PT1700245E - Método, instalação e programa informático para estimar o tamanho inicial de uma população de ácidos nucleicos em particular por pcr - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODO, INSTALAÇÃO E PROGRAMA INFORMÁTICO PARA ESTIMAR O TAMANHO INICIAL DE UMA POPULAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS EM PARTICULAR POR PCR" A presente invenção refere-se a estimativa do tamanho inicial de uma população de interesse numa amostra sujeita a uma sucessão de reacções de amplificação.

Antecedentes da invenção A presente invenção tem uma aplicação particularmente vantajosa, mas não limitadora, na determinação de uma quantidade inicial de ácidos nucleicos numa amostra sujeita a uma reacção em cadeia de polimerase (PCR) em tempo real. Uma técnica deste tipo, conhecida como "quantificação PCR" é utilizada em particular para avaliar o número de cópias de agentes patogénicos (p.ex. do vírus da imunodeficiência humano (HIV)) numa amostra de fluidos corporais recolhidos de um paciente, tipicamente no contexto de uma análise médica.

Faz-se referência à figura 1, para uma breve descrição do aspecto diagramático de uma curva de amplificação PCR em tempo real com números de índice do ciclo PCR registados ao longo das abcissas e, no exemplo apresentado, com quantidades de fluorescência emitida (em unidades arbitrárias) conforme a medição para cada ciclo PCR registado nas ordenadas. Para cada ciclo PCR, deve-se subentender que a amostra é sujeita a variações térmicas que permitem à polimerase ADN amplificar ácidos nucleicos e que permitem os produtos PCR correspondentes ser detectados por moléculas fluorescentes. Ao registar a fluorescência 2 medida Fn como uma função do número de ciclo PCR n, é obtida a variação do tipo apresentado na figura 1 e inclui pelo menos: uma primeira porção em que as medições por fluorescência coincidem substancialmente com o ruido de fundo do aparelho para medição da fluorescência; uma segunda porção EXP em que as quantidades medições de fluorescência aumentam de uma forma substancialmente exponencial; uma terceira porção LIN em que o aumento das quantidades medições de fluorescência é significativamente atenuado e se comporta de um modo geral de uma forma substancialmente linear e uma quarta porção PLA em que as medições da fluorescência atingem uma fase estável.

Deve-se ter em atenção que, para os ciclos iniciais PCR (primeira e segunda porções) , a população de interesse aumenta de forma substancialmente exponencial, enquanto que para os ciclos seguintes (terceira e quarta porções) entram em competição outros fenómenos com o crescimento da população de interesse, de forma que o crescimento mencionado é então atenuado até à fase de estabilidade PLA. 0 documento "Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of Standard curves" by R.G. Rutledge and C. Côté, published in Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 16, revela um método de estimar a quantidade inicial desconhecida de ácidos nucleicos numa amostra de interesse por meio de PCR. Esse método consiste na utilização de várias amostras com quantidades iniciais conhecidas de ácidos nucleicos, designadas como "padrões", de forma a 3 determinar por meio de interpolação a quantidade inicial de ácidos nucleicos presentes na amostra de interesse.

Em geral, quanto maior a quantidade inicial de ácidos nucleicos numa amostra, mais rapidamente é atingida a quantidade detectável de produto PCR, isto é, mais rapidamente é atingida uma quantidade detectável de fluorescência emitida. Relativamente à figura 2, referente à técnica anterior, subentende-se que a população inicial na Stl padrão é maior que a da St2 padrão, que é maior que a da St3, etc, uma vez que o ciclo Ctl para a Stl padrão ocorre antes do ciclo correspondente Ct2 para a St2 padrão, o que ocorre antes do ciclo Ct3 para a St3 padrão, etc.

Assim, um ciclo CT destes, correspondendo ao ciclo em que as medições de fluorescência atingem um limiar de fluorescência (conforme se vê na figura 2) estabelece a um nivel arbitrário (tipicamente abaixo do ruido de fundo) e age como um parâmetro representativo do nivel inicial NO de uma população de ácidos nucleicos sujeita aos ciclos PCR. Foi feito uso desta observação na técnica anterior, previamente citada, para estabelecer uma relação do tipo apresentado na figura 3, entre os números de ciclo Ctl, Ct2, Ct3, Ct4 para vários padrões com populações iniciais conhecidas e as suas populações iniciais No1, N02, No3, No4. Assim, ao registar os ciclos Ctl, Ct2, Ct3, Ct4, etc. pelas ordenadas acima e o logaritmo do tamanho inicial da população No1, N02, N03, N04 ao longo das abcissas, é obtida uma curva de regressão REG. Nesta curva de regressão Peg, o ciclo Ctint, detectado para a amostra de interesse é registado (seta a tracejado Fl) . Por meio da interpolação na curva de regressão REG (seta a tracejado F2) o tamanho 4 inicial da população Noint é então determinado para a amostra de interesse.

Apesar de o método estar amplamente divulgado, apresenta mesmo assim, algumas desvantagens.

Em primeiro lugar, requer a utilização de várias amostras padrão com as respectivas populações iniciais conhecidas.

Em segundo lugar, o método depende da avaliação do utilizador, uma vez que o valor limiar de fluorescência, conforme seleccionado pelo utilizador tem uma influência directa nos valores dos ciclos Ct nas curvas de amplificação e, consequentemente, nos valores estimados para o tamanho inicial da população na amostra de interesse . 0 valor limiar tem também um impacto na exactidão do resultado, uma vez que a exactidão é geralmente melhor se o limiar for seleccionado para se situar na fase de crescimento exponencial EXP da curva de amplificação. Mesmo assim, na prática, é dificil para o utilizador saber se o nível limiar de fluorescência THR que foi estabelecido corresponde, realmente, à fase exponencial das curvas e fá-lo para todas as amostras (as amostras padrão e as amostras de interesse).

Finalmente, o método assume sem qualquer verificação que a população tem a mesma amplificação na amostra de interesse e em todas as amostras padrão. Assim, se a amostra de interesse contiver inibidores PCR, tal como é tipicamente o caso, então o seu resultado será falsamente diminuído.

Deve-se assim, subentender que a técnica anterior depende do limiar de fluorescência THR, conforme definido pelo 5 utilizador. 0 valor seleccionado tem uma influência nos valores dos ciclos Ct e consequentemente na determinação da quantidade inicial na amostra de interesse. Esta é uma das razões porque uma grande quantidade de trabalho tem sido recentemente realizado para automatizar o ciclo de detecção Ct e o tornar fiável.

OBJECTOS E RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção procura melhorar a situação por meio da proposta de uma abordagem que é completamente diferente.

Em primeiro lugar, a presente invenção oferece um método, sendo o método implementado por meio de computador, para quantificar de forma absoluta e/ou relativa uma população inicial de ácidos nucleicos numa amostra de interesse. A amostra é sujeita a uma sucessão de aplicações de uma reacção para a amplificação da população de interesse. De uma forma muito geral, esta amplificação pode ser realizada por meio da implementação de ciclos PCR sucessivos, no entanto pode também ser utilizada qualquer outra técnica de amplificação. Antes de mais, deve-se assumir que a amplificação necessita apenas de ser definida por um rendimento da reacção como se descreve em seguida. Durante estas operações de amplificação sucessivas, são realizadas medições experimentais que são representativas de um tamanho de população actual, pelo menos na amostra de interesse. Pressupõe-se que uma ou mais medições podem ser realizadas depois ou durante cada reacção de amplificação sem perda de generalidade.

Numa definição presentemente preferida da presente invenção, o método no sentido da presente invenção inclui as seguintes etapas: 6 a) apresentação de um modelo de rendimento da reacção de amplificação em função da sucessão de amplificações, incluindo o dito modelo: • um estádio substancialmente constante para uma primeira porção das aplicações da reacção de amplificação e • um estádio não-constante para uma segunda porção das aplicações da reacção de amplificação; estando as primeira e segunda porções unidas por uma região de transição em que as alterações do rendimento por entre os estádios constante e não constante, tendo um índice de amplificação substancialmente correspondente à transição; b) utilizando o modelo de rendimento para exprimir uma relação envolvendo pelo menos o índice de transição e um parâmetro representativo do tamanho inicial de população na amostra de interesse; c) determinando pelo menos o índice de transição por meio de comparação com as medições experimentais; e, numa etapa subsequente ou imediatamente seguinte d) deduzindo daí o tamanho inicial de população na amostra de interesse.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Outras vantagens e características da presente invenção evidenciam-se durante a leitura da descrição pormenorizada seguinte, de uma implementação indicada em seguida a título de exemplo com referência às figuras anexas, em que: A figura 1 refere-se à técnica anterior e representa variação na quantidade medida de fluorescência em 7 função do número de ciclos PCR, conforme anteriormente descrito; A figura 2 refere-se à técnica anterior e representa as quantidades medições de fluorescência que são emitidas em função do número de ciclos PCR, conforme anteriormente descrito; A figura 3 representa um método de interpolação para a determinação da quantidade inicial da população de interesse na amostra de interesse utilizando um método conhecido na técnica anterior e descrito anteriormente; A figura 4A é um diagrama que mostra a variação nas medições experimentais anteriormente descritas, em função da sucessão de amplificações aplicadas à amostra de interesse; A figura 4B é um diagrama que mostra a variação no rendimento da reacção de amplificação, obtida de medições experimentais, em função da sucessão de amplificações aplicadas à amostra de interesse; A figura 5 regista a relação de regressão entre os indices de transição de rendimento que ocorrem na transição entre o estádio constante e o estádio não-constante e os logaritmos das populações iniciais para amostras padrão e para as amostras de interesse, para utilização numa primeira implementação; A figura 6A apresenta uma variação típica na quantidade medida de fluorescência depois de ter sido ajustada tendo em conta o ruído de fundo específico das medições e registada em função do número n de ciclos de reacção PCR; A figura 6B apresenta a variação da eficácia do PCR apresentado na figura 6A em função do número n de ciclos; A figura 7 compara a variação experimental em fluorescência emitida, conforme se mostra na figura 6A, com os resultados obtidos por meio da aplicação do modelo de fluorescência emitida, obtidos por meio da inclusão de um modelo de eficácia numa segunda implementação; A figura 8 é uma comparação entre a variação na eficácia da figura 6B e a pedido de patente de um modelo de eficácia deduzido a partir do modelo de fluorescência emitida da figura 7; A figura 9 é um fluxograma que define as principais etapas no método numa implementação proposta da presente invenção e A figura 10 é um diagrama de uma instalação para a quantificação da população inicial de uma amostra de interesse.

DESCRIÇÃO MAIS PORMENORIZADA

Faz-se referência às figuras 4A e 4B para uma breve descrição de alguns princípios da presente invenção que ilustram as caracteristicas do método apresentado anteriormente.

Em primeiro lugar, deve-se pressupor que a figura 4A é um registo de uma sucessão de medições experimentais Fn, representativas do verdadeiro tamanho de uma população de interesse que está a ser sujeita progressivamente a uma sucessão de reacções de amplificação, estando cada reacção indexada por um número índice n. No exemplo não limitativo descrito neste caso, esta sucessão de reacções corresponde a uma sucessão de ciclos PCR. Neste exemplo não limitativo, as medições experimentais Fn correspondem a quantidades medições de fluorescência em cada ciclo PCR. Assim, num 9 método de quantificação que combina a reacção de PCR e a fluorescência emitida pela amostra de interesse, os reagentes de fluorescência são introduzidos na amostra de forma que a fluorescência que é emitida durante um ciclo PCR é proporcional ao tamanho da população de ácidos nucleicos na amostra. Na realidade, pode ser preferível realizar várias medições ou absolutamente nenhuma medição para certos ciclos PCR. Além disso, mais geralmente, o método de medição pode recorrer a técnicas diferentes da fluorescência, mesmo se a fluorescência for o método que é frequentemente utilizado para quantificar por PCR. Finalmente, subentende-se que outras técnicas de amplificação podem ser implementadas no contexto da presente invenção, desde que seja possível seguir a variação no rendimento da reacção correspondente à amplificação. Uma vez que o exemplo descrito em seguida se refere preferencialmente a ciclos PCR, faz-se referência à "eficácia do PCR" escrito En para cada ciclo PCR do índice n, de forma a referir ao rendimento da reacção de amplificação.

Conforme anteriormente mencionado, relativamente à figura 1, a figura 4A inclui principalmente duas regiões em que: • durante os ciclos iniciais PCR (porção EXP), a população cresce substancialmente exponencialmente; enquanto que durante os ciclos seguintes (as porções LIN e PLA) outros fenómenos entram em competição com o crescimento da população de interesse, assim o crescimento torna-se atenuado. São levantadas as duas hipóteses seguintes: 10 •o rendimento da reacção En é relativamente constante durante os ciclos iniciais durante a porção EXP e •depois de realizados alguns ciclos, o rendimento En da reacção começa a diminuir durante as porções LIN e PLA.

Esta diminuição no rendimento pode ter várias explicações, em particular uma degradação e/ou uma falta de reagentes PCR (polimerase ADN, dNTPs, iniciadores, etc) e/ou inibição pelos produtos que são eles próprios feitos.

Presume-se que o rendimento é inicialmente constante e que depois diminui. Mesmo assim, deve-se subentender que a presente invenção aplica mais geralmente ao contexto do rendimento: que é inicialmente constante, que corresponde a uma situação normal para o crescimento por meio de amplificação e que é posteriormente não constante (diminui ou aumenta), o que corresponde a uma situação que é substancialmente anormal. circunstância.

No contexto das reacções para a amplificação da quantidade de ácidos nucleicos, constatou-se que o rendimento muda frequentemente de um estádio constante para um estádio não constante. No sentido da presente invenção, tira-se partido desta observação para deduzir a quantidade inicial dos ácidos nucleicos, conforme se descreve pormenorizadamente em seguida. Inicialmente, constata-se apenas que o rendimento pode também modificar-se de um estádio não-constante durante os primeiros ciclos para um estádio constante subsequente. A presente invenção é igualmente aplicável nesta circunstância. Em geral, deve-se 11 subentender, por conseguinte, que no sentido da presente invenção é detectada uma transição de rendimento entre um estádio constante e um estádio não constante. 0 objectivo consiste em encontrar o tamanho inicial da população que foi sujeita à amplificação. Relativamente à figura 4, subentende-se que a medição F0, representativa deste tamanho de população inicial, o que coincide na prática com a medição do ruído de fundo BN, não pode ser utilizada isoladamente para determinar directamente o tamanho de população inicial. Na técnica anterior, têm sido feitas tentativas para quantificar o tamanho de população inicial recorrendo ao estádio exponencial, isto é, um estádio que ocorre tipicamente no ruído de fundo de saída. É então determinado um ciclo Ct limiar (correspondente ao ponto TA para "técnica anterior" na figura 4A. Tal como anteriormente mencionado, Nesta região as medições são frequentemente afectadas pelo ruído e é difícil determinar com exactidão um ciclo limiar Ct representativo do ruído de fundo de saída.

Numa abordagem completamente diferente, a presente invenção recorre antes a quase todos os pontos da curva de amplificação de forma a determinar com exactidão uma região CHO onde o rendimento muda entre um estádio constante e um estádio não constante, tipicamente nas presentes circunstâncias entre o estádio exponencial EXP e o estádio linear LIN. Subentende-se que as medições são logicamente menos afectadas pelo ruído nesta região CHO do que na região de ruído de fundo de saída, uma vez que a região CHO ocorre durante os ciclos posteriores. Além disso, particularmente devido às propriedades matemáticas associada ao rendimento, revela-se em seguida que, muito 12 vantajosamente, o número de padrões que necessitam de ser utilizados para a quantificação do tamanho inicial da população de interesse é menor do que o número de padrões utilizados na quantificação da técnica anterior. A relação para associar a região de transição CHO com o tamanho inicial da população de interesse é rapidamente descrito em seguida. 0 rendimento de uma reacção de amplificação é indicada por:

Nn+1 Nn + En x Nn em que:

Nn é o tamanho da população de interesse depois de uma amplificação do índice n é uma sucessão de amplificações;

Nn+i é o tamanho da população de interesse depois de uma amplificação seguinte do índice n+1 na sucessão de amplificações anteriormente mencionada e

En é o rendimento da reacção de amplificação do índice n na sucessão de amplificações anteriormente mencionada.

Ao reformular esta relação como uma relação recorrente obtemos: = (1 + En) (1 + En-!) (1 + En-2) ... (1 + Eo)No em que No é o tamanho inicial da população de interesse. Enquanto o rendimento En é constante subentende-se que a relação anterior pode ser escrita de forma mais simples da seguinte maneira:

Nn+i = N0 x (1 + E0)"+i 13 onde o índice n+1 não atingiu a região de transição CHO. Enquanto o rendimento é constante durante os ciclos iniciais aplica-se o seguinte:

En - En-1 - En-2 - ... - Eo onde E0 é o valor do rendimento durante o estádio constante. Mesmo assim, quando o índice n+1 se move para a região de transição CHO, a relação torna-se:

Nn-t-i - No x (1 + Eq)Ceep x function (.CEep, n+1) em que: •(Ceep - 1) é o último índice da reacção de amplificação durante a qual o rendimento é ainda constante (subentende-se assim que o próprio índice CEep representa o índice de transição propriamente dito entre o estádio exponencial e o estádio linear) e •o termo função (CEEpr n+1) é uma função particular que caracteriza o estádio não constante do rendimento e que depende pelo menos do índice de transição CEEp e do índice de amplificação actual n+1.

Assim, pode-se ver como é possível associar o índice de transição CEEp e o tamanho inicial N0 da população de interesse. Neste estádio pode-se subentender que as etapas a) e b) do método anteriormente mencionado foram já implementadas.

Uma primeira implementação consiste na determinação experimental do índice de transição CEEp e na sua correlação com o tamanho inicial por meio de regressão utilizando 14 várias amostras padrão que são sujeitas ao mesmo tratamento de amplificação que a amostra de interesse. Nestas circunstâncias, subentende-se que as etapas b) e c) do método anteriormente definido são meramente intercambiadas, uma vez que inicialmente o índice de transição CEep (etapa c)) é determinado experimentalmente e subsequentemente a relação entre o índice CEep e o tamanho inicial N0 (etapa b)) é determinada de forma a acabar com o tamanho inicial N0 (etapa d)).

Antes de descrever todas estas etapas pormenorizadamente no sentido da primeira implementação é descrito um método para a determinação do índice CEep com base em medições experimentais. Em particular, subentende-se que este método de determinação do índice CEEP experimentalmente pode ser aplicado a outra implementação que é diferente da primeira implementação anteriormente mencionada.

Voltando à relação entre a eficácia En de um dado ciclo n e o tamanho actual da população de interesse no mesmo ciclo Nn e num ciclo subsequente Nn+i, a eficácia da amplificação pode ser expressa da seguinte forma: κ - -1

Nalgumas circunstâncias, particularmente quando não existe necessidade de ter em conta o ruído de fundo BN nas medições é possível uma primeira aproximação para assumir que as medições são substancialmente proporcionais ao tamanho actual da população de interesse. Mesmo assim, na prática, ter-se-à mais frequentemente em conta o desvio da medição, sendo determinadas medições experimentais 15 corrigidas F'n com base nas medições directas Fn como se mostra na figura 4A. É preferencialmente aplicada uma etapa anterior de processamento das medições experimentais Fn, consistindo esta etapa na subtracção do ruído de fundo BN e subsequentemente na introdução de compensação para ter em consideração uma medição não zero ε, representativa do tamanho inicial de população. No exemplo apresentado na figura 4A, a variação no ruído de fundo BN em função do índice n pode ser representado por uma função linear uma vez que os testes revelaram que um modelo linear é satisfatório para medições de fluorescência em PCR. Mesmo assim, nalgumas circunstâncias poderá ser preferível utilizar um modelo de variação exponencial. Em qualquer caso, é aplicado um modelo que respeita melhor a variação no ruído de fundo BN, tal como é tipicamente indicado pelos pontos de medição iniciais. EM seguida, o modelo seleccionado para variação no ruído de fundo BN é subtraído de todos os valores de medição experimental Fn. Ao aplicar esta etapa, subentende-se que a medição de fluorescência teórica FO é reduzida para um valor de medição zero, correspondente a um tamanho de população inicial No de zero, o que não é representativo da realidade física. Consequentemente, é vantajoso aplicar compensação para esta correcção da seguinte forma: F'n = Fn - BN + ε em que: o termo F'n corresponde a uma medição corrigida para um índice actual n; 16 • o termo Fn corresponde à medição experimental em bruto do índice actual n mencionado; • o termo BN corresponde ao valor para o ruído de fundo, tal como modelado para o índice actual n e • ε é o termo de compensação correspondente que é assumido como constante no exemplo descrito e que representa directamente o tamanho inicial de população NO.

Apesar de as etapas de correcção do ruído de fundo serem muito vantajosas na determinação do índice de transição Ceep, podem também ser aplicados a qualquer determinação e quantificação do tamanho inicial de população NO sempre que o ruído de fundo puder falsificar a medição do tamanho de população NO mencionado. Neste contexto, estas etapas podem constituir assunto de protecção em separado quando apropriado.

As medições corrigidas F'n obtidas desta forma são vantajosamente proporcionais aos tamanhos de população actuais Nn nas amostras de interesse, de forma que o rendimento En pode agora ser expresso directamente como uma função dos valores de medição (corrigidos como anteriormente descrito), pela relação seguinte: E„ = (F’n+i/F’n) - 1

Assim, a partir das medições experimentais Fn da figura 4A, foram obtidas medições corrigidas F'n, a partir das quais é subsequentemente determinada a variação na eficácia En como uma função da sucessão de índices n, como se mostra na figura 4B. 17

Em resumo, as medições experimentais são expressas na forma de uma variação experimental na eficácia En do tipo apresentado na figura 4B como uma função da sucessão de amplificações n. Este facto proporciona uma variação determinada de forma experimental para o rendimento, incluindo: uma primeira região perceptivelmente ruidosa para índices de amplificação baixos n (especificamente antes do ciclo CG no exemplo da figura 4B) e seguido por uma segunda região com menos ruído para maiores índices de amplificação (pelo menos depois da região de transição CHO).

Pelo menos na circunstância mais habitual de amplificação por PCR e medição por fluorescência, o estádio não constante de rendimento é decrescente e corresponde à segunda região mencionada com pouco ruído (como se mostra na figura 4B) . Especificamente para fins de eliminação de pontos de medição que correm o risco de falsificação de resultados quando se selecciona um modelo para aplicar à variação de rendimento: um valor em bruto E0 é estimado para o estádio de rendimento constante e • particularmente quando se procura o índice de transição CEep^ pelo menos algumas da medições na segunda região menos barulhenta são ignoradas, para o que o rendimento estimado é inferior ao valor limiar, p.ex. correspondente a alguma fracção do estádio constante E0. 18

Estes pontos NEG (figura 4) que são eliminados são tipicamente os que correspondem a índices de amplificação n muito altos e que podem já não satisfazer o modelo de eficácia que é seleccionado substancialmente em torno da região de transição CHO. A título de exemplo, a fim de os eliminar, é avaliada uma média para o estádio constante de rendimento E0, tipicamente para os índices iniciais n. Em seguida, é seleccionado um valor limiar que corresponde a uma fracção da média encontrada para o estádio constante Eo p.ex. 10%. Em seguida, a começar nos índices mais altos n, todos os pontos de medição NEG de rendimento medido inferiores ou iguais ao valor limiar mencionado são eliminados. Esta etapa, que é muito vantajosa para a detecção do índice CEEP, pode mesmo assim ser aplicada a qualquer determinação baseada no rendimento En e pode constituir o assunto de protecção em separado quando apropriado.

Quando o rendimento apresenta um estádio não constante em que o rendimento está a diminuir e que segue um estádio constante, como se revela na figura 4B, a região de transição CHO é identificada trabalhando na direcção dos números de índice n decrescentes, a começar na segunda região menos ruidosa e detectando um índice CG grosseiro para o qual o rendimento passa um valor pré-determinado. Assim, relativamente à figura 4B, seguir na direcção dos números do índice n decrescentes de forma a ascender na direcção da região de transição CHO, o rendimento associado com cada número do índice é avaliado. Para o primeiro ponto de medição do rendimento que é significativamente maior do que o valor pré-determinado anteriormente mencionado, é considerado que o índice grosseiro anteriormente mencionado 19 CG foi detectado e corresponde ao índice do ponto de medição.

Como se descreve em seguida numa implementação subsequente, é possível para cada ponto de medição modelar a variação no seu rendimento como se o próprio ponto estabelecido correspondesse ao índice de transição CEep- Nessa implementação, se o estádio de rendimento constante E0 for estimado, e se o valor estimado exceder o valor pré-determinado, anteriormente mencionado, então o ponto é considerado como correspondendo ao índice grosseiro CG.

Em geral, um rendimento máximo tem um valor de 1, de forma que é possível seleccionar o valor pré-determinado anteriormente mencionado como sendo igual a 1. Mesmo assim, este pode variar e, por exemplo, pode-se preparar para estabelecer o valor pré-determinado como correspondendo ao rendimento médio E0, tal como avaliado pelos ciclos de reacção iniciais.

Em seguida, a estimativa do valor do índice de amplificação CEep na região de transição é refinado, valor esse que pode ser vantajosamente uma fracção, trabalhando na direcção de números índice da amplificação crescentes, a começar no índice grosseiro CG e detectando um índice de amplificação para o qual o rendimento seja aproximadamente igual ao valor pré-determinado, anteriormente mencionado. Assim, de novo relativamente à figura 4B, a fim de refinar a busca do índice de transição CEep depois de ter sido determinado o índice grosseiro CG, é realizada uma busca no sentido descendente, a começar no índice grosseiro CG e seguindo na direcção do número índice n crescente, por etapas de um tamanho menor que um índice inteiro e o valor das abcissas 20 é determinado, p.ex. por interpolação, em que o valor pré-determinado é cruzado. Tipicamente, desde que o valor estádio constante se mantenha maior que 1, a busca é continuada na direcção do número n crescente, e o índice (Ceep-1) que precede a transição é determinado assim que o valor constante E0 é igual a ou muito próximo de 1. É por isso que é apropriado seleccionar um tamanho de etapa de busca correspondente a uma fracção do índice, por exemplo 10% de um ciclo n.

Na primeira implementação anteriormente mencionada, várias amostras padrão são apresentadas com tendo respectivos tamanhos iniciais de população conhecidos e a sucessão de amplificações é-lhes aplicada em condições substancialmente iguais às da amostra de interesse. Os seus respectivos índices de transição são determinados de acordo com as etapas anteriormente descritas a), b) e c), Na etapa d) : é estabelecida uma relação de dependência entre os tamanhos iniciais de população das amostras padrão N0st e os seus índices CEEpst e depois de determinar o índice CEEp para a amostra de interesse, o tamanho inicial da população de interesse No é determinado por meio de interpolação nessa relação de dependência.

Assim, relativamente à figura 5, pode ser estabelecida uma relação de dependência entre os ciclos de transição CEEP1, CEEP2 dos padrões e suas concentrações iniciais No1, N02 (na realidade os seus logaritmos), p.ex. por regressão. Medindo o índice de transição CEEPint para a amostra de interesse e registando o seu valor na curva de regressão da figura 5, a 21 concentração inicial Noint na amostra de interesse é obtido por interpolação.

Esta primeira implementação é, portanto, muito semelhante à da técnica anterior, descrita relativamente à figura 3. Mesmo assim, não se deve esquecer que o índice de transição CEep de que depende a primeira implementação não corresponde de forma alguma ao ciclo limiar Ct da técnica anterior.

Numa abordagem que é significativamente diferente desta primeira implementação: na etapa b) recorre-se ao modelo de rendimento para exprimir variação que é parametrizada como uma função da sucessão de amplificações, recorrendo esta variação a pelo menos um parâmetro representando o índice de transição CEep e • na etapa c), pelo menos o parâmetro mencionado, representando o índice de transição CEep é determinado por meio de comparação com as medições experimentais.

Numa segunda implementação, esta variação parametrizada é representativa do tamanho de população actual Nn na amostra de interesse.

Tipicamente, esta variação parametrizada pode ser calculada a partir de uma expressão do tipo indicado anteriormente:

Nn+1 = No X (1 + Eo)Ceep X function(CEEP, n+1)

Assim, para além de um parâmetro que representa o índice de transição CEep^ esta variação recorre a um parâmetro que 22 representa o tamanho inicial de população No na amostra de interesse.

Em seguida, nas etapas c) e d) desta segunda implementação, estes dois parâmetros CEep e No são determinados substancialmente em conjunto.

Anteriormente, na etapa a), é necessário determinar um modelo para a função anteriormente mencionado (CEep, n+1) .

Normalmente, para a quantificação PCR, é seleccionado um modelo para o estádio não constante do rendimento, correspondente a um exponencial decrescente, com um parâmetro de diminuição β que é descrito mais pormenorizadamente em seguida. Este parâmetro de diminuição β é então determinado na etapa c), pelo menos com o indice de transição CEep por meio de comparação com as medições experimentais.

Assim, nesta segunda implementação, assim que o modelo de rendimento En é seleccionado, é aplicado à expressão geral para o tamanho de população actual Nn indicado pela relação anterior. Este facto proporciona um modelo de variação no tamanho de população actual Nn.

Mesmo assim, a menos que as medições experimentais indique o valor para o tamanho de população actual Nn directamente (o que raramente é verdade na prática, actualmente) é apropriado subsequentemente modelar as próprias medições experimentais Fn, tendo em consideração o ruido de fundo subtraído e a subsequente compensação ε, tal como descrito anteriormente. 23

Assim, numa implementação presentemente preferida, a variação parametrizada anteriormente mencionada: é representativa de medições experimentais e • inclui um parâmetro correspondente a um valor de medição F0, representativo do tamanho de população inicial.

Em seguida, o valor medido do tamanho de população inicial Fo é determinado por meio de comparação da variação parametrizada Fn mencionada com as medições experimentais.

Para realizar esta comparação é possível, por exemplo, ajustar os parâmetros F0, E0, CEep e o parâmetro de diminuição β no modelo de medições Fn por meio da utilização de correlações estatísticas (tipicamente o método do quadrático minimo) aplicado às medições experimentais em bruto. Um exemplo de implementação é descrito de forma pormenorizada em seguida.

Inicialmente, a variação é obtida para a quantidade medida e ajustada de fluorescência como uma função do número de ciclos PCR que foram aplicados, como se mostra, por exemplo na figura 6A. Esta figura mostra a curva de amplificação para uma amostra de interesse contendo ácidos nucleicos, neste caso um fragmento de ADN com uma quantidade inicial de 100.000 de cópias, marcado com o intercalador SYBGREEN durante a reacção PCR que é realizada no aparelho I-Cycler IQ® do fornecedor BI-RAD®.

No exemplo descrito, subentende-se que a reacção de amplificação é uma reacção PCR em tempo real. A medição 24 experimental representa quantidades de fluorescência emitida. A fluorescência do ciclo n depois do ajustamento do ruido de fundo, como anteriormente descrito, é Fn escrito em seguida. A fluorescência teórica inicial antes do primeiro ciclo é escrita F0. A eficácia do PCR no ciclo n é escrito En. 0 número total de ciclos executados durante a reacção PCR é escrito N.

Por hipótese, a fluorescência medida em cada ciclo n do ciclo de reacção PCR é definido por:

FnU « F^l + EJ for all η € {o, 1,2,...,N-l} (1) com 0^ En^ 1. A eficácia da reacção em cada ciclo n é calculada da seguinte forma: E - i « IsaL - i for all n e ÍO,l,2,...,N-l} (2) " Nn Fn

Deve-se ter em atenção que a equação (1) é assumida como sendo verdadeira para n= 0. No entanto, por definição, a fluorescência inicial F0 é desconhecida. Por conseguinte, não é possível calcular a eficácia no primeiro ciclo E0 directamente para a fórmula (2). A figura 6B mostra a eficácia da reacção PCR por aproximação à fórmula (2) e com base na variação ajustada em fluorescência da figura 6A como uma função do número do ciclo n. 25 São preferidas as seguintes hipóteses: a eficácia da reacção é relativamente constante durante os ciclos iniciais e após a realização de um certo número de ciclos, a eficácia da reacção diminui. A figura 6B confirma a segunda hipótese uma vez que pode-se verificar que a eficácia diminui a partir do ciclo n=17. No entanto, as eficácias medições em ciclos 1 a 16 são muito ruidosas, o que torna dificil verificar a primeira hipótese graficamente.

No entanto, será preferível assumir que a variação na eficácia obedece a um modelo do tipo incluindo: • um primeiro estádio que é constante entre o primeiro ciclo PCR e o ciclo (Ceep’1) a preceder o ciclo de transição escrito CEep e um segundo estádio em que decresce para ciclos com números maiores ou iguais ao ciclo (Ceep-1) · 0 ciclo (Ceep-1) representa assim o último ciclo (que pode ser uma fracção) para o qual a eficácia continua a ser constante.

Propõe-se assim modelar a eficácia da reacção da seguinte forma: ÍE0 for 0 < n < (CEEP -1) |( 1 + Eo)esP(_P(r'~cM»+1» _ I for (CEEP-1) < η £ (N-l) (3) 26 em que E0 e β são parâmetros reais que são estimados utilizando a curva de amplificação da figura 6A ou utilizando a curva de eficácia da figura 6B de uma forma descrita em seguida.

Numa variante, pode ser preferida outra selecção, p.ex. dos modelos F1 a F3 indicados em seguida, particularmente conforme o tipo de ácido nucleico que se pretende quantificar.

Fl:

En = exp (-β (n-CEEp+l) ) -1 F2:

En = exp(-p (n-CEEP+l)e)-1 F3:

En = <x - exp (-μ (n-CnEP+l)a) -1

De preferência, vários conjuntos de parâmetros são estimados na etapa c) para vários ciclos de transição candidatos CEEP e o ciclo candidato mínimo é seleccionado, para o que os parâmetros associados maximizam as correlações estatísticas que podem ser postas em prática na etapa c) , para cada ciclo de transição CEep·

Tal como anteriormente mencionado, a expressão (1) pode também ser escrita da seguinte forma: n-1

(4) 27

Assim, ao introduzir a expressão (3) para a eficácia na fórmula (4), é obtido um novo modelo com quatro parâmetros (F0, E0, β, CEep) para a fluorescência emitida ajustada Fn:

F0( 1 + E0)n for 1 < n £ CEEP (5) c | l-e»p |-p (n-C^ep))

F0( 1 + E0) exp,|Jhl for CEEP < η < N 0 tamanho inicial No da população de interesse, a eficácia E0 da reacção de n=0, o parâmetro β e o ciclo de transição Ceep são avaliados repetidamente por vários valores de ciclo na vizinhança da região de transição CHO, de forma a encontrar uma correlação estatística máxima que é atingida durante um valor de ciclo mínimo que é igual ao ciclo de transição CEep-

Nesta segunda implementação prefere-se modelar as variações nas quantidades medições e ajustada de fluorescência como uma função do número de ciclos com base nos modelos ou variação da eficácia e subsequentemente executar as correlações directamente nas quantidades medições e ajustadas de fluorescência.

Deve-se ter em atenção que ao ajustar a fluorescência emitida medida tendo em conta o ruído de fundo é também feito um ajuste artificial na fluorescência inicial Fo. Assim, ao estimar os parâmetros do modelo de eficácia com base nas medições da eficácia que são deduzidas a partir de medições de fluorescência ajustadas constitui uma fonte adicional de erro e poderá ser preferível proceder em dois estádios conforme se passa a descrever em seguida para a terceira implementação. 28

Mesmo assim, a segunda implementação, tal como é descrita, é mais simples e adapta-se bem a quantificação por PCR utilizando medições de fluorescência. É baseada nas medições reais da fluorescência F'n que corresponde às medições de fluorescência ajustadas para desvio no ruído de fundo, em conjunto com a compensação á nas medições mencionadas. Assim que o ruído de fundo é subtraído temos uma relação do seguinte tipo: 28 F' n + ε em que ε é uma quantidade que pode ou não depender do número de ciclo n. É preferivelmente seleccionado para ser constante.

Nestas circunstâncias, a eficácia medida e "ajustada", também escrita E'n no ciclo n é definida por: E’ - 1 = Fn4l-+ -£ - 1 for all n e {l, 2,...,N-l}· (7) P*n + ε 1 1 0 modelo da relação (5) anterior torna-se assim:

F^I + e;)" for 1 < n < CEEP (8) c | l-exp l-p 1 n-Cm))

Fód + Eo)” e*p,p'hl f°r CEEP ^ η < N

Nessas circunstâncias, os valores de eficácia E'n são, experimentalmente, aproximados das medições, no sentido de fixar um limiar de eficácia minimamente aceitável durante a fase de eficácia decrescente. Desta forma, é determinado um 29 ciclo limiar, para além do qual não são usadas, para os objectivos deste modelo, as medições de fluorescência ajustadas (pontos NEG na Figura 4B) . Tipicamente. 0 ciclo limite corresponde ao primeiro ciclo no estádio de eficácia decrescente, ou seja quando a eficácia desce abaixo do limiar de eficácia minimamente aceitável (por exemplo, Ο,ΙΕο) .

De uma forma mais generalizada, o valor do limiar de eficácia reside, preferencialmente, entre 0 e 0,5, e a reacção em cadeia da polimerase que apresente um valor de eficácia abaixo desse limiar é, potencialmente, influenciada por fenómenos de inibição não controlados.

No exemplo que se apresenta na Figura 7, o valor limiar em termos de eficácia foi fixado em 0,02 (ou seja 2% do valor de E0) . O ciclo limite Cs correspondia ao ciclo n=36. A Figura 7 mostra as medições ajustadas de fluorescência emitida. É possivel observar que existe uma correlação aceitável com o modelo (linha continua) para aquelas medições experimentais (marcadas com "o") até ao ciclo n=36. A Figura 8 apresenta, igualmente, uma boa correlação com as medições experimentais para eficácia preditiva, tal como foi obtido na Figura 7 com recurso ao modelo baseado na fluorescência medida e ajustada.

Os principais estádios desta implementação podem ser resumidos como a seguir se apresenta; com referência para a Figura 9.

Num estádio inicial 70, os valores medidos para quantidades de fluorescência foram obtidos e ajustados relativamente ao 30 ruído de fundo como uma função do número de ciclo n, tal como mostra a Figura 6A.

No estádio 71, é calculada uma aproximação à eficácia da reacção no ciclo n, com recurso à fórmula acima (2) para cada um dos ciclos n = 1, 2, ..., (N-l) .

No estádio 72, é determinado o ciclo mínimo Cs, sendo atingidas duas condições: o ciclo Cs encontra-se no estádio de eficácia decrescente; e a eficácia do ciclo limite é inferior ao valor de eficácia limite Es (por exemplo, Es= 0.1 E0) :

Ecs ^ Es É, já, possível eliminar os pontos NEG para os quais a eficácia é inferior a Es.

No estádio 73, é formado um modelo para a curva de fluorescência emitida ajustada, estando a eficácia a decrescer durante o ciclo CEEP = (Cs - 5) para Cs, e utilizando a expressão (8) , na qual se assume que a compensação ε é bys= F'0: „ l-exp<-fMn-Ctt?í)

Fn = F0(l + E'0) exp,l>H - F'0

Posteriormente, o teste 74 no valor Ê'0 estimado para o valor E'o e a decrementação no estádio 75 do valor pois o ciclo de mudança CEep procura encontrar o valor procurado de 31

Ceep, utilizando um tempo de operação P (que pode ser igual a 1), e no estádio de repetição 73, desde que o valor de Ê'0 seja inferior a 1.

Depois, quando o valor de eficácia estimado excede o valor 1 (seta n à saida do teste 74), o valor do índice CEEP é incrementado por um tempo de operação h (que pode ser uma fracção mais pequena que a unidade); nas estádios 76 e 77, a fluorescência Fn é modelada da mesma forma que no estádio 73. Desde que a eficácia estimada Ê'o seja superior ou igual a 1 no estádio 78; os estádios 76 a 78 são repetidos. Quando a eficácia estimada atingir um valor inferior a 1, AJ , Λ Λ os parâmetros estimados (f’o:£’d.!%ceep} sg0 conservados no estádio final 79.

A

Neste estádio, foi, finalmente, obtido um valor Fo que, só por si, é representativo da dimensão da população inicial No numa amostra de interesse. É, então, possível, utilizar, pelo menos, uma amostra padrão com uma conhecida dimensão da população Nost, no sentido de determinar na etapa 80 a dimensão da população inicial No na amostra de interesse.

Para este objectivo, é obtido um valor medido de dimensão da população inicial Fost numa amostra padrão da conhecida população inicial Nost- Posteriormente, o valor da dimensão da população inicial N0 na amostra de interesse é obtido derivando uma relação de proporcionalidade entre a medida para a amostra padrão e a sua conhecida dimensão da população inicial e aplicando essa relação para a medida F'o, com vista a obter a real dimensão da população inicial N0. 32

Por outras palavras, no estádio 80 da Figura 9, é possível determinar o valor N0 da dimensão da população inicial na amostra de interesse, aplicando uma simples relação de proporcionalidade do tipo: sugerindo que a dimensão da população inicial no padrão N0st e a Razão de fluorescências correctas são compensadas e estimadas pelo ajuste do modelo de fluorescência tanto à amostra de interesse como à amostra padrão.

Pode compreender-se, assim, que um simples padrão deva ser suficiente para determinar a dimensão inicial da população de interesse na amostra de interesse; uma vantagem proporcionada pela invenção.

Contudo, numa variante, e onde seja necessário, pode ser feita uma provisão no sentido de obter os respectivos A. valores medidos para as dimensões da população inicial F*ost numa pluralidade de amostras padronizadas que apresentam conhecidas dimensões da população inicial N0st. Depois, é estabelecida uma relação de dependência entre as dimensões da população inicial NOst das amostras padronizadas e os respectivos valores medidos para as suas dimensões da Λ população inicial Posteriormente, e após encontrar o valor medido para a dimensão da população inicial da Λ amostra de interesse ^o, a real dimensão da população inicial Nost de interesse é determinada pela interpolação que recorre à relação de dependência. Percebe-se que esta relação de dependência pode, igualmente, e de forma típica, 33 ser uma regressão do tipo apresentado na Figura 5, mas tendo os valores de fluorescência iniciais P.0at e P;0 dos padrões e da amostra de interesse traçado a ordenada (ou os valores dos seus respectivos logaritmos) em vez de traçar os valores para o indice de mudança CEep-

Uma vez utilizado um ou mais padrões, pode ser feita uma provisão para um ou mais amostras padronizadas com as respectivas conhecidas dimensões da população inicial NOst para as quais é aplicada a sucessão de reacções de amplificação, substancialmente nas mesmas condições que para a amostra de interesse. Depois, os valores medidos A, F^gt para as suas dimensões da população inicial são determinados por meio de comparações das variações parametrizadas com as medições experimentais, como para a amostra de interesse.

Por outras palavras, são aplicados os mesmos cálculos referentes às quantidades medições e ajustadas de fluorescência tanto no(s) padrão(ões) como na amostra de interesse. É estimada, para o(s) padrão(ões), a quantidade Λ de fluorescência Fost antes do primeiro ciclo, com o recurso ao mesmo método que o utilizado para determinar o Λ F’0 para a amostra de interesse, tal como descrito acima.

Uma terceira implementação, correspondendo a uma variante da segunda implementação acima descrita, consiste, no geral, em ajustar o modelo para a eficácia En relativamente às medições experimentais, e em, subsequentemente, injectar o tal modelo de eficácia ajustada no modelo para a actual dimensão da população Nn, ou no modelo para a medida Fn. 34

Esta terceira implementação pode ser resumida conforme se segue. A variação parametrizada construída no passo b) é representativa da produção, e no passo c), é determinada a variação da produção com base nas medições experimentais no sentido de comparar as variações parametrizadas com a variação experimental. Depois, com vista a obter um parâmetro representativo da dimensão da população inicial No, são seguidos os seguintes passos no passo d): dl) determinar uma segunda variação parametrizada representativa da dimensão da população actual Nn na amostra de interesse, utilizando, pelo menos, o parâmetro representativo do índice de mudança CEep^ e um parâmetro representativo da dimensão da população inicial N0; d2) aplicar, à dita segunda variação, um valor parametrizado para o índice de mudança Ceep como determinado no passo c); e d3) ajustando, pelo menos, o parâmetro representativo da dimensão da população inicial No por meio de comparação directa da segunda variação com as medições experimentais.

De forma vantajosa, é levado a cabo o seguinte: no passo d2), aplicando um valor grosseiro para o índice de mudança CEep da mesma forma que a descrita para detectá-lo com referência para a Figura 4B; e 35 no passo d3), refinando, consequentemente, o valor do índice, e ajustando o parâmetro representativo da dimensão da população inicial N0.

Finalmente, deverá perceber-se que a segunda implementação, agora preferida, das Figuras 7 e 8 difere desta terceira implementação devido ao facto de não ser feita nenhuma tentativa para realizar correlações de eficácia, mas usando, meramente, o modelo matemático para variação de eficácia no sentido de modelar e refinar a estimativa de fluorescência correcta e compensada.

Naturalmente, a presente invenção não se encontra limitada ao que foi acima descrito a título exemplificativo, estende-se, sim, a outras variantes.

Como tal, perceber-se-á que a presente invenção pode, igualmente, aplicar-se a uma quantificação relativa, em particular, à reacção em cadeia da polimerase. Nesta aplicação, tal como amplificar a população de interesse, é, igualmente, amplificada uma população de referência, tanto de forma simultânea e no mesmo meio, ou em separado. As medições são tiradas da seguinte forma: medições experimentais representativas da dimensão da população de interesse; e medições experimentais representativas da dimensão da população de referência. 0 método pode, depois, continuar com os passos a), b) e c) aplicados à população de referência, enquanto o passo d) consiste, meramente, em determinar uma Razão entre as 36 respectivas dimensões da população inicial de interesse e da população de referência. A quantificação relativa pode ser utilizada por meio da análise da expressão de um gene de interesse durante o desenvolvimento de um organismo. No sentido de corrigir, especificamente, variações de quantidade e qualidade entre as amostras tiradas do organismo em diferentes alturas, e analisar o gene alvo de interesse, é, igualmente, analisado um gene de referência conhecido por apresentar um nivel de expressão que se mantém estável durante o desenvolvimento. Um último estádio consiste em comparar Razões

Nptarget

Npref entre as várias amostras que foram tiradas.

No sentido de atingir os resultados desejados, são possíveis duas estratégias. A estratégia da técnica anterior baseia-se em detectar o ciclo limite Ct e isso, normalmente, acontece da seguinte forma. Para cada amostra tirada em diferentes instantes to, ti, t2, ..., tn, a Razão

N

Otarget N,

OceC é determinada, usando, pelo menos, um padrão (ou seja, um padrão para o qual são conhecidos N0alvo e N0ref) , as 37 quantidades para realizar duas quantidades sucessivas absolutas seguidas de um cálculo da Razão. Uma outra estratégia, particularmente, vantajosa no contexto da invenção consiste em determinar para cada amostra tirada em diferentes instantes t0, ti, t2, tn, a Razão:

N

Otarget N V Oief /sample

N

Otarget N,

\ Orei / sample tO utilizando, directamente, a seguinte fórmula:

í N ^ Otarget N \ Oref /saraple _ N ÍFt

Otarget

N

Oref XsampletO

Otarget 'sample (F ) 1 Otarget'aarapletO í F ) » Orei 'sample (F ) ' Oref'sample_tO

Nesta segunda implementação, que, no final, usa o parâmetro

Fo, em combinação com a técnica da invenção, não é necessária nenhuma amostra padrão; algo, particularmente, vantajoso. A referência é, agora, feita à Figura 10 que mostra uma instalação para implementar o método da invenção. Consiste num suporte SUPP, neste caso com uma cavidade que contém uma amostra de interesse ECH e uma cavidade com uma amostra padrão referenciada St, por exemplo. O suporte SUPP encontra-se incluido numa caixa ENC, por exemplo equipada com um meio quente (não é mostrado) para aplicar uma reacção em cadeia da polimerase ao padrão e à amostra de interesse. 38

No exemplo descrito, é feita, preferencialmente, uma provisão para tirar medições das quantidades de fluorescência emitidas em cada ciclo, tanto pelo padrão St como pela amostra de interesse ECH. Para este fim, é inserido nas cavidades um reagente seleccionado e as amostras são iluminadas com uma lâmpada (por exemplo, uma lâmpada de halogéneo-tungsténio), no sentido de medir as respectivas quantidades que saem da amostra de interesse e da amostra padrão em cada ciclo da reacção em cadeia da polimerase que é aplicado. Para além disso, um aparelho para detectar a fluorescência compreende, por exemplo, uma lente objectiva 11 para recolher a luz que sai da fluorescência, e um meio de contar fotões 10, por exemplo uma câmara acoplada a um carregador, no sentido de medir a fluorescência emitida em cada ciclo da reacção em cadeia da polimerase a partir da amostra de interesse e do padrão. Sendo assim, a fluorescência emitida por cada cavidade é, de forma vantajosa, focada pela lente 11 e é, preferencialmente, detectada por uma câmara 10 ligada a um cartão 21, por exemplo do tipo PCMCIA, numa unidade central 20 de um computador. O computador é, depois, conectado ao meio de medição acima descrito 10 para receber os sinais que dai advêm e que são representativos das quantidades medições da fluorescência detectada em cada ciclo da PCR, e para processar estes sinais no sentido de determinar uma dimensão da população inicial de interesse antes do primeiro ciclo, implementando o método da invenção.

Tipicamente, a unidade de processamento compreende o seguinte: um cartão 21 ligado a um meio de medição 10; 39 • memória 25 (por exemplo, uma memória do tipo RAM) para armazenagem temporária e processamento dos sinais acima mencionados; memória permanente 24 para armazenar o produto do programa informático no contexto da invenção e para armazenar os dados que foram processados e se encontram disponíveis para serem utilizados, por exemplo num diagnóstico subsequente; • onde seja apropriado, um leitor 22 como um CD-ROM, por exemplo, que possa, inicialmente, fazer correr o produto do programa informático; opcionalmente, uma interface de comunicação 26 para comunicar com um ponto local ou remoto (conexão 28) , por exemplo para transmitir ou processar dados no sentido de permitir um diagnóstico referente a um paciente remoto; uma interface gráfica 27, conectado, de forma típica, a um ecrã 30; e um processador 23 para gerir as interacções entre os vários itens de equipamento. O computador pode, igualmente, conter outros itens como um teclado 41 e/ou um rato 42 ligados à unidade central 20.

Contudo, deverá perceber-se que no contexto da invenção a instalação compreende, no geral: um suporte de amostra SUPP, pelo menos para a amostra de interesse; um primeiro aparelho ENC para aplicar a dita sucessão de reacções de amplificação, pelo menos, à população de interesse na amostra de interesse; 40 um segundo aparelho 10 para tirar medições representativas da corrente dimensão da população de interesse; e um computador 20 adequado para receber sinais de medições do segundo aparelho e para implementação deste método da invenção.

Com este objectivo, pode ser utilizado um produto do programa informático para controlar o computador. O programa pode ser armazenado numa memória da unidade de processamento 20 ou numa memória removível (CD-ROM, etc.) e adequado para cooperar com o leitor da unidade de processamento. O programa informático no contexto da invenção contém, assim, instruções para implementar todas as estádios do método da invenção. Por exemplo, o algoritmo do programa pode ser representado por um fluxograma equivalente ao diagrama da Figura 9.

Lisboa, 20 de Setembro de 2007

Claims (22)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método implementado por meios informáticos para a quantificação , de modo absoluto e/ou relativo, de uma população inicial de ácidos nucleicos numa amostra de interesse submetida a uma sucessão de aplicações de uma reacção de amplificação de população, durante a qual se tomam como representativas medições experimentais de uma dimensão normal da população de pelo menos uma amostra de interesse, em que o método compreende os seguintes passos: a) proporcionar um modelo do rendimento da reacção de amplificação como função da sucessão de amplificações, em que o referido modelo compreende: uma fase substancialmente constante para a primeira porção das aplicações da reacção de amplificação; e uma fase não constante para a segunda porção das aplicações da reacção de amplificação; em que a primeira e a segunda porções são unidas por uma região de transição na qual o rendimento é comutado entre as fases constante e não constante, tendo a referida região um índice de amplificação que corresponde substancialmente à mudança de sistema; b) utilizar o modelo de rendimento para expressar uma relação que envolva pelo menos o índice de transição e um parâmetro representativo da dimensão da população inicial na amostra de interesse; c) determinar pelo menos o índice de transição por comparação com as medições experimentais; e, num passo 2 subsequente ou imediatamente seguinte d) deduzir desta determinação a dimensão da população inicial numa amostra de interesse.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, que inclui: no passo b), utilizar o modelo de rendimento para expressar uma variação que é tomada como parâmetro como função da referida sucessão de amplificações, envolvendo pelo menos um parâmetro que representa o indice de transição; e • o passo c) , determinar pelo menos o referido parâmetro que representa o índice de transição por comparação com as referidas medições experimentais.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a referida variação tomada como parâmetro é representativa da dimensão corrente da população na amostra de interesse, em que a referida variação envolve adicionalmente um parâmetro representativo da dimensão inicial da população na amostra de interesse; e em que nos passos c) e d), os parâmetros representativos do referido índice de amplificação e a dimensão inicial da população na amostra de interesse são determinados substancialmente em conjunto.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a referida variação tomada como parâmetro é representativa do rendimento e em que no passo c), se determina uma variação experimental do rendimento a partir das referidas medições experimentais, a fim de comparar a variação tomada como parâmetro com a variação experimental. 3

5. Método de acordo com a reivindicação 4, que inclui, no passo d): dl) determinar uma segunda variação tomada como parâmetro que é representativa da dimensão corrente da população na amostra de interesse e que envolve pelo menos o parâmetro que representa o referido índice de amplificação, e um parâmetro representativo da dimensão inicial da população na amostra de interesse; d2) aplicar um valor tomado como parâmetro para o índice determinado no passo c) para a segunda variação; e d3) ajustar pelo menos o parâmetro representativo da dimensão inicial da população por comparação directa da segunda variação com as medições experimentais.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, que inclui: • no passo d2) , aplicar um valor aproximado para o índice, enquanto • no passo d3), se refina o valor do índice ajustando também ao mesmo tempo o parâmetro representativo da dimensão inicial da população.

7. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 6, em que a referida variação tomada como parâmetro ou a referida segunda variação tomada como parâmetro, conforme o caso: • é representativa das referidas medições experimentais; e • inclui um parâmetro que corresponde a um valor medido representativo da dimensão inicial da população, e em que o valor da medição da dimensão inicial da população é determinado por comparação das referidas 4 variações tomadas como parâmetro com as medições experimentais.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, que inclui a aplicação de um passo anterior de processamento das medições experimentais, em que este passo compreende a subtracção de um ruído de fundo das medições e a introdução de uma compensação para tomar em conta uma medição não nula representativa da dimensão inicial da população.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, que inclui a obtenção de um valor de medição para uma dimensão inicial da população numa amostra padrão que tem uma dimensão inicial de população conhecida e a derivação de uma relação de proporcionalidade entre estes; e a determinação do valor da dimensão inicial da população na amostra de interesse por aplicação da mesma relação de proporcionalidade entre a dimensão inicial da população e a respectiva medição na amostra de interesse.

10. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, que inclui a obtenção dos respectivos valores de medição para as dimensões iniciais das populações nas amostras padrão que têm dimensões iniciais de população conhecidos e por: • estabelecer uma relação de dependência entre as dimensões iniciais da população das amostras padrão e os valores de medição correspondentes para as suas respectivas dimensões iniciais de população; e • após determinação do valor da medição para a dimensão inicial da população da amostra de interesse, determinar a 5 dimensão inicial da população de interesse por interpolação na referida relação de dependência.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, que inclui proporcionar uma ou várias amostras padrão que têm dimensões iniciais de população respectivas conhecidas, aplicar a referida sucessão de amplificações às referidas amostras padrão sob substancialmente as mesmas condições como para a amostra de interesse, e determinar os seus valores de medições iniciais efectivos por comparação das variações tomadas como parâmetro com os valores experimentais.

12. Método de acordo com a reivindicação 3, que inclui proporcionar uma pluralidade de amostras padrão que têm dimensões iniciais respectivas conhecidas, aplicar a estas a referida sucessão de amplificações sob substancialmente as mesmas condições como para a amostra de interesse e determinar os respectivos índices na aplicação dos passos a), b) e c) e por, no passo d): • estabelecer uma relação de dependência entre as dimensões iniciais de população das amostras padrão e os seus índices; e • após determinação do índice para a dimensão inicial da população da amostra de interesse, determinar a dimensão inicial da população de interesse por interpolação na referida relação de dependência.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que, para uma quantificação relativa, proporcionar não apenas a população de interesse, mas também uma população de referência que é submetida a uma sucessão de 6 aplicações da reacção de amplificação, em que o método consiste em tomar, respectivamente: • medições experimentais representativas da dimensão da população de interesse; e • medições experimentais representativas da dimensão da população de referência; continuando o método por aplicação dos passos a) , b) e c) à população de referência, em que o passo d) consiste em determinar uma relação entre as respectivas dimensões iniciais da população de interesse e da população de referência.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, que inclui: • expressar as medições experimentais sob a forma de uma variação experimental do rendimento como uma função da referida sucessão de amplificações; e • obter uma variação experimental de rendimento como função da referida sucessão de amplificações que compreende: • uma primeira região que é substancialmente submetida a ruido para números de indice de amplificação baixos; e • seguida por uma segunda região com menos ruido para números de indice de amplificação mais elevados.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, no qual a referida fase não constante do rendimento é uma fase de rendimento decrescente, em que o método inclui: • estimar um valor aproximado para a fase constante de rendimento; e 7 • pelo menos quando se pretende o índice na referida região de transição, ignorar pelo menos algumas das medições na referida segunda região com menos ruído, para a qual o rendimento estimado é inferior a um valor limiar, de preferência inferior a uma fracção da fase constante.

16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, em que a referida fase não constante do rendimento é uma fase de rendimento decrescente, em que o método inclui a identificação da referida região de transição trabalhando na direcção de número de índice de amplificação decrescente começando a partir da referida segunda região com menos ruído e detectando um índice de amplificação aproximado no qual o rendimento excede de modo perceptível um valor pré--determinado.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o valor estimado do referido índice de amplificação na região de transição é refinado, possivelmente para obter um valor fraccional, trabalhando na direcção de números de índice de amplificação crescentes começando a partir do índice aproximado, por detecção de um índice de amplificação para o qual o rendimento é aproximadamente igual ao referido valor pré-determinado.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, que inclui a modelação da referida fase não constante do rendimento por um exponencial decrescente que inclui um parâmetro de redução e determinar o referido parâmetro de redução no passo c) com o índice na região de transição por comparação com as medições experimentais.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, no qual a reacção de amplificação é uma reacção de cadeia de polimerase realizada em tempo real.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, no qual as referidas medições são quantidades medições de fluorescência emitida.

21. Instalação para a implementação do método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, que compreende: um suporte de amostra para suportar pelo menos uma amostra de interesse; um primeiro aparelho para aplicação da referida sucessão de reacções de amplificação, pelo menos à população de interesse na amostra de interesse; • um segundo aparelho para fazer medições representativas da dimensão corrente da população de interesse; e • meios informáticos adequados para a recepção dos sinais das medições do segundo aparelho e implementação do método de acordo com a reivindicação 1.

22. Um produto de um programa informático para guardar numa memória de uma unidade de processamento ou num meio de memória removível adequado para a cooperação com um leitor da referida unidade de processamento, em que o produto de programa compreende instruções para implementar o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20. Lisboa, 20 de Setembro de 2007.