JP2006501141A - 表面上に固定化した細胞質性付属タンパク質の配列体及び関連方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)候補の細胞質性付属タンパク質で、1種又はそれより多い種類の対象の細胞質性付属タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程;
(ii)配列体を、前記膜タンパク質の細胞質性断片及び/又は他の関連する膜タンパク質系列の一員の細胞質性断片と接触させる工程;及び
(iii)相互作用する相手を検出し、及び同定する工程
を含む。
(i)細胞質性付属タンパク質で、1種又はそれより多い種類の対象の細胞質性タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程;
(ii)配列体を化合物又はペプチド又はタンパク質と接触させる工程;及び
(iii)相互作用する相手を同定する工程
を含む。
(i)細胞質性付属タンパク質で、1種又はそれより多い種類の対象の細胞質性タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程;
(ii)配列体を、化合物又はペプチド又はタンパク質と、及び対象の1種又はそれより多い種類の膜タンパク質又はその細胞質性断片と、同時にか、又は順にかのいずれかで接触させる工程;及び
(iii)前記相互作用が前記化合物又はペプチド又はタンパク質の存在によって修飾されるかどうかを定める工程
を含む。
a) 単一タンパク質種類の試料(単量体、二量体、三量体、四量体又はより一層大きな多量体);
b) 相互作用分子に結合した単一タンパク質種類の試料(例えば、DNA、抗体、他のタンパク質);
c) 合成分子に結合した単一タンパク質種類の試料(例えば、ペプチド、化学的化合物);又は
d) 所定の付属タンパク質系列からの2種又はそれよりも多い種類のヘテロマの混合物
の1種又はそれよりも多い種類のコピーを含むことができる。
結合リガンド=B max /((K D/[L])+1) (式1)
[L]=アッセイ中に用いるリガンドの濃度
図1はβサブユニットの粗可溶化物のウエスタンブロットを示す。それぞれのβサブユニット発現クローンからの粗可溶化物及び清澄な可溶化物の10μLを、SDS PAGEを用いて動かした。ゲルを移し、及び膜をストレプトアビジン(A)及び抗His抗体(B)で探索した。レーンに負荷されたものは:1及び2ヒトβ1、3及び4ヒトβ2、5及び6ヒトβ3、7及び8ラットβ1、9及び10ラットβ2、11及び12ラットβ3。奇数のレーン−粗可溶化物、偶数のレーン−清澄な可溶化物。
図3は精製したヒト及びラットKvβサブユニットの紫外-可視光吸収スペクトルを示す。凡例:青色;ヒトβ1、ピンク色;ヒトβ2、黄色;ヒトβ3、青緑色;ラットβ1、紫色;ラットβ2、茶色;ラットβ3。挿入図は360nmでのピークをより一層詳細に示す。
図10はマイクロアレイしたKyβサブユニットに結合したKvαサブユニットT1ドメインを示す。KyβサブユニットのマイクロアレイをKvαサブユニットT1ドメイン可溶化物と共にインキュベートした。洗浄後、βサブユニットに結合したKvαサブユニットT1ドメインを、抗FLAG抗体及びCy3標識化抗マウスIgGを用いて検出することができた。
電位作動型カリウム(Kv)チャネルを、治療上の標的として、障害であって、CNS、心臓、肺及び膀胱のそれらを含む障害において認識する。したがって、それらは重要な治療上及び商業上の標的である。それらは、6種の貫膜橋架け(spanning)ドメインを持ち、及び細胞質調節性β-サブユニットの構築物に繋がる(coupled)α-サブユニットの四量体構築物からなる。
Kvβサブユニット配列体の構成体のための材料及び方法
His及びビオチン標識KyβサブユニットcDNAsのクローン化
ラット及びヒトのKvβ1、β2及びβ3サブユニットのコアドメインcDNAを、ポリ・ヒスチジン-標識及び大腸菌AccB遺伝子からのBCCPドメインのためのコード配列の下流の大腸菌発現ベクタにライゲートした。連結混合物を、化学的に形質転換受容性の(competent)XL10-Gold cells〔ゴールド細胞、Stratagene(ストラタジーン社)〕中に入れ、製造者の指示に従って形質転換させた。KyβサブユニットcDNA配列を、配列決定によって点検し、及び期待されたタンパク質に対応することが見出された-添付物参照。
Kyβサブユニットプラスミドを含むXL10-Gold細胞のコロニーを、20ml試験管中にアンピシリンを含有する5mLのLB培地中に接種し、及び37℃で振盪培養器中一昼夜増殖させた。2mLの一昼夜培養物を用い、500 mLのフラスコ中の200mLの他のLB/アンピシリンに接種し、及び〜1.0のOD600に達するまで37℃で増殖させた。次いで、IPTG及びビオチンをそれぞれ1mM及び50μMの終濃度まで添加し、及び誘導を23℃で4時間続けた。次いで、細胞を遠心分離によって収穫し、細胞のペレットをPBS×3中で洗浄し、及び一定分量中-80℃で貯えた。
細胞ペレットを氷上で解かし、及び400μLの溶解緩衝液〔1%のTween(トゥイーン)20、1mg/mLのリゾチーム及び1μg/mLのDNAse Iを含有するPBS〕を添加し、及び細胞をピペッティングによって再懸濁させた。細胞細片を遠心分離、13000rpm10分間4℃によって収集する前に、溶解をロッカー上で室温の30分間のインキュベーションにより助けた。清澄な上清の可溶性タンパク質を除去し、及び直ちに用いた。
Kyβサブユニットをヘキサヒスチジン標識の使用によって精製した。50mMのイミダゾールを含有するPBS中で希釈した清澄な溶解物を、Talon Cobalt(タロンコバルト)アフィニティ樹脂〔Clontech(クローンテック社)〕を含むカラムに添加した。カラムを10倍のカラム容量で洗浄し、及び300mMのイミダゾールを含有するPBSの2倍のカラム容量中でタンパク質を溶離した。
タンパク質試料を4〜20%のTris-グリシンのゲル〔NOVEX(ノベックス社)〕上への負荷及び200Vでの45分間の駆動に先立ち、SDS含有緩衝液中で煮沸した。次いで、ゲルをウエスタンブロット法用に用いるか、又はタンパク質をクーマシーブリリアントブルー染料で直接的に染色した。
タンパク質をPVDF膜〔Hybond(ハイボンド)-P、Amersham(アマシャム社)〕上に移し、及び標準的な技術を用いて種々のエピトープの存在について探索した。ヒスチジン-標識の検出のために、膜を5% Marvel(マーベル)/PBST中でブロックし、及び抗-RGSHis抗体〔QIAGEN(キアゲン社)〕を一次抗体として1/1000希釈で用いた。ビオチン標識の検出のために、膜を、Superblock(スーパーブロック)/TBS(ピアス社)中でブロックし、及びSuperblock/TBS/0.1%Tween20中で1/2000希釈のストレプトアビジン/HRP複合物(Amersham)で探索した。RGSHis抗体のための二次抗体は、Marvel/PBST中1/2000希釈で用いた抗-マウスIgG(Fc特異的)HRP複合物〔Sigma(シグマ社)〕であった。大規模な洗浄の後、結合したHRP複合物を、ECLPlus(プラス)(Amersham)及びHyperfilm(ハイパーフィルム)ECL(Amersham)を用いてか、又はDAB染色(Pierce)によって検出した。
精製したKyβサブユニットの紫外-可視スペクトル(250〜500nm)を、Thermo(サーモ)スペクトロニック走査分光光度計を用いて記録した。タンパク質を溶出緩衝液中で希釈し、及び溶出緩衝液の単独を用い、すべての試料から控除される基線を取った。
αサブユニットT1ドメイン(アミノ酸33〜135)のためのcDNAを、大腸菌発現ベクタ中のHis-標識及びFLAG-標識をコードする配列の下流でクローン化した。プラスミドを正しい配列についての配列決定によって点検し、及び大腸菌培養物の誘導は期待された寸法のHis及びFLAG標識の可溶性タンパク質の発現を示した。αサブユニットT1ドメインとKyβサブユニットとの間の相互作用を試験するために、10μLのαサブユニットT1ドメインの清澄な溶解物の存在下で、及び欠損下で、300mMのNaCl含有の500μLのリン酸緩衝食塩水、0.1%Tween20及び1%(w/v)ウシ血清アルブミンにおいて、結合反応を、10μLのKyβサブユニットの清澄な溶解物、10μLの抗-FLAGアガロースを含めて構築した。反応をロッカー上で室温1時間インキュベートし、及びFLAG結合複合体を5000rpmで2分間遠心分離することによって収穫した。PBST中での大規模な洗浄の後、FLAG結合複合体をSDS試料緩衝液中で変性させ、及びウエスタンブロッティングした。ビオチン化Kyβサブユニットの存在をストレプトアビジン/HRP複合物によって検出した。
96個のウェルのストレプトアビジン被覆マイクロタイタプレートに、100μLの最適化した濃度のKyβサブユニット清澄溶解物(典型的にPBS-Tween中で16中の1の希釈)を各ウェルに添加した。各ウェルを3回300μLのPBS-Tweenで洗浄する前に、プレートを室温で振とうさせながら45分間インキュベートした。しかる後、プレートをアッセイにおいて用いるか、又は-20℃でPBS-Tween中50%(v/v)のグリセリン存在下に貯蔵した。
αサブユニットドメインの部分に基づくKyβサブユニット相互作用ペプチド(SPL2)を設計し、合成し、及びフルオレセイン標識化した。0.1%w/vBSAを含有するPBS-Tween中で適切に希釈したSPL2ペプチドを100μL/ウェルでKyβサブユニット被覆マイクロタイタプレートに添加した。未結合ペプチドを3回300μLのPBS-Tweenでの洗浄によって除去する前に、ペプチドを、1時間室温で振とうさせながら、インキュベートした。各ウェル中のフルオレセイン標識化SPL2ペプチド濃度を評価する前に、100μLの6MグアニジンHC1を各ウェルに添加した。96ウェルのマイクロタイタプレートの各ウェルの蛍光を、485nm及び520nmの励起及び放出フィルタをそれそれ備えるPackardの融合マイクロタイタプレート読取機において読取った。
KvαサブユニットT1ドメインの清澄な溶解物を0.1%w/vBSA含有PBS-Tween中で10中の1で希釈し、100μL/ウェルでKyβサブユニット被覆マイクロタイタプレートに添加した。未結合のαサブユニットT1ドメインを3回の300μLのPBS-Tweenでの洗浄によって除去する前に、ペプチドを1時間室温で振とうさせながらインキュベートした。結合αサブユニットT1ドメインを、適切に希釈したマウス抗FLAG抗体及び標準的なELISA法を用いる抗マウスIgG二次抗体HRP複合物の使用によって評価した。HRPを比色分析のHRP基質2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)の添加によって検出し、及びマイクロタイタプレートを、405nmの吸光度フィルタを備えるPackardの融合マイクロタイタプレート読取機において読取った。
Kyβサブユニットの清澄な溶解物を384個のウェルプレート中に負荷し、及び4種のピンのマイクロアレイイングヘッドを備えるQarray(キアレイ)のマイクロアレイイングロボット〔Genetix(ゲネティックス社)、英国〕を用いてデキストラン被膜〔Xantec(キサンテック)〕上に固定化されたニュートラビジン(neutravidin)を有するガラスの顕微鏡用スライド上に印刷した。各溶解物を各配列体上に16回スポットした。印刷後、PBS-Tween中での洗浄の前に、配列体を4℃の湿気のあるチャンバ中で1時間インキュベートした。洗浄後、配列体をアッセイのために用意した。
Cy3標識化抗His抗体をPBS-Tween+0.1%(w/v)BSA中で1μg/mLに希釈し、及びおよそ500μLをスライド上にピペットで取った。スライドをPBS-Tweenの大容量中での2回×2分の洗浄の前に、室温で極わずかに振とうさせながら1時間インキュベートした。スライドを、Cy3フルオロフォア検出のために適切な励起レーザ及び放出フィルタを備えるマイクロアレイ走査装置〔Affymetrix(アフィメトリクス)428アレイスキャナ〕において走査する前に、スライドを簡潔に2000gで遠心分離し、液体を除いた。
KvαサブユニットT1ドメインの清澄な溶解物を1%w/vBSA含有PBS-Tween中で50中の1で希釈し、及びおよそ500μLをスライド上にピペットで取った。スライドをPBS-Tweenの大容量中での2回×2分の洗浄の前に、室温で極わずかに振とうさせながら1時間インキュベートした。次いで、適切に希釈した抗FLAG抗体を配列体上にピペットで取り、及びインキュベートし、及びCy3標識化抗マウスIgGの添加前に、上述のようにインキュベートし、及び洗浄した。スライドをインキュベートし、及び簡潔な2000gでの遠心分離の前に上述のように洗浄し、Cy3フルオロフォア検出のために適切な励起レーザ及び放出フィルタを備えるマイクロアレイ走査装置(Affymetrix428アレイスキャナ)において走査する前に、液体を除いた。
大腸菌中でのKyβサブユニットの発現
Kyβサブユニットのコアドメインを、大腸菌遺伝子ACCBからのBCCPドメインが既にクローン化されているベクタpQE80中のtacプロモータの下流でクローン化した。次いで、得られるタンパク質を、そのN-端でHis及びビオチン標識する。図1は誘導された大腸菌培養物からの全体の及び可溶性タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。すべてのβサブユニットについて、およそ50kDaの分子量を有するHis-標識された及びビオチン化されたタンパク質についての明確なバンドがある。同じ寸法のバンドは、用いたすべてのβサブユニットと交差反応するヒトのKvβ2〔Biosource(バイオソース)〕に対して生じる多クローン抗体によって検出される(データを示していない)。
親和性標識の使用により配列化する前に、タンパク質を精製することができる。本明細書では、Talon樹脂上でのタンパク質の精製によってhis標識を用いた。図2はこの方法で精製したKvβサブユニットが、Kvβサブユニット、又はタンパク分解産物に対応するSDS-PAGE上のバンドのみを示すことを示す。
紫外-可視スペクトルをすべてのヒト及びラットのKvβサブユニットについて得た。図3は、ヒト及びラットの双方のKvβ2サブユニットが360nmでのそれらの吸光度ピークによって立証されるようにNAD(P)Hの補助因子を含んでいることを示す。
発現したKvβサブユニットが自然な機能を保持していることを確認するため、アッセイを考案し、ここではKvβサブユニットがαサブユニットT1ドメイン被覆ビーズに結合することによって沈降する。抗FLAGビーズに対し、FLAG標識KvαサブユニットT1ドメイン溶解物を添加した。次いで、これらを、Kvβサブユニットを含有する溶解物と混合した。図4は、Kvβサブユニットの抗FLAGビーズに対する非特異的結合が高いが、KvαサブユニットT1ドメインの存在下の結合が増加することを示す。また、ラットKvβ3サブユニットが、KvαサブユニットT1ドメイン被覆ビーズに、任意の他のKvβサブユニットよりも多い量で結合していることが分かる。
ストレプトアビジン被覆マイクロタイタプレートがKvβサブユニットで被覆され得ることを確認するために、溶解物を連続的に希釈し、及びプレートのウェルに添加した。図5は、ウェル当りの特異的に固定化されたタンパク質の同様のレベルを達成することができることを示す。
図6はKvαサブユニットT1ドメインのすべてのKyβサブユニットへの特異的結合を示す。また、ラットのKvβ3サブユニットがより一層多くのKvαサブユニットT1ドメインを明らかに結合しており、共沈アッセイの結果を映していることは注目され得る。
SPL2ペプチドを、Kyβサブユニットのマイクロタイタプレート配列体に、100から1600μMまでの濃度の範囲で添加した。1時間のインキュベーションの後、ウェルを洗浄し、未結合のペプチドを除去した。残っているペプチドを蛍光定量的に定量化した。結果(図7に示す)は、それぞれのKyβサブユニットについてのK d及びB max の評価を可能にするデータへの適合を提供する(表1)。
SPL2ペプチドのKyβサブユニット配列体への結合を、KvαサブユニットT1ドメインの存在下に抑制した。図8では、ラットKyβ1及び2サブユニットについて、ペプチド結合が減少することが見られる。
マイクロアレイしたKyβサブユニットは、ストレプトアビジンを被覆したガラスの顕微鏡用スライド上に特異的に固体化されることが示される。図9では、スポットされる溶液中の遊離のビオチンの包含がKvβ3の固体化を完全に抑制することが見られる。すべてのKvβサブユニットが配列体上に存在し、また、固定化BCCP標識が配列体上に存在する。
配列体上に固定化されたKvβサブユニットは、まだKvαサブユニットT1ドメインに結合することができる。図10では、KvαサブユニットT1ドメインが固定化したKvβサブユニットへの結合の後に検出することができる。また、図10から、固定化した親和性標識がKvαサブユニットT1ドメインのわずかな結合しか持たないことも見られる。
1. Jan(ヤン) LY及びJan YN(1997年) Receptor-regulated ion channels(受容体-調節イオンチャネル). Curr Opin Cell Biol(細胞生物学における最新の見解) 9 (2): 155-60.
2. Trimmer(トリマー), J. S.(1998年) Regulation of ion channel expression by cytoplasmic subunits(細胞質サブユニットによるイオンチャネル発現の調節). Curr. Opin. Neurobiol(神経生物学における最新の見解). 8, 370-374.
3. Perez-Garcia(ペレス-ガルシア), MT等,(1995年) Functional properties of cardiac L-type calcium channels transiently expressed in HEK293 cells(HEK293細胞において一過性に発現する心臓L-型カルシウムチャネルの機能的特性). Roles of alpha 1 and beta subunits(アルファ1及びベータサブユニットの役割). J. Gen. Physio.(一般生理学誌) 105, 289-305.
4. Brady(ブレディ) AE, Limbird(リムバード) LE.(2002年) G protein-coupled receptor interacting proteins(Gタンパク質-共役受容体相互作用タンパク質): Emerging roles in localization and signal transduction(局在化及びシグナル伝達における新たな役割). Cell Signal(細胞性情報伝達) 14 (4): 297-309
5. Ruiz-Velasco(ルイス-ベラスコ) V, Ikeda(イケダ) SR, Puhl(プール) HL.(2002年) Cloning, tissue distribution, and functional expression of the human G protein {beta} 4-subunit(ヒトGタンパク質{ベータ}4-サブユニットのクローン化、組織分布、及び機能的発現). Physiol Genomics(生理学的ゲノム科学) 8 (1) : 41-50
6. Walker(ウォーカー), D等.(1998年) A β4 isoform-specific interaction site in the carboxyl-terminal region of the voltage-dependent Ca2+ channel αlA subunit(電位-依存性Ca2+チャネルαlAサブユニットのカルボキシ-端領域におけるβ4イソ型-特異的相互作用部位). J. Biol. Chem.(生物化学誌), 273, 2361-2367.
7. Xu(スー)及びLi(リー),(1998年) Auxiliary Subunits of Shaker-type potassium channels(振盪機-型カリウムチャネルの補助的サブユニット). Trends. Cardiovasc. Med.(心血管医薬における動向), 8, 229-234.
8. Zhu(チュー) H, Klemic(クレミック) JF, Chang(チャン) S, Bertone(ベルトーネ) P, Casamayor(カーサメイヤー) A, Klemic KG, Smith(スミス) D, Gerstein(ガーシュタイン) M, Reed(リード) MA, Snyder(スナイダー) M. Analysis of yeast protein kinases using protein chips(タンパク質チップを用いる酵母プロテインキナーゼの分析). Nat Genet(ネイチャー遺伝学)(2000年) 26 (3): 283-9
9. Dolly(ドリー), JO及びParcej(パース), DN(1996年) Molecular properties of voltage-gated K+ channels(電位-作動型K+チャネルの分子的特性). J. Bioenerg. Biomembr.(生体エネルギー論及び生体膜誌), 28, 231-253.
10. Scott(スコット), VE等,(1990年) Alpha-dendrotoxin acceptor from bovine brain is a K+ channel protein(ウシ脳からのアルファ-デンドロトキシン・アクセプタはK+チャネルタンパク質である). Evidence from the N-terminal sequence of its larger subunit(そのより一層大きなサブユニットのN-端配列からの証拠). J. Biol. Chem., 265, 20094-20097.
11. Wang(ワン), Z等,(1996年) Comparison of Binding and Block Produced by Alternatively Spliced Kvβ1 Subunits(選択的にスプライシングされたKvβ1 サブユニットにより生産された結合及びブロックの比較). J. Biol. Chem., 271, 28311-28317.
12. Restituito(レスティテゥイト), S等,(2001年) Ca2+ Channel Inactivation Heterogeneity Reveals Physiological Unbinding of Auxiliary Subunits(Ca2+チャネル不活化の異種性が補助的サブユニットの生理学的解離を明らかにする). Biophys. J.(生物物理学誌) 81, 89-96.
13. Strader(ストラダー), CD等(1994年) Structure and function of G-protein-coupled receptors(G-タンパク質-共役受容体の構造及び機能). Annu. Rev. Biochem.(アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリ), 63, 101-132.
14. Strader, CD等(1995年) The family of G-protein-coupled receptors(G-タンパク質-共役受容体の系列). FASEB J.(FASEB誌), 9, 745-754.
15. Tucker(タッカー), S. J.及びAshcroft(アシュクロフト), F. M.(1999年) Mapping of the physical interaction between the intracellular domains of an inwardly rectifying potassium channel, Kir6.2(内向きに整流されるカリウムチャネル、Kir6.2の細胞内ドメイン間の物理的相互作用の地図作製). J. Biol. Chem., 274, 33393-33397.
16. Yokoyama(ヨコヤマ), CT等(1997年) Phosphorylation of the synaptic protein interaction site on N-type calcium channels inhibits interactions with SNARE proteins(N-型カルシウムチャネル上のシナプス性タンパク質相互作用部位のリン酸化はスネアタンパク質との相互作用を抑制する). J. Neurosci.(神経科学誌), 17, 6929-6938.
17. Gelber(ゲルバー), E等,(1999年) Structure and function of the third intracellular loop of the 5-HT2A receptor(5-HT2A受容体の第3細胞内ループの構造及び機能): The third intracellular loop is α-helical and binds purified arrestins(第3細胞内ループはα-ヘリックスであり、及び精製したアレスチンに結合する).
18. Weixel(ワイクセル), KM及びBradbury(ブラッドベリー), NA(2001年) μ2 Binding directs the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the clathrin-mediated endocytic pathway(μ2結合はクラスリン-媒介エンドサイトーシス経路に対する嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子に指向する). J. Biol. Chem., 49, 46251-46259.
19. Tu(トゥー), JC等(1998年) Homer binds a novel proline-rich motif and links group 1 metabotropic glutamate receptors with IP3 receptors(ホーマーは新しいプロリンに富むモティーフに結合し、及び代謝調節型のグルタミン酸受容体をIP3受容体と連結させる). Neuron(ニューロン), 21, 717-726.
20. Shieh(シー), B-H及びZhu, M-Y(1996年) Regulation of the TRP Ca+ channel by INAD in Drosophila photoreceptors(ショウジョウバエ光受容体におけるINADによるTRP Ca+チャネルの調節). Neuron, 16, 991-998.
21. Pongs(ポングス), O., Leicher(ライヒャー), T. , Berger(バーガー), M.等(1999年) Functional and molecular aspects of voltage-gated K+ channel β subunits(電位-作動型K+チャネルβサブユニットの機能的及び分子的局面).
22. Walker, D. and Waard(ワード), M:(1998年) Subunit interaction sites in voltage- dependent Ca2+ channels: role in channel function(電位-依存性Ca2+チャネルにおけるサブユニット相互作用部位:チャネル機能における役割).
23. Onrust(オンルスト), R, Herzmark(ヘルツマーク), P等(1997年) Receptor and βγ binding sites in the α subunit of the retinal G-protein transcducin(網膜のG-タンパク質トランスデューシンのαサブユニットにおける受容体及びβγ結合部位). Science(サイエンス), 275, 381-384
24. Bourne(ボーン), HR(1997年) How receptors talk to trimeric G proteins(受容体はどのようにして三量体Gタンパク質と通信する). Curr. Opin. Cell. Biol.(細胞生物学における現代の見解), 9, 134-142.
25. Ferguson(ファーガスン), SSG(2001年) Evolving concepts in G protein-coupled receptor endocytosis(Gタンパク質-共役受容体エンドサイトーシスにおける発展的理念): The role in receptor desensitization and signaling(受容体脱感作及び情報伝達における役割). Pharmacol. Rev.(薬理学的総説), 53, 1-24.
26. Krupnick(クルプニック), JG等,(1994年) Arrestin-rhodopsin interaction(アレスチン-ロドプシン相互作用). Multi-site binding delineated by peptide inhibition(ペプチド抑制によって描かれる多-部位結合). J. Biol. Chem. 269, 3226-3232.
27. Nam(ナン), T-W等,(2001年) The Escherichia coli glucose transporter enzyme IICBGlc recruits the global repressor Mlc(大腸菌輸送体酵素IICBGlcは全体的なリプレッサーMlcを漸加する). EMBO J. 20, 491-498.
28. Zhang(チャン), J-Z等,(2001年) Overexpression of stomatin depresses GLUT-1 glucose transporter activity(ストマチンの高発現はGLUT-1グルコース輸送体活性を抑制する). Am. J. Physiol. Cell. Physiol.(アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー-セル・フィジオロジー), 280, C1277-C1283.
タンパク質配列ヒトKvβ1サブユニットコアドメイン(残基87-419):
GTGMKYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGGQISDEVAERLMTIAYESG
VNLFDTAEVYAAGKAEVILGSIIKKKGWRRSSLVITTKLYWGGKAETE
RGLSRKHIIEGLKGSLQRLQLEYVDVVFANRPDSNTPMEEIVRAMTHVI
NQGMAMYWGTSRWSAMEIMEAYSVARQFNMIPPVCEQAEYHLFQRE
KVEVQLPELYHKIGVGAMTWSPLACGIISGKYGNGVPESSRASLKCYQ
WLKERIVSEEGRKQQNKLKDLSPIAERLGCTLPQLAVAWCLRNEGVSS
VLLGSSTPEQLIENLGAIQVLPKMTSHVVNEIDNILRNKPYSKKDYRS
GLQFYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGGQITDEMAEQLMTLAYDNGI
NLFDTAEVYAAGKAEVVLGNIIKKKGWRRSSLVITTKIFWGGKAETER
GLSRKHIIEGLKASLERLQLEYVDWFANRPDPNTPMEETVRAMTHVIN
QGMAMYWGTSRWSSMEIMEAYSVARQFNLTPPICEQAEYHMFQREK
VEVQLPELFHKIGVGAMTWSPLACGIVSGKYDSGIPPYSRASLKGYQW
LKDKILSEEGRRQQAKLKELQAIAERLGCTLPQLAIAWCLRNEGVSSVL
LGASNADQLMENIGAIQVLPKLSSSIIHEIDSILGNKPYSKKDYRS
GTGMKYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGSQISDETAEDVLTVAYEHG
VNLFDTAEVYAAGKAERTLGNILKSKGWRRSSYVITTKIFWGGQAETE
RGLSRKHIIEGLRGSLERLQLGYVDIVFANRSDPNCPMEEIVRAMTYVI
NQGLALYWGTSRWGAAEIMEAYSMARQFNLIPPVCEQAEHHLFQREK
VEMQLPELYHKIGVGSVTWYPLACGLITSKYDGRVPDTCRASIKGYQW
LKDKVQSEDGKKQQAKVMDLLPVAHQLGCTVAQLAIAWCLRSEGVSS
VLLGVSSAEQLIEHLGALQVLSQLTPQTVMEIDGLLGNKPHSKK
GTGMKYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGGQISDEVAERLMTIAYESG
VNLFDTAEVYAAGKAEVILGSIIKKKGWRRSSLVITTKLYWGGKAETE
RGLSRKHIIEGLKGSLQRLQLEYVDVVFANRPDSNTPMEEIVRAMTHVI
NQGMAMYWGTSRWSAMEIMEAYSVARQFNMIPPVCEQAEYHLFQRE
KVEVQLPELYHKIGVGAMTWSPLACGIISGKYGNGVPESSRASLKCYQ
WLKERIVSEEGRKQQNKLKDLSPIAERLGCTLPQLAVAWCLRNEGVSS
VLLGSSTPEQLIENLGAIQVLPKMTSHWNEIDNILRNKPYSKKDYRS
GLQFYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGGQITDEMAEHLMTLAYDNGI
NLFDTAEVYAAGKAEVVLGNIIKKKGWRRSSLVITTKIFWGGKAETER
GLSRKHIIEGLKASLERLQLEYVDVVFANRPDPNTPMEETVRAMTHVIN
QGMAMYWGTSRWSSMEIMEAYSVARQFNLIPPICEQAEYHMFQREKV
EVQLPELFHKIGVGAMTWSPLACGIVSGKYDSGIPPYSRASLKGYQWL
KDKILSEEGRRQQAKLKELQAIAERLGCTLPQLAIAWCLRNEGVSSVLL
GASNAEQLMENIGAIQVLPKLSSSIVHEIDSILGNKPYSKKDYRS
GTGMKYRNLGKSGLRVSCLGLGTWVTFGSQISDETAEDLLTVAYEHG
VNLFDTAEVYAAGKAERTLGNILKSKGWRRSSYVITTKIFWGGQAETE
RGLSRKHIIEGLQGSLDRLQLEYVDIVFANRSDPSSPMEEIVRAMTYVIN
QGLALYWGTSRWSAAEIMEAYSMARQFNLIPPVCEQAENHFFQREKV
EMQLPELYHKIGVGSVTWSPLACSLITSKYDGQVPDACKATVKGYQW
LKEKVQSEDGKKQQARVTDLLPIAHQLGCTVAQLAIAWCLRSEGVSSV
LLGVSSAEQLMEHLGSLQVLGQLTPQTVMEIDALLGNKSHSKK
Claims (15)
- 配列体であって、表面を含み、それに付着する少なくとも1種の細胞質性付属タンパク質を持ち、通常複合化されるその膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まない配列体。
- 前記細胞質性付属タンパク質が、相同的な膜タンパク質の系列の一員である膜タンパク質の細胞質性付属タンパク質である請求項1記載の配列体。
- 相同的な膜タンパク質の系列が、イオン−チャネル、Gタンパク質共役受容体及び貫膜輸送体タンパク質からなる群より選ばれる請求項2記載の配列体。
- 前記細胞質性付属タンパク質が相同的な付属タンパク質の系列の一員である請求項1記載の配列体。
- 前記系列が、イオン−チャネルサブユニット、受容体相互作用タンパク質及び膜輸送体タンパク質に対する付属タンパク質からなる群より選ばれる請求項4記載の配列体。
- 前記系列が、K+−チャネルβ−サブユニット、Ca2+−チャネルβ−サブユニット、Gタンパク質サブタイプ及び輸送体のための付属タンパク質からなる群より選ばれる請求項4記載の配列体。
- 前記系列が、Kvチャネルβ−サブユニット、カルシウムチャネルβ−サブユニット、Gs系列、Gt系列、Gi系列、Gi−0系列、Gq−11系列、Gα−感覚系列、βγ系列及び輸送体のための付属タンパク質からなる群より選ばれる請求項4記載の配列体。
- 細胞質性付属タンパク質が、所定の膜タンパク質と相互作用するか、又はその反対であるかを定める方法であって、前記方法が次の工程:
(i)候補の細胞質性付属タンパク質で、1種又はそれより多い種類の対象の細胞質性付属タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程;
(ii)配列体を、前記膜タンパク質の細胞質性断片及び/又は他の関連する膜タンパク質系列の一員の細胞質性断片と接触させる工程;及び
(iii)相互作用する相手を検出し、及び同定する工程
を含む方法。 - 細胞質性付属タンパク質と選択的に相互作用する能力について、化合物又はペプチド又はタンパク質をスクリーニングする方法であって、前記方法が次の工程:
(i)細胞質性付属タンパク質で、1種又はそれより多い種類の対象の細胞質性タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程;
(ii)配列体を化合物又はペプチド又はタンパク質と接触させる工程;及び
(iii)相互作用する相手を同定する工程
を含む方法。 - 方法が、追加の工程(iv)であって、相互作用する相手の相互作用を定量化する工程を含む請求項9記載の方法。
- 細胞質性付属タンパク質及び膜タンパク質の間の相互作用を選択的に修飾する能力について、化合物又はペプチド又はタンパク質をスクリーニングする方法であって、前記方法が次の工程、
(i)細胞質性付属タンパク質で、1種又はそれより多い種類の対象の細胞質性タンパク質の系列からの、通常複合体化されるそれらの膜タンパク質成分又は他のサブユニットを含まないものの配列体を提供する工程;
(ii)配列体を、化合物又はペプチド又はタンパク質と、及び対象の1種又はそれより多い種類の膜タンパク質又はその細胞質性断片と、同時にか、又は順にかのいずれかで接触させる工程;及び
(iii)前記相互作用が前記化合物又はペプチド又はタンパク質の存在によって修飾されるかどうかを定める工程
を含む方法。 - 前記方法が、追加の工程(iv)であって、相互作用の修飾の程度を定量化する工程を含む請求項11記載の方法。
- 配列体の使用であって、請求項1〜7のいずれか一項記載の細胞質性付属タンパク質の配列体を、付属タンパク質の系列の異なる一員の相対的触媒活性を測定するのに用いる使用。
- 配列体の使用であって、請求項1〜7のいずれか一項記載の細胞質性付属タンパク質の配列体を、表現型−遺伝子型−結合抗体(例えば、ファージ提示抗体)のライブラリから抗体を選ぶための親和性表面として用いる使用。
- 配列体の使用であって、請求項1〜7のいずれか一項記載の細胞質性付属タンパク質の配列体を、付属タンパク質と膜タンパク質との相互作用上に、及び/又は前記膜タンパク質の特性上に及ぼす翻訳後修飾の効果を定めるために用いる使用。
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