ES2291196T3 - Uso de complejos de epoxido hidrolasas para tratar la hipertension. - Google Patents
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Abstract
Uso de un compuesto que tiene la estructura en la que X e Y son independientemente nitrógeno, oxígeno o azufre, pudiendo X ser también carbono, por lo menos uno de R1-R4 es hidrógeno, R2 es hidrógeno cuando X es nitrógeno pero no está presente cuando X es azufre u oxígeno, R4 es hidrógeno cuando Y es nitrógeno pero no está presente cuando Y es azufre u oxígeno y R1 y R3 son independientemente hidrógeno, alquilo C1-C20 sustituido o no sustituido, cicloalquilo, arilo, acilo o un radical heterocíclico, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hipertensión en un mamífero.
Description
Uso de complejos de epóxido hidrolasas para
tratar la hipertensión.
La presente invención se refiere en general al
uso de compuestos de acuerdo con la fórmula de la reivindicación 1,
como ureas, que forman un complejo con epóxido hidrolasas, en la
fabricación de un medicamento para tratar la hipertensión.
Esta invención se ha hecho con el apoyo del
gobierno de los Estados Unidos bajo la subvención ES02710, concedida
por el Instituto Nacional de la Salud. El gobierno tiene ciertos
derechos en esta invención.
Esta solicitud es continuación parcial de la
solicitud pendiente de tramitación número de serie 08/909.523,
presentada el 12 de agosto de 1997 por Hammock et al., de
asignación común con ésta, que se basó en la solicitud provisional
número de serie 60/023.397, presentada el 13 de agosto 1996 y
actualmente abandonada.
Las epóxido hidrolasas (EH; EC 3.3.2.3) son
enzimas que catalizan la hidrólisis de epóxidos, incluidos óxidos
de arenos, a sus correspondientes dioles por adición de agua. Las EH
desempeñan un papel importante en el metabolismo de una diversidad
de compuestos, incluidas hormonas, derivados de ácidos grasos,
fármacos quimioterapéuticos, carcinógenos, contaminantes
medioambientales, micotoxinas y otros compuestos extraños
perjudiciales.
Se han descrito varios miembros de esta
subfamilia de enzimas omnipresentes basándose en la especificidad
de su sustrato y en su localización subcelular. Las EH de mamíferos
incluyen epóxido de colesterol hidrolasa, leucotrieno A_{4}
hidrolasa, hepoxilín hidrolasa, epóxido hidrolasa microsómica (mEH)
y epóxido hidrolasa soluble (sEH). Las dos últimas enzimas han sido
estudiadas ampliamente y se ha descubierto que tienen una
selectividad amplia y complementaria de sustratos. Se sabe que las
formas microsómicas y solubles destoxifican epóxidos xenobióticos
mutagénicos, tóxicos y carcinogénicos, están implicadas en la
homeostasis fisiológica y son miembros de la familia de las
\alpha/\beta-hidrolasas.
La patente de los Estados Unidos 5.445.956,
concedida el 29 de agosto de 1995 a Hammock et al., describe
epóxido hidrolasa soluble recombinante humana y de ratón. La enzima
de ratón proporciona un modelo de roedor para evaluar el desarrollo
terapéutico de inhibidores de epóxido hidrolasas solubles
humanas.
Durante los últimos veinte años se han realizado
activamente investigaciones sobre buenos inhibidores de sEH, como
se recopila en Hammock et al., Comprehensive
Toxicology, (F. P. Guengerich editores), Pergamon, Oxford
(1997), vol. 3, cap. 18, pág. 283-305. Numerosos
reactivos que modifican selectivamente tioles, imidazoles y
carboxilos inhiben irreversiblemente sEH. Mullin y Hammock, Arch.
Biochem. Biophys., 216 (1982), pág. 423-429,
describen que los óxidos de chalconas son potentes inhibidores de
sEH y Dietze et al., Comp. Biochem. Physiolo., 104B,
nº 2 (1993), pág. 309-314, describen que los
trans-3-fenilglicidoles son potentes
inhibidores quirales de sEH.
La solicitud de patente pendiente de tramitación
número de serie 08/909.523, presentada el 12 de agosto de 1997 por
Hammock et al., sugiere el tratamiento de enfermedades
pulmonares con inhibidores de epóxido hidrolasas, como óxidos de
chalconas, y describe ensayos para inhibidores de epóxido
hidrolasas. Con respecto a los inhibidores de epóxido hidrolasas,
se describen sustratos alternativos de las enzimas, como el epóxido
de oleato de metilo y de otros ácidos grasos y ésteres o
epoxioctadecenoato de metilo y fenilglicidioles, así como óxidos
de
chalconas.
chalconas.
Se ha publicado que las enzimas EH están
presentes en una gran diversidad de especies, incluidas bacterias,
levaduras, hongos, plantas, nematodos, insectos, aves, peces y
mamíferos. En realidad, parece que están presentes en la mayoría de
los organismos, si no en todos, y tienen varias funciones. También
se conocen epóxido hidrolasas de plantas. Por ejemplo, se han
descrito epóxido de ácido graso hidrolasas de piel de manzana,
semillas de soja y plantas de arroz. Se ha aislado y clonado la
epóxido hidrolasa codificadora de cDNA de patata, berro y tabaco
[Stapleton et al., Plant J., 6 (1994), pág.
251-258 (1994); Kiyosue et al., Plant
J., 6 (1994), pág. 259-269; Guo et al.,
Plant J., 15 (1998), pág. 647-656]. Estas
epóxido hidrolasas vegetales muestran una gran homología con
epóxido hidrolasas solubles de mamíferos aunque son un 30% más
cortas en el extremo amino terminal.
Las epóxido hidrolasas de insectos y de otros
artrópodos actúan en el metabolismo de mediadores químicos
endógenos, como la hormona juvenil, y en la degradación de
aleloquímicos vegetales que defienden las plantas contra insectos.
Estas enzimas de las plantas catalizan la hidratación del ácido
epoxiesteárico a los correspondientes
\alpha,\beta-dioles, que son intermedios
importantes en la biosíntesis de la cutina y tienen actividad
antifúngica.
Los epóxidos y dioles son intermedios sintéticos
claves en la producción de sustancias químicas orgánicas brutas y
finas. Así, son muy importantes los mecanismos biosintéticos para
convertir epóxidos en dioles bajo condiciones suaves y
estereoespecíficas. La capacidad de ensayar si una ruta biosintética
implica un epóxido usando un inhibidor selectivo puede ser
importante en la investigación de nuevas enzimas biosintéticas y el
uso de agentes de unión de gran afinidad en la purificación por
afinidad rápida de epóxido hidrolasas ha demostrado ser muy
importante en el estudio de las epóxido hidrolasas solubles de
mamíferos.
Los agentes de unión de gran afinidad conocidos
actualmente para la purificación por afinidad de las epóxido
hidrolasas solubles de mamíferos incluyen tioles, como benciltiol,
alquiltioles o tioles terpenoides, que han reaccionado con medio de
separación SEPHAROSE activado por epoxi (SEPHAROSE es un material
disponible de la firma Pharmacia). Estas columnas de cromatografía
de afinidad unen una diversidad de proteínas, muchas de las cuales
tienen un sitio catalítico lipófilo. La epóxido hidrolasa soluble
puede ser eluída selectivamente de estas columnas con óxidos de
chalconas, en general como describen Prestwich, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 82 (1985), pág. 1.663-1.667, y
Wixtrom et al., Analyt. Biochem., 169 (1988), pág.
71-80. Sin embargo, hasta la fecha no hay sistemas
de purificación por afinidad para otras epóxido hidrolasas que se
puedan usar para el aislamiento inicial y clonación de enzimas así
como para el aislamiento de epóxido hidrolasas con fines
industriales. Siguen siendo un objetivo útil nuevos agentes de unión
de gran afinidad para diversas epóxido hidrolasas, particularmente
para epóxido hidrolasas solubles de mamíferos. También, pueden ser
valiosos agentes eluyentes que sean competitivos, en lugar de
inhibidores irreversibles.
La patente
FR-A-1.403.699 describe
1,3-dicicloarilureas asimétricas y su uso para
reducir el desarrollo de maleza. La patente
US-A-3.347.658 describe
composiciones herbicidas y métodos que emplean dicicloarilureas. P.
H. Beaune et al., Journal of Chromatography, 426
(1998), 169-176, describen un método para la
purificación de epóxido hidrolasa microsómica de hígado humano. La
patente EP-A-4.011.903 describe el
uso de compuestos derivados de la vainillina para el tratamiento de
enfermedades o dolencias respiratorias. La patente
EP-A-446699 describe compuestos que
son útiles como inhibidores de la biosíntesis de óxido nitroso. R.
Usha et al., Protein Expression and Purification, 15
(1999), 48-56, describen la purificación de un
complejo multicatalítico de proteasa revelando por cromatografía de
inmunoafinidad indirecta de semillas aladas de alubias. R. J.
Riley et al., Br. J. Clin. Pharmac., 28 (1989),
482-487, describen requisitos estructurales para la
bioactivación de anticonvulsivos a metabolitos citotóxicos in
vitro. La solicitud WO 98/06261 describe métodos para tratar
enfermedades pulmonares mediadas por metabolitos lipídicos
poliinsaturados y ensayos de inhibidores de epóxido hidrolasas.
Se describe, aunque no se reivindica, un proceso
que es útil para purificar, aislar o inhibir una epóxido hidrolasa
diana formando un complejo con un compuesto inmovilizado o en forma
libre, para modificar la actividad de la epóxido hidrolasa
complejada con respecto a la epóxido hidrolasa no complejada activa
enzimáticamente. Compuestos útiles para formar complejos con
epóxido hidrolasas en la práctica de esta invención incluyen
miméticos del estado transición de la epóxido hidrolasa. Por
ejemplo, las ureas, amidas y carbamatos pueden mimetizar el estado
de transición de la enzima o de otros intermedios transitorios junto
con el coordinado de la reacción cuando estos compuestos
interaccionan establemente con el sitio catalítico de la enzima.
La presente invención se refiere al uso de una
clase de compuestos con esta capacidad de formar un complejo que
tienen la estructura indicada en la fórmula 1
en la que X e Y son
independientemente nitrógeno, oxígeno o azufre, pudiendo X ser
también carbono, por lo menos uno de
R_{1}-R_{4} es hidrógeno, R_{2} es hidrógeno
cuando X es nitrógeno pero no está presente cuando X es azufre u
oxígeno, R_{4} es hidrógeno cuando Y es nitrógeno pero no está
presente cuando Y es azufre u oxígeno y R_{1} y R_{3} son
independientemente un alquilo sustituido o no sustituido,
haloalquilo, cicloalquilo, arilo, acilo o radical heterocíclico, en
la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la
hipertensión en un
mamífero.
Cuando la actividad modificada de la epóxido
hidrolasa complejada es inhibición de la enzima, entonces las
realizaciones de compuestos particularmente preferidos tienen una
IC_{50} (inhibición de potencia o, por definición, concentración
de inhibidor que reduce la actividad de la enzima un 50%) menor que
500 \muM. Por ejemplo, se ha descubierto que los cinco compuestos
enumerados en la tabla 1 tienen una IC_{50} menor que 0,1 \muM
en el caso de epóxido hidrolasa soluble de ratón y menor que 0,8
\muM en el caso de epóxido hidrolasa soluble humana.
En la tabla 1, el compuesto 187 es una amida e
ilustra que el farmacóforo puede ser más general que ureas o
carbamatos.
Típicamente las enzimas de interés para esta
invención pueden distinguir enantiómeros. Así, en la elección de un
inhibidor a usar para una aplicación de acuerdo con la invención se
prefiere investigar diferentes isómeros ópticos del inhibidor con
la enzima seleccionada mediante ensayos de rutina para elegir el
isómero óptico mejor, si fuera apropiado, para la aplicación
particular. Los farmacóforos descritos en la presente memoria se
pueden usar para aportar una funcionalidad reactiva al sitio
catalítico. Aquellos pueden incluir agentes alquilantes como
halógenos o epóxidos o aceptores de Michael que reaccionarán con
tioles y aminas. Estas funcionalidades reactivas también se pueden
usar para aportar marcadores fluorescentes o de afinidad al sitio
activo de la enzima para detección de la enzima.
La inhibición de epóxido hidrolasas solubles
puede ser terapéuticamente eficaz para tratar enfermedades
inflamatorias, como síndrome de insuficiencia respiratoria del
adulto. Esto se debe a que los inhibidores adecuados de epóxido
hidrolasas retrasan o evitan una respuesta inflamatoria en un
paciente por inhibición o formación de uno o más metabolitos
lipídicos poliinsaturados de modo que inhiben la formación de
dihidroxioxieicosadienoatos (diOHoxiEDE) en la serie de ácidos
araquidónicos de oxilipinas. Es bien sabido que los epóxidos del
ácido araquidónico (EET) y en algunos casos los correspondientes
dioles (DHET) son también biológicamente activos. Se supone que
están implicados en el comienzo y gravedad de la fiebre (Kozak,
1998), inhiben la producción de prostaglandina E2 en el músculo de
fibras lisas de los vasos (Fang, 1998), median vasodilatación del
corazón inducida por bradiquinina (Fulton, 1998), inducen
vasodilatación (Oltman, 1998; Imaoka, 1998) y tienen otros efectos
fisiológicos. Parece que las epóxido hidrolasas solubles bioactivan
un mediador derivado de un inflamatorio, lo cual sugiere la
necesidad de inhibidores eficaces y específicos del sitio de epóxido
hidrolasas como los descritos en la presente memoria. Los
inhibidores de epóxido hidrolasas también se pueden usar
terapéuticamente para tratar fiebre, enfermedades inflamatorias e
hipertensión. Así, los inhibidores de la invención actúan
reduciendo la conversión de epóxidos de lípidos en los
correspondientes dioles, como la conversión de EET en DHET.
La formación de un complejo de epóxido hidrolasa
es útil para purificar o aislar la epóxido hidrolasa diana. Por
ejemplo, se puede derivatizar el compuesto de fórmula 1 para
inmovilizarle a un soporte insoluble en agua. Cuando se pone en
contacto el soporte con epóxido hidrolasa enzimáticamente activa,
como cuando se eluye una solución acuosa que tiene hidrolasa unida
al soporte, la formación del complejo origina la separación
selectiva de la epóxido hidrolasa.
También se pueden usar inhibidores, como ciertos
análogos y derivados activos del compuesto de fórmula 1, para eluir
epóxido hidrolasas de aquellos y de otros soportes. Como se ha
indicando anteriormente, compuestos útiles para formar un complejo
con epóxido hidrolasas incluyen miméticos diciclohexílicos del
estado de transición de la epóxido hidrolasa, como ureas y
carbamatos, que pueden mimetizar el estado de transición de la
enzima cuando interaccionan establemente con el sitio catalítico de
la enzima. Se ha descubierto que análogos del compuesto de fórmula
1, que también pueden actuar como inhibidores selectivos de epóxido
hidrolasas solubles, incluyen compuestos con la estructura de la
fórmula 2 (en la que X, Y, R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son
como se ha descrito para la fórmula 1 pero en la que Z es oxígeno o
azufre y W es carbono, fósforo o azufre). En la tabla 2 se indican
varios compuestos ilustrativos con la estructura de la fórmula 2. El
compuesto 12 se puede convertir en la correspondiente carbodiimida
(compuesto 1) y después en la correspondiente urea (compuesto 2).
Los compuestos de fórmula 2 no son parte de la presente invención,
excepto los que están dentro de la fórmula 1.
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Se puede convertir química y bioquímicamente una
tiourea en una carbodiimida e hidrolizar ésta a la urea. Si los
sustituyentes de N y N' son ciclohexilo, el compuesto es
diciclohexilcarbodiimida (compuesto 1).
Se cree que los inhibidores descritos en la
presente memoria son los primeros inhibidores biológicamente
estables de epóxido hidrolasas. Los inhibidores tienen aplicaciones
en epóxido hidrolasas de mamíferos, plantas, insectos y
probablemente en cualquier organismo con una epóxido hidrolasa.
Las figuras 1A y 1B ilustran gráficamente el
efecto del tiempo sobre la inhibición de EH soluble de ratón y EH
soluble humana, respectivamente, por los compuestos 1 y 2, y
la figura 2 ilustra gráficamente el efecto del
compuesto 2 sobre la EH soluble de patata (22,5 nM) y EH soluble de
berro (35 nM).
Los presentes compuestos son inhibidores de
epóxido hidrolasas, preferiblemente inhibidores selectivos. Esto
significa que un inhibidor tiene un efecto inhibidor mayor sobre una
enzima EH que sobre otras enzimas EH y tiene una selectividad mayor
hacia enzimas EH que hacia enzimas que no son EH.
La práctica particularmente preferida de esta
invención es inhibir selectivamente EH solubles. El ejemplo 5
muestra el ensayo usado para determinar la inhibición selectiva de
EH solubles para una serie de compuestos útiles de acuerdo con esta
invención, cuyos datos de inhibición se detallan en la tabla 4. La
selectividad se ilustra en la tabla 3 en la que el inhibidor usado
fue el compuesto 2.
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Como indican los datos de la tabla 3, el
compuesto 2 a una concentración de 100 \muM inhibió totalmente
las actividades de EH citosólica y peroxisómica sin que se observara
una inhibición significativa en las actividades de otras enzimas
ensayadas. Estos resultados ilustran la inhibición selectiva, por
los compuestos útiles de la invención, de EH solubles presentes en
el citosol y peroxisoma. Una conclusión de estos datos es que el
compuesto 2 es un inhibidor potente de EH citosólica y peroxisómica
pero no de las otras enzimas ensayadas. La K_{i} calculada para
el compuesto 2 con sEH de ratón fue 22 \pm 3 nM.
Se describe un proceso que es útil para
purificar, aislar o inhibir una epóxido hidrolasa diana formando un
complejo con un compuesto inmovilizado o en forma libre para
modificar la actividad de la epóxido hidrolasa así complejada con
respecto a la epóxido hidrolasa no complejada activa
enzimáticamente.
Los compuestos con esta capacidad de formar un
complejo a usar de acuerdo con la invención tienen la estructura
indicada por la fórmula 1
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en la que X e Y son
independientemente nitrógeno, oxígeno o azufre, pudiendo X ser
también carbono, por lo menos uno de
R_{1}-R_{4} es hidrógeno, R_{2} es hidrógeno
cuando X es nitrógeno pero no está presente cuando X es azufre u
oxígeno, R_{4} es hidrógeno cuando Y es nitrógeno pero no está
presente cuando Y es azufre u oxígeno y R_{1} y R_{3} son
independientemente hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{20} sustituido o no sustituido,
cicloalquilo, arilo, acilo o radical
heterocíclico.
Además de los compuestos de fórmula 1 que
interaccionan con la enzima de una manera reversible basándose en
que el inhibidor mimetiza un estado de transición del sustrato de la
enzima o un intermedio de la reacción, otros compuestos son
inhibidores irreversibles de la enzima. Las estructuras activas como
las indicadas en las tablas o por la fórmula 1 pueden dirigir el
inhibidor hacia la enzima, en la que una funcionalidad reactiva
presente en el sitio catalítico de la enzima puede formar un enlace
covalente con el inhibidor. Un grupo de moléculas que pueden
interaccionar así puede tener un grupo saliente, como un halógeno o
tosilato, que puede ser atacado de una manera S_{N}2 con una
lisina o histidina. Alternativamente, la funcionalidad reactiva
puede ser un epóxido o un aceptor de Michael, como un éster
\alpha/\beta-insaturado, aldehído, cetona,
éster o nitrilo.
Como se muestra en la figura 1, la inhibición de
la sEH de ratón por el compuesto 1 se incrementa con el tiempo
mientras que la inhibición por el compuesto 2 es estable con el
tiempo. Esta observación puede ser explicada por el hecho de que la
carbodiimida 1 se hidroliza lentamente en solución acuosa a la urea
2. Estos resultados apoyan la hipótesis de que las ureas,
carbamatos, amidas y compuestos relacionados discutidos en esta
invención actúan directamente. Estos resultados ilustran también la
posibilidad de usar carbodiimidas como formas precursoras de las
ureas útiles en la invención. A su vez, se han usado comercialmente
tioureas como formas precursoras de
carbodiimidas.
carbodiimidas.
La diciclohexiltiolurea puede ser oxidada a
diciclohexilcarbodiimida que, con la enzima o un ácido acuoso
(solución salina fisiológica), formará una diciclohexilurea activa.
Alternativamente, los protones ácidos de carbamatos o ureas pueden
ser reemplazados por una diversidad de sustituyentes que por
oxidación, hidrólisis o ataque por un nucleófilo (como glutatión)
darán la correspondiente estructura generadora. Estos materiales
son conocidos como profármacos o protoximas [Gilman et al.,
The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7ª edición
(1985), MacMillan Publishing Company, Nueva York, pág. 16]. Por
ejemplo, profármacos comunes son ésteres, que se descomponen
enzimáticamente dando los correspondientes alcoholes y ácidos
[Yoshigae et al., Chiralty, 9 (1997), pág.
661-666]. Los profármacos pueden ser quirales para
tener una mayor especificidad. Estos derivados se han usado
ampliamente en química médica y agrícola para alterar propiedades
farmacológicas de los compuestos, como aumentar su solubilidad en
agua, mejorar la química de formulación, alterar el tejido diana,
alterar su volumen de distribución y alterar su penetración. También
se han usado para alterar perfiles toxicológicos.
Hay muchos profármacos posibles pero es
particularmente atractiva la sustitución de uno o los dos hidrógenos
activos de las ureas descritas en la presente memoria o del único
hidrógeno activo presente en los carbamatos. Estos derivados han
sido descritos ampliamente por Fukuto y asociados y se usan
comúnmente en química médica y agrícola para alterar propiedades
farmacológicas de los compuestos [Black et al., "Selective
Toxicity of N-Sulfenylated Derivatives of
Insecticidal Methylcarbamate Esters", Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 21(5) (1973), pág.
747-751; Fahmy et al., "Selective Toxicity
of N,N'-thiodicarbamates", Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 31(3) (1983), pág.
613-620; y Fahmy et al.,
"N-Sulfinylated Derivative of Methylcarbamate
Esters", Journal of Agricultural and Food Chemistry,
29(3) (mayo-junio 1981), pág.
567-572].
Sin estar ligado por teoría alguna, se cree que
los inhibidores adecuados de la invención mimetizan el estado de
transición de la enzima por lo que hay una interacción estable con
el sitio catalítico de la enzima. Parece que los inhibidores forman
enlaces de hidrógeno con el ácido carboxílico nucleófilo y una
tirosina polarizante del sitio catalítico.
Cuando la actividad modificada de la epóxido
hidrolasa complejada es inhibición de la enzima, las realizaciones
de compuestos particularmente preferidos tienen una IC_{50}
(potencia de inhibición o, por definición, concentración de
inhibidor que reduce la actividad de la enzima un 50%) menor que 500
\muM.
Se describen sistemas de purificación por
afinidad para enzimas que tienen una cavidad de oxianión y un ácido
nucleófilo en el sitio catalítico, particularmente cuando la enzima
es una epóxido hidrolasa. Se cree que los inhibidores indicados en
la presente memoria que inhiben EH solubles inhibirán también una
amplia gama de enzimas de la familia de
\alpha/\beta-hidrolasas que tienen un ácido
nucleófilo en el sitio catalítico. Así, se describe un método de
purificación de una epóxido hidrolasa inmovilizando a un soporte
insoluble en agua un compuesto que tiene la estructura de la
fórmula 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Z es oxígeno, nitrógeno o
azufre, W es carbono, fósforo o azufre, X e Y son independientemente
nitrógeno, oxígeno o azufre, pudiendo X ser también carbono,
R_{1}-R_{4} son hidrógeno, R_{2} es hidrógeno
cuando X es nitrógeno pero no está presente cuando X es azufre u
oxígeno, R_{4} es hidrógeno cuando Y es nitrógeno pero no está
presente cuando Y es azufre u oxígeno y R_{1} y R_{3} son
independientemente hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{20} sustituido o no sustituido,
cicloalquilo, arilo, acilo o un radical
heterocíclico.
Soportes insolubles en agua adecuados a los que
se inmoviliza útilmente el compuesto de fórmula 2 incluyen
SEPHAROSE activada por epoxi, y aminopropil-, hexil- o
carboxil-SEPHAROSE. Se puede usar una diversidad de
matrices sólidas, incluidas perlas de vidrio, perlas de polivinilo o
agarosa.
\newpage
Los compuestos así inmovilizados constituyen un
material adecuado de relleno para separaciones por afinidad,
pudiendo formar los compuestos inmovilizados un complejo con la
epóxido hidrolasa cuando se eluye una solución acuosa a través de
una columna rellena con el material de separación o en un
procedimiento discontinuo.
Típicamente la inmovilización del compuesto será
derivatizando uno de R_{1} o R_{3} por métodos bien conocidos.
Por ejemplo, Pharmacia Fine Chemicals comercializa materiales de
afinidad con aminopropilo u otro amino terminal (típicamente bajo
el nombre comercial "SEPHAROSE") y BioRad Laboratories
comercializa geles y perlas de agarosa para diversas necesidades de
cromatografía de afinidad (típicamente bajo la marca comercial
"AFFI-GEL"). Estos materiales pueden ser
tratados, por ejemplo, con isocianatos para dar derivados de urea
inmovilizados estables de acuerdo con la invención que pueden
formar un complejo con epóxido hidrolasas. Alternativamente, se
pueden usar los compuestos de fórmula 1 para eluir epóxido
hidrolasas en columnas de afinidad más generales, como cuando un
tiol (por ejemplo, benciltiol) reacciona con "SEPHAROSE"
activada por epoxi (en forma de gel o de perlas) preparada por
reacción de diglicidil éter de butanoglicol. Las epóxido hidrolasas
en solución acuosa pueden ser eluidas selectivamente con las ureas
derivatizadas de fórmula 1 o con compuestos derivatizados de
fórmula 2 de acuerdo con esta invención.
La respuesta inflamatoria es uno de los
mecanismos fisiológicos más importantes para el mantenimiento de la
salud humana. Sin embargo, trastornos de inflamación o una respuesta
inflamatoria inapropiada pueden originar lesión de tejidos,
morbilidad o mortalidad.
El síndrome de insuficiencia respiratoria del
adulto (ARDS, de sus siglas en inglés Adult
Respiratory Distress Syndrome) es una
enfermedad pulmonar que tiene una tasa de mortalidad del 50% y
resulta de lesiones de los pulmones causadas por una diversidad de
condiciones presentes en pacientes con traumas y en víctimas de
quemaduras graves [R. H. Ingram Jr., "Adult Respiratory Distress
Síndrome", Harrison's Principals of Internal Medicine, 13
(1995), pág. 1.240]. Con la posible excepción de glucocorticoides,
no hay agentes terapéuticos conocidos que sean eficaces para
prevenir o mejorar las lesiones de los tejidos, como daño
microvascular, asociadas con la inflamación aguda que se produce
durante el desarrollo inicial del ARDS.
El ARDS, que se define en parte por el
desarrollo de edema alveolar, representa una manifestación clínica
de enfermedad pulmonar resultante de lesión directa e indirecta de
los pulmones. Aunque estudios anteriores han detallado una
diversidad aparentemente no relacionada de agentes causantes, no se
comprenden bien los síntomas iniciales de la patofisiología del
ARDS. El ARDS fue considerado originalmente como fallo de un único
órgano pero actualmente se considera como componente del síndrome de
fallo multiorgánico. La intervención o prevención farmacológica de
la respuesta inflamatoria se considera actualmente como un método
más prometedor de controlar el proceso de la enfermedad que
técnicas de apoyo de ventilación mejorada. Véase, por ejemplo,
Demling. Annu. Rev. Med., 46 (1995), pág.
193-203.
Otra enfermedad (o grupo de enfermedades) que
implica inflamación aguda es el síndrome de respuesta inflamatoria
sistemática (SIRS), que es la designación establecida recientemente
por un grupo de investigadores para describir estados relacionados
resultantes, por ejemplo, de sepsis, pancreatitis, trauma múltiple
(como lesión cerebral) y lesión de tejidos (como laceración de
musculatura), cirugía del cerebro, shock hemorrágico y lesiones de
órganos mediadas inmunológicamente [Bone, JAMA, 268: 24
(1992), pág. 3.452-3.455].
Los pulmones, con su extensa superficie expuesta
directamente al medioambiente, son particularmente susceptibles a
lesiones oxidantes y productos de inflamación. Puesto que toda la
producción cardíaca pasa a través de la arteria pulmonar, los
pulmones también pueden ser lesionados por agentes transportados por
la sangre. La heterogeneidad celular de los pulmones de los
mamíferos complica el estudio directo de las células pulmonares más
susceptibles a lesión. Además, la compleja anatomía pulmonar hace
difícil distinguir exactamente dónde se metabolizan agentes
biológicos en los tejidos de los pulmones. El tejido diana y la
secuencia de sucesos en el edema alveolar no se han establecido de
modo definitivo; en consecuencia, siguen siendo dudosas las
interrelaciones y contribuciones relativas de compartimentos
endotelial versus epitelial versus inflamatorio para mitigar el daño
a la barrera
aire-sangre.
aire-sangre.
Las molestias del ARDS se ven en una diversidad
de pacientes con quemaduras graves o sepsis. La sepsis es, a su
vez, uno de los síntomas del ARDS. En el ARDS hay una reacción
inflamatoria aguda con cantidades grandes de neutrófilos que
emigran al interior del intersticio y alvéolos. Si esto progresa,
hay mayor inflamación, edema y proliferación celular y el resultado
final es el deterioro de la capacidad de extraer oxígeno. El ARDS
es así una complicación común en una gran variedad de enfermedades y
traumas. El único tratamiento es de apoyo. Se estima unos 150.000
casos anuales y la mortalidad varía de 10 a 90%.
No se conoce la causa exacta del ARDS. Sin
embargo se ha supuesto que una sobreactivación de los neutrófilos
origina la liberación de ácido linoleico a niveles altos por
actividad de la fosfolipasa A_{2}. El ácido linoleico se
convierte a su vez enzimáticamente en
9,10-epoxi-12-octadecenoato
por la epoxigenasa del citocromo P-450 de los
neutrófilos y/o por un estallido de oxígeno activo. Este epóxido de
lípido, o leucotoxina, se encuentra a niveles altos en piel quemada
y en el suero y lavado bronquial de pacientes quemados. Además,
cuando se inyecta en ratas, ratones, perros y otros mamíferos
origina ARDS. No se conoce el mecanismo de acción. Sin embargo,
parece que el leutotoxindiol producido por la acción de la epóxido
hidrolasa soluble es un inductor específico de la transición de la
permeabilidad de la membrana interior mitocondrial (MPT). Esta
inducción por el leucotoxindiol, la liberación diagnóstica de
citocromo c, condensación nuclear, ADN que corre y activación de
CPP32 que origina muerte celular son inhibidas por la ciclosporina A
que es diagnóstico de muerte celular inducida por MPT. Las acciones
a nivel celular y mitocondrial son conformes con este mecanismo de
acción sugiriendo que los inhibidores descritos en la presente
memoria se pueden usar terapéuticamente con compuestos que bloquean
MPT.
Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas
útiles en la invención que contienen los inhibidores se pueden
preparar por cualquiera de diversos métodos bien conocidos.
Típicamente, el inhibidor se formula para una administración oral o
parenteral adecuada y se disuelve o dispersa en un excipiente o
diluyente fisiológicamente tolerable. Como ejemplo, el inhibidor se
puede disolver o dispersar en una composición líquida como
suspensión o solución estéril o como preparación isotónica.
Particularmente adecuados son medios inyectables formulados con
solución de glucosa o con solución salina estéril o isotónica
tamponada o no tamponada. Son bien conocidos para uso in
vitro en el que la inhibición de la actividad de la epóxido
hidrolasa diana puede ser monitorizada por la disminución del grado
de inflamación. La cantidad de inhibidor terapéutico administrado
puede ser en una sola administración o un submúltiplo de la
cantidad total. También se contempla varias administraciones
durante un período de varios días, semanas o meses.
El agente activo también se puede usar en
composiciones como comprimidos o píldoras que contienen
preferiblemente una dosis unidad y se puede mezclar con
ingredientes convencionales de preparación de comprimidos. Los
niveles reales de dosificación del inhibidor de la epóxido
hidrolasa se pueden variar para obtener la respuesta terapéutica
deseada para una composición y método de administración
particulares. Se contempla que la dosis diaria total es 0,001 a 100
mg por kg de peso corporal. Sin embargo, cuando se practica la
invención se deben evitar fármacos como clofibrato, que se sabe
induce a la epóxido hidrolasa soluble y al citocromo
P-450, y acetaminofeno, que consume glutatión. Esto
se debe a que se tienen datos experimentales que sugieren que cuando
disminuyen los niveles de glutatión, la leucotoxina es más tóxica.
Por el contrario, se deben estimular terapias paralelas diseñadas
para favorecer rutas alternativas del metabolismo de la leucotoxina,
como administración de N-acetilcisteína y glutatión
y sus ésteres etílicos.
El ejemplo 1 ilustra un uso in vivo del
inhibidor 2 para bloquear la muerte de ratones inducida por
leucotoxinas/isoleucotoxinas o alargar la vida de ratones.
Ejemplo 1 de
referencia
Se adquirieron ratones machos Swiss Webster (de
25-28 gramos) de Simonsen, Gilroy, California. Los
animales tenía acceso libre a agua y comida. Se trataron los
animales (tres en cada grupo) por vía intraperitoneal con
diciclohexilurea (compuesto 2) suspendida en aceite de maíz (400
mg/kg, 7 ml/kg) o con aceite de maíz como controles positivos.
Después de 30 minutos de pretratamiento, se trataron los ratones por
vía intravenosa a través de la vena caudal con una mezcla 1:1 de
ésteres metílicos de leucotoxina/isoleucotoxina en etanol (700
mg/kg, 1,0 ml/kg).
Los ratones murieron de insuficiencia
respiratoria después de exponerlos a leucotoxina/isoleucotoxina. Las
reacciones letales tuvieron lugar secuencialmente con respiración
acelerada, apertura de la boca para ayudar a respirar y sangrado de
la nariz. Sin embargo, el pretratamiento con
N,N'-diciclohexilurea (compuesto 2) bloqueó la
muerte de los animales inducida por leucotoxina/isoleucotoxina o
alargó la vida de los ratones.
La inhibición de epóxido hidrolasas puede ser
valiosa para fines de investigación, como inhibir epóxido hidrolasa
microsómica en el ensayo de Ames y en otros ensayos de toxicidad en
los que se puede incrementar la sensibilidad del ensayo para
mutagenes y carcinogenes que contienen epóxido y ensayar la
hipótesis de que el epóxido está implicado en la acción de
toxinas.
La tabla 4 ilustra una diversidad de inhibidores
junto con datos de inhibición.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de la tabla 4 ilustran que las EH
solubles pueden ser inhibidas selectivamente y que las EH
microsómicas también pueden ser inhibidas por los compuestos 19 y
101 . Se cree que estos compuestos inhibirán una amplia gama de
enzimas de la familia de las
\alpha/\beta-hidrolasas que tienen un ácido
nucleófilo en el sitio catalítico. Los compuestos permitirán
desarrollar química computacional para predecir materiales activos
adicionales.
Además, la tabla 4 ilustra que el compuesto 2
(realización preferida) es un inhibidor muy potente de las EH.
También ilustra que los compuestos 19, 101, 204 y 238 son
inhibidores selectivos potentes de la EH microsómica. El compuesto
225 ilustra que se pueden usar compuestos quirales para incrementar
la potencia y selectividad.
Como se ha indicado anteriormente, los
metabolitos o productos de la degradación de los inhibidores de
fórmula 1 ó 2 también pueden formar complejos inhibidores con EH y
ser útiles en la práctica de la invención. Así, por ejemplo, el
compuesto 32 de la tabla 4 es un conocido metabolito del herbicida
Diurón y el compuesto 32 inhibe epóxido hidrolasa soluble humana y
de ratón. El compuesto 303 (producto de la degradación del compuesto
28) es un inhibidor mejor de la epóxido hidrolasa microsómica de
rata.
También pueden ser útiles usos terapéuticos de
la inhibición de epóxido hidrolasas de acuerdo con la invención
conjuntamente con una terapia contra el cáncer. Esto se debe a que
la expresión de epóxido hidrolasas en tumores malignos es un
mecanismo posible que ha sido sugerido en el caso de resistencia a
fármacos anticancerosos [Murray et al., "The Expression of
Cytochrome P-450, Epoxide Hydrolase and Glutathione
S-Transferase in Hepatocellular Carcinoma",
Cancer, 71 (1993), pág. 36-43; Theyer et
al., "Role of the
MDR-1-Encoded Multiple Drug
Resistance Phenotype in Prostate Cancer Cell Line", J. of
Urology, 150 (1993), pág. 1.544-1.547; Murray
et al., "The Immunohistochemical Localization of
Drug-Metabolizing Enzymes in Prostate Cancer",
J. of Pathology, 177 (1995), pág.
147-152].
Por ejemplo, la tabla 5 ilustra actividad de mEH
para el óxido de cis-estilbeno [Wixtrom y Hammock,
Biochemical Pharmacology and Toxicology (1985), vol. 1:
Methodological Aspect of Drug Metabolizing Enzymes (Zakin y Versey
editores), pág. 1-93, John Wiley & Sons Inc.,
Nueva York] con diversas líneas de células cancerosas que expresan
EH microsómica. Es bien sabido que esta enzima participa en el
metabolismo hepático de fármacos. Así, la inhibición de esta enzima
por compuestos de fórmula 1 o por el compuesto 2 disminuirá el
metabolismo de fármacos anticancerosos que contengan epóxido e
incrementará por tanto su eficacia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ve por los datos de la tabla 5, la
actividad de EH microsómicas es expresada significativamente en
varias líneas de células cancerosas y podría participar en el
metabolismo de fármacos anticancerosos, como diepóxido de
ciclohexeno, en tumores malignos. Se ha desarrollado una diversidad
de fármacos antineoplásicos cuya acción se basa en las propiedades
alquilantes de epóxidos y diepóxidos. Los inhibidores de epóxido
hidrolasas pueden estabilizar estos compuestos e incrementar su
actividad antineoplásica.
Se añaden 0,53 ml (0,47 g, 3,0 mmol) de
isocianato de octilo a 0,262 g (3,00 mmol) de pentilamina en 20 ml
de hexano, agitando, para producir finalmente un sólido cristalino
blanco. Después de dejar en reposo durante una noche, la mezcla se
enfría y el producto sólido se recoge y lava con hexano frío. Tras
secar al aire se obtienen 0,705 g (2,91 mmol, 97%) de
1-octil-3-pentilurea
en forma de agujas blancas muy finas (P.f.
65,0-65,5ºC). El material presenta un espectro de
RMN-^{13}C y de masas de acuerdo con la estructura
asignada.
RMN-^{13}C (CDCl_{3})
\delta : 159,0 (C=O), 40,47 y 40,45 (C-1 y
C-1'), 31,8 (C-6 y
C-3'), 30,4 (C-2), 30,1
(C-2'), 29,3 (C-4), 29,2
(C-5), 27,0 (C-3), 22,5
(C-7), 22,4 (C-4'), 13,9
(C-8 y C-5'); están presente bandas
importantes de absorción infrarroja (disco de KBr) a 3.334 (s,
N-H), 1.617 (vs, C=O) y 1.579 (vs, amido II)
cm^{-1}.
0,382 g de ciclooctilamina (0,382 g, 3,00 mmol)
y 0,40 ml (0,39 g, 3,1 mmol) de isocianato de ciclohexilo en 20 ml
de hexano proporcionan, después de dejar en reposo durante un día,
0,664 g (88%) de
1-ciclohexil-3-ciclooctilurea
en forma de agujas blancas (P.f.
194,0-194,5ºC).
El espectro de infrarrojos [3.344 (s, NH), 3.334
(s, NH), 1.624 (vs, C=O), 1.564 (vs, amido II) cm^{-1}] y el
espectro de masas [FAB-MS m/z calculado para
C_{15}H_{28}N_{2}O: 252; observado: 253 (M + H^{+})]
confirman la identidad de este material.
Se añade lentamente una solución de 0,626 g
(5,00 mmol) de isocianato de ciclohexilo en 5 ml de hexano a una
solución de 0,61 ml (0,58 g, 5,0 mmol) de ciclohexiltiol en 25 ml de
hexano. Añadiendo una gota de
1,8-diaza-biciclo[5.4.0]undec-7-eno
se inicia la formación de un producto cristalino blanco. Después
de varios días a temperatura ambiente, la mezcla se enfría
y el éster de S-ciclohexilo del ácido
ciclohexilcarbamotioico se recoge, se lava con hexano enfriado por
hielo y se seca proporcionando 1,15 g (4,76 mmol, 95%) de producto,
que funde a 117,0-118,0ºC.
Se observa el espectro de
RMN-^{13}C confirmativo de este material: \delta
165,9 (C=O), 50,3 (C-1), 43,4
(C-1'), 33,8 (C-2',6'), 33,1
(C-2,6), 26,0 (C-3',5'), 25,5
(C-4'), 25,4 (C-4), 24,7
(C-3,5). Se observan bandas infrarrojas (KBr) a
3.343 (s, N-H), 1.649 (vs, C=O) y 1.206 (m,
C-N) cm^{-1}.
Ejemplo 5 de
referencia
Se produjeron sEH recombinante de ratón (MsEH) y
sEH humana (HsEH) en un sistema de expresión de baculovirus como se
ha publicado anteriormente [Grant et al., J. Biol.
Chem., 268 (1993), pág. 17.628-17.633; Beetham
et al., Arch. Biochem. Biophys., 305 (1993), pág.
197-201]. Las proteínas expresadas se purificaron a
partir de lisado de las células por cromatografía de afinidad
[Wixtrom et al., Anal. Biochem., 169 (1988), pág.
71-80]. Se cuantificó la concentración de proteínas
mediante el ensayo BCA de Pierce usando como patrón de calibración
albúmina de suero bovino (BSA). Las preparaciones tenían una pureza
de por lo menos 97%, evaluada por electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE)
y densitometría de barrido. No contenían esterasa detectable ni
mostraban actividad de glutatión transferasa que pudiera interferir
en el ensayo. El ensayo también se evaluó con resultados similares
en lisados brutos de células u homogeneizado de tejidos.
Se determinó la IC_{50} de cada inhibidor
mediante el ensayo espectrofotométrico de Dietze et al.
[Dietze et al., "Spectrophotometric Substrates for
Cytosolic Epoxide Hydrolase", Anal. Biochem., 216 (1994),
pág. 176-187] usando genes clonados de epóxido
hidrolasa expresados en el sistema de baculovirus usando carbonato
de
4-nitrofenil-trans-2,3-epoxi-3-fenilpropilo
racémico (NEP2C) como sustrato. En una microplaca de estireno de 96
pocillos, se añadieron 20 \mul de la preparación de enzimas y 2
\mul de la solución del inhibidor en dimetilformamida (DMF) ([I]
final: 0,05 a 500 M) a 180 \mul de fosfato sódico (0,1M, pH 7,4)
que contenía 0,1 mg/ml de BSA. Se incubó la mezcla durante 5
minutos a 30ºC. Se obtuvo después una concentración de sustrato de
40 \muM añadiendo 4 \mul de una solución 3 mM. Se valoró la
actividad midiendo la aparición de 4-nitrofenolato
a 405 nm a 30ºC durante 1 minuto (Spectramax 200; Molecular Device
Inc., Estados Unidos). Los ensayos se realizaron por cuatriplicado.
Por definición, IC_{50} es la concentración de inhibidor que
reduce la actividad de la enzima un 50%. Se determinó la IC_{50}
por regresión de por lo menos cinco puntos de datos con un mínimo
de dos puntos en la región lineal de la curva en cada lado de la
IC_{50}. Se generó la curva a partir de por lo menos cuatro
ensayos distintos para obtener la desviación estándar. En por lo
menos un ensayo se incluyeron compuestos de potencia similar para
asegurar el orden del rango. Un orden de rango adicional entre
compuestos muy buenos se determinó mediante el ensayo con óxido de
^{3}H-trans-estilbeno descrito por
Wixtrom y Hammock (véase la referencia a continuación) y mediante
un ensayo relacionado basado en Borhan et al., "Improved
Radiolabeled Substrates for Soluble Epoxide Hydrolase",
Anal. Biochem., 231 (1995), pág.
188-200. Un ensayo similar de partición basado en
óxido de ^{3}H-trans-estilbeno se
describe en Wixtrom y Hammock, "Membrane-Bound
and Soluble-Fraction Epoxide Hydrolases:
Methodological Aspects", Biochemical Pharmacology and
Toxicology, vol. 1, (Zakim y Vessey editores), pág.
1-93, John Wiley & Sons Inc., Nueva York
(1985).
Ejemplo 6 de
referencia
Se ensayaron EH microsómica de mamíferos usando
óxido de ^{3}H-trans-estilbeno, EH
microsómica de insectos con ^{3}H-hormona juvenil
III y óxido de
^{3}H-trans-difenilpropeno, EH
citosólico y peroxisómico de mamíferos y plantas usando óxido de
^{3}H-trans-difenilpropeno,
P-450 usando ^{3}H-testosterona,
carboxil esterasa usando acetato de p-nitrofenilo y
glutatión-S-transferasa usando
clorodinitrobenceno. Se ensayó pepsina usando hemoglobina como
sustrato.
Claims (4)
1. Uso de un compuesto que tiene la
estructura
en la que X e Y son
independientemente nitrógeno, oxígeno o azufre, pudiendo X ser
también carbono, por lo menos uno de
R_{1}-R_{4} es hidrógeno, R_{2} es hidrógeno
cuando X es nitrógeno pero no está presente cuando X es azufre u
oxígeno, R_{4} es hidrógeno cuando Y es nitrógeno pero no está
presente cuando Y es azufre u oxígeno y R_{1} y R_{3} son
independientemente hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{20} sustituido o no sustituido,
cicloalquilo, arilo, acilo o un radical heterocíclico, en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de la
hipertensión en un
mamífero.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
la que el medicamento es para usarlo conjuntamente con una terapia
contra el cáncer.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que la cantidad terapéutica eficaz del compuesto proporcionado
es una dosis diaria total de 0,001 a 100 mg por kg de peso corporal
del mamífero.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el compuesto reduce la conversión de epóxidos de lípidos a
los correspondientes dioles.
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