hz, 2H), 8,11 (d, J=8,8 Hz, 2H), 8,01 (d, J=1,2 Hz, 1H), 7,77 (d, J=8,8 Hz, 1H), 7,59 (dd, J=1,2, 8,8 Hz, 1H), 7,50 (d, J=7,6 Hz, 1H), 7,42 (d, J=7,6 Hz, 1H), 4,04 (septeto, J=6,8 Hz, 1H), 1,3 (d, J=6,8 Hz, 6H). RMN de ^{13}C (DMSO-d_{6}): 162,7, 153,8, 147,2, 145,2, 144,8, 140,7, 138,2, 135,2, 125,4, 124,7, 124,0, 123,5, 116,3, 116,9, 115,3, 112,6, 45,6, 21,4. FABMS m/e 376 (M^{+}+1). Anal. calculado para C_{21}H_{19}N_{5}O_{3}\cdot2HCl\cdot2,0H_{2}O: C, 49,71; H, 5,16; N, 13,80. Observado: C, 49,65; H, 5,11; N, 13,50.
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Ejemplo 11
2-[5(6)-N-isopropilamidino-2-bencimidazoil]-5-(4-aminofenil)furano
La sal mono-hidrocloruro del análogo nitro anteriormente indicado (0,411 g, 0,001 moles) y 0,3 g de Pd al 10%/C en 120 ml de metanol se sometieron a hidrogenación a 50 psi durante 4 horas. Se separó el catalizador mediante filtración sobre adyuvante de filtración, lavando con metanol caliente. El volumen de solvente se redujo hasta aproximadamente la mitad bajo presión reducida. El matraz que contenía la solución se introdujo en un baño de hielo y se saturó con gas HCl. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas y se trató con éter seco y el sólido se recogió mediante filtración. El sólido se secó bajo vacío a 80ºC durante 24 horas, rindiendo 0,41 g (87%), p.f. >300ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}/D_{2}O): 8,04 (d, J=1,6 Hz, 1H), 7,91 (d, J=8,4 Hz, 2H), 7,80 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,64 (dd, J=1,6, 8,4 Hz, 1H), 7,60 (d, J=4,0 Hz, 1H), 7,24 (d, J=8,4 Hz, 2H), 7,14 (d, J=4,0 Hz, 1H), 4,05 (septeto, J=6,4 Hz, 1H), 1,3 (d, J=6,4 Hz, 6H). RMN de ^{13}C (DMSO-d_{6}): 162,4, 156,8, 144,4, 140,9, 138,8, 137,6, 135,0, 126,3, 125,4, 124,6, 124,1, 121,1, 118,0, 115,6, 114,9, 108,6, 45,6, 21,3. FABMS m/e 360 (M^{+}+1). Anal. calculado para C_{21}H_{21}N_{5}O_{3}\cdot3HCl: C, 53,80; H, 5,15; N, 14,93. Observado: C, 54,22; H, 4,75; N, 15,05.
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Ejemplo 12
(No según la invención)
2,5-bis(2-bencimidazolil-4-cianofenil)furano
Una mezcla de 5-[4-cianofenil]-2-furancarboxaldehído (1,97, 0,01 moles), 1,2-fenilendiamina (1,06 g, 0,01 moles) y 1,4-benzoquinona (1,08 g, 0,01 moles) en 50 ml de etanol seco se calentó bajo reflujo (bajo nitrógeno) durante 8 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se diluyó con éter y se filtró. El sólido se recogió y se agitó con una mezcla 1:3 de EtOH y éter durante 20 minutos y se filtró el sólido marrón amarillento, se lavó con éter y se secó en el vacío a 70ºC durante 12 horas, rindiendo 1,96 g (69%), p.f.: 227ºC a 228ºC dec., ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 8,06 (d, 2H, J=8,8 Hz), 7,91 (d, 2H, J=8,8 Hz), 7,60 (dd, 2H, J=3,2 Hz, J=6,4 Hz), 7,38 (d, 1H, J=3,6 Hz), 7,32 (d, 1H, J=3,6 Hz), 7,23 (dd, 2H, J=3,2 Hz, J=6,4 Hz). RMN de ^{13}C (DMSO-d_{6}): 152,1, 146,0, 142,7, 138,7, 133,2, 132,6, 124,1, 122,3, 118,4, 114,9, 112,5, 111,1, 109,8, MS: m/e 283 (M^{+}). Anal. calculado para C_{18}H_{11}N_{3}O: C, 73,79; H, 3,86; N, 14,73. Observado: C, 75,88; H, 3,77; N, 14,55.
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Dihidrocloruro de 2,5-bis[2-bencimidazolil-4-(amidino)fenil]fitrano
El compuesto ciano anteriormente indicado (2,85 g, 0,01 moles) en 60 ml de etanol se saturó con gas HCl seco a una temperatura comprendida entre 0ºC y 5ºC. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 días (realizando el seguimiento mediante IR y TLC). La mezcla se diluyó con éter y el hidrocloruro de éster de imidato amarillo se filtró, se lavó con éter y se secó al vacío durante 6 horas (3,73 g, 92%). El sólido se utilizó en la etapa siguiente sin purificación adicional. Una suspensión del hidrocloruro de éster de imidato (0,808 g, 0,002 moles) en 35 ml de etanol se saturó con gas amonio a una temperatura comprendida entre 0ºC y 5ºC y se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. El solvente se redujo a un tercio bajo presión reducida, se diluyó con éter y se filtró. El sólido amarillo se resuspendió en 10 ml de etanol y se trató con 4 ml de HCl etanólico saturado y se agitó a 35ºC durante 2 horas. Se eliminó el solvente bajo vacío y el residuo se trituró con éter, se filtró, se lavó con éter y se secó bajo vacío a 45ºC durante 24 horas, rindiendo 0,61 g (81%) de sólido amarillo, p.f. >280ºC dec. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}/D_{2}): 8,15 (d, 2H, J=8,7 Hz), 7,93 (d, 2H, J=8,7 Hz), 7,78 (d, 1H, J=3,6 Hz), 7,75 (dd, 2H, J=3 Hz, J=6,3 Hz), 7,50 (d, 1H, J=3,6 Hz), 7,49 (dd, 1H, J=3 Hz, J=6,3 Hz). RMN de ^{13}C (DMSO-d_{6}): 165,0, 155,9, 139,8, 133,4, 132,4, 129,3, 127,5, 126,3, 125,2, 119,5, 114,3, 112,0. FABMS: m/e 303 (M^{+}+1). Anal. calculado para: C_{18}H_{14}N_{4}O\cdot2HCl: C, 57,61; H, 4,29; N, 14,93. Observado: C, 57,45; H, 4,46; N, 14,64.
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Dihidrocloruro de 2,5-bis[2-bencimidazolil-4-(2-imidazolino)fenil]furano
Una mezcla del hidrocloruro de éster de imidato (0,808 g, 0,002 moles) anteriormente indicada, etilendiamina (0,12 g, 0,002 moles) en 20 ml de etanol seco se calentó bajo reflujo durante 12 horas. El volumen de solvente se redujo a 8 ml bajo presión reducida y se diluyó con éter. El sólido resultante se filtró y se secó. Este sólido se disolvió en 35 ml de etanol caliente y se saturó con gas HCl a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a 50ºC durante 2 horas y se concentró bajo presión reducida y se añadieron 30 ml de éter seco. La sal amarilla precipitado se filtró, se lavó con éter y se secó bajo vacío a 70ºC durante 24 horas, rindiendo 0,69 g (84%) de sólido amarillo, p.f. >300ºC dec. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}/D_{2}): 8,06 (d, 2H, J=8,7 Hz), 7,91 (d, 2H, J=8,7 Hz), 7,71 (dd, 2H, J=3 Hz, J=6 Hz), 7,64 (d, 1H, J=3,9 Hz), 7,47 (dd, 1H, J=3 Hz, J=6,3 Hz), 7,44 (d, 1H, J=3,9 Hz), 3,94 (s, 4H). RMN de ^{13}C (DMSO-d_{6}): 164,6, 155,7, 140,3, 140,1, 133,9, 132,9, 129,7, 126,7, 125,4, 122,1, 119,2, 114,6, 112,5, 44,8. FABMS: m/e 303 (M^{+}+1). Anal. calculado para: C_{20}H_{16}N_{4}O\cdot2HCl\cdot0,5H_{2}O: C, 58,54; H, 4,67; N, 13,65. Observado: C, 58,54; H, 4,67;
N, 13,66.
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Ejemplos 13 a 24
Propiedades anti-BVDV de los compuestos de la invención
Ejemplo 13
Cribado de compuestos antivíricos para actividad anti-BVDV
Se sembraron pocillos de 2,0 cm^{2} en una placa de 24 pocillos con 50 \mul de medio procedente de 12 ml de MEM-eq. (medio mínimo esencial (MEM) con sales de Earle suplementadas con suero equino al 10% (v/v), bicarbonato sódico (0,75 mg/ml), L-glutamina (0,29 mg/ml), penicilina G (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) y anfotericina B (0,25 \mug/ml)), que se derivó mediante tripsinización de una monocapa confluyente de células de riñón bovino de Madin-Barby (MDBK) en un matraz de 25 cm^{2}. Las células se incubaron a 38,5ºC con 5% de CO_{2} durante 24 horas. Se determinó el número medio de células por pocillo y posteriormente se utilizó este número para calcular las multiplicidades de infección (MOI) apropiadas de virus BVDV.
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Las células se inocularon con BVDV en medio que contenía compuestos antivíricos de ensayo (12,5 \muM, 200 \mul volumen total), de la manera siguiente:
dos pocillos no presentaban BVDV ni compuesto antivírico
un pocillo presentaba BVDV a 0,05 MOI, y no presentaba compuesto antivírico
un pocillo presentaba BVDV a 1,0 MOI, y no presentaba compuesto antivírico
diez pocillos presentaban BVDV a 0,05 MOI y 12,5 \muM de compuesto antivírico
diez pocillos presentaban BVDV a 1,0 MOI y 12,5 \muM de compuesto antivírico
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Las células inoculadas se incubaron durante hora a 38,5ºC con 5% de CO_{2} en aire humidificado. Se eliminó el medio de los pocillos y las células se lavaron una vez con PBS libre de Ca^{2+} y de Mg^{2+} que comprendía compuesto antivírico (12,5 \muM) (las células en los pocillos no tratadas inicialmente con compuestos antivíricos se lavaron sin compuesto antivírico). Se añadió un ml de MEM-eq. que comprendía compuesto antivírico (12,5 \muM) a pocillos tratados inicialmente con compuesto antivírico; aquellos no tratados con compuesto antivírico inicialmente no recibieron compuesto antivírico en esta etapa. Tres días después de la inoculación, se eliminó el medio y se almacenaron a -20ºC para el ensayo. Se añadió un ml de medio fresco que contenía 200 \mul en total (12,5 \muM) de compuesto antivírico a pocillos tratados inicialmente con compuesto antivírico; aquellos no tratados con compuesto antivírico no recibieron compuesto antivírico en esta etapa. Siete días después de la inoculación, se eliminó el medio y se almacenaron a -80ºC para la dilución seriada y ensayo.
Las células MDBK se resuspendieron en MEM-eq. sin compuesto antivírico. Se congelaron-descongelaron células tubales uterinas (UTC) y se almacenaron a -80ºC para el análisis. Los lisados UTC se diluyeron seriadamente con medio a partir del día 7 y se sometieron a ensayo con inmunoperoxidasa para la presencia de BVDV.
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Ejemplo 14
Ensayo de monocapa de inmunoperoxidasa para BVDV
Todas las muestras se sometieron a ensayo para BVDV utilizando el ensayo de monocapa de inmunoperoxidasa tal como se describe en A. Afshar et al., Can. J. Vet. Res. 55:91-93, 1991. Se sometieron a ensayo muestras por triplicado mediante la adición de 50 \mul de MEM-eq. que contenía aproximadamente 2,5 x 10^{3} células MDBK a 50 \mul de cada muestra suplementada con 50 \mul de MEM-eq. fresco en una placa de cultivo de 96 pocillos. Las placas se incubaron durante 72 horas a 38,5ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2} y aire antes de llevar a cabo la técnica de marcaje con inmunoperoxidasa, de la manera siguiente:
Tras la fijación, las células potencialmente infectadas se incubaron con anticuerpos monoclonales D89 (M.L. Vickers et al., J. Vet. Diagn. Invest. 2:300-302, 1990; Xue, W. et al., J. Clin. Microbiol. 28:1688-1693, 1990) específicos para E2/gp53, una glucoproteína de cubierta mayor de BVDV (Xue, W. et al., Vet. Microbiol. 57:105-118, 1997) y 20.10.6 específico para NS3-p80, una proteína no estructural conservada (W.V. Corapi et al., Am. J. Vet. Res. 51:1388-1394, 1990). Tras lavar con PBS y Tween 20 para eliminar los anticuerpos no unidos, se añadió IgG anti-ratón de conejo conjugado con peroxidasa (Jackson Immuno Research Lab., West Grove, PA). Tras un periodo de incubación corto, se eliminó el anticuerpo conjugado con peroxidasa no unido mediante lavado con PBS y Tween 20. Finalmente, se añadió el sustrato del enzima, aminoetil-carbazol (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA), que produce un color marrón rojizo cuando resulta oxidado por la peroxidasa de rábano picante. Se visualizó el cambio de color bajo microscopía óptica y se comparó con controles positivos y negativos conocidos en cada placa.
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Ejemplo 15
Pase de cultivo de tejido
Todas las muestras excepto las alícuotas del stock vírico también se pasaron en cultivo de tejido para optimizar el aislamiento del BVDV. Tras la descongelación inicial, se inocularon 200 \mul de cada muestra en un pocillo de 2 cm^{2} sembrado 24 horas antes con células MDBK. Los pases de cultivo se incubaron durante 5 días (d) a 38,5ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2} y aire humidificado. Los pases de cultivo se congelaron a -80ºC para el almacenamiento de los mismos. Se descongelaron muestras de pase de cultivo de tejidos y se sometieron a ensayo para el aislamiento de virus en caso de no conseguir el aislamiento del BVDV de la muestra original. Se informaba que las muestras se encontraban libres de BVDV según el aislamiento de virus únicamente si no se detectaba virus en ninguno de dos pases seriados.
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Ejemplo 16
Ensayo de reacción en cadena de la polimerasa anidada de transcripción inversa (RT-nPCR)
Se llevó a cabo un ensayo de reacción en cadena de polimerasa anidada de transcripción inversa para detectar BVDV en todas las muestras excepto alícuotas de virus madre. Tras la descongelación inicial, se aisló ARN de las muestras utilizando el mini kit QLAamp® de ARN vírico (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se almacenaron muestras de ARN a -80ºC hasta la realización de la RT-nPCR.
Todas las etapas de producción y amplificación de ADN complementario (ADNc) se llevaron a cabo en una sola reacción de tubo cerrado utilizando una modificación del protocolo de McGoldrick et al. (ver Duffell, S.J. et al., Vet. Rec. 117:240-245, 1985; Givens, M.D. et al., Theriogenology 54:1093-1107, 2000; Lang-Ree, J.R. et al., Vet. Rec. 135:412-413, 1994). En la primera etapa, se utilizaron 5 \mul de trehalosa (solución madre al 22% p/v; Sigma, St. Louis, MO, nº de cat. T5251) para almacenar y mantener la mezcla siguiente en la tapa de un tubo de 200 \mul de paredes delgadas, 0,4 \mul de cada cebador interno BVD 180 y HCV 368 (50 \muM), 1 \mul de dNTPs (10 mM) y 0,25 \mul de polimerasa Taq (1,25 U, Progema, Madison, WI). Los tubos se dejaron secar durante 2 horas a temperatura ambiente previamente al almacenamiento de los mismos.
En la segunda etapa, se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa inicial en el fondo de los tubos que contenían la mezcla de trehalosa seca dentro de la tapa. Se añadieron dos \mul de ARN a través del aceite mineral superpuesto (50 \mul) al volumen de reacción inicial (48 \mul) que contenía los reactivos siguientes (Promega): 5 \mul de tampón Iox, 8 \mul de MgCl_{2} (25 mM), 2 \mul de dNTPs (10 mM), 1 \mul de cada cebador externo BVD 100 y HCV 368 (5 \muM), 1 \mul de Triton X-100 (solución madre al 10%), 0,25 \mul de ditiotreitol (100 mM), 0,25 \mul (10 U) de ARNsin, 0,5 \mul (2,5 U) de polimerasa Taq y 0,5 \mul (100 U) de transcriptasa inversa del MMLV (virus Moloney de la leucemia murina). A continuación, los tubos se sometieron a los parámetros de ciclo siguientes: 37ºC durante 45 minutos, 95ºC durante 5 minutos y después 20 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto.
Una etapa final de alargamiento de 72ºC durante 10 minutos completó la reacción inicial de amplificación. En la tercera etapa, los tubos se invirtieron varias veces para mezclar las muestras en la tapa y en la base con el fin de iniciar la reacción en cadena de la polimerasa anidada (nPCR). A continuación, los tubos se centrifugaron a 14.000xg durante 12 segundos antes de devolverlas al termociclador para la nPCR, utilizando 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 45 segundos. Una etapa final de alargamiento de 72ºC durante 10 minutos completó el procedimiento de amplificación previamente al mantenimiento de las reacciones a 4ºC. Se separaron alícuotas de cinco microlitros de los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Los geles de agarosa contenían 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio para permitir la visualización de los productos de RT-nPCR utilizando un transiluminador de ultravioleta.
Los cebadores externos, BVD 100 (5'-GGCTAGCCATGCCCTTAG-3') (SEC ID nº 1) y HCV 368 (5'-CCATGTG
CCATGTACAG-3') (SEC ID nº 2) amplificaron una secuencia de 290 pares de bases de la región 5' no traducida del genoma vírico. Los cebadores internos, BVD 180 (5'-CCTGAGTACAGGGDAGTCGTCA-3') (SEC ID nº 3) y HCV 368 amplificaron una secuencia de 213 pares de bases dentro del primer amplicón. El nuevo cebador BVD 180 era degenerado en la base decimocuarta (D=G+A+T) para permitir diferencias dentro de las secuencias 5' no traducidas de las cepas víricas utilizadas en la presente investigación, según se determinó mediante secuenciación automatizada de nucleótidos de terminadores pigmentos (Nucleic Acid Resource Facility, Auburn University, AL) de los productos de PCR iniciales procedentes de los stocks víricos.
Ejemplo 17
Recolección y maduración de oocitos
Se recogieron ovarios de vaca de un matadero en Omaha, Nebraska, y se introdujeron en PBS para el transporte a un laboratorio cercano. Se aspiró el contenido de los folículos de 1 a 10 mm a una tasa de vacío de 21,5 ml/minuto y se vertieron sobre un filtro de 70 \mum. Se enjuagaron los componentes celulares del aspirado folicular agrupado con TL-HEPES y se buscaron los oocitos que se encontraban rodeados de múltiples capas de células cumulus densas. Los complejos de cumulus-oocito (COCs) utilizables se lavaron dos veces más en TL-HEPES, después se introdujeron en 7,5 ml de medio de maduración que había sido previamente equilibrado a 38,5ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2} y aire humidificado. A continuación, se selló el medio de maduración y se mantuvo a 38,5ºC durante 20 a 22 horas durante el transporte hasta el laboratorio experimental.
Ejemplo 18
Medio para los ensayos de fertilización in vitro/embriones
Se maduraron oocitos en medio de cultivo celular 199 (CCM 199) con sales de Earle (GIBCO-BRL, Gran Island, NY, USA) suplementadas con suero de feto bovino inactivado por calor al 10% (v/v) (FBS; HyClone Lab., Inc., Logan, UT, USA), piruvato sódico (11 \mug/ml), FSH bovino (0,01 U/ml), LH bovino (0,01 U/ml), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml).
Se fertilizaron oocitos madurados en medio CR2 (C.F. Rosenkrans et al., Theriogenology 35:266, 1991) suplementado con BSA (6 mg/ml), heparina (10 \mug/ml), penicilamina (0,3 \mug/ml), hipotaurina (0,2 \mug/ml), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml).
Los primeros tres días (d) de cultivo in vitro (IVC) se llevaron a cabo en medio CR2 suplementado con BSA (6 mg/ml), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml). Los últimos cuatro d de IVC se llevaron a cabo en medio CR2 suplementado con FBS al 10% (v/v), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml).
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Ejemplo 19
Exposición al virus de la diarrea vírica bovina (BVDV)
Tras la maduración in vitro (IVM), se lavaron COCs 5 veces en 3 ml de MEM-eq. Tras el lavado, los COCs se expusieron a una cepa no citopática de BVDV en 3 ml de MEM-eq. o se mantuvieron separadamente como controles negativos en MEM-eq. libre de BVDV. Los COCs expuestos y no expuestos se incubaron durante 1 hora a 38,5ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2} y aire humidificado, y después se lavaron 3 veces en 3 ml de TL-HEPES antes de la adición de gotas IVF.
Las cepas no citopáticas de BVDV utilizadas en la presente investigación incluían 2 cepas diferentes de Genotipo I (SD-1 y NY-1) y 2 cepas diferentes de Genotipo II (CD-87 y PA-131) (Givens MD et al., Theriogenology 54:1093-1107, 2000). Todos los stocks se propagaron en células MDBK libres de BVDV cultivadas en MEM-eq. Se recolectaron los virus mediante congelación y descongelación y se almacenaron en viales criogénicos a -80ºC hasta la utilización de los mismos.
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Ejemplo 20
Fertilización in vitro
Se introdujeron COCs maduros en gotas de 42 \mul de medio de fertilización bajo aceite mineral. Para la fertilización se utilizó semen bovino conservado criogénicamente procedente de una sola recolección. Se confirmó que este semen se encontraba libre de BVDV mediante aislamiento de virus y RT-nPCR. Tras la separación en gradiente PERCOLL® (45% a 90%), se añadieron 1,5 x 10^{5} espermatozoos a cada gota de fertilización, que se incubaron durante aproximadamente 18 horas a 38,5ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2} y aire.
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Ejemplo 21
Cultivo in vitro
Tras el periodo IVF, se separaron los cigotos presuntivos, se lavaron 4 veces en TL-HEPES, se equilibraron en medio IVC con BSA, y se introdujeron con células de cumulus todavía unidas, en gotas de 30 \mul (10 a 12 por gota) del medio IVC con BSA bajo aceite mineral. Las placas IVC se incubaron durante 3 d a 38,5ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2} y aire. Tras los primeros 3 d en IVC, los embriones se lavaron 3 veces en TL-HEPES, y la mayoría de las células de cumulus se separaron mediante aspiración lenta por una pipeta estéril. Los embriones prácticamente desnudos se examinaron para división, y aquellos en el estadio de 5 o más células se lavaron 1 vez más en medio IVC y se introdujeron con trozos de cumulus desprendido en gotas de 60 \mul (20 a 25 por gota) del medio IVC con FBS al 10% (v/v) bajo aceite mineral. Estos embriones desarrollados se incubaron 4 d adicionales. Tras los 4 d finales en IVC, los embriones se transfirieron a 3 ml de MEM-eq., se separaron de células de cumulus, y se observó el desarrollo hasta el estadio de mórula o de blastocito.
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Ejemplo 22
Lavado y tratamiento con tripsina de los embriones
El lavado y tratamiento con tripsina de embriones de día 7 se realizó de acuerdo a procedimientos recomendados por la International Embryo Transfer Society para el tratamiento de embriones bovinos derivados in vivo (Stringfellow DA et al., Manual of the International Embryo Transfer Society, 3a edición, Savoy IL: International Embryo Transfer Society 1998; 79-84). Los embriones de día 7 degenerados y desarrollados se lavaron 12 veces en 1 ml de MEM-eq. en pocillos de 2 cm^{2}.
Para el tratamiento con tripsina, se utilizaron doce lavados de 3 ml en placas de Petri de 35 mm. Los primeros 5 y los últimos 5 lavados se realizaron con PBS suplementado con BSA al 0,4%, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml). El sexto y séptimo lavados se realizaron con tripsina diluida 1:250 en 3 ml de solución salina equilibrada de Hank sin Ca^{2+} ni Mg^{2+}. Los embriones se trataron en tripsina durante aproximadamente 90 segundos (45 segundos/lavado) antes de seguir con los últimos 5 lavados.
Ejemplo 23
Muestras sometidas a ensayo para BVDV
Durante cada una de las réplicas de las 12 réplicas de investigación (3 réplicas con 4 cepas diferentes de BVDV), se expusieron 140 a 180 COCs a virus, mientras que 50 a 80 COCs se mantuvieron como controles negativos. Para cada réplica, se obtuvieron muestras procedentes de cultivos expuestos y no expuestos para someterlos a ensayo para BVDV. Todas las muestras excepto las alícuotas de virus de stock se sometieron a ensayo para BVDV mediante aislamiento vírico utilizando: (a) ensayo de inmunoperoxidasa para la detección de virus, (b) pase de cultivo de tejido previamente al aislamiento vírico para optimizar la detección de los virus, y (c) RT-nPCR. Entre las muestras se incluían:
Alícuotas del stock vírico. La alícuota vírica a la que se expusieron los COCs se diluyó seriadamente y se sometió a ensayo mediante aislamiento vírico utilizando el ensayo de inmunoperoxidasa.
Células de cumulus de día 3. En el día 3 de IVC, se separaron algunas células de cumulus desenganchadas del tercer lavado con TL-HEPES, se transfirieron a 3 ml de MEM-eq., y después se introdujeron en 500 \mul de MEM-eq. en un vial criogénico. Las células se lisaron mediante congelación a -80ºC y descongelación para liberar cualquier virus intracelular previamente al ensayo para BVDV.
Células de cumulus de día 7. El día 7 de IVC, las células de cumulus de cultivos expuestos y no expuestos se transfirieron de los 3 ml de MEM-eq. a 500 \mul de MEM-eq. dentro de un vial criogénico. Las células se lisaron mediante congelación a -80ºC y descongelación con el fin de liberar cualquier virus intracelular previamente al ensayo para BVDV.
Embriones individuales de día 7. Si se desarrollaba un número suficiente de M/B expuestos a BVDV alcanzado el día 7 de cada réplica de ensayo, se lavaba un grupo de 10 M/B tal como se ha descrito anteriormente y se trataba con tripsina tal como se ha descrito anteriormente. Los M/B lavados y expuestos a virus se introducían individualmente en 500 \mul de MEM-eq. (4 a 5 por réplica) o se conservaban criogénicamente individualmente y se descongelaban antes de introducirlos en MEM-eq. (4 a 5 por réplica). Los M/B tratados con tripsina y expuestos a virus se introducían individualmente en 500 \mul de MEM-eq. (3 a 5 por réplica) o se conservaban criogénicamente de manera individual y se descongelaban antes de introducirlos en MEM-eq. (4 a 5 por réplica). Todas las muestras se sonicaron previamente al ensayo vírico.
Si se desarrollaba un número suficiente de M/B no expuestos alcanzado el día 7 de cada réplica, se lavaba un grupo de 10 M/B tal como se ha descrito anteriormente. Los M/B lavados no expuestos se introducían individualmente directamente en 500 \mul de MEM-eq. (5 por réplica) o se conservaban criogénicamente de manera individual y se descongelaban antes de introducirlos en MEM-eq. (5 por réplica). Las muestras se sonicaron previamente al ensayo vírico.
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Ejemplo 24
Análisis estadístico y resultados
El 50% de la dosis infectiva en cultivo de tejido (TCID_{50})/ml de la alícuota expuesta se determinó mediante el método de Reed y Muench (L.J. Reed y H. Muench, Am. J. Hygiene 27:493-497, 1938). Los resultados de los ensayos de detección vírica se compararon utilizando un estadístico de prueba de Chi cuadrado de Pearson (J. Sall y A. Lehman, JMP Start Statistics (Duxbury Press, Belmont, California, 1996, 195-211).
La Tabla 2 proporciona los resultados del análisis de los medios de cultivo in vitro y de los lisados celulares que habían sido tratados con el compuesto antivírico indicado durante el tiempo indicado a una concentración de 12,5 \muM tras la exposición a BVDV a una MOI de 0,05 (ver el Ejemplo 12).
TABLA 2
25
La Tabla 4, posteriormente, proporciona los resultados del análisis de los medios de cultivo in vitro el día 3 y los lisados celulares el día 3 que habían sido tratados con el compuesto antivírico indicado a una concentración de 12,5 \muM, tras la exposición a BVDV a una MOI de 0,5 (ver el Ejemplo 12).
TABLA 4
27
La Tabla 5 proporciona los resultados del análisis de los lisados celulares el día 3 que habían sido tratados con el compuesto antivírico indicado durante tres días a la concentración indicada, tras la exposición a BVDV a una MOI de 0,05.
TABLA 5
28
En la especificación y ejemplos se han dado a conocer las realizaciones preferentes típicas de la invención y, aunque se utilizan términos específicos, se utilizan en un sentido meramente genérico y descriptivo y no con fines limitativos, exponiendo el alcance de la invención en las reivindicaciones posteriormente.
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Referencias citadas en la descripción
La presente lista de referencias citadas por el solicitante se proporciona únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se han compilado las referencias con extremo cuidado, no puede excluirse la posibilidad de errores u omisiones y la EPO se exime de toda responsabilidad a este respecto.
Documentos de patente citados en la descripción
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<110> Boykin, David
\hskip1cm
Tidwell, Richard 
\hskip1cm
Stringfellow, David 
\hskip1cm
Brock, Kenny 
\hskip1cm
Stephens, Chad 
\hskip1cm
Kumar, Arvind 
\hskip1cm
Wilson, W. David 
\hskip1cm
Givens, Daniel 
\hskip1cm
Dykstra, Christine 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPUESTOS, PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES ÚTILES PARA EL TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN POR VIRUS DE LA DIARREA VÍRICA BOVINA (BVDV) Y DE LA INFECCIÓN POR VIRUS DE LA HEPATITIS C (HCV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 5470-333
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggctagccat gcccttag 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccatgtgcca tgtacag 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> D
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El nuevo cebador BVD 180 se encontraba degenerado en la base decimocuarta (D=G+A+T) para permitir diferencias dentro de las secuencias 5' no traducidas de las cepas víricas utilizadas en la presente investigación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctgagtaca gggdagtcgt ca 
\hfill
22

Claims (16)

1. Compuesto según la Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
29
en la que:
X_{1} y X_{3} se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de O, S y NR_{9}, en los que R_{9} es H o alquilo;
30
X_{2} y X_{4} son, cada uno independientemente, CH o N;
A se selecciona de entre el grupo que consiste de:
R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de los grupos H, alquilo, alcoxi, haluro, alquilhaluro, nitro y amino;
R_{6} es H, alquilo o arilo; y
R_{7} y R_{8} se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de H y alquilo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que:
X_{1} es O;
X_{2} es CH;
X_{3} es NH;
X_{4} es N; y
R_{2}, R_{3} y R_{4} son, cada uno, H; o
en el que A es:
31
y R_{6} es alquilo; o
en el que A es:
32
y R_{7} y R_{8} son, cada uno, H; o
en el que R_{1} es un grupo amino; o
en el que R_{1} es un grupo nitro.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Compuesto según la reivindicación 1, en el que el compuesto se encuentra representado por una de las fórmulas siguientes:
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
35
36
4. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 1, en un portador farmacéuticamente aceptable, preferentemente formulado para la administración intravenosa o para la administración oral.
5. Compuesto según la Fórmula II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
37
en la que:
X_{1} y X_{3} se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de O, S y NR_{9}, en el que R_{9} es H o alquilo;
X_{2} y X_{4} son, cada uno independientemente, CH o N;
A se selecciona de entre el grupo que consiste de:
38
R_{1}, R_{2} y R_{3} se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de los grupos H, alquilo, alcoxi, haluro, alquilhaluro, nitro y amino;
R_{6} es H, alquilo o arilo; y
R_{7} y R_{8} se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de H y alquilo.
6. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 5, en un portador farmacéuticamente aceptable, preferentemente formulado para la administración intravenosa o para la administración oral.
7. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en una cantidad suficiente para tratar la infección por virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la infección por virus de la diarrea vírica bovina
(BVDV).
8. Utilización según la reivindicación 7 para el tratamiento de una vaca o un embrión.
9. Utilización según la reivindicación 7 ú 8, en la que el medicamento se ha diseñado para la administración oral o intravenosa.
10. Utilización de un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste de Fórmula I y Fórmula II:
39
en las que:
X_{1} y X_{3} se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de O, S y NR_{9}, en el que R_{9} es H o alquilo;
X_{2} y X_{4} son, cada uno independientemente, CH o N;
A se selecciona de entre el grupo que consiste de:
40
R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de los grupos H, alquilo, alcoxi, haluro, alquilhaluro, nitro y amino;
R_{6} es H, alquilo o arilo; y
R_{7} y R_{8} se seleccionan, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de H y alquilo; o
en el que el compuesto es un compuesto de Fórmula II, o
en el que el compuesto se encuentra representado por la fórmula:
41
o por la fórmula:
42
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos en una cantidad suficiente para tratar la infección por virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un elemento de la familia Flaviviridae de virus en una infección por virus de la diarrea bovina (BVDV).
11. Utilización según la reivindicación 10, en la que el medicamento se ha diseñado para la administración oral o intravenosa.
12. Compuesto según la reivindicación 5, en el que el compuesto se encuentra representado por la fórmula:
43
13. Compuesto según la reivindicación 5, en el que el compuesto se encuentra representado por la fórmula:
44
14. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos en una cantidad suficiente para tratar la infección por virus de la hepatitis C para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la infección por virus de la hepatitis C.
15. Utilización según la reivindicación 14 para el tratamiento de un ser humano.
16. Utilización según la reivindicación 14 ó 15, en la que el medicamento se ha diseñado para la administración oral o intravenosa.
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