ES2293085T3 - Agente de control biologico y formulaciones. - Google Patents
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Abstract
. Formulación líquida que tiene su composición cuantitativa como se indica a continuación: . Aceites vegetales 94 96% en peso . Componentes inertes 6 4% en peso . Una mezcla de: Trichoderma CECT 20443 2x103 2x109 conidio/ml Trichoderma CECT 20444 2x103 2x109 conidio/ml Trichoderma CECT 20445 2x103 2x109 conidio/ml Trichoderma CECT 20447 2x103 2x109 conidio/ml y Trichoderma CECT 20481 2x103 2x109 conidio/ml
Description
Agente de control biológico y formulaciones.
La presente invención se refiere a formulaciones
líquidas y sólidas basadas en hongos filamentosos
Trichoderma, como agentes de control biológico, resistentes
a los fungicidas e insecticidas comerciales, para enfermedades de
plantas y cultivares ocasionadas por hongos fitopatogénicos. La
invención describe un procedimiento para controlar la transmisión
de enfermedades de plantas y cultivares ocasionadas principalmente
por hongos fitopatogénicos, y procedimientos para estimular el
crecimiento de plantas y cultivares.
Uno de los mayores retos del nuevo milenio es la
mejora de la calidad de vida con una nutrición sana y variada,
considerando el impacto de las duras condiciones medioambientales
además de las pérdidas debidas a plagas que conllevan la escasez de
alimentos en el mundo. La destrucción de las cosechas por hongos y
plagas fitopatogénicas son un posible problema global importante y
causa grandes pérdidas de producción.
Estas consideraciones económicas y humanas, así
como las nuevas tecnologías científicas, han hecho necesario el
desarrollo de procedimientos de control directo y preventivo,
importantes para el desarrollo agrícola futuro. En este periodo,
para detener o controlar las enfermedades se han desarrollado
algunas estrategias, cuyos tratamientos químicos han sido muy
útiles para erradicar y controlar las enfermedades, la mayoría de
ellas ocasionadas por hongos patogénicos en los cultivares,
cosechas o semillas. Sin embargo, la utilización extensiva de
fungicidas químicos ha incrementado la incidencia de la resistencia
de las poblaciones patogénicas, forzando el incremento de las
cantidades de pesticidas químicos para combatirlas.
La utilización extensiva de pesticidas químicos
contra el medioambiente, debido a su alta toxicidad, ha expuesto a
la población humana a niveles crecientes. Algunos de ellos son
potencialmente carcinógenos y responsables del 98% de los tumores
producidos por pesticidas. De esta manera, en la actualidad algunos
gobiernos han adoptado una nueva política legislativa para limitar
el uso, y eliminar gradualmente los más tóxicos (bromuro de metilo
y derivados). De esta manera, las inversiones y estudios que apuntan
hacia nuevas estrategias de control patogénico que eliminan o
reducen las cantidades de pesticidas, son en la actualidad más que
necesarias, esenciales.
El control biológico como una nueva estrategia
de control de enfermedades de los diferentes cultivares se inició
hace muchos años, y en la actualidad está alcanzando su propósito
final. En realidad, el control biológico de plagas utilizando
compuestos antifúngicos producidos por hongos u otros
microorganismos, es ahora un procedimiento normal.
Como un procedimiento sistemático, la aplicación
de agentes de control biológico en enfermedades de plantas, empieza
con un muestreo adecuado de cepas salvajes que pueden ser utilizadas
de una manera específica contra los diferentes agentes patógenos.
Esto podría ser respaldado con un muestreo de cepas productoras de
actividades antibióticas o enzimáticas que constituyen el efecto
antagonista.
La búsqueda de formulaciones, medios de cultivo
o sustratos baratos para obtener mejores producciones, es otra
etapa necesaria para la mayor eficacia del control biológico. La
expresión "control biológico" se utilizó inicialmente para
definir "el control de la población patogénica mediante sus
enemigos naturales". En la actualidad, el significado que puede
tomar el control biológico en los nuevos desarrollos
biotecnológicos, se ha enunciado como: "se establece el control
biológico como la utilización de organismos, genes o productos
génicos naturales o modificados, para reducir los organismos no
deseados y para proteger los organismos útiles para la humanidad,
tal como los cultivares, animales y microorganismos útiles". Tras
una discusión acerca de qué podría considerarse como control
biológico, se podría definir como la utilización de microorganismos
vivos o sus productos para eliminar las actividades perjudiciales
de otros organismos, en este caso, plagas o patógenos de plantas. Se
realiza utilizando agentes de control.
En la agricultura, el objetivo principal del
control biológico es reducir las plagas y enfermedades de plantas
mediante tres objetivos principales: a) la reducción de inóculo de
patógeno reduciendo su viabilidad entre cosechas b) la reducción de
infección del huésped por el patógeno y c) la reducción de los daños
ocasionados por el patógeno.
El control biológico no elimina la enfermedad,
sino que mantiene el patógeno en un equilibrio natural y este es el
procedimiento en el que debe aplicarse. Mientras que los
tratamientos químicos erradican el patógeno y sus enemigos
naturales, si reaparece, el daño causado es mayor. Los agentes de
control biológico se seleccionan a partir de sistemas naturales que
normalmente tienen una alta especificidad con relación a los
huéspedes. El control biológico puede ser duradero, barato e
inocuo, además, puede ser utilizado en diferentes prácticas
agrícolas siendo su aplicación provechosa para todo tipo de
cultivos.
Hay una enorme diversidad de agentes de control
biológico, tales como antagonistas: virus, bacterias, hongos,
protozoos e incluso nemátodos. Entre todos ellos, los micofungicidas
son los más utilizados en fitopatología, más de la mitad de ellos
son miembros del grupo Hifomicetos, en el que destaca la
Trichoderma.
\newpage
Las especies del género Trichoderma son
un modelo excepcional de productores fungicidas, están ampliamente
distribuidas en todos los ecosistemas, son fáciles de aislar y
cultivar, con un crecimiento rápido en diferentes suelos y
sustratos, son micoparásitos, producen antibiótico y son buenos
competidores por nichos y nutrientes.
El género Trichoderma es un Deuteromiceto
perteneciente a los Hifomicetos, caracterizado por su rápido
crecimiento y conidio verde en masa. Está caracterizado por
presentar conidióforos muy ramificados (hifas especializadas para
el desarrollo conidial).
La utilización de cepas de Trichoderma en
diferentes estrategias de control biológico de hongos
fitopatogénicos, ha sido realizada satisfactoriamente durante
varias décadas, a pesar de las eficaces formulaciones comerciales
disponibles basadas en estos hongos, sólo se ha hecho posible
recientemente. El documento WO 97/16974 da a conocer cepas de
Trichoderma harzianum y T. viride para el
control de los hongos patogénicos en plantas. Estas cepas son
activas contra Fusarium oxysporum.
La utilización de cepas de Trichoderma ha
posibilitado el control de una gran variedad de plantas y cultivares
patógenos. La mayoría de las cepas de Trichoderma, con
actividad antagonista, muestran una alta especificidad. Por otra
parte, una cepa de Trichoderma podría ser o no un agente de
control biológico eficaz, dependiendo del papel en el modelo
patogénico.
Los procedimientos de control biológico
sugeridos en Trichoderma son: competencia, antibiosis y
micoparasistismo.
La presencia del género Trichoderma en
suelos naturales y agrícolas en todo el mundo, es una prueba de que
es un competidor eficaz para nichos y nutrientes.
La actividad antibiótica de Trichoderma
fue anunciada en 1934. La Trichoderma produce varios
metabolitos, especialmente antibiótico, que restringen el
crecimiento de organismos patogénicos. Estos antibióticos penetran
en las células patógenas causando la inhibición por toxicidad
química. La Trichodermina y la Suzukamicina son dos ejemplos bien
caracterizados con propiedades antibacterianas y antifúngicas.
La primera descripción del descubrimiento de
micoparasitismos de Trichoderma en Rhizoctonia fue en
1932. Se observó que el mecanismo más común es el arrollamiento de
las hifas antagonistas alrededor del patógeno, penetrando y
creciendo en el interior de la célula. También, se ha demostrado que
el contacto entre ambos organismos no es preciso. En ambos casos,
se han detectado enzimas con actividades hidrolíticas sobre la pared
celular del patógeno. Estas enzimas producidas por la
Trichoderma son principalmente \beta-1,3
glucanasas, \beta-1,6 glucanasas, quitinasas,
celulasas y proteasas.
La Trichoderma debe pasar a través de la
pared celular del parásito para alimentarse de su contenido
intracelular. Además de la función de barrera física, la pared de
la célula juega los papeles siguientes: es responsable de la forma
celular de los hongos, permite la integridad osmótica, actúa como un
filtro para la secreción e incorporación de sustancias y es una
reserva de carbono, capaz de movilizar los componentes adecuados en
situaciones de déficit nutricional.
La composición química de la pared celular del
hongo es relativamente simple: carbohidratos, proteínas, lípidos,
pigmentos y sales minerales, en orden decreciente de abundancia. Los
carbohidratos en forma de homo o heteropolisacáridos constituyen
más del 80% del peso en seco de la pared. Estos polisacáridos pueden
ser de dos tipos, estructural de la pared y soluble en agua, con
apariencia amorfa y granular, sin una aparente organización. Los
polisacáridos fibrilares son quitina y los
\beta-glucanos, incluyendo celulosa.
Debido a que la quitina y los
\beta-glucanos representan la mayoría de los
polímeros de la pared, universales para todos los grupos de hongos,
las quitinasas y las \beta-glucanasas son las
principales enzimas en la acción micoparasítica.
Para aplicar satisfactoriamente el control
biológico con estos microorganismos, se deben considerar tres
factores fundamentales: a) la Trichoderma puede utilizar
simultáneamente varios mecanismos de acción; b) no todos los
aislamientos de la misma especie Trichoderma tienen la misma
capacidad antagonista cuando son utilizadas como agentes de control
biológico; c) el tratamiento de campo del campo con pesticidas
selectivos, vapor, solarización y otros procedimientos de
esterilización, pueden modificar el ecosistema para la proliferación
de Trichoderma.
Una vez que el hongo de control biológico ha
demostrado su capacidad para controlar la enfermedad ocasionada por
un patógeno, en base a ensayos de laboratorio, en invernadero y en
campo, el mayor problema es la producción de biomasa. Pueden
utilizarse fermentaciones en medio líquido, semisólido o sólido.
La fermentación en estado sólido se define como
un procedimiento fermentativo que ocurre en ausencia parcial o
total de agua libre, utilizando sustratos naturales e inertes como
soporte sólido.
El éxito en la producción de biomasa de
Trichoderma, pasa por el desarrollo de un medio adecuado, que
puede ser barato y un subproducto agrícola razonablemente fácil con
un equilibrio de nutrientes adecuado. La utilización de biomasa
vegetal en procedimientos fermentativos, tal como recursos
renovables y material industrial sin refinar, representa uno de los
aspectos de interés principal en biotecnología. Dentro de la
biomasa vegetal, el material agrícola de desecho constituye el
material lignocelulósico más adecuado por el bajo costo y la fácil
disponibilidad. Estos sustratos incluyen molasas, harinas de
semillas (algodón, semilla de soja, etcétera), paja, trigo, maíz,
cebada, etcétera.
Al final de una fermentación líquida o sólida,
la biomasa es recogida junto con el sustrato, que proporcionará una
protección física y una base nutritiva, que ayudará a la
supervivencia en las condiciones de suelo fúngico. En una
fermentación sólida, se obtienen una gran cantidad de enzimas
hidrolíticas y conidio con pared gruesa y reservas más
nutritivas.
Tras obtener una biomasa adecuada, llega la
etapa de la formulación. Los problemas a considerar en esta etapa
son importantes al estar relacionados con la producción de biomasa.
Una formulación de control biológico para aplicación en la
agricultura, debe tener varias características, tal como facilidad
de preparación y aplicación, estabilidad, supervivencia, abundante
conidio viable y bajo costo.
Varios autores sugieren que la adecuada
combinación de enzimas con modelos de acción complementarios, son
capaces de incrementar la actividad antifúngica.
También se ha estudiado la sinergia entre las
enzimas hidrolíticas y otros agentes antifúngicos. La utilización
de antibiótico purificado producido por la Trichoderma
harzianum junto con enzimas hidrolíticas, produjeron un efecto
sinérgico en la actividad antifúngica de la T. harzianum
contra Botritys cinerea. Se demostró una sinergia
entre las mezclas de consorcios fúngicos comerciales utilizados
contra B. cinerea, y enzimas quitinolíticas y glucanolíticas
de la T. harzianum.
La gestión de plagas integrada (IPM) permite
controlar patógenos tales como los agentes Botritys cinerea,
Sclerotinia Sclerotiorum y Cladosporium fulvum
responsables de producir las enfermedades de las hojas del tomate y
la calabaza, al mismo tiempo que reducen al 60% la cantidad de los
pesticidas requeridos. Los mayores niveles de control de B.
cinerea en vides se obtienen con la aplicación conjunta de T.
harzianum T39 y fungicidas químicos. También, se obtuvieron
mejores niveles de control de patógenos de césped con procedimientos
cooperativos utilizando la cepa 1245-22 de T.
harzianum, como un buen competidor en la rizosfera. Todos estos
datos apoyan el concepto de búsqueda y selección de cepas naturales
resistentes a los pesticidas, para su utilización en la gestión de
plagas integrada.
Es necesario considerar los tratamientos
químicos. La aplicación de pesticidas incompatibles puede llevar a
una reducción importante del inóculo e incluso puede causar su total
destrucción. La utilización de algunas sustancias activas debe
restringirse, incluso para tratamientos de hojas, ya que una parte
de la solución pulverizada sobre las hojas cae directamente al
suelo, otra parte es drenada por el lavado o tras la caída de las
hojas. Los fungicidas más tóxicos son benzimidazol, tiofanatos,
ditianona, triadimenol y triforina.
Los fungicidas tales como captan, procimidona y
vinclozolín no inhiben el crecimiento de Trichoderma. Otros
autores han utilizado ventajosamente la resistencia de T.
harzianum y T. viride al captan, para controlar la
Verticilium dahliae y Sclerotium rolfsii en el tomate,
respectivamente.
La utilización de microorganismos como
promotores del crecimiento en plantas es un fenómeno muy conocido,
extendido a bacterias (PGPR). En años recientes, numerosas
publicaciones científicas han demostrado la potencial capacidad de
crecimiento en hongos, enfatizando en especies pertenecientes al
género Trichoderma.
Esta capacidad de incrementar el crecimiento de
la planta con la aplicación de especies del género
Trichoderma para liberar suelos patógenos, ha sido ensayada
en cultivos de pepino, pimienta, tomate y alubias; así como en
plantas ornamentales como las petunias y el crisantemo. Una
disminución del periodo de germinación, incremento del porcentaje
de germinación, diámetro, peso en seco y área de las hojas, así como
un incremento en la altura de las plantas.
En ensayos con remolacha azucarera, sembradas
por medio de la técnica paper-pot, se aplicaron
mediante formulación líquida que contenía conidio de
Trichoderma, dando como resultado un incremento de peso
(14,6%) y del contenido de azúcar en las raíces.
Los factores que condicionan la capacidad de
estimular el crecimiento en las plantas de lechuga por
Trichoderma se dice que son los siguientes: tipo de cultivo,
la cepa de Trichoderma utilizada, la concentración de
inóculo y el procedimiento de aplicación. También, en el control de
patógenos secundarios se ha observado que, la producción de
vitaminas y hormonas en la planta o la conversión de material no
asimilable a otros estados mejor asimilados por las plantas, son
mecanismos importantes para explicar la estimulación o involución
de estas plantas por medio de ciertos microorganismos.
Se ha demostrado que algunas especies de
Trichoderma facilitan el efecto de los hongos micorrízicos,
rizobacterias y bacterias saprofíticas, capaces de colonizar las
raíces y producir beneficios en los cultivos.
Hay diferentes posibilidades de aplicar cepas de
Trichoderma mediante la utilización de conidio, micelio o
clamidosporas, directamente al suelo o en partes aéreas de la
planta; separadamente o por medio de una combinación de los
diferentes iniciadores de colonias. La aplicación directa es menos
eficaz, debido a que las paredes de conidio y micelio son muy
finas, lo que causa que pierdan la viabilidad con el secado. La
aplicación con un portador es utilizada habitualmente en la
agricultura y compuesto por sustancias agronómicamente aceptables
(alginato, caolín, etcétera) puede incrementar considerablemente la
viabilidad y eficacia de estos iniciadores. Los adyuvantes,
emulsionantes, agentes de suspensión, aceites vegetales o minerales,
pueden incrementar la adhesión de los iniciadores e incrementar la
actividad antifúngica contra los patógenos.
Las formulaciones de Trichoderma y los
iniciadores, pueden aplicarse como una preparación líquida o sólida,
incluyendo componentes de ayuda como emulsionantes, productos
resuspensores y agentes adherentes. Las formulaciones sólidas
pueden ser polvo, polvo seco o granular, mientras que las
formulaciones líquidas pueden mostrarse como soluciones acuosas,
soluciones no acuosas, suspensiones, dispersiones o soluciones
altamente concentradas.
La concentración óptima de conidio, micelio o
clamidospora es desde 10^{5} hasta 10^{9} (UFC/ml) en una
formulación líquida.
Finalmente, en la producción industrial de
biofungicidas existen problemas para obtener suficiente biomasa a
niveles comerciales, así como para obtener una calidad reproducible
y la conservación y viabilidad del producto. Es deseable obtener
una cantidad óptima de biomasa en el menor tiempo posible, ya que el
incremento del tiempo de fermentación reduce la viabilidad e
incrementa el riesgo de contaminación.
La invención consiste en una o varias
formulaciones sólidas y/o líquidas para aplicación en suelo u hojas,
que contienen una suspensión de estructuras vegetativas y sexuales
(conidio, esporas, micelio y clamidosporas) de cinco agentes de
control biológico de cepas de la especie Trichoderma,
aislados, caracterizados y depositados en la colección española de
cultivos tipo (CECT): CECT 20443, CECT 20444; CECT 20445; CECT 20447
y CECT 20481.
Las cinco cepas de Trichoderma utilizadas
en esta invención han demostrado un efecto antagonista potencial
contra varios hongos fitopatogénicos responsables de enfermedades de
plantas y cultivares. Algunos ejemplos de especies patogénicas
controladas mediante las cepas de Trichoderma utilizadas son:
Acremonium cucurbitacearum, Botrytis cinerea,
Sclerotinia sclerotiorum, Verticilium dahliae,
Rhizoctonia solani, Phoma betae, Fusarium
oxysporum, Fusarium moniliforme, Thielaviopsis
basicola, Pyricularia oryzae, Collectotrichum
fragariae, Fusicoccum amygdali, Stereum purpureum
y Rosellinia necatrix.
Las formulaciones, incluidas las cinco cepas de
Trichoderma seleccionadas, pueden ser aplicadas como una
preparación líquida o sólida, incluyendo componentes auxiliares
tales como emulsionantes, productos de resuspensión y agentes
adherentes. Las formulaciones sólidas pueden ser polvo, polvo seco o
granular, mientras que las formulaciones líquidas pueden mostrarse
como soluciones acuosas, soluciones no acuosas, suspensiones,
dispersiones o soluciones altamente concentradas.
En estas formulaciones la unión del portador
representa una reserva nutricional para el antagonista así como la
protección necesaria que permite una buena supervivencia de la
colonia en suelo o superficie de planta.
La concentración óptima de conidio, micelio o
clamidospora es de 10^{3} a 10^{9} unidades formadoras de
colonias (UFC/g) en una formulación sólida y de 10^{3} a 10^{9}
(UFC/ml) en una formulación líquida.
También, pueden aplicarse diferentes
formulaciones con las cinco cepas de Trichoderma de esta
invención operando sinergéticamente con los pesticidas químicos
compatibles, en programas de control integral, reduciendo dichos
pesticidas al 50% de las concentraciones recomendadas.
En otros aspectos, la invención proporciona
formulaciones que comprenden las cepas de la especie
Trichoderma CECT 20443, CECT 20444, CECT 20445, CECT 20447 y
CECT 20481 y un portador.
En aspectos adicionales, la invención
proporciona la utilización de las cepas de la especie
Trichoderma CECT 20443, CECT 20444, CECT 20445, CECT 20447 y
CECT 20481, o la utilización de las formulaciones indicadas
anteriormente, como agentes de control biológico, por ejemplo de
plagas en plantas y cultivos; particularmente contra patógenos,
particularmente contra hongos patogénicos seleccionados de entre
Acremonium cucurbitacearum, Botrytis cinerea,
Sclerotinia Sclerotiorum, Verticilium dahliae,
Rizizoctonia solani, Phoma betae, Fusarium
oxysporum, Fusarium moniliforme, Thielaviopsis
basicola, Pyricularia oryzae, Colletotrichum
fragariae, Fusicoccum amygdali, Stereum purpureum
y Rosellinia necatrix.
En aspectos adicionales, la invención
proporciona procedimientos de utilización o la utilización de las
cepas de la especie Trichoderma CECT 20443, CECT 20444, CECT
20445, CECT 20447 y CECT 20481, o formulaciones como las indicadas
anteriormente, en combinación con, o sinergéticamente con,
pesticidas químicos compatibles.
La invención proporciona además un procedimiento
para controlar y tratar enfermedades de caída de plántulas en
cultivares de lechuga, ocasionadas por hongos fitopatogénicos tales
como la especie Sclerotinia, especie Rhizoctonia y
especie Botrytis.
La invención proporciona además un procedimiento
para el control y tratamiento de Dematophora necatrix en
olivos.
La invención proporciona además un procedimiento
para la aplicación de cepas de Trichoderma en el control de
Thielaviopsis basicola en cultivares de ciclamen y flor de
pascua.
Los presentes inventores han dirigido sus
esfuerzos de investigación a aislar varias cepas de
Trichoderma capaces de superar las dificultades expuestas en
los párrafos anteriores, que han culminado con el descubrimiento de
cinco nuevas cepas, bien caracterizadas desde un punto de vista
morfológico, fisiológico, bioquímico y molecular, capaces de crecer
y esporular rápidamente.
Debido a que cada cepa de Trichoderma es
extremadamente específica contra patógenos particulares, la
aplicación de las cinco cepas en una asociación fúngica, en la
misma formulación, incrementa las posibilidades de éxito del
producto bajo condiciones medioambientales y patógenicas diferentes.
Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporcionan
las formulaciones líquidas y sólidas con nutrientes orgánicos e
inorgánicos, así como adyuvante, que contienen las estructuras
vegetativas y reproductivas de las cinco cepas del hongo filamentoso
Trichoderma, objeto de esta patente. Esta invención se
describe detalladamente en las secciones siguientes en esta
descripción.
Las cinco cepas de Trichoderma objeto de
esta patente, fueron aisladas y seleccionadas a partir de muestras
de suelo y huéspedes sanos, de diferentes áreas geográficas,
siguiendo el procedimiento descrito en Elad et al., (1981).
En el laboratorio se obtuvieron cultivos monospóricos.
Las cepas aisladas se conservaron en 25% de
glicerol y se almacenaron a -80ºC. Las cepas se recuperaron
fácilmente en agar patata dextrosa (PDA), agar harina de maíz (CMA)
y agar extracto de malta (MEA).
Las cepas objeto de esta invención se
depositaron en la "Colección Española de Cultivos Tipo" (CECT).
La Tabla 1 muestra el código interno de laboratorio de la cepa,
número CECT asignado y fecha de depósito.
Se estudiaron las características morfológicas
de cultivos PDA, CMA y MEA monoconidiales. Los cultivos fueron
incubados a 25ºC en la oscuridad durante 14 días. Se estudiaron el
micelio, la presencia de clamidosporas (terminal o intermedia),
desarrollo fialídico y conidial en diapositivas de cristal azul
algodón lactofenol para la observación microscópica.
Todas las cepas tienen conidioforas complejas
(hifas especializadas donde ocurre el desarrollo de conidio), con
varias series de ramas en ángulo recto, de esta manera cada conjunto
de ramificaciones tiene una forma piramidal parecida a un pequeño
arbusto. Todas estas características son características de todas
las especies pertenecientes al género Trichoderma.
Se estudió la asimilación de fuentes de carbono
para las cinco cepas. Las fuentes de carbono ensayadas fueron las
siguientes: glucosa (LBGL), ácido láctico (LBAL), ácido cítrico
(LBCA), oxalato de amonio (LBAO) y tartrato de amonio (LBAT).
Se utilizó medio líquido Lynch B
(NH_{4}H_{2}PO_{4} 1 g/l, KCl 0,2 g/l,
MgSO_{4}-7H_{2}O 0,2 g/l,
CuSO_{4}-5H_{2}O 5 mg/l y
ZnSO_{4}-7H_{2}O 10 mg/l), conteniendo 0,05 g/l
de púrpura de bromocresol, que se añadieron con la fuente de
carbono estudiada al 1% (p/v). El pH se ajustó a 6 y el medio fue
alicuotado en 10 ml por tubo. Todas las fuentes de carbono fueron
esterilizadas. Se utilizaron placas agar agua de 0,5 cm al 2% de
esta cepa como inóculo. Todos los experimentos se realizaron por
triplicado. Los resultados fueron observados tras la incubación en
la oscuridad a 25ºC durante 14 días.
Sólo la cepa C7 es capaz de asimilar las fuentes
de carbono del tipo oxalato de amonio y tartrato de amonio.
Se estudió la asimilación de fuentes de
nitrógeno de las cinco cepas. Las fuentes de nitrógeno ensayadas
fueron las siguientes: creatina (LACR), oxalato de amonio (LAAO),
nitrato de sodio (LANI), glicina (LAGY) y urea (LAU).
Se utilizó un medio líquido Lynch A
(KH_{2}PO_{4} 1 g/l, KCl 0,5 g/l,
MgSO_{4}-7H_{2}O 0,2 g/l,
CaCl_{2}-2H_{2}O 0,1 g/l y sucrosa 10 g/l),
conteniendo 0,05 g/l púrpura de bromocresol, que se añadieron con
las fuentes de nitrógeno estudiadas al 0,2% (p/v). El pH se ajustó
a 6 y el medio se alicuotó en 10 ml por tubo. Todas las fuentes de
nitrógeno fueron esterilizadas. Se utilizaron placas de
agua-agar de 0,5 cm al 2% de esta cepa como
inóculo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Los
resultados se observaron tras la incubación en la oscuridad a 25ºC
durante 14 días.
Todas las cepas son capaces de asimilar las
diferentes fuentes de nitrógeno ensayadas, excepto la A3 que es
incapaz de metabolizar el nitrato de sodio como fuente de
nitrógeno.
Se estudió la caracterización de cultivo para
todas las cepas de Trichoderma, en los medios de cultivo
siguientes: agua-agar (WA), agar extracto de malta
(MEA), agar harina de trigo (CMA), agar CZNH_{4}, agar nitrato
glicerol (G25N), agar nitrito sacarosa (NSA).
Se inocularon las placas con los medios
indicados anteriormente con placas de agua-agar de
0,5 cm al 2% de cada cepa, se incubaron en la oscuridad a 25ºC
durante 14 días. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Los resultados se muestran en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió la influencia del sulfato cúprico,
sulfato de cinc, violeta cristal, en las cinco cepas de
Trichoderma. Se ensayaron las concentraciones
siguientes:
- \bullet
- Cristal Violeta: 0,2 g/l y 0,04 g/l
- \bullet
- Sulfato cúprico: 0,5 g/l
- \bullet
- Sulfato de cinc: 3 g/l
Las soluciones de estos agentes químicos, se
esterilizaron por filtración (Millipore HA de 0,45 \mum de
diámetro) y se añadieron a matraces que contenían 250 ml de medio
agar Lynch B esterilizado. Los medios con diferentes concentraciones
fueron dispensados en placas de Petri y una vez solidificados se
inocularon con placas de agua-agar al 2% de las
diferentes cepas de Trichoderma. Los experimentos se
realizaron por triplicado. Las placas se observaron después de 24,
48 horas y 14 días de incubación en la oscuridad a 25ºC.
Ninguna de las cinco cepas experimentó
crecimiento en el medio Lynch B suplementado con sulfato
cúprico.
Ninguna de las cinco cepas experimentó
crecimiento en el medio Lynch B suplementado con cristal violeta en
diferentes concentraciones.
Sólo las cepas A3, F2 y T18 experimentaron
crecimiento en el medio Lynch B suplementado con sulfato de cinc en
las cinco concentraciones ensayadas. Los microorganismos crecieron
formando colonias suaves y transparentes, sin micelio aéreo y con
ausencia de esporulación o producción de pigmento. La Tabla 5
muestra los diámetros de las colonias en medio Lynch B con 3 g/l de
sulfato de cinc, tras 24, 48 y 14 días de incubación en la oscuridad
a 25ºC.
Se estudiaron la hidrólisis de gelatina y la
esporulación de las cinco cepas en un medio rico en gelatina, tras
10 días de incubación.
Medio rico en gelatina (Sucrosa 10 g/l, gelatina
120 g, CuSO_{4}-5H_{2}O 5 mg/l y
ZnSO_{4}-7H_{2}O 10 mg/l, solución stock A 50
ml/l, solución stock C 50 ml). Composición de la solución stock A:
NaNO_{3} 40 g/l, KCL 10 g/l, MgSO_{4}-7H_{2}O
10 g/l, FeSO_{4}-7H_{2}O 0,2 g/l y solución
stock C: K_{2}HPO_{4} 20 g/l).
Los medios fueron esterilizados y dispensados en
matraces, y después fueron inoculados con placas de
agua-agar de 0,5 cm al 2%, de las cinco cepas. Las
placas resultantes fueron incubadas en la oscuridad a 25ºC durante
10 días. Una vez concluido el tiempo de incubación, los matraces se
almacenaron a 4ºC durante una hora y a continuación los resultados
se escribieron como se muestra a continuación.
La Tabla 6 muestra los resultados tras 10 días
de incubación en medio de gelatina para las cinco cepas.
\bullet La cepa A3 produce una hidrólisis de
gelatina positiva, mostrando una clara licuefacción del medio.
\bullet La cepa B5 produce una hidrólisis muy
débil (ligera licuefacción).
\bullet La cepa B7 produce una hidrólisis muy
débil (ligera licuefacción).
\bullet La cepa F2 produce una hidrólisis de
gelatina positiva, mostrando una clara licuefacción del medio.
\bullet La cepa T18 produce una hidrólisis de
gelatina positiva, mostrando una clara licuefacción del medio.
Se estudió la hidrólisis de esculina de las
cinco cepas. Las placas de Petri con el medio agar esculina fueron
inoculadas con placas de agua-agar de 0.5 cm al 2%
de las cepas de Trichoderma. Los cultivos fueron incubados
en la oscuridad a 25ºC durante 10 días. El experimento se realizó
por triplicado.
La reacción de hidrólisis es considerada
positiva cuando aparece el color negro en el reverso de las placas.
La hidrólisis libera glucosa y esculetina (sustancia que al
interaccionar con iones férricos produce una precipitación negra
que tiñe el medio).
Todas las cepas mostraron una reacción de
hidrólisis de esculina positiva. Sin embargo, se observaron
diferencias en el proceso de esporulación, siendo muy débil en la
cepa A3, positivo en la cepa F2 y fuertemente positivo en B5, C7 y
T18.
Se estudiaron las hidrólisis de lipasas para las
cinco cepas. El medio basal TWH (peptona micológica 10 g/l, NaCl 5
g/l, CaCl_{2}-2H_{2}O 0,1 g) que contenía
púrpura de bromocresol 0,025 g/l, agar al 2% (p/v) y 100 ml de
solución Tween 80 al 10% (v/v). El pH se ajustó a 6 y se sometió a
autoclave. El medio de suspensión se dispensó en placas de Petri,
que fueron inoculadas con placas de agua-agar de 0,5
cm al 2% de cepas de Trichoderma. Los cultivos fueron
incubados en la oscuridad a 25ºC durante 14 días. El experimento se
realizó por triplicado.
La reacción de hidrólisis se considera como
positiva cuando el medio se vuelve azul, apareciendo también un
anillo blanco cristalino bajo las colonias. La Tabla 8 muestra los
resultados después de 14 días de incubación.
\bullet Sólo las cepas F2 y T18 muestran una
reacción positiva en el ensayo de hidrólisis de lipasa.
\bullet Sólo las cepas F2 y T18 esporularon en
el medio TWH.
La capacidad de crecimiento en un medio que
contiene urea fue ensayada para las cinco cepas. Para llevar a cabo
el ensayo se preparó un medio Lynch B suplementado con 2% (p/v) de
urea, 1% (p/v) glucosa, 2% (p/v) agar y 0,05 g/l de púrpura de
bromocresol. El medio fue esterilizado y dispensado en placas de
Petri. El mismo medio sin urea fue utilizado como control. Las
placas fueron inoculadas con placas de agua-agar de
0,5 cm de diámetro (al 2%) de las cepas de Trichoderma. Las
placas de Petri fueron incubadas en la oscuridad a 25ºC durante 14
días. El experimento se realizó por triplicado.
\bullet Todas las cepas mostraron una reacción
positiva en el ensayo de ureasa.
Se estudió la capacidad de las cinco cepas de
Trichoderma para crecer en un medio con valores extremos de
pH, en medio ácido (pH 2), así como en medio básico (pH 10). El
experimento se realizó utilizando un medio CZ pH 2 (solución stock
CZ A 50 ml/l, K_{2}HPO_{4} 1 g/l, sucrosa 30 g/l, ácido cítrico
10,5 g/l, CuSO_{4}-5H_{2}O 5 mg/l y
ZnSO_{4}-7H_{2}O 10 mg/l) y CZ pH 10 (solución
de stock CZ A 50 ml/l, glicina 3,75 g/l, K_{2}HPO_{4} 0,2 g/l,
sucrosa 30 g/l, CuSO_{4}-5H_{2}O 5 mg/l y
ZnSO_{4}-7H_{2}O 10 mg/l) ambos medios
complementados con 0,05 g/l de púrpura de bromocresol. Composición
de la solución de stock A: NaNO_{3} 40 g/l, KCl 10 g/l,
MgSO_{4}-7H_{2}O 10 g/l,
FeSO_{4}-7H_{2}O 0,2 g/l.
No se observó esporulación para ninguno de los
pHs ensayados. Sin embargo, se observó un crecimiento inclinado
superficial positivo.
Con el objetivo de ensayar la tolerancia al
calor del conidio de las cinco cepas de Trichoderma, se
realizó un ensayo calentando a 75ºC durante 5 minutos. Los
cultivos en MEA y PDA crecieron durante 8 días. Después de la
esporulación, se añadieron 5 ml de una solución Tween 80 al 0,2%
(v/v) esterilizada. Las placas de Petri se agitaron ligeramente
ayudando a la difusión conidial. Al mismo tiempo, se prepararon
tubos de ensayo añadiendo 1 ml de solución Tween 80 al 0,2% (v/v) y
se sometió a autoclave. Una vez enfriados, los tubos se calentaron
en un baño de agua a 75ºC durante 30 minutos, para estabilizar la
temperatura. Cada tubo fue inoculado con 100 \mul de suspensión
conidial y se mantuvo durante 5 minutos adicionales a 75ºC en un
baño de agua. Se determinó la supervivencia conidial después de
todo este procedimiento raspando las placas de MEA o PDA. Las
placas de Petri se incubaron en la oscuridad a 25ºC durante 7 días.
El experimento se realizó por sextuplicado.
Se observó germinación conidial para todas las
cepas después del tratamiento térmico a 75ºC durante 5 minutos.
El sistema API-ZYM (Biomérieux
S.A., Marcy-l'Etoile, Francia) es un kit
semicuantitativo para la detección de actividad enzimática, que
permite una rápida detección de hasta 19 actividades enzimáticas, a
partir de pequeñas cantidad de muestra. Las tiras
API-ZYM están compuestas por 20 microtubos que
contienen un tampón con un sustrato enzimático.
Se estudiaron las siguientes actividades
enzimáticas: fosfatasa alcalina, esterasa, esterasa lipasa, lipasa,
leucina arilamidasa, valina arilamidasa, cistina arilamidasa,
tripsina, \alpha-quimotripsina, fosfatasa ácida,
naftol-AS-BI-fosfohidrolasa,
\alpha-galactosidasa,
\beta-galactosidasa,
\beta-glucuronidasa,
\alpha-glucosidasa,
\beta-glucosidasa,
N-acetil-\beta-glucosaminidasa,
\alpha-manosidasa y
\alpha-fucosidasa.
Las muestras inoculadas en las tiras
API-ZYM fueron los sobrenadantes de los cultivos de
Trichoderma (cinco cepas) cultivados en la oscuridad, a 25ºC
durante 9 días en medio GYM.
La lectura de las tiras, se valoró de 0 a 2. La
Tabla 12 muestra los resultados del ensayo de actividad
enzimática.
El valor 0 corresponde a una reacción negativa
(incoloro), el valor 2 a una reacción de máxima intensidad
(violeta, naranja, azul o marrón, dependiendo de la actividad
enzimática) y el valor 1 corresponde a una reacción intermedia.
Se determinaron las siguientes actividades
enzimáticas extracelulares:
\beta-1,3-glucanasas,
\beta-1,6-glucanasas,
\beta-1,4-endoglucanasas (CMCasas)
y exoquitinasas para las cinco cepas de Trichoderma
cultivadas en medios GYM, GYM-CMC y
LB-CMC. (GYM: glucosa 10 g/l,
NH_{4}H_{2}PO_{4} 1 g/l, KCl 0,2 g/l,
MgSO_{4}-7H_{2}O 0,2 g/l,
CuSO_{4}-5H_{2}O 5 mg/l y
ZnSO_{4}-7H_{2}O 10 mg/l, extracto de levadura 5
g; GYM-CMC es una modificación del medio GYM,
remplazando la glucosa por carboximetilcelulosa (CMC, Sigma
viscosidad media) al 1%); LB-CMC
(NH_{4}H_{2}PO_{4} 1 g/l, KCl 0,2 g/l,
MgSO_{4}-7H_{2}O 0,2 g/l,
CuSO_{4}-5H_{2}O 5 mg/l y
ZnSO_{4}-H_{2}O 10 mg/l, carboximetilcelulosa al
1%), en la oscuridad a 25ºC durante 9 días sin agitación.
Se determina a 37ºC, en un reacción que contiene
0,2 ml de solución Laminarin
(\beta-1,3-glucano procedente de
la alga roja Laminaria hyperborea, Sigma) al 0,5% (en tampón
acético/acetato 100 mM pH 5,2) y 0,1 ml de la solución enzimática
diluida adecuadamente. La mezcla de la reacción es incubada durante
una hora y la reacción se detiene calentándola a 100ºC durante 7
minutos.
La concentración de azúcar se determina en una
mezcla de reacción de 0,5 ml por medio del procedimiento de Somogyi
(1952) y Nelson (1957), utilizando glucosa entre 0 mg/ml y 1 mg/ml
como estándar.
Una unidad de actividad enzimática de
\beta-1,3-glucanasa se define como
la cantidad de enzima capaz de producir un micromol de equivalentes
de glucosa por minuto en las condiciones de ensayo.
La determinación de azúcar se realiza como
sigue: una solución de 0,15 ml de Somogyi I:Somogyi II (4:1) es
añadida a 0,15 ml de la muestra. La mezcla se hierve durante 10
minutos y se enfría en hielo, se añaden 0,15 ml de una solución
Nelson y se agita fuertemente para ayudar a la eliminación de
CO_{2}. Finalmente, la mezcla es diluida en 1,5 ml de agua
destilada y se lee la absorbencia a 540 nm en un luminómetro de
lectura de microplaca (Elx 800, Bio-Tek
Instruments, Inc).
Se utilizaron las soluciones siguientes:
Solución Somogyi I: 15 g de potasio sodio
tartrato y 30 g de anhidro Na_{2}CO_{3} se diluyen en 300 ml de
agua destilada. Posteriormente, se añaden 20 g de NaHCO_{3}. En un
tubo diferente se diluyen 180 g de anhidro Na_{2}SO_{4} en 500
ml de agua destilada calentando sin llegar a hervir para eliminar el
aire formado. Una vez enfriada esta última solución es añadida a la
primera y el volumen se incrementa hasta 1 litro con agua
destilada. La mezcla final se conserva a temperatura ambiente.
Solución Somogyi II: 2 g de
CuSO_{4}-5H_{2}O y 18 g de anhidro
Na_{2}SO_{4} se disuelven en 100 ml de agua destilada. El
reactivo se conserva a temperatura ambiente.
Solución Nelson: 12,5 g de molibdato de
amonio-4H_{2}O se disuelven en 225 ml de agua
bidestilada, posteriormente se añadieron 10,5 ml de H_{2}SO_{4}
concentrado con agitación. Se diluyen 1,5 arsenato de sodio en 12,5
ml de agua bidestilada y se mezcla con la primera mezcla. Esta
mezcla se protege de la luz a temperatura ambiente tras mantenerla
por lo menos 48 horas a 37ºC.
Los resultados de la actividad enzimática de la
\beta-1,3-glucanasa (IU/ml)
correspondientes a las cinco cepas de Trichoderma se
muestran en la Tabla 13 para tres diferentes medios de cultivo (GYM,
GYM-CMC y LB-CMC).
La actividad
\beta-1,6-glucanasa se determina a
37ºC, los contenidos de la mezcla de reacción son: 0,2 ml de una
solución Pustulan al 0,5%
(\beta-1,6-glucan de la
Umbillicaria papulosa, Calbiochem, USA) (en tampón de
acetato de potasio 50 mM, pH 5,5) y 0,1 ml de una solución
enzimática diluida adecuadamente. La mezcla se incuba durante una
hora y la reacción se detiene calentando a 100ºC durante 7 minutos.
Finalmente la concentración de azúcares se determina en 0,15 ml de
la mezcla siguiendo el procedimiento Somogyi-Nelson
(descrito anteriormente), utilizando glucosa entre 0 mg/ml y 1 mg/ml
como estándar.
Una unidad de actividad enzimática de
\beta-1,6-glucanasa se define como
la cantidad de enzima capaz de producir un micromol de equivalentes
de glucosa por minuto en las condiciones de ensayo.
Los resultados de la actividad enzimática de
\beta-1,6-glucanasa (IU/ml)
correspondientes a las cinco cepas de Trichoderma se
muestran en la Tabla 14 para tres diferentes medios de cultivo (GYM,
GYM-CMC y LB-CMC).
En las Figuras: 3T y E1 son dos cepas de
Trichoderma utilizadas como control interno.
La actividad se determina a 37ºC, los contenidos
de la mezcla de reacción son: 0,2 ml de carboximetilcelulosa
(solución al 0,5% en tampón de acetato de potasio 50 mM pH 5,5) y
0,1 ml de una solución enzimática diluida adecuadamente. La mezcla
se incuba durante una hora y la reacción se detiene calentando a
100ºC durante 7 minutos. Finalmente, se determina la concentración
de azúcares en 0,15 ml de la mezcla siguiendo el procedimiento
Somogyi-Nelson (descrito anteriormente), utilizando
glucosa entre 0 mg/ml y 1 mg/ml como estándar.
Una unidad de actividad enzimática de
\beta-1,4-endoglucanasa se define
como la cantidad de enzima capaz de producir un micromol de
equivalentes de glucosa por minuto en condiciones de ensayo.
Los resultados de la actividad enzimática de
\beta-1,4-endoglucanasa (IU/ml)
correspondientes a las cinco cepas de Trichoderma se
muestran en la Tabla 15 para tres medios de cultivo diferentes (GYM,
GYM-CMC y LB-CMC).
Esta enzima hidroliza las unidades de monómero
de la quitina desde un extremo. Se calcula midiendo la liberación
de nitrofenol de
p-nitrofenil-\beta-D-N-acetilglucosaminida
(Sigma).
Se prepara la mezcla de reacción que contiene
0,05 ml de una solución de
p-nitrofenil-\beta-D-N-acetilglucosaminidasa
(0,3 mg/ml de tampón de fosfato de potasio KHPO_{4} 50 mM, pH
6,7) y 0,03 ml de la solución enzimática diluida adecuadamente. La
placa es incubada durante 15 minutos a 50ºC y la reacción se detiene
añadiendo 0,05 ml de Na_{2}CO_{3} 0,4 M. La evaluación se
realiza midiendo la absorbencia utilizando un luminómetro de 96
pocillos a 410 nm. La actividad enzimática viene dada por: A =
Absorbencia X factor de dilución.
La Tabla 16 muestra los resultados de la
actividad enzimática exoquitinasa correspondientes a las cinco cepas
de Trichoderma en medios de cultivo GYM,
GYM-CMC y LB-CMC.
Las cepas de Trichoderma objeto de la
presente patente, son aislamientos naturales, sin adiciones o
borrados en el ADN, cuyos genomas no han sido modificados. Sin
embargo, las fuertes similitudes morfológicas existentes entre las
especies pertenecientes al género Trichoderma dificultan
mucho una correcta identificación y la discriminación entre los
agentes de control biológico. Los procedimientos morfológicos (Stasz
et al., 1988) han demostrado que no son suficientemente
resolutivos para; a) Diferenciar y caracterizar las cepas
industriales dirigidas a patentes o comercialización. B) Controlar
la pureza genética de los agentes de control biológico durante los
procedimientos de industrialización. C) Monitorizar la persistencia
de cepas antagonistas una vez que son liberadas en el suelo y
después de varios tratamientos sucesivos. d) La lucha contra el
fraude y afrontar posibles litigios referentes a los derechos
industriales.
Un gran avance fue el desarrollo de técnicas
basadas en el análisis de criterios bioquímicos, también conocidos
como marcadores bioquímicos, que han permitido superar algunos de
los problemas indicados. Sin embargo, estas técnicas presentaban la
desventaja de no ser suficientemente repetitivas y decisivas para la
diferenciación de cepas.
En realidad, para resolver algunas de estas
dificultades, se ha incrementado la utilización de criterios
moleculares basados en el análisis del ácido nucleico (ADN),
buscando diferencias en el genoma fúngico, agentes de control
biológico, que podrían utilizarse como marcadores moleculares
estables y viables, permitiendo la identificación inequívoca de las
cepas en cuestión.
Para observar diferencias en el ADN de estos
organismos, es necesario recurrir a un conjunto de técnicas
adecuadas. De entre todas las técnicas disponibles, una de las más
importantes y con mayor aplicación es la reacción en cadena de
polimerasa (PCR) descrita por Mullis y Fallona (1986).
Una de las potenciales metodologías en la
determinación e identificación es la utilización de marcadores
moleculares a nivel genómico, principalmente aquellos basados en la
amplificación de fragmentos de ADN o genes con una secuencia
específica altamente conservativa, utilizando PCR. En el caso
específico de los hongos filamentosos, y en este caso para las
especies pertenecientes al género Trichoderma, la
codificación genética para el ácido ribonucleico ribosomal (rRNA)
que es altamente conservada, siendo muy similar entre las diferentes
especies relacionadas. Sin embargo, las regiones adyacentes a la
subunidad 5.8s, denominadas regiones ITS (Espaciador transcrito
interno ITS1 e ITS2), permite establecer diferencias importantes y
precisas e nivel infraespecífico. Estas regiones pueden ser
amplificadas mediante cebadores ITS1 e ITS4 (Kuhls et al.,
1996).
Una condición necesaria para la caracterización
molecular de las cepas de Trichoderma es trabajar con
poblaciones genéticamente puras, considerando la gran variabilidad
fenotípica exhibida por los aislamientos fúngicos cultivados en
laboratorio.
La extracción de ADN genómico de las cepas de
Trichoderma se realizó siguiendo el procedimiento propuesto
por Raeder y Broda (1985) con algunas modificaciones. Medio sólido:
para mantener los iniciadores y los cultivos fúngicos, las placas
preparadas con placas agar 0,5 cm de medio PDA (Agar patata
dextrosa, Sigma-USA) se transfirieron al centro de
la placa utilizando un cilindro clonador estéril, proveniente del
otro cultivo fúngico vivo. Posteriormente, las placas se incubaron
en la oscuridad sin agitación (incubador) a 25ºC hasta la total
colonización.
Medio líquido: se utilizan matraces con un caldo
PDB estéril (caldo patata dextrosa, Sigma-USA). Más
tarde se inoculan con una suspensión conidial (10^{6}
conidial/ml) proveniente de cultivos cultivados en medio sólido
(PDA). Los matraces inoculados se colocaron en un incubador agitador
orbital a 25ºC y 250 rpm.
Todos los materiales de vidrio, plástico o papel
fueron esterilizados previamente en autoclave. Se recogió y se
filtró el micelio fúngico a través de un papel de filtro comet, a
continuación se lavó varias veces con agua destilada estéril hasta
la total eliminación de los restos de agar. La biomasa obtenida se
secó utilizando papel de filtro estéril y se distribuyó en viales
criogénicos para la conservación por congelación.
Se deshicieron 50 mg de micelio seco congelado
(secador congelador, Telstar Cryodos) en nitrógeno líquido, en un
baño de hielo. Se recogió el polvo miceliar en un microtubo, y fue
homogeneizado en un tampón de lisis de 0,5 ml (SDS al 0,5%,
Tris-HCl 200 mM, NaCl 250 mM, EDTA 25 mM; a pH 8,5).
Para retirar las proteínas de la fase líquida, se añadieron 350
\mul de fenol (solución fenólica: se preparó según Sambrook et
al., 1989. Se utilizó fenol cristalizado (Merck) saturado con
tampón Tris-HCl 1 M pH 8, en presencia de
8-hidroxiquinoleína y almacenado a 4ºC, en una
botella de vidrio topacio estéril) y 150 \mul de cloroformo
isoamílico (se mezclaron cloroformo y alcohol isoamílico en una
proporción de 24:1 (v/v)), mezclando cuidadosamente. Las mezclas
fueron centrifugadas a 13.000 rpm y 4ºC durante 1 hora. El
sobrenadante fue transferido a un microtubo limpio, se añadieron al
mismo 500 \mug de ARNasa (10 mg/ml de ribonucleasa pancreática
(Sigma) disuelta en tampón pH 7,5 NaCl 15 mM pH 7,5 y
Tris-HCl 10 mM, y se calentó a 100ºC durante 15
minutos para reactivarla y se alicuotó y conservó a -20ºC), más
tarde se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Se añadió y mezcló un
volumen equivalente de cloroformo isoamílico. Después del
centrifugado durante 10 minutos a 13.000 rpm, a temperatura
ambiente, el sobrenadante se transfirió a un microtubo limpio. El
ADN fue precipitado, añadiendo 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3
M pH 5 y 2,5 volúmenes de etanol al 96% (v/v) a 20ºC. El pelet
obtenido mediante la centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos
a 4ºC, fue lavado con etanol frío al 70% (v/v), y secado al aire y
suspendido en 100 ml de tampón TE (10:1) (Tris-HCl
10 mM; EDTA 1 mM, pH 8). Las muestras de ADN genómico se almacenaron
a -20ºC.
La cuantificación del ADN genómico, así como su
pureza se midió por medio de técnicas espectrofotométricas,
siguiendo el protocolo descrito en Sambrook et al. (1989). Se
realizaron diluciones 1/100 de las muestras de ADN genómico con
agua destilada. Más tarde, se registraron respectivamente las
absorbencias a longitudes de onda de \lambda= 260 nm y \lambda
= 280 nm. La pureza del ADN fue confirmada dividiendo ambos valores
de absorbencia, el resultado debe ser superior o igual a 1,8. La
cantidad de ADN genómico contenido en las muestras fue determinada
considerando que cuando la absorbencia a \lambda=260 nm es igual a
1, la cantidad del ADN genómico de doble cadena es de 50 \mug/ml
(Sambrook et al., 1989).
Se utilizaron los siguientes cebadores:
Los cebadores son oligonucleótidos que permiten
la unión de la enzima ADN polimerasa sobre la plantilla de ADN. Son
sintetizados automáticamente por Roche Biochemicals, y se
suministran liofilizados. En el laboratorio de los presentes
inventores fueron resuspendidos en agua MiliQ (Millipore) a una
concentración final de 50 \muM y a continuación fueron
alicuotados en varios tubos y almacenados a -20ºC.
La amplificación PCR de la región ITS fue
realizada utilizando los cebadores ITS1 e ITS4 con un termociclador
Ptc-100 de MJ Research que incorpora una tapa
calentada para evitar evaporaciones, utilizando enzima ADN
polimerasa (Echo Taq Biochemical) y siguiendo el protocolo descrito
en White et al. (1990) modificado. Los reactivos para la
reacción PCR se muestran en la Tabla 17:
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron todos los reactivos siguiendo el
orden mostrado en la Tabla 17 y se mezclaron en microtubos de PCR
de 200 \mul. Todo ello se realizó en condiciones completamente
estériles, así como con hielo para prevenir la desnaturalización
del ADN, el templado de los cebadores y la actividad enzimática
prematura.
La mezcla de reacción se centrifugó durante 5
segundos e incubó en el termociclador durante 5 minutos a 95ºC
(etapa de desnaturalización inicial), a continuación se programaron
40 ciclos siguiendo las etapas siguientes:
\bullet Desnaturalización del ADN de doble
cadena 1 minuto a 95ºC
\bullet Hibridación de los cebadores a la
plantilla de ADN 2 minutos a 55ºC
\bullet Etapa de extensión 3 minutos a
72ºC
Tras 40 ciclos se realizó un ciclo de extensión
final, durante 10 minutos a 72ºC para completar todas las cadenas.
El procedimiento de amplificación duró aproximadamente 4 horas y 30
minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN genómico así como los productos de la
amplificación PCR fueron separados y purificados y se analizó
mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% en tampón TAE
(Tris-acetato 40 mM, EDTA 2 mM, pH 8,3). La
electroforesis se realizó bajo una corriente eléctrica constante (40
voltios) durante 4 horas. Las muestras se cargaron en el gel,
añadiendo ¼ del volumen de la muestra en tampón de carga en gel
(0,25% azul de bromofenol, 0,25% xileno cianol y 25% Ficoll
400).
Al final de la electroforesis los geles se
tintaron con 0,5 \mug/ml de una solución de bromuro de etidio, a
continuación se fotografiaron y analizaron con un sistema
densitométrico fotográfico (BIOPROFIL), con un transiluminador
ultravioleta y una cámara CCD.
Los fragmentos PCR de la región ITS de las cinco
cepas de Trichoderma fueron secuenciados utilizando un
secuenciador de ADN automático (Perkin Elmer/Applied Biosystem). Se
utilizaron 300 ng de plantilla de ADN y 5 pmoles de los cebadores
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron los accesorios y reactivos
habituales del equipo secuenciador de ADN automático Perkin Elmer.
Las secuencias nucleótidas obtenidas fueron alineadas utilizando el
programa de ordenador Meg Align del paquete de software DNASTAR
(DNASTAR, Londres). Se realizaron búsquedas en bases de datos
utilizando el servicio proporcionado por EMBL/Gen Bank (European
Bioinformatics Institute, EBI) para comparar estas secuencias con
otras secuencias pertenecientes al género Trichoderma.
\newpage
La extracción del ADN genómico se realizó
siguiendo los protocolos descritos por Raeder y Broda (1985). Las
producciones obtenidas fueron muy diferentes teniendo en cuenta la
cepa pertinente. Las bajas producciones obtenidas en
Trichoderma confirman que los antagonistas objeto de esta
invención son buenos agentes de control biológico, adaptados para
sobrevivir en diversos ambientes naturales diferentes y tienen
paredes celulares difíciles de romper.
El ADN genómico muy puro obtenido siguiendo el
procedimiento descrito en Raeder y Broda (1985), fue utilizado como
plantilla de ADN para amplificar el gen 5.8s rARN y las regiones
adyacentes ITS1 e ITS2, siguiendo un protocolo PCR utilizando los
cebadores ITS1 e ITS4. Los resultados obtenidos de geles de agarosa
muestran una banda de longitud 600 pb para todos los aislamientos
de Trichoderma estudiados. Dos cepas diferentes de
Trichoderma de nuestra colección de cultivos de laboratorio,
identificadas previamente como Trichoderma harzianum y T.
ressei, fueron utilizadas como comprobadores internos.
La subunidad 5,8s rARN, muestra una elevada
homología con otros hongos filamentosos (cepas 212 y 318), así como
con otras cepas de Trichoderma de Gen Bank. Las diferencias
existentes fueron localizadas en la región ITS1 así como en la
región ITS2. Los fragmentos amplificados obtenidos muestran
diferencias en longitud comprendidas entre los cebadores
ITS1-ITS4 (570 pb a 600 pb).
Se adjuntan las secuencias obtenidas para las
cinco cepas de Trichoderma
\vskip1.000000\baselineskip
Trichoderma CECT 20443 (región ITS)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Trichoderma CECT 20444 (región ITS)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Trichoderma CECT 20445 (región ITS)
Trichoderma CECT 20447 (región ITS)
Trichoderma CECT 20481 (región ITS)
Las secuencias para las cepas de
Trichoderma CECT 20443 y CECT 20444, han resultado ser
idénticas para este gen. Sin embargo, las caracterizaciones
morfológica, fisiológica, bioquímica y molecular permiten tener una
identificación inequívoca de las cinco cepas de Trichoderma
objeto de esta patente.
Se estudió la capacidad antigénica de las cinco
cepas de Trichoderma contra varios patógenos. Estos patógenos
son responsables de diferentes enfermedades en cultivares y de
pérdidas económicas importantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se siguió el protocolo siguiente: una placa agar
de 0,5 cm fue trasladada a 2,5 cm del borde de una placa de Petri,
para cada cepa a ensayar, y las placas se incubaron a 25ºC en la
oscuridad. Las placas de las cepas fúngicas patógenas se cultivaron
hasta que las colonias alcanzaron por lo menos un diámetro de entre
2 cm y 2,5 cm (dependiendo del periodo de incubación del patógeno
que variaba desde pocas horas hasta un par de días). Cuando las
colonias alcanzaron un diámetro aceptable, las placas de Petri
fueron inoculadas con placas agar de 0,5 cm de las cinco cepas de
Trichoderma. Estas placas agar, fueron trasladadas a 3 cm del
punto de inoculación del patógeno. Las placas de Petri fueron
incubadas tal como se ha indicado anteriormente. El ensayo se
realizó por triplicado para cada cepa de Trichoderma.
El porcentaje de inhibición de crecimiento
radial para cada patógeno fue calculado siguiendo Royse y Ries
(1978) utilizando la fórmula: % inhibición radial = [100
x(R1-R2)/R1]. Donde R1 es el máximo diámetro
de la colonia y R2 es el mínimo diámetro, medidos en la zona de
inhibición de crecimiento.
La Tabla 18 muestra los resultados de los
ensayos antagónicos para todas las cepas de Trichoderma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudiaron los principales mecanismos por
medio de los cuales las cepas de Trichoderma limitaron el
crecimiento de otros microorganismos (micoparasitismo, antibiosis y
competición) contra todos los patógenos ensayados. Los resultados
se muestran en la Tabla 19.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se evaluó la compatibilidad de las diferentes
cepas de Trichoderma con varios pesticidas químicos
ampliamente utilizados en la agricultura. Este ensayo permite
aclarar la posibilidad de utilizar pesticidas químicos y el
microorganismo antagónico conjuntamente. La aplicación de una
gestión de plagas integrada, que combina las herramientas normales
para el control químico junto con agentes de control biológico
eficaces, tales como las especies Trichoderma, permite
prolongar el intervalo entre sucesivos tratamientos y también
reducir los residuos.
El éxito de la gestión de plagas integrada
combinando pesticidas y antagonistas ha sido observada en el control
patógeno de suelo fúngico así como contra microorganismos que
atacan tejidos aéreos de plantas.
La supervivencia de los agentes de control
biológico a los tratamientos químicos, les confiere un efecto
complementario y un refuerzo de sus propiedades. Un plan de
tratamiento detallado durante el periodo de desarrollo de la
enfermedad puede realizarse sólo una vez que se ha establecido la
tolerancia al pesticida.
Los principales beneficios de la gestión de
plagas integrada utilizando agentes de control biológico son:
\bullet Una disminución en la utilización de
fungicidas e insecticidas químicos. La consecuencia de esto es que
habrá una menor acumulación de residuos de pesticidas en el
medioambiente.
\bullet Cuanto menor sea la exposición de los
patógenos a los fungicidas químicos menor será la resistencia que
adquieran a los mismos y por lo tanto se reducirá la virulencia y la
severidad de los daños en los cultivos.
El ensayo se realizó utilizando dos diferentes
concentraciones de fungicida: las dosis máxima y mínima aconsejadas
por el fabricante.
El medio de cultivo utilizado fue Lynch B (LB)
con 1% de glucosa como fuente de carbono. Los inóculos utilizados
eran placas agar PDA de cepas de Trichoderma precultivadas
durante dos días a 24ºC. Se prepararon dos conjuntos de placas de
Petri, uno de ellos conteniendo concentraciones diferentes del
fungicida utilizado en el ensayo y el otro sin el mismo (placas
tratadas y placas de control). Las placas de Petri se incubaron a
25ºC en la oscuridad durante 21 días. El experimento se realizó por
triplicado.
El porcentaje de inhibición se midió a los 4, 7
y 21 días. Los resultados se muestran usando la siguiente fórmula:
Porcentaje de inhibición = [(C-T)*100]/C, donde C es
la media de las tres cepas de control y T es la media de las tres
cepas tratadas con cada producto.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó una compatibilidad total de todas las
cepas de Trichoderma con todos los insecticidas después de 7
días (0=crecimiento total).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Considerando todo lo descrito anteriormente
concerniente a la presente invención, se proporciona una formulación
sólida que incluye fuentes de carbono, minerales, elementos traza,
tales como nutrientes orgánicos e inorgánicos, junto con
estructuras reproductivas y vegetativas de las cinco cepas de
Trichoderma (CECT 20443; CECT 20444; CECT 20445; CECT 20447;
CECT 2481).
Cada cepa de Trichoderma, objeto de la
presente patente, es un microorganismo adaptado específicamente a
condiciones abióticas. De hecho, la actividad antagonista de cada
cepa de Trichoderma puede variar, dependiendo del patógeno.
El uso de una asociación fúngica con las cinco cepas de
Trichoderma en una preparación, incrementa el espectro del
tratamiento, contra varios microorganismos que ocasionan diferentes
patologías en plantas (caída de plántulas, colapso por estrés
hídrico, etcétera).
Tal como se ha indicado anteriormente, en la
presente memoria se describen formulaciones líquidas y sólidas para
aplicación en suelo y/o aérea, que contienen estructuras
reproductivas y vegetativas de las cinco cepas de
Trichoderma aisladas y caracterizadas en la presente
memoria.
La descripción se ilustra además por medio de
los ejemplos no limitativos siguientes, que hacen referencia a las
figuras adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 1 a 3 muestran los resultados de la
actividad glucanasa expuestos en la Tabla 13.
Las Figuras 4 y 5 muestran los resultados de la
actividad glucanasa expuestos en la Tabla 14.
Las Figuras 6 y 7 muestran los resultados de la
actividad glucanasa expuestos en la Tabla 15.
La Figura 8 muestra los resultados de la
actividad glucanasa expuestos en la Tabla 16.
\vskip1.000000\baselineskip
Una formulación líquida de la presente invención
y su composición cuantitativa vienen dadas como se indica a
continuación:
\bullet Aceites vegetales
94-96%
\bullet Componentes inertes
6-4%
\bullet Una cepa o mezcla de entre el grupo
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Trichoderma CECT 20443 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Trichoderma CECT 20444 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/m
Trichoderma CECT 20445 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Trichoderma CECT 20447 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Trichoderma CECT 20481 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
\vskip1.000000\baselineskip
Es una mezcla de diferentes emulsionantes,
surfactantes no iónicos con aceites vegetales. La formulación
incluye algunos componentes que la Trichoderma utiliza como
nutrientes y soporta la humedad suficiente para la germinación de
la Trichoderma.
La naturaleza oleosa de esta formulación actúa
como adherente y/o previene la evaporación que permite la
persistencia de las esporas en la superficie de hojas y plantas,
manteniendo la concentración del producto y evitando la
volatilización.
Debido a las características descritas
anteriormente, la formulación resulta eficaz para el control de
patógenos que atacan partes aéreas (enfermedades de las hojas
ocasionadas por Botrytis, Sphaerotheca,
Erysiphe, etcétera) que no han sido fácilmente controladas
con formulaciones líquidas hasta la fecha.
Los aceites vegetales utilizados en esta
formulación, son una mezcla de emulsionantes provenientes de
extractos de plantas tales como Aloe vera, semilla de soja,
jojoba, etcétera, o ésteres de ácido graso con glicerol. Los
agentes tensoactivos sorbilen, polietilenglicol, etcétera son la
parte inerte de esta formulación.
\newpage
Una formulación líquida de la presente invención
y su composición cuantitativa vienen dadas como se indica a
continuación:
\bullet Molasas 40-100
g/l
\bullet Sorbytol 15-40
g/l
\bullet
Phyto-Fos-K* 1-10
g/l
\bullet NO_{3}K 1-10
g/l
\bullet Mg_{2}SO_{4} 7H_{2}O
0,1-10 g/l
\bullet NH_{4}H_{2}PO_{4}
0,1-10 g/l
\bullet CuSO_{4} 5H_{2}O
1-15 mg/l
\bullet ZnSO_{4} 7H_{2}O
1-15 mg/l
*Phyto-Fos-K:
suministrado por A.M.C. Chemical Company, que contiene anhídrido
fosfórico al 25% (p/p) y óxido de potasio al 18% (p/p).
Una cepa o una mezcla de entre el siguiente
grupo:
Trichoderma CECT 20443 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Trichoderma CECT 20444 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/m
Trichoderma CECT 20445 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Trichoderma CECT 20447 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Trichoderma CECT 20481 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
\vskip1.000000\baselineskip
Estos elementos de la formulación, son
utilizados como fuentes nutricionales por los microorganismos
antagonistas (Trichoderma) además proporciona un
medioambiente adecuado y estimula la supervivencia en suelo.
La naturaleza de la formulación líquida estimula
su drenaje en suelos, permitiendo la colonización de conidio
alrededor de la rizosfera de la planta, protegiendo las raíces de
posibles patógenos.
La presente invención proporciona una
formulación sólida compuesta por un portador y una combinación de
compuestos biológicos cuya composición cuantitativa es la
siguiente:
\bullet Proteínas 10-50%
\bullet Grasas 10-30%
\bullet Celulosa 1-10%
\bullet Lactosa 10-60%
\bullet Vitamina A
10.000-30.000 UI/Kg
\bullet Vitamina D-3
1.000-10.000 UI/Kg
\bullet Vitamina E 10-60
mg/Kg
\bullet Sulfato cúprico (CuSO_{4}
5H_{2}O) 5-20 mg/Kg
Una o más de las cepas expuestas a
continuación:
\global\parskip0.920000\baselineskip
Trichoderma CECT 20443 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Trichoderma CECT 20444 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/m
Trichoderma CECT 20445 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Trichoderma CECT 20447 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Trichoderma CECT 20481 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a las características del portador, la
formulación ayuda al incremento de la viabilidad y longevidad
conidial en todas las cepas de Trichoderma objeto de la
presente invención. Debido a que contribuye a la absorción de agua
y facilita la suspensión conidial en un medio líquido, en el momento
de su aplicación.
Debido a la naturaleza de los carbohidratos
portadores, que tienen carácter adherente, ayuda (como en el ejemplo
1) a la adhesión del conidio de Trichoderma a las partes
aéreas tratadas de la planta.
El portador puede ser utilizado como fuente
nutricional para los microorganismos antagonistas
(Trichoderma). Al mismo tiempo, proporciona un microambiente
adecuado que ayuda a su establecimiento y supervivencia en la
planta.
La característica más importante del portador es
un protector contra los rayos solares, que incrementa la
estabilidad genética de las cepas, ayudándolas a preservar la
eficacia y decreciendo la mortandad una vez aplicadas en
campos.
Debido a todas estas características, la
formulación ha demostrado tener una buena estabilidad durante el
almacenamiento a temperatura ambiente y bajo refrigeración.
La presente invención proporciona una
formulación sólida cuya composición cuantitativa es como se indica a
continuación:
\bullet Materia orgánica total
8,7-90%
\bullet Nitrógeno orgánico
0,16-10%
\bullet Proteína 1-20%
\bullet Fósforo (P)
0,025-2%
\bullet Potasio (K)
0,02-2%
\bullet Magnesio (Mg)
0,01-1%
\bullet Calcio (Ca) 16-200
ppm
\bullet Hierro (Fe) 16-100
ppm
\bullet Manganeso (Mn) 5-100
ppm
\bullet Cinc (Zn) 10-100
ppm
\bullet Cobre (Cu) 0,1-10
ppm
\vskip1.000000\baselineskip
Una o más cepas de Trichoderma de la
lista expuesta a continuación:
Trichoderma CECT 20443 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Trichoderma CECT 20444 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/m
Trichoderma CECT 20445 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Trichoderma CECT 20447 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
Trichoderma CECT 20481 c.s.p.
2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
\global\parskip1.000000\baselineskip
La materia orgánica utilizada en esta
formulación pueden ser polímeros de glucosa tales como almidón
proveniente de plantas como trigo, patata, arroz, etcétera, o
azúcares simples como glucosa, sucrosa, fructosa o lactosa.
Mientras que las proteínas pueden ser tales como albúmina,
globulina, etcétera.
Esta formulación sólida ha sido obtenida a
partir de un procedimiento fermentativo semisólido. Una vez
terminada la fermentación, la biomasa se recupera junto con el
medio utilizado. Después de un procedimiento de secado entre 30ºC y
35ºC durante 7 días, es sometido a un procedimiento de
triturado.
Los conidios obtenidos se caracterizan para una
correcta estabilidad y viabilidad, especialmente no refrigerados, y
una mayor tolerancia a la temperatura, cambio, secado y exposición a
radiación. Los conidios tienen una mejor eficacia si se utilizan a
escala comercial en condiciones agronómicas ambientales.
La formulación sólida puede almacenarse
refrigerada a 4ºC o a temperatura ambiente, evitando el calor,
manteniendo una temperatura inferior a 18ºC. Puede aplicarse
directamente en el suelo o cultivos mediante irrigación. Puede
aplicarse también mezclándola con fertilizantes o compost ya que
ayuda a su diseminación. La dilución del producto ayuda a la
diseminación de los microorganismos y permite a los iniciadores
empezar el crecimiento y desarrollo, consiguiendo masa miceliar que
les permitirá colonizar el suelo.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento de aplicación utilizando la
fórmula descrita anteriormente y utilizada en los Ejemplos 1 y 2
para controlar y tratar enfermedades de pobredumbre radicular en la
variedad Iceberg de cultivos de lechuga, ocasionadas por la especie
Botrytis, especie Sclerotinia y especie
Rhizoctonia, en Aguilas (Murcia).
El ensayo se realizó en una parcela de 2
hectáreas, durante el segundo trasplante. Se detectaron muchas
plantas dañadas durante la primera plantación. Se designaron los
siguientes tratamientos:
\bullet T1: control blanco sin fungicida
\bullet T2: tratamiento que consistía en una
combinación de las fórmulas descritas en el Ejemplo 1 (tratamiento
aéreo) y Ejemplo 2 (tratamiento de suelo), se diluyeron 750 cc de
cada formulación en 12 litros de agua. Se realizó un pretratamiento
en cubetas de trasplante, sumergiéndolas durante 1 minuto en la
dilución que contenía la formulación del Ejemplo 2. Después de un
tiempo de asentamiento, se aplicó la formulación del Ejemplo 1 a
las partes aéreas de la planta. El resto se aplicó semanalmente en
la cantidad de 1,5 litros por hectárea durante 4 semanas
consecutivas (dosis repetitiva) al suelo y a las hojas.
Los resultados se cuantificaron seleccionando al
azar 1.200 plantas en cada tratamiento, buscando plantas sanas y
enfermas afectadas por cualquiera de los patógenos anteriores.
Los resultados del ensayo fueron: En la parcela
de control (T1), las plantas enfermas eran aproximadamente el
62,5%, mientras que en la parcela tratada (T2) la incidencia de la
enfermedad era del 12,5%. La incidencia de la enfermedad se redujo,
principalmente debida a Botrytis, Sclerotinia y
Rhizoctonia, aproximadamente el 50% en relación a la parcela
de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe un procedimiento para el tratamiento
y control de Dematophora necatrix, ya que es una de las
enfermedades más serias de las plantaciones de olivo en Tarragona.
Se observa que los árboles adultos pierden su color verde de su
masa vegetal, perdiendo brillo y finalmente tornándose amarillentos
(cloróticos), la decoloración se inicia en la punta de la hoja
hacia el pecíolo, apareciendo algunas veces puntas necróticas. Más
tarde, se da una caída de hojas, lo cual implica la foliación.
Durante el florecimiento y la recogida, los síntomas son más
evidentes. La fruta maduró prematuramente y mostró un color negro y
violeta entre la foliación amarilla. Al final, el árbol muere
rápidamente.
La parcela estudiada tiene 72 árboles (variedad
Arbequina). La mortandad antes del inicio del tratamiento era de 29
árboles muertos y 7 con síntomas de enfermedad. Los árboles muertos
(M) fueron sustituidos al inicio del ensayo (R) por otros árboles
sanos. Durante el ensayo, se analizaron las siguientes
variables:
\bullet Mortandad de los árboles durante el
ensayo.
\bullet Nuevos síntomas en los árboles sanos
o replantados (confirmados en laboratorio).
\bullet Sanación de los árboles enfermos.
Para realizar el ensayo, se utilizó la
formulación del Ejemplo 3, con una dosificación de 50 cc/árbol.
Posteriormente se aplicaron dosis repetitivas en intervalos de 35
días durante dos años de tratamiento.
Los resultados se muestran en la tabla
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
X Árbol sano al principio o tras una
sustitución
R Árbol replantado
X o R Árbol que muestra síntomas de
enfermedad
M Árbol muerto al principio del
ensayo
M Árbol muerto durante el ensayo
X o R Árbol sanado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se combinan las cinco cepas de
Trichoderma en el procedimiento de aplicación descrito en el
Ejemplo 4, para controlar la Thielaviopsis basicola en
cultivos de ciclamen y flor de pascua. En este ensayo se comparó la
eficacia de esta formulación frente a los fitosanitarios
clásicos.
Se realizó un tratamiento de los cultivos a
principios de Mayo-Junio, justo después de plantar
el esqueje en la parcela definitiva. Se aplicaron dosis de 300
cc/m^{3}. Entre 30 y 40 días después, se realizó otro tratamiento
utilizando media dosis. Al mismo tiempo, en otras parcelas alejadas,
se realizaron tratamientos con Benomyl, Cloratalonil y Propamocarb,
siguiendo las dosis recomendadas por el fabricante. El control fue
una parcela sin tratamiento.
El tratamiento con Trichoderma
proporcionó muy buenos resultados, de hecho, se observó un aumento
en la velocidad de crecimiento de las raíces y una reducción del
número de plantas muertas (comparado con las plantas tratadas con
productos químicos y pesticidas y las plantas de ensayo).
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es solamente para conveniencia del lector. La misma no
forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha
tenido mucho cuidado durante la recopilación de las referencias, no
deben excluirse errores u omisiones y a este respecto la EPO
(Oficina Europea de Patentes) se exime de toda responsabilidad.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> A.M.C. Chemical S.L.
\hskip1,1cmGomis García, María Dolores
\hskip1,1cmAkdi, Khalid
\hskip1,1cmPérez Barrera, Francisco
\hskip1,1cmExpósito Cubero, Carmelo
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<120> Agente de control biológico y
formulaciones
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<130> WPP287206
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<140> PCT/GB2003/005493
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<141>
2003-12-15
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB0229126.8
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<151>
2002-12-13
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<160> 9
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<170> Patente en versión 3.1
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<210> 1
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskiptcggtaggtg aacctgcgg
\hfill19
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<210> 2
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 2
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\hfill20
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<210> 3
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipgctgcgttct tcatcgatgc
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<211> 20
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<212> ADN
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<223> Cebador
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<400> 4
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\hfill20
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<210> 5
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<211> 617
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<212> ADN
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<213> Especie Trichoderma
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 617
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<212> ADN
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<213> Especie Trichoderma
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 617
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<212> ADN
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<213> Especie Trichoderma
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 631
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<212> ADN
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<213> Especie Trichoderma
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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<210> 9
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<211> 610
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<212> ADN
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<213> Especie Trichoderma
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (7)
1. Formulación líquida que tiene su composición
cuantitativa como se indica a continuación:
\bullet Aceites vegetales
94-96% en peso
\bullet Componentes inertes
6-4% en peso
\bullet Una mezcla de:
- Trichoderma CECT 20443 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
- Trichoderma CECT 20444 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
- Trichoderma CECT 20445 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
- Trichoderma CECT 20447 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml y
- Trichoderma CECT 20481 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml.
2. Formulación según la reivindicación 1 para
controlar y tratar enfermedades en cultivos de lechugas ocasionadas
por la especie Botrytis, especie Sclerotinia y especia
Rhizoctonia.
3. Formulación sólida cuya composición
cuantitativa es como se indica a continuación:
\bullet Materia orgánica total
8,7-90% en peso
\bullet Nitrógeno orgánico
0,16-10% en peso
\bullet Proteína 1-20% en
peso
\bullet Fósforo (P) 0,025-2%
en peso
\bullet Potasio (K) 0,02-2%
en peso
\bullet Magnesio (Mg) 0,01-1%
en peso
\bullet Calcio (Ca) 16-200
ppm
\bullet Hierro (Fe) 16-100
ppm
\bullet Manganeso (Mn) 5-100
ppm
\bullet Cinc (Zn) 10-100
ppm
\bullet Cobre (Cu) 0,1-10
ppm
\bullet Una mezcla de:
- Trichoderma CECT 20443 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
- Trichoderma CECT 20444 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
- Trichoderma CECT 20445 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml
- Trichoderma CECT 20447 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml y
- Trichoderma CECT 20481 2x10^{3}-2x10^{9} conidio/ml.
4. Formulación según la reivindicación 3 para el
control y tratamiento de Dematophora necatrix en olivos.
5. La utilización de una formulación según la
reivindicación 3 para controlar la transmisión y extensión de
Thielaviopsis basicola en cultivos de ciclamen y flor de
pascua.
6. Formulación según las reivindicaciones 1 y 3
para la utilización con insecticidas químicos, que se ha observado
que son compatibles, ejemplos de los cuales son Orytis®, Dicarzol®,
Lannate® y Confidor® en un programa de gestión de plagas
integrado.
7. Formulación según las reivindicaciones 1 y 3
para la utilización con fungicidas químicos ejemplos de los cuales
son Captan®, Ridomil®, Folicur®, Combi®, Tisar®, Baycor®, Benomyl®,
Metaxyl®, Tachigaren®, Previcur®, Scala®, Terraclor® en un programa
de gestión de plagas integrado.
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