JP5611835B2 - 関連アプリケーションに相互参照する有効関連値を使用する対立遺伝子識別解析 - Google Patents

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Description

本願は、2008年6月11日に提出のUSSN 61/060,742および2007年12月28日提出のUSSN 61/017,531の優先権および便益をを主張するものであり、この両方が、全ての目的のために全体として参照して本明細書に取り込まれる。
37 C.F.R. 1.71(e)を請求するために、出願人は、本開示が、司法権のいずれかにおいて著作権保護が利用可能な、または利用可能であるかもしれない対象となる、本出願における、ソースコード表(source code listing)、スクリーンショット、ユーザーインターフェース、ユーザー説明書およびいずれかの他の態様のような、しかしそれに制限されない、著作権保護の対象となる、および請求される物品を含むことを喚起する。特許商標庁(Patent and Trademark Office)の記録に現れるため、著作権保有者は、誰かによる特許書類または特許開示のファクシミリによる再生産に意義をはさむものではない。全ての他の権利は保存されており、本願の内容、公的開示、および公的実行、あるいはそれらのいずれかの一部に基づく派生的な生産物の他の再生産、配布、生成は、適用可能な著作権法により禁止されている。
本発明は、核酸増幅反応のデータ解析に関する。より詳細には、ある実施態様において本発明は、PCR解析を含むがそれに限定されない、リアルタイム核酸増幅を使用した、対立遺伝子識別(allelic discrimination)、および/または他の核酸の検出/識別を実行するための情報システムおよび方法に関する。
核酸配列解析は、多くの調査、医学、および産業分野においてより重要となってきている（Caskey (1987) Science 236: 1223-1228; Landegren et al. (1988) Science, 242: 229-237; Arnheim et al. (1992) Ann. Rev. Biochem., 61: 131-156などを参照）。特に、影響のある結果をもたらすリスクのある単一遺伝子欠損を、数学的に予測することができるように、2000より多くの条件が同定されている。ヒトにおけるこれらの条件には、ハンチントン舞踏病、嚢胞性線維症、OC1抗トリプシン欠乏症、筋ジストロフィー、ハンター症候群(Hunter's syndrome)、レッシュ-ナイハン症候群(Lesch-Nyhan syndrome)、ダウン症候群(Down's syndrome)、テイ・サックス病、血友病、フェニルケトン尿症、サラセミア(thalasemia)、および鎌状赤血球貧血が含まれる。核酸配列解析を利用することにより種々の遺伝的疾患を診断することができるのに加えて、原因となる微生物に特異的なDNA配列特性の化学的サンプルにおける存在により、種々の感染性疾患を診断することができる。これらは、バクテリア、ウイルスおよび寄生虫を含むがそれに限定されない。さらに、特定の病原体菌株（例えば、薬剤耐性病原菌）を、核酸解析により同定することができる。種々の核酸多型(polymorphism)を同定することにより、基礎研究、遺伝子タイピング(genotyping)、および科学捜査にも利用することができる。
既知のヌクレオチドの相違を検出するための現在の診断技術は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(allele-specific oligonucleotides (ASO))とのハイブリダイゼーション(Ikuta, et al., Nucleic Acids Research 15: 797-811 (1987); Nickerson, et al., PNAS (USA) 87: 8923-8927 (1990); Saiki, et al., PNAS (USA) 86: 6230-6234 (1989); Verlaan-de Vries, et al., Gene 50: 313-320 (1980); Wallace, et al., Nucleic Acids Research 9:879-894 (1981); Zhang, Nucleic Acids Research 19: 3929-3933 (1991)); 対立遺伝子特異的PCR (allele- specific PCR)(Gibbs, et al., Nucleic Acids Research 17: 2437-2448 (1989); Newton, et al., Nucleic Acids Research 17: 2503-2516 (1989)); 固相ミニ配列解析(solid-phase minisequencing) (Syvanen, et al., American Journal of Human Genetics 1993; 52: 46-59 (1993)); オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(oligonucleotide ligation assay (OLA)) (Grossman, et al., Nucleic Acids Research 22: 4527-4534 (1994); Landegren, et al., Science 241: 1077-1080 (1988)); ならびに、対立遺伝子特異的リガーゼ鎖反応(allele- specific ligase chain reaction (LCR)) (Abravaya, et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 675-682; Barany, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 88: 189-193; Wu, et al., (1989) Genomics 4: 560-569)
を含む。特異的DNAセグメントを増幅し、その後検出解析してどの対立遺伝子が存在するのかを決定することによるこれらの方法によって、ゲノムDNAを解析する。
USSN 61/060,742 USSN 61/017,531
Ikuta, et al., Nucleic Acids Research 15: 797-811 (1987) Nickerson, et al., PNAS (USA) 87: 8923-8927 (1990) Saiki, et al., PNAS (USA) 86: 6230-6234 (1989) Verlaan-de Vries, et al., Gene 50: 313-320 (1980) Wallace, et al., Nucleic Acids Research 9:879-894 (1981) Zhang, Nucleic Acids Research 19: 3929-3933 (1991) Gibbs, et al., Nucleic Acids Research 17: 2437-2448 (1989) Newton, et al., Nucleic Acids Research 17: 2503-2516 (1989) Syvanen, et al., American Journal of Human Genetics 1993; 52: 46-59 (1993) Grossman, et al., Nucleic Acids Research 22: 4527-4534 (1994) Landegren, et al., Science 241: 1077-1080 (1988) Abravaya, et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 675-682 Barany, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 88: 189-193 Wu, et al., (1989) Genomics 4: 560-569
核酸の定量がより困難となるため、あるいは増幅反応の間採取されるデータが、表適格酸に反応して生成されていないシグナル（すなわち、ノイズ）によってしばしば顕著にあいまいになっているために、対立遺伝子検出/識別に対する、特に臨床上検出/識別に対する核酸増幅反応の慣用的な使用は妨げられてきた。さらに、多くの観測方法により採取されるデータは、多用であり、反応の間に変化しうる、または反応の異なる事例の間に変化しうる条件による再現性の不足にさらされる可能性がある。
ある態様において本発明は、増幅データの効率関連変換の最大値を使用することにより、そのような増幅において異なる核酸標的を区別するための有効な解析ツールが提供されるという発見に関する。
従って、ある態様において、2つ以上の異なる標的核酸を識別する方法が提供される。典型的には、これらの方法は、
単一のサンプルから2つ以上の異なる標的核酸を増幅する試薬を含む、1つ以上の増幅反応からのデータを提供する工程であって、前記データが、増幅反応における各標的核酸の増幅度を示す振幅測定を含むシグナル、ならびに振幅が測定される増幅反応中の時間点を含み、前記シグナルは、増幅反応における時間点の多重度に対するデータを提供する、工程；
反応における増幅効率に関連する振幅決定を、効率関連変換(efficiency related transform)が提供する、データの効率関連変換を決定する工程；
標的核酸に対して決定された効率関連変換の最大強度である、各標的核酸に対する効率関連値(efficiency related value)を決定する工程；ならびに
各標的核酸に対する効率関連値を、ディスプレー、プリンター、または記憶媒体に出力する工程であって、各標的核酸に対する効率関連値の関連振幅が、サンプル中の核酸それぞれの存在の指標である、工程
を含む。ある実施態様において、2つ以上の標的核酸を増幅する試薬は、単一の増幅反応中に存在する。ある実施態様において、各増幅反応が異なる標的核酸を増幅する試薬を含むように、2つ以上の標的核酸を増幅する試薬が分配/別離されている。ある実施態様において、反応は、一つの組み合わせた反応混合物中で進行し、他の分離した反応混合物中で進行する。ある態様において、前記「提供」は、PCR反応、またはPCR反応のリアルタイム観測からのデータファイルを読み込むこと、あるいはネットワーク結合を介してそのような値を受信することを含む。種々の実施態様において、増幅反応における時間点を、サイクル数または反応時間において測定する。ある実施態様において、前記方法は、少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個の異なる標的核酸を識別することを含む。ある実施態様において、前記標的核酸は、遺伝子の第一の対立遺伝子に由来する第一の核酸、および遺伝子の第二の対立遺伝子に由来する第二の核酸を含む。ある実施態様において、前記出力は、サンプルが第一の対立遺伝子のホモ接合型(homozygous)であるか、第二の対立遺伝子のホモ接合型であるか、または両方の対立遺伝子のヘテロ接合型(heterozygous)であるかを示す情報を出力することを含む。種々の実施態様において、前記効率関連変換は、シグナルの比率変換、シグナルのシフト比率変換、シグナルの一次導関数(first derivative of the signals)、連続したシグナル間の差異、およびシグナルの対数の傾きまたは勾配からなる群より選択される。ある実施態様において、前記効率関連変換(ERT)は、
(a) ERT = (Signaln+1/Signaln) -1、または
(b) ERT = (Signaln/Signaln-1) -1
と算出され、
前記式中、Signalnはサイクル番号nにおいて生成されるシグナルであり、Signaln+1はそれに続くサイクル番号において生成されるシグナルであり、Signaln- 1はその直前のサイクル番号において生成されるシグナルであり、かつ、式(a)に対してnは1から反応において解析される増幅サイクルの数までの範囲にあり、かつ式(b)に対してnは2から反応において解析される増幅サイクルの数-1までの範囲にある。ある実施態様において、前記効率関連値は、効率関連変換の最大値、または増幅反応の対数の最大勾配、または増幅反応の最大比、または増幅反応の一次導関数の最大値である。ある実施態様において、測定したシグナル値の間の点を（例えば三次スプライン(cubic spline)を使用して）補間することにより、付加的なシグナル値を生成する。ある実施態様において、効率関連変換はさらに、増幅反応における時間またはサイクル数の測定を提供する。ある実施態様において、前記方法は、効率関連変換の最大強度が生じる部分サイクル数(fractional cycle number)または時間である反応点を算出する工程をさらに含む。ある実施態様において、前記方法は、調節反応点(adjusted reaction point)（例えば、反応点から効率関連値の底が2の対数を引いたものに等しい調節反応点）を算出する工程をさらに含む。ある実施態様において、前記調節反応点は、反応点から効率関連値の底が2の対数を引いた上記バックグラウンドのシグナル強度に等しい。ある実施態様において、最大強度である各標的核酸に対する効率関連値の測定は、時間またはサイクル数の関数としての効率関連変換におけるピークを同定することを含む。そして前記方法は、ピークの幅を測定する工程；受容可能なピーク幅の選択範囲とピーク幅とを比較する工程；ならびに、ディスプレー、プリンターまたは記憶媒体に、測定されたピーク幅が、受容可能なピーク幅の選択範囲より大きいまたは小さい場合、核酸増幅反応をおそらく異常(possibly abnormal)であると同定する指標を出力する工程をさらに含む。ある実施態様において、前記ピーク幅を、有効関連値の反応点値において、またはその前に発生する有効関連変換のみを使用して算出する。種々の実施態様において、増幅反応を、増幅する標的核酸の一つの全てまたは一部に相補的であるFRETプローブを含む、一連のプローブとともに実行する。ある実施態様において、前記増幅反応を、増幅する標的核酸の一つの全てまたは一部に相補的である分子ビーコン(molecular beacon)を含む、一連のプローブとともに実行する。ある実施態様において、データの提供は、データを含むデータファイルを読み取る、ネットワーク結合またはフィード(feed)よりデータを受信する、およびリアルタイムにおける増幅反応よりデータを受信することからなる群より選択される様式を含む。
種々の実施態様において、本発明はまた、機械により実行するのであれば、本明細書に記述される解析を含む操作を機械が実行するような命令を提供する、機械で読み取り可能な媒体(machine -readable medium)も提供する。
核酸増幅を実行し、反応の時間点および標的核酸の増幅強度の測定値を含む出力シグナルを提供するための装置、前記装置に連動して作働するプロセッサー、本明細書に記述される機械で読み取り可能な媒体を含むシステムもまた提供される。
定義
「標的核酸」の語は、（しばしば生物学的サンプルに由来する）核酸を指し、増幅反応は増幅および検出および/または定量化するように設計される。それは検出される標的核酸の存在または非存在、あるいは定量化される標的核酸の量である。種々の実施態様において、「標的核酸」の語は、増幅される全ての核酸または一部を指す。そして、標的核酸は、増幅反応の鋳型またはそれに由来する核酸を含むことができる。
本明細書において、「核酸に由来する」の語は、その合成のために、参照される核酸またはそれに続くものが、鋳型として一様に提供される、核酸を指す。そして、例えば、mRNAから逆転写されたDNAまたはmRNA由来のRT- PCR'd、cDNAから転写されたRNA、cDNAから増幅されたDNA、増幅したDNAから転写されたRNAなどは、全てmRNAに由来する。鋳型から増幅されるDNA、遺伝子、遺伝子の転写物から逆転写されたDNA、逆転写産物から増幅されたDNAは、全て遺伝子（核酸）に由来する。
MR、FCNおよび幅の定義を示す比率変換(ratio transform)を説明する。 慣用的なCt解析（図２Ａ）およびMaxRatio解析（図２Ｂ）を使用するリアルタイムPCR対立遺伝子識別解析の結果を示す。 慣用的なCt解析（上のパネル）およびMaxRatio解析（下のパネル）を使用するリアルタイムPCR対立遺伝子識別解析の結果を示す。 慣用的なCt解析（上のパネル）およびMaxRatio解析（下のパネル）を使用するリアルタイムPCR対立遺伝子識別解析の結果を示す。 慣用的なCt解析（上のパネル）およびMaxRatio解析（下のパネル）を使用するリアルタイムPCR対立遺伝子識別解析の結果を示す。 本発明の実施態様による、反応標的の比率変換および対照データを解説するプロットを示す。 本発明の実施態様による、反応標的の比率変換および対照データを解説するプロットである。 リアルタイムHIV-Iアッセイ増幅プロットの最大比(maxRatio)による解析を示す。7.44 log10コピー(copy)/mLから1.56 log10 コピー/mLの範囲にあるHIV-I RNAを、m2000spおよびm2000rt装置を使用して、4回試験した。(A) HIV-I標準化FAM蛍光対サイクル数の増幅プロット。(B) 比率変換を適用後の対応するプロット。(C) 比率反応(ratio response)のピークに由来するMR対FCN値のプロット サイクル数の関数としてプロットした標的核酸の数に対する反応データ（上のパネル）およびこれらのデータの比率変換（下のパネル）を示す。 期限に由来し、本発明のある実施態様によりスケール化した、標的を示す反応データおよび対照データを解説するプロットである。 本発明の実施態様によりFCN-MRプロットを表示するユーザーインターフェースの例を示す。 本発明の実施態様によりシフト比プロット(shifted ratio plot)を表示するユーザーインターフェースの例を示す。 本発明の種々の態様が実体化される論理装置(logic device)の代表的例を示すブロックダイアグラム(block diagram)である。 本発明の方法の例示的実施態様に対するフローチャートを示す。
本発明は、核酸増幅反応における密接に関連する核酸を検出し、識別する方法の改善に関する。前記方法は、慣用的な技術を使用することにより容易に実行され、単一のヌクレオチド差異さえも効率的に検出して識別し、それにより対立遺伝子識別、単一ヌクレオチド多型の検出などのための強力な方法を提供する。
前記方法を、単一増幅反応における複数の標的核酸（例えば、異なる遺伝子の対立遺伝子）の解析に適用することができる。典型的な対立遺伝子識別アッセイは、少なくとも2つの異なる標的核酸が、同一の反応混合物において増幅される、多重増幅アッセイである。種々の実施態様において、多重反応混合物は、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つの異なる標的核酸を増幅する試薬を含む。
慣用的な対立遺伝子識別解析は、標的核酸が存在するか否かに関する、反応物における各標的核酸（例えば対立遺伝子）に対して生じる蛍光（シグナル）の量を測定することにより、増幅の「量」を決定することを試みる、「エンドポイント(end-point)」アッセイシステムを使用して実行される。しかし、PCR反応において生成する総蛍光は、増幅の効率に高く関連する必要はない。濃度が高く、しかし効率が低い増幅は、効率は高いが濃度が低い増幅よりも強く蛍光を生じる可能性がある。さらに、最終蛍光は、一般的にPCR反応が、反応の他の側面がパフォーマンスに顕著に影響する可能性がある、対数増幅領域を超えている。この理由により、最終蛍光レベルは、変動しうる増幅の指標である。さらに、十分な蛍光測定値を得るために、一連のプレ(pre)およびポスト(post)PCR蛍光読み取りが必要であり、それによりプロセス時間を増加させる。
特に、従来の解析方法では、サイクル数決定に関わる量的反応に最初に焦点を絞る。これらのアプローチにより、増幅成長曲線、すなわち対数増殖が観測される領域の一部分に焦点を絞ることにより、量的評定が提供される。サイクル閾値(cycle threshold)法、すなわちCt法(Heid et al. (1996) Genome Res., 6: 986-989)では、蛍光反応がバックグラウンドレベルを超えて、前もって決定した蛍光閾値よりも高く増幅する点に基づいて、サイクル数が決定される。Ct決定に関わる重大なステップは、ベースラインを決定し、外部較正曲線または内部量的標準のいずれかと使用する標的を定量化するための適切な閾値を確立するステップを含む。しかし、これらの方法は、増幅曲線シグナルが、変則的な特徴を示す場合に問題がある。そのような場合、解析にはしばしば、特定の反応が本当に増幅であるか否かを判定するデータレビューア(data reviewer)の一部に対する、解釈の複数の測定が必要とされる。
対照的に、本願発明は、効率関連増幅(ERT)が増幅反応における時間またはサイクル数の測定、ならびに前記反応における増幅の効率に関する強度測定を提供する、増幅シグナルの増幅関連変換を利用する。関連する核酸標的の解析/識別におけるそのような増幅関連変換の使用により、標的の感度および識別が改善するという発見は、驚くべきものであった。
種々の実施態様において、増幅関連変換は、それぞれが時間値またはサイクル数で標識される、連続し、それにより一連の比率が得られる増幅測定値間の比率の算出に関連する。種々の実施態様において、増幅効率関連値(MR値)は、増幅がバックグラウンドから立ち上がる早期のサイクルで決定される。これらのMR値が決定される一方、反応はいまだ対数期に近いため、それらはより直接に増幅効率に関連し、慣用的なCt解析（図２Ａ、２Ｂおよび図３参照）よりも良好な標的核酸間の識別を提供し、総蛍光よりもADまたはSNPコール(call)を決定するためにより有用であったであろう。MaxRatio解析は、ほとんどの測定値をリアルタイムPCR反応より利用する。この理由により、総蛍光法において利用できないPCR増幅の質および妥当性を評価する能力がある、さらに、MR値を使用するには、PCRサイクリングプロトコルのみが必要であり、MR値を使用することによりプレおよびポスト読み取りを除去してプロセス時間を短縮する。
I. 増幅法
本明細書に記載の方法は、複数の増幅方法のいずれかに比べて、関連する標的核酸を識別する際に有用である。
核酸を増幅し、検出することができる多くのシステムが開発されてきた。同様に、多くのシステムが、その量でなければ検出限界以下である核酸の量を、シグナル増幅を使用して決定させている。核酸の存在のシグナル指標、または核酸のコピーの増幅のシグナル指標を、時間依存的、またはサイクル依存的方法において測定することができると言う条件で、本発明は、これらのシステムのいずれかを使用することができる。本願発明の文脈において、複数の好ましい核酸検出システムは、PCR、LCR、3SR、NASBA、TMA、およびSDAを含むがそれに限定されない。
ポリメラーゼ鎖反応(PCR)は、当業者によく知られており、Saiki et al. (1985) Science 230: 1350-1354; Saiki et al. (1988) Science 239: 487-491; ならびに米国特許 5,538,848; 5,723,591; および5,876,930、ならびに他の参考文献に本質的に記載されている。PCRをまた、リバーストランスクリプターゼ(RT)および/またはある多機能DNAポリメラーゼと結合させて、RNA分子をDNAコピーに変換し、それによりRNA分子を、DNAポリメラーゼによるPCR増幅に対する基質として使用できるように使用することもできる（Myers et al. (1991) Biochem. 30: 7661-7666参照）。
ライゲーション鎖反応(LCR)は、PCRに類似しており、主な区別できる特徴として、LCRでは重合(polymerization)の代わりにライゲーション(ligation)を使用して標的配列を増幅する点を有する。LCRは、それ自体欧州特許 320 308、Landegren et al. (1988) Science 241(4869): 1077-1080;Wu et al. (1989) Genomics 4(4): 560-569などに記述されている。LCRの複数の進歩した形態では、鋳型依存的重合(template-dependent polymerization)によって埋められるギャップを、オリゴヌクレオチド間に提供することにより特異性を増加させることができる。これは特に、オリゴヌクレオチドプローブ間のギャップを埋めるために全ての4種のNTPが必要ではない場合、および増幅試薬中に全ての4種のNTPが供給されない場合、特に有利である。同様に、ローリング環増幅(rolling circle amplification (RCA))が、Lisby (19999) MoL BiotechnoL 12(1): 75-99), Hatch et al. (19999) Genet. Anal. 15(2): 35-40などにより記載され、本発明の文脈において有用である。
定温増幅反応(isothermal amplification reaction)が当業者によく知られており、本発明の文脈において有用である。定温増幅反応の例には、Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 86: 1173-1177に記載の3SR、さらに当業者により発展させたKievits et al. (1991) /. Virol. Meth. 35: 273-286に記載のもの、およびさらに当業者により発展させたもの、最初にWalker et al. (1992) Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 89: 392-396およびU.S. Patent No. 5,270,184に記載された鎖置換増幅(Strand Displacement Amplification (SDA))法、およびさらに当業者により発展させたものが含まれる。
そして、標的核酸の量のシグナルゲイン指標(signal gains indicative)のみを必要とする、多くの増幅または検出システムを、時間依存またはサイクル依存的方法で測定することができ、本発明の文脈において有用である。これらの特性を有する他のシステムが当業者に公知であり、上述されていないものの、本発明の文脈において有用である。
明確化のために、本発明は、リアルタイムPCR反応を参照して説明されるが、前記方法は、本明細書に記載される他の増幅システムを含むがそれに限定されない、他の増幅システムに同様に適用可能であることも認識されるであろう。
リアルタイムPCRでは、核酸(NA)配列標的の増幅が、増幅産物の実質的に同時の検出と組み合わされている。任意に、標的核酸の存在に依存して消光される、または活性化される蛍光プローブまたはプライマーに、検出は基づくことができる。蛍光強度は、サンプル中の標的配列の濃度または量に依存する（おそらく、もちろん標的の量は最小検出限界より高く、飽和限界のいずれかよりも低い）。プローブのこの消光/蛍光能力により、均一なアッセイ条件が可能となる、すなわち、増幅と検出の両方のための試薬全てを、反応容器、例えばマルチウェル反応プレート(multi-well reaction plate)中の単一ウェルに一緒に添加する。電子検出システム、標的補足システム(target-capture based system)、ならびにアリコート解析(aliquot-analysis)システムおよび技術は、所与のシステムが標的増幅反応の種々の時間点の間でサンプル中に存在する標的の量を示すデータを蓄積する限りにおいて、本発明の文脈において有用な、他の形態の検出システムである。
対立遺伝子識別システム(allelic discrimination system)において、増幅は多重である(multiplexed)。すなわち、各反応は典型的には、少なくとも2つの異なる標的核酸を増幅するプライマーを含む。さらに、前記システムは典型的には、増幅産物を検出するためのプローブを含む。
PCR反応において、標的核酸の量は、試薬が制限されるまたは消尽されるまで各サイクルで2倍となり、顕著な競合、不十分な試薬の供給、または反応進行につれて蓄積する他の要素が存在する。PCRが特定のサイクルにおいて（正確に）標的を2倍にする間の時間において、反応は、1の効率(efficiency) (e)を有する（例えばe =1）と言われる。多数のサイクルの後、検出可能な標的の量を、非常に小さく、最初は検出不可能な量の標的より生成することができる。典型的には、PCRサイクリングプロトコールは、増幅のおよそ30から50サイクルの間に存し、しかし、より大きいまたはより小さいサイクルを使用するPCR反応もまた当業者に公知であり、本発明の文脈において有用である。
本発明を説明するために以下に記述されるリアルタイムPCR反応において、反応混合物は、オリゴヌクレオチドプライマー、相補的標的核酸に結合していない場合消光される（または再消光される）ことができる蛍光染色標識オリゴヌクレオチドプローブ、または挿入染料(intercalating dye)、増幅酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTPs)、ならびに付加的な薬剤の適切な試薬カクテルを含む。また、増幅されうる「対照配列」または「内部対照」、および任意に連続反応を通して増幅されないままでいるオリゴヌクレオチドに接着されてよい「参照染料(reference dye)」を検出するための第二の蛍光染色標識オリゴヌクレオチドプローブを、リアルタイムPCR反応のための混合物に任意に添加することができる。そして、複数のリアルタイムPCRシステムにおいて、各サンプルまたは反応容器（例えばウェル）中で、最小量の三種の蛍光色素が使用される。
種々の増幅システムにおいて、特に多重標的核酸を増幅する場合（例えば、対立遺伝子識別において）、多重増幅反応であることがしばしば望ましい。そして、単一増幅反応は、2つ以上、ある特定の実施態様においては3つ以上、4つ以上、5つ以上の異なる標的核酸を増幅するプライマーおよび検出するプローブを含むことができる。そのようなシステムにおいて、プローブおよび/または標識は、各標的核酸の増幅手順のために異なり、区別できるシグナルを供給するよう、選択される。
対立遺伝子識別反応（例えば、2つ以上の近接した関連核酸の存在を決定する反応）を、多重増幅反応中でしばしば実行する間、そのような多重性は必要ではない。そして例えば、異なる標的核酸を、異なる反応混合物中で（例えばPCRプレート上の異なるウェル中で）検出することができる。また、多重および個別標的増幅反応の組み合わせも利用することができる。そして、例えば、3つの対立遺伝子を、3つの全ての標的に対する1つの反応混合物を使用して、各標的核酸に対して異なる反応混合物を利用して、または2つの標的核酸に対して1つの反応混合物を、3つ目の標的核酸に対して2番目の増幅反応を使用することにより、検出することができる。
一つ、場合によれば多数の反応（例えば多ウェルプレート）に対するデータをプロットおよび表示するシステムもまた、本発明の文脈において有用である。これらのシステムは、場合により、時間またはサイクル数 (CN)、あるいは両方の関数で、2次元プロットとして（y対x）、プローブの蛍光強度を表す値を算出する。そして、プロットした蛍光強度は、場合により多重染色(multiple dye)（例えば、異なるプローブ染色(probe dye)、および/または場合により対照染色(control dye)、および/または場合により参照染色(reference dye)）からの算出値を表し、算出されるバックグラウンドの引き算(subtraction)を含むことができる。PCRシステムにおいて、そのようなプロットは、一般的にPCR増幅曲線として参照され、プロットされたデータは、PCR増幅データとして参照される。
PCRにおいて、データ解析は、数々の要素により困難となる可能性がある。従って、種々のステップを実行して、これらの要素を説明することができる。例えば、補足光シグナル(captured light signal)を、解析して、光検出それ自体における不正確性と説明することができる。そのような不正確性は、色素の混合物中における複数の色素の間の、個々の色素の蛍光の解像度におけるエラーまたは困難性（以下で、「過剰なにじみ(bleedover)」と記述される）に起因する可能性がある。同様に、ある量のシグナルが存在し（例えば、「バックグラウンドシグナル」、標的が存在しない場合により高くなる（例えば「ベースラインドリフト(baseline drift)」可能性がある。そして、複数のバックグラウンドを除去するための技術、好ましくはベースラインドリフト、傾向解析(trend analysis)、および標準化(normalization)を含む技術が、本明細書に記述され、および/または当業者に公知である。これらの技術は、有用であるが、本願明細書の文脈において必要ではない（ベースラインドリフト、または傾向化(trending )は、多くの供給源、例えば、色素の不安定性、ランプの不安定性、温度変動、光学的配列(optical alignment)、センサーの安定性、または前記の組み合わせに起因する可能性がある。これらの要素および他のノイズ要素のために、ベースライン領域を同定し、修正する自動化方法は、エラーが起きやすい傾向にある）。
本明細書において、核酸増幅反応は、標的核酸の配列の一部の増幅、および、標的核酸の存在の指標となるシグナルの増幅および蓄積の両方を指すことができ、前者はしばしば後者より好ましい。
II. 解析方法
リアルタイムPCR（または他の増幅）曲線は、PCR増幅法の間における増幅産物の増加に相関する、だいたいシグモイド形状の蛍光反応である。PCR増幅曲線の形状は、反応成分（プライマーおよびプローブの設計および濃度、酵素、活性化剤、バッファーdNTPなどの濃度）、ならびに反応のサイクル条件を含むアッセイ設計により特異的に制御される、個々のサンプルに対するPCR反応の動力学を反映する。伝統的なリアルタイムPCRデータ減縮法(data reduction method)は、Ct法を利用する。Ct法は、PCR曲線の対数増殖領域に相当する、ベースラインシグナルレベルに極めて近くであるように選択される閾値を利用する。シグナルが閾値より高く上昇する、補間サイクルは、曲線に対するCt値である。PCRの対数増殖期の間のシグナル強度に調和するために、Ct法は定量的PCR解析を行うために極めて優れた方法である。しかし、泡またはノイズによるスペクトルクロストークまたは不連続性のようなシグナル以上にさらされる場合、エラーが生じやすい。PCR曲線の対数増殖領域において検出するために、低い閾値が必要とされる。閾値が低ければ、Ctエラーを引き起こす、例えばスペクトルクロストークのような異常シグナルによる誤った閾値交差(false threshold crossing)と、本当のシグナルCt値との間を区別することが困難となる。ベースライン決定法におけるエラーが小さくても、閾値を交差するネガティブ反応、または早くまたは遅く交差する反応シグナルを引き起こす可能性がある。
従って、種々の実施態様において、本発明の方法は、増幅反応における連続的な測定値の間の比率に関する、MaxRatio法を利用する。この方法において、連続的な測定値の間の比率を算出し、それにより一連の比率を得て、そのそれぞれが時間値またはサイクル数の指標である可能性がある。これらの比率を算出する多くの適切な方法が存在し、いずれかの適切な方法を使用することができる。この比率を算出する最も簡単な方法は、以下の式を利用するものであり、
前記式中、nはサイクル数を表し、s(n)は、サイクルnにおけるシグナルを表す。この算出により、反応のベースライン領域においておよそ1で出発し、増殖領域の間で最大値に増加し、そしてプラトーでおよそ1に戻る曲線が得られる。この算出を効率的に実行するMATLAB表現は、以下である。
式中、「s」はシグナル反応マトリックスを表し、各列は別個の反応を表す。図４は、この比率変換の例を示す。固有のバックグラウンド蛍光のために、シグナルが2倍となるのであればPCR反応で予想されるように、比率は2には達しない。にもかかわらず、ピークの強度は乗法強度変数(multiplicative intensity variation)に独立であり、その点における増殖または効率の比率に比例する。比率を算出する方法は、簡単であり、有効に算出される。他の同等の算出法も使用されうる。実施例は、進行(forward)および逆行(reverse)比を算出し、その後それらを平均化することに関する。比率の逆数を使用することもでき、その場合、曲線は、ベースライン領域のおよそ1の値から開始し、増殖領域で減少し、プラトー領域でおよそ1に戻るであろう。その後、解析のために、ピークの変わりに谷(trough)の強度および位置を使用する。この変換により、比率法に必須的に同等な方法を実施することができる。
MaxRatioアルゴリズムは上述のように使用可能であるにもかかわらず、各点から定数を引く、例えば約(1)を引くことにより、曲線をシフトすることが好都合である。この操作により、もとの反応を変換し、それにより、ベースライン領域の0に近い値から出発し、曲線の増殖領域でピークまで増加し、プラトー領域で0近くに戻る（例えば、図１参照）。このシフト比率算出は、以下の関数により記述される。
式中、Signalnはサイクルnにおいて所望の標的に対して測定されるリアルタイムPCR蛍光反応である。比率算出により、ほぼシグモイド形状の増幅曲線が、明確なピークを有する比率曲線に変換される。図１はこの変換を示す。比率曲線は、複数の明確な特徴を提示する。
比率曲線の最大値は、2つの値を定義する。最大値が生じるサイクル数を、FCN値または部分サイクル数(fractional cycle number)と定義する。最大値における比率曲線の強度を、MR (maxRatio)値と定義する。比率曲線は、幅パラメーター(width parameter)として参照される、最大値の半分の幅として測定される、特徴的な幅を有する。
比率曲線は、PCR反応を通した、蛍光シグナル増殖の相対的な測定値である。0に近い早期サイクルの比率曲線は、PCR曲線のベースライン領域を表し、後期サイクル領域はプラトー領域に相当する。比率曲線の増加部分は、対数増殖期に相当し、比率曲線の減少部分は、PCR曲線における対数増殖からプラトー期の転移である。この比率変換は、サイクルnにおけるPCR反応効率の等式(Peirson et al. (2003) Nucleic Acids Res., 31(14 e73))に類似している。
式中、ΔRnはサイクルnにおけるベースラインのPCRシグナルである。実際には、式IIIを現実の増殖反応に適用するには問題がある。ベースラインのPCRシグナル曲線が、ベースライン部分においておよそ0であるために、式IIIは、0で割ることの問題を生じる。さらに、微小なバックグラウンドの傾きの変動さえも、対数増殖領域における効率測定に顕著な変化を生じる。比率式IIにおけるシグナル値Signalnは、PCRシグナル強度および固有のバックグラウンド蛍光レベルを含む。そのため、MR値は反応効率の相対的測定値である。比率式において取り込まれるバックグラウンド蛍光の固有レベルのために、完全に効率的な反応に対してさえ、MR値の強度は常に1より小さい。比率式におけるバックグラウンド蛍光を含むことにより、得られる比率曲線は、0で割る問題を回避し、中程度のベースラインの傾きの変動に対してさえも高度に無反応である。
図１は、簡単なCt解析に対するこの算出の関係を示し、一方図５は、このシフト比率算出の実際の出力を示す。シフト比率曲線のピークの反応点および強度を、その後決定する。反応点（すなわち、x軸上の距離）により、MRのFCN値が特定され、強度により効率関連値MR（比率の最大値(Maximum of the Ratio)）が特定される。
図６は、maxRatioアルゴリズムで処理したAbbott RealTime(登録商標) HIV-I標準化FAM蛍光の一連の例示的希釈を示す。MR対FCN値をプロットすることにより、このデータに対する特徴的MR-FCNプロットが生成される。
図６は、サンプル反応を実行するための増幅プロットを示す。唯一のネガティブ反応は、ネガティブ対照に由来し、それはMR値が0に近いMR対FCNプロットにより同定される。標的のない反応においてはシグナル増殖がないため、増殖行程を等して比率曲線はほぼ0に近い。およそ0のMR値は、全ての反応サンプルにおけるネガティブ反応を容易に区別する。実際に、これらの2つの反応の集団を区別するように、線を容易に確立することができる。この線は、比率閾値(Ratio Threshold)と呼ばれる。
同様または本質的に同等の結果をもたらす同等の比率算出萌芽存在することが理解されるであろう。例えば、式IIに本質的に同等な比率算出式は、
である。
これは、例示的なものを意図し、限定的なものを意図するものではない。本明細書による教唆を使用して、他の効率関連変換、特に比率算出を当業者は利用することができるであろう。
ある例示、しかし限定的ではない実施形態において、maxRatio法は、Abbott m2000システムの一部として実行される。m2000システムは効率的な自動ベースライン化アルゴリズムを有しているため、ベースライン傾き較正(baseline slope correction)（しかし補正(offset)ではない）が適用される。標準化およびベースライン傾き較正はmaxRatio法によって必要とされないものの、それらを使用することにより、実行時に小さいが顕著な改善が達成される。さらに、シグナルには平滑化フィルタ(smoothing filter)が適用される。Ct法に比較してサイクル数に顕著な影響を与えることなく、より多くの積極的ノイズフィルターを適用することができることが、maxRatio法の特徴である。m2000rt装置は、4次元の、ゼロフェーズノイズフィルター(zero-phase noise filter)を使用する。0.01サイクルの解像度を得るために、比率曲線に三次元スプライン補間(cubic spline interpolation)を適用することができる。
抑制されたシグナルレベルのアッセイ反応に対して、FCN値が少し早くシフトする可能性があることが発見されている。より線形な結果を得るために、調整FCN (FCNA)値を、場合により式IVを使用して算出することができる。
比率変換は、反応シグナル強度に対して固有な自己補償であるため、反応の生の蛍光シグナルに、それを適用することができる。参照色素が利用できる場合、標準化蛍光シグナルを解析することができる。蛍光シグナルは、消光しない蛍光のバックグラウンドレベルを天然に有することに注意すべきである。比率変換において除せられるために、このバックグラウンドレベルをゼロで除することを避ける必要がある。生のまたは標準化蛍光反応を直接利用する別法として、反応を固定したポジティブバックグラウンド蛍光レベルにシフトしてよい。この反応シフトの有利な点は、プローブ製造におけるばらつき、またはサーマルサイクラーブロック(thermal cycler block)における蛍光の汚染のような、バックグラウンド蛍光のレベルを変化させる可能性がある要素に対する感受性を排除することである。反応をシフトする不利な点は、それによりシグナル強度に対する固有の不感受性が除去され、ある装置と装置の間の変動が導入される可能性がある点である。この理由により、シフトが実行される場合、バックグラウンド蛍光の天然レベルに近いシフト値を使用することが推奨される。シフト化により、MR値の強度が直接影響を受けることに注意すべきである。低い値へのシフトにより、ポジティブ反応のMR値ならびにネガティブ反応に対するMRの平均と標準偏差の両方が増加するであろう。集団を統計的に分離する点において、これにより顕著な差異が生じることはまれである。しかし、低いレベルへのシフトにより、増幅反応のベースライン部分におけるスペクトルクロストーク(spectral crosstalk)、最初のシグナル過渡信号(initial signal transient)、および他の異常を減少させることができる。それゆえ、アッセイを開発する場合に、MR値を最大化させずに、非反応集団からMRにより反応を分離することに焦点を絞ることが重要である。
III. 対立遺伝子および他の「関連」核酸の識別
上述の通り、上記の解析方法は、関連核酸（例えば、遺伝子の異なる対立遺伝子(different allele)、病原体のバリアント株、単一ヌクレオチド多型など）を検出/識別する際に特に有用である。そのようなアッセイにおいて、核酸サンプルは、生物学的サンプルより由来する（取得される）。「生物学的サンプル」の語は、本明細書中に記載されるアッセイにより検出/スクリーニングされる核酸を含む、生物学的組織、細胞、液体、病原体などを含むサンプルを指す。そのようなサンプルには、一次細胞調製物、唾液、羊水、血液、組織または微細ニードル生検サンプル、尿、腹膜液、および胸膜液、またはそれらに由来する細胞が含まれるがそれに限定されない。生物学的サンプルにはまた、（例えば生物より採取された）一次サンプル中、または培養物であったサンプル中のいずれかに存在する病原体（例えば、バクテリア、ウイルス、寄生虫など）のサンプルも含まれる。生物学的サンプルにはまた、組織切片（例えば解剖学的目的で採取される凍結切片）なども含まれてよい。サンプルを、必要に応じて適切なバッファー中に希釈することで前処理してよく、あるいは望ましければ、濃縮してよい。リン酸、トリスなどのような種々のバッファーのうちの一つを、生理学的なpHで用いて、複数の標準水性バッファー溶液のいずれかを使用することができる。
種々の実施態様において、増幅のために使用されるサンプルは、ゲノムDNAおよび/またはそのようなものに由来する核酸を含むことができる。そして、例えばある実施態様において、サンプルはRNA、RNAより逆転写されたDNAなどを含むことができる。
増幅反応を、当業者に公知の標準方法により実行する。典型的には、増幅反応を、試薬（例えばプライマーおよびプローブ）とともに実行して、目的の標的核酸を特異的に検出するであろう。そして、例えば、異なる対立遺伝子（SNPなど）を検出することが望ましい場合、プライマーおよびプローブを、標的核酸の全てまたは一部を増幅および検出するように選択するであろう。標的核酸の断片のみを検出する場合、プローブおよびプライマーを、対立遺伝子間で異なると予想される核酸のその断片を、増幅および検出するように選択する。
アッセイは、「多重化(multiplexed)」である、または分離している、あるいはその両方である可能性がある。多重化アッセイにおいて、単一増幅反応物（反応混合物）は、少なくとも2つ（ある実施態様において、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つなど）の異なる標的核酸を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブを含むであろう。分離アッセイにおいて、分離増幅反応物（反応混合物）は、異なる標的核酸をそれぞれ増幅および検出するために使用されるであろう。ある実施態様において、ある増幅反応物（反応混合物）を使用して、単一の標的核酸をそれぞれ増幅および検出し、一方同時に他の増幅反応物（反応混合物）がそれぞれ少なくとも2つの異なる標的核酸を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブを含むことができる。「分離」および「組み合わせ」アッセイにおいて、異なる増幅反応を、同一のサンプルに由来する核酸において実行することが望ましい。
増幅反応由来の増幅データを（例えばコンピュータシステムを使用して）取得し、（例えば上述のように）解析して、各標的核酸の存在および/または量の測定値を得ることができる。対立遺伝子識別解析において、各標的核酸の増幅値を示すスキャッタープロット(scatter plot)として解析した情報を提供することがしばしば望ましい。ある実施態様において、得られたデータを（例えばクラスター解析、識別関数(discriminant function)解析などを使用して）統計的に解析し、各標的核酸の分離および検出を最適化することができる。
IV. 取得した/受信したデータ
例として、典型的なリアルタイムPCR反応検出システムが、1つ以上の検出色素から生成したシグナルを蓄積したデータファイルを生成する。これらの色素は、例えば、2つ以上の異なる標的核酸に対する増幅データ、任意に、内部対照データ、ならびに参照データを示す可能性がある。図７の上のパネルは、本発明による解析方法において使用することができる、複数の標的核酸に対して受信した/捕捉した反応データのプロットを示す。このプロットにおいて、x軸はサイクル数（例えば1から40）の指標を与え、y軸は、相対的蛍光単位において検出される染色強度を示す。この図において、異なるデータのセットが連続した曲線として説明される。しかし、実際に補足されるデータ値は、一般的に、各サイクル番号において補足される具体的なシグナル値である。
図７の下のパネルに示されるように、最大比率値を与えることができる比率変換、任意に、最大比率が生じる点、ならびに任意にピーク幅（例えば最大値の半分の全幅）を使用して、（例えば本明細書に記載したように）データを変換することができる。
V. 任意誤差較正
a) 標準化
任意であるが、複数の異なる方法で捕捉したデータ上で、標準化を実行することができる。ある方法は、各サイクル測定値における標的および対照値を、相当する参照染色シグナルで割ることに関する。あるいは、除数は、全てのサイクルにわたる平均参照値またはある際来るの平均である可能性がある。別の実施態様において、除数は、標的染色または対照染色の平均、あるいは、増幅シグナルが検出されない場合、1つ以上早い（ベースライン）サイクルにわたる標的染色および対照染色の平均である可能性がある。既知の標準化法のいずれかを、データ解析に使用することができる。本発明を、PCRシステムにより標準化されているデータで使用することができる。
標準化は任意であるため、本発明を使用して、標準化または参照色素を使用することなく、反応データを解析することができる。あるいは、標的シグナルまたは対照シグナルまたはその両方を、標準化に使用することができる。
b) スケール化(scaling)
スケール化は任意であるが、人のオペレーターがデータを容易に資格かできるように実行することができる。スケール化は、解析データに影響しない。標準化に加えて、標準化なしに、あるいは、標準化の前または後に、スケール化を実行することができる。
スケール化の一方法は、各データセットの値を、一般的にポジティブデータシグナルのいずれかが検出される前のベースライン領域における、いくらか早いサイクルの間の値の平均値で割ることに関する。この例では、4から8の測定値が平均化され、標準化が最初に実行される。図８は、スケール化された標的および対照データを示す反応データのプロットである。この例では、スケール化により標的および対照の早期の値が一つにされ、早期の値は1より小さいため、割り算により後期の値は若干純粋な数よりも大きくなる。
c) デジタルフィルタリング(Digital Filtering)
1つ以上のデジタルフィルタリング法を、単一データセットを「きれいにする(clean up)」ため、およびシグナル対ノイズ比を改善するために、補足データに適用することができる。多くの異なるフィルタリングアルゴリズムが知られている。本発明は、ゼロなし4極フィルター(four-pole filter with no zeros)を使用することができる。これにより、フィルターしたシグナルのオーバーシュートする可能性を除去する。例として、これを、MATLABシグナルプロセシングツールボックス(Signal Processing Toolbox)と提供されるMATLAB関数「filtfilt」で実行することができ、ここで順行(forward)および逆行(backward)の両方が、いずれかの相のラグ（時間の遅れ）を除去する。パラメーターとMATLAB関数コールの例は以下のようなものである。
この例において、「b」および「a」はフィルター係数を含む。「data(:,:, assay)」および「data(:,:,ic)」は、標準化、スケール化またはその両方がなされていてもいなくてもよい捕捉されたデータを含む。この場合、フィルター化したデータは、標準化とスケール化の両方がなされている。
d) 傾き除去/ベースライン化
任意の傾き除去法を使用して、検出可能な実際のシグナルのいずれかが生じる前の早期のベースラインシグナルに存在する残った傾きのいずれかを除去することができる。この手順はまた、ベースライン化と呼ばれてもよいが、複数の実施態様において、補正ではなく、傾きのみが除去される。ある実施態様において、傾き除去のために、標的(DYE1)および、存在する場合には、対照(DYE2)シグナルが同時に調査される。（存在する場合）どのシグナルが最初に順行退行点(forward regression point)を表そうとも、前記方法は一般的に10サイクル戻る。10サイクルの戻りがサイクル5より前の場合、サイクル5を最初の退行点として使用して、早期のシグナル過渡信号を回避する。線形退行線(linear regression line)を、これらの点の間のシグナルデータと、色素シグナルから引かれる各色素の退行の傾きを使用して、算出することができる。この場合、傾き除去を、上述のように標準化、スケール化、およびフィルター化したデータに適用する。
VI. システム、装置およびソフトウェア
本発明の方法を、複数の適切なシステム、コンピューター製品、および/または情報装置に取り込むことができる。いくらか詳しいMRソフトウェアの実行が以下に与えられる。特定のユーザーインターフェースの記載および説明を使用して、特定の実施態様の見を説明し、かつ情報操作分野の当業者に公知である複数の異なるユーザーインターフェース方法のいずれかを、本発明を使用するシステムにおいて使用することができる。以下に述べるオプションの実質的に全てをプリセットし、算出し、情報システムにより提供し、その結果としてユーザーインターフェースオプションをほとんど提供しない、または全く提供しないシステムにおいて、本発明を使用することもできる。ある場合において、プロトタイプシステムの詳細および/またはオプションを、例示的な目的に記述し、これらのオプションおよび/または詳細の多くは、製造システムに関係ない、または利用できないものであってもよい。
さらに、ソフトウェアの実施態様は、例えば、２、３、４、または５個の、あるいはそれ以上の標的反応物との反応工程、ならびに、任意に、１個以上の内部対照反応物のような種々の官能基、または参照データ、あるいは前記の組み合わせを含むことができる。本発明のしように適するソフトウェアシステムは、開く(open)、閉じる(close)、印刷する(printing)、保存する(saving)などのようないずれかの数の標準ファイル操作機能を提供することができる。
A) 例示的ユーザーインターフェース
図９は、本発明によるPCR対立遺伝子識別データのためのユーザーインターフェースを示す。このインターフェースにおいて、種々の標的（例えば、標的１（対立遺伝子１）、標的２（対立遺伝子２）など）、および任意に内部対照に相当する適切な色素、ならびに参照反応が、ウィンドウ中に示すポップアップリスト(popup list)より選択される。異なるビューオプション(viewing option)（例えば、MR-FCNプロット、シフト比率曲線、標的の関数としての標的シグナルのスキャッタープロットなど）を選択するタブが、ウィンドウの中央に位置し、水平に並べられる。図９は、MR-FCNプロットを示すタブが選択されていることを示す。図１０は、ウェル１に対する同一のデータを示すが、シフト比率曲線を示すユーザーインターフェースを説明する。他のタブにより、生の蛍光データ、標準化蛍光、ベースライン化データなどを、全ての反応に対して視認することができ、ドロップダウンセレクター(Drop-down selector)により、各色素（標的）の選択が可能になる。さらに、タブにより各反応を個々に調査することが可能となる。プロットの右側のフィールドは、MR, FCN, Ctのような算出される反応値、およびベースライン領域における標準偏差を示す。これらの算出される値以下では、ユーザーは、アッセイデータ、内部対照データなどのいずれかを、ラジオボタンにより表示することができる。
B) プログラム化した情報電気器具/装置および/またはシステムにおける実施態様
図１１は、本発明の種々の態様が実施される論理装置(logic device)および/またはシステムの一例をスキーム化して説明するブロックダイアグラム(block diagram)である。本明細書による教唆より理解されるであろうように、本発明を、ハードウェアまたはソフトウェア、またはその両方で実行することができる。複数の実施態様において、本発明の異なる態様を、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかにおいて、およびクライアント側の論理またはサーバー側の論理において実行することができる。さらに、本発明またはその組み合わせを、論理装置またはデータを含む、適切に変形させたコンピュータ装置にロードした際に、本発明による操作を装置に実行させることができる（例えば、コンピューターでアクセス可能な/コンピューターで読み取り可能な）固定メディアのプログラム成分中に実行することができる。種々の実施態様において、論理命令を含む固定メディア成分を、ビューアのコンピューターに物理的にロードするための固定メディア上のビューアに送信することができ、あるいは論理命令を含む固定メディア成分を、プログラム成分をダウンロードするために、コミュニケーション媒体を通してビューアがアクセスすることができるようにリモート上で存在することができる。
図１１で説明したように、システムは、本明細書に記載されるように、イメージディスプレイまたは解析、あるいは両方に関して論理操作を実行するための論理装置として使用することができる、情報命令またはデジタル装置700を含む。そのような装置を、本発明の種々の実施態様に従って実行する論理命令を走らせる汎用コンピューターシステムまたはワークステーションとして実施することができる。そのような装置をまた、種々のサンプル操作のための機械に論理操作を組み込むカスタム化した、および/または特殊化した研究室用または科学用ハードウェアであってもよい。一般に、本発明による装置の論理操作成分は、媒体717またはネットワークポート719、あるいはその両方から命令を読み取ることができる。中央処理単位(CPU)を、任意に固定メディア722を有するサーバー720に連結することができる。その後、装置700は、これらの命令を、本明細書に記載されているように、直接動作へ使用、または解析を実行することができる。本発明を体現することができる論理装置のタイプの一つは、700に説明され、CPU 707を含み、任意に入力装置709および711、記憶メディア715、例えばディスク装置、ならびに任意にモニター705を含む、コンピューターシステムである。固定メディア717、またはポート719上の固定メディア722を、そのようなシステムをプログラムするために使用することができ、ディスク型の光学または磁気メディア、磁気テープ、固相ダイナミックまたはスタティックメモリーなどを表すことができる。本発明をまた、この固定メディアに記録したソフトウェア全体またはその一部に体現することもできる。コミュニケーションポート719を使用して、そのようなシステムをプログラムするために使用される命令を最初に受信するこができ、それはいずれかのタイプのコミュニケーション結合を表す。
図１１は、システムが、診断的なシステム(diagnostic system)または増幅システムを含むことができることを示す。そして、例えば、システムはサーモサイクラー785、および、サーモサイクラーにロード(load)およびアンロード(unload)するために任意にサンプルハンドラー790を含むことができる。これらの付加的な成分は、論理解析および/または対照を含む単一システムの成分である可能性がある。これらの装置はまた、当業者に理解されるであろう、ネットワーク、バス、ワイアレスコミュニケーションを介した、700のような情報装置を有するデジタルコミュニケーション中に存在する、本質的にスタンドアロン(stand-alone)な装置であってもよい。そのようなシステムの成分は、好都合な物理的変形および/または外見のいずれかを有する可能性があり、単一統合システム中に組み合わされる可能性がある。そして、図１１に示す個々の成分は、システムの一例を示すに過ぎない。
C) コンピューターでアクセス可能な/読み取り可能な媒体
上記のように、ある実施態様において、本発明は、機械（例えばコンピュータープロセッサー）により実行した場合に、本明細書に記載の種々の解析操作を機械に実行させるであろう、命令のセットを提供する、コンピューター（機械）でアクセス可能な/コンピューター（機械）で読み取り可能な媒体を意図する。そして、ある実施態様において、機械で読み取り可能な媒体は、機械により実行した場合に、以下の工程を含む操作を機械に実行させるであろう、命令を提供する。
単一のサンプルから2つ以上の異なる標的核酸を増幅する試薬を含む、1つ以上の増幅反応からシグナルを受信する工程であって、
前記シグナルが、増幅反応における各標的核酸の増幅度を示す振幅測定、ならびに振幅が測定される増幅反応中の時間点を含むデータを提供し、かつ前記シグナルが、増幅反応における時間点の多重度に対するそのようなデータを提供する、工程；
前記反応における増幅効率に関連する振幅測定を、効率関連変換(efficiency related transform)が提供する、前記データの前記効率関連変換を測定する工程；
標的核酸に対して測定された効率関連変換の最大強度である、各標的核酸に対する効率関連値(efficiency related value)を測定する工程；ならびに
各標的核酸に対する増幅反応における効率関連値および対応する点を、ディスプレー、プリンター、または記憶媒体に出力する工程であって、各標的核酸に対する効率関連値の関連振幅が、前記サンプル中の前記核酸それぞれの存在の指標である、工程。
そのような命令の例示的実施態様が、図１２に示される。
種々の実施態様において、機械で読み取り可能な媒体は、命令セットを保持する/保存することが可能な、有形な媒体のいずれかを含む。そのような媒体は、磁気媒体、フラッシュメモリー、光学メモリー、DRAM、SRAMなど含むが、それに限定されない。
D) 電気回路における実施態様
種々の実施態様において、本発明はまた、特定用途向け集積回路(application specific integrated circuit (ASIC))またはプログラム可能論理回路(programmable logic device (PLD))の電子回路中の全体または一部において体現することもできる。そのような場合、本発明を、本明細書に記載されるように操作する、ASICまたはPLDを作成するために使用されてよい、コンピュータに理解可能なディスクリプター言語(computer understandable descriptor language)において体現することができる。
VII. 他の実施態様
本発明を、特定の実施態様を参照して記載した。他の実施態様は、当業者に明らかであろう。特に、ビューアーデジタル情報電子機器が、パーソナルコンピューターのようなコンピューターワークステーションとして一般的に説明されている。しかし、デジタルコンピューティング機器は、本発明の論理方法を実行するために適する情報電子機器のいずれかを意味し、デジタル化研究用システムまたは装置、デジタル化テレビジョン、携帯電話、パーソナルデジタル補助機器などのような装置を含む。本発明の精神の範囲内における改変は、当業者に明らかであろう。さらに、種々の異なる動作を使用して、本発明の特定の実施態様によるシステムとの相互作用をもたらすことができる。例えば、声コマンド(voice command)がオペレーターにより話されてよく、キーがオペレーターにより押されてよく、クライアント側科学装置のボタンがオペレーターにより押されてよく、あるいはいずれかのポインティング装置(pointing device)を使用する選択がユーザーによりもたらされてよい。
以下の実施例が説明のために供されるが、本発明の請求の範囲を制限するものではない。
実施例１
Applied Biosystems SDSにより、対立遺伝子が存在するか否かに関する、生成する蛍光の量を測定して、増幅の「量」を測定することを試みるエンドポイント(end-point)アッセイシステムを使用して対立遺伝子識別を実行する。PCR反応において生成する総蛍光は、増幅の効率に高く関連する必要はない。より高い濃度であるがより低い増幅効率により、より高い効率であるがより低い濃度の増幅よりも多い蛍光を生成することができる。さらに、反応の他の側面が顕著に実行に影響する可能性がある、対数増幅領域をPCR反応が超えた後に、一般に最終蛍光を測定する。この理由により、最終蛍光レベルは、増幅の変動指標であるさらに、十分な蛍光測定を行うために、SDSシステムにより、操作時間を増大する、一連のプレおよびポストPCR蛍光読み取りを行う。
MaxRatio生成MR値を、増幅がバックグラウンドから立ち上がる早期のサイクルにおいて測定する。反応がいまだ対数増殖の近くにある間にこれらのMR値を測定するために、それらはより直接に増幅効率に関連し、リアルタイムPCR反応からのほとんどの測定を使用する総蛍光MaxRatio解析よりも、ADまたはSNPコールを測定するためにより有用であろう。この理由により、総蛍光法ではりようできないPCR増幅の質および評価を測定する能力がある。さらに、MR値を使用するためには、PCRサイクリングプロトコールのみが必要であり、MR値を使用することにより、操作時間を顕著に減少させるように、プレおよびポストの読み取りの必要を除去するであろう。
DVT SNP反応からのアッセイ測定を利用して、本明細書に記載の方法を試験した。深部静脈血栓症(thromobosis)プロトタイプアッセイは、３つの遺伝子：第V因子(G1691A) (「第V因子ライデン(Leiden)」)、第II因子 (G20210A)およびMTHFR (C677T)内のSNP（単一ヌクレオチド多型）の同定からなる。第V因子ライデン変異は、静脈血栓症および肺塞栓症の最も一般的な遺伝学的危険であり、コーカシア人集団(Caucasian popluation)の5%に存在し、静脈血栓症に罹患した経歴を有する個人の20%から40%に存在する。第V因子ライデンヘテロ接合体は、静脈血栓症に対して7倍の危険にある。第V因子ライデン変異は、APC抵抗の85%から95%に関連する。APCは、第Va因子および第VIIIa因子を不活性化する天然の抗凝集剤である。第II因子（プロトロンビン）変異は、プロトロンビンの循環レベルの上昇に関する。プロトロンビンの利用効率が高いほど、トロンビンへの変換が高くなり、血栓症の機会が上昇すると考えられている。MTHFR （メチレンテトラヒドロ葉酸リダクターゼ(methylene tetrahydrofolate reductase)）C677T変異は、おそらく静脈血栓症の危険の増大に関する。
これらのファイルを、対立遺伝子識別の結果のためのSDSにおいて処理する。これらは公知のサンプルであるため、コールを前もって決定した。SDSの結果報告を作成した。成分蛍光ファイルを、SDSからエクスポートし、MultiAnalyze 3.0で走らせ、MR値を生成した。SDS生成総蛍光値およびMR値を、プロット作成のためにExcelにインポートした。結果を図２Ａおよび図２Ｂに示す。図２Ａは、SDSにより生成された結果を示す。図２Ｂは、MaxRatioを使用して生成された結果を示す。MTHFR主クラスターは、MR値を使用する鋳型なし対照(no template control (NTC))からより明確に分離される。一般に、クラスターは、少なくとも、SDSを有するものと同様にMR法を使用して分離される。
比較の第二のセットが図３に供される。MaxRatioは、明確に変動を減少させ、対立遺伝子の識別を容易にするよりクリーンなシグナル（より密なクラスタリング）を与える。アッセイ条件は、SDSに対して最適化され、maxratio解析に対して最適化されないことに注意すべきである。maxratioに対してアッセイを最適化することにより、さらにクリーンな結果が得られると考えられる。
本明細書に記載の実施例および実施態様は例示の目的のためのものであり、それに照らした種々の変更または変化が、本明細書における教唆により当業者に提案され、本願の精神および範囲、ならびに請求項の範囲内に含まれるであろうことが理解される。
本明細書に引用される、または本出願とともに提出され、情報開示陳述書(Information Disclosure Statement)の一部として提出されるいずれかの引用文献を含む全ての出版物、特許、および特許出願は、その全体が参照して取り込まれる。
本明細書に記載の実施例および実施態様は例示の目的ののみためのものであり、それに照らした種々の変更または変化が、当業者に提案され、本願の精神および範囲、ならびに添付の請求項の範囲内に含まれるであろうことが理解される。本明細書に引用される、全ての出版物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために、その全体が参照して取り込まれる。

Claims (70)

  1. 2つ以上の異なる対立遺伝子を識別する方法であって、前記方法が、
    単一のサンプルから2つ以上の異なる対立遺伝子を増幅する試薬を含む、1つ以上の増幅反応物からデータを提供する工程であって、前記データが、増幅反応における各対立遺伝子の増幅度を示す連続した振幅シグナル測定値、ならびに増幅反応における時間点の多重度に対する増幅シグナルが測定される増幅反応中の時間点を含む、工程；
    前記データの効率関連変換を決定する工程であって、前記反応における増幅の効率に関連する振幅測定を効率関連変換が提供する、工程；
    各対立遺伝子に対して決定される最大強度の効率関連変換である、各対立遺伝子に対する効率関連値を決定する工程；ならびに
    各対立遺伝子に対する効率関連値を、ディスプレー、プリンター、または記憶媒体に出力する工程であって、各対立遺伝子に対する効率関連値の相対的振幅が、前記サンプル中の前記対立遺伝子それぞれの存在の指標である、工程
    を含む、方法。
  2. 2つ以上の異なる対立遺伝子を増幅する前記試薬が、単一の増幅反応物中に存在する、請求項１に記載の方法。
  3. 異なる複数の対立遺伝子を増幅する試薬を各増幅反応物が含むように、2つ以上の異なる対立遺伝子を増幅する前記試薬が分配されている、請求項１に記載の方法。
  4. 異なる1種類の対立遺伝子を増幅する試薬を各増幅反応物が含むように、2つ以上の異なる対立遺伝子を増幅する前記試薬が分配されている、請求項１に記載の方法。
  5. 前記提供が、PCR反応からデータファイルを読み取ることを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記提供が、PCR反応をリアルタイムでモニタリングすることを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 増幅反応における時間点を、サイクル数において測定する、請求項１に記載の方法。
  8. 増幅反応における時間点を、反応時間において測定する、請求項１に記載の方法。
  9. 前記増幅が、少なくとも3つの異なる対立遺伝子を増幅することを含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記増幅が、少なくとも5つの異なる対立遺伝子を増幅することを含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記対立遺伝子が、遺伝子の第一の対立遺伝子に由来する第一の核酸、および前記遺伝子の第二の対立遺伝子に由来する第二の核酸を含む、請求項１に記載の方法。
  12. 出力が、前記サンプルが前記第一の対立遺伝子のホモ接合体であるか、前記第二の対立遺伝子のホモ接合体であるか、または両方の対立遺伝子のヘテロ接合体であるかを示す出力情報を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 効率関連変換が、シグナル測定値の比率変換、シグナル測定値のシフト比率変換、シグナル測定値の一次導関数、連続したシグナル測定値間の差異、およびシグナル測定値の対数の傾きまたは勾配からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  14. 効率関連変換(ERT)が、
    (a) ERT = (Signaln+1/Signaln) -1、または
    (b) ERT = (Signaln/Signaln-1) -1
    として算出される、請求項１に記載の方法。
    ［前記式中、Signalnはサイクル数nにおいて生成されるシグナルであり、Signaln+1はそれに続くサイクル数において生成されるシグナルであり、Signaln- 1はその直前のサイクル数において生成されるシグナルであり、かつ、式(a)に対してnは1から反応において解析される増幅サイクルの数までの範囲にあり、かつ式(b)に対してnは2から反応において解析される増幅サイクルの数-1までの範囲にある］
  15. 効率関連値が、シグナル測定値の対数の最大勾配である、請求項１に記載の方法。
  16. 効率関連値が、シグナル測定値の最大比である、請求項１に記載の方法。
  17. 効率関連値が、シグナル測定値の最大一次導関数である、請求項１に記載の方法。
  18. 付加的なシグナル値を、シグナル測定値の間における点を補間することにより生成する、請求項１に記載の方法。
  19. 前記付加的なシグナル値を、シグナル測定値の間における点を三次スプラインを使用して補間することにより生成する、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記効率関連変換が、前記増幅反応における時間またはサイクル数の測定をさらに提供する、請求項１、１３または１４に記載の方法。
  21. 最大強度の効率関連変換が生じる部分サイクル数または時間である反応点を算出する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 調節反応点を算出する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  23. 調節反応点が、反応点から効率関連値の底が2の対数を引いたものに等しい、請求項２２に記載の方法。
  24. 調節反応点が、反応点から、バックグラウンドより高いシグナル強度の底が2の対数を引いたものに等しい、請求項２２に記載の方法。
  25. 最大強度である各対立遺伝子に対する効率関連値の前記決定が、時間またはサイクル数の関数として効率関連変換におけるピークを同定することを含む、請求項１、１３または１４に記載の方法。
  26. 前記ピークの幅を決定する工程；
    ピークの幅と、受容可能なピーク幅の選択範囲とを比較する工程；ならびに、
    決定されたピーク幅が、受容可能なピーク幅の選択範囲より大きいまたは小さい場合、ディスプレー、プリンターまたは記憶媒体、および測定器に、核酸増幅反応をおそらく異常であると同定するように出力する工程
    をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. ピーク幅を、効率関連値の反応点値において、またはその前に発生する効率関連変換のみを使用して算出する、請求項２６に記載の方法。
  28. 増幅する対立遺伝子の一つの全てまたは一部に相補的であるFRETプローブを含む一連のプローブとともに増幅反応を実行する、請求項１に記載の方法。
  29. 増幅する対立遺伝子の一つの全てまたは一部に相補的である分子ビーコンを含む一連のプローブとともに増幅反応を実行する、請求項１に記載の方法。
  30. 前記データの提供が、前記データを含むデータファイルを読み取る、ネットワーク結合またはフィードよりデータを受信する、ならびにリアルタイムにおける増幅反応より前記データを受信することからなる群より選択される様式を含む、請求項１に記載の方法。
  31. 方法を機械が実行する命令を提供する、機械で読み取り可能な媒体であって、前記方法が、
    単一のサンプルから2つ以上の異なる対立遺伝子を増幅する試薬を含む1つ以上の増幅反応物からデータを受信する工程であって、前記データが、増幅反応における各対立遺伝子の増幅度を示す連続した振幅シグナル測定値、ならびに増幅反応における時間点の多重度に対する振幅シグナルが測定される増幅反応中の時間点を含む、工程；
    前記反応における増幅効率に関連する振幅測定を、効率関連変換が提供する、前記データの前記効率関連変換を測定する工程；
    各対立遺伝子に対して決定された最大強度の効率関連変換である、各対立遺伝子に対する効率関連値を決定する工程；ならびに
    各対立遺伝子に対する効率関連値を、ディスプレー、プリンター、または記憶媒体に出力する工程であって、各対立遺伝子に対する効率関連値の相対的振幅が、前記サンプル中の前記対立遺伝子の存在の指標である、工程
    を含む、媒体。
  32. 前記データが、単一増幅反応物に由来する、請求項３１に記載の媒体。
  33. 前記データが、2つ以上の増幅反応に由来し、各反応が異なる対立遺伝子を増幅する、請求項３１に記載の媒体。
  34. 前記データが、2つ以上の増幅反応に由来し、各反応が単一の対立遺伝子を増幅する、請求項３１に記載の媒体。
  35. 増幅反応における時間点を、サイクル数において測定する、請求項３１に記載の媒体。
  36. 増幅反応における時間点を、反応時間において測定する、請求項３１に記載の媒体。
  37. 前記増幅が、少なくとも3つの異なる対立遺伝子を増幅することを含む、請求項３１に記載の媒体。
  38. 前記増幅が、少なくとも5つの異なる対立遺伝子を増幅することを含む、請求項３１に記載の媒体。
  39. 前記対立遺伝子が、遺伝子の第一の対立遺伝子に由来する第一の核酸、および前記遺伝子の第二の対立遺伝子に由来する第二の核酸を含む、請求項３１に記載の媒体。
  40. 出力が、前記サンプルが前記第一の対立遺伝子のホモ接合体であるか、前記第二の対立遺伝子のホモ接合体であるか、あるいは両方の対立遺伝子のヘテロ接合体であるかを示す出力情報を含む、請求項３９に記載の媒体。
  41. 効率関連変換が、シグナル測定値の比率変換、シグナル測定値のシフト比率変換、シグナル測定値の一次導関数、連続したシグナル測定値間の差異、およびシグナル測定値の対数の傾きまたは勾配からなる群より選択される、請求項３１に記載の媒体。
  42. 効率関連変換(ERT)が、
    (a) ERT = (Signaln+1/Signaln) -1、または
    (b) ERT = (Signaln/Signaln-1) -1
    として算出される、請求項３１に記載の媒体。
    ［前記式中、Signalnはサイクル数nにおいて生成されるシグナルであり、Signaln+1はそれに続くサイクル数において生成されるシグナルであり、Signaln- 1はその直前のサイクル数において生成されるシグナルであり、かつ、式(a)に対してnは1から反応において解析される増幅サイクルの数までの範囲にあり、かつ式(b)に対してnは2から反応において解析される増幅サイクルの数-1までの範囲にある］
  43. 効率関連値が、シグナル測定値の対数の最大勾配である、請求項３１に記載の媒体。
  44. 効率関連値が、シグナル測定値の最大比である、請求項３１に記載の媒体。
  45. 効率関連値が、シグナル測定値の一次導関数の最大値である、請求項３１に記載の媒体。
  46. 付加的なシグナル値を、シグナル測定値の間における点を補間することにより生成する、請求項３１に記載の媒体。
  47. 前記付加的なシグナル値を、シグナル測定値の間における点を三次スプラインを使用して補間することにより生成する、請求項４６に記載の媒体。
  48. 前記効率関連変換が、増幅反応における時間またはサイクル数の測定をさらに提供する、請求項３１、４１または４２に記載の媒体。
  49. 前記方法が、最大強度の効率関連変換が生じる部分サイクル数または時間である反応点を算出する工程をさらに含む、請求項３１に記載の媒体。
  50. 前記方法が、調節反応点を算出する工程をさらに含む、請求項３１に記載の媒体。
  51. 調節反応点が、反応点から効率関連値の底が2の対数を引いたものに等しい、請求項５０に記載の媒体。
  52. 調節反応点が、反応点から、バックグラウンドより高いシグナル強度の底が2の対数を引いたものに等しい、請求項５０に記載の媒体。
  53. 最大強度である各対立遺伝子に対する効率関連値の前記決定が、時間またはサイクル数の関数としての効率関連変換におけるピークを同定することを含む、請求項３１、４１または４２に記載の媒体。
  54. 前記ピークの幅を決定する工程；
    ピークの幅と、受容可能なピーク幅の選択範囲とを比較する工程；ならびに、
    決定されたピーク幅が、受容可能なピーク幅の選択範囲より大きいまたは小さい場合、ディスプレー、プリンターまたは記憶媒体、および測定器に、核酸増幅反応をおそらく異常であると同定するように出力する工程
    をさらに含む、請求項５３に記載の媒体。
  55. ピーク幅を、効率関連値の反応点値において、またはその前に発生する効率関連変換のみを使用して算出する、請求項５４に記載の媒体。
  56. 増幅する対立遺伝子の一つの全てまたは一部に相補的であるFRETプローブを含む一連のプローブとともに増幅反応を実行する、請求項３１に記載の媒体。
  57. 増幅する対立遺伝子の一つの全てまたは一部に相補的である分子ビーコンを含む一連のプローブとともに増幅反応を実行する、請求項３１に記載の媒体。
  58. 前記受信が、オペレーター、またはコンピューターで読み取り可能な媒体から増幅データの受信をすること含む、請求項３１に記載の媒体。
  59. 前記受信が、PCR反応からデータファイルを読み取ることを含む、請求項３１に記載の媒体。
  60. 前記受信が、ネットワークから増幅データを受信することを含む、請求項３１に記載の媒体。
  61. 前記受信が、以前に収集した増幅データを受信することを含む、請求項３１に記載の媒体。
  62. 前記受信が、生成したときの増幅データを受信することを含む、請求項３１に記載の媒体。
  63. 核酸増幅システムの一部分である、請求項３１に記載の媒体。
  64. 磁気媒体、フラッシュメモリー、光学メモリー、DRAM、およびSRAMからなる群より選択される、請求項３１に記載の媒体。
  65. 核酸増幅を実行し、反応の時間点および２つ以上の異なる対立遺伝子の増幅強度の測定値を含む出力シグナルを提供するための装置、
    前記装置に連動して作働するプロセッサー、
    請求項３１から６４のいずれか一項に記載の、機械で読み取り可能な媒体
    を含むシステム。
  66. 前記プロセッサーがまた、前記装置により実行される増幅反応も制御する、請求項６５に記載のシステム。
  67. 前記プロセッサーが、前記装置により実行される増幅反応を制御しない、請求項６５に記載のシステム。
  68. 前記対立遺伝子が単一ヌクレオチド多型を含む、請求項１に記載の方法。
  69. 前記対立遺伝子が単一ヌクレオチド多型を含む、請求項３１に記載の媒体。
  70. 前記対立遺伝子が単一ヌクレオチド多型を含む、請求項６５に記載のシステム。
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