ES2294348T3 - Agente de control biologico y formulaciones. - Google Patents
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Abstract
Cepa Bb1 del hongo filamentoso Beauveria bassiana depositado bajo el código CECT 20480, adaptable a un valor extremo de pH básico de 10.
Description
Agente de control biológico y formulaciones.
La presente invención se refiere a formulaciones
líquidas y sólidas basadas en la cepa Bb1 del hongo
filamentoso Beauveria bassiana, agente de control biológico,
resistente a los insecticidas comerciales, para el control de
plagas en plantas y cultivos.
Los artrópodos, especialmente insectos, tienen
un efecto dañino importante sobre los cultivos, tanto antes como
después de la recolección. Entre los insectos, aquellos que
pertenecen a la familia Aleyrodidae son económicamente
importantes, especialmente Bemisia tabaci Genadius y
Trialeurodes vaporariorum Westwood. La primera es una plaga
de los cultivos de algodón y semilla de soja. La última está
presente normalmente en cultivos horticulturales protegidos
(tomate, pepino, melón, etcétera). Ambas especies son conocidas
normalmente como mosca blanca, en referencia a la apariencia
general de los adultos (pequeños insectos alados, cubiertos de
polvo blanco ceroso). Estos insectos pertenecen al orden
Homoptera, que incluye también otras plagas importantes, como
piojos de plantas, piojos de la madera, moscas de la zanahoria,
etcétera. Estos son insectos mordedores chupadores, que viven a
expensas de las plantas, alimentándose de su savia.
Trialeurodes vaporariorum Westwood se
detectó por primera vez en España en 1943, proveniente probablemente
de una zona tropical en América Central. En 1970 se convirtió en
una de las plagas más importantes de los cultivos horticulturales
protegidos, en un rápido proceso de expansión. Desde entonces (a
finales de los años ochenta), nuevas especies, especialmente la
Bemisia tabaci Gennadius, proveniente de zonas tropicales en
Asia, se han extendido por todas partes en España. En 1991, ambas
especies estaban presentes en cultivos horticulturales, siendo
difícil diferenciarlas en el campo. En la actualidad, las moscas
blancas son todavía una de las plagas más importantes.
Para un control eficaz de estos insectos,
resulta necesario un conocimiento adicional de las características
biológicas de cada especie.
La importancia de las moscas blancas como plaga
de cultivos es debida principalmente a varias características
biológicas que les proporcionan un elevado potencial de expansión.
Entre estas características, se pueden enfatizar las siguientes: a)
son altamente polifágicas, alimentándose de un gran número de
especies de plantas por todo el mundo, cada especie de insecto con
un huésped preferente diferente; b) son altamente prolíficas, con
velocidades de desarrollo y crecimiento muy rápidas bajo condiciones
ventajosas, mostrando un ciclo de vida entre 20 días y 30 días, y
un número de huevos por hembra de entre 100 y 400; c) muestran una
fácil diseminación, debida a la movilidad de los adultos que se
propagan a las partes superiores de las plantas, y entre plantas
adyacentes, y a pesar de su limitada capacidad de vuelo, pueden ser
transportadas a largas distancias por corrientes de aire; d) son
altamente adaptables a las condiciones variables, desarrollándose en
diferentes condiciones de temperatura, humedad y luz, tanto en
exterior como en invernaderos. Estos factores, así como las
características de las plantas huéspedes (especies, variedad, estado
nutricional, nivel de infestación, situación geográfica, etcétera)
y las actividades de los depredadores naturales, afectan a la
evolución de las poblaciones de mosca blanca, proporcionando como
resultado un desarrollo muy
variable.
variable.
Los daños en los cultivos ocasionados por la
mosca blanca son normalmente el resultado de la succión de tejidos
de la hoja y la secreción de un tipo de molasas por las larvas o por
los insectos adultos. Esto puede producir los efectos siguientes en
los cultivos:
\bullet Si la población de mosca blanca es muy
grande, la succión de los fluidos de la planta por los adultos puede
afectar a los procesos biológicos de la planta, y prevenir el
crecimiento. Con luz del sol intensa, las hojas pueden marchitarse
y caer. Los daños de las hojas afectan al desarrollo de la fruta y
pueden originar una reducción de la cosecha.
\bullet La savia elaborada por la planta es
demasiado rica en carbohidratos para las necesidades de las moscas.
Debido a esta razón deben eliminar el exceso como una secreción
líquida (molasas) que se deposita en el cultivo. Estas molasas
sirven también como alimento para un hongo saprofítico conocido como
"fumagina" (Cladosporium spherosporum) o
"negrilla" que se desarrolla fácilmente. Tanto las molasas como
el hongo saprofítico reducen la actividad fotosintética y la
transpiración de la planta, originan una mala apariencia de las
frutas, con un menor valor comercial, e implican costes de
manipulación extra. Por otra parte, sirven como refugio de otras
plagas y enfermedades.
\bullet Las moscas blancas actúan como un
vector de transmisión para importantes enfermedades víricas en
cultivos, principalmente horticulturales. Las larvas o adultos,
infectados por la alimentación en una planta dañada, mantienen el
virus, que se reproduce en el interior. Los insectos pueden infectar
un gran número de plantas durante su vida. Entre las más de de
1.000 especies de moscas blancas conocidas, sólo tres han sido
confirmadas como vectores de virus (T. vaporarium, T.
abutilon y B. tabaci). T. vaporarium propaga
varios virus a cultivos horticulturales y de frutas, tales como el
virus del amarilleo infeccioso de la lechuga. B. tabaci es
particularmente eficaz propagando virus, siendo el más importante en
España el virus del rizado amarillo del tomate (TYLCV). El mayor
riesgo de enfermedad se da en verano y otoño, cuando se alcanzan
los tamaños máximos de las poblaciones.
Desde su aparición como una plaga económicamente
importante, el control de la mosca blanca ha sido uno de los
principales problemas en la agricultura. Sin embargo, se ha
observado una evolución en la estrategia de control a lo largo de
los años, debido a las variaciones en las especies de mosca blanca.
En la actualidad, el control de la mosca blanca implica costos
elevados de los cultivos. Por ello, la selección de una estrategia
y condiciones de aplicación adecuadas es un factor importante en el
control de plagas.
Se recomiendan algunos procedimientos
preventivos y culturales diseñados para evitar los focos de
fitófagos e infecciones de cultivos, tales como: eliminación de
hierbajos, utilización de redes y eliminación de restos vegetales
de cosechas anteriores. En cualquier caso, se debe tener gran
cuidado de no eliminar los depredadores naturales utilizando estos
procedimientos.
El control químico de esta plaga es muy
problemático debido a la rápida adquisición de resistencia a todos
los tipos de pesticidas. Los productos utilizados normalmente son
metomilo (sólo para tratamientos exteriores), imidacloprid y
algunos reguladores de desarrollo como buprofezina. Otros productos
son: algunos piretroideos, naled, aceite, endosulfan, etcétera.
El control de insectos con pesticidas químicos
no ha sido siempre satisfactorio. De esta manera, han existido
casos en los que el insecto elabora una cera a partir de su cutícula
que previene la penetración de los pesticidas, permitiendo el
rápido desarrollo de las poblaciones resistentes y reduciendo la
eficacia del control de los pesticidas.
El control biológico está siendo utilizado como
una alternativa al control químico. Hay muchas referencias acerca
de los enemigos naturales de la mosca blanca, como parásitos y
depredadores, así como patógenos. De esta manera, se ha utilizado
el himenóptero afelínido Encarsia formosa en invernaderos
durante un largo tiempo.
Para un control biológico eficaz es necesario
considerar los puntos siguientes:
\bullet Búsqueda y potenciación de los
enemigos naturales nativos. Especies de parásitos, tales como E.
mundus, han mostrado altos niveles de parasitismo contra B.
tabaci en cultivos de tomate.
\bullet Tener en cuenta la influencia de los
hierbajos y zonas adyacentes al cultivo para la movilidad de las
plagas y sus enemigos naturales.
\bullet Compatibilidad entre los productos
químicos y los enemigos naturales.
En relación a la gestión de plagas, el control
biológico normalmente se refiere a la acción que los parásitos,
depredadores o patógenos tienen en la población de la plaga, dando
lugar a su reducción por debajo de los niveles dañinos,
manteniéndolo en equilibrio natural en el ecosistema.
Los parásitos son los organismos que viven en o
sobre el cuerpo de otro organismo durante parte de sus vidas.
Los depredadores son los animales en libertad
que se alimentan de otros animales. Los depredadores pueden atacar
a sus presas tanto en el estado inmaduro como en el estado adulto;
como por ejemplo aves, reptiles, mamíferos y artrópodos.
Los patógenos son los microorganismos útiles
para el control de plagas. De esta manera, como principales agentes
de control se enfatizan los siguientes:
\bullet bacterias: tales como Bacillus
thuringensis contra orugas, escarabajos, mosquitos, etcétera
\bullet hongos: tales como Metarhizium
(contra cucarachas); Beauveria bassiana (contra la mosca
blanca, escarabajo de la patata, crisomélido del maíz, etcétera) y
Verticillium lecanii.
\bullet virus: tales como los virus
nucleopolihedrosis (contra el taladro del maíz).
\bullet protozoos: tales como Nosema
locustae (contra lagartijas, saltamontes)
\bullet nemátodos: tales como
Steimesema y Heterorhabditis (contra gorgojos de
suelo, orugas taladradoras de tallos).
Hay información relativa a un gran número de
hongos que pueden vivir como parásitos y matar diferentes tipos de
artrópodos, rompiendo su cutícula y penetrando a través de su duro y
resistente exoesqueleto.
Entre todos los organismos considerados como
agentes de control biológico contra plagas, los hongos
entomopatogénicos son los que ofrecen una mayor posibilidad.
Hay más de 500 especies con capacidad patogénica
conocida, pero sólo se utiliza un pequeño número de las mismas en
el control biológico. Esto se debe principalmente a que la manera de
penetración, a través de la cutícula, puede verse afectada por las
condiciones medioambientales, siendo la humedad esencial para las
primeras etapas de la penetración.
Las especies de hongos más utilizadas
normalmente en el control biológico son Beauveria bassiana,
Meterhizium anisopliae y Verticillium lecanii. Estas
especies tienen una distribución mundial y un amplio rango de
huéspedes. Otras especies notables, asociadas a un cierto tipo de
huésped, son Hirsutella thompsonii, específica de garrapatas
(arácnidos) y hongos acuáticos de géneros tales como la especie
Coelomyces y la especie Culicinomyces, específicas de
mosquitos.
Los hongos parasíticos de insectos u otros
ortrópodos pueden actuar durante todas las diferentes etapas del
desarrollo del huésped. Por lo tanto, estos hongos pueden aplicarse
en todas las etapas interesantes.
Los enemigos naturales de las plagas (parásitos,
depredadores o patógenos) deberían aplicarse al inicio del ciclo de
cultivo, cuando las plantas son todavía jóvenes, la incidencia de la
plaga es baja y el daño es inapreciable. Debido a que los agentes
de control biológico actúan más lentamente que los pesticidas, no
pueden utilizarse como un tratamiento de recuperación.
Los deutoromicetos crecen bien en medio sólido,
produciendo gran cantidad de conidio, que son las unidades
infecciosas. Estos conidios germinan, y las hifas penetran a través
de la cutícula, invadiendo la epidermis y la hipodermis y
extendiéndose en los tejidos del huésped, resultando en la muerte
del insecto. A continuación, el hongo vive como un saprófito en el
cuerpo del insecto, produciendo conidio nuevo que se disemina y
germina de nuevo, completando el ciclo de vida.
Con el fin de una utilización eficaz de los
hongos para el control biológico, resulta necesaria una gran
cantidad de inóculo para obtener un efecto a corto plazo y de corta
duración. Este efecto normalmente resiste sólo una temporada,
siendo necesario repetir el tratamiento periódicamente.
Los hongos entomopatogénicos causan rápidamente
la muerte del huésped produciendo una gran cantidad de esporas o
conidio que pueden dar lugar a una importante epizootia y destruir
la plaga. Debido a que estas epizootias son afectadas por los
factores medioambientales, es difícil predecir el éxito de las
inoculaciones en medioambientes naturales.
Beauveria bassiana es un patógeno de
insectos que se encuentra normalmente en la naturaleza,
principalmente en algunas plantas así como en el suelo. Entre sus
huéspedes se pueden enfatizar moscas blancas (Trialeurodes
vaporariorum, y Bemisia tabaci), homopteras
pertenecientes a la familia Aleyrodidae. Otras especies
huéspedes son coleoptera, hemiptera, heteroptera, lepidoptera y
diptera, en zonas templadas así como en zonas tropicales.
El ciclo biológico de B. bassiana incluye
dos etapas, una etapa patogénica y una etapa saprofítica. La
patogénesis ocurre cuando el hongo contacta con los tejidos vivos
del huésped, siendo necesario un microclima con una humedad del 85%
o superior. B. bassiana es un parásito facultativo. El
proceso infeccioso, realizado por conidio (estructuras
reproductoras fúngicas), comprende tres etapas. La primera etapa es
la germinación de conidio, seguida de una penetración y desarrollo
de hifas en el interior del insecto (3 ó 4 días). Este proceso
puede tener lugar a través de la cutícula (por secreciones
enzimáticas: lipasas, quitinasas y proteasas) u oralmente. El tubo
de germinación del conidio invade produciendo apresoria que penetra
la epicutícula, dando lugar a cuerpos fructíferos. La patogenicidad
fúngica en insectos depende de una relación compleja entre la
capacidad fúngica de penetrar la cutícula y la resistencia del
sistema inmunológico del insecto para prevenir el desarrollo
fúngico.
El desarrollo fúngico en el interior del insecto
puede ser influenciado por la eficacia de los hematocitos para
encapsular y melanizar el patógeno. Los hematocitos forman agregados
en el sitio de penetración dando lugar a "nódulos" alrededor
del conidio. En el interior del cuerpo del insecto, la germinación
ocurre sólo cuando el conidio está fuera de los agregados de
hematocitos.
En la segunda etapa, los tejidos del insecto son
invadidos por micelio fúngico, dando como resultado la muerte del
insecto (entre 2 y 3 días). En este proceso, el hongo produce muchos
metabolitos secundarios tóxicos. Entre ellos se pueden enfatizar
beauvericina, beauverólidos, bassianólidas, isarólidos, enniatinas y
oosporeína. Los síntomas de enfermedad en el insecto son la pérdida
de sensibilidad y pérdida de coordinación de movimientos, y
finalmente la parálisis.
La tercera etapa es la esporulación y el inicio
de un nuevo ciclo. El micelio fúngico, que puede observarse
inicialmente en las uniones y en las partes blandas del insecto, se
extiende por todo el cuerpo, cubriéndolo, y causando de esta manera
la muerte del insecto.
En la mayoría de los hongos entomopatogénicos,
las etapas de infección inicial incluyen una penetración directa a
través de la cutícula del insecto. Por lo tanto, las evidencias
ultraestructurales e histoquímicas sugieren que el proceso implica
una degradación enzimática; de hecho, se ha demostrado que estos
hongos pueden producir enzimas tales como lipasas, proteasas y
quitinasas.
Se ha demostrado que la serinproteasa Pr1 es la
enzima principal en la degradación de la cutícula, cuyo contenido
de proteína es superior al 70%. El efecto de Pr1 ha sido demostrado
por una degradación importante de la cutícula y por su elevada
concentración en los sitios de penetración.
Se ha demostrado que Pr1 tiene una especificidad
de sustrato diferente en cada especie fúngica. Estas diferencias en
la afinidad de Pr1 para los sitios de unión en cada especie son uno
de los principales factores en el reconocimiento de los insectos a
infectar.
El aislamiento y la caracterización de los genes
de Pr1 y de su ORF han sido logrados mediante estudios moleculares
utilizando estrategias RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Las
secuencias de los genes de Pr1 de diferentes especies han sido
comparadas y se han establecido sus homologías aminoácidas. Estos
resultados serán muy útiles para la identificación fúngica.
La gestión de plagas integrada (IPM) consiste en
la utilización de estrategias de control biológico junto con otras
técnicas químicas y físicas, para reducir el impacto medioambiental
ocasionado por estos últimos.
Una aplicación exitosa de las estrategias IPM
implica el mantenimiento de cultivos sanos, para lo que son
necesarios exámenes rutinarios, para detectar infecciones tempranas
y tomar las medidas correctoras adecuadas. Entre estas medidas, se
remarcan las siguientes:
\bullet Monitorización de los cultivos.
\bullet Utilización de hongos
entomopatogénicos, micopesticidas biológicos, pueden estar
caracterizados por:
- -
- Especificad de huésped
- -
- Bajos costes de producción
- -
- Actividad en un amplio rango de condiciones medioambientales
- -
- Sin patogenicidad humana.
La primera etapa en la aplicación de un control
biológico es la búsqueda, el aislamiento y la selección de los
antagonistas mediante estudios morfológicos, fisiológicos,
bioquímicos y moleculares, para su adecuada caracterización antes
de su aplicación en el campo.
Una segunda etapa importante es un estudio
exhaustivo para la selección y el desarrollo de un medio de cultivo
adecuado para la producción de biomasa fúngica.
La producción masiva de agentes de control
biológico ha sido expuesta por diferentes autores a lo largo de
varias décadas. Este procedimiento industrial implica la producción
de conidios u otros iniciadores implicados en el antagonismo.
Deberían ser producidos en un medio barato y disponible, con el
equilibrio de nutrientes adecuado y en el mínimo tiempo
posible.
Los sustratos utilizados para la producción
industrial de hongos entomopatogénicos son principalmente granos de
cereal, bien quebrados o no, suplementados con nutrientes
específicos, o arcillas inertes tales como vermiculita impregnadas
con medios de cultivo. Una vez seleccionados los sustratos
adecuados, deben establecerse las condiciones de fermentación
óptimas (temperatura, luz, humedad, ventilación, agitado,
etcétera).
Otro requerimiento es la obtención de biomasa
suficiente con los iniciadores adecuados para su eficacia.
La siguiente parada sería la etapa de
formulación. Una buena formulación para el control biológico debe
tener las características siguientes:
- \text{*}
- Base de preparación
- \text{*}
- Estabilidad
- \text{*}
- Relaciones de supervivencia adecuadas
- \text{*}
- Abundantes iniciadores viables
- \text{*}
- Bajo costo
La formulación debe tener un papel importante en
la protección de los antagonistas durante su almacenamiento y
aplicación, y además debe facilitar su extensión y crecimiento, y
asegurar su persistencia en el campo. Además debe permitir una
fácil aplicación del producto sin pérdida de eficacia. Por lo tanto,
para formular el micoinsecticida es necesario evitar los procesos o
prácticas que pueden inhibirla o dañarla.
En el caso de B. bassiana, el desarrollo
comercial de una formulación eficaz debe considerar la necesidad de
conservar su viabilidad y virulencia durante los procedimientos de
producción.
Es conocido en la técnica anterior "el control
biológico de Bemisia tabaci con hongos" como el dado a
conocer en el documento de Faria Marcos et al.: "Biological
control of Bemisia tabaci with fungi". Este documento repasa las
últimas innovaciones en el control biológico de Bemisia
tabaci utilizando hongos. Además de las técnicas de aislamiento
y selección, los presentes inventores/solicitantes describen algunos
productos comerciales que han demostrado ser eficaces para el
control biológico de la mosca blanca del tabaco, tanto en cultivos
de invernadero como en cultivos en campo abierto. La cepa de la
invención puede soportar condiciones extremas de pH y temperatura,
tales como un pH igual a 10 y temperaturas de 75ºC durante cinco
minutos fue eficaz en el control de insectos adultos en estrategias
de control integradas utilizando adulticidas compatibles con el
hongo y ha sido seleccionado en base a la superproducción de enzimas
extracelulares tales como las proteasas, glucanasas y
quitinasas.
La presente invención proporciona la cepa
Bb1 del hongo filamentoso Beauveria bassiana
depositada bajo CECT 20480.
En otros aspectos, la invención proporciona
formulaciones que comprenden B. bassiana, Bb1 (CECT
20480) y un portador.
En aspectos adicionales, la invención
proporciona la utilización la cepa Bb1 de B. bassiana
(CECT 20480) o la utilización de las formulaciones indicadas
anteriormente, como agentes de control biológico, por ejemplo de
plagas en plantas y cultivos, particularmente contra la mosca blanca
(Hemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum y
Aleyrodes proletella).
En aspectos adicionales, la invención
proporciona procedimientos para la utilización, o la utilización de
la cepa Bb1 de B. bassiana (CECT 20480) o
formulaciones como las indicadas anteriormente, en combinación con,
o sinergéticamente con, insecticidas químicos compatibles tales como
Orytis®, Dicarzol®, Lannate® y Confidor®, o en combinación con, o
sinergéticamente con, el fungicida químico Previeur® a la mitad de
la concentración máxima recomendada por el fabricante.
La cepa Bb1 de Beauveria bassiana,
objeto de la presente invención, fue aislada y seleccionada a partir
de una muestra de un huésped infectado. Se obtuvieron cultivos
monospóricos y puros en el laboratorio.
La cepa aislada se almacenó en una solución de
glicerol al 25% a -80ºC. La cepa es recuperada fácilmente en agar
patata dextrosa (PDA), agar harina de maíz (CMA) y agar extracto de
malta (MEA).
Esta cepa ha sido depositada en la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT). La Tabla 1 muestra el código
interno del laboratorio, el número de acceso asignado y la fecha del
depósito.
De los cultivos monospóricos obtenidos
previamente, se estudiaron las diferentes características
morfológicas en los medios de cultivo de laboratorio, tales como
PDA, CMA y MEA. Los cultivos se incubaron a 25ºC en la oscuridad
durante 14 días. Se estudiaron los tipos de micelio y desarrollo
conidial, y se realizaron diapositivas azul algodón lactofenol para
el examen microscópico.
Se estudió la capacidad de asimilación de las
diferentes fuentes de carbono de la cepa Bb1. Las fuentes de
carbono ensayadas fueron: glucosa (LBGL), ácido láctico (LBAL),
ácido cítrico (LBCA), oxalato de amonio (LBAO) y tartrato de amonio
(LBAT).
Se utilizó medio líquido Lynch B
(NH_{4}H_{2}PO_{4} 1 g/l, KCl 0,2 g/l,
MgSO_{4}-7H_{2}O 0,2 g/l,
CuSO_{4}-5H_{2}O 5 mg/l y
ZnSO_{4}-7H_{2}O 10 mg/l), conteniendo 0,05 g/l
de púrpura de bromocresol, y 1% (p/v) de la fuente de carbono
estudiada. El medio se ajustó a un valor de pH de 6. Se dispensaron
10 ml del medio en tubos inclinados. Los medios con las diferentes
fuentes de carbono se sometieron a autoclave. Los tubos se
inocularon con placas agar agua de 0,5 cm (al 2%) de la cepa. Todos
los experimentos se realizaron por triplicado. Los resultados se
observaron tras la incubación de los tubos en la oscuridad a 25ºC
durante 14 días.
La Tabla 2 muestra los resultados obtenidos para
la asimilación de fuente de carbono. Tal como se observa, la cepa
Bb1 no puede asimilar las fuentes de carbono oxalato de
amonio y tartrato de amonio.
Se estudió la capacidad de asimilación de
diferentes fuentes de nitrógeno para la cepa Bb1. Las fuentes
de nitrógeno ensayadas fueron: oxalato de amonio (LAAO), nitrito de
sodio (LANI) y glicina (LAGY).
Se utilizó un medio líquido Lynch A
(KH_{2}PO_{4} 1 g/l, KCl 0,5 g/l,
MgSO_{4}-7H_{2}O 0,2 g/l,
CaCl_{2}-2H_{2}O 0,1 g/l y sucrosa 10 g/l),
conteniendo 0,05 g/l púrpura de bromocresol, y 0,2% (p/v) de la
fuente de nitrógeno estudiada. El medio se ajustó a un valor de pH
de 6. Se dispensaron 10 ml del medio en tubos inclinados. Los
medios con las diferentes fuentes de nitrógeno se sometieron a
autoclave. Los tubos fueron inoculados con placas agua agar de 0,5
cm (al 2%) de la cepa. Todos los experimentos se realizaron por
triplicado. Los resultados se observaron tras la incubación de los
tubos en la oscuridad a 25ºC durante 14 días.
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La Tabla 3 muestra los resultados obtenidos para
la asimilación de fuente de nitrógeno. Tal como se observa, la cepa
Bb1 puede asimilar las diferentes fuentes de nitrógeno
ensayadas.
Se estudiaron diferentes características de
cultivo de la cepa Bb1 en diferentes medios de cultivo. Los
medios de cultivo ensayados fueron: agua agar (AA), agar extracto de
malta (MEA), agar harina de trigo (CMA), agar CZ NH_{4}, agar
nitrato glicerol (G25N) y agar nitrito sacarosa (ANS).
Se prepararon placas con los diferentes medios
de ensayo, y se inocularon con placas agua agar de 0,5 cm (al 2%)
de la cepa. Las placas fueron incubadas en la oscuridad a 25ºC
durante 14 días. Todos los experimentos se realizaron por
triplicado.
La Tabla 4 muestra los resultados obtenidos tras
14 días de incubación de la cepa Bb1 en los diferentes
medios.
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Se estudió la influencia de los reactivos
químicos sulfato cúprico, sulfato de cinc y violeta cristal sobre
el crecimiento la cepa Bb1. Se ensayaron las concentraciones
siguientes:
\bullet Cristal Violeta: 0,2 g/l y 0,04
g/l
\bullet Sulfato cúprico: 0,5 g/l
\bullet Sulfato de cinc: 3 g/l
Las soluciones de estos reactivos químicos se
esterilizaron por filtración (Millipore HA de 0,45 \mum) y se
añadieron a matraces que contenían 250 ml de medio agar Lynch B
sometido a autoclave. Los medios con diferentes concentraciones de
reactivos fueron dispensados en placas de Petri e inoculados con
placas agua agar de 0,5 cm (2%) de la cepa. Todos los experimentos
se realizaron por triplicado. Las placas inoculadas se observaron
tras 24 horas, 48 horas y 7 días de incubación en la oscuridad a
25ºC.
El crecimiento de la cepa Bb1 fue
inhibido completamente cuando este reactivo estaba presente.
La cepa Bb1 creció en medio Lynch B con
todas las diferentes concentraciones ensayadas de cristal violeta,
durante 7 días. Las colonias eran suaves, hialinas y sin
esporulación.
La cepa Bb1 creció en medio Lynch B con
sulfato de cinc durante 7 días. Las colonias eran suaves, hialinas,
sin esporulación.
Se estudió la hidrólisis de gelatina, así como
la esporulación de la cepa Bb1, en un medio rico en gelatina,
tras 10 días de incubación.
El medio rico en gelatina contenía: Sucrosa 10
g/l, gelatina 120 g, CuSO_{4}-5H_{2}O 5 mg/l y
ZnSO_{4}-7H_{2}O 10 mg/l, solución stock A 50
ml/l, solución stock C 50 ml. Formulación de la solución stock A:
NaNO_{3} 40 g/l, KCL 10 g/l, MgSO_{4}-7H_{2}O
10 g/l, FeSO_{4}-7H_{2}O 0,2 g/l. Formulación de
la solución stock C: K_{2}HPO_{4} 20 g/l.
El medio se dispensó en matraces, se sometió a
autoclave y se inoculó con placas agua agar de 0,5 cm (2%) de la
cepa. Los matraces fueron incubados en la oscuridad a 25ºC durante
10 días y se mantuvieron a 4ºC durante una hora.
La Tabla 5 muestra los resultados obtenidos tras
10 días de incubación de la cepa Bb1 en un medio rico en
gelatina.
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Se estudió la hidrólisis de esculina de la cepa
Bb1. Las placas de Petri que contenían agar esculina fueron
inoculadas con placas de agua-agar de 0.5 cm al 2%
de la cepa. Los cultivos inoculados fueron incubados en la
oscuridad a 25ºC durante 10 días. El experimento se realizó por
triplicado.
La reacción de hidrólisis es considerada como
positiva cuando el reverso de las colonias se torna negro. La
hidrólisis produce glucosa y esculetina (que interactúa con iones
férricos produciendo una precipitación negra que oscurece el
medio). La Tabla 6 muestra los resultados obtenidos tras 10 días de
incubación de la cepa Bb1.
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La cepa Bb1 muestra una reacción de
hidrólisis de esculina positiva.
Se estudió la capacidad de hidrólisis de lipasa,
y por lo tanto, la metabolización de lipasa, por la cepa
Bb1. El medio basal TWH (peptona fúngica 10 g/l, NaCl 5 g/l,
CaCl_{2}-2H_{2}O 0,1 g) que contenía púrpura de
bromocresol 0,025 g/l, agar al 2% (p/v) y 100 ml de solución Tween
80 al 10% (p/v). El medio se ajustó a un valor de pH de 6 y se
sometió a autoclave. A continuación, se dispensó en placas de Petri
y se inoculó con placas agua agar de 0,5 cm (2%) de la cepa. Los
cultivos inoculados se incubaron en la oscuridad a 25ºC durante 14
días. El experimento se realizó por
triplicado.
triplicado.
La reacción de hidrólisis se considera como
positiva cuando el medio se torna azul y aparece un anillo blanco
cristalino bajo las colonias.
La Tabla 7 muestra los resultados obtenidos tras
14 días de incubación.
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Se ensayó para la capacidad de crecimiento en un
medio que contiene urea. Se preparó un medio Lynch B suplementado
con 2% (p/v) de urea, 1% (p/v) glucosa, 2% (p/v) agar y 0,05 g/l de
púrpura de bromocresol. El medio se dispensó en placas de Petri
tras la esterilización para establecer una comparación con el medio
sin urea. Las placas fueron inoculadas con placas agua agar de 0,5
cm (2%) de la cepa. Las placas fueron incubadas en la oscuridad a
25ºC durante 14 días. Los experimentos se realizaron por
triplicado.
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Se estudió la tolerancia de Beauveria
bassiana a valores extremos de pH en medio ácido (pH 2) así como
en medio básico (pH 10). Se realizaron los siguientes medios de
cultivo. CZ pH 2 (50 ml/l de solución CZ A, 1 g/l de
K_{2}HPO_{4}, 30 g/l de sucrosa, 10,5 g/l de ácido cítrico, 5
mg/l de CuSO_{4}-5H_{2}O y 10 mg/l
ZnSO_{4}-7H_{2}O) y solución CZ pH 10 (50 ml/l
de solución CZ A, 3,75 g/l de glicina, 0,2 g/l de K_{2}HPO_{4},
30 g/l de sucrosa, 5 mg/l de CuSO_{4}-5H_{2}O y
10 mg/l de ZnSO_{4}-7H_{2}O) ambos medios se
complementaron con 0,05 g/l de púrpura de bromocresol. Composición
de la solución CZ A: 40 g/l NaNO_{3}, 10 g/l de KCl, 10 g/l de
MgSPO_{4}-7H_{2}O, 0,2 g/l de
FeSO_{4}-7H_{2}O.
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El conidio de la cepa Bb1 de Beauveria
bassiana se calentó a 75ºC durante 5 minutos. Los cultivos se
cultivaron en MEA o PDA durante 8 días. Se añadió una solución Tween
80 estéril al 0,2% (v/v) a las placas tras la esporulación del
hongo. Las placas se agitaron ligeramente para ayudar a la
dispersión conidial. Al mismo tiempo se prepararon tubos inclinados
añadiendo 1 ml de solución Tween 80 al 0,2% (v/v) y se sometieron a
autoclave. Los tubos inclinados se mantuvieron durante 30 minutos en
un baño de agua a 75ºC para estabilizar la temperatura. A
continuación, cada tubo fue inoculado con 100 \mul de suspensión
conidial y se mantuvo durante otros 5 minutos en el baño de agua a
75ºC. Se determinó la supervivencia conidial rayando las placas de
MEA o PDA. Las placas se incubaron en la oscuridad a 25ºC durante 7
días. El experimento se realizó por centuplicado.
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El sistema API-ZYM (Biomérieux
S.A., Marcy-l'Etoile, Francia) es un kit
semicuantitativo para la detección de actividad enzimática, que
permite una rápida detección simultánea de hasta 19 actividades
enzimáticas, a partir de pequeñas cantidades de muestra. Las tiras
API-ZYM están compuestas de 20 microtubos que
contienen un tampón con un sustrato enzimático.
Se estudiaron las siguientes actividades
enzimáticas: fosfatasa alcalina, esterasa, esterasa lipasa, lipasa,
leucina arilamidasa, valina arilamidasa, cistina arilamidasa,
tripsina, \alpha-quimotripsina, fosfatasa ácida,
naftol-AS-BI-fosfohidrolasa,
\alpha-galactosidasa,
\beta-galactosidasa,
\beta-glucuronidasa,
\alpha-glucosidasa,
\beta-glucosidasa,
N-acetil-\beta-glucosaminidasa,
\alpha-manosidasa y
\alpha-fucosidasa.
Las muestras inoculadas en las tiras
API-ZYM fueron los sobrenadantes de los cultivos de
la cepa Bb1 de Beauveria bassiana cultivados en la
oscuridad, a 25ºC durante 9 días en medio GYM. La lectura de las
tiras, se valoró de 0 a 2. La Tabla 11 muestra los resultados de
los ensayos de actividad enzimática. El valor 0 corresponde a una
reacción negativa, el valor 2 a una reacción de máxima intensidad y
el valor 1 corresponde a una reacción intermedia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron las siguientes actividades
enzimáticas extracelulares:
\beta-1,3-glucanasas,
\beta-1,6-glucanasas,
\beta-1,4-endoglucanasas (CMCasas)
y exoquitinasas para la cepa Bb1 de Beauveria bassiana
cultivada en medios GYM, GYM-CMC y
LB-CMC. (GYM: glucosa 10 g/l,
NH_{4}H_{2}PO_{4} 1 g/l, KCl 0,2 g/l,
MgSO_{4}-7H_{2}O 0,2 g/l,
CuSO_{4}-5H_{2}O 5 mg/l y
ZnSO_{4}-7H_{2}O 10 mg/l, extracto de levadura 5
g; GYM-CMC es una modificación del medio GYM,
remplazando la glucosa por carboximetilcelulosa (CMC, Sigma
viscosidad media) al 1%); LB-CMC
(NH_{4}H_{2}PO_{4} 1 g/l, KCl 0,2 g/l,
MgSO_{4}-7H_{2}O 0,2 g/l,
CuSO_{4}-5H_{2}O 5 mg/l y
ZnSO_{4}-7H_{2}O 10 mg/l, carboximetilcelulosa
al 1%), en la oscuridad a 25ºC durante 9 días sin agitación.
Se determina a 37ºC, en un reacción que contiene
0,2 ml de solución Laminarin
(\beta-1,3-glucano procedente de
la alga roja Laminaria hyperborea, Sigma) al 0,5% (en tampón
acético/acetato 100 mM pH 5,2) y 0,1 ml de la solución enzimática
diluida adecuadamente. La mezcla de la reacción fue incubada durante
una hora y la reacción se detuvo calentando a 100ºC durante 7
minutos.
La concentración de azúcar se determinó en una
mezcla de 0,5 ml por medio del procedimiento de Somogyi (1952) y
Nelson (1957), utilizando glucosa entre 0 mg/ml y 1 mg/ml como
estándar.
Una unidad de actividad enzimática de
\beta-1,3-glucanasa se definió
como la cantidad de enzima capaz de producir un micromol de
equivalentes de glucosa por minuto en las condiciones de ensayo.
La determinación de azúcar se realizó como
sigue: una solución de 0,15 ml de solución Somogyi I:Somogyi II
(4:1) fue añadida a 0,15 ml de la muestra. La mezcla se hirvió
durante 10 minutos y se enfrió en hielo, se añadieron 0,15 ml de
una solución Nelson y se agitó fuertemente para ayudar a la
eliminación de CO_{2}. Finalmente, la mezcla fue diluida en 1,5
ml de agua destilada y se leyó la absorbencia a 540 nm en un
luminómetro de lectura de microplaca (Elx 800,
Bio-Tek Instruments, Inc).
Se utilizaron las soluciones siguientes:
Solución Somogyi I: 15 g de potasio sodio
tartrato y 30 g de anhidro Na_{2}CO_{3} fueron diluidos en 300
ml de agua destilada. Posteriormente, se añadieron 20 g de
NaHCO_{3}. En un tubo diferente se diluyeron 180 g de anhidro
Na_{2}SO_{4} en 500 ml de agua destilada calentando sin llegar a
hervir para eliminar el aire formado. Una vez enfriada esta última
solución fue añadida a la primera y el volumen se incrementó hasta
1 litro con agua destilada. La mezcla final se almacenó a
temperatura ambiente.
Solución Somogyi II: 2 g de
CuSO_{4}-5H_{2}O y 18 g de anhidro
Na_{2}SO_{4} se disolvieron en 100 ml de agua destilada. El
reactivo se almacenó a temperatura ambiente.
Solución Nelson: 12,5 g de molibdato de amonio
tetrahidratado se disolvieron en 225 ml de agua bidestilada,
posteriormente se añadieron 10,5 ml de H_{2}SO_{4} concentrado
con agitación. Se diluyeron 1,5 g de arsenato de sodio en 12,5 ml
de agua bidestilada y se mezcló con la primera mezcla. Esta mezcla
se protegió de la luz a temperatura ambiente tras mantenerla por lo
menos 48 horas a 37ºC.
Los resultados de la actividad enzimática
\beta-1,3-glucanasa (IU/ml)
correspondientes a la cepa Bb1 de Beauveria bassiana
se muestran en la Tabla 12 para tres diferentes medios de cultivo
(GYM, GYM-CMC y LB-CMC).
La actividad se determinó a 37ºC. Los contenidos
de la mezcla de la reacción química son: 0,2 ml de una solución
Pustulan al 0,5% (\beta-1,6-glucan
de la Umbillicaria papulosa, Calbiochem, USA) (en tampón de
acetato de potasio 50 mM, pH 5,5) y 0,1 ml de una solución
enzimática diluida adecuadamente. La mezcla se incubó durante una
hora y la reacción se detuvo calentando a 100ºC durante 7 minutos.
Finalmente la concentración de azúcar se determinó en 0,15 ml de la
mezcla siguiendo el procedimiento Somogyi-Nelson
(descrito anteriormente), utilizando glucosa entre 0 mg/ml y 1
mg/ml como estándar.
Una unidad de actividad enzimática de
\beta-1,6-glucanasa se definió
como la cantidad de enzima capaz de producir un micromol de
equivalentes de glucosa por minuto en las condiciones de ensayo.
Los resultados de la actividad enzimática de
\beta-1,6-glucanasa (IU/ml)
correspondientes a la cepa Bb1 de Beauveria bassiana
se muestran en la Tabla 12 para tres diferentes medios de cultivo
(GYM, GYM-CMC y LB-CMC).
La actividad se determinó a 37ºC. Los contenidos
de la mezcla de la reacción química son: 0,2 ml de
carboximetilcelulosa (solución al 0,5% en tampón de acetato de
potasio 50 mM pH 5,5) y 0,1 ml de una solución enzimática diluida
adecuadamente. La mezcla se incubó durante una hora y la reacción se
detuvo calentando a 100ºC durante 7 minutos. Finalmente, se
determinó la concentración de azúcar en 0,15 ml de la mezcla
siguiendo el procedimiento Somogyi-Nelson (descrito
anteriormente), utilizando glucosa entre 0 mg/ml y 1 mg/ml como
estándar.
Una unidad de actividad enzimática de
\beta-1,4-endoglucanasa se define
como la cantidad de enzima capaz de producir un micromol de
equivalentes de glucosa por minuto en condiciones de ensayo.
Los resultados de la actividad enzimática de
\beta-1,4-endoglucanasa (IU/ml)
correspondientes a la cepa Bb1 de Beauveria bassiana
se muestran en la Tabla 12 para tres medios de cultivo diferentes
(GYM, GYM-CMC y LB-CMC).
Esta enzima hidroliza las unidades monómericas
terminales de la quitina. Su actividad se calculó midiendo la
liberación de nitrofenol de
p-nitrofenil-\beta-D-N-acetilglucosaminidasa
(Sigma).
Se preparó la mezcla de reacción que contenía
0,05 ml de una solución de
p-nitrofenil-\beta-D-N-acetilglucosaminidasa
(0,3 mg/ml de tampón de fosfato de potasio KHPO_{4} 50 mM, pH
6,7) y 0,03 ml de la solución enzimática diluida adecuadamente. La
placa fue incubada durante 15 minutos a 50ºC y la reacción se detuvo
añadiendo 0,05 ml de Na_{2}CO_{3} 0,4 M. La evaluación se
realizó midiendo la absorbencia utilizando un luminómetro de 96
pocillos a 410 nm. La actividad enzimática se calculó como sigue: A
= Absorbencia X factor de dilución.
La Tabla 13 muestra los resultados de la
actividad enzimática exoquitinasa correspondientes a la cepa
Bb1 de Beauveria bassiana en medio de cultivo GYM. En
los medios de cultivo GYM-CMC y
LB-CMC la inducción de la exoquitinasa fue
prácticamente nula.
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AU Unidad arbitraria AU = Absorbencia a 41 nm x
factor dilución
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa Bb1 de Beauveria bassiana
objeto de la presente patente, es un aislamiento natural, cuyo
genoma no ha sido modificado. Sin embargo, las altas similitudes
morfológicas entre las especies pertenecientes al género
Beauveria dificultan mucho una correcta identificación y la
discriminación entre los agentes de control biológico. Los
procedimientos morfológicos (Stasz et al., 1988) han
resultado no ser suficientemente resolutivos para; a) diferenciar y
caracterizar las cepas industriales para patentes o
comercialización. b) controlar la estabilidad genética de los
agentes de control biológico durante los procedimientos
industriales. c) monitorizar la persistencia de cepas antagonistas
una vez que son introducidas en el suelo y después de varios
tratamientos sucesivos. d) la lucha contra el fraude y posibles
litigios relativos a los derechos industriales.
Un gran avance fue el desarrollo de técnicas
basadas en el análisis bioquímico, también conocidas como marcadores
bioquímicos, que han permitido superar algunos de los problemas
indicados. Sin embargo, estas técnicas presentan la desventaja de
no ser suficientemente reproducibles y resolutivas en la
diferenciación de las cepas.
En la actualidad, la utilización de análisis de
ácidos nucleicos (ADN) se ha incrementado, para resolver algunas de
estas dificultades, buscando diferencias en el genoma fúngico,
agentes de control biológico, que podrían ser marcadores
moleculares reproducibles, permitiendo la identificación de las
diferentes cepas.
Se necesitan técnicas adecuadas para encontrar
las diferencias en el ADN del organismo. Las herramientas más
potentes para este fin son las basadas en la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) descrita por Mullis y Fallona (1987).
Algunas de las potenciales metodologías son las
basadas en la amplificación de fragmentos de ADN o genes con una
secuencia específica altamente conservada, utilizando PCR. En los
hongos filamentosos, especialmente en las especies pertenecientes
al género Beauveria, los genes rARN son altamente conservados
y son muy similares entre las diferentes especies relacionadas. Sin
embargo, la región ITS (Espaciador transcrito interno), permite
establecer diferencias importantes y precisas a nivel
infraespecífico. Estas regiones pueden ser amplificadas mediante
cebadores ITS1 e ITS4 (Kuhls et al., 1996).
Una condición necesaria para la caracterización
molecular de la cepa Bb1 de Beauveria bassiana es
trabajar con poblaciones genéticamente puras, considerando la gran
variabilidad fenotípica exhibida por los aislamientos fúngicos
cultivados en laboratorio.
\newpage
La extracción de ADN genómico de la cepa
Bb1 de Beauveria bassiana se realizó siguiendo el
procedimiento propuesto por Raeder y Broda (1985) con algunas
modificaciones.
Medio sólido: para mantener los iniciadores y
los cultivos fúngicos, se prepararon placas con medio PDA (Agar
patata dextrosa, Sigma-USA). Se transfirieron placas
agar 0,5 cm de otros cultivos de la cepa Bb1 al centro de la
placa utilizando un cilindro clonador estéril. Las placas se
incubaron en la oscuridad a 25ºC hasta la total colonización.
Medio líquido: Matraces con un PDB estéril
(Caldo patata dextrosa, Sigma-USA) fueron inoculados
con una suspensión conidial (10^{6} conidio/ml) proveniente de
cultivos cultivados en medio sólido (PDA). Los matraces inoculados
se cultivaron con agitación a 25ºC y 250 rpm.
Todo el material fue sometido previamente a
autoclave. El micelio fúngico fue recogido y filtrado a través de
un embudo filtro de papel. A continuación fue lavado varias veces
con agua destilada estéril hasta la total eliminación de restos de
agar. La biomasa obtenida fue secada utilizando un filtro de papel
estéril y fue distribuida en criotubos para su congelación y
conservación.
Se deshicieron 50 mg de micelio seco congelado
(secador congelador, Telstar Cryodos) en nitrógeno líquido, en un
baño de hielo. Se recogió el polvo miceliar en un microtubo, y fue
homogeneizado en un tampón de lisis de 0,5 ml (SDS al 0,5%,
Tris-HCl 200 mM, NaCl 250 mM, EDTA 25 mM; a pH 8,5).
Para retirar las proteínas de la fase líquida, se añadieron 350
\mul de fenol (la solución fenólica se preparó según Sambrook
et al., 1989. Se utilizó fenol cristalizado (Merck) saturado
con tampón Tris-HCl 1 M pH 8, en presencia de
8-hidroxiquinoleína y almacenado a 4ºC, en una
botella de vidrio topacio estéril) y 150 \mul de cloroformo
isoamílico (cloroformo/alcohol isoamílico 24/1 (v/v)), mezclando
cuidadosamente. Los microtubos fueron centrifugados a 13.000 rpm y
4ºC durante 1 hora. El sobrenadante fue transferido a un microtubo
limpio, se añadieron 500 \mug de ARNasa (10 mg/ml de ribonucleasa
pancreática (Sigma) disuelta en tampón pH 7,5 NaCl 15 mM y
Tris-HCl 10 mM, y se calentó a 100ºC durante 15
minutos para reactivarla y se alicuotó y conservó a -20ºC). A
continuación, se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Se añadió y
mezcló un volumen equivalente de cloroformo isoamílico. Después del
centrifugado durante 10 minutos a 13.000 rpm, a temperatura
ambiente, el sobrenadante se transfirió a un microtubo limpio. El
ADN fue precipitado, añadiendo 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M
pH 5 y 2,5 volúmenes de etanol al 96% (v/v) a 20ºC. El pelet
obtenido mediante la centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos
a 4ºC, fue lavado con etanol frío al 70% (v/v), y secado al aire y
resuspendido en 100 ml de tampón TE (10:1) (Tris-HCl
10 mM; EDTA 1 mM, pH 8). Las muestras de ADN genómico se
almacenaron a -20ºC.
La cuantificación del ADN genómico, así como su
pureza se midió por medio de técnicas espectrofotométricas,
siguiendo el protocolo descrito en Sambrook et al. (1989). Se
realizaron diluciones 1/100 de las muestras de ADN genómico con
agua destilada. Más tarde, se registraron respectivamente las
absorbencias a longitudes de onda de \lambda= 260 nm y \lambda
= 280 nm. La pureza del ADN fue confirmada dividiendo ambos valores
de absorbencia. El resultado debe ser superior o igual a 1,8. La
cantidad de ADN genómico fue determinada considerando que cuando la
absorbencia a \lambda=260 nm es igual a 1, la cantidad del ADN
genómico de doble cadena es de 50 \mug/ml (Sambrook et
al.,
1989).
1989).
La producción de la extracción de ADN genómico
siguiendo el protocolo descrito por Raeder y Broda (1985) fue muy
elevada.
Se utilizaron los siguientes cebadores:
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Los cebadores son oligonucleótidos que permiten
la unión de la enzima ADN polimerasa sobre la plantilla de ADN. Son
sintetizados automáticamente por Roche Biochemicals, y se
suministran liofilizados. Fueron resuspendidos en el laboratorio de
los presentes inventores en agua MiliQ (Millipore) a una
concentración final de 50 \muM y a continuación fueron
alicuotados en varios tubos y almacenados a -20ºC.
La amplificación de la región ITS fue realizada
utilizando los cebadores ITS1 e ITS4 con un termociclador
Ptc-100 de MJ Research que incorpora una tapa
calentada para evitar evaporaciones, utilizando enzima ADN
polimerasa (Echo Taq Biochemical) y siguiendo el protocolo descrito
en White et al. (1990) modificado. Los reactivos para la
reacción PCR se muestran en la Tabla 14:
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Se añadieron todos los reactivos siguiendo el
orden mostrado en la Tabla 14 y se mezclaron en microtubos de PCR
de 200 \mul. Todo ello se realizó en condiciones completamente
estériles para evitar cualquier posible contaminación, así como con
hielo para prevenir la desnaturalización del ADN, el templado de los
cebadores y la actividad enzimática prematura.
La mezcla de reacción se centrifugó durante 5
segundos y se incubó en el termociclador durante 5 minutos a 95ºC
(etapa de desnaturalización inicial), a continuación se programaron
40 ciclos siguiendo las etapas siguientes:
\bullet Desnaturalización del ADN de doble
cadena 1 minuto a 95ºC
\bullet Unión de los cebadores a la plantilla
de ADN 2 minutos a 55ºC
\bullet Etapa de extensión 3 minutos a
72ºC.
Tras 40 ciclos se realizó un ciclo de extensión
final, durante 10 minutos a 72ºC para completar la extensión de
todas las cadenas.
El ADN genómico así como los productos de la
amplificación PCR fueron separados y purificados mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1% en tampón TAE
(Tris-acetato 40 mM, EDTA 2 mM, pH 8,3). La
electroforesis se realizó bajo una corriente eléctrica constante
(40 voltios) durante 4 horas. Las muestras se cargaron en el gel,
añadiendo ¼ del volumen de la muestra en tampón de carga en gel
(0,25% azul de bromofenol, 0,25% xileno cianol y 25% Ficoll
400).
Al final de la electroforesis los geles se
tintaron con 0,5 \mug/ml de una solución de bromuro de etidio, se
fotografiaron y analizaron con un sistema densitométrico fotográfico
(BIOPROFIL), con un transiluminador ultravioleta y una cámara
CCD.
Los fragmentos PCR de la región ITS de la cepa
Bb1 de Beauveria bassiana fueron secuenciados
utilizando un secuenciador de ADN automático (Perkin Elmer/Applied
Biosystem). Se utilizaron 300 ng del producto de la PCR y 5 pmoles
de los cebadores siguientes:
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Las secuencias nucleótidas obtenidas fueron
alineadas utilizando el programa de ordenador Meg Align del paquete
de software DNASTAR (DNASTAR, Londres). Se realizaron búsquedas en
bases de datos utilizando el servicio proporcionado por EMBL/Gen
Bank (European Bioinformatics Institute, EBI) para comparar estas
secuencias con otras secuencias pertenecientes al género
Beauveria.
La secuenciación de la región ITS utilizando los
cebadores ITS1, ITS2, ITS3 e ITS4 muestra una elevada homología con
otros hongos filamentosos, así como con otras cepas de Beauveria
bassiana de Gen Bank. Las diferencias existentes fueron
localizadas en los espaciadores ITS1 e ITS2. A continuación se
muestra la secuencia obtenida de la cepa Bb1 de Beauveria
bassiana.
Beauveria bassiana Bb1 CECT 20480
(región ITS).
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Supervivencia de los agentes de control
biológico a los tratamientos químicos, que les confiere un efecto
complementario y un refuerzo de sus propiedades. Un plan de
tratamiento detallado a lo largo del periodo de desarrollo de la
enfermedad puede realizarse sólo una vez que se ha establecido la
tolerancia a los pesticidas.
Los principales beneficios de la integración de
los agentes de control biológico en un programa de gestión de
plagas integrado serían:
\bullet Una disminución en la utilización de
fungicidas e insecticidas químicos. La consecuencia de esto es que
habrá una menor acumulación de residuos de pesticidas en el
medioambiente.
\bullet Cuanto menor sea la exposición de los
patógenos a los fungicidas químicos menor será la resistencia que
adquieran los mismos y por lo tanto se reducirá la virulencia y la
severidad de los daños en los cultivos.
Se ensayó la compatibilidad in vitro de
la cepa Bb1 de Beauveria bassiana con los insecticidas
químicos mas utilizados en la agricultura como control de plagas.
Este ensayo muestra la posibilidad de utilizar ambos tipos de
productos al mismo tiempo, en caso de requerirse un tratamiento
simultáneo con insecticidas químicos y biológi-
cos.
cos.
Se realizaron estudios para dilucidar si estos
productos producirían un efecto inhibidor del crecimiento en la
cepa Bb1 de Beauveria bassiana. Las diferentes placas
PDA fueron preparadas añadiendo los diferentes insecticidas
químicos. La concentración de los insecticidas era de 1 \mul/ml
(dosis típica utilizada en campo). Al mismo tiempo, se prepararon
placas de control, sin insecticida químico. Las placas fueron
inoculadas utilizando placas PDS de 0,5 cm de cultivos de
Beauveria. Las placas fueron incubadas a 25ºC en la oscuridad
durante 21 días. El experimento se realizó por triplicado. El
porcentaje de inhibición radial se midió a los 3, 7, 14 y 21
días.
Los resultados se muestran utilizando la fórmula
siguiente:
Porcentaje
inhibición radial =
[(C-T)*100]/C
Donde C es la media de las tres cepas de control
y T es la media de las tres cepas tratadas con cada producto (ver
Tabla 15).
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No se observó inhibición del crecimiento en las
colonias de la cepa Bb1 cuando los insecticidas estaban
presentes. La única conclusión posible es que hay una total
compatibilidad entre los insecticidas ensayados y la cepa
Bb1 de Beauveria bassiana.
El ensayo se realizó utilizando dos
concentraciones de fungicida diferentes: Las dosis máxima y mínima
recomendadas por el fabricante. El medio de cultivo utilizado fue
Lynch B (LB) con 1% de glucosa como fuente de carbono. Los inóculos
utilizados eran placas agar PDA de la cepa Bb1 de placas
cultivadas durante dos días a 24ºC. Se prepararon dos tipos de
placas de Petri, uno de ellos que contenía las diferentes
concentraciones utilizadas en el ensayo y el otro sin el mismo
(placas tratadas y placas de control). Las placas se incubaron a
25ºC en la oscuridad durante 21 días. El experimento se realizó por
triplicado.
El porcentaje de inhibición se midió a los 3, 7,
14 y 21 días. Los resultados se muestran usando la fórmula
siguiente:
siguiente:
Porcentaje de
inhibición =
[(C-T)*100]/C
Donde C es la media de las tres cepas de control
y T es la media de las tres cepas tratadas con cada producto (ver
Tablas 16A y 16B).
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Según los resultados obtenidos no hay
compatibilidad entre la cepa Bb1 y la concentración máxima de
fungicida recomendada. Sin embargo, cuando se ensayó la mínima
recomendada (aproximadamente el 50% de la concentración máxima)
sólo se observó una total compatibilidad con Previcur durante el
experimento.
La presente invención se ilustra adicionalmente
con los ejemplos no limitativos siguientes que hacen referencia a
las figuras adjuntas.
Las Figuras 1 a 3 muestran los resultados de la
actividad glucanasa mostrados en la Tabla 12.
Según la descripción anterior, a continuación se
describirán formulaciones líquidas y sólidas para su aplicación en
hojas y/o suelo. La formulación contendrá una suspensión de
estructuras vegetativas y reproductivas (conidio) de la cepa
Bb1 de Beauveria bassiana, un agente de control
biológico en la presente invención.
Ejemplo
1
La presente invención proporciona una
formulación líquida cuya composición cuantitativa es como se indica
a continuación:
\bullet Aceites vegetales
94-96%
\bullet Componentes inertes
6-4%
\bulletBeauveria bassiana CECT 20480
c.s.p. 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Es una mezcla de diferentes emulsionantes,
surfactantes no iónicos con aceites vegetales. Tal como se ha
indicado en la invención, la formulación tiene componentes que son
utilizados como nutrientes por la cepa Bb1 de Beauveria
bassiana, y mantiene una humedad suficiente para la germinación
del conidio.
Las características de los aceites presentes en
la formulación les permiten actuar como un adhesivo y/o
antievaporante, que permitirá la persistencia del conidio en
superficies de hojas, plantas e insectos, reteniendo el producto
aplicado y previniendo su volatilización.
Debido a las características descritas
anteriormente, la formulación ha demostrado ser muy eficaz en el
control de plagas, que atacan a las plantas que han sido
difícilmente controladas hasta la fecha con formulaciones
químicas.
Los aceites vegetales utilizados en esta
formulación son una mezcla de emulsionantes provenientes de
extractos de plantas tales como aloe vera, semilla de soja, jojoba,
etcétera o ésteres de ácidos grasos y glicerol. La fracción inerte
de la formulación está compuesta por agentes tensoactivos tales como
sorbilen, polietilenglicol, etcétera.
La viabilidad de la formulación líquida será del
85% después de seis meses de almacenamiento en condiciones de
refrigeración, sin embargo la viabilidad después del mismo tiempo de
almacenamiento a temperatura ambiente será sólo del 50%.
La medición de la viabilidad de la formulación
se realizó mediante el recuento de las colonias. Para realizarlo,
se prepararon diluciones en serie de la formulación, a continuación
100 \mul de la solución fueron cultivados en PDA (agar patata
dextrosa) suplementado con 0,1% de Triton 100x. Se prepararon cuatro
placas de cada dilución y se incubaron a 25ºC durante un periodo de
48 a 72 horas, y tras este tiempo se realizó un recuento de las
colonias. Los resultados se expresan en c.f.u. por ml de producto
(c.f.u. = unidad formadora de colonia).
La formulación fue ensayada en un invernadero
para prevenir la infección de cultivos de pimienta por la mosca
blanca (B. tabaci). Los ensayos se realizaron en dos
diferentes variedades: california roja, cultivo roxy (PV1) y lamuyo
amarillo cultivos maribel y triana (PV2).
La formulación biológica es aplicada en una
concentración de entre 0,5 y 1 litro por hectárea. Simultáneamente
la fórmula es aplicada con dos insecticidas, uno de ellos es un
adulticida y el otro es un inhibidor de quitina (IGR). Ambos
insecticidas se aplicaron en las concentraciones recomendadas por el
fabricante.
Las fórmulas se aplicaron utilizando una red
pulverizadora, con una concentración media de 600 litros por
hectárea.
El trabajo se realizó de la manera
siguiente:
\bullet Recuento inicial de niveles de mosca
blanca en los cultivos, se hizo un recuento de los adultos y las
larvas. Para ello se hizo un muestreo del 10% de las plantas del
invernadero, buscando moscas a tres niveles diferentes, en la parte
superior y la parte inferior de la planta y a un nivel
intermedio.
\bullet Tras el recuento inicial, se
aplicaron las fórmulas ensayadas.
\bullet Tras cinco días se repitieron los
recuentos.
\bullet Los recuentos se repitieron cuatro
veces durante el ensayo con intervalos de 10 días.
Los resultados se expresan en porcentajes del
recuento inicial.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó que el control de la plaga de mosca
blanca era más eficaz en los ensayos realizados con la aplicación
simultánea de la fórmula F1 y el producto IGR y que era incluso más
eficaz en los ensayos realizados con la mezcla de la fórmula y el
producto adulticida. Esto es debido a que los tratamientos de choque
con ambos productos adulticida e IGR no afectan al crecimiento de
los hongos entomopatogénicos Beauveria bassiana, pero
disminuyen considerablemente la población de mosca blanca.
Ejemplo
2
La presente invención proporciona una
formulación sólida compuesta por un portador y una combinación de
compuestos biológicos cuya composición cuantitativa es como se
indica a continuación:
- \bullet
- Proteína 10-50%
- \bullet
- Grasas 10-30%
- \bullet
- Celulosa 1-10%
- \bullet
- Lactosa 10-60%
- \bullet
- Vitamina A 10.000-30.000 UI/Kg
- \bullet
- Vitamina D-3 1.000-10.000 UI/Kg
- \bullet
- Vitamina E 10-60 mg/Kg
- \bullet
- Sulfato cúprico (CuSO_{4} 5H_{2}O) 5-20 mg/Kg
-
\;
* - Beauveria bassiana CECT 20480 c.s.p. 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Las características del portador ayudan a la
acción de la formulación incrementando la longevidad y la viabilidad
del conidio de la cepa Bb1 de Beauveria bassiana
porque mejora la absorción de agua y facilita una suspensión
conidial en un elemento líquido en el momento de la aplicación.
Las propiedades adhesivas de la composición
carbohidrato del portador mejoran (como en el Ejemplo 1) la adhesión
conidial a las superficies de hojas e insectos.
El propio portador puede ser utilizado como
fuente nutritiva por la Beauveria bassiana. Al mismo tiempo
crea un medioambiente favorable en el que el microorganismo se puede
establecer y sobrevivir. La característica más importante del
portador es la protección que proporciona contra los rayos solares,
incrementando la estabilidad genética del aislamiento de la
formulación y le ayuda a retener su eficacia así como incrementar la
viabilidad una vez aplicada al campo.
La formulación ha demostrado una gran
estabilidad durante el almacenamiento debido al efecto combinado de
todas estas características.
La viabilidad de la formulación sólida era del
90% después de 6 meses de almacenamiento a 4-9ºC,
sin embargo la viabilidad después del mismo periodo de tiempo de
almacenamiento a temperatura ambiente era de 60%.
La viabilidad se determinó siguiendo el
procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
La formulación fue ensayada en un invernadero
para prevenir la infección de cultivos de tomate por la mosca
blanca (B. tabaci). Los ensayos se realizaron en dos
variedades diferentes: "suelto pintón", cultivo brillante
(TV1) y "tomate en ramillete", cultivo pitenza (TV2).
La formulación biológica es aplicada en una
concentración desde 125 a 250 gramos por hectárea. Simultáneamente
la fórmula se aplicó con dos insecticidas, uno de ellos es un
adulticida y el otro es un inhibidor de quitina (IGR). Ambos
insecticidas se aplicaron en las concentraciones recomendadas por el
fabricante.
Las fórmulas se aplicaron utilizando una red
pulverizadora con una concentración media de 600 litros por
hectárea.
El trabajo se realizó de la manera
siguiente:
\bullet Recuento inicial de niveles de mosca
blanca en los cultivos, se hizo un recuento de los adultos y las
larvas. Para ello se hizo un muestreo del 10% de las plantas del
invernadero, buscando moscas a tres niveles diferentes, en la parte
superior y la parte inferior de la planta y a un nivel
intermedio.
\bullet Tras el recuento inicial, se
aplicaron las fórmulas ensayadas.
\bullet Tras cinco días se repitieron los
recuentos.
\bullet Los recuentos se repitieron cuatro
veces durante el ensayo con intervalos de 10 días.
Los resultados se expresan en porcentajes del
recuento inicial.
Se observó que el control de plaga de mosca
blanca era más exitoso en los ensayos realizados con la aplicación
simultánea de la fórmula F1 y el producto IGR y eran incluso más
exitosos en el ensayo realizado con la mezcla de la fórmula y el
producto adulticida. Esto era debido a que los tratamientos de
choque con ambos productos adulticida e IGR no afectan al
crecimiento de los hongos entomopatogénicos Beauveria
bassiana, pero disminuyen considerablemente la población de
mosca blanca.
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\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es solamente para conveniencia del lector. La misma no
forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha
tenido mucho cuidado durante la recopilación de las referencias, no
deben excluirse errores u omisiones y a este respecto la EPO
(Oficina Europea de Patentes) se exime de toda responsabilidad.
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\hskip1cmGomis Garcia, Maria Dolores
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<120> Agente de control biológico y
formulaciones
\vskip1.000000\baselineskip
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<130> WPP287205
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2003-12-15
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<150> GB0229127.6
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2002-12-13
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<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 18
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 1
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<210> 2
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<400> 2
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\hfill20
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<210> 4
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipgcatcgatga agaacgcagc
\hfill20
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 605
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Beauveria bassiana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Cepa Bb1 del hongo filamentoso
Beauveria bassiana depositado bajo el código CECT 20480,
adaptable a un valor extremo de pH básico de 10.
2. Hongo filamentoso según la reivindicación 1
adaptable a una temperatura extrema de 75ºC durante cinco
minutos.
3. Utilización de la cepa Bb1 de B.
baussiana depositada bajo el código CECT 20480 como un agente
de control biológico.
4. Formulación que comprende la cepa Bb1
del hongo filamentoso B. bassiana depositado bajo el código
CECT 20480 y un portador.
5. Formulación líquida cuya composición
cuantitativa es como se indica a continuación:
\bullet Aceites vegetales
94-96% en peso
\bullet Componentes inertes
6-4% en peso
\bulletBeauveria bassiana CECT 20480
c.s.p. 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
6. Formulación sólida compuesta por un portador
y una combinación de compuestos biológicos cuya composición
cuantitativa es como se indica a continuación:
Portador
- \bullet
- Proteína 10-50% en peso
- \bullet
- Grasas 10-30% en peso
- \bullet
- Celulosa 1-10% en peso
- \bullet
- Lactosa 10-60% en peso
- \bullet
- Vitamina A 10.000-30.000 UI/Kg
- \bullet
- Vitamina D-3 1.000-10.000 UI/Kg
- \bullet
- Vitamina E 10-60 mg/Kg
- \bullet
- Sulfato cúprico (CuSO_{4} 5H_{2}O) 5-20 mg/Kg
Compuestos biológicos
\bulletBeauveria bassiana CECT 20480
c.s.p. 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
7. Formulación según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6 para la utilización con insecticidas
químicos, que se ha observado que son compatibles, ejemplos de los
cuales son Orytis, Dicarzol®, Lannate® y Canfidor® en un programa
de gestión de plagas integrado.
8. Formulación según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6 para la utilización con el fungicida químico
Previcur® a la mitad de la concentración máxima recomendada por el
fabricante, en un programa de gestión de plagas integrado.
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