ES2289264T3 - Redes que contienen proteinas citosolicas accesorias inmovilizadas sobre una superficie y procedimientos asociados. - Google Patents

Abstract

Una matriz que comprende una superficie que tiene unida a la misma al menos una proteína accesoria citosólica de una proteína de membrana seleccionada de canales de iones, receptores acoplados a proteína G y proteínas transportadoras transmembrana, en la que dicha proteína accesoria citosólica está libre de componentes de proteínas de membrana u otras subunidades de dicho canal de iones, receptor acoplado a proteína G o complejo de proteínas transportadoras transmembrana.

Description

Redes que contienen proteínas citosólicas accesorias inmovilizadas sobre una superficie y procedimientos asociados.

La presente invención se refiere a ciertas matrices de proteínas y a su uso en procedimientos de selección.

Una multitud de procesos de señalización celular y homeostáticos están mediados por proteínas transmembrana tales como canales de iones, receptores y transportadores. Todas estas clases de proteínas se conectan con proteínas de señalización, reguladoras, de andamiaje y adaptadoras a través de interacciones proteína-proteína que implican dominios citoplasmáticos.

Los canales de iones, los receptores de unión a membrana tales como receptores acoplados a proteína G y muchos transportadores de la superficie de la célula están comprendidos de complejos de subunidades de proteínas, que están constituidos por montajes homoméricos o heteroméricos de subunidades (denominados en este documento proteínas accesorias) sobre la cara citoplasmática de la membrana. La capacidad de estos grupos de proteínas para formar complejos de un modo combinatorio proporciona un mecanismo para la expresión específica de tejidos de complejos de proteína transmembrana con las propiedades biofísicas requeridas o la sensibilidad moduladora. Los determinantes de las interacciones de subunidades están localizándose cada vez más para definir dominios dentro de estas estructuras de subunidades. El entendimiento de las interacciones de estos dominios ayudará en la aclaración del montaje de proteínas de membrana en sistemas nativos e identificará proteínas moduladoras importantes para la función de la proteína dentro de una célula. Además, la sabiduría percibida dentro de estos campos de investigación reconoce que perturbar la interacción entre las subunidades citoplasmáticas accesorias y la parte unida a la membrana de una proteína transmembrana, una vez se ha identificado, podría representar un tejido sumamente selectivo y por tanto una ruta específica para regular la actividad de la molécula unida a la membrana. De ahí que los inhibidores exógenos de interacciones de proteínas accesorias y por tanto el montaje de subunidades o proteínas moduladoras puedan proporcionar dianas terapéuticas novedosas específicas para tejidos.

Los canales de potasio (Kv) dependientes del voltaje y los canales de calcio (Ca^{2+}) se reconocen como importantes dianas terapéuticas en muchos trastornos que incluyen aquellos del SNC, corazón, pulmones y vejiga. Ambos tipos de canales tienen una subunidad \alpha principal sensible al voltaje formadora de poros. Los canales Kv requieren el montaje de cuatro subunidades \alpha similares, conteniendo cada una seis segmentos transmembrana, mientras que los canales de calcio tienen una única subunidad \alpha con 24 segmentos transmembrana, empaquetados en cuatro "pseudosubunidades" de seis segmentos transmembrana [1]. Tanto los canales Kv como los Ca^{2+} ensamblan con subunidades \beta citoplasmáticas estructuralmente similares mediante dominios bien definidos dentro de la subunidad \alpha. Estos pueden afectar la dependencia de canales en diversas medidas y puede alterar espectacularmente la eficiencia de expresión de la superficie de subunidades \alpha mediante mecanismos que pueden parecerse a o imitar la interacción de proteínas de membrana con chaperonas moleculares auténticas [2]. Hasta la fecha se han identificado seis subunidades \beta para cada uno de los dos tipos de canales. Se ha determinado la capacidad de las subunidades \beta de los canales de Ca^{2+} para ensamblarse con las seis subunidades \alpha [3], pero las interacciones de las subunidades \beta del canal Kv con las aproximadamente veinte subunidades \alpha está peor establecida y todavía no se conoce en detalle que las combinaciones de las subunidades \beta y \alpha son de verdad biológicamente relevantes ya que los procedimientos de análisis actualmente disponibles son relativamente primitivos (véase más adelante).

Los receptores, en particular los receptores acoplados a proteína G, se reconocen como un grupo extremadamente importante de proteínas de la superficie de la célula y realizan una amplia variedad de funciones en muchos sistemas [4]. Estas 7-12 proteínas transmembrana están agrupadas en tres familias, A, B y C, dentro de las que hay muchos subtipos. Cada GPCR interactúa con al menos una proteína G en su cara citoplasmática, aunque la naturaleza e identidad de estas interacciones se entiende escasamente y es actualmente imposible de predecir a partir de la bioinformática. Las proteínas G, además de complejarse con GPCR, también interactúan con subunidades de canales de K^{+} y Ca^{2+} de un modo específico con resultados sorprendentes [5].

Las proteínas en la superficie de las células que permiten la entrada de moléculas voluminosas representan una tercera clase de proteínas de membrana, los transportadores, que se complejan con múltiples subunidades de proteínas citosólicas con el fin de funcionar, pero de nuevo aquí la naturaleza e identidad de estas interacciones está escasamente caracterizada en la actualidad debido a limitaciones en las metodologías de análisis actuales.

Las nuevas metodologías que permiten la caracterización in vitro sumamente paralela, que incluye la determinación de parámetros de unión de equilibrio y cinéticos, de interacciones de unión de subunidades de proteínas entre diversos componentes de subunidades supuestas será tremendamente útil en este campo, particularmente si también permiten la evaluación de la capacidad de compuestos potencialmente terapéuticos para modular tales interacciones. Los procedimientos actuales para estudiar estas interacciones se basan en engorrosas técnicas basadas en células tales como análisis electrofisiológico, o sistemas de unión in vitro de bajo rendimiento tales como ensayos de interacción de proteínas ("pull-down")/inmunoprecipitación. En comparación, la presente invención describe una procedimiento basado en matrices en el que la unión in vitro de dominios funcionales solubles de proteínas unidas a membranas, tales como canales de iones, receptores de la superficie de la célula y transportadores, a matrices de proteínas accesorias citoplasmáticas inmovilizadas puede caracterizarse en detalle. La invención permite determinar la afinidad y especificidad de unión de la interacción proteína-proteína que va a determinarse y también permite explorar las acciones de inhibidores/competidores de la interacción que van a explorarse en un sistema sumamente
paralelo.

Se ha usado el sistema de dos híbridos en levadura para detectar interacciones entre, por ejemplo, dominios de proteínas de canales de iones. Esta aproximación ha sido razonablemente útil para identificar dominios de unión y para determinar el efecto de sustituciones de aminoácidos en la interacción. Sin embargo, este procedimiento no puede proporcionar información cuantitativa sobre las afinidades de unión y no puede tratar el potencial de sustancias exógenas para modular las interacciones. Alternativamente se han usado los sistemas basados en células, por ejemplo electrofisiología de células completas seguida por expresión de subunidades en oocitos de Xenopus o líneas celulares de mamíferos, para estudiar el montaje de canales de iones. Esta aproximación es técnicamente difícil, intrínsecamente lleva mucho tiempo y proporciona información limitada sobre los acontecimientos de unión actuales debido a la medición de efectos posteriores, es decir, corrientes de células completas.

Se han usado procedimientos bioquímicos para aislar componentes individuales de montajes de canales de iones en sistemas nativos y recombinantes. Se han usado experimentos de co-inmunoprecipitación y purificación por afinidad de subunidades de canales para identificar componentes de complejos de canales de iones. Sin embargo, ningún procedimiento proporciona información detallada sobre afinidades de unión o es adecuado para seleccionar moduladores potenciales de interacciones de subunidades. En el caso de los canales de Ca^{2+}, los fragmentos de una subunidad \alpha particular se han inmovilizado sobre perlas de agarosa como fusiones a GST y la unión de las subunidades \beta traducidas in vitro se usó para definir más detenidamente la región específica de la subunidad \alpha implicada en la interacción [6]. En este estudio no se dispuso de información detallada sobre afinidades de unión y no está claro que la subunidad alfa se plegara correctamente en este estudio.

La unión por superposición de proteínas examina las interacciones de unión directamente entre un péptido soluble/proteína y una proteína diana inmovilizada sobre un soporte de membrana [7]. Durante este procedimiento, las proteínas se disocian inicialmente y se separan mediante SDS-PAGE y se transfieren a un filtro de nitrocelulosa como para inmunotransferencia de Western. Sin embargo, la etapa desnaturalizante implícita en este procedimiento sugiere que las proteínas ensayadas en esta técnica no pueden ser funcionales (es decir, plegarse) y por tanto biológicamente activas. Puede intentarse volver a naturalizar la proteína antes que se investigue la unión de una proteína marcada soluble; sin embargo, el porcentaje de éxito en este caso en escaso.

Se ha investigado la identificación de interacciones nativas entre proteínas de membrana y proteínas accesorias, y los dominios de unión implicados, usando diversos procedimientos basados en células. Por ejemplo, las combinaciones nativas de subtipos de canales Kv \alpha y \beta dentro de un complejo se han probado usando co-purificación con anticuerpos o toxinas específicas para subtipos [9, 10]. Los experimentos de dos híbridos en levadura se han usado ampliamente para identificar dominios de interacción proteína-proteína y, por ejemplo, se usaron para identificar la región del dominio T1 N-terminal de canales Kv que interactúa con las subunidades \beta citoplasmáticas [11]. Se ha investigado la capacidad de las proteínas para interactuar en una célula modelo usando técnicas de expresión recombinante. Ejemplos incluyen co-expresión de canales de iones dependientes del voltaje y caracterización funcional usando electrofisiología [3, 11, 12], y la expresión de GPCR quiméricos y mutantes [revisado en 13, 14]. La sabiduría percibida derivada de tales experimentos es que las subunidades \alpha y \beta forman un complejo estable en la ER que no se disocia posteriormente.

Se han estudiado las interacciones de unión entre dominios de proteínas de membrana y los dominios de otras subunidades o sus componentes citoplasmáticos, tras la expresión separada, usando ensayos de interacción de proteínas sobre una base uno a uno. De esta forma se han examinado los dominios de tetramerización de subunidades transmembrana de canales de K^{+} [15]. Se han examinado los dominios intracelulares de canales de Ca^{2+} que se unen a subunidades \beta [6] o proteínas SNARE [16], la unión de GPCR 5-HT_{2A} a arrestinas [17] y la unión del transportador CFTR que se une a la proteína adaptadora AP-2 [18] inmovilizando el dominio de la proteína de membrana sobre perlas. Alternativamente, la proteína Homer citoplasmática se ha inmovilizado sobre perlas para mostrar la interacción con receptores de glutamato metabotrópico expresado en un lisado de células [19]. Los experimentos de reticulación se han realizado entre CFTR y AP-2 en placas de microtitulación [18], pero en este caso no se inmovilizaron las proteínas. Los experimentos de superposición de proteínas permiten que se identifiquen simultáneamente varias interacciones de unión. Esta técnica se usó para mostrar la unión de INAD de Drosophila marcada a canales de Ca^{2+} TRP inmovilizados [20]. Esta técnica permite que varias proteínas se fraccionen en diferentes carriles de un gel de SDS-PAGE y luego se inmovilicen sobre un filtro de nitrocelulosa que va a probarse para la unión.

La naturaleza de las técnicas descritas anteriormente significa que el análisis de proteínas normalmente implica o la coexpresión del componente de interacción potencial, o implica la desnaturalización de uno o más de los componentes potenciales, antes del ensayo de unión. Siempre son de bajo rendimiento y no dan información detallada sobre la especificidad o afinidad de unión y generalmente no son compatibles con estudios de inhibidores de moléculas pequeñas. Para superar tales problemas, los inventores han ideado una matriz de proteínas accesorias separadas, y en gran medida, funcionales, que no se co-expresaron originalmente con los componentes de proteínas de membrana. Una matriz tal permite, por primera vez, la determinación cuantitativa de interacciones de un modo sumamente paralelo.

Por tanto, en un primer aspecto, la invención proporciona una matriz que comprende una superficie que tiene unida a la misma al menos una proteína accesoria citosólica libre de sus componentes de proteínas de membrana u otras subunidades con las que está normalmente complejada. Preferentemente, las proteínas accesorias citosólicas son proteínas accesorias citosólicas de proteínas de membrana que son miembros de una familia de proteínas de membrana homólogas. En una realización, la familia de proteínas de membrana homólogas se selecciona del grupo constituido por canales de iones, receptores acoplados a proteína G y proteínas transportadoras transmembrana.

Las proteínas accesorias sobre la matriz pueden ser miembros de una familia de proteínas accesorias homólogas, por ejemplo subunidades de canales de iones (por ejemplo, subunidades \beta), proteínas que interactúan con receptores (por ejemplo, proteínas G, arrestinas y cinasas de receptores de proteína G) o proteínas accesorias para transportadores (por ejemplo proteínas que interactúan con proteínas transportadoras). Particularmente, se prevén matrices en las que las proteínas accesorias son subunidades \beta de canales de K^{+}, subunidades \beta de canales de Ca^{2+}, subtipos de proteínas G, por ejemplo, G\alpha, G\beta/\gamma o proteínas accesorias para transportadores. Ejemplos incluyen subunidades \beta de Kv de canal, por ejemplo \beta 1.1, 1.2, 1.3, 2.1, 2.2, 3.1, 3.2, 4, subunidades \beta de canales de calcio, por ejemplo, \beta1a, \beta1b, \beta1c, \beta2a, \beta2b, \beta2c, \beta3a, \beta3b, \beta4, familias de proteínas G, por ejemplo la familia G_{s} (\alpha_{s} y \alpha_{olf}), familia G_{t}, familia G_{i} (\alpha_{o}, \alpha_{i1}-\alpha_{i13}, \alpha_{z}), familia G_{i-0}, familia G_{q-11} (\alpha_{q}, \alpha_{11}, \alpha_{14}, \alpha_{15}, \alpha_{16}, \alpha_{12}, \alpha_{13}) y familia sensorial de G_{\alpha} (\alpha_{t-rod}, \alpha_{gust}) y familia \beta\gamma (\gamma_{t}, \gamma_{1}, \gamma_{2}, \gamma_{3} etc.), o proteínas accesorias para proteínas transportadoras (por ejemplo proteínas transportadoras de seratonina y glicina).

El número de proteínas unido a las matrices de la invención se determinará, al menos hasta un cierto punto, mediante el número proteínas que se producen naturalmente o que son de suficiente interés experimental comercial o clínico. Una matriz que lleva una o dos proteínas sería de utilidad para el investigador. Sin embargo, en la práctica y con el fin de aprovecharse de la idoneidad de tales matrices para ensayos de alto rendimiento, se prevé que de 1 a 10000, 1 a 1000, 1 a 500, 1 a 400, 1 a 300, 1 a 200, 1 a 100, 1 a 75, 1 a 50, 1 a 25, 1 a 10 o 1 a 5 de tales proteínas están presentes sobre una matriz.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un procedimiento para determinar qué proteínas accesorias citosólicas interactúan con una proteína de membrana dada o viceversa, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(i) proporcionar una matriz de proteínas accesorias citosólicas candidatas libres de sus componentes de proteínas de membrana u otras subunidades con las que están normalmente complejadas de una o más familias de proteínas accesorias citosólicas de interés;

(ii) poner en contacto la matriz con fragmentos citosólicos de dicha proteína de membrana y/o fragmentos citosólicos de otros miembros de familias de proteínas de membrana relacionados; y

(iii) detectar e identificar los componentes que interactúan.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para seleccionar compuestos o péptidos o proteínas para determinar la capacidad para interactuar selectivamente con una proteína accesoria citosólica, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(i) proporcionar una matriz de proteínas accesorias citosólicas libres de sus componentes de proteínas de membrana u otras subunidades con las que están normalmente complejadas de una o más familias de proteínas citosólicas de interés;

(ii) poner en contacto la matriz con compuestos o péptidos o proteínas; y

(iii) identificar los componentes que interactúan.

Este procedimiento comprende opcionalmente la etapa adicional (iv) de cuantificar la interacción de los componentes que interactúan.

También se proporciona un procedimiento para seleccionar compuestos o péptidos o proteínas para determinar la capacidad para modular selectivamente la interacción entre una proteína accesoria citosólica y una proteína de membrana, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

(i) proporcionar una matriz de proteínas accesorias citosólicas libres de sus componentes de proteínas de membrana u otras subunidades con las que están normalmente complejadas de una o más familias de proteínas de interés;

(ii) poner en contacto la matriz con compuestos o péptidos o proteínas y con una o más proteínas de membrana o fragmentos citosólicos de las mismas de interés, o simultáneamente o sucesivamente; y

(iii) determinar si dicha interacción está modulada por la presencia de dichos compuestos o péptidos o proteínas.

Este procedimiento comprende opcionalmente la etapa adicional (iv) de cuantificar el grado de modulación de la interacción.

La invención también proporciona el uso de una matriz de proteínas accesorias citosólicas de la invención para medir la actividad catalítica relativa de diferentes miembros de una familia de proteínas accesorias.

La invención también proporciona el uso de una matriz de proteínas accesorias citosólicas de la invención como una superficie de afinidad sobre la que seleccionar anticuerpos de una biblioteca de anticuerpos ligados a fenotipos-genotipos (por ejemplo anticuerpos de expresión en fagos).

La invención también proporciona el uso de una matriz de proteínas accesorias citosólicas de la invención para determinar el efecto de modificaciones post-translacionales en las interacciones de proteínas accesorias con proteínas de membrana y/o las propiedades de dichas proteínas de membrana o proteínas accesorias.

Las matrices de subunidades según la invención pueden comprender constructos de proteínas marcadas que están cada uno marcado e inmovilizado de una manera funcional en un formato espacialmente definido. Los constructos de proteínas marcadas pueden sacarse de grupos de subunidades de proteínas accesorias tales como las subunidades \beta auxiliares citoplasmáticas de canales de iones K^{+} o Ca^{2+} dependientes del voltaje, proteínas G, o proteínas accesorias globulares que interactúan con transportadores voluminosos. La unión de una sonda marcada, que puede ser otra subunidad de canal, proteína de asociación, dominio de interacción, péptido u otros ligandos potenciales, puede investigarse usando protocolos técnicamente sencillos con un alto rendimiento. También puede examinarse la unión de mezclas de complejos o proteínas marcadas o no marcadas de sistemas recombinantes o lisados celulares. Una matriz de subunidades idénticas es adecuada para seleccionar grandes números de componentes de unión potencial y obtener información de unión detallada. Alternativamente, una matriz de proteínas diferentes, que representan subunidades de diferentes subtipos y especies, es la más adecuada para examinar la especificidad de unión de
ligandos.

Tales matrices pueden usarse para estudiar canales de iones, que incluye la clase de receptores de canales de iones dependientes de ligandos que existen como complejos de múltiples subunidades, que están constituidos por subunidades formadoras de canales, proteínas moduladoras y proteínas implicadas en la localización subcelular del canal. Las interacciones entre subunidades de canales pueden mediarse mediante dominios intracelulares definidos. Los canales de K^{+} y Ca^{2+} dependientes del voltaje se ensamblan con subunidades \beta citoplasmáticas estructuralmente similares mediante dominios bien definidos dentro de la subunidad \alpha [7, 21, 22]. Estos pueden afectar la dependencia del canal en varias medidas y pueden alterar espectacularmente la eficiencia de la expresión de superficies de subunidades \alpha mediante mecanismos que pueden parecerse a o imitar la interacción de proteínas de membrana con chaperonas moleculares auténticas [2].

Otra aplicación de las matrices de la invención está en el estudio de receptores, por ejemplo receptores acoplados a proteína G (GPCR). Estos constituyen la mayor familia de moléculas de la superficie de la célula implicadas en la transmisión de señales, con más de 1000 proteínas heptahelicoidales identificadas en el genoma humano. Los GPCR transducen señales extracelulares mediante la activación de un subconjunto de proteínas G triméricas. Los sitios de unión pueden determinarse para componentes de proteínas GPCR-G específicos tales como rodopsina y la transducina de la proteína G de retina [23]. Sin embargo, los determinantes de unión de los GPCR no forman dominios diferenciados y es difícil predecir el subconjunto de proteínas G al que se unirá un receptor [24]. Sería sumamente ventajoso un procedimiento basado en matrices para determinar tales interacciones con el mayor número de GPCR huérfanos actualmente en investigación. Los efectos de GPCR se modulan, por ejemplo, mediante interacciones y unión con cinasas de receptores acoplados a proteína G (GRK) y arrestinas, que conducen a disminución de la sensibilidad e internalización de receptores [25]. Se ha demostrado que la interacción con arrestina es suficientemente fuerte para detectarse mediante co-inmunoprecipitación [17] y puede inhibirse mediante péptidos sintéticos [26]. Como tal, es un diana potencial para la investigación usando un procedimiento de unión in vitro.

Otra aplicación de las matrices de la invención es en el estudio de proteínas transportadoras transmembrana. Estas proteínas controlan la captación selectiva de nutrientes y exportación de productos metabólicos, regulan el equilibrio de iones y solutos entre el exterior y el interior de las células y modulan la transmisión sináptica mediante la eliminación de neurotransmisores de la hendidura sináptica. Un mecanismo regulador muy importante para estas proteínas implica la translocalización a y de membranas celulares. Sin embargo, la evidencia está revelando que también se produce la regulación mediante la interacción proteína-proteína con transportadores localizados en la membrana celular. Por ejemplo, la unión in vitro dependiente de la fosforilación entre la enzima transportadora IICB^{Glc} de E. coli unida a la membrana y el represor Mlc global ha indicado un mecanismo de control transcripcional [27]. También se ha demostrado la unión de un dominio terminal en C del transportador de glucosa GLUT-1 a una proteína reguladora transmembrana, estomatina, mediante cromatografía de afinidad en columna [28].

El término "matriz" como se define en este documento se refiere a una disposición espacialmente definida de uno o más restos de proteínas en un modelo sobre una superficie. Preferentemente, los restos de proteínas están unidos a la superficie bien directa o indirectamente. La unión puede ser no específica (por ejemplo mediante absorción física sobre la superficie o mediante formación de una interacción covalente no específica). En una realización preferida, los restos de proteínas están unidos a la superficie mediante un resto marcador común ligado a cada proteína, por ejemplo como se describe en el documento WO01/57198.

Por tanto, por ejemplo, cada posición en el modelo puede contener una o más copias de:

a) una muestra de un único tipo de proteína (en forma de un monómero, dímero, trímero, tetrámero o multímero superior);

b) una muestra de un único tipo de proteína unido a una molécula que interactúa (por ejemplo ADN, anticuerpo, otra proteína);

c) una muestra de un único tipo de proteína unido a una molécula sintética (por ejemplo péptido, compuesto químico); o

d) una mezcla heterómera de 2 o más proteínas de una familia de proteínas accesorias dada.

La superficie que soporta la matriz puede recubrirse/derivatizarse, por ejemplo, mediante tratamiento químico. Ejemplos de superficies adecuadas incluyen portaobjetos de vidrio, polipropileno o poliestireno, sílice, soporte de oro o metal o membranas hechas de, por ejemplo, nitrocelulosa, PVDF, nailon o fosfocelulosa. El formato de la matriz puede ser el de una placa de micropocillos o una micromatriz.

El uso de un formato de matrices de proteínas según la invención tiene muchas ventajas. Por ejemplo, una matriz de componentes de un montaje de proteínas de membrana, tal como subunidades auxiliares, proteínas asociadas y dominios de subunidades de canales, permite interacciones con componentes de unión en la fase de disolución que va a examinarse. Los parámetros de unión pueden determinarse con exactitud y los efectos de moduladores o inhibidores de unión pueden estudiarse de un modo sumamente paralelo.

Varias publicaciones recientes [por ejemplo la referencia 8] han mostrado que las matrices de proteínas funcionales permiten que los miembros individuales de una matriz puedan seleccionarse simultáneamente en condiciones idénticas. Esto permite experimentos sumamente paralelos y rápidos en comparación con otras técnicas, que conducen a resultados directamente comparables a través de muchas proteínas. Estas cualidades diferencian matrices de proteínas de otros ensayos para la función de proteínas, tal como Y2H e inmunoprecipitaciones/interacciones de proteínas, en los que la compartimentación celular que es implícita en estos otros procedimientos divide eficazmente cada grupo de proteínas en proteínas individuales y, por tanto, ensayos individuales.

Las matrices de proteínas según la invención pueden conservar la actividad funcional de proteínas cuando están específicamente inmovilizadas, permitiendo medir directamente la actividad biológica. Además, proporcionan un procedimiento directo para determinar el efecto de potenciales entidades inhibidoras en las interacciones observadas que no es posible de un modo comparable usando inmunoprecipitaciones y ensayos de interacción de proteínas.

Las matrices de proteínas según la invención pueden usarse para cuantificar constantes de unión (K_{d}) para interacciones observadas y también permiten la concentración de un compuesto requerido para inhibir una interacción dada que va a medirse a través de la determinación de valores de CI_{50}.

Los resultados obtenidos a partir de la interrogación de matrices de la invención pueden ser cuantitativos (por ejemplo midiendo las constantes de unión o catalíticas K_{D} y K_{M}), semicuantitativos (por ejemplo normalizando la cantidad unida frente a la cantidad de proteína) o cualitativos (por ejemplo funcional frente a no funcional). Mediante la cuantificación de las señales para duplicar matrices en las que el ligando se añade a varias concentraciones (por ejemplo, dos o más), pueden determinarse tanto las afinidades de unión como las concentraciones activas de proteína en el punto. Por ejemplo, los resultados cuantitativos K_{D} y B_{máx}, que describen la afinidad de la interacción entre el ligando y la proteína y el número de sitios de unión para ese ligando, respectivamente, pueden derivarse de los datos de la matriz de proteínas. Brevemente, las cantidades o cuantificadas o relativas de ligando unido a cada punto de proteína individual pueden medirse a diferentes concentraciones de ligando en la disolución de ensayo. Suponiendo una relación lineal entre la cantidad de proteína y ligando unido, la cantidad (relativa) de ligando unida a cada punto respecto a un intervalo de concentraciones de ligandos usadas en el ensayo puede ajustarse a la ecuación 1, reorganizaciones o derivaciones.

(Ecuación 1)Ligando\ unido = B_{máx.} / ((K_{D}/[L])+1)

[L] = concentración de ligando usada en el ensayo

Los inventores han producido una matriz funcional de proteínas accesorias de proteínas de membrana para proporcionar una herramienta para la rápida investigación de parámetros de unión y especificidad de ligandos. Los ligandos pueden ser otras proteínas, tales como dominios de unión de otras subunidades de proteínas de membrana, péptidos o potenciales compuestos terapéuticos para modular el montaje de complejos. La metodología proporciona la determinación de constantes de unión precisas en un formato sumamente paralelo.

La invención se describirá además mediante el siguiente ejemplo que se refiere a las siguientes figuras en las que:

La fig. 1 muestra inmunoensayos de lisados brutos de subunidades \beta. 10 \mul de lisado bruto y lisado purificado de cada uno de los clones que expresan subunidades \beta se realizaron usando SDS-PAGE. Los geles se transfirieron y las membranas se sondearon con estreptavidina (A) y anticuerpo anti-His (B). Se cargaron los carriles: 1 y 2 \beta1 humana, 3 y 4 \beta2 humana, 5 y 6 \beta3 humana, 7 y 8 \beta1 de rata, 9 y 10 \beta2 de rata, 11 y 12 \beta3 de rata. Carriles impares -lisado bruto, carriles pares - lisado purificado;

la fig. 2 muestra SDS-PAGE de subunidades \beta de Kv purificadas. Los carriles 1 y 8 marcadores Mr, 2 \beta1 humana, 3 \beta2 humana, 4 \beta3 humana, 5 \beta1 de rata, 6 \beta2 de rata, 7 \beta3 de rata;

la fig. 3 muestra espectros de absorbancia UV-visible de subunidades \beta de Kv humanas y de rata purificadas. Leyenda: azul; \beta1 humana, rosa; \beta2 humana, amarillo; \beta3 humana, cian; \beta1 de rata, púrpura; \beta2 de rata, marrón; \beta3 de rata. La inserción muestra en más detalle el pico a 360 nm;

la fig. 4 muestra un ensayo de co-precipitación de la subunidad \beta de Kv. A; se añadieron lisados de la subunidad \beta de Kv a perlas anti-FLAG recubiertas de la subunidad \beta de Kv (carriles 7-12) y a perlas anti-FLAG sin recubrir (carriles 1-6). Después de la incubación durante 1 h, las perlas se lavaron y se llevaron a ebullición en tampón de muestra de SDS antes de realizarse SDS-PAGE. El gel se transfirió a membrana de nitrocelulosa y las subunidades \beta de Kv biotiniladas se visualizaron usando un conjugado de estreptavidina-HRP. B; las bandas del inmunoensayo se cuantificaron y se representaron;

la fig. 5 muestra la inmovilización de subunidades \beta de Ky en placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina. Los lisados de subunidades \beta de Ky (concentración original de aproximadamente 3,5 mg/ml) se diluyeron en series y se añadieron a pocillos de una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina. Después del lavado para eliminar la proteína sin unir, las subunidades \beta de Ky se cuantificaron usando un anticuerpo anti-His marcado con Cy3. El anticuerpo unido se cuantificó mediante fluorometría en un lector de placa de microtitulación de fusión Packard equipado con filtros de excitación y emisión a 550 y 570 nm, respectivamente;

la fig. 6 muestra de unión de dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv a la matriz de placas de microtitulación de subunidades \beta de Ky. El lisado dominio T1 de las subunidades \alpha bruto diluido se añadió a cada pocillo de una matriz de placas de microtitulación de subunidades \beta de Ky. Después de la incubación, los pocillos se lavaron para eliminar el dominio T1 no unido de las subunidades \alpha de Kv. El dominio T1 restante de las subunidades \alpha de Kv unido se midió usando la marca FLAG y anticuerpos anti-FLAG y se visualizó usando un anticuerpo secundario conjugado a HRP y sustrato colorimétrico;

la fig. 7 muestra las curvas de unión para el péptido SPL2 a la matriz de subunidades \beta de Kv. El péptido SPL2 se unió a la matriz de subunidades \beta de Kv. Después de lavar la cantidad restante unida a la matriz se cuantificó mediante fluorometría. Los datos se han ajustado a curvas de unión. Triángulos azules; \beta1 de Kv de rata, cuadrados negros; \beta2 de Kv de rata, cuadrados rosas abiertos; \beta3 de Kv de rata, estrellas rojas; \beta1 de Kv humana, círculos verdes; \beta2 de Kv humana, círculos cian abiertos; \beta3 de Kv humana;

la fig. 8 muestra la inhibición de la unión del péptido a la matriz de subunidades \beta de Ky mediante el dominio T1 de las subunidades \beta de Kv. El péptido SPL2 se añadió a aproximadamente K_{d} a pocillos de matriz de subunidades \beta de Ky en presencia y ausencia del dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv purificado. Después de lavar, el péptido SPL2 unido se cuantificó mediante fluorometría;

la fig. 9 muestra la detección de anticuerpos de subunidades \beta de Kv en micromatrices. Todas las subunidades \beta de Kv podrían detectarse usando anticuerpo anti-His marcado con Cy3.

la fig. 10 muestra el dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv unido a subunidades \beta de Ky en micromatrices. Una micromatriz de subunidades \beta de Ky se incubó con lisado del dominio T1 de las subunidades \beta de Kv. Después de lavar el dominio T1 de las subunidades \beta de Kv unido a la subunidad \beta podría detectarse usando un anticuerpo anti-FLAG e IgG anti-ratón marcada con Cy3.

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Ejemplo 1

Los canales de potasio (Kv) dependientes del voltaje se reconocen como dianas terapéuticas en muchos trastornos que incluyen aquellos del SNC, corazón, pulmones y vejiga. Por tanto, son importantes dianas terapéuticas y comerciales. Están constituidos por un conjunto tetrámero de subunidades \alpha que tienen seis dominios que atraviesan la membrana y se acoplan a un montaje de subunidades \beta reguladoras citoplasmáticas.

Hasta la fecha, la clonación molecular ha identificado al menos 23 productos génicos diferentes que codifican subunidades \alpha de canales Kv. Además, la diversificación que resulta del corte y empalme alternativo se ha demostrado para varias subunidades \alpha. Cuatro familias de subunidades Kv formadoras de canales, Kv1 a Kv4, se derivan de los canales de potasio de Drosophila, Shaker, Shab, Shaw y Shal, respectivamente. Cada uno de estos tipos de canales tiene múltiples miembros de subfamilias. Se han identificado otras cuatro familias de canales Kv, Kv5, Kv6, Kv8 y Kv9, que no forman canales funcionales solos. Sin embargo, pueden combinarse con las subunidades formadoras de canales para formar canales funcionales con propiedades biofísicas alteradas. Al menos dos de estas familias de subunidades \alpha auxiliares (Kv6 y Kv9) tienen múltiples miembros de subfamilias.

Además de la diversidad molecular proporcionada por la tetramerización homomérica y heteromérica de las subunidades \alpha de canales Kv, las subunidades \beta citoplasmáticas pueden unirse al complejo de canales y modular la cinética de los canales o la expresión de la superficie de la célula. Hasta la fecha se han identificado tres familias, \beta1 de Kv a \beta3 de Kv, con 3 variantes de corte y empalme observadas del gen Kv\beta1. El complejo de subunidades \beta se une a una región del extremo N de la subunidad \alpha conocida como el dominio T1 y la presencia de la subunidad aumenta la expresión de la superficie de la célula del canal de iones. También se ha establecido otro papel adicional para las subunidades \beta1 de Kv en la modulación de la cinética dependiente de canales.

Matriz de subunidades \beta de Kv Materiales y Procedimientos para la construcción de matriz de subunidades \beta de Kv Clonación de ADNc de subunidades \beta de Ky marcadas con His y biotina

Los ADNc de dominios centrales de subunidades \beta1, \beta2 y \beta3 de Kv de rata y humanas se ligaron en un vector de expresión de E. coli aguas debajo de la secuencia que codifica una marca de polihistidina y el dominio BCCP del gen AccB de E. coli. La mezcla de ligadura se transformó en células químicamente competentes XL10-Gold (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. La secuencia de ADNc de la subunidad \beta de Ky se comprobó mediante secuenciación y se encontró que se correspondía con la secuencia de proteína esperada - véase el
apéndice.

Expresión de subunidades \beta de Ky en E. coli

Las colonias de células XL10-Gold que contienen plásmidos de las subunidades \beta de Ky se inocularon en 5 ml de medio LB que contenía ampicilina en tubos de 20 ml y se hicieron crecer durante toda la noche a 37ºC en un incubador con agitación. Se usaron 2 ml de cultivo durante toda la noche para inocular otros 200 ml de LB/ampicilina en matraces de 500 ml y se hicieron crecer a 37ºC hasta que se alcanzó una DO600 de \sim1,0. Entonces se añadió IPTG y biotina a concentraciones finales de 1 mM y 50 \muM respectivamente y la inducción continuó a 23ºC durante 4 horas. A continuación se recogieron las células mediante centrifugación, los pellets de células se lavaron en PBS x 3 y se almacenaron en alícuotas a -80ºC.

Lisis de E. coli que contiene subunidades \beta de Ky

Los pellets de células se descongelaron en hielo y se añadieron 400 \mul de tampón de lisis (PBS que contiene 0,1% de Tween 20, 1 mg/ml de lisozima y 1 \mug/ml de ADNsa I) y las células se volvieron a suspender mediante pipeteo. La lisis se ayudó mediante la incubación en un agitador de balanceo a temperatura ambiente durante 30 min antes de recogerse los residuos celulares mediante centrifugación a 13000 rpm durante 10 min a 4ºC. El sobrenadante purificado de proteína soluble se extrajo y se usó inmediatamente.

Purificación de subunidades \beta de Ky

Las subunidades \beta de Ky se purificaron usando la marca de hexahistidina. Se añadieron los lisados purificados diluidos en PBS que contenían imidazol 50 mM a una columna que contenía resina de afinidad Talon Cobalt (Clontech). La columna se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón y la proteína se eluyó en 2 volúmenes de columna de PBS que contenían imidazol 300 mM.

SDS-PAGE

Las muestras de proteína se llevaron a ebullición en tampón que contenía SDS durante 5 min antes de cargarlas en geles tris-glicina al 4-20% (NOVEX) y realizarse a 200 V durante 45 min. A continuación, los geles se usaron para inmunotransferencia de Western o la proteína se tiñó directamente con colorante azul brillante de
Coomassie.

Inmunotransferencia de Western

La proteína se transfirió sobre membrana de PVDF (Hybond-P, Amersham) y se exploró para determinar la presencia de diversos epítopos usando técnicas habituales. Para la detección de la marca de histidina, las membranas se bloquearon en Marvel al 5%/PBST y se usó anticuerpo anti-RGSHis (QIAGEN) como anticuerpo primario a una dilución 1/1000. Para la detección de la marca de biotina, las membranas se bloquearon en Superblock/TBS (Pierce) y se probaron con conjugado estreptavidina/HRP (Amersham) a una dilución 1/2000 en Superblock/TBS/Tween20 al 0,1%. El anticuerpo secundario para el anticuerpo RGSHis fue conjugado de HRP (Sigma) de IgG anti-ratón (Fc específico) usado a una dilución 1/2000 en Marvel/PBST. Después de lavado exhaustivo, los conjugados de HRP unidos se detectaron usando o ECLPlus (Amersham) y Hyperfilm ECL (Amersham) o mediante tinción con DAB
(Pierce).

Espectros

Los espectros de UV-vis (250-500 nm) de subunidades \beta de Ky se registraron usando un espectrofotómetro de barrido Termo Spectronic. Las proteínas se diluyeron en tampón de elución y el tampón de elución solo se usó para tomar el nivel inicial que se resta de todas las muestras.

Ensayo de interacción del dominio T1 de las subunidades \alpha

El ADNc para el dominio T1 de las subunidades \alpha (aminoácidos 33 - 135) se clonó aguas abajo a partir de secuencias que codifican para una marca de His y una marca FLAG en un vector de expresión de E. coli. Los plásmidos se comprobaron mediante secuenciación para la secuencia correcta y la inducción de los cultivos de E. coli mostró la expresión de una proteína soluble marcada con His y FLAG del tamaño deseado. Para explorar la interacción entre el dominio T1 de las subunidades \alpha y las subunidades \beta de Ky, las reacciones de unión se montaron conteniendo 10 \mul de lisados purificados de subunidades \beta de Ky, 10 \mul de agarosa anti-FLAG en presencia y ausencia de 10 \mul de lisado purificado del dominio T1 de las subunidades \alpha, en 500 \mul de solución salina tamponada con fosfato que contenía NaCl 300 mM, Tween 20 al 0,1% y 1% (p/v) de albúmina de suero bovino. Las reacciones se incubaron en un agitador de balanceo a temperatura ambiente durante 1 hora y los complejos unidos a FLAG se recogieron mediante centrifugación a 5000 rpm durante 2 min. Después de lavado exhaustivo en PBST, los complejos unidos a FLAG se desnaturalizaron en tampón de muestra de SDS y se sometieron a inmunoensayo. La presencia de subunidades \beta de Ky biotiniladas se detectaron mediante el conjugado estreptavidina/
HRP.

Fabricación de matrices de placas de microtitulación de subunidades \beta de Ky

Se añadieron 100 \mul de concentraciones optimizadas de lisados purificados de subunidades \beta de Ky (normalmente 1 en 16 diluciones en PBS-Tween) en cada pocillo a placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina. Las placas se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 45 min antes de lavar cada pocillo 3 veces con 300 \mul de PBS-Tween. Después, las placas se usaron en ensayos o se almacenaron a -20ºC en presencia de glicerina al 50% (v/v) en PBS-Tween.

Ensayo de unión de péptidos de matrices de subunidades \beta de Ky

El péptido que interactúa con la subunidad \beta de Ky(SPL2) basado en una parte del dominio de las subunidades \alpha se diseñó, se sintetizó y se marcó con fluoresceína. El péptido SPL2 apropiadamente diluido en PBS-Tween que contenía 0,1% p/v de BSA se añadió a 100 \mul/pocillo a la placa de microtitulación recubierta con subunidades \beta de Ky. El péptido se incubó durante 1 h a temperatura ambiente con agitación antes de eliminar el péptido sin unir lavando 3 veces en 300 \mul de PBS-Tween. Se añadieron 100 \mul de guanidina HCl 6 M a cada pocillo antes de la evaluación de la concentración de péptido SPL2 marcado con fluoresceína en cada pocillo. La fluorescencia de cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos se leyó en un lector de placas de microtitulación de fusión Packard equipado con filtros de excitación y emisión de 485 y 520 nm, respectivamente.

Ensayo de interacción del dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv de matrices de subunidades \beta de Ky

El lisado purificado del dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv diluido 1 en 10 en PBS-Tween que contenía 0,1% p/v de BSA se añadió a 100 \mul/pocillos a la placa de microtitulación recubierta con subunidades \beta de Ky. El péptido se incubó durante 1 h a temperatura ambiente con agitación antes de eliminarse el dominio T1 de las subunidades \alpha no unido lavando 3 veces en 300 \mul de PBS-Tween. El dominio T1 de las subunidades \alpha unido se estimó usando conjugado de anticuerpo anti-FLAG de ratón apropiadamente diluido y HRP de anticuerpo secundario de IgG anti-ratón usando procedimientos de ELISA habituales. La HRP se detectó mediante la adición del sustrato de HRP colorimétrico ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) y las placas de microtitulación se leyeron en un lector de placas de microtitulación de fusión Packard equipado con un filtro de absorbancia de 405 nm.

Fabricación de micromatrices de subunidades \beta de Ky

Los lisados purificados de subunidades \beta de Ky se cargaron en una placa de 384 pocillos y se imprimieron sobre portaobjetos de microscopio de vidrio con una neutravidina inmovilizada sobre recubrimiento de dextrano (Xantec) usando un robot para micromatrices Qarray (Genetix, RU) con un cabezal para micromatrices de 4 contactos. Cada lisado se depositó 16 veces sobre cada matriz. Después de la impresión, las matrices se incubaron en una cámara húmeda a 4ºC durante 1 h antes de lavarse en PBS-Tween. Después del lavado, las matrices estaban listas para
ensayarse.

Detección de anticuerpos de subunidades \beta de Ky en micromatrices

El anticuerpo anhi-His marcado con Cy3 se diluyó a 1 \mug/ml en PBS-Tween + 0,1% (p/v) de BSA y se pipetearon aproximadamente 500 \mul sobre el portaobjetos. El portaobjetos se incubó a temperatura ambiente con una agitación muy ligera durante 1 h, después se lavó 2 x 2 min en un gran volumen de PBS-Tween. Los portaobjetos se centrifugaron brevemente a 2000 g para eliminar el líquido antes de escanearlos en un escáner de micromatrices (Affymetrix, escáner de 428 matrices) equipado con filtros láser de excitación y emisión apropiados para la detección del fluoróforo
Cy3.

Unión del dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv a subunidades \beta de Kv en micromatrices

El lisado purificado del dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv se diluyó 1 en 50 en PBS-Tween que contenía 1% p/v de BSA y se pipetearon aproximadamente 500 \mul sobre el portaobjetos. El portaobjetos se incubó a temperatura ambiente con una agitación muy ligera durante 1 h, después se lavó 2 x 2 min en un gran volumen de PBS-Tween. A continuación, el anticuerpo anti-FLAG apropiadamente diluido se pipeteó sobre la matriz y se incubó y lavó como anteriormente antes de la adición de IgG de ratón marcada con Cy3. Los portaobjetos se incubaron y se lavaron como anteriormente antes de centrifugar brevemente a 2000 g para eliminar el líquido antes de escanearlos en un escáner de micromatrices (Affymetrix, escáner de 428 matrices) equipado con filtros láser de excitación y emisión apropiados para la detección del fluoróforo Cy3.

Resultados Expresión de subunidades de \beta de Ky en E. coli

Los dominios centrales de las subunidades \beta de Ky se clonaron aguas abajo del promotor tac en el vector pQE80 dentro del que ya se había clonado el dominio BCCP del ACCB de E. coli. A continuación, la proteína resultante se marcaría con His y biotina en su extremo N-terminal. La figura 1 muestra el análisis de inmunoensayo de la proteína total y soluble de cultivos de E. coli inducidos. Para todas las subunidades \beta hay bandas claras para proteína marcada con His y biotinilada con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa. Las bandas del mismo tamaño se detectan mediante un anticuerpo policlonal llevado a \beta2 de Kv humana (Biosource) que reacciona de manera cruzada con todas las subunidades \beta usadas (no se muestran los datos).

Aunque las marcas de His y biotina se han usado en esta matriz, podrían usarse otras marcas de afinidad (por ejemplo FLAG, myc, VSV) para posibilitar la purificación, detección e inmovilización de las proteínas clonadas. Por tanto, si se requiere, puede usarse un huésped de expresión distinto de E. coli (por ejemplo levadura, células de insectos, células de mamíferos).

Purificación de subunidades \beta de Ky

Las proteínas pueden purificarse antes de formar matrices usando una marca de afinidad. En este documento se ha hecho uso de esta marca de his purificando la proteína en resina Talon. La figura 2 muestra que las subunidades \beta de Kv purificadas de este modo sólo muestran bandas en SDS-PAGE que se corresponden con la subunidad \beta de Kv, o productos de proteolisis.

Espectros de absorbancia de UV-Vis

Los espectros de UV-Vis se obtuvieron para todas las subunidades \beta de Kv humanas y de rata. La figura 3 muestra que ambas subunidades \beta2 de Kv humanas y de rata contienen un cofactor NAD(P)H como se demuestra por sus picos de absorbancia a 360 nm.

Ensayo de interacción del dominio T1 de las subunidades \alpha

Para confirmar que las subunidades \beta de Kv expresadas han conservado la función nativa se ideó un ensayo en el que las subunidades \beta de Kv se precipitarían mediante la unión a perlas recubiertas del dominio T1 de las subunidades \alpha. A las perlas anti-FLAG se añadieron lisados del dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv marcadas con FLAG. A continuación se mezclaron con lisados que contenían las subunidades \beta de Kv. La figura 4 muestra que, aunque la unión no específica de subunidades \beta de Kv a perlas anti-FLAG fue alta, aumentó la unión en presencia del dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv. Por tanto, puede observarse que la subunidad \beta3 de Kv se ha unido a las perlas recubiertas con el dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv en mayores cantidades que cualquier otra subunidad \beta de
Kv.

Fabricación de matrices de placas de microtitulación de las subunidades \beta de Kv

Para confirmar que las placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina pueden recubrirse con subunidades \beta de Kv, los lisados se diluyeron en serie y se añadieron a pocillos de placas. La figura 5 muestra que pueden alcanzarse niveles similares de proteína específicamente inmovilizada por pocillo.

Ensayo de interacción del dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv de matrices de subunidades \beta de Ky

La figura 6 demuestra la unión específica del dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv a todas las subunidades \beta de Ky. También puede observarse que la subunidad \beta3 de Kv ha unido mucho más dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv, reflejando los resultados del ensayo de co-precipitación.

Ensayo de unión de péptidos de matriz de subunidades \beta de Ky

Se añadió péptido SPL2 a una matriz de placas de microtitulación de subunidades \beta de Ky en un intervalo de concentraciones de 100 a 1600 \muM. Después de la incubación durante 1 h, los pocillos se lavaron para eliminar el péptido sin unir. El péptido restante se cuantificó mediante fluorometría. Los resultados (mostrados en la fig. 7) proporcionan ajustes a los datos, permitiendo estimaciones de K_{d} y B_{máx} para cada una de las subunidades \beta de Ky (tabla 1).

TABLA 1 Cálculos aproximados de K_{d} y B_{máx} para cada una de las subunidades \beta de Ky. Los datos en la figura 7 se ajustaron a las curvas de unión usando un software de ajuste de curvas

1

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Inhibición de unión del péptido a matriz de subunidades \beta de Ky mediante dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv

La unión del péptido SPL2 a la matriz de subunidades \beta de Ky se inhibió en presencia del dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv. En la figura 8 puede verse que para las subunidades \beta1 y 2 de Ky de rata se reduce la unión de péptidos.

Detección de anticuerpos de subunidades \beta de Ky en micromatrices

Se muestra que las subunidades \beta de Ky en micromatrices están específicamente inmovilizadas sobre portaobjetos de microscopio de vidrio recubiertos con estreptavidina. En la figura 9 puede observarse que la inclusión de biotina libre en la disolución de deposición inhibe completamente la inmovilización de \beta3 de Kv. Todas las subunidades \beta de Kv están presentes sobre la matriz, por tanto la inmovilización de la marca de BCCP está presente sobre la
matriz.

Unión del dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv a subunidades de \beta de Kv en micromatrices

Las subunidades \beta de Kv inmovilizadas sobre una matriz todavía pueden unirse al dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv. La figura 10 muestra que el dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv puede detectarse después de la unión a subunidades \beta de Kv inmovilizadas. De la figura 10 también puede verse que la marca de afinidad inmovilizada tiene una pequeña unión del dominio T1 de las subunidades \alpha de Kv.

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Bibliografía

1. Jan L Y y Jan Y N (1997) Receptor-regulated ion channels. Curr Opin Cell Biol 9(2): 155-60

2. Trimmer, J. S. (1998) Regulation of ion channel expression by cytoplasmic subunits. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 370-374.

3. Perez-Garcia, M T y col., (1995) Functional properties of cardiac L-type calcium channels transiently expressed in HEK293 cells. Roles of alpha 1 and beta subunits. J. Gen. Physiol. 105, 289-305.

4. Brady A E, Limbird L E. (2002) G protein-coupled receptor interacting proteins: Emerging roles in localization and signal transduction. Cell Signal 14(4):297-309.

5. Ruiz-Velasco V, Ikeda S R, Puhl H L. (2002) Cloning, tissue distribution, and functional expression of the human G protein {beta}4-subunit. Physiol Genomics 8(1):41-50.

6. Walker, D y col. (1998) A b4 isoform-specific interaction site in the carboxyl-terminal region of the voltage-dependent Ca2+ channel \alpha1A subunit. J. Biol. Chem., 273, 2361-2367.

7. Xu y Li, (1998) Auxiliary Subunits of Shaker-type potassium channels. Trends. Cardiovasc. Med., 8, 229-234.

8. Zhu H, Klemic J F, Chang S, Bertone P, Casamayor A, Klemic K G, Smith D, Gerstein M, Reed M A, Snyder M. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet (2000) 26(3):283-9.

9. Dolly, J O y Parcej, D N (1996) Molecular properties of voltage-gated K+ channels. J. Bioenerg. Biomembr., 28, 231-253.

10. Scott, VE y col., (1990) Alpha-dendrotoxin acceptor from bovine brain is a K+ channel protein. Evidence from the N-terminal sequence of its larger subunit. J. Biol. Chem., 265, 20094-20097.

11. Wang, Z y col., (1996) Comparison of Binding and Block Produced by Alternatively Spliced Kv\beta1 Subunits. J. Biol. Chem., 271, 28311-28317.

12. Restituito, S y col., (2001) Ca2+ Channel Inactivation Heterogeneity Reveals Physiological Unbinding of Auxiliary Subunits. Biophys. J. 81, 89-96.

13. Strader, C D y col. (1994) Structure and function of G-protein-coupled receptors. Annu. Rev. Biochem., 63, 101-132.

14. Strader, C D y col. (1995) The family of G-protein-coupled receptors. FASEB J., 9, 745-754.

15. Tucker, S. J. y Ashcroft, F. M. (1999) Mapping of the physical interaction between the intracellular domains of an inwardly rectifying potassium channel, Kir6.2. J. Biol. Chem., 274, 33393-33397.

16. Yokoyama, C T y col. (1997) Phosphorylation of the synaptic protein interaction site on N-type calcium channels inhibits interactions with SNARE proteins. J. Neurosci., 17, 6929-6938.

17. Gelber, E y col., (1999) Structure and function of the third intracellular loop of the 5-HT2A receptor: The third intracellular loop is \alpha-helical and binds purified arrestins.

18. Weixel, K M y Bradbury, N A (2001) \mu2 Binding directs the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the clathrin-mediated endocytic pathway. J. Biol. Chem., 49, 46251-46259.

19. Tu, J C y col. (1998) Homer binds a novel proline-rich motif and links group 1 metabotropic glutamate receptors with IP3 receptors. Neuron, 21, 717-726.

20. Shieh, B-H y Zhu, M-Y (1996) Regulation of the TRP Ca+ channel by INAD in Drosophila photoreceptors. Neuron, 16, 991-998.

21. Pongs, O., Leicher, T., Berger, M. y col. (1999) Functional and molecular aspects of voltage-gated K+ channel \beta subunits.

22. Walker, D. y Waard, M: (1998) Subunit interaction sites in voltage-dependent Ca2+ channels: role in channel function.

23. Onrust, R, Herzmark, P y col. (1997) Receptor and \beta\gamma binding sites in the a subunit of the retinal G-protein transcducin. Science, 275, 381-384.

24. Bourne, H R (1997) How receptors talk to trimeric G proteins. Curr. Opin. Cell. Biol., 9, 134-142.

25. Ferguson, S S G (2001) Evolving concepts in G protein-coupled receptor endocytosis: The role in receptor desensitization and signaling. Pharmacol. Rev., 53, 1-24.

26. Krupnick, J G y col., (1994) Arrestin-rhodopsin interaction. Multi-site binding delineated by peptide inhibition. J. Biol Chem. 269, 3226-3232.

27. Nam, T-W y col., (2001) The Escherichia coli glucose transporter enzyme IICBGlc recruits the global repressor Mlc. EMBO J., 20, 491-498.

28. Zhang, J-Z y col., (2001) Overexpression of stomatin depresses GLUT-1 glucose transporter activity. Am. J. Physiol. Cell. Physiol., 280, C1277-C1283.

\newpage

Apéndice 1

2

7

<110> Sense Proteomic Limited

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Blackburn, Jonathan M

\hskip1cm

Kozlowski, Roland Z

\hskip1cm

Davies, Andrew

\hskip1cm

Godber, Ben

\hskip1cm

Hart, Darren

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<120> Matrices y Métodos

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<130> P33676WO

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<140> PCT/GB2003/001049

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<141> 2003-03-13

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<150> GB 0205910.3

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<151> 2002-03-13

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<160> 6

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<170> PatentIn version 3.2

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<210> 1

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<211> 334

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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8

9

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<210> 2

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<211> 333

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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10

11

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<210> 3

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<211> 330

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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12

13

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<210> 4

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<211> 334

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<212> PRT

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<213> Rattus sp.

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<400> 4

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14

15

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<210> 5

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<211> 333

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<212> PRT

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<213> Rattus sp.

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 330

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<212> PRT

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<213> Rattus sp.

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<400> 6

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19

Claims (21)

1. Una matriz que comprende una superficie que tiene unida a la misma al menos una proteína accesoria citosólica de una proteína de membrana seleccionada de canales de iones, receptores acoplados a proteína G y proteínas transportadoras transmembrana, en la que dicha proteína accesoria citosólica está libre de componentes de proteínas de membrana u otras subunidades de dicho canal de iones, receptor acoplado a proteína G o complejo de proteínas transportadoras transmembrana.

2. Una matriz según la reivindicación 1, que comprende una pluralidad de proteínas accesorias citosólicas seleccionadas de subunidades de canales de iones, proteínas accesorias citosólicas de receptores acoplados a proteína G, proteínas accesorias citosólicas de transportadores transmembrana, subunidades \beta de canales de K^{+}, subunidades \beta de canales Ca^{2+}, subtipos de proteína G, subunidades \beta de canales Kv, subunidades \beta de canales de calcio, familia Gs, familia Gt, familia Gi, familia Gi-0, familia Gq-11, familia sensorial de G\alpha y proteínas de la familia \beta\gamma.

3. Una matriz según la reivindicación 1, que comprende una pluralidad de proteínas accesorias citosólicas que son idénticas y se seleccionan de subunidades de canales de iones, proteínas accesorias citosólicas de receptores acoplados a proteína G, proteínas accesorias citosólicas de transportadores transmembrana, subunidades \beta de canales de K^{+}, subunidades \beta de canales de Ca^{2+}, subtipos de proteína G, subunidades \beta de canales Kv, subunidades \beta de canales de calcio, familia Gs, familia Gt, familia Gi, familia Gi-0, familia Gq-11, familia sensorial de G\alpha y proteínas de la familia \beta\gamma.

4. Una matriz según la reivindicación 2 ó 3, en la que la matriz comprende al menos una subunidad \beta de canales de K^{+} seleccionada de: \beta1.1, \beta1.2, \beta1.3, \beta2.1, \beta2.2, \beta3.1, \beta3.2 y \beta4.

5. Una matriz según la reivindicación 2 ó 3, en la que la matriz comprende al menos una subunidad \beta de canales de calcio seleccionada de: \beta1a, \beta1b, \beta1c, \beta2a, \beta2b, \beta2c, \beta3a, \beta3b y \beta4.

6. Una matriz según cualquier reivindicación precedente, en la que la proteína accesoria citosólica es un dominio de subunidades de canales de iones.

7. Una matriz según cualquier reivindicación precedente, en la que las subunidades de las proteínas accesorias citosólicas se proporcionan como constructos de proteínas marcadas.

8. Una matriz según la reivindicación 7, en la que el constructo de proteína marcada comprende una marca de afinidad.

9. Una matriz según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en la que la marca es una marca de His, biotina, FLAG, myc o VSV.

10. Una matriz según cualquier reivindicación precedente, en la que los restos de proteínas están unidos a la superficie mediante un resto marcador común.

11. Una matriz según cualquier reivindicación precedente, en la que cada posición en la matriz contiene una o más copias de un único tipo de proteína en forma de un monómero, dímero, trímero, tetrámero o multímero superior.

12. Un procedimiento para determinar qué proteínas citosólicas interactúan con una proteína de membrana dada, o viceversa, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(i)

proporcionar una matriz de proteínas accesorias citosólicas según cualquier reivindicación precedente;

(ii)

poner en contacto la matriz con fragmentos citosólicos de dicha proteína de membrana y/o fragmentos citosólicos de otros miembros de familias de proteínas de membrana relacionados; y

(iii)

detectar e identificar los componentes que interactúan.

13. Un procedimiento para seleccionar compuestos o péptidos o proteínas respecto a la capacidad para interactuar selectivamente con una proteína citosólica, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(i)

proporcionar una matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1-11;

(ii)

poner en contacto la matriz con compuestos o péptidos o proteínas candidatos; y

(iii)

identificar los componentes que interactúan.

14. Un procedimiento según la reivindicación 13, que comprende además la etapa de cuantificar la interacción de los componentes que interactúan midiendo las constantes de unión o catalíticas K_{D} o K_{M}, o normalizando la cantidad unida frente a la cantidad de proteína.

15. Un procedimiento para seleccionar compuestos o péptidos o proteínas respecto a la capacidad para modular selectivamente la interacción entre una proteína citosólica y una proteína de membrana, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(i)

proporcionar una matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1-11;

(ii)

poner en contacto la matriz con compuestos o péptidos o proteínas candidatas y con una o más proteínas de membrana o fragmentos citosólicos de las mismas, o simultáneamente o sucesivamente; y

(iii)

determinar si dicha interacción está modulada por la presencia de dichos compuestos o péptidos o proteínas.

16. Un procedimiento según la reivindicación 15, en el que el fragmento citosólico de una proteína de membrana es un dominio funcional soluble.

17. Un procedimiento según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, que comprende además la etapa de cuantificar el grado de modulación de la interacción midiendo las constantes de unión o catalíticas K_{D} o K_{M}, o normalizando la cantidad unida frente a la cantidad de proteína.

18. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, en el que la concentración de un compuesto requerido para inhibir una interacción dada se mide determinando el valor de CI_{50}.

19. El uso de una matriz de proteínas accesorias citosólicas según cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para medir la actividad catalítica relativa de diferentes miembros de una familia de dichas proteínas accesorias citosólicas.

20. El uso de una matriz de proteínas accesorias citosólicas según cualquiera de las reivindicaciones 1-11 como una superficie de afinidad sobre la que seleccionar anticuerpos de una biblioteca de anticuerpos ligados a fenotipos-genotipos (por ejemplo anticuerpos expresados en fagos).

21. El uso de una matriz de proteínas accesorias citosólicas según cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para determinar el efecto de modificaciones post-translacionales en las interacciones de proteínas accesorias con proteínas de membrana.