ES2292652T3 - Ligando de exotoxinas. - Google Patents
Ligando de exotoxinas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2292652T3 ES2292652T3 ES02004217T ES02004217T ES2292652T3 ES 2292652 T3 ES2292652 T3 ES 2292652T3 ES 02004217 T ES02004217 T ES 02004217T ES 02004217 T ES02004217 T ES 02004217T ES 2292652 T3 ES2292652 T3 ES 2292652T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- adsorbent
- ligand
- matrix
- blood
- meth
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3268—Macromolecular compounds
- B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
- B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
- B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
- B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
- B01J20/321—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
- B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
- B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Un método para la producción de un adsorbente, caracterizado por la preparación de un ligando para toxinas bacterianas que comprende un oligosacárido y/o un oligopéptido y/o un oligonucleótido y que es capaz de interaccionar selectivamente con la estructura de lámina beta-bisagra-hélice alfa de los superantígenos, que comprende la secuencia aminoacídica YNKKKVTAQELD (SEC ID Nº: 4), y la unión covalente del ligando a una matriz.
Description
Ligando de exotoxinas.
La presente invención se refiere a un método
para la producción de un adsorbente con un ligando para toxinas
bacterianas, particularmente enterotoxinas o exotoxinas de bacterias
grampositivas, que es capaz de interaccionar selectivamente con una
estructura que comprende una secuencia aminoacídica que está
conservada en las toxinas bacterianas.
Los superantígenos bacterianos pertenecen a las
toxinas más potentes. A la familia de los superantígenos pertenecen,
por ejemplo, las enterotoxinas o exotoxinas de bacterias
grampositivas como SEA a SEE (donde SEB aparece más frecuentemente)
de Staphylococcus, la toxina 1 del síndrome de choque tóxico
(TSST-1) y SPEA y SPEC de Streptococcus. Las
mismos estimulan, por la unión al receptor de células T (TCR) y/o al
complejo principal de histocompatibilidad II (MCH II) de las
células T auxiliares 1 (Th 1), la producción y secreción de
linfocinas (por ejemplo, citoquinas o interleucinas), como por
ejemplo IL-2, IFN-\gamma y/o
TNF-\beta. Como superantígenos, estas moléculas
actúan desacopladas del mecanismo normal de activación de la
respuesta inmune por la presentación de antígenos procesados.
Para el tratamiento o la prevención de un choque
tóxico desencadenado por tales antígenos, se han propuesto en el
estado de la técnica, entre otras cosas, materiales para retirar de
la sangre de un paciente estas sustancias de efecto pirógeno. De
este modo, en el documento
US-A-4.381.293 se han descritos
adsorbentes para pirógenos que comprenden un soporte insoluble en
agua y un compuesto heterocíclico que contiene nitrógeno. En el
documento US-A-5.928.633 se
describe un material que contiene un compuesto de urea o tiourea que
presenta una afinidad respecto a la enterotoxina de
Staphylococcus y la exotoxina de Streptococcus.
Además, en el documento DE-A-197 05
366 se describe un dispositivo para la purificación de soluciones
que contienen proteínas, como sangre, plasma sanguíneo o medios de
cultivo, que comprende un material de soporte biocompatible de
plástico que está recubierto de forma covalente mediante enlaces
peptídicos con albúmina y, por tanto, debe unir una serie de
toxinas, a modo de ejemplo, toxinas exógenas.
Sin embargo, los ligandos contenidos en los
adsorbentes conocidos a partir del estado de la técnica se unen de
forma relativamente inespecífica a los más diversos sitios de las
estructuras de proteína que se tienen que unir y/o solamente
presentan una afinidad respecto a representantes individuales de los
superantígenos.
Por lo tanto, la presente invención tiene el
objetivo de proporcionar un sistema nuevo para la unión de toxinas
bacterianas que se basa en la interacción selectiva con las
estructuras conservadas en las toxinas y, por lo tanto, se puede
usar en composiciones farmacéuticas y adsorbentes, para tratar o
evitar, por ejemplo, un choque séptico producido o esperado por
tales toxinas bacterianas.
Este objetivo se resuelve por las realizaciones
caracterizadas en las reivindicaciones de la presente invención.
Particularmente, este objetivo se resuelve por el método definido en
la reivindicación 1 para la producción de un adsorbente.
El ligando para toxinas bacterianas es capaz de
interaccionar selectivamente con la estructura de lámina
\beta-bisagra-hélice \alpha de
los superantígenos.
La expresión "capaz de interaccionar
selectivamente" significa que el ligando de acuerdo con la
invención presenta una elevada afinidad respecto a la estructura
conservada en las toxinas, y por lo tanto, interacciona
preferiblemente con la misma. Preferiblemente, la constante de
asociación del ligando para la toxina o la estructura, por ejemplo,
in vitro en condiciones fisiológicas o aproximadamente
fisiológicas, como a 37ºC, pH 7,4 y NaCl aproximadamente de 140 a
150 mM, comprende al menos 10^{6} M^{-1}, más preferiblemente al
menos 10^{8} M^{-1}. La interacción del ligando puede
comprender cualquier tipo de unión química o física, como por
ejemplo, interacciones electrostáticas, interacciones Van der Waals,
enlaces de puentes de hidrógeno y/o interacciones hidrófobas.
Por lo tanto, la preparación del ligando se basa
en el conocimiento de que las toxinas bacterianas pertenecientes a
los superantígenos presentan, respecto a sus secuencias totales,
solamente una baja homología entre sí, sin embargo, en el interior
de estas secuencias se presentan motivos de secuencias conservados o
las estructuras espaciales conservadas están configuradas por estas
secuencias aminoacídicas relacionadas y/o restos aminoacídicos
separados entre sí en la secuencia lineal.
Particularmente, la estructura de lámina
\beta-bisagra-hélice \alpha de
los superantígenos, también denominada P12, está muy conservada
(compárese Fig. 1) y comprende generalmente un dodecapéptido. La
secuencia correspondiente de la SEB comprende los aminoácidos 150 a
161 y es TNKKKVTAQELD (SEC ID Nº: 1). El motivo estructural
correspondiente en SEA (TNKKNVTVQRLD, aminoácidos 145 a 156, SEC ID
Nº: 2) solamente está modificado en dos posiciones en comparación
con la SEB. La zona de secuencia correspondiente de la
TSST-1 (FDKKQLAISTLD, aminoácidos 135 a 146, SEC ID
Nº: 3), de hecho, comprende en comparación con la SEB solamente
cuatro restos idénticos, sin embargo, forma, como muestra la
formación marcada en rojo en la Fig. 1, una estructura espacial muy
parecida. Las numeraciones de aminoácidos anteriores se refieren a
las secuencias publicadas por Papageorgiou et al. (Protein
Sci. 5 (8), 1737-1741, 1996), Sundstrom et
al. (J. Biol. Chem. 271, 32212-32216, 1996) o
Papageorgiou et al. (J. Mol. Biol. 277,
61-79, 1998).
En Arad et al. (2000), Nature Medicine 6,
414-421 se hace referencia a una posible importancia
de esta estructura conservada para la investigación y el modo de
acción de las correspondientes toxinas bacterianas. Según ese
documento, el dodecapéptido YNKKKVTAQELD (SEC ID Nº: 4), en el que,
en comparación el motivo de secuencia inicial de la SEB, se ha
sustituido la primera treonina por tirosina, ya que el primer
aminoácido correspondiente en TSST-1 es una
fenilalanina, inhibe como antagonista la activación de la respuesta
inmune, es decir, la producción de linfocinas. Por el suministro
intravenoso del péptido se ha conseguido evitar un choque séptico
en un ensayo animal con ratones. También se demostró la inhibición
de la producción de linfocinas respecto a la inducción inmune
modulada por SEA, SEB, TSST-1 y SPEA. Sin embargo,
Arad et al. no describen la posibilidad de proporcionar un
ligando dirigido contra una estructura conservada en las toxinas
bacterianas, por ejemplo, el dominio de lámina
\beta-bisagra-
hélice \alpha.
hélice \alpha.
Preferiblemente, por lo tanto, el ligando une
exotoxinas o enterotoxinas de bacterias grampositivas, como SEA,
SEB, SEC, SED, SEE, TSST-1, SPEA y SPEC.
De acuerdo con realizaciones preferidas, el
ligando puede ser un ligando orgánico sintético, un sacárido, por
ejemplo, un oligosacárido, un péptido, por ejemplo, un oligopéptido
o un ácido nucleico, como un oligonucleótido de hélice única. Un
ejemplo de un ligando peptídico es un anticuerpo que está dirigido
contra la estructura conservada de los superantígenos. El
anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal, recombinante o puede
ser una quimera, por ejemplo, de una parte variable de ratón y
partes no variables de ser humano.
Desde el punto de vista de posibles problemas
inmunológicos, particularmente cuando el ligando está contenido en
un adsorbente, se prefiere que el ligando comprenda un oligopéptido,
oligosacárido u oligonucleótido, donde se trata más preferiblemente
de aquellos oligómeros con no más de 100 componentes.
A continuación se describen métodos para la
producción del ligando.
Para la producción del ligando se pueden usar
diferentes métodos, en los que durante la selección del método en
concreto se tienen que tener en cuenta los siguientes puntos:
- -
- estabilidad térmica de los ligandos y estabilidad frente al entorno biológico (por ejemplo, sangre o plasma sanguíneo),
- -
- gran variabilidad de los ligandos para cubrir un gran grupo de moléculas diana durante la identificación del ligando,
- -
- economía del método y
- -
- afinidad suficiente de los ligandos respecto a la estructura diana, para usarse en la absorción de sangre o plasma sanguíneo.
De este modo, por ejemplo, se pueden identificar
ligandos sintéticos usando la denominada síntesis de SPOT. La
síntesis de SPOT (o síntesis de punto) ofrece la posibilidad de
producir, por síntesis paralela automática, bibliotecas de péptidos
sobre fases sólidas de forma rápida y flexible. El principio se basa
en la distribución de gotas mínimas con soluciones de reactivos
sobre zonas que se han definido anteriormente de forma exacta
(ingles "spots", puntos) de una superficie adecuada (por
ejemplo, membranas de celulosa, vidrio, etc.). La fijación en una
superficie común ofrece la ventaja de que las bibliotecas que se
están generando se presentan en un formato fácil de manejar. Las
etapas intermedias de la síntesis, como el lavado, o la retirada de
grupos protectores, se pueden realizar de forma común para todos
los miembros de la biblioteca. Por lo demás, la biblioteca también
se puede explorar de esta manera de forma común, lo que conlleva en
total un ahorro evidente de tiempo y de material.
La técnica de SPOT se puede usar, por el empleo
de un sistema a modo de caja, que se desarrolló por Jerini et
al, supra, para la construcción de los más diversos
sistemas de ligandos. La estructura líder que se tiene que unir,
por ejemplo, una estructura que comprende la secuencia aminoacídica
TNKKKVYAQELD (SEC ID Nº: 1), se puede optimizar o estabilizar
dependiendo de los requerimientos. Además de la realización de
mutaciones con los aminoácidos naturales, en cada sitio de la
secuencia se puede introducir cualquier componente. Se dispone de
un amplio repertorio de componentes orgánicos sintéticos, que se
conocen por el especialista. Por ejemplo, se pueden usar
componentes de 1,3,5-triclorotriazina, cuya
introducción, por la posibilidad de sustitución múltiple
controlada, proporciona múltiples posibilidades de modificación. Por
la sustitución por etapas de todos los aminoácidos, de este modo
también se puede construir un ligando orgánico completamente
sintético. Esta circunstancia se ilustra por el siguiente esquema
de reacción:
Tales ligandos sintéticos son estables en el
entorno biológico como la sangre y el plasma sanguíneo.
Evidentemente, el péptido deseado se puede
modificar químicamente o derivatizar per se por métodos
conocidos en el estado de la técnica.
Un método adicional para proporcionar ligandos
basados en péptidos se sirve de la denominada técnica de
presentación de fagos. Por la manipulación del ADN de un fago se
presenta una secuencia peptídica adicional sobre la superficie de
este fago y, por lo tanto, es accesible para ensayos de unión con la
molécula diana. Si se detecta en la biblioteca de fagos usada una
secuencia que une la molécula diana, se puede precisar su estructura
primaria de forma conocida por amplificación del correspondiente
ADN de fago y su secuenciación. Una ventaja de la técnica de
presentación de fagos consiste, por ejemplo, en que un ligando
identificado en primer lugar se puede optimizar en esta técnica de
forma sencilla respecto a su afinidad por la molécula diana. Para
esto, la secuencia nucleotídica que codifica el ligando peptídico
se modifica por sustitución, adición, deleción y/o inserción de uno
o varios nucleótidos de tal modo (mutagénesis) que se proporciona de
forma rápida y sencilla, partiendo del ligando peptídico
identificado en primer lugar, un ligando mejorado respecto a la
actividad frente a la estructura diana, que comprende una secuencia
aminoacídica modificada de forma correspondiente a la manipulación
del ADN codificante.
Un problema de la técnica de presentación de
fagos original consiste en que, de forma similar a las bibliotecas
peptídicas combinatorias, las bibliotecas, a partir de cierto número
de aminoácidos, solamente se pueden construir de forma compleja
(por ejemplo, una biblioteca de dodecámeros peptídicos basados en
todos los 20 aminoácidos de origen natural requiere más de
10^{15} clones). Sin embargo, el uso de péptidos más cortos no
alcanza, por norma, las afinidades de unión de péptidos más largos.
Por lo tanto, de acuerdo con la invención se usa preferiblemente la
"estrategia Cosmix" descrita a continuación
(Cosmiplexing-Technik, Empresa Cosmix Molecular
Biologicals GmBH): en un primer ciclo de selección se realiza una
preselección de secuencias peptídicas que interaccionan con la
estructura diana. En las secuencias obtenidas se realiza a
continuación, por la técnica Cosmiplexing, una optimización de la
afinidad respecto a la molécula diana. La optimización de unión se
realiza de forma particularmente eficaz, ya que por la técnica de
combinación específica usada se consigue una diversidad
extremadamente elevada en la biblioteca de secuencias
preseleccionada, que conduce a una combinación óptima de
incrementos de estructura de unión. Esto conduce a afinidades,
particularmente en secuencias peptídicas cortas, que por lo demás
solamente se consiguen con oligómeros de moléculas superiores de
bibliotecas base esencialmente mayores.
De acuerdo con otra realización, la diversidad
de bibliotecas de presentación de fagos se puede limitar delimitando
la secuencia inicial que puede mutar. Como base para la
construcción de una biblioteca de presentación de fagos se
proporcionan, por ejemplo, inhibidores de proteasa de la empresa
Dyax (Cambridge, MA, EEUU). Parte de estas proteínas se presenta en
la biblioteca sobre el fago, y en los dominios de unión se realizan
mutaciones de aminoácidos individuales o de varios aminoácidos. El
problema que se presenta usando péptidos de origen natural de la
posible inestabilidad en fluidos biológicos como la sangre o el
plasma sanguíneo se puede evitar usando ligandos basados en
inhibidores de proteasa, que por lo general presentan una elevada
bioestabilidad.
Para la exploración, la molécula diana se
inmoviliza sobre microesferas o perlas y se pone en contacto de
forma conocida con la biblioteca de fagos. Las microesferas con los
fagos unidos a las mismas por los ligandos peptídicos se aíslan y
los fagos se escinden enzimáticamente de los péptidos presentados
por los mismos. Los fagos separados de este modo que contienen las
moléculas de ADN que codifican los ligandos peptídicos que unen la
molécula diana se amplifican en E. coli y, por tanto, quedan
disponibles para etapas adicionales, a modo de ejemplo, la
mutagénesis que se ha mencionado anteriormente para optimizar la
afinidad del ligando respecto a la estructura diana, etc.
Por lo demás, debido a las interacciones
proteína-ácido nucleico específicas que se presentan a menudo en la
naturaleza (por ejemplo, proteína/ARN en ribosomas y proteína/ADN en
nucleasas) también se pueden usar ácidos nucleicos para la
producción del ligando de acuerdo con la invención. Al usar ácidos
nucleicos, por una sustitución de bases es posible proporcionar un
gran número de variantes de secuencias, y por lo tanto, de
estructuras, de forma sencilla. Las secuencias de longitud
predefinida se acoplan a una matriz y, como se ha descrito
anteriormente respecto a la presentación de fagos, se ponen en
contacto con la molécula diana. Los ácidos nucleicos de unión
presentan una estructura que es capaz de interaccionar con la
molécula diana. Desde el punto de vista de la optimización de la
secuencia para proporcionar un ligando con mayor afinidad, los
ácidos nucleicos presentan la ventaja de que se pueden amplificar de
forma sencilla (por ejemplo, in vitro por PCR o in
vivo mediante E. Coli), por lo que, como punto de partida
para la optimización de la unión, puede ser suficiente la unión de
una única molécula de ácido nucleico. En condiciones adecuadas se
puede realizar un pase, como se ha descrito anteriormente, adicional
de una primera mezcla de ácido nucleico (amplificada)
enriquecida.
Como en los ligandos peptídicos que se han
descrito anteriormente, también en los ácidos nucleicos se puede
presentar el problema de la inestabilidad en un entorno biológico.
Particularmente, el ARN es a menudo más inestable que el ADN. Como
ligandos de ácidos nucleicos se pueden considerar especies de hélice
única y de doble hélice (donde en una molécula de hélice única,
evidentemente, se pueden presentar pares de bases intramoleculares).
Para la estabilización respecto a las nucleasas que se presentan en
líquidos biológicos como sangre o plasma sanguíneo son adecuados,
por ejemplo, los métodos que se describen a continuación.
Un método preferido para preparar un ligando
basado en ácidos nucleicos se basa en el principio de la denominada
tecnología Spiegelmer (compárese documento
WO-A-98/00885). A partir de la
molécula diana (por ejemplo, el dodecapéptido con la SEC ID Nº: 4)
se sintetiza una "imagen especular", es decir, su enantiómero,
que se compone de componentes de L-aminoácidos. La
molécula diana reflejada de tal modo se explora a continuación con
una biblioteca, por ejemplo, de oligómeros de ARN en su forma D
natural. Se determina la secuencia de miembros de unión de la
biblioteca y después se sintetiza en forma de sus isómeros L que no
son de origen natural. Estos isómeros L se unen, debido a la
esteroquímica, a las moléculas diana no reflejadas. De este modo se
proporcionan ligandos de ácidos nucleicos que son particularmente
adecuados para usarse en líquidos biológicos, debido a que son
esencialmente biológicamente inertes por la forma L que no se
presenta en la naturaleza.
Los ligandos basados en ácidos nucleicos se
pueden estabilizar adicionalmente, por ejemplo, por la introducción
de nucleótidos modificados por fosfato. De este modo, por la
introducción de nucleótidos correspondientemente modificados, por
ejemplo, mediante PCR se consigue una estabilización en el entorno
biológico. Por ejemplo, son posibles sustituciones de oxigeno en el
grupo fosfato por azufre (compárese secuenciación de
ADN-S^{35}, \alpha-tiofosfatos)
o por un grupo metilo. Tales moléculas de ADNcs modificados están
protegidas, por ejemplo, de la degradación por ADNasas.
Una posibilidad adicional de estabilización,
particularmente de ligandos de ADN, consiste en la metilación por
metilasas. De este modo se pueden producir, por ejemplo, ligandos de
ADN en bacterias como E. Coli en presencia de diferentes
metilasas, que se presentan preferiblemente codificadas por
plásmidos. Particularmente en ligandos de ADNcs se protegen
secciones de doble hélice producidas por pares de bases
intramoleculares, por la metilación contra endonucleasas. Una
protección eficaz contra exonucleasas, por lo demás, se puede
conseguir por la unión de secuencias "cap" repetitivas.
Las posibilidades de utilización de los ligandos
que se han definido anteriormente, comprenden, por ejemplo, su uso
para la purificación de toxinas bacterianas o su retirada de
líquidos, como por ejemplo, sangre o plasma sanguíneo, y para la
inhibición de las toxinas bacterianas diana debido a la unión
selectiva a una estructura conservada presente en las mismas.
La presente invención se refiere a un método
para la producción de un adsorbente que comprende una matriz,
preferiblemente una matriz orgánica, y al menos un ligando que se ha
definido anteriormente que se une de forma covalente a la
matriz.
El adsorbente es preferiblemente biocompatible.
Un adsorbente "biocompatible" es preferiblemente compatible
con sangre y plasma. De acuerdo con una realización preferida
adicional es compatible con sangre completa.
En principio se pueden concebir varios
materiales de soporte como matriz, como por ejemplo, vidrio,
hidratos de carbono, Sepharose®, sílice, o matrices orgánicas, como
copolímeros de acrilatos o metacrilatos y poliamidas.
Preferiblemente, la matriz se compone de material orgánico, y
particularmente preferiblemente, es de copolímeros derivados de
ésteres y/o amidas de ácido (met)acrílico. Los mismos
comprenden preferiblemente grupos epoxi. Por el término
"(met)acrilo" se entienden los correspondientes
compuestos acrilo y metacrilo.
Como matriz para el adsorbente se prefiere un
copolímero estadístico producido por polimerización de las unidades
monoméricas
- (A)
- (met)acrilamida en una cantidad del 10 al 30% en peso
- (B)
- N,N'-metilen-bis(met)acrilamdida en una cantidad del 30 al 80% en peso y
- (C)
- alilglicidiléter y/o glicidil(met)acrilato en una cantidad del 10 al 20% en peso, referido respectivamente al peso total de las unidades monoméricas.
El copolímero se produce preferiblemente por
polimerización en suspensión.
Tal copolímero está disponible en el mercado con
la denominación Eupergit C250L o Eupergit FE 162 de la empresa Röhm
GmBH.
Al usar el copolímero que se ha mencionado
anteriormente u otra matriz orgánica que contiene los grupos oxirano
(grupos epoxi), por ejemplo, un copolímero también preferido en el
marco de la presente invención, que se ha obtenido por la
polimerización en suspensión de etilenglicoldimetacrilato y
glicidilmetacrilato y/o alilglicidiléter, estos grupos oxirano se
aminan antes de la introducción de los ligandos que se tienen que
unir de forma covalente preferiblemente con amoniaco o con una
amina primaria. Se prefiere el amoniaco por motivos de la técnica
del método y por motivos económicos.
Usando el adsorbente para la retirada de toxinas
bacterianas, como enterotoxinas o exotoxinas de bacterias
grampositivas de sangre o plasma sanguíneo, la matriz se puede
presentar, por ejemplo, en forma de partículas esféricas no
agregadas, las denominadas microesferas o perlas, fibras o una
membrana, proporcionándose una matriz porosa que presenta una
superficie mayor. La formación o el ajuste de la porosidad se puede
conseguir, por ejemplo, por la adición de formadores de poros, como
ciclohexanol o 1-dodecanol, a la mezcla de reacción
de la polimerización en suspensión para la matriz. Por lo demás, es
ventajoso que la matriz tenga un límite exclusión de al menos
10^{7} Dalton, de forma que las toxinas bacterianas puedan
penetrar con el plasma en los poros para alcanzar el ligando unido
a la matriz.
Una configuración ventajosa adicional de la
invención consiste en introducir el adsorbente por una selección
adecuada de la matriz de soporte en sangre completa. Para esto, la
matriz se compone de partículas no agregadas esféricas en un
intervalo de tamaño de partícula de 50 a 250 \mum y tiene un
límite de exclusión de al menos 10^{7} Dalton. De este modo se
pueden poner en contacto las células sanguíneas con el material del
adsorbedor sin que se ocluya la columna o se retenga o agregue un
número inaceptable de células. Esto se posibilita por el tamaño y
la configuración esférica de las perlas junto con el límite de
exclusión del adsorbente de acuerdo con la invención, ya que las
células se deslizan a lo largo de la superficie externa lisa de las
perlas, por lo que solamente se produce una baja adhesión de
trombocitos y el plasma con las toxinas bacterianas sigue teniendo
la posibilidad de penetrar en los
poros.
poros.
De este modo se omiten etapas extracorpóreas
como la separación de células sanguíneas, el tratamiento del plasma
aislado, y la agregación posterior de los componentes sanguíneos,
por lo que la biocompatibilidad del método aumenta, por ejemplo,
continúa disminuyendo considerablemente el riesgo de una activación
del complemento. La omisión de etapas extracorpóreas provoca
adicionalmente un acortamiento del tiempo de tratamiento y una
simplificación del método, por lo que se posibilita una retirada lo
más rápida posible de las toxinas de la circulación sanguínea del
paciente.
El adsorbente, por lo demás, se puede usar para
la purificación de toxinas bacterianas, preferiblemente
enterotoxinas o exotoxinas de bacterias grampositivas.
Un método para la purificación de toxinas
bacterianas de un fluido comprende las etapas
- a)
- preparación del adsorbente como se ha definido anteriormente y
- b)
- puesta en contacto del fluido con el adsorbente.
Preferiblemente, el método de purificación se
realiza de forma continua, proporcionándose el adsorbente, por
ejemplo, en una columna de cromatografía, y el fluido con la toxina
que se tiene que purificar se pasa por la columna de cromatografía
que contiene el adsorbente de forma conocida. Sin embargo, también
es posible usar el adsorbente de acuerdo con la invención en un
método discontinuo.
Como se ha explicado anteriormente, un
adsorbente que contiene el ligando para toxinas bacterianas se puede
usar para disminuir la concentración de toxinas bacterianas,
particularmente de las enterotoxinas y exotoxinas de bacterias
grampositivas, en sangre o plasma sanguíneo. Para ello se usa el
adsorbente en la producción de un absorbedor correspondiente.
Un adsorbente para disminuir la concentración de
toxinas bacterianas en sangre o plasma sanguíneo comprende una
cubierta que se configura preferiblemente con forma de tubo o de
columna, y que contiene el adsorbente como material de relleno.
Desde el punto de vista de las cantidades de sangre o de plasma
sanguíneo que se tienen que pasar habitualmente y desde el punto de
vista de la eficacia del adsorbedor, el mismo comprende
preferiblemente un volumen de 30 a 1250 ml, más preferiblemente de
50 a 200 ml, particularmente cuando se trata de un adsorbedor que
se puede regenerar. El adsorbedor se pude usar individualmente, en
un funcionamiento doble o múltiple. Con dos o más adsorbedores
existe la posibilidad de alimentar un adsorbedor con la sangre o el
plasma sanguíneo, mientras que el otro adsorbedor se regenera. Esto
conduce a un aumento adicional de la eficacia usando el adsorbedor,
particularmente ya que puede ser decisivo durante el tratamiento y/o
la prevención de una sepsis grampositiva con el adsorbedor, retirar
las toxinas correspondientes lo más rápidamente posible de la
sangre o del plasma sanguíneo del paciente. El adsorbedor se
configura preferiblemente de tal modo que comprende una cubierta
con una zona de entrada en el lado frontal, por el que se suministra
la sangre o el plasma sanguíneo al adsorbedor, donde en este caso,
la salida se sitúa en el fondo de la cubierta del adsorbedor.
Para evitar que se conduzcan sustancias no
deseadas, por ejemplo, sustancias que se originan en el material
del adsorbente, con la sangre o el plasma sanguíneo tratada/o de
vuelta a la circulación sanguínea del paciente, preferiblemente, en
la salida de la cubierta del adsorbedor se dispone un filtro. Se
trata preferiblemente de un filtro de partículas.
Usando el adsorbedor también se proporciona un
método para el tratamiento y/o la prevención de la sepsis
grampositiva, en el que la sangre o el plasma sanguíneo de un
paciente que se ha infectado con las respectivas bacterias, como
Staphylococcus o Streptococcus, y en el que
posiblemente se tenga que esperar un choque séptico debido a las
toxinas originadas en las bacterias, se conduce en un circuito por
el adsorbedor de acuerdo con la invención.
Como se ha explicado anteriormente, el ligando,
por su unión selectiva a las toxinas bacterianas correspondientes,
también se puede usar para la inhibición o disminución del efecto
tóxico de estas moléculas.
Una posibilidad de utilización adicional del
ligando consiste en su uso para la comprobación de las toxinas
bacterianas correspondientes, lo que puede servir, por ejemplo, para
detectar una sepsis que posiblemente se presentará debido a la
infección con bacterias, como bacterias grampositivas, para poder
aplicar a tiempo contramedidas terapéuticas adecuadas.
Las Figuras muestran:
La Fig. 1 es una representación gráfica que
muestra la estructura peptídica de las estructuras espaciales de
los superantígenos SEB (Fig. 1A), TSST-1 (Fig. 1B) y
SEA (Fig. 1C). Las secuencias aminoacídicas (SEC ID Nº: 1 a 3) de
los dominios conservados de lámina
\beta-bisagra-hélice \alpha y
sus posiciones se indican en la secuencia global.
Claims (12)
1. Un método para la producción de un
adsorbente, caracterizado por la preparación de un ligando
para toxinas bacterianas que comprende un oligosacárido y/o un
oligopéptido y/o un oligonucleótido y que es capaz de interaccionar
selectivamente con la estructura de lámina
\beta-bisagra-hélice \alpha de
los superantígenos, que comprende la secuencia aminoacídica
YNKKKVTAQELD (SEC ID Nº: 4), y la unión covalente del ligando a una
matriz.
2 El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la toxina es una enterotoxina o exotoxina de bacterias
grampositivas.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que la toxina se selecciona del grupo compuesto por SEA, SEB,
SEC, SED, SEE, TSST-1, SPEA y SPEC.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la matriz es una matriz orgánica.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que la matriz orgánica es un copolímero derivado de ésteres
y/o amidas de ácido (met)acrílico.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que el copolímero derivado de ésteres y/o amidas de ácido
(met)acrílico comprende grupos epoxi.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 5
ó 6, en el que el copolímero es un copolímero estadístico producido
por la polimerización de las unidades monoméricas
- (A)
- (met)acrilamida en una cantidad del 10 al 30% en peso,
- (B)
- N,N'-metilen-bis(met)acrilamida en una cantidad del 30 al 80% en peso y
- (C)
- alilglicidiléter y/o glicidil(met)acrilato en una cantidad del 10 al 20% en peso, referido respectivamente al peso total de las unidades monoméricas.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 6
ó 7, en el que los grupos epoxi se han aminado antes de la
introducción de las cadenas laterales con amoniaco o una amina
primaria.
9. El método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 4 a 8, en el que la matriz orgánica se compone de
partículas esféricas no agregadas.
10. El método de acuerdo con la reivindicación
9, en el que las partículas esféricas no agregadas presentan un
tamaño de partícula de 50 \mum a 250 \mum.
11. El método de acuerdo con una del las
reivindicaciones 4 a 10, en el que la matriz orgánica presenta un
límite de exclusión de al menos 10^{7} Dalton.
12. El método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que el adsorbente es
biocompatible.
13. El método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que el adsorbente es compatible con
sangre completa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10116042A DE10116042A1 (de) | 2001-03-30 | 2001-03-30 | Exotoxin-Ligand |
| DE10116042 | 2001-03-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2292652T3 true ES2292652T3 (es) | 2008-03-16 |
Family
ID=7679856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02004217T Expired - Lifetime ES2292652T3 (es) | 2001-03-30 | 2002-02-25 | Ligando de exotoxinas. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020177573A1 (es) |
| EP (1) | EP1245238B1 (es) |
| JP (1) | JP2003012694A (es) |
| AT (1) | ATE373490T1 (es) |
| DE (2) | DE10116042A1 (es) |
| ES (1) | ES2292652T3 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004072095A2 (en) * | 2003-02-12 | 2004-08-26 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Cyclized peptides as exotoxin antagonists |
| MX2011003569A (es) * | 2008-10-02 | 2011-06-09 | Univ Pittsburgh | Administracion de un polimero adsorbente para el tratamiento de inflamacion sistemica. |
| CN114602237B (zh) * | 2022-03-10 | 2023-11-28 | 华兰生物工程股份有限公司 | 一种从人血浆或人血浆衍生原料中去除内毒素的方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4737544A (en) * | 1982-08-12 | 1988-04-12 | Biospecific Technologies, Inc. | Biospecific polymers |
| DE3932971C2 (de) * | 1989-10-03 | 2003-03-13 | Fresenius Ag | Zur Eliminierung von Biomakromolekülen, insbesondere LDL und Endotoxinen, aus Vollblut in extrakorporalem Kreislauf geeignetes Adsorbens |
| WO1994025483A1 (en) * | 1993-05-03 | 1994-11-10 | The University Of British Columbia | Immunotherapeutic peptides derived from toxic shock syndrome toxin-1, antibodies thereto, their uses in pharmaceutical compositions and diagnosis |
| IL119938A (en) * | 1996-12-30 | 2005-08-31 | Yissum Res Dev Co | Peptides capable of eliciting protective immunity against toxic shock induced by pyrogenic exotoxins or of antagonizing toxin-mediated activation of t cells |
| DE19705366C2 (de) * | 1997-02-12 | 2002-08-01 | Fresenius Ag | Trägermaterial zur Reinigung proteinhaltiger Lösungen, Verfahren zur Herstellung des Trägermaterials und Verwendung des Trägermaterials |
| US6075119A (en) * | 1997-04-07 | 2000-06-13 | The Rockefeller University | Peptides useful for reducing symptoms of toxic shock syndrome |
| JPH10290833A (ja) * | 1997-04-21 | 1998-11-04 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | トキシックショックシンドロームトキシン−１の吸着剤、その吸着除去方法および該吸着剤を充填してなる吸着器 |
| JP4283430B2 (ja) * | 2000-09-26 | 2009-06-24 | 株式会社カネカ | エンテロトキシンの吸着材、吸着除去方法および吸着器 |
-
2001
- 2001-03-30 DE DE10116042A patent/DE10116042A1/de not_active Ceased
-
2002
- 2002-02-25 AT AT02004217T patent/ATE373490T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-02-25 EP EP02004217A patent/EP1245238B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-25 DE DE50210908T patent/DE50210908D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-25 ES ES02004217T patent/ES2292652T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 JP JP2002087634A patent/JP2003012694A/ja active Pending
- 2002-03-29 US US10/113,809 patent/US20020177573A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE50210908D1 (de) | 2007-10-31 |
| US20020177573A1 (en) | 2002-11-28 |
| EP1245238A3 (de) | 2003-03-12 |
| DE10116042A1 (de) | 2002-10-24 |
| JP2003012694A (ja) | 2003-01-15 |
| ATE373490T1 (de) | 2007-10-15 |
| EP1245238A2 (de) | 2002-10-02 |
| EP1245238B1 (de) | 2007-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2292638T3 (es) | Peptidos, su preparacion y su uso para la union a inmunoglobulinas. | |
| ES2710025T3 (es) | Esquemas de aislamiento y purificación secuencial de proteínas mediante cromatografía de afinidad | |
| ES2673005T3 (es) | Preparación y composición de proteínas inter-alfa inhibidoras a partir de sangre | |
| US20080220968A1 (en) | [1, 2, 4] Triazolo [1, 5-A] Pyrimidine Derivatives as Chromatographic Adsorbent for the Selective Adsorption of Igg | |
| WO2013027796A1 (ja) | IgG結合性ペプチド及びそれによるIgGの検出および精製方法 | |
| Huang et al. | Affinity purification of von Willebrand factor using ligands derived from peptide libraries | |
| CN107405377B (zh) | 外泌体的破坏方法、外泌体的破坏试剂盒及来自正常细胞的外泌体的分离方法 | |
| ES2384571T3 (es) | Procedimiento para el enriquecimiento y/o la separación de ADN procariota mediante una proteína que se une específicamente a ADN que contiene motivos CpG no metilados | |
| CN112789295B (zh) | 包含IgG结合肽的固相担载体及IgG的分离方法 | |
| KR102468989B1 (ko) | IgG 결합 펩타이드를 포함하는 고상 담체 및 IgG의 분리 방법 | |
| KR19990082040A (ko) | 면역글로블린과 그의 복합체를 위한 흡착제, 흡착 방법 그리고흡착 장치 | |
| ES2292652T3 (es) | Ligando de exotoxinas. | |
| ES2269238T3 (es) | Procedimiento para la produccion de un adsorbente para disminuir la concentracion de fibrinogeno y/o de fibrina, adsorbente y su uso en la produccion de un adsorbedor. | |
| US20230391829A1 (en) | Aav8 affinity agents | |
| CA2309335A1 (en) | Igg-binding protein from staphylococcus and nucleotide sequence encoding this protein | |
| US20130165539A1 (en) | Alkaline-stable chromatographic resins | |
| US11104705B2 (en) | Methods for removing bacterial toxins from a biological fluid | |
| ES2362699T3 (es) | Método de esterilización para un medio de separación cromatográfica. | |
| Ruvo et al. | Branched peptides for the modulation of protein-protein interactions: more arms are better than one? | |
| RU2389022C2 (ru) | Сорбент для удаления иммуноглобулинов | |
| WO2022004707A1 (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２吸着担体およびそれを含むカラム | |
| EP4294542A1 (en) | Aav2 affinity agents | |
| WO2023122327A2 (en) | Chi domain affinity ligands and agents | |
| JP2015073692A (ja) | 体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材 | |
| Goldstein et al. | General references for plastics |