ES2289718T3

ES2289718T3 - Metodo, instalacion y programa informatico para estimar el tamaño inicial de una poblacion de acidos nucleicos, en particular mediante pcr.

Info

Publication number: ES2289718T3
Application number: ES05815440T
Authority: ES
Inventors: Karine Piot; Pierre Martineau; Claire Lamoure; Franck Molina
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Bio Rad Pasteur SA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Bio Rad Innovations SAS
Priority date: 2004-11-24
Filing date: 2005-11-18
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2025-11-18
Also published as: EP1700245B1; ATE365350T1; EP1700245A1; DE602005001443D1; DE602005001443T2; WO2006048337A1; US20070260440A1; CA2589129C; AU2005300646A1; AU2005300646B2; CA2589129A1

Abstract

Método implementado por medios informáticos para cuantificar, de manera absoluta y/o relativa, una población inicial de ácidos nucleicos en una muestra de interés sometida a una sucesión de aplicaciones de una reacción de amplificación de población, durante el que las mediciones experimentales se toman representativas de un tamaño actual de la población de al menos la muestra de interés, comprendiendo el método las siguientes etapas: a) proporcionar un modelo del rendimiento de la reacción de amplificación como una función de la sucesión de amplificaciones, comprendiendo dicho modelo: * una fase sustancialmente constante para una primera parte de las aplicaciones de la reacción de amplificación; y * una fase no constante para una segunda parte de las aplicaciones de la reacción de amplificación; uniéndose la primera y segunda parte por una región de cambio en la que el rendimiento cambia entre la fase constante y la no constante, teniendo dicha región un índice de amplificación que se corresponde sustancialmente con el cambio; b) utilizar el modelo de rendimiento para expresar una relación que implica al menos al índice de cambio y a un parámetro representativo del tamaño de población inicial en la muestra de interés; c) determinar al menos el índice de cambio mediante comparación con las mediciones experimentales; y, en una etapa d) posterior o inmediatamente siguiente deducir a partir del mismo el tamaño de población inicial en la muestra de interés.

Description

Método, instalación y programa informático para estimar el tamaño inicial de una población de ácidos nucleicos, en particular mediante PCR.

La presente invención se refiere a estimar el tamaño inicial de una población de interés en una muestra sometida a una sucesión de reacciones de amplificación.

Antecedentes de la invención

La presente invención encuentra una aplicación particularmente ventajosa, pero no limitativa, para determinar una cantidad inicial de ácidos nucleicos en una muestra sometida a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. Una técnica de este tipo, conocida como "cuantificación PCR", se utiliza en particular para evaluar el número de copias de agentes patógenos (por ejemplo, del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en una muestra de fluidos corporales tomada de un paciente, normalmente en el contexto de un chequeo médico.

Se hace referencia a la figura 1 para una breve descripción del aspecto gráfico de una curva de amplificación PCR en tiempo real con números de índice de ciclo de PCR representados gráficamente a lo largo de la abscisa y, en el ejemplo mostrado, con cantidades de fluorescencia emitida (en unidades arbitrarias) medidas para cada ciclo PCR representado gráficamente hasta la ordenada. Para cada ciclo PCR, debe entenderse que la muestra está sometida a variaciones de temperatura que permiten a la ADN polimerasa amplificar los ácidos nucleicos y permitir que se detecten los productos de PCR correspondientes mediante moléculas fluorescentes. Representando gráficamente la fluorescencia F_{n} medida como una función del número n de ciclos de PCR, se obtiene la variación del tipo mostrado en la figura 1 y comprende al menos:

\bullet: una primera parte RF en la que las mediciones de fluorescencia coinciden sustancialmente con el ruido de fondo del aparato para medir la fluorescencia;

\bullet: una segunda parte EXP en la que las cantidades medidas de fluorescencia aumentan de manera sustancialmente exponencial;

\bullet: una tercera parte LIN en la que el aumento de las cantidades medidas de fluorescencia se atenúa significativamente y se comporta en su totalidad de una manera sustancialmente lineal; y

\bullet: una cuarta parte ESTO en la que las mediciones de fluorescencia alcanzan una fase de estancamiento.

Debe observarse que para los ciclos de PCR iniciales (primera y segunda parte), la población de interés aumenta de manera sustancialmente exponencial, mientras que para los ciclos siguientes (tercera y cuarta parte), otros fenómenos entran en competición con el crecimiento de la población de interés, de manera que dicho crecimiento se amortigua hasta la fase ESTO de estancamiento.

El documento "Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves" por R.G. Rutledge y C. Côté, publicado en Nucleic Acids Research, 2003, volumen 31, Nº 16, da a conocer un método para estimar la cantidad inicial desconocida de ácidos nucleicos en una muestra de interés por medio de PCR. Ese método consiste en utilizar una pluralidad de muestras que tienen cantidades iniciales conocidas de ácidos nucleicos, denominadas en lo sucesivo como "patrones", con el fin de determinar mediante interpolación la cantidad inicial de ácidos nucleicos presentes en la muestra de interés.

En general, cuanto mayor sea la cantidad inicial de ácidos nucleicos en una muestra, más pronto se obtendrá una cantidad detectable de producto de PCR, es decir, más pronto se obtendrá una cantidad detectable de fluorescencia emitida. Con referencia a la figura 2, que se refiere a la técnica anterior, se entenderá que la población inicial en el patrón Pt1 es superior a la del patrón Pt2 que es superior a la del patrón Pt3, etc., puesto que el ciclo Ct1 para el patrón Pt1 tiene lugar antes del ciclo Ct2 correspondiente para el patrón Pt2, que tiene lugar antes del ciclo Ct3 para el patrón Pt3, etc.

Por tanto, un ciclo CT de este tipo, correspondiente al ciclo en el que las mediciones de fluorescencia alcanzan un umbral UMB de fluorescencia (tal como se muestra en la figura 2), se establece en un nivel arbitrario (normalmente por debajo ruido de fondo) y actúa como un parámetro representativo del tamaño inicial N_{0} de una población de ácidos nucleicos sometidos a los ciclos de PCR. Se ha hecho uso de esta observación en la técnica anterior mencionada previamente para establecer una relación del tipo mostrado en la figura 3 entre los números Ct1, Ct2, Ct3, Ct4 de ciclos para una pluralidad de patrones que tienen poblaciones iniciales conocidas, y sus poblaciones iniciales N_{0}^{1}, N_{0}^{2}, N_{0}^{3} y N_{0}^{4}. Por tanto, representando gráficamente los ciclos Ct1, Ct2, Ct3 y Ct4, etc. hasta las ordenadas y el logaritmo de los tamaños de las poblaciones iniciales N_{0}^{1}, N_{0}^{2}, N_{0}^{3} y N_{0}^{4} a lo largo de la abscisa, se obtiene la pendiente de regresión REG. En esta pendiente de regresión REG, está representado gráficamente el ciclo Ctint detectado para la muestra de interés (flecha F1 de línea discontinua). Mediante la interpolación en la pendiente de regresión REG (flecha F2 de línea discontinua), se determina entonces el tamaño N_{0}^{int} de población inicial para la muestra de interés.

Aunque ese método se utiliza de manera generalizada, presenta sin embargo algunos inconvenientes.

En primer lugar, requiere la utilización de una pluralidad de muestras patrón que tienen respectivas poblaciones iniciales conocidas.

En segundo lugar, el método depende del juicio del usuario, ya que el valor umbral de fluorescencia, seleccionado por el usuario, tiene una influencia directa en los valores de los ciclos Ct en las curvas de amplificación, y por consiguiente en los valores estimados para el tamaño de población inicial en la muestra de interés. El valor umbral también tiene un impacto en la precisión del resultado, puesto que la precisión es en general mejor si se Selecciona que el umbral se encuentre en la fase EXP de crecimiento exponencial de la curva de amplificación. No obstante, en la práctica, es difícil que el usuario sepa si el nivel umbral UMB de fluorescencia que se ha establecido se corresponde realmente con la fase exponencial de las curvas, y si lo hace para todas las muestras (las muestras patrón y la muestra de interés).

Finalmente, el método supone sin ninguna verificación que la población tiene el mismo rendimiento de amplificación en la muestra de interés y en todas las muestras patrón. Por tanto, si la muestra de interés contiene inhibidores de PCR, como es normalmente el caso, entonces su resultado se disminuirá de forma falsa.

Por tanto, debe entenderse que las técnicas de la técnica anterior dependen del umbral UMB de fluorescencia definido por el usuario. El valor seleccionado ejerce una influencia sobre los valores de los ciclos Ct y, por consiguiente, en la determinación de la cantidad inicial en la muestra de interés. Esa es una de las razones por la que se ha realizado una gran cantidad de trabajo para automatizar la detección del ciclo Ct y hacerla fiable.

Objetivos y sumario de la invención

La presente invención busca mejorar la situación proponiendo un enfoque que es completamente diferente.

En primer lugar, la invención proporciona un método, implementándose el método mediante medios informáticos para cuantificar de manera absoluta y/o relativa una población inicial de ácidos nucleicos en una muestra de interés. La muestra se somete a una sucesión de aplicaciones de una reacción para amplificar la población de interés. De manera muy general, puede realizarse esta amplificación implementando ciclos de PCR sucesivos, aunque también podría utilizarse cualquier otra técnica de amplificación. Por encima de todo, debe entenderse que la amplificación simplemente necesita definirse por un rendimiento de reacción, tal como se describe a continuación. Durante estas operaciones de amplificación sucesivas, se toman mediciones experimentales que son representativas de un tamaño de población actual, al menos en la muestra de interés. Se entenderá que pueden tomarse una o más mediciones después de o durante cada reacción de amplificación sin pérdida de generalidad.

En una definición actualmente preferida de la invención, el método en el sentido de la invención comprende las siguientes etapas:

a): proporcionar un modelo del rendimiento de la reacción de amplificación como una función de la sucesión de amplificaciones, comprendiendo dicho modelo:

\bullet: una fase sustancialmente constante para una primera parte de las aplicaciones de la reacción de amplificación; y

\bullet: una fase no constante para una segunda parte de las aplicaciones de la reacción de amplificación;

: estando unidas la primera y segunda parte por una región de cambio en la que el rendimiento cambia entre las fases constante y no constante, teniendo dicha región un índice de amplificación que se corresponde sustancialmente con el cambio;

b): Utilizar el modelo de rendimiento pera expresar una relación que implica al menos al índice de cambio y a un parámetro representativo del tamaño de población inicial en la muestra de interés;

c): determinar al menos el índice de cambio mediante comparación con las mediciones experimentales; y, en una etapa d) posterior o inmediatamente siguiente deducir del mismo el tamaño de población inicial en la muestra de interés.

Breve descripción de los dibujos

Otras ventajas y características de la invención aparecen tras la lectura de la siguiente descripción detallada de una implementación proporcionada a continuación a modo de ejemplo con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

\bullet la figura 1 se refiere a la técnica anterior y representa la variación en la cantidad medida de fluorescencia como una función del número de ciclos de PCR, tal como se describió anteriormente;

\bullet la figura 2 se refiere a la técnica anterior y es representativa de las cantidades crecientes de fluorescencia que se emiten como una función del número de ciclos de PCR, tal como se describió anteriormente;

\bullet la figura 3 representa un método de interpolación para determinar la cantidad inicial de la población de interés en la muestra de interés utilizando un método conocido en la técnica anterior y descrito anteriormente;

\bullet la figura 4A es un diagrama que muestra la variación en las mediciones experimentales descritas anteriormente como una función de la sucesión de amplificaciones aplicadas a la muestra de interés;

\bullet la figura 4B es un diagrama que muestra la variación en el rendimiento de la reacción de amplificación, obtenida a partir de mediciones experimentales, como una función de la sucesión de amplificaciones aplicadas a la muestra de interés;

\bullet la figura 5 representa gráficamente una relación de regresión entre los índices de cambio de rendimiento que tienen lugar en el cambio entre la fase constante y la fase no constante, y los logaritmos de las poblaciones iniciales para muestras patrón y para la muestra de interés, para su utilización en una primera implementación;

\bullet la figura 6A muestra la variación típica en la cantidad medida de fluorescencia después de que se ha ajustado teniendo en cuenta el ruido de fondo específico a las mediciones, y representada gráficamente como una función del número n de ciclos de reacción de PCR;

\bullet la figura 6B muestra la variación en la efectividad de la PCR mostrada en la figura 6A como una función del número n de ciclos;

\bullet la figura 7 compara la variación experimental en la fluorescencia emitida, tal como se muestra en la figura 6A, con los resultados obtenidos aplicando el modelo de fluorescencia emitida obtenido incluyendo un modelo de efectividad en una segunda implementación;

\bullet la figura 8 es una comparación entre la variación en la efectividad de la figura 6B y la aplicación de un modelo de efectividad deducido a partir del modelo de fluorescencia emitida de la figura 7;

\bullet la figura 9 es un diagrama de flujo que esboza las etapas principales en el método en una implementación propuesta de la presente invención; y

\bullet la figura 10 es un diagrama de una instalación para cuantificar la población inicial de una muestra de interés.

Descripción más detallada

Se hace referencia a las figuras 4A y 4B para describir brevemente algunos principios de la invención que ilustran las características del método anterior.

En primer lugar, debe entenderse que la figura 4A representa gráficamente una sucesión de mediciones F_{n} experimentales representativas del tamaño actual de una población de interés que está sometiéndose progresivamente a una sucesión de reacciones de amplificación, siendo indexada cada reacción por un número n de índice. En el ejemplo no limitativo descrito en el presente documento, esta sucesión de reacciones corresponde a una sucesión de ciclos de PCR. En este ejemplo no limitativo, las mediciones F_{n}, experimentales corresponden a cantidades medidas de fluorescencia en cada ciclo PCR. Por tanto, en un método de cuantificación que combina la reacción de PCR y la fluorescencia emitida por la muestra de interés, se introducen reactivos fluorescentes en la muestra de manera que la fluorescencia que se emite durante un ciclo de PCR es proporcional al tamaño de la población de ácidos nucleicos en la muestra. De hecho, puede ser preferible realizar una pluralidad de mediciones o ninguna medición para determinados ciclos de PCR. Además, más generalmente, el método de medición puede hacer uso de técnicas distintas a la fluorescencia, incluso si la fluorescencia es el método que se utiliza con frecuencia para la cuantificación mediante PCR. Finalmente, debe entenderse que podrían implementarse otras técnicas de amplificación en el contexto de la presente invención, previendo que sea posible realizar un seguimiento de la variación en el rendimiento de la reacción correspondiente a la amplificación. Puesto que el ejemplo que se describe a continuación se refiere preferentemente a ciclos de PCR, se hace referencia a la "efectividad del PCR" que se escribe como En para cada ciclo de PCR de índice n, con el fin de referirse al rendimiento de la reacción de amplificación.

Tal como se mencionó anteriormente con referencia a la figura 1, la figura 4A comprende principalmente dos regiones en las que:

\bullet: durante los ciclos de PCR iniciales (parte EXP), la población aumenta sustancialmente de manera exponencial; mientras que

\bullet: durante los ciclos siguientes (las partes LIN y ESTC), otros fenómenos entran en competición con el crecimiento de la población de interés, por lo que el crecimiento se amortigua.

Se realizan las siguientes dos hipótesis:

\bullet: el rendimiento de la reacción E_{n} es relativamente constante durante los ciclos iniciales durante la parte EXP; y

\bullet: después que se ha realizado algún número de ciclos, el rendimiento E_{n} de la reacción empieza a disminuir durante las partes LIN y ESTC.

Esta disminución en el rendimiento puede tener varias explicaciones, en particular una degradación y/o una carencia de reactivos de PCR (ADN polimerasa, dNTP, cebadores, etc.) y/o una inhibición por los productos de los que están éstos están hechos.

Se supone en el presente documento que el rendimiento es constante inicialmente y que disminuye posteriormente. No obstante, debe entenderse que la invención se aplica más generalmente al contexto del rendimiento:

\bullet: que es inicialmente constante, que corresponde a una situación normal para el crecimiento mediante amplificación; y

\bullet: que no es constante posteriormente (disminuye o aumenta) lo que se corresponde con una situación que nos sustancialmente anormal.

En el contexto de reacciones para amplificar la cantidad de ácidos nucleicos, se ha descubierto que el rendimiento cambia con frecuencia desde una fase constante a una fase no constante. En el sentido de la invención, se toma ventaja de esta observación para deducir a partir de la misma la cantidad inicial de ácidos nucleicos, tal como se describe en detalle a continuación. Inicialmente, simplemente se plantea que el rendimiento también puede cambiar desde una faje no constante durante los primeros ciclos hasta una fase constante posterior. La presente invención puede aplicarse igualmente a una circunstancia de este tipo. Por lo tanto, en general, debe entenderse que, en el sentido de la invención, se detecta un cambio de rendimiento entre una fase constante y una fase no constante.

El objetivo es encontrar el tamaño inicial de la población que se ha sometido a la amplificación. Con referencia a la figura 4, se entenderá que la medición Fo representativa de este tamaño de población inicial, que coincide en la práctica con la medición del ruido RF de fondo, no puede utilizarse por si mismo para determinar directamente el tamaño de población inicial. En la técnica anterior, se han realizado intentos para cuantificar este tamaño de población inicial haciendo uso de la fase exponencial, es decir, una etapa que tiene lugar normalmente tras salir el ruido de fondo. Se determina entonces un ciclo Ct umbral (correspondiente al punto TA de "técnica anterior") en la figura 4A. Tal como se mencionó anteriormente, en esta región las mediciones se ven afectadas con frecuencia por el ruido y es difícil determinar de manera precisa un ciclo Ct umbral representativo del ruido de fondo que sale.

En un enfoque completamente diferente, la presente invención hace uso en su lugar de casi todos las puntos de la curva de amplificación con el fin de determinar de manera precisa una región CMB en la que el rendimiento cambia entre una fase constante y una fase no constante, normalmente en las presentes circunstancias entre la fase EXP exponencial y la fase LIN lineal. Se entenderá que las mediciones se ven menos afectadas lógicamente por el ruido en esta región CMB que en la región de salida de ruido de fondo puesto que la región CMB tiene lugar durante ciclos posteriores. Además, debido particularmente a las propiedades matemáticas asociadas con el rendimiento, se muestra a continuación que, de manera más ventajosa, el número de patrones que necesitan utilizarse para cuantificar el tamaño inicial de la población de interés es inferior al número de patrones utilizados en la cuantificación de la técnica anterior.

La relación para asociar la región CMB de cambio con el tamaño inicial de la población de interés se describe brevemente a continuación. El rendimiento de una reacción de amplificación viene dado por:

N_{n+1} = N_{n} + E_{n} \times N_{n}

en la que:

\bullet: N_{n} es el tamaño de la población de interés después de una amplificación de índice n en una sucesión de amplificaciones;

\bullet: N_{n+1} es el tamaño de la población de interés después de una amplificación siguiente, de índice n+1, en la sucesión de amplificaciones mencionada anteriormente; y

\bullet: E_{n} es el rendimiento de la reacción de amplificación de índice n en la sucesión de amplificaciones mencionada anteriormente.

Volviendo a formular esta relación como una relación de recurrencia, se obtiene:

N_{n+1} = (1 + E_{n}) (1 + E_{n-1}) (1 + E_{n-2}) \ . . . \ (1 + E_{0}) N_{0}

en la que N_{0} es el tamaño inicial de la población de interés. Siempre que el rendimiento E_{n} sea constante, se entenderá que la relación anterior puede escribirse de una manera más sencilla como sigue:

N_{n+1} = N_{0} \times (1 + E_{0})^{n+1}

en la que el índice n+1 no ha alcanzado todavía la región CMB de cambio. Mientras que el rendimiento es constante durante los ciclos iniciales, se aplica lo siguiente:

E_{n} = E_{n-1} = E_{n-2} = \ . . . \ = E_{0}

en la que E_{0} es el valor del rendimiento durante la fase constante. No obstante, cuando el índice n+1 entra en la región CMB de cambio, la relación se convierte en:

N_{n+1} = N_{0} \times (1 + E_{0})^{C}{}_{EEP} \times \ función (C_{EEP}, n+1)

en la que

\bullet: (C_{EEP} - 1) es el último índice de la reacción de amplificación durante la cual el rendimiento todavía es constante (por tanto, se entenderá que el propio índice C_{EEP} representa el índice de cambio apropiado entre la fase exponencial y la fase lineal); y

\bullet: el termino función (C_{EEP}, n+1) es una función particular que caracteriza la fase no constante del rendimiento y que depende al menos del índice C_{EEP} de cambio y del índice n+1 de amplificación actual.

Por tanto, puede observarse cómo es posible asociar el índice C_{EEP} de cambio y el tamaño No inicial de la población de interés. En esta fase puede entenderse que ya se han implementado las etapas a) y b) del método definido anteriormente.

Una primera implementación consiste en determinar el índice C_{EEP} de cambio de manera experimental y en correlacionarlo con el tamaño inicial mediante regresión utilizando una pluralidad de muestras patrón que están sometidas al mismo tratamiento de amplificación que la muestra de interés. Bajo tales circunstancias, se entenderá que las etapas b) y c) del método definido anteriormente simplemente se intercambian puesto que inicialmente el índice C_{EEP} de cambio (etapa c) se determina de manera experimental y, por consiguiente, la relación entre el índice C_{EEP} y el tamaño N_{0}, inicial (etapa b) se determina con el fin de obtener el tamaño N_{0} inicial (etapa d).

Antes de describir todas estas etapas en detalle en el sentido de la primera implementación, se describe un método para determinar el índice C_{EEP} basándose en mediciones experimentales. En particular, se entenderá que este método para determinar el índice C_{EEP} de manera experimental puede aplicarse a otra implementación que es diferente de la primera implementación mencionada anteriormente.

Volviendo a la relación entre la efectividad E_{n}, de un ciclo n dado y el tamaño actual de la población de interés en el mismo ciclo N_{n} y en un ciclo N_{n+1} posterior, la efectividad de la amplificación puede expresarse como sigue:

E_{n} = (N_{n+1}/N_{n}) - 1

En determinadas circunstancias, en particular cuando no hay necesidad de tener en cuenta el ruido RF de fondo en las mediciones, es posible que una primera aproximación suponga que las mediciones son sustancialmente proporcionales al tamaño actual de la población de interés. No obstante, en la práctica, con frecuencia se tendrá más en cuenta la desviación de las mediciones, determinándose las mediciones F'_{n} experimentales corregidas que se determinan basándose en mediciones F_{n} directas tal como se muestra en la figura 4A.

Se aplica preferiblemente una etapa previa para procesar las mediciones F_{n} experimentales, consistiendo esta etapa en sustraer el ruido RF de fondo y en introducir posteriormente compensación para tener en cuenta un medición \varepsilon distinta de cero representativa del tamaño de población inicial. En el ejemplo mostrado en la figura 4A, la variación en el ruido RF de fondo como una función en el índice n puede representarse mediante una función lineal ya que las pruebas han mostrado que un modelo lineal es satisfactorio para mediciones de fluorescencia en PCR. No obstante, en determinadas circunstancias puede ser preferible utilizar una modelo que varía exponencialmente. En cualquier caso, se aplica un modelo que se ajuste mejor a la variación en el ruido RF de fondo que viene dada normalmente por los puntos de medición inicial. Después de esto, el modelo seleccionado para la variación en el ruido RF de fondo se sustrae de todos los valores F_{n} de medición experimentales. Al aplicar esta etapa, se entenderá que la medición F_{0} de fluorescencia teórica se reduce a un valor de medición de cero, correspondiente a un tamaño No de población inicial de cero, que no es representativo de la realizad física. Por consiguiente, es ventajoso aplicar compensación para esta corrección como sigue:

F'_{n} = F_{n} - BN + \varepsilon

en la que:

\bullet: el término F'_{n} se corresponde con una medición corregida para un índice n actual;

\bullet: el término F_{n} se corresponde con la medición experimental en bruto en dicho índice n actual;

\bullet: el término RF se corresponde con el valor para el ruido de fondo tal como se modela para el índice n actual; y

\bullet: \varepsilon es el término de compensación correspondiente que se supone que es constante en el ejemplo que se está describiendo y que representa directamente el tamaño N_{0} de población inicial.

Aunque estas etapas de corrección para el ruido de fondo son muy ventajosas para determinar el índice C_{EEP} de cambio, también pueden aplicarse a cualquier determinación y cuantificación del tamaño N_{0} de población inicial cuando es probable que el ruido de fondo falsee la medición de dicho tamaño N_{0} de población. Con respecto a esto. estas etapas pueden constituir el objeto de una protección independiente, cuando sea apropiado.

Las mediciones F'_{n} corregidas obtenidas de esta manera son proporcionales de manera ventajosa a los tamaños N_{n} de población actuales en las muestras de interés, de manera que el rendimiento E_{n}, puede expresarse ahora directamente como una función de los valores de medición (corregidas tal como se describió anteriormente), mediante la siguiente relación:

E_{n} = (F'_{n+1}/F'_{n}) - 1

Por tanto, a partir de las mediciones F_{n} experimentales de la figura 4A, se obtienen mediciones F'_{n} corregidas a partir de las cuales se determina posteriormente la variación en la efectividad En como una función de la sucesión de índices n, tal como se muestra en la figura 4B.

Resumiendo, las mediciones experimentales se expresan en la forma de una variación experimental en la efectividad En del tipo mostrado en la figura 4B como una función de la sucesión de amplificaciones n. Esto proporciona una variación que se determina de manera experimental para el rendimiento, que comprende:

\bullet: una primera región perceptiblemente ruidosa para índices n de amplificación bajos (especialmente antes del ciclo CG en el ejemplo de la figura 4B); y

\bullet: seguida por una segunda región que muestra menos ruido para índices de amplificación más altos (al menos después de la región CMB de cambio).

Al menos en la circunstancia más habitual de amplificación mediante PCR y medición mediante fluorescencia, la fase no constante de rendimiento disminuye y se corresponde con dicha segunda región que presenta poco ruido (tal como se muestra en la figura 4B). Específicamente para el fin de eliminar puntos de medición que corren el riesgo de falsear resultados cuando se selecciona un modelo para aplicarlo a la variación en el rendimiento:

\bullet: se estima un valor E_{0} preliminar para la fase de rendimiento constante; y

\bullet: particularmente cuando se busca el índice C_{EEP} de cambio, se ignoran al menos algunas de las mediciones en la segunda región de menor ruido para las cuales el rendimiento estimado es inferior a un valor umbral, por ejemplo correspondiente a alguna fracción de la fase E_{0} constante.

Estos puntos NEG (figura 4) que se eliminan son normalmente aquellos que se corresponden con índices n muy altos de amplificación y que ya no podrían satisfacer el modelo para la efectividad que se selecciona sustancialmente alrededor de la región CMB de cambio. A modo de ejemplo, con el fin de eliminarlos, se evalúa un promedio para la fase constante de rendimiento E_{0}, normalmente para los índices n iniciales. Después de esto, se selecciona un valor umbral que se corresponde con una fracción del promedio encontrado para la etapa E_{0} constante, por ejemplo el 10%. Después de esto, partiendo de los índices n más altos, se eliminan todos los puntos NEG de rendimiento medidos menores que o iguales a dicho valor umbral. No obstante, esta etapa, que es la más ventajosa para detectar el índice C_{EEP}, puede aplicarse a cualquier determinación basada en el rendimiento E_{n}, y puede constituir el objeto de una protección independiente, cuando sea apropiado.

Cuando el rendimiento representa una fase no constante en la que el rendimiento disminuye y a la que sigue una fase constante, tal como se muestra en la figura 4B, la región CMB de cambio se identifica trabajando en la dirección de los números n de índice decrecientes, partiendo de la segunda región de menor ruido, y detectando un índice CG aproximado por el que el rendimiento pasa a un valor predeterminado. Por tanto, con referencia a la figura 4B, yendo en la dirección de números n de índice decrecientes para subir hacia la región CMB de cambio, se evalúa el rendimiento asociado con cada número de índice. Para el primer punto de medición de rendimiento que es significativamente superior al valor predeterminado mencionado anteriormente, se considera que se ha detectado el índice CG aproximado mencionado anteriormente y se corresponde con el índice del punto de medición.

Tal como se describe a continuación en una implementación posterior, es posible para cada punto de medición modelar la variación en su rendimiento como si dicho propio punto de ajuste correspondiese con el índice C_{EEP} de cambio. En esa implementación, si se estima la fase E_{0} de rendimiento constante y si el valor estimado supera el valor predeterminado mencionado anteriormente, entonces se considera que el punto se corresponde con el índice CG aproximado.

En general, un rendimiento máximo tiene un valor de 1 de modo que es posible seleccionar el valor predeterminado mencionado anteriormente como igual a 1. No obstante, esto puede variarse y, por ejemplo, puede hacerse una previsión para establecer el valor predeterminado correspondiente al rendimiento E_{0} medio evaluado durante los ciclos de reacción iniciales.

Después de esto, se refina la estimación del valor del índice C_{EEP}, de amplificación en la región de cambio, valor que puede ser de manera ventajosa una fracción, trabajando en la dirección de los números de índice de amplificación crecientes, partiendo del índice CG aproximado y detectando un índice de amplificación para el que el rendimiento es aproximadamente igual al valor predeterminado mencionado anteriormente. Por tanto, haciendo de nuevo referencia a la figura 4B, con el fin de refinar la búsqueda del índice C_{EEP} de cambio después de que se ha determinado el índice CG aproximado, se realiza una búsqueda hacia abajo partiendo del índice CG aproximado y yendo en la dirección de número n de índice creciente, en etapas de un tamaño inferior a todo un índice, y el valor de la abscisa se determina, por ejemplo mediante interpolación, en el que se cruza el valor predeterminado. Normalmente, siempre que el valor de la fase constante sea superior a 1, la búsqueda se continúa en la dirección de número n creciente, y el índice (C_{EEP} - 1) que precede al cambio se determina tan pronto como el valor E0 constante sea igual a o muy cercano a 1. Por esta razón es apropiado seleccionar un tamaño de etapa de búsqueda correspondiente a una fracción del índice, por ejemplo el 10% de un ciclo n.

En la primera implementación mencionada anteriormente, se proporciona una pluralidad de muestras patrón que tienen respectivos tamaños de población inicial conocidos, y la sucesión de amplificaciones se aplica a las mismas bajo sustancialmente las mismas condiciones que para la muestra de interés. Sus índices de cambio respectivo se determinan según las etapas a), b) y c) descritas anteriormente. En la etapa d):

\bullet: se establece una relación de dependencia entre los tamaños de población inicial de las muestras N_{0}^{pt} estándar y sus índices C_{EEP}^{pt}; y

\bullet: después de determinar el índice C_{EEP} para la muestra de interés, se determina el tamaño No inicial de la población de interés mediante interpolación sobre esa relación de dependencia.

Por tanto, con referencia a la figura 5, puede establecerse una relación de dependencia entre los ciclos C_{EEP}^{1}, C_{EEP}^{2} de cambio de los patrones y sus concentraciones N_{0}^{1}, N_{0}^{2} iniciales (realmente los logaritmos de los mismos), por ejemplo mediante regresión. Midiendo el índice C_{EEP}^{int} de cambio para la muestra de interés y representando gráficamente su valor en la pendiente de regresión de la figura 5, se obtiene la concentración N_{0}^{int} en la muestra de interés mediante interpolación.

Por tanto, esta primera interpolación es bastante similar a la de la técnica anterior descrita con referencia a la figura 3. Sin embargo, no debe olvidarse que el índice C_{EEP} de cambio sobre el que reside esta primera implementación no se corresponde de ninguna manera con el ciclo Ct umbral de la técnica anterior.

En un enfoque que es significativamente diferente a esta primera implementación:

\bullet: en la etapa b) se hace uso del modele de rendimiento para expresar la variación que se parametriza como una función de la sucesión de amplificaciones, haciendo uso dicha variación de al menos un parámetro que representa el índice C_{EEP} de cambio; y

\bullet: en la etapa c), al menos dicho parámetro que representa el índice C_{EEP} de cambio se determina mediante comparación con las mediciones experimentales.

En una segunda implementación, esta variación parametrizada es representativa del tamaño N_{n} de población actual en la muestra de interés.

Normalmente, esta variación parametrizada puede extraerse de una expresión del tipo dado anteriormente:

N_{n+1} = N_{0} \times (1 + E_{0})^{C}{}_{EEP} \times \ función (C_{EEP}, n+1)

Por tanto, además de un parámetro que representa el índice C_{EEP} de cambio, esta variación hace uso de un parámetro representativo del tamaño No de población inicial en la muestra de interés.

Después de esto, en las etapas c) y d) de esta segunda implementación, estos dos parámetros C_{EEP} y N_{0} se determinan sustancialmente juntos.

Previamente, en la etapa a), es necesario determinar un modelo para la función mencionada anteriormente función(C_{EEP}, n+1).

Normalmente, para la cuantificación de PCR, se selecciona un modelo para la fase no constante del rendimiento correspondiente a una disminución exponencial que tiene un parámetro \beta de decremento que se describe en mayor detalle a continuación. Este parámetro \beta de decremento se determina entonces en la etapa c), al menos con el índice C_{EEP} de cambio, mediante comparación con las mediciones experimentales.

Por tanto, en esta segunda implementación, una vez que se ha seleccionado el modelo E_{n} de rendimiento, se aplica a la expresión general para el tamaño N_{n} de población actual dada por la relación anterior. Esto proporciona un modelo para la variación en el tamaño N_{n} de población actual.

No obstante, a menos que las mediciones experimentales proporcionen el valor para el tamaño N_{n} de población actual directamente (lo que casi nunca es cierto en la práctica en la actualidad), es apropiado modelar posteriormente las propias mediciones F_{n} experimentales, teniendo en cuenta el ruido de fondo sustraído y la compensación \varepsilon posterior tal como se describió anteriormente.

Por tanto, en una implementación actualmente preferida, la variación parametrizada mencionada anteriormente:

\bullet: es representativa de mediciones experimentales; e

\bullet: incluye un parámetro correspondiente a un valor F_{0} de medición representativo del tamaño de población inicial.

A partir de entonces, se determina el valor medido del tamaño F_{0} de población inicial comparando dicha variación F_{n} parametrizada con las mediciones experimentales.

Con el fin de realizar esta comparación, es posible, por ejemplo, ajustar los parámetros F_{0}, E_{0}, C_{EEP} y el parámetro \beta de decremento en el modelo de las mediciones F_{n} utilizando correlaciones estadísticas (normalmente el método de mínimos cuadrados) aplicadas a las mediciones experimentales en bruto. Se describe una implementación de ejemplo en mayor detalle a continuación.

Inicialmente, se obtiene la variación para la cantidad medida y ajustada de fluorescencia como una fruición del número de ciclos de PCR que se han aplicado, tal como se muestra por ejemplo en la figura 6A. Esta figura muestra la curva de amplificación para una muestra de interés que contiene ácidos nucleicos, en este caso un fragmento de ADN que tiene una cantidad inicial de 100.000 copias, marcadas mediante el intercalante SYBRGREEN durante la reacción PCR que se realiza en el aparato I-Cycler IQ® del proveedor BI-RAD®.

En el ejemplo descrito, se entenderá que la reacción de amplificación es una reacción de PCR en tiempo real. La medición experimental representa cantidades de fluorescencia emitida.

La fluorescencia de ciclo n tras el ajuste para el ruido de fondo, tal como se describió anteriormente, se escribe como F_{n} a continuación. La fluorescencia inicial teórica antes del primer ciclo se escribe como F_{0}. La efectividad de la PCR en el ciclo n se escribe como E_{n}. El número total de ciclos realizados durante la reacción de PCR se escribe como N.

Como hipótesis, la fluorescencia medida en cada ciclo n del ciclo de reacción de PCR se define por:

100

con 0 \leq E_{n} \leq 1.

La efectividad de la reacción de cada ciclo n se calcula como sigue:

101

Debe observarse que se supone que la ecuación (1) es verdadera para n=0. Sin embargo, por definición, la fluorescencia F_{0} inicial es desconocida. Por lo tanto, no es posible calcular la efectividad en el primer ciclo E_{0} directamente para la fórmula (2).

La figura 6B muestra la efectividad de la reacción de PCR como aproximada mediante la fórmula (2) y basándose en la variación ajustada en la fluorescencia de la figura 6A, como una función del número n de ciclos.

\newpage

Se realizan preferiblemente las siguientes hipótesis:

\bullet: la efectividad de la reacción es relativamente constante durante los ciclos iniciales; y

\bullet: después de que se ha realizado un determinado número de ciclos, la efectividad de la reacción disminuye.

La figura 6B confirma la segunda hipótesis puesto que puede observarse que la efectividad disminuye a partir del ciclo n = 17. Sin embargo, las efectividades medidas en los ciclos de 1 a 16 tienen mucho ruido, lo que dificulta el verificar la primera hipótesis gráficamente.

No obstante, es preferible suponer que la variación en la efectividad obedece a un modelo del tipo que incluye:

\bullet: una primera fase que es constante entre el primer ciclo de PCR y el ciclo (C_{EEP} - 1) que precede al ciclo de cambio escrito como C_{EEP}; y

\bullet: una segunda fase en la que disminuye para los ciclos de números mayores que o iguales al ciclo (C_{EEP} - 1).

Por tanto, el ciclo (C_{EEP} - 1) representa el último ciclo (que puede ser una fracción) para el que la efectividad continúa siendo constante.

Por tanto, se propone modelar la efectividad de la reacción tal como sigue:

102

en la que E_{0} y \beta son parámetros reales que se estiman utilizando la curva de amplificación de la figura 6A o utilizando la curva de efectividad de la figura 6B de una manera descrita a continuación.

En una variante, puede preferirse alguna otra selección, por ejemplo a partir de los modelos F1 a F3 dados a continuación, dependiendo en particular del tipo de ácido nucleico que va a cuantificarse.

103

104

105

Preferiblemente, se estiman varios conjuntos de parámetros en la etapa c) para diversos ciclos C_{EEP} de cambio candidatos, y se selecciona el ciclo candidato mínimo para el que los parámetros asociados maximizan las correlaciones estadísticas que pueden realizarse en la etapa c) para cada ciclo C_{EEP} de cambio.

Tal como se mencionó anteriormente, la expresión (1) también puede escribirse en la forma:

106

Por tanto, introduciendo la expresión (3) para la efectividad en la fórmula (4), se obtiene un nuevo modelo que tiene cuatro parámetros (F_{0}, E_{0}, \beta, C_{EEP}) para la fluorescencia F_{n} emitida ajustada:

107

El tamaño No inicial de la población de interés, la efectividad E_{0} de la reacción de n=0, el parámetro \beta y el ciclo C_{EEP} de cambio se evalúan repetitivamente para varios valores de ciclo en la proximidad de la región CMB de cambio con el fin de encontrar una correlación estadística máxima que se consigue para un valor de ciclo mínimo que es igual al ciclo C_{EEP} de cambio.

En esta segunda implementación, se prefiere modelar la variación en las cantidades de fluorescencia medidas y ajustadas como una función de número de ciclo basándose en los modelos o variación en la efectividad, y posteriormente llevar a cabo las correlaciones directamente sobre las cantidades de fluorescencia medidas y ajustadas.

Debe observarse que ajustando la fluorescencia emitida medida para el ruido de fondo, también se realiza un ajuste artificial en la fluorescencia F_{0} inicial. Por tanto, la estimación de los parámetros del modelo de efectividad basándose en las mediciones de efectividad que se deducen de las mediciones de fluorescencia ajustadas constituye una fuente adicional de error y podría ser preferible proceder en dos etapas tal como se describe a continuación para la tercera implementación.

No obstante, la segunda implementación tal como se describe es más sencilla y se adapta bien a la cuantificación de PCR utilizando mediciones de fluorescencia. Se basa en las mediciones reales de fluorescencia F'_{n} que se corresponden con las mediciones de fluorescencia ajustadas para la desviación en el ruido de fondo junto con la compensación de s en dichas mediciones. Una vez que se ha sustraído el ruido de fondo, se obtiene una relación del tipo siguiente:

F'_{n} = F_{n} + \varepsilon

en la que \varepsilon es una cantidad que puede depender o no del número n de ciclo. Preferiblemente se elige que sea constante.

Bajo tales circunstancias, se define la efectividad medida y "ajustada" también escrita como E'_{n} en el ciclo n por:

108

El modelo de la relación (5) anterior se convierte por tanto en:

109

Bajo tales circunstancias, los valores E'_{n} de efectividad se aproximan de manera experimental a partir de las mediciones para que pueda establecerse un umbral de efectividad aceptable mínimo durante la fase de efectividad decreciente. Por tanto, se determina un ciclo umbral mas allá del cual las mediciones de fluorescencia ajustadas no se utilizan para los fines del modelo (puntos NEG en la figura 4B). Normalmente, el ciclo umbral se corresponde con el primer ciclo en la fase de efectividad decreciente en la que la efectividad cae por debajo de algún umbral de efectividad aceptable mínimo (por ejemplo 0,1E_{0}).

Más generalmente, el valor del umbral de efectividad se encuentra preferiblemente en el intervalo de 0 a 0,5, y la PCR que tiene un valor de efectividad por debajo de dicho umbral se desvía potencialmente mediante fenómenos de inhibición no controlados.

En el ejemplo mostrado en la figura 7, el valor umbral para la efectividad se estableció en 0,02 (es decir, el 2% de E_{0}. El ciclo C_{S} umbral se corresponde con el ciclo n=36. La figura 7 muestra las mediciones ajustadas de fluorescencia emitida. Puede observarse que hay una correlación satisfactoria con el modelo (línea continua) para aquellas mediciones experimentales (marcadas con una "o") hasta el ciclo n=36. La figura 8 también muestra una buena correlación con mediciones experimentales para efectividad predictiva tal como se obtiene a partir de la figura 7 utilizando el modelo basado en la fluorescencia medida y ajustada.

Las etapas principales de esta implementación pueden resumirse como sigue, con referencia a la figura 9.

En una etapa 70 de inicio, los valores medidos para cantidades de fluorescencia se han obtenido y ajustado con respecto al ruido de fondo como una función del número n de ciclo, tal como se muestra en la figura 6A.

En la etapa 71, se calcula una aproximación para la efectividad de la reacción en el ciclo n utilizando la fórmula (2) anterior para cada uno de los ciclos n=1,2,..., (N-1).

\newpage

En la etapa 72, se determina el ciclo Cs mínimo para el que se satisfacen las dos condiciones siguientes:

\bullet: el ciclo C_{s} se encuentra en la fase de efectividad decreciente; y

\bullet: la efectividad del ciclo umbral es inferior al valor ES de efectividad umbral (por ejemplo E_{s}=0,1E_{0}):

E_{Cs} \leq E_{S}

Ya es posible eliminar los puntos NEG para los que la efectividad es inferior a E_{s}.

En la etapa 73, se forma un modelo para la curva de fluorescencia emitida ajustada cuya efectividad es decreciente sobre el intervalo de ciclo C_{EEP}=(C_{s}-5) a C_{s}, utilizando la expresión (8) en la que se supone que la compensación \varepsilon viene dada por \varepsilon=F'_{0}:

110

A partir de entonces, la prueba 74 sobre el valor \hat{E}'_{0} estimado para el valor E'_{0} y el decremento en la etapa 75 del valor para el ciclo C_{EEP} de cambio busca encontrar el valor buscado de CEEP utilizando un valor de incremento P (que puede ser igual a 1), y repitiendo la etapa 73 siempre que el valor de \hat{E}'_{0} sea inferior a 1.

A partir de entonces, cuando el valor de efectividad estimado supera el valor 1 (la flecha n en la salida de la prueba 74), el valor del índice CEEP se incrementa un valor de incremento h (que puede ser una fracción más pequeña que la unidad) en la etapa 76 y en la etapa 77 la fluorescencia F„ se modela de la misma manera que en la etapa 73. Siempre que la efectividad \hat{E}'_{0} estimada sea mayor que o igual a 1 en la etapa 78, se repiten las etapas 76 a 78. Cuando la efectividad estimada toma un valor inferior a 1, los parámetros (\hat{F}'_{0}, \hat{E}'_{0}, \hat{\beta}'_{0}, \hat{C}_{EEP}) estimados se guardan en una etapa 79 final.

En esta etapa, se ha obtenido finalmente un valor \hat{F}'_{0} que solo por sí solo es representativo del tamaño No de población inicial en la muestra de interés. Entonces, es posible utilizar al menos una muestra patrón que tiene un tamaño N_{0}^{pt} de población conocido para determinar en la etapa 80 el tamaño No de población inicial en la muestra de interés.

Para este fin, se obtiene un valor medido de un tamaño F_{0pt} de población inicial en una muestra patrón de población N_{0pt} inicial conocida. De aquí en adelante, el valor del tamaño N_{0} de población inicial en la muestra de interés se obtiene derivando una relación de proporcionalidad entre la medición para la muestra patrón y su tamaño de población inicial conocido, y aplicando esa relación a la medición F'_{0} para obtener el tamaño No de población inicial real.

Dicho de otro modo, en la etapa 80 de la figura 9, es posible determinar el valor N_{0} del tamaño de población inicial en la muestra de interés aplicando una relación de proporcionalidad sencilla del tipo:

111

que implica que el tamaño de población inicial en el patrón N_{0pt} y la razón de las fluorescencias corregidas, tal como se compensan y estiman ajustando el modelo de fluorescencia, se aplican ambos a la muestra de interés y a la muestra patrón.

Por tanto, se entenderá que un único patrón debería ser suficiente para determinar el tamaño inicial de la población de interés en la muestra de interés, lo que es una ventaja proporcionada por la invención.

Sin embargo, en una variante, y donde se necesario, también podría realizarse la previsión para obtener valores medidos respectivos para los tamaños \hat{F}'_{0 \ pt} de población iniciales en una pluralidad de muestras patrón que tienen tamaños N_{0pt} de población inicial conocidos. A partir de entonces, se establece una relación de dependencia entre los tamaños N_{0pt} de población inicial de las muestras patrón y los respectivos valores medidos para sus tamaños \hat{F}'_{0 \ pt} de población iniciales. A partir de entonces, después de encontrar el valor medido para el tamaño \hat{F}'_{0} de población inicial de la muestra de interés, el tamaño N_{0} de población inicial real de interés se determina mediante interpolación utilizado la relación de dependencia. Se entenderá que esta relación de dependencia puede ser normalmente una regresión del tipo mostrado en la figura 5, pero teniendo los valores \hat{F}'_{0 \ pt} y \hat{F}'_{0} de fluorescencia iniciales de los patrones y de la muestra de interés representados gráficamente en la ordenada (o los valores de sus respectivos logaritmos) en lugar de representar gráficamente valores para el índice C_{EEP} de cambio.

Una vez que se hace uso de uno o más patrones, puede realizarse previsión para una o más muestras patrón que tienen tamaños N_{0pt} de población inicial conocidos respectivos a los que se aplica la sucesión de reacciones de amplificación bajo sustancialmente las mismas condiciones que para la muestra de interés. A partir de entonces, los valores \hat{F}'_{0 \ pt} medidos para sus tamaños de población inicial se determinan haciendo comparaciones de las variaciones parametrizadas con las mediciones experimentales, tal como para la muestra de interés.

Dicho de otro modo, los mismos cálculos se aplican lógicamente en relación a las cantidades de fluorescencia medidas y ajustadas tanto en el(los) patrón(es) como en la muestra de interés. La cantidad de fluorescencia \hat{F}'_{0 \ pt} antes del primer ciclo se estima para el(los) patrón(es) utilizando el mismo método que el utilizado para determinar \hat{F}'_{0} para la muestra de interés, tal como se describió anteriormente.

Una tercera implementación, correspondiente a una variante de la segunda implementación descrita anteriormente consiste en su totalidad en ajustar el modelo para la efectividad E_{n} con respecto a las mediciones experimentales, y en incluir posteriormente dicho modelo de efectividad ajustada en el modelo para el tamaño N_{n} de población actual, o en el modelo para la medición F_{n}. Esta tercera implementación puede resumirse como sigue.

La variación parametrizada generada en la etapa b) es representativa del rendimiento, y en la etapa c), la variación experimental del rendimiento se determina basándose en mediciones experimentales con el fin de comparar las variaciones parametrizadas con la variación experimental. A partir de entonces, con el fin de obtener un parámetro representativo del tamaño No de población inicial, se realizan las siguientes etapas en la etapa d):

: d1) determinar una segunda variación parametrizada representativa del tamaño N_{n} de población actual en la muestra de interés, haciendo uso al menos del parámetro que representa el índice C_{EEP} de cambio, y un parámetro representativo del tamaño No de población inicial;

: d2) aplicar, a dicha segunda variación, un valor parametrizado para el índice CEEP de cambio tal como se determinó en la etapa c); y

: d3) ajustar al menos el parámetro representativo del tamaño N_{0} de población inicial mediante comparación directa de la segunda variación con las mediciones experimentales.

De manera ventajosa, se realiza lo siguiente:

\bullet: en la etapa d2), aplicar un valor aproximado para el índice C_{EEP} de cambio de la misma manera que la descrita para detectarlo con referencia a la figura 4B anterior; y

\bullet: en la etapa d3), refinar posteriormente el valor de índice junto con ajustar el parámetro representativo del tamaño N_{0} de población inicial.

Finalmente, debería entenderse que la segunda implementación actualmente preferida de las figura 7 y 8 difiere de esta tercera implementación por el hecho de que no se hace ningún intento de realizar correlaciones en la efectividad, sino que simplemente se hace uso del modelo matemático para la variación de efectividad con el fin modelar y refinar la estimación de la fluorescencia corregida y compensada.

Lógicamente, la presente invención no está limitada a las realizaciones descritas anteriormente a modo de ejemplo, y se extiende a otras variantes.

Por tanto, se entenderá que la presente invención también puede aplicarse a cuantificación relativa, en particular mediante POR. En esta aplicación, así como amplificar la población de interés, también se amplifica una población de referencia o bien simultáneamente en el mismo medio, o bien por separado. Las mediciones se toman como
sigue:

\bullet: mediciones experimentales representativas del tamaño de la población de interés; y

\bullet: mediciones experimentales representativas del tamaño de población de referencia.

Entonces, el método puede continuar aplicando las etapas a), b) y c) a la población de referencia mientras que la etapa d) consiste simplemente en determinar una razón entre los tamaños iniciales de la población de interés y de la población de referencia.

La cuantificación relativa puede utilizarse para analizar la expresión de un gen de interés durante el desarrollo de un organismo. Con el fin de corregir, en particular, las variaciones en cantidad y calidad entre muestras tomadas de organismos en momentos diferentes, además de analizar el gen diana de interés, también se analiza un gen de referencia que es conocido por tener un nivel de expresión que permanece estable durante el desarrollo.

\newpage

Una etapa final consiste entonces en comparar las razones

112

entre las diversas muestras que se han tomado.

Con el fin de conseguir los resultados deseados, son posibles dos estrategias.

La estrategia de la técnica anterior se basa en detectar el ciclo Ct umbral y normalmente tiene lugar como sigue. Para cada muestra tomada en diferentes instantes t0, t1, t2,..., tn, se determina la razón

113

haciendo uso de al menos un patrón (es decir, un patrón para el que se conocen N_{0diana} y N_{0ref}), lo que equivale a realizar dos cuantificaciones absolutas sucesivas seguidas de calcular una razón.

Otra estrategia que es particularmente ventajosa en el contexto de la invención consiste en determinar para cada muestra tomada en diferentes instantes t0, t1, t2,..., tn la razón:

114

directamente utilizando la siguiente fórmula:

115

En esta segunda implementación, en la que al final sólo hace uso del parámetro F_{0}, en combinación con la técnica de la invención, no se necesita muestra patrón, lo que es particularmente ventajoso.

A continuación se hace referencia a la figura 10 que muestra una instalación para implementar el método de la invención. Comprende un soporte SOP que comprende en este caso un hueco que contiene la muestra ECH de interés y un hueco que contiene una muestra patrón denominada Pt, por ejemplo. El soporte SOP está encerrado en una caja CAJ, por ejemplo instalada con medios de calentador (no mostrados) para aplicar una reacción de PCR al patrón y a la muestra de interés.

En el ejemplo descrito, preferiblemente se hace previsión para tomar mediciones de las cantidades de fluorescencia emitida en cada ciclo, tanto por el patrón Pt como por la muestra ECH de interés. Con este fin, se inserta un reactivo seleccionado en los huecos y las muestras se iluminan mediante una lámpara (por ejemplo una lámpara halógena de tungsteno) con el fin de medir las cantidades respectivas de fluorescencia que procede de ]a muestra de interés y de la muestra patrón en cada ciclo de PCR que se aplica. Además, un aparato para detectar fluorescencia comprende, por ejemplo, una lente 11 de objetive para reunir la luz que procede de la fluorescencia, y medios 10 de recuento de fotones, por ejemplo una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD), y/o fotomultiplicadores, con el fin de medir la fluorescencia emitida en cada ciclo de PCR a partir de la muestra de interés y a partir del patrón. Por tanto, la fluorescencia emitida por cada hueco se concentra de manera ventajosa mediante la lente 11 y entonces se detecta preferiblemente mediante una cámara 10 CCD conectada a una tarjeta 21 de adquisición, por ejemplo del tipo de la Asociación Internacional de Tarjetas de Memoria para Ordenadores Personales (PCMCIA) prevista en una unidad 20 central de un ordenador.

Entonces se conecta el ordenador a los medios 10 de medición mencionados anteriormente para recibir señales desde los mismos que son representativas de las cantidades medidas de fluorescencia detectada en cada ciclo de PCR, y para procesar estas señales con el fin de determinar un tamaño inicial para la población de interés antes del primer ciclo, implementando el método de la invención.

Normalmente, la unidad de procesador comprende lo siguiente:

\bullet: una tarjeta 21 de adquisición conectada a los medios 10 de medición;

\bullet: memoria 25 de trabajo (por ejemplo, del tipo de memoria de acceso aleatorio (RAM)) para el procesamiento y almacenamiento temporal y de las señales mencionadas anteriormente;

\bullet: memoria 24 permanente para almacenar el producto de programa informático en el sentido de la invención y para almacenar los datos que se han procesado y que están listos para su uso, por ejemplo, en diagnósticos posteriores;

\bullet: si fuese apropiado, un lector 22 de un medio de memoria tal como un CD-ROM, por ejemplo, que puede contener el producto de programa informático;

\bullet: de manera opcional, una interfaz 26 de comunicaciones para comunicarse con un sitio local o remoto (conexión 28) por ejemplo para transmitir los datos procesados para permitir que se haga un diagnóstico de manera remota en relación a un paciente;

\bullet: una interfaz 27 gráfica conectada normalmente a una pantalla 30 de visualización; y

\bullet: un procesador 23 para administrar las interacciones entre estos diversos elementos del equipo.

El ordenador también puede tener elementos de entrada tales como un teclado 41 y/o un ratón 42 conectados a la unidad 20 central.

Sin embargo, debería entenderse que en el sentido de la invención la instalación comprende en su totalidad:

\bullet: un soporte SOP de muestras, al menos para la muestra de interés;

\bullet: un primer aparato CAJ para aplicar dicha sucesión de reacciones de amplificación al menos a la población de interés en la muestra de interés;

\bullet: un segundo aparato 10 para tomar mediciones representativas del tamaño actual de la población de interés; y

\bullet: medios 20 informáticos adecuados para recibir señales de medición desde el segundo aparato 10 y para implementar el método de la invención.

Para este fin, puede utilizarse un producto de programa informático para controlar los medios informáticos. El programa puede almacenarse en una memoria de la unidad 20 de procesador o sobre un medio de memoria extraíble (CD-ROM, etc.) y adecuado para funcionar conjuntamente con el lector de la unidad de procesador. El programa informático en el sentido de la invención contiene entonces instrucciones para implementar todas o algunas de las etapas del método de la invención. Por ejemplo, el algoritmo del programa puede representarse mediante un diagrama de flujo equivalente al diagrama de la figura 9.

Claims

1. Método implementado por medios informáticos para cuantificar, de manera absoluta y/o relativa, una población inicial de ácidos nucleicos en una muestra de interés sometida a una sucesión de aplicaciones de una reacción de amplificación de población, durante el que las mediciones experimentales se toman representativas de un tamaño actual de la población de al menos la muestra de interés, comprendiendo el método las siguientes etapas:

a) proporcionar un modelo del rendimiento de la reacción de amplificación como una función de la sucesión de amplificaciones, comprendiendo dicho modelo:

\bullet: una fase sustancialmente constante para una primera

parte: de las aplicaciones de la reacción de amplificación; y

uniéndose la primera y segunda parte por una región de cambio en la que el rendimiento cambia entre la fase constante y la no constante, teniendo dicha región un índice de amplificación que se corresponde sustancialmente con el
cambio;

b) utilizar el modelo de rendimiento para expresar una relación que implica al menos al índice de cambio y a un parámetro representativo del tamaño de población inicial en la muestra de interés;

c) determinar al menos el índice de cambio mediante comparación con las mediciones experimentales; y, en una etapa d) posterior o inmediatamente siguiente deducir a partir del mismo el tamaño de población inicial en la muestra de interés.

2. Método según la reivindicación 1, que incluye:

\bullet: en la etapa b), utilizar el modelo de rendimiento para expresar una variación que se parametriza como una función de dicha sucesión de amplificaciones, implicando al menos un parámetro que representa el índice de cambio; y

\bullet: en la etapa c), determinar al menos dicho parámetro que representa el índice de cambio mediante comparación con dichas mediciones experimentales.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicha variación parametrizada es representativa del tamaño de población actual en la muestra de interés,

en el que dicha variación implica además un parámetro representativo del tamaño de población inicial en la muestra de interés; y

en el que las etapas c) y d), los parámetros representativos de dicho índice de amplificación y del tamaño de población inicial en la muestra de interés se determinan sustancialmente juntos.

4. Método según la reivindicación 2, en el que dicha variación parametrizada es representativa del rendimiento, y en el que en la etapa c), se determina una variación experimental del rendimiento a partir de dichas mediciones experimentales, con el fin de comparar la variación parametrizada con la variación experimental.

5. Método según la reivindicación 4, que incluye, en la etapa d):

d1) determinar una segunda variación parametrizada que es representativa del tamaño de población actual en la muestra de interés, y que implica al menos al parámetro que representa dicho índice de amplificación, y a un parámetro representativo del tamaño de población inicial en la muestra de interés;

d2) aplicar un valor parametrizado para el índice determinado en la etapa c) a la segunda variación; y

d3) ajustar al menos el parámetro representativo del tamaño de población inicial mediante comparación directa de la segunda variación con las mediciones experimentales.

6. Método según la reivindicación 5, que incluye:

\bullet: en la etapa d2), aplicar un valor aproximado para el índice, mientras que

\bullet: en la etapa d3), refinar el valor del índice mientras que también se ajusta el parámetro representativo del tamaño de población inicial.

7. Método según la reivindicación 3 ó 6, en el que dicha variación parametrizada o dicha segunda variación parametrizada, como pueda ser el caso:

\bullet: es representativa de dichas mediciones experimentales; e

\bullet: incluye un parámetro correspondiente a un valor medido representativo del tamaño de población inicial,

y en el que el valor de medición del tamaño de población inicial se determina comparando dichas variaciones parametrizadas con las mediciones experimentales.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que incluye aplicar una etapa previa de procesamiento de las mediciones experimentales, etapa que comprende sustraer un ruido de fondo de las mediciones e introducir u:-1.a compensación para tener en cuenta una medición distinta de cero representativa del tamaño de población inicial.

9. Método según la reivindicación 7 u 8, que incluye obtener un valor de medición para un tamaño de población inicial en una muestra patrón que tiene un tamaño de población inicial conocido y derivar una relación de proporcionalidad entre los mismos; y determinar el valor del tamaño de población inicial en la muestra de interés aplicando la misma relación de proporcionalidad entre el tamaño de población inicial y su medición para la muestra de interés.

10. Método según la reivindicación 7 u 8, que incluye obtener valores de medición respectivos para los tamaños de población inicial en muestras patrón que tienes. tamaños de población inicial conocidos, y:

\bullet: establecer una relación de dependencia entre los tamaños de población inicial de las muestras patrón y los valores de medición correspondientes para sus tamaños de población inicial respectivos; y

\bullet: después de determinar el valor de medición para el tamaño de población inicial de la muestra de interés, determinar el tamaño inicial de la población de interés mediante interpolación sobre dicha relación de dependencia.

11. Método según la reivindicación 9 ó 10, que incluye proporcionar una o más muestras patrón que tienen tamaños de población inicial conocidos respectivos, aplicar dicha sucesión de amplificaciones a dichas muestras patrón bajo sustancialmente las mismas condiciones como para la muestra de interés, y determinar sus valores de medición inicial eficaces comparando las variaciones parametrizadas con los valores experimentales.

12. Método según la reivindicación 3, que incluye proporcionar una pluralidad de muestras patrón que tienen tamaños de población inicial conocidos respectivos, aplicar dicha sucesión de amplificaciones a las mismas bajo sustancialmente las mismas condiciones como para la muestra de interés, y determinar sus índices respectivos en la aplicación de las etapas a), b) y c), y, en la etapa d):

\bullet: establecer una relación de dependencia entre los tamaños de población iniciales de las muestras patrón y sus índices; y

\bullet: después de determinar el índice para la muestra de interés, determinar el tamaño inicial de la población de interés mediante interpolación sobre dicha relación de dependencia.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que, para una cuantificación relativa, proporcionando no sólo la población de interés, sino también una población de referencia que está sometida a una sucesión de aplicaciones de la reacción de amplificación, el método consiste en tomar, respectivamente:

\bullet: mediciones experimentales representativas del tamaño de la población de referencia;

continuando el método aplicando las etapas a), b), y c) a la población de referencia, con la etapa d) consistiendo en determinar una razón entre los tamaños iniciales respectivos de la población de interés y de la población de referencia.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que incluye:

\bullet: expresar las mediciones experimentales en la forma de una variación experimental de rendimiento como una función de dicha la sucesión de amplificaciones; y

\bullet: obtener una variación experimental de rendimiento como una función de dicha sucesión de amplificaciones que comprende:

: - una primera región que está sometida sustancialmente a ruido para números de índice de amplificación bajos; y

: - seguida por una segunda región con menos ruido para números de índice de amplificación más altos.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicha fase no constante del rendimiento es una de rendimiento decreciente, incluyendo el método:

\bullet: estimar un valor aproximado para la fase constante de rendimiento; y

\bullet: al menos cuando se busca el índice en dicha región de cambio, ignorar al menos algunas de las mediciones en dicha segunda región de menor ruido para las que el rendimiento estimado está por debajo de un valor umbral, preferiblemente por debajo de una fracción de la fase constante.

16. Método según la reivindicación 14 ó 15, en el que dicha fase no constante del rendimiento es una fase de rendimiento decreciente, incluyendo el método identificar dicha región de cambio trabajando en la dirección del número de índice de amplificación decreciente, partiendo de dicha segunda región de menor ruido, y detectar un índice de amplificación aproximado en el que el rendimiento supera perceptiblemente un valor predeterminado.

17. Método según la reivindicación 16, en el que el valor estimado de dicho índice de amplificación en la región de cambio se redefine, posiblemente para obtener un valor fraccionario, trabajando en la dirección del número de índice de amplificación creciente, partiendo del índice aproximado, detectando un índice de amplificación para el que el rendimiento es aproximadamente igual a dicho valor predeterminado.

18. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que incluye modelar dicha fase no constante del rendimiento mediante una exponencial decreciente que incluye un parámetro de decrecimiento, y determinar dicho parámetro de decrecimiento en la etapa c) con el índice en la región de cambio mediante comparación con las mediciones experimentales.

19. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la reacción de amplificación es una reacción en cadena de la polimerasa realizada en tiempo real.

20. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que dichas mediciones son cantidades medidas de fluorescencia emitida.

21. Instalación para implementar el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, comprendiendo la instalación:

\bullet: un soporte de muestras para soportar al menos la muestra de interés;

\bullet: un primer aparato para aplicar dicha sucesión de reacciones de amplificación, al menos a la población de interés en la muestra de interés;

\bullet: un segundo aparato para tomar mediciones representativas del tamaño actual de la población de interés; y

\bullet: medios informáticos adecuados para recibir señales de medición desde el segundo aparato e implementar el método según la reivindicación 1.

22. Producto de programa informático para almacenar en una memoria de una unidad de procesador o sobre un medio de memoria extraíble adecuado para funcionar conjuntamente con un lector de dicha unidad de procesador, comprendiendo el producto de programa instrucciones para implementar el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.