ES2291196T3 - Uso de complejos de epoxido hidrolasas para tratar la hipertension. - Google Patents

Abstract

Uso de un compuesto que tiene la estructura en la que X e Y son independientemente nitrógeno, oxígeno o azufre, pudiendo X ser también carbono, por lo menos uno de R1-R4 es hidrógeno, R2 es hidrógeno cuando X es nitrógeno pero no está presente cuando X es azufre u oxígeno, R4 es hidrógeno cuando Y es nitrógeno pero no está presente cuando Y es azufre u oxígeno y R1 y R3 son independientemente hidrógeno, alquilo C1-C20 sustituido o no sustituido, cicloalquilo, arilo, acilo o un radical heterocíclico, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hipertensión en un mamífero.

Description

Uso de complejos de epóxido hidrolasas para tratar la hipertensión.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al uso de compuestos de acuerdo con la fórmula de la reivindicación 1, como ureas, que forman un complejo con epóxido hidrolasas, en la fabricación de un medicamento para tratar la hipertensión.

Esta invención se ha hecho con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos bajo la subvención ES02710, concedida por el Instituto Nacional de la Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

Esta solicitud es continuación parcial de la solicitud pendiente de tramitación número de serie 08/909.523, presentada el 12 de agosto de 1997 por Hammock et al., de asignación común con ésta, que se basó en la solicitud provisional número de serie 60/023.397, presentada el 13 de agosto 1996 y actualmente abandonada.

Antecedentes de la invención

Las epóxido hidrolasas (EH; EC 3.3.2.3) son enzimas que catalizan la hidrólisis de epóxidos, incluidos óxidos de arenos, a sus correspondientes dioles por adición de agua. Las EH desempeñan un papel importante en el metabolismo de una diversidad de compuestos, incluidas hormonas, derivados de ácidos grasos, fármacos quimioterapéuticos, carcinógenos, contaminantes medioambientales, micotoxinas y otros compuestos extraños perjudiciales.

Se han descrito varios miembros de esta subfamilia de enzimas omnipresentes basándose en la especificidad de su sustrato y en su localización subcelular. Las EH de mamíferos incluyen epóxido de colesterol hidrolasa, leucotrieno A_{4} hidrolasa, hepoxilín hidrolasa, epóxido hidrolasa microsómica (mEH) y epóxido hidrolasa soluble (sEH). Las dos últimas enzimas han sido estudiadas ampliamente y se ha descubierto que tienen una selectividad amplia y complementaria de sustratos. Se sabe que las formas microsómicas y solubles destoxifican epóxidos xenobióticos mutagénicos, tóxicos y carcinogénicos, están implicadas en la homeostasis fisiológica y son miembros de la familia de las \alpha/\beta-hidrolasas.

La patente de los Estados Unidos 5.445.956, concedida el 29 de agosto de 1995 a Hammock et al., describe epóxido hidrolasa soluble recombinante humana y de ratón. La enzima de ratón proporciona un modelo de roedor para evaluar el desarrollo terapéutico de inhibidores de epóxido hidrolasas solubles humanas.

Durante los últimos veinte años se han realizado activamente investigaciones sobre buenos inhibidores de sEH, como se recopila en Hammock et al., Comprehensive Toxicology, (F. P. Guengerich editores), Pergamon, Oxford (1997), vol. 3, cap. 18, pág. 283-305. Numerosos reactivos que modifican selectivamente tioles, imidazoles y carboxilos inhiben irreversiblemente sEH. Mullin y Hammock, Arch. Biochem. Biophys., 216 (1982), pág. 423-429, describen que los óxidos de chalconas son potentes inhibidores de sEH y Dietze et al., Comp. Biochem. Physiolo., 104B, nº 2 (1993), pág. 309-314, describen que los trans-3-fenilglicidoles son potentes inhibidores quirales de sEH.

La solicitud de patente pendiente de tramitación número de serie 08/909.523, presentada el 12 de agosto de 1997 por Hammock et al., sugiere el tratamiento de enfermedades pulmonares con inhibidores de epóxido hidrolasas, como óxidos de chalconas, y describe ensayos para inhibidores de epóxido hidrolasas. Con respecto a los inhibidores de epóxido hidrolasas, se describen sustratos alternativos de las enzimas, como el epóxido de oleato de metilo y de otros ácidos grasos y ésteres o epoxioctadecenoato de metilo y fenilglicidioles, así como óxidos de
chalconas.

Se ha publicado que las enzimas EH están presentes en una gran diversidad de especies, incluidas bacterias, levaduras, hongos, plantas, nematodos, insectos, aves, peces y mamíferos. En realidad, parece que están presentes en la mayoría de los organismos, si no en todos, y tienen varias funciones. También se conocen epóxido hidrolasas de plantas. Por ejemplo, se han descrito epóxido de ácido graso hidrolasas de piel de manzana, semillas de soja y plantas de arroz. Se ha aislado y clonado la epóxido hidrolasa codificadora de cDNA de patata, berro y tabaco [Stapleton et al., Plant J., 6 (1994), pág. 251-258 (1994); Kiyosue et al., Plant J., 6 (1994), pág. 259-269; Guo et al., Plant J., 15 (1998), pág. 647-656]. Estas epóxido hidrolasas vegetales muestran una gran homología con epóxido hidrolasas solubles de mamíferos aunque son un 30% más cortas en el extremo amino terminal.

Las epóxido hidrolasas de insectos y de otros artrópodos actúan en el metabolismo de mediadores químicos endógenos, como la hormona juvenil, y en la degradación de aleloquímicos vegetales que defienden las plantas contra insectos. Estas enzimas de las plantas catalizan la hidratación del ácido epoxiesteárico a los correspondientes \alpha,\beta-dioles, que son intermedios importantes en la biosíntesis de la cutina y tienen actividad antifúngica.

Los epóxidos y dioles son intermedios sintéticos claves en la producción de sustancias químicas orgánicas brutas y finas. Así, son muy importantes los mecanismos biosintéticos para convertir epóxidos en dioles bajo condiciones suaves y estereoespecíficas. La capacidad de ensayar si una ruta biosintética implica un epóxido usando un inhibidor selectivo puede ser importante en la investigación de nuevas enzimas biosintéticas y el uso de agentes de unión de gran afinidad en la purificación por afinidad rápida de epóxido hidrolasas ha demostrado ser muy importante en el estudio de las epóxido hidrolasas solubles de mamíferos.

Los agentes de unión de gran afinidad conocidos actualmente para la purificación por afinidad de las epóxido hidrolasas solubles de mamíferos incluyen tioles, como benciltiol, alquiltioles o tioles terpenoides, que han reaccionado con medio de separación SEPHAROSE activado por epoxi (SEPHAROSE es un material disponible de la firma Pharmacia). Estas columnas de cromatografía de afinidad unen una diversidad de proteínas, muchas de las cuales tienen un sitio catalítico lipófilo. La epóxido hidrolasa soluble puede ser eluída selectivamente de estas columnas con óxidos de chalconas, en general como describen Prestwich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 (1985), pág. 1.663-1.667, y Wixtrom et al., Analyt. Biochem., 169 (1988), pág. 71-80. Sin embargo, hasta la fecha no hay sistemas de purificación por afinidad para otras epóxido hidrolasas que se puedan usar para el aislamiento inicial y clonación de enzimas así como para el aislamiento de epóxido hidrolasas con fines industriales. Siguen siendo un objetivo útil nuevos agentes de unión de gran afinidad para diversas epóxido hidrolasas, particularmente para epóxido hidrolasas solubles de mamíferos. También, pueden ser valiosos agentes eluyentes que sean competitivos, en lugar de inhibidores irreversibles.

La patente FR-A-1.403.699 describe 1,3-dicicloarilureas asimétricas y su uso para reducir el desarrollo de maleza. La patente US-A-3.347.658 describe composiciones herbicidas y métodos que emplean dicicloarilureas. P. H. Beaune et al., Journal of Chromatography, 426 (1998), 169-176, describen un método para la purificación de epóxido hidrolasa microsómica de hígado humano. La patente EP-A-4.011.903 describe el uso de compuestos derivados de la vainillina para el tratamiento de enfermedades o dolencias respiratorias. La patente EP-A-446699 describe compuestos que son útiles como inhibidores de la biosíntesis de óxido nitroso. R. Usha et al., Protein Expression and Purification, 15 (1999), 48-56, describen la purificación de un complejo multicatalítico de proteasa revelando por cromatografía de inmunoafinidad indirecta de semillas aladas de alubias. R. J. Riley et al., Br. J. Clin. Pharmac., 28 (1989), 482-487, describen requisitos estructurales para la bioactivación de anticonvulsivos a metabolitos citotóxicos in vitro. La solicitud WO 98/06261 describe métodos para tratar enfermedades pulmonares mediadas por metabolitos lipídicos poliinsaturados y ensayos de inhibidores de epóxido hidrolasas.

Resumen de la invención

Se describe, aunque no se reivindica, un proceso que es útil para purificar, aislar o inhibir una epóxido hidrolasa diana formando un complejo con un compuesto inmovilizado o en forma libre, para modificar la actividad de la epóxido hidrolasa complejada con respecto a la epóxido hidrolasa no complejada activa enzimáticamente. Compuestos útiles para formar complejos con epóxido hidrolasas en la práctica de esta invención incluyen miméticos del estado transición de la epóxido hidrolasa. Por ejemplo, las ureas, amidas y carbamatos pueden mimetizar el estado de transición de la enzima o de otros intermedios transitorios junto con el coordinado de la reacción cuando estos compuestos interaccionan establemente con el sitio catalítico de la enzima.

La presente invención se refiere al uso de una clase de compuestos con esta capacidad de formar un complejo que tienen la estructura indicada en la fórmula 1

1

en la que X e Y son independientemente nitrógeno, oxígeno o azufre, pudiendo X ser también carbono, por lo menos uno de R_{1}-R_{4} es hidrógeno, R_{2} es hidrógeno cuando X es nitrógeno pero no está presente cuando X es azufre u oxígeno, R_{4} es hidrógeno cuando Y es nitrógeno pero no está presente cuando Y es azufre u oxígeno y R_{1} y R_{3} son independientemente un alquilo sustituido o no sustituido, haloalquilo, cicloalquilo, arilo, acilo o radical heterocíclico, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hipertensión en un mamífero.

Cuando la actividad modificada de la epóxido hidrolasa complejada es inhibición de la enzima, entonces las realizaciones de compuestos particularmente preferidos tienen una IC_{50} (inhibición de potencia o, por definición, concentración de inhibidor que reduce la actividad de la enzima un 50%) menor que 500 \muM. Por ejemplo, se ha descubierto que los cinco compuestos enumerados en la tabla 1 tienen una IC_{50} menor que 0,1 \muM en el caso de epóxido hidrolasa soluble de ratón y menor que 0,8 \muM en el caso de epóxido hidrolasa soluble humana.

TABLA 1

2

En la tabla 1, el compuesto 187 es una amida e ilustra que el farmacóforo puede ser más general que ureas o carbamatos.

Típicamente las enzimas de interés para esta invención pueden distinguir enantiómeros. Así, en la elección de un inhibidor a usar para una aplicación de acuerdo con la invención se prefiere investigar diferentes isómeros ópticos del inhibidor con la enzima seleccionada mediante ensayos de rutina para elegir el isómero óptico mejor, si fuera apropiado, para la aplicación particular. Los farmacóforos descritos en la presente memoria se pueden usar para aportar una funcionalidad reactiva al sitio catalítico. Aquellos pueden incluir agentes alquilantes como halógenos o epóxidos o aceptores de Michael que reaccionarán con tioles y aminas. Estas funcionalidades reactivas también se pueden usar para aportar marcadores fluorescentes o de afinidad al sitio activo de la enzima para detección de la enzima.

La inhibición de epóxido hidrolasas solubles puede ser terapéuticamente eficaz para tratar enfermedades inflamatorias, como síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto. Esto se debe a que los inhibidores adecuados de epóxido hidrolasas retrasan o evitan una respuesta inflamatoria en un paciente por inhibición o formación de uno o más metabolitos lipídicos poliinsaturados de modo que inhiben la formación de dihidroxioxieicosadienoatos (diOHoxiEDE) en la serie de ácidos araquidónicos de oxilipinas. Es bien sabido que los epóxidos del ácido araquidónico (EET) y en algunos casos los correspondientes dioles (DHET) son también biológicamente activos. Se supone que están implicados en el comienzo y gravedad de la fiebre (Kozak, 1998), inhiben la producción de prostaglandina E2 en el músculo de fibras lisas de los vasos (Fang, 1998), median vasodilatación del corazón inducida por bradiquinina (Fulton, 1998), inducen vasodilatación (Oltman, 1998; Imaoka, 1998) y tienen otros efectos fisiológicos. Parece que las epóxido hidrolasas solubles bioactivan un mediador derivado de un inflamatorio, lo cual sugiere la necesidad de inhibidores eficaces y específicos del sitio de epóxido hidrolasas como los descritos en la presente memoria. Los inhibidores de epóxido hidrolasas también se pueden usar terapéuticamente para tratar fiebre, enfermedades inflamatorias e hipertensión. Así, los inhibidores de la invención actúan reduciendo la conversión de epóxidos de lípidos en los correspondientes dioles, como la conversión de EET en DHET.

La formación de un complejo de epóxido hidrolasa es útil para purificar o aislar la epóxido hidrolasa diana. Por ejemplo, se puede derivatizar el compuesto de fórmula 1 para inmovilizarle a un soporte insoluble en agua. Cuando se pone en contacto el soporte con epóxido hidrolasa enzimáticamente activa, como cuando se eluye una solución acuosa que tiene hidrolasa unida al soporte, la formación del complejo origina la separación selectiva de la epóxido hidrolasa.

También se pueden usar inhibidores, como ciertos análogos y derivados activos del compuesto de fórmula 1, para eluir epóxido hidrolasas de aquellos y de otros soportes. Como se ha indicando anteriormente, compuestos útiles para formar un complejo con epóxido hidrolasas incluyen miméticos diciclohexílicos del estado de transición de la epóxido hidrolasa, como ureas y carbamatos, que pueden mimetizar el estado de transición de la enzima cuando interaccionan establemente con el sitio catalítico de la enzima. Se ha descubierto que análogos del compuesto de fórmula 1, que también pueden actuar como inhibidores selectivos de epóxido hidrolasas solubles, incluyen compuestos con la estructura de la fórmula 2 (en la que X, Y, R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son como se ha descrito para la fórmula 1 pero en la que Z es oxígeno o azufre y W es carbono, fósforo o azufre). En la tabla 2 se indican varios compuestos ilustrativos con la estructura de la fórmula 2. El compuesto 12 se puede convertir en la correspondiente carbodiimida (compuesto 1) y después en la correspondiente urea (compuesto 2). Los compuestos de fórmula 2 no son parte de la presente invención, excepto los que están dentro de la fórmula 1.

3

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

4

\vskip1.000000\baselineskip

Se puede convertir química y bioquímicamente una tiourea en una carbodiimida e hidrolizar ésta a la urea. Si los sustituyentes de N y N' son ciclohexilo, el compuesto es diciclohexilcarbodiimida (compuesto 1).

Se cree que los inhibidores descritos en la presente memoria son los primeros inhibidores biológicamente estables de epóxido hidrolasas. Los inhibidores tienen aplicaciones en epóxido hidrolasas de mamíferos, plantas, insectos y probablemente en cualquier organismo con una epóxido hidrolasa.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B ilustran gráficamente el efecto del tiempo sobre la inhibición de EH soluble de ratón y EH soluble humana, respectivamente, por los compuestos 1 y 2, y

la figura 2 ilustra gráficamente el efecto del compuesto 2 sobre la EH soluble de patata (22,5 nM) y EH soluble de berro (35 nM).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Los presentes compuestos son inhibidores de epóxido hidrolasas, preferiblemente inhibidores selectivos. Esto significa que un inhibidor tiene un efecto inhibidor mayor sobre una enzima EH que sobre otras enzimas EH y tiene una selectividad mayor hacia enzimas EH que hacia enzimas que no son EH.

La práctica particularmente preferida de esta invención es inhibir selectivamente EH solubles. El ejemplo 5 muestra el ensayo usado para determinar la inhibición selectiva de EH solubles para una serie de compuestos útiles de acuerdo con esta invención, cuyos datos de inhibición se detallan en la tabla 4. La selectividad se ilustra en la tabla 3 en la que el inhibidor usado fue el compuesto 2.

TABLA 3

5

\vskip1.000000\baselineskip

Como indican los datos de la tabla 3, el compuesto 2 a una concentración de 100 \muM inhibió totalmente las actividades de EH citosólica y peroxisómica sin que se observara una inhibición significativa en las actividades de otras enzimas ensayadas. Estos resultados ilustran la inhibición selectiva, por los compuestos útiles de la invención, de EH solubles presentes en el citosol y peroxisoma. Una conclusión de estos datos es que el compuesto 2 es un inhibidor potente de EH citosólica y peroxisómica pero no de las otras enzimas ensayadas. La K_{i} calculada para el compuesto 2 con sEH de ratón fue 22 \pm 3 nM.

Inhibición adecuada

Se describe un proceso que es útil para purificar, aislar o inhibir una epóxido hidrolasa diana formando un complejo con un compuesto inmovilizado o en forma libre para modificar la actividad de la epóxido hidrolasa así complejada con respecto a la epóxido hidrolasa no complejada activa enzimáticamente.

Los compuestos con esta capacidad de formar un complejo a usar de acuerdo con la invención tienen la estructura indicada por la fórmula 1

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

en la que X e Y son independientemente nitrógeno, oxígeno o azufre, pudiendo X ser también carbono, por lo menos uno de R_{1}-R_{4} es hidrógeno, R_{2} es hidrógeno cuando X es nitrógeno pero no está presente cuando X es azufre u oxígeno, R_{4} es hidrógeno cuando Y es nitrógeno pero no está presente cuando Y es azufre u oxígeno y R_{1} y R_{3} son independientemente hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido o no sustituido, cicloalquilo, arilo, acilo o radical heterocíclico.

Además de los compuestos de fórmula 1 que interaccionan con la enzima de una manera reversible basándose en que el inhibidor mimetiza un estado de transición del sustrato de la enzima o un intermedio de la reacción, otros compuestos son inhibidores irreversibles de la enzima. Las estructuras activas como las indicadas en las tablas o por la fórmula 1 pueden dirigir el inhibidor hacia la enzima, en la que una funcionalidad reactiva presente en el sitio catalítico de la enzima puede formar un enlace covalente con el inhibidor. Un grupo de moléculas que pueden interaccionar así puede tener un grupo saliente, como un halógeno o tosilato, que puede ser atacado de una manera S_{N}2 con una lisina o histidina. Alternativamente, la funcionalidad reactiva puede ser un epóxido o un aceptor de Michael, como un éster \alpha/\beta-insaturado, aldehído, cetona, éster o nitrilo.

Como se muestra en la figura 1, la inhibición de la sEH de ratón por el compuesto 1 se incrementa con el tiempo mientras que la inhibición por el compuesto 2 es estable con el tiempo. Esta observación puede ser explicada por el hecho de que la carbodiimida 1 se hidroliza lentamente en solución acuosa a la urea 2. Estos resultados apoyan la hipótesis de que las ureas, carbamatos, amidas y compuestos relacionados discutidos en esta invención actúan directamente. Estos resultados ilustran también la posibilidad de usar carbodiimidas como formas precursoras de las ureas útiles en la invención. A su vez, se han usado comercialmente tioureas como formas precursoras de
carbodiimidas.

La diciclohexiltiolurea puede ser oxidada a diciclohexilcarbodiimida que, con la enzima o un ácido acuoso (solución salina fisiológica), formará una diciclohexilurea activa. Alternativamente, los protones ácidos de carbamatos o ureas pueden ser reemplazados por una diversidad de sustituyentes que por oxidación, hidrólisis o ataque por un nucleófilo (como glutatión) darán la correspondiente estructura generadora. Estos materiales son conocidos como profármacos o protoximas [Gilman et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7ª edición (1985), MacMillan Publishing Company, Nueva York, pág. 16]. Por ejemplo, profármacos comunes son ésteres, que se descomponen enzimáticamente dando los correspondientes alcoholes y ácidos [Yoshigae et al., Chiralty, 9 (1997), pág. 661-666]. Los profármacos pueden ser quirales para tener una mayor especificidad. Estos derivados se han usado ampliamente en química médica y agrícola para alterar propiedades farmacológicas de los compuestos, como aumentar su solubilidad en agua, mejorar la química de formulación, alterar el tejido diana, alterar su volumen de distribución y alterar su penetración. También se han usado para alterar perfiles toxicológicos.

Hay muchos profármacos posibles pero es particularmente atractiva la sustitución de uno o los dos hidrógenos activos de las ureas descritas en la presente memoria o del único hidrógeno activo presente en los carbamatos. Estos derivados han sido descritos ampliamente por Fukuto y asociados y se usan comúnmente en química médica y agrícola para alterar propiedades farmacológicas de los compuestos [Black et al., "Selective Toxicity of N-Sulfenylated Derivatives of Insecticidal Methylcarbamate Esters", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 21(5) (1973), pág. 747-751; Fahmy et al., "Selective Toxicity of N,N'-thiodicarbamates", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 31(3) (1983), pág. 613-620; y Fahmy et al., "N-Sulfinylated Derivative of Methylcarbamate Esters", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 29(3) (mayo-junio 1981), pág. 567-572].

Sin estar ligado por teoría alguna, se cree que los inhibidores adecuados de la invención mimetizan el estado de transición de la enzima por lo que hay una interacción estable con el sitio catalítico de la enzima. Parece que los inhibidores forman enlaces de hidrógeno con el ácido carboxílico nucleófilo y una tirosina polarizante del sitio catalítico.

Cuando la actividad modificada de la epóxido hidrolasa complejada es inhibición de la enzima, las realizaciones de compuestos particularmente preferidos tienen una IC_{50} (potencia de inhibición o, por definición, concentración de inhibidor que reduce la actividad de la enzima un 50%) menor que 500 \muM.

Aislamiento o purificación de epóxido hidrolasas mediante separación por afinidad

Se describen sistemas de purificación por afinidad para enzimas que tienen una cavidad de oxianión y un ácido nucleófilo en el sitio catalítico, particularmente cuando la enzima es una epóxido hidrolasa. Se cree que los inhibidores indicados en la presente memoria que inhiben EH solubles inhibirán también una amplia gama de enzimas de la familia de \alpha/\beta-hidrolasas que tienen un ácido nucleófilo en el sitio catalítico. Así, se describe un método de purificación de una epóxido hidrolasa inmovilizando a un soporte insoluble en agua un compuesto que tiene la estructura de la fórmula 2

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

en la que Z es oxígeno, nitrógeno o azufre, W es carbono, fósforo o azufre, X e Y son independientemente nitrógeno, oxígeno o azufre, pudiendo X ser también carbono, R_{1}-R_{4} son hidrógeno, R_{2} es hidrógeno cuando X es nitrógeno pero no está presente cuando X es azufre u oxígeno, R_{4} es hidrógeno cuando Y es nitrógeno pero no está presente cuando Y es azufre u oxígeno y R_{1} y R_{3} son independientemente hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido o no sustituido, cicloalquilo, arilo, acilo o un radical heterocíclico.

Soportes insolubles en agua adecuados a los que se inmoviliza útilmente el compuesto de fórmula 2 incluyen SEPHAROSE activada por epoxi, y aminopropil-, hexil- o carboxil-SEPHAROSE. Se puede usar una diversidad de matrices sólidas, incluidas perlas de vidrio, perlas de polivinilo o agarosa.

\newpage

Los compuestos así inmovilizados constituyen un material adecuado de relleno para separaciones por afinidad, pudiendo formar los compuestos inmovilizados un complejo con la epóxido hidrolasa cuando se eluye una solución acuosa a través de una columna rellena con el material de separación o en un procedimiento discontinuo.

Típicamente la inmovilización del compuesto será derivatizando uno de R_{1} o R_{3} por métodos bien conocidos. Por ejemplo, Pharmacia Fine Chemicals comercializa materiales de afinidad con aminopropilo u otro amino terminal (típicamente bajo el nombre comercial "SEPHAROSE") y BioRad Laboratories comercializa geles y perlas de agarosa para diversas necesidades de cromatografía de afinidad (típicamente bajo la marca comercial "AFFI-GEL"). Estos materiales pueden ser tratados, por ejemplo, con isocianatos para dar derivados de urea inmovilizados estables de acuerdo con la invención que pueden formar un complejo con epóxido hidrolasas. Alternativamente, se pueden usar los compuestos de fórmula 1 para eluir epóxido hidrolasas en columnas de afinidad más generales, como cuando un tiol (por ejemplo, benciltiol) reacciona con "SEPHAROSE" activada por epoxi (en forma de gel o de perlas) preparada por reacción de diglicidil éter de butanoglicol. Las epóxido hidrolasas en solución acuosa pueden ser eluidas selectivamente con las ureas derivatizadas de fórmula 1 o con compuestos derivatizados de fórmula 2 de acuerdo con esta invención.

Inhibición de epóxido hidrolasas para tratar enfermedades inflamatorias (no es parte de la invención)

La respuesta inflamatoria es uno de los mecanismos fisiológicos más importantes para el mantenimiento de la salud humana. Sin embargo, trastornos de inflamación o una respuesta inflamatoria inapropiada pueden originar lesión de tejidos, morbilidad o mortalidad.

El síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto (ARDS, de sus siglas en inglés Adult Respiratory Distress Syndrome) es una enfermedad pulmonar que tiene una tasa de mortalidad del 50% y resulta de lesiones de los pulmones causadas por una diversidad de condiciones presentes en pacientes con traumas y en víctimas de quemaduras graves [R. H. Ingram Jr., "Adult Respiratory Distress Síndrome", Harrison's Principals of Internal Medicine, 13 (1995), pág. 1.240]. Con la posible excepción de glucocorticoides, no hay agentes terapéuticos conocidos que sean eficaces para prevenir o mejorar las lesiones de los tejidos, como daño microvascular, asociadas con la inflamación aguda que se produce durante el desarrollo inicial del ARDS.

El ARDS, que se define en parte por el desarrollo de edema alveolar, representa una manifestación clínica de enfermedad pulmonar resultante de lesión directa e indirecta de los pulmones. Aunque estudios anteriores han detallado una diversidad aparentemente no relacionada de agentes causantes, no se comprenden bien los síntomas iniciales de la patofisiología del ARDS. El ARDS fue considerado originalmente como fallo de un único órgano pero actualmente se considera como componente del síndrome de fallo multiorgánico. La intervención o prevención farmacológica de la respuesta inflamatoria se considera actualmente como un método más prometedor de controlar el proceso de la enfermedad que técnicas de apoyo de ventilación mejorada. Véase, por ejemplo, Demling. Annu. Rev. Med., 46 (1995), pág. 193-203.

Otra enfermedad (o grupo de enfermedades) que implica inflamación aguda es el síndrome de respuesta inflamatoria sistemática (SIRS), que es la designación establecida recientemente por un grupo de investigadores para describir estados relacionados resultantes, por ejemplo, de sepsis, pancreatitis, trauma múltiple (como lesión cerebral) y lesión de tejidos (como laceración de musculatura), cirugía del cerebro, shock hemorrágico y lesiones de órganos mediadas inmunológicamente [Bone, JAMA, 268: 24 (1992), pág. 3.452-3.455].

Los pulmones, con su extensa superficie expuesta directamente al medioambiente, son particularmente susceptibles a lesiones oxidantes y productos de inflamación. Puesto que toda la producción cardíaca pasa a través de la arteria pulmonar, los pulmones también pueden ser lesionados por agentes transportados por la sangre. La heterogeneidad celular de los pulmones de los mamíferos complica el estudio directo de las células pulmonares más susceptibles a lesión. Además, la compleja anatomía pulmonar hace difícil distinguir exactamente dónde se metabolizan agentes biológicos en los tejidos de los pulmones. El tejido diana y la secuencia de sucesos en el edema alveolar no se han establecido de modo definitivo; en consecuencia, siguen siendo dudosas las interrelaciones y contribuciones relativas de compartimentos endotelial versus epitelial versus inflamatorio para mitigar el daño a la barrera
aire-sangre.

Las molestias del ARDS se ven en una diversidad de pacientes con quemaduras graves o sepsis. La sepsis es, a su vez, uno de los síntomas del ARDS. En el ARDS hay una reacción inflamatoria aguda con cantidades grandes de neutrófilos que emigran al interior del intersticio y alvéolos. Si esto progresa, hay mayor inflamación, edema y proliferación celular y el resultado final es el deterioro de la capacidad de extraer oxígeno. El ARDS es así una complicación común en una gran variedad de enfermedades y traumas. El único tratamiento es de apoyo. Se estima unos 150.000 casos anuales y la mortalidad varía de 10 a 90%.

No se conoce la causa exacta del ARDS. Sin embargo se ha supuesto que una sobreactivación de los neutrófilos origina la liberación de ácido linoleico a niveles altos por actividad de la fosfolipasa A_{2}. El ácido linoleico se convierte a su vez enzimáticamente en 9,10-epoxi-12-octadecenoato por la epoxigenasa del citocromo P-450 de los neutrófilos y/o por un estallido de oxígeno activo. Este epóxido de lípido, o leucotoxina, se encuentra a niveles altos en piel quemada y en el suero y lavado bronquial de pacientes quemados. Además, cuando se inyecta en ratas, ratones, perros y otros mamíferos origina ARDS. No se conoce el mecanismo de acción. Sin embargo, parece que el leutotoxindiol producido por la acción de la epóxido hidrolasa soluble es un inductor específico de la transición de la permeabilidad de la membrana interior mitocondrial (MPT). Esta inducción por el leucotoxindiol, la liberación diagnóstica de citocromo c, condensación nuclear, ADN que corre y activación de CPP32 que origina muerte celular son inhibidas por la ciclosporina A que es diagnóstico de muerte celular inducida por MPT. Las acciones a nivel celular y mitocondrial son conformes con este mecanismo de acción sugiriendo que los inhibidores descritos en la presente memoria se pueden usar terapéuticamente con compuestos que bloquean MPT.

Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas útiles en la invención que contienen los inhibidores se pueden preparar por cualquiera de diversos métodos bien conocidos. Típicamente, el inhibidor se formula para una administración oral o parenteral adecuada y se disuelve o dispersa en un excipiente o diluyente fisiológicamente tolerable. Como ejemplo, el inhibidor se puede disolver o dispersar en una composición líquida como suspensión o solución estéril o como preparación isotónica. Particularmente adecuados son medios inyectables formulados con solución de glucosa o con solución salina estéril o isotónica tamponada o no tamponada. Son bien conocidos para uso in vitro en el que la inhibición de la actividad de la epóxido hidrolasa diana puede ser monitorizada por la disminución del grado de inflamación. La cantidad de inhibidor terapéutico administrado puede ser en una sola administración o un submúltiplo de la cantidad total. También se contempla varias administraciones durante un período de varios días, semanas o meses.

El agente activo también se puede usar en composiciones como comprimidos o píldoras que contienen preferiblemente una dosis unidad y se puede mezclar con ingredientes convencionales de preparación de comprimidos. Los niveles reales de dosificación del inhibidor de la epóxido hidrolasa se pueden variar para obtener la respuesta terapéutica deseada para una composición y método de administración particulares. Se contempla que la dosis diaria total es 0,001 a 100 mg por kg de peso corporal. Sin embargo, cuando se practica la invención se deben evitar fármacos como clofibrato, que se sabe induce a la epóxido hidrolasa soluble y al citocromo P-450, y acetaminofeno, que consume glutatión. Esto se debe a que se tienen datos experimentales que sugieren que cuando disminuyen los niveles de glutatión, la leucotoxina es más tóxica. Por el contrario, se deben estimular terapias paralelas diseñadas para favorecer rutas alternativas del metabolismo de la leucotoxina, como administración de N-acetilcisteína y glutatión y sus ésteres etílicos.

El ejemplo 1 ilustra un uso in vivo del inhibidor 2 para bloquear la muerte de ratones inducida por leucotoxinas/isoleucotoxinas o alargar la vida de ratones.

Ejemplo 1 de referencia

Se adquirieron ratones machos Swiss Webster (de 25-28 gramos) de Simonsen, Gilroy, California. Los animales tenía acceso libre a agua y comida. Se trataron los animales (tres en cada grupo) por vía intraperitoneal con diciclohexilurea (compuesto 2) suspendida en aceite de maíz (400 mg/kg, 7 ml/kg) o con aceite de maíz como controles positivos. Después de 30 minutos de pretratamiento, se trataron los ratones por vía intravenosa a través de la vena caudal con una mezcla 1:1 de ésteres metílicos de leucotoxina/isoleucotoxina en etanol (700 mg/kg, 1,0 ml/kg).

Los ratones murieron de insuficiencia respiratoria después de exponerlos a leucotoxina/isoleucotoxina. Las reacciones letales tuvieron lugar secuencialmente con respiración acelerada, apertura de la boca para ayudar a respirar y sangrado de la nariz. Sin embargo, el pretratamiento con N,N'-diciclohexilurea (compuesto 2) bloqueó la muerte de los animales inducida por leucotoxina/isoleucotoxina o alargó la vida de los ratones.

Otras aplicaciones de la inhibición de epóxido hidrolasas

La inhibición de epóxido hidrolasas puede ser valiosa para fines de investigación, como inhibir epóxido hidrolasa microsómica en el ensayo de Ames y en otros ensayos de toxicidad en los que se puede incrementar la sensibilidad del ensayo para mutagenes y carcinogenes que contienen epóxido y ensayar la hipótesis de que el epóxido está implicado en la acción de toxinas.

La tabla 4 ilustra una diversidad de inhibidores junto con datos de inhibición.

TABLA 4

8

\vskip1.000000\baselineskip

Los datos de la tabla 4 ilustran que las EH solubles pueden ser inhibidas selectivamente y que las EH microsómicas también pueden ser inhibidas por los compuestos 19 y 101 . Se cree que estos compuestos inhibirán una amplia gama de enzimas de la familia de las \alpha/\beta-hidrolasas que tienen un ácido nucleófilo en el sitio catalítico. Los compuestos permitirán desarrollar química computacional para predecir materiales activos adicionales.

Además, la tabla 4 ilustra que el compuesto 2 (realización preferida) es un inhibidor muy potente de las EH. También ilustra que los compuestos 19, 101, 204 y 238 son inhibidores selectivos potentes de la EH microsómica. El compuesto 225 ilustra que se pueden usar compuestos quirales para incrementar la potencia y selectividad.

Como se ha indicado anteriormente, los metabolitos o productos de la degradación de los inhibidores de fórmula 1 ó 2 también pueden formar complejos inhibidores con EH y ser útiles en la práctica de la invención. Así, por ejemplo, el compuesto 32 de la tabla 4 es un conocido metabolito del herbicida Diurón y el compuesto 32 inhibe epóxido hidrolasa soluble humana y de ratón. El compuesto 303 (producto de la degradación del compuesto 28) es un inhibidor mejor de la epóxido hidrolasa microsómica de rata.

También pueden ser útiles usos terapéuticos de la inhibición de epóxido hidrolasas de acuerdo con la invención conjuntamente con una terapia contra el cáncer. Esto se debe a que la expresión de epóxido hidrolasas en tumores malignos es un mecanismo posible que ha sido sugerido en el caso de resistencia a fármacos anticancerosos [Murray et al., "The Expression of Cytochrome P-450, Epoxide Hydrolase and Glutathione S-Transferase in Hepatocellular Carcinoma", Cancer, 71 (1993), pág. 36-43; Theyer et al., "Role of the MDR-1-Encoded Multiple Drug Resistance Phenotype in Prostate Cancer Cell Line", J. of Urology, 150 (1993), pág. 1.544-1.547; Murray et al., "The Immunohistochemical Localization of Drug-Metabolizing Enzymes in Prostate Cancer", J. of Pathology, 177 (1995), pág. 147-152].

Por ejemplo, la tabla 5 ilustra actividad de mEH para el óxido de cis-estilbeno [Wixtrom y Hammock, Biochemical Pharmacology and Toxicology (1985), vol. 1: Methodological Aspect of Drug Metabolizing Enzymes (Zakin y Versey editores), pág. 1-93, John Wiley & Sons Inc., Nueva York] con diversas líneas de células cancerosas que expresan EH microsómica. Es bien sabido que esta enzima participa en el metabolismo hepático de fármacos. Así, la inhibición de esta enzima por compuestos de fórmula 1 o por el compuesto 2 disminuirá el metabolismo de fármacos anticancerosos que contengan epóxido e incrementará por tanto su eficacia.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5

9

\vskip1.000000\baselineskip

Como se ve por los datos de la tabla 5, la actividad de EH microsómicas es expresada significativamente en varias líneas de células cancerosas y podría participar en el metabolismo de fármacos anticancerosos, como diepóxido de ciclohexeno, en tumores malignos. Se ha desarrollado una diversidad de fármacos antineoplásicos cuya acción se basa en las propiedades alquilantes de epóxidos y diepóxidos. Los inhibidores de epóxido hidrolasas pueden estabilizar estos compuestos e incrementar su actividad antineoplásica.

Ejemplo 2 Síntesis de 1-octil-3-pentilurea

Se añaden 0,53 ml (0,47 g, 3,0 mmol) de isocianato de octilo a 0,262 g (3,00 mmol) de pentilamina en 20 ml de hexano, agitando, para producir finalmente un sólido cristalino blanco. Después de dejar en reposo durante una noche, la mezcla se enfría y el producto sólido se recoge y lava con hexano frío. Tras secar al aire se obtienen 0,705 g (2,91 mmol, 97%) de 1-octil-3-pentilurea en forma de agujas blancas muy finas (P.f. 65,0-65,5ºC). El material presenta un espectro de RMN-^{13}C y de masas de acuerdo con la estructura asignada.

RMN-^{13}C (CDCl_{3}) \delta : 159,0 (C=O), 40,47 y 40,45 (C-1 y C-1'), 31,8 (C-6 y C-3'), 30,4 (C-2), 30,1 (C-2'), 29,3 (C-4), 29,2 (C-5), 27,0 (C-3), 22,5 (C-7), 22,4 (C-4'), 13,9 (C-8 y C-5'); están presente bandas importantes de absorción infrarroja (disco de KBr) a 3.334 (s, N-H), 1.617 (vs, C=O) y 1.579 (vs, amido II) cm^{-1}.

Ejemplo 3 Síntesis de 1-ciclohexil-3-ciclooctilurea

0,382 g de ciclooctilamina (0,382 g, 3,00 mmol) y 0,40 ml (0,39 g, 3,1 mmol) de isocianato de ciclohexilo en 20 ml de hexano proporcionan, después de dejar en reposo durante un día, 0,664 g (88%) de 1-ciclohexil-3-ciclooctilurea en forma de agujas blancas (P.f. 194,0-194,5ºC).

El espectro de infrarrojos [3.344 (s, NH), 3.334 (s, NH), 1.624 (vs, C=O), 1.564 (vs, amido II) cm^{-1}] y el espectro de masas [FAB-MS m/z calculado para C_{15}H_{28}N_{2}O: 252; observado: 253 (M + H^{+})] confirman la identidad de este material.

Ejemplo 4 Éster de ciclohexilo del ácido ciclohexilcarbamotioico

Se añade lentamente una solución de 0,626 g (5,00 mmol) de isocianato de ciclohexilo en 5 ml de hexano a una solución de 0,61 ml (0,58 g, 5,0 mmol) de ciclohexiltiol en 25 ml de hexano. Añadiendo una gota de 1,8-diaza-biciclo[5.4.0]undec-7-eno se inicia la formación de un producto cristalino blanco. Después de varios días a temperatura ambiente, la mezcla se enfría y el éster de S-ciclohexilo del ácido ciclohexilcarbamotioico se recoge, se lava con hexano enfriado por hielo y se seca proporcionando 1,15 g (4,76 mmol, 95%) de producto, que funde a 117,0-118,0ºC.

Se observa el espectro de RMN-^{13}C confirmativo de este material: \delta 165,9 (C=O), 50,3 (C-1), 43,4 (C-1'), 33,8 (C-2',6'), 33,1 (C-2,6), 26,0 (C-3',5'), 25,5 (C-4'), 25,4 (C-4), 24,7 (C-3,5). Se observan bandas infrarrojas (KBr) a 3.343 (s, N-H), 1.649 (vs, C=O) y 1.206 (m, C-N) cm^{-1}.

Ejemplo 5 de referencia

Ensayo para determinar la inhibición de EH soluble

Se produjeron sEH recombinante de ratón (MsEH) y sEH humana (HsEH) en un sistema de expresión de baculovirus como se ha publicado anteriormente [Grant et al., J. Biol. Chem., 268 (1993), pág. 17.628-17.633; Beetham et al., Arch. Biochem. Biophys., 305 (1993), pág. 197-201]. Las proteínas expresadas se purificaron a partir de lisado de las células por cromatografía de afinidad [Wixtrom et al., Anal. Biochem., 169 (1988), pág. 71-80]. Se cuantificó la concentración de proteínas mediante el ensayo BCA de Pierce usando como patrón de calibración albúmina de suero bovino (BSA). Las preparaciones tenían una pureza de por lo menos 97%, evaluada por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y densitometría de barrido. No contenían esterasa detectable ni mostraban actividad de glutatión transferasa que pudiera interferir en el ensayo. El ensayo también se evaluó con resultados similares en lisados brutos de células u homogeneizado de tejidos.

Se determinó la IC_{50} de cada inhibidor mediante el ensayo espectrofotométrico de Dietze et al. [Dietze et al., "Spectrophotometric Substrates for Cytosolic Epoxide Hydrolase", Anal. Biochem., 216 (1994), pág. 176-187] usando genes clonados de epóxido hidrolasa expresados en el sistema de baculovirus usando carbonato de 4-nitrofenil-trans-2,3-epoxi-3-fenilpropilo racémico (NEP2C) como sustrato. En una microplaca de estireno de 96 pocillos, se añadieron 20 \mul de la preparación de enzimas y 2 \mul de la solución del inhibidor en dimetilformamida (DMF) ([I] final: 0,05 a 500 M) a 180 \mul de fosfato sódico (0,1M, pH 7,4) que contenía 0,1 mg/ml de BSA. Se incubó la mezcla durante 5 minutos a 30ºC. Se obtuvo después una concentración de sustrato de 40 \muM añadiendo 4 \mul de una solución 3 mM. Se valoró la actividad midiendo la aparición de 4-nitrofenolato a 405 nm a 30ºC durante 1 minuto (Spectramax 200; Molecular Device Inc., Estados Unidos). Los ensayos se realizaron por cuatriplicado. Por definición, IC_{50} es la concentración de inhibidor que reduce la actividad de la enzima un 50%. Se determinó la IC_{50} por regresión de por lo menos cinco puntos de datos con un mínimo de dos puntos en la región lineal de la curva en cada lado de la IC_{50}. Se generó la curva a partir de por lo menos cuatro ensayos distintos para obtener la desviación estándar. En por lo menos un ensayo se incluyeron compuestos de potencia similar para asegurar el orden del rango. Un orden de rango adicional entre compuestos muy buenos se determinó mediante el ensayo con óxido de ^{3}H-trans-estilbeno descrito por Wixtrom y Hammock (véase la referencia a continuación) y mediante un ensayo relacionado basado en Borhan et al., "Improved Radiolabeled Substrates for Soluble Epoxide Hydrolase", Anal. Biochem., 231 (1995), pág. 188-200. Un ensayo similar de partición basado en óxido de ^{3}H-trans-estilbeno se describe en Wixtrom y Hammock, "Membrane-Bound and Soluble-Fraction Epoxide Hydrolases: Methodological Aspects", Biochemical Pharmacology and Toxicology, vol. 1, (Zakim y Vessey editores), pág. 1-93, John Wiley & Sons Inc., Nueva York (1985).

Ejemplo 6 de referencia

Efecto sobre otras enzimas

Se ensayaron EH microsómica de mamíferos usando óxido de ^{3}H-trans-estilbeno, EH microsómica de insectos con ^{3}H-hormona juvenil III y óxido de ^{3}H-trans-difenilpropeno, EH citosólico y peroxisómico de mamíferos y plantas usando óxido de ^{3}H-trans-difenilpropeno, P-450 usando ^{3}H-testosterona, carboxil esterasa usando acetato de p-nitrofenilo y glutatión-S-transferasa usando clorodinitrobenceno. Se ensayó pepsina usando hemoglobina como sustrato.

Claims (4)

1. Uso de un compuesto que tiene la estructura

10

en la que X e Y son independientemente nitrógeno, oxígeno o azufre, pudiendo X ser también carbono, por lo menos uno de R_{1}-R_{4} es hidrógeno, R_{2} es hidrógeno cuando X es nitrógeno pero no está presente cuando X es azufre u oxígeno, R_{4} es hidrógeno cuando Y es nitrógeno pero no está presente cuando Y es azufre u oxígeno y R_{1} y R_{3} son independientemente hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} sustituido o no sustituido, cicloalquilo, arilo, acilo o un radical heterocíclico, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hipertensión en un mamífero.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el medicamento es para usarlo conjuntamente con una terapia contra el cáncer.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cantidad terapéutica eficaz del compuesto proporcionado es una dosis diaria total de 0,001 a 100 mg por kg de peso corporal del mamífero.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto reduce la conversión de epóxidos de lípidos a los correspondientes dioles.