ES2287169T3 - Procedimiento para detectar cancer de ovario basado en calicreina humana 6 (hk6). - Google Patents
Procedimiento para detectar cancer de ovario basado en calicreina humana 6 (hk6). Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento in vitro para diagnosticar o hacer un seguimiento del cáncer de ovario o determinar el pronóstico de cáncer de ovario en un sujeto que comprende: (a) determinar el nivel de calicreína humana 6 en una muestra de suero del sujeto; y (b) comparar el nivel determinado de calicreína humana 6 con un nivel presente en una muestra de suero control adquirida de un sujeto control que se sabe que no está afectado por cáncer de ovario o con enfermedad benigna o una muestra de suero control tomada del sujeto en un momento diferente, en el que un aumento en el nivel de calicreína humana 6 en la muestra de suero del sujeto en comparación con el nivel de calicreína humana 6 en la muestra de suero control es indicativo de cáncer de ovario en el sujeto o mal pronóstico.
Description
Procedimiento para detectar cáncer de ovario
basado en calicreína humana 6 (hK6).
La invención se refiere a procedimientos de
diagnóstico y pronóstico para carcinoma de ovario.
Hasta hace poco, se creía que la familia de
genes de la calicreína humana consistía sólo en 3 genes: calicreína
pancreática/renal (KLK1, que codifica para la proteína hK1),
calicreína glandular humana 2 (KLK2, que codifica para la proteína
hK2) y calicreína humana 3 (KLK3, que codifica para la proteína hK3
o antígeno prostático específico, PSA). Las dos últimas
calicreínas, PSA y hK2, son relativamente específicas de la próstata
y ya se han encontrado aplicaciones importantes para ellas como
biomarcadores para el diagnóstico y seguimiento del cáncer de
próstata (1-6).
Recientemente se han descubierto nuevos miembros
de la familia de genes de la calicreína humana (1). Esta familia de
genes contiene ahora al menos 14 genes que codifican todos para las
serina proteasas, muestran una homología significativa tanto a
nivel de ADN como de aminoácidos y están ubicados todos en el locus
cromosómico 19q13.3-q13.4, en tándem, sin ninguna
intervención de otros genes distintos de la calicreína. Este área de
investigación se ha revisado recientemente (1).
El gen KLK6 (que codifica para la calicreína
humana 6, hK6) se ha clonado independientemente por tres grupos de
investigadores y se le dieron anteriormente los nombres zyme (7),
proteasa M (8) y neurosina (9). Recientemente, se ha establecido
una nomenclatura uniforme para todos los genes de calicreína
tradicionales y descubiertos recientemente (10). El gen KLK6
codifica para una serina proteasa similar a la tripsina de 244
aminoácidos de longitud, de los que 16 aminoácidos constituyen el
péptido señal y 5 aminoácidos, el péptido de activación. La enzima
madura consiste en 223 aminoácidos. Se ha predicho previamente que
la hK6 es una proteína secretada (7-9,11). Esto se
verificó recientemente por el hallazgo de la proteína hK6 en
diversos fluidos biológicos, incluyendo líquido cefalorraquídeo,
fluido mamario del pezón, fluido quístico mamario, suero de hombres
y de mujeres, plasma seminal, líquido amniótico y citosoles de
cáncer de mama (12). Little et al. (7) han demostrado que
esta enzima presenta potencial amiloidogénico en el cerebro y puede
desempeñar un papel en el desarrollo y la evolución de la
enfermedad de Alzheimer. Otros han clonado el mismo gen mediante el
procedimiento de visualización diferencial, y han encontrado que
está regulado por disminución en formas agresivas de cáncer de mama
(8). Yamashiro et al. clonaron el mismo gen a partir de la
línea celular de adenocarcinoma de colon humano COLO 201 (9).
Entre las calicreínas humanas clásicas, la PSA
ha demostrado ser el biomarcador más valioso para el cáncer de
próstata y se usa actualmente para el diagnóstico y seguimiento de
esta enfermedad (2-4). También se ha introducido
recientemente otro posible biomarcador prostático, hK2 (5, 6). Entre
las calicreínas descubiertas recientemente (1), ninguna de ellas se
ha examinado como marcador serológico para ningún cáncer dado que
actualmente no existen procedimientos para medir las proteínas
secretadas con alta sensibilidad y especificidad.
El cáncer de ovario es una enfermedad grave que
provoca más muertes que ningún otro cáncer del sistema reproductor
femenino (13). Dado que la supervivencia podría mejorarse
enormemente si la enfermedad se diagnosticara pronto (14), existe
un gran interés por la identificación de biomarcadores que podrían
ayudar en la detección temprana y facilitar la clasificación y/o
estadificación (15). Desafortunadamente, los marcadores serológicos
actuales para carcinoma de ovario, incluyendo CA125
(16-19), inhibina (20-23), OVX1 (24)
así como muchos otros marcadores (revisados en 25) han mostrado
alguna promesa pero no han ganado una aceptación clínica amplia.
Otro marcador de cáncer de ovario potencial, el ácido
lisofosfatídico, parece presentar también algún valor para este fin
(26).
Anisowiez et al, Molecular Medicine
(1996), 2(5), 624-636 se refiere al
aislamiento de proteasa M (también conocida como calicreína 6) y da
a conocer que el ARNm de proteasa M se expresa intensamente en las
líneas celulares y el tejido de cáncer de ovario y puede ser útil
como marcador para la detección de cáncer de ovario primario. Sin
embargo, los autores concluyeron que la proteína principalmente se
localiza intracelularmente más que se secreta ya que pudieron
detectarla en lisados celulares pero no en medios acondicionados.
Los autores también observaron una carencia de correlación entre
los niveles de expresión de ARNm de proteasa M (altos) y niveles de
proteína proteasa M (bajos o ausentes) en líneas celulares de cáncer
de mama.
El documento
WO-A-98/11238 se refiere al
descubrimiento de proteasa M y da a conocer la utilización de
anticuerpos para detectar proteasa M en un sobrenadante o lisado
celular.
El documento
WO-A-98/41656 se refiere a un
procedimiento para detectar cáncer de ovario que comprende examinar
una pluralidad de marcadores de proteasa en el tejido. En
particular, el documento se refiere a detectar en muestras de
tejido proteasas del grupo que consiste en enzima quimotríptica del
estrato córneo (SCCE), TADG12, TADG13, TADG14, hepsina,
pump-1 y proteasa M.
\newpage
Existe una necesidad urgente de descubrir y
validar nuevos biomarcadores para carcinoma de ovario. El
diagnóstico temprano del cáncer de ovario, particularmente con
análisis serológicos, puede mejorar los desenlaces clínicos a
través de la administración de un tratamiento eficaz.
Se desarrolló un inmunoensayo para hK6 altamente
sensible para medir hK6 en diversos fluidos biológicos (ejemplo 1).
Usando este ensayo sensible, se encontró que la concentración de hK6
en suero estaba aumentada significativamente en una gran proporción
de pacientes con cáncer de ovario. En particular, se encontró que la
hK6 estaba significativamente aumentada en pacientes con cáncer de
ovario en comparación con pacientes sin cáncer normales y pacientes
con enfermedad benigna. Por tanto la hK6 constituye un nuevo
biomarcador para el diagnóstico y seguimiento de cáncer de ovario.
La hK6 puede usarse para diagnosticar y hacer el seguimiento de
cáncer de ovario en fase tardía, y puede usarse como biomarcador
antes de la cirugía o tras la recidiva.
Los presentes inventores también cuantificaron
la cantidad de hK6 en extractos de tumores de ovario y determinaron
que la cantidad de hK6 se correlacionaba con variables
clinicopatológicas documentadas en el momento de la escisión
quirúrgica y con evolución de la supervivencia libre y la
supervivencia global. Se encontró que los niveles de hK6 aumentados
predicen un comportamiento más agresivo del tumor a lo largo del
tiempo. Se encontró que la positividad de hK6 estaba asociada con
aproximadamente un aumento de 2 veces en el riesgo tanto de
evolución de la enfermedad como de muerte.
La hK6 y los agentes que se unen a la hK6 pueden
usarse para detectar cáncer de ovario y en particular pueden usarse
en la evaluación del diagnóstico de cáncer de ovario y la
identificación de sujetos con una predisposición al cáncer de
ovario.
La presente invención se refiere a un
procedimiento in vitro para diagnosticar o hacer un
seguimiento del cáncer de ovario o determinar el pronóstico de
cáncer de ovario en un sujeto que comprende:
- (a)
- determinar el nivel de calicreína humana 6 en una muestra de suero del sujeto; y
- (b)
- comparar el nivel determinado de calicreína humana 6 con un nivel presente en una muestra de suero control adquirida de un sujeto control que se sabe que no está afectado por cáncer de ovario o con enfermedad benigna o una muestra de suero control tomada del sujeto en un momento diferente, siendo un aumento en el nivel de calicreína humana 6 en la muestra de suero del sujeto en comparación con el nivel de calicreína humana 6 en la muestra de suero control indicativo de cáncer de ovario en el sujeto o mal pronóstico.
Los términos "que detecta" o
"detectar" incluyen someter a ensayo, cuantificar, generar
imágenes o establecer de otra manera la presencia o ausencia de la
hK6 diana, subunidades de la misma, o combinaciones o dianas unidas
a reactivos, y similares, o someter a ensayo, generar imágenes,
averiguar, establecer o determinar de otra manera una o más
características objetivas de cáncer de ovario, metástasis, fase o
estados similares. El término abarca el diagnóstico, pronóstico y
el seguimiento de aplicaciones para hK6.
En una forma de realización, la invención se
refiere a un procedimiento para detectar cáncer de ovario en un
sujeto cuantificando la hK6 en una muestra biológica del sujeto que
comprende (a) hacer reaccionar la muestra biológica con un
anticuerpo específico para hK6 que está directa o indirectamente
marcado con una sustancia detectable; y (b) detectar la sustancia
detectable.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento para diagnosticar y hacer el seguimiento de carcinoma
de ovario en un sujeto cuantificando la hK6 en una muestra de un
sujeto que comprende (a) hacer reaccionar una muestra biológica del
sujeto con un anticuerpo específico para hK6 que está directa o
indirectamente marcado con una sustancia detectable; (b) y detectar
la sustancia detectable.
Las formas de realización de los procedimientos
de la invención implican (a) hacer reaccionar una muestra biológica
de un sujeto con un anticuerpo específico para hK6 que está directa
o indirectamente marcado con una enzima; (b) añadir un sustrato
para la enzima seleccionando el sustrato de modo que el sustrato, o
un producto de reacción de la enzima y el sustrato forma complejos
fluorescentes; (c) cuantificar la hK6 en la muestra midiendo la
fluorescencia de los complejos fluorescentes; y (d) comparar los
niveles cuantificados con los de un patrón. El patrón puede
corresponder a niveles obtenidos para otras muestras del paciente
sujeto o sujetos control. En una forma de realización, los niveles
cuantificados se comparan con niveles cuantificados para sujetos
sin carcinoma de ovario siendo un aumento en los niveles de hK6 en
comparación con los sujetos control indicativo de carcinoma de
ovario, en particular carcinoma de ovario en fase tardía.
Una forma de realización preferida de la
invención comprende las etapas siguientes
- (a)
- incubar una muestra biológica con un primer anticuerpo específico para hK6 que está directa o indirectamente marcado con una sustancia detectable, y un segundo anticuerpo específico para hK6 que está inmovilizado;
- (b)
- separar el primer anticuerpo del segundo anticuerpo para proporcionar una primera fase de anticuerpo y una segunda fase de anticuerpo;
- (c)
- detectar la sustancia detectable en la primera o segunda fase de anticuerpo cuantificando de este modo la hK6 en la muestra biológica; y
- (d)
- comparar la hK6 cuantificada con niveles para un patrón.
El patrón puede corresponder a niveles
cuantificados para muestras de sujetos control sanos, de sujetos con
enfermedad benigna, sujetos con enfermedad en fase temprana o de
otras muestras del sujeto. Los niveles de hK6 aumentados en
comparación con el patrón pueden ser indicativos de cáncer de
ovario, en particular cáncer de ovario en fase tardía.
La invención contempla asimismo los
procedimientos descritos en la presente memoria usando múltiples
marcadores para el cáncer de ovario. Por tanto, la invención
contempla un procedimiento para analizar una muestra biológica para
determinar la presencia de hK6 y otros marcadores que son
indicadores específicos de cáncer de ovario. Otros marcadores
incluyen marcadores de calicreínas tales como enzima quimotríptica
del estrato córneo humana (HSCCE), calicreína 4, calicreína 5,
calicreína 8, calicreína 9, calicreína 10, calicreína 11; CA125,
CA15-3, CA19-9, OVX1, ácido
lisofosfatídico (LPA) y antígeno carcinoembriónico (CEA).
Preferentemente los otros marcadores son marcadores de calicreínas.
En una forma de realización preferida, los marcadores son dos o más
de entre hK6, hK10 y CA 125. Los procedimientos descritos en la
presente memoria pueden modificarse incluyendo reactivos para
detectar los marcadores adicionales, o ácidos nucleicos para los
marcadores.
La invención se refiere asimismo a kits para
llevar a cabo los procedimientos de la invención.
Otros objetos, características y ventajas de la
presente invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir
de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse
que la descripción detallada y los ejemplos específicos aunque
indican formas de realización preferidas de la invención, se dan
sólo a modo de ilustración, ya que diversos cambios y
modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención
resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir de
esta descripción detallada.
La invención se describirá ahora en relación con
los dibujos, en los que:
La figura 1 es una curva de calibración para un
ensayo de proteína hK6. La fluorescencia del patrón cero
(\sim18.000 unidades arbitrarias de fluorescencia) se restó de
todas las demás mediciones.
La figura 2 muestra los resultados de separación
por cromatografía de líquidos de alta resolución de tres fluidos
biológicos y el análisis de todas las fracciones con el inmunoensayo
para hK6 desarrollado. En los tres fluidos, se detectó un único
pico inmunorreactivo alrededor de las fracciones
38-42, lo que corresponde a una masa molecular de
\sim30 kDa. La columna se calibró con patrones de peso molecular
(mostrados en la parte superior con flechas; las masas están en
kDa). La muestra de leche se diluyó 10 veces antes de la inyección
a la columna de HPLC.
La figura 3 es una gráfica que muestra los
resultados de los análisis de diversos extractos citosólicos de
tejido humano para la proteína hK6.
La figura 4 es una gráfica que muestra la
distribución de frecuencia de concentraciones de hK6 en el suero de
80 pacientes con carcinoma de ovario. El nivel de 15 \mug/l que se
usó como límite en la tabla 1 se indica mediante una flecha.
Aproximadamente el 66% de pacientes con cáncer de ovario presentan
una concentración de hK6 en suero mayor que este valor límite. De
otras 298 muestras de suero con cáncer no de ovario, sólo 2 sueros
presentaban valores ligeramente mayores que 15 \mug/l (véase la
tabla 1).
La figura 5 es una gráfica que muestra la
correlación entre la concentración de hK6 y CA125 en 96 muestras de
suero de pacientes con cáncer de ovario.
La figura 6 son gráficas que muestran los
análisis de hK6 y CA125 en muestras de suero en serie de pacientes
con cáncer de ovario. Estos datos sugieren que la hK6 puede tener un
valor para el seguimiento de pacientes.
La figura 7A es una gráfica que muestra la
distribución de hK6 en pacientes normales, con respecto a benignos,
con respecto a pacientes con cáncer.
La figura 7B es una gráfica que muestra la
distribución de CA 125 en pacientes normales, con respecto a
benignos, con respecto a pacientes con cáncer.
La figura 8 es una gráfica que muestra la
concentración de hK6 en muestras de suero prequirúrgicas y
posquirúrgicas de pacientes con cáncer de ovario.
La figura 9 es una gráfica que muestra la
correlación entre concentraciones de hK6 y CA125 en suero.
La figura 10 es una gráfica que muestra la
sensibilidad y especificidad de concentraciones de hK6 en suero.
La figura 11A es una gráfica que muestra la
concentración de hK6 frente a la fase del cáncer de ovario.
La figura 11B es una gráfica que muestra la
concentración de hK6 frente al grado del cáncer de ovario.
La figura 12A es una gráfica que muestra la
probabilidad de supervivencia frente a supervivencia libre de
progresión (SLP).
La figura 12B es una gráfica que muestra la
probabilidad de supervivencia frente a supervivencia global
(SG).
La figura 13(A) es una gráfica que
muestra la distribución de frecuencia de la actividad específica de
hK6 en extractos de tumor de ovario. El valor de 35 ng/mg de
proteína total corresponde al límite que, según el análisis de chi
cuadrado, da la mejor predicción de supervivencia global de la
población de estudio (véase la figura 13(B) para la
representación gráfica de chi cuadrado). Los tumores con hK6
superior a 35 ng/mg de proteína total se clasificaron como hK6
positivos y aquéllos con valores inferiores a o iguales a 35 ng/mg
de proteína total se clasificaron como hK6 negativos. El 30% de los
tumores se clasificaron como positivos según este criterio.
La figura 13(B), representación gráfica
de la actividad específica tumoral de hK6 frente a estadística de
chi cuadrado para determinar el límite entre tumores hK6 positivos y
hK6 negativos que predice de la mejor manera la supervivencia
global. El máximo potencial de predicción se produjo entre 28 y 40
ng de proteína hK6 de extracto total con un pico a 35 ng de hK6/mg
de proteína de extracto total.
La figura 14 es una gráfica que muestra una
comparación de la concentración de hK6 en extractos de tejidos
ováricos normales ("normal") y cáncer de ovario
("cáncer"). N indica el número de muestras en cada grupo. Las
barras horizontales representan la actividad específica media de hK6
(ng de hK6/mg de proteína de extracto total) en cada grupo. La
prueba de Krustal Wallis mostró que actividad específica de hK6
extraída era significativamente elevada en las preparaciones de
tumor de ovario (P<0,001).
La figura 15 es una gráfica que muestra la
distribución de actividad específica de hK6 (ng de hK6/mg de
proteína total) en extractos de tumor de pacientes con cáncer de
ovario en fase I/II y fase III/IV. N indica el número de tumores
que comprende cada grupo. Las barras horizontales representan el
valor medio de actividad específica tumoral de hK6. La prueba de
Mann-Whitney demostró que la actividad específica de
hK6 era significativamente elevada en tumores de pacientes con
cáncer de ovario en fase III/IV (P=0,002).
La figura 16 muestra las curvas de supervivencia
de Kaplan-Meier de toda la población de pacientes en
estudio:efecto del estado de hK6. Parte superior: supervivencia
libre de progresión (SLP). Parte inferior: supervivencia global
(SG). El número de pacientes en cada grupo (n) se indica tal como la
significación estadística (valor P) de la diferencia de
supervivencia entre los grupos hK6 positivo y hK6 negativo. El
efecto adverso de la positividad de hK6 tanto sobre el tiempo con
respecto a la evolución como la supervivencia global era
significativo.
La figura 17 son gráficas que muestran el efecto
del estado de hK6 (positivo o negativo) sobre la supervivencia
libre de progresión (SLP) y sobre la supervivencia global (SG) entre
los pacientes con tumor de ovario de grado I y II. El número de
pacientes en cada grupo (n) se indica tal como la significación
estadística (valor P) de la diferencia de supervivencia entre los
individuos hK6 positivos y hK6 negativos. El efecto adverso de la
positividad de hK6 tanto sobre el tiempo con respecto a la evolución
como sobre la supervivencia global era significativo
(P\leq0,002).
La figura 18 es una representación gráfica que
muestra la ubicación inmunohistoquímica de hK6 en neoplasias de
ovario de potencial maligno variable, tipo de célula y origen
(epitelial frente a mesenquimatoso). (A) Adenocarcinoma seroso
papilar invasivo, el tumor epitelial maligno común del ovario.
Obsérvese la fuerte tinción citoplasmática de muchas células
tumorales y la ausencia de tinción de estromas o vasos. (B)
Cistadenofibroma seroso, una neoplasia benigna, fibrosa y epitelial
mixta. La inmunotinción está ausente en el componente fibroso, pero
es fuertemente positiva en el citoplasma del epitelio que reviste
los quistes. (C) Leiomioma de ovario, un tumor del músculo liso
benigno. Obsérvese la ausencia de tinción. (D) Tumor epitelial
mucinoso de bajo potencial maligno, un tumor epitelial de grado
intermedio. Obsérvese una débil tinción citoplásmica difusa del
epitelio neoplásico y ausencia de tinción en el estroma conjuntivo
(extremo izquierdo).
Tal como se ha mencionado anteriormente en la
presente memoria, la presente invención proporciona un procedimiento
para hacer el seguimiento, diagnosticar, o para el pronóstico de
carcinoma de ovario en un sujeto detectando hK6 en una muestra
biológica del sujeto. En una forma de realización, el procedimiento
comprende hacer reaccionar la muestra con un agente que se une a
hK6, preferentemente un anticuerpo específico para hK6 que está
directa o indirectamente marcado con una sustancia detectable, y
detectar la sustancia detectable.
\newpage
Los procedimientos de la invención pueden usarse
para la detección de o bien una superabundancia o bien una falta de
abundancia de hK6 con respecto a un estado de no trastorno o la
presencia de una hK6 modificada (por ejemplo, de menos de la
longitud completa) que se correlaciona con un estado de trastorno
(por ejemplo cáncer de ovario), o una evolución hacia un estado de
trastorno. Los procedimientos descritos en la presente memoria
pueden usarse para evaluar la probabilidad de la presencia de
células malignas o premalignas, por ejemplo, en un grupo de células
recientemente eliminadas de un huésped. Dichos procedimientos pueden
usarse para detectar tumores, cuantificar su crecimiento y ayudar
en el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad. Los procedimientos
pueden usarse para detectar la presencia de metástasis cancerosa,
así como confirmar la ausencia o eliminación de todo el tejido
tumoral tras la cirugía, quimioterapia contra el cáncer y/o
radioterapia. Además pueden usarse para hacer el seguimiento de la
quimioterapia contra el cáncer y la reaparición de tumores.
Los procedimientos de la invención son
particularmente útiles en el diagnóstico de carcinoma de ovario en
fase tardía y para el pronóstico de la evolución de la enfermedad y
mortalidad del carcinoma de ovario. Tal como se ilustra en la
presente memoria, un aumento en los niveles de hK6 detectados en
suero en comparación con un patrón son indicativos de enfermedad en
fase tardía, y un aumento en los niveles de hK6 en tejidos
tumorales o extractos de los mismos en comparación con un patrón son
indicativos de un aumento en el riesgo de evolución de la
enfermedad y mortalidad.
Los términos "muestra", "muestra
biológica" y similares significan un material que se sabe o se
sospecha que expresa o contiene hK6. La muestra de prueba puede
usarse directamente tal como se obtiene de la fuente o tras un
pretratamiento para modificar el carácter de la muestra. La muestra
puede derivar de cualquier fuente biológica, tal como tejidos o
extractos, incluyendo células (por ejemplo células tumorales) y
fluidos fisiológicos, tales como, por ejemplo, sangre completa,
plasma, suero, saliva, fluido ocular del cristalino, líquido
cefalorraquídeo, sudor, orina, leche, líquido ascítico, líquido
sinovial, líquido peritoneal y similares. La muestra puede
obtenerse de animales, preferentemente mamíferos, lo más
preferentemente seres humanos. La muestra puede tratarse antes de
su utilización, tal como preparar plasma a partir de sangre, diluir
fluidos viscosos y similares. Los procedimientos de tratamiento
pueden implicar filtración, destilación, extracción, concentración,
inactivación de componentes interferentes, la adición de reactivos
y similares. Las proteínas pueden aislarse de las muestras y
utilizarse en los procedimientos de la invención. En una forma de
realización preferida, la muestra biológica es suero o extractos de
tejido tumoral, lo más preferentemente suero.
En formas de realización de la invención, el
procedimiento descrito en la presente memoria está adaptado para
diagnosticar y hacer el seguimiento, y para el pronóstico de
carcinoma de ovario detectando hK6 en muestras biológicas de un
sujeto. Estas aplicaciones requieren que la cantidad de hK6
detectada en una muestra de un sujeto que se está sometiendo a
prueba se compare con niveles detectados para otra muestra o una
muestra anterior del sujeto, o niveles detectados para una muestra
control. Los niveles para muestras control de sujetos sanos o
sujetos con enfermedad benigna pueden establecerse mediante estudios
estadísticos prospectivos y/o retrospectivos. Los sujetos sanos que
no presentan anomalías o una enfermedad clínicamente evidente pueden
seleccionarse para estudios estadísticos. El diagnóstico puede
realizarse mediante un hallazgo de niveles estadísticamente
diferentes de hK6 en comparación con una muestra control o niveles
previos detectados para el mismo sujeto.
El término "hK6" se refiere una calicreína
humana 6, (también conocida como zyme, proteasa M y neurosina) una
serina proteasa similar a tripsina de 244 aminoácidos de longitud,
de los que 16 aminoácidos constituyen el péptido señal y 5
aminoácidos, el péptido de activación (7, 8 y 9). El término incluye
todos los homólogos, las variantes alélicas que se producen de
manera natural, isoformas y precursores de calicreína humana 6 de
números de registro GenBank AF013988, AF149289, HSU62801, D78203 y
NM002774. En general por ejemplo, las variantes alélicas que se
producen de manera natural de calicreína humana 6 compartirán una
homología significativa (70-90%) con las secuencias
mostradas en los números de registro GenBank AF013988, AF149289,
HSU62801, D78203 y NM002774. Las variantes alélicas pueden contener
sustituciones conservativas de aminoácidos de la secuencia KLK6 o
contendrán una sustitución de un aminoácido de una posición
correspondiente en un homólogo de hK6 tal como, por ejemplo, el
homólogo de calicreína 6 murina.
El término "sujeto" se refiere a un animal
de sangre caliente tal como un mamífero que está afectado o se
sospecha que está afectado por cáncer de ovario. Preferentemente,
"sujeto" se refiere a un ser humano.
Los anticuerpos específicos para hK6 usados en
los procedimientos de la invención pueden obtenerse de fuentes
científicas o comerciales. Alternativamente, puede utilizarse hK6
nativa aislada o hK6 recombinante para preparar anticuerpos,
anticuerpos monoclonales o policlonales, y fragmentos
inmunológicamente activos (por ejemplo un fragmento Fab o
(Fab)_{2}), una cadena pesada de anticuerpo, una cadena
ligera de anticuerpo, anticuerpos humanizados, una molécula de
F_{v} de cadena sencilla modificada mediante ingeniería genética
(Ladner et al, patente US nº 4.946.778), o un anticuerpo
quimérico, por ejemplo, un anticuerpo que contiene la especificidad
de unión de un anticuerpo murino, pero en el que las porciones
restantes son de origen humano. Los anticuerpos que incluyen
anticuerpos monoclonales y policlonales, fragmentos y quimeras,
pueden prepararse usando procedimientos conocidos por los expertos
en la materia. Preferentemente, los anticuerpos usados en los
procedimientos de la invención son reactivos frente a hK6 si se
unen con una K_{a} superior o igual a 10^{-7} M. En un
inmunoensayo de tipo sándwich de la invención se utilizan
anticuerpos policlonales de ratón y anticuerpos policlonales de
conejo.
\newpage
Los anticuerpos específicamente reactivos con
hK6, o derivados, tales como conjugados enzimáticos o derivados
marcados, pueden usarse para detectar hK6 en diversas muestras
biológicas, por ejemplo pueden usarse en cualquier inmunoensayo
conocido que se base en la interacción de unión entre un
determinante antigénico de una proteína y los anticuerpos. Los
ejemplos de dichos ensayos son radioinmunoanálisis, inmunoensayos
enzimáticos (por ejemplo ELISA), inmunofluorescencia,
inmunoprecipitación, aglutinación con látex, hemaglutinación y
pruebas
histoquímicas.
histoquímicas.
Un anticuerpo específico para hK6 puede marcarse
con una sustancia detectable y localizarse o identificarse en
muestras biológicas basándose en la presencia de la sustancia
detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen, pero
no se limitan a los siguientes: radioisótopos (por ejemplo, ^{3}H,
^{14}C, ^{35}S, ^{125}I, ^{131}I), marcas fluorescentes
(por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), marcas
luminiscentes tales como luminol; marcas enzimáticas (por ejemplo,
peroxidasa del rábano, beta-galactosidasa,
luciferasa, fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa), grupos
biotinilo (que pueden detectarse mediante avidina marcada por
ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o
actividad enzimática que puede detectarse mediante procedimientos
ópticos o calorimétricos), epítopos de polipéptido predeterminados
reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de
pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos
secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo).
También pueden emplearse procedimientos indirectos en los que la
reacción antígeno-anticuerpo primaria se amplifica
mediante la introducción de un segundo anticuerpo que presenta
especificidad para el anticuerpo reactivo frente a hK6. A modo de
ejemplo, si el anticuerpo que presenta especificidad frente a hK6
es un anticuerpo IgG de conejo, el segundo anticuerpo puede ser
gamma-globulina anticonejo de cabra marcada con una
sustancia detectable tal como se describe en la presente
memoria.
Los procedimientos para conjugar o marcar los
anticuerpos tratados anteriormente pueden realizarse fácilmente por
un experto habitual en la materia. (Véase por ejemplo Inman, Methods
In Enzymology, vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification:
Part B, Jakoby and Wichek (eds.), Academic Press, Nueva York, pág.
30, 1974; y Wilchek y Bayer, "The Avidin-Biotin
Complex in Bioanalytical Applications", Anal. Biochem.
171:1-32, 1988 con respecto a procedimientos para
conjugar o marcar los anticuerpos con enzima o componente de unión a
ligando).
La fluorometría de resolución temporal puede
usarse para detectar una señal. Por ejemplo, el procedimiento
descrito en Christopoulos TK y Diamandis EP Anal Chem
1992:64:342-346 puede usarse con un fluorómetro de
resolución temporal convencional.
Por tanto, según una forma de realización de la
invención, se proporciona un procedimiento en el que un anticuerpo
hK6 se marca con una enzima, se añade un sustrato para la enzima
seleccionándose el sustrato de modo que el sustrato, o un producto
de reacción de la enzima y sustrato, forma complejos fluorescentes
con un metal lantánido. Se añade un metal lantánido y se cuantifica
la hK6 en la muestra midiendo la fluorescencia de los complejos
fluorescentes. Los anticuerpos específicos para hK6 pueden marcarse
directa o indirectamente con una enzima. Las enzimas se seleccionan
basándose en la capacidad de un sustrato de la enzima, o un producto
de reacción de la enzima y sustrato, de formar complejos con
metales lantánidos tales como europio y terbio. Los ejemplos de
enzimas adecuadas incluyen fosfatasa alcalina y
\beta-galactosidasa. Preferentemente, la enzima es
fosfatasa alcalina. Los anticuerpos hK6 también pueden estar
marcados indirectamente con una enzima. Por ejemplo, los
anticuerpos pueden estar conjugados a un componente de un par de
unión a ligando, y la enzima puede estar acoplada al otro
componente del par de unión a ligado. Los ejemplos representativos
incluyen proteína de unión riboflavina-riboflavina
y avidina-biotina. Preferentemente los anticuerpos
están biotinilados, y la enzima está acoplada a estreptavidina.
En el procedimiento, se detecta el anticuerpo
unido a hK6 en una muestra añadiendo un sustrato para la enzima. El
sustrato se selecciona de modo que en presencia de un metal
lantánido (por ejemplo europio, terbio, samario y disprosio,
preferentemente europio y terbio), el sustrato, o un producto de
reacción de la enzima y sustrato, forma un complejo fluorescente
con el metal lantánido. Los ejemplos de enzimas y sustratos para
enzimas que proporcionan tales complejos fluorescentes se describen
en la patente US nº 5.312.922 concedida a Diamandis. A modo de
ejemplo, cuando el anticuerpo está marcado directa o indirectamente
con fosfatasa alcalina el sustrato empleado en el procedimiento
puede ser
4-metilumbeliferil-fosfato, o
5-fluorosalicil-fosfato. La
intensidad de fluorescencia de los complejos se mide normalmente
usando un fluorómetro de resolución temporal por ejemplo un
inmunoanalizador CyberFluor 615 (Nordion International, Kanata,
Ontario).
La muestra, un anticuerpo específico para hK6, o
hK6 puede inmovilizarse. Los ejemplos de vehículos adecuados son
agarosa, celulosa, dextrano, Sephadex, Sepharose, liposomas,
poliestireno de carboximetilcelulosa, papel de filtro, resina de
intercambio iónico, película de plástico, tubo de plástico, perlas
de vidrio, copolímero de poliamina-metilvinil
éter-ácido maleico, copolímero de aminoácidos, copolímero de
etileno-ácido maleico, nylon, seda, etc. El vehículo puede estar en
la forma de, por ejemplo, un tubo, placa de prueba, pocillo,
perlas, disco, esfera, etc. El anticuerpo inmovilizado puede
prepararse haciendo reaccionar el material con un vehículo
insoluble adecuado usando procedimientos químicos y físicos
conocidos, por ejemplo, acoplamiento de bromuro de cianógeno.
Según una forma de realización, la presente
invención proporciona medios para determinar hK6 en una muestra de
sangre o un extracto de tejido tumoral, preferentemente una muestra
de suero, midiendo la hK6 mediante inmunoensayo. Resultará evidente
para un experto en la materia que puede usarse una variedad de
procedimientos de inmunoensayo para medir la hK6. En general, un
procedimiento de inmunoensayo de hK6 puede ser competitivo o no
competitivo. Los procedimientos competitivos normalmente emplean un
anticuerpo inmovilizado o que puede inmovilizarse frente a hK6
(anti-hK6) y una forma marcada de hK6. La hK6 de
muestra y la hK6 marcada compiten por unirse al
anti-hK6. Tras la separación de la hK6 marcada
resultante que se ha unido al anti-hK6 (fracción
unida) de la que ha permanecido sin unir (fracción no unida), se
mide la cantidad de la marca tanto en la fracción unida como no
unida y puede correlacionarse con la cantidad de hK6 en la muestra
de prueba de cualquier manera convencional, por ejemplo, mediante
comparación con una curva patrón.
Preferentemente se usa un procedimiento no
competitivo para la determinación de hK6, siendo el procedimiento
más común el procedimiento "de tipo sándwich". En este ensayo,
se emplean dos anticuerpos anti-hK6. Uno de los
anticuerpos anti-hK6 está marcado directa o
indirectamente (denominado en ocasiones "anticuerpo de
detección") y el otro está inmovilizado o puede inmovilizarse
(denominado en ocasiones "anticuerpo de captura"). Los
anticuerpos de captura y de detección pueden ponerse en contacto
simultánea o secuencialmente con la muestra de prueba. Los
procedimientos secuenciales pueden llevarse a cabo incubando el
anticuerpo de captura con la muestra, y añadiendo el anticuerpo de
detección en un momento predeterminado después de esto (denominado
en ocasiones procedimiento "directo"); o puede incubarse el
anticuerpo de detección con la muestra en primer lugar y añadirse
después el anticuerpo de captura (denominado en ocasiones
procedimiento "inverso"). Después de que se haya(n)
producido la(s) incubación/incubaciones necesaria(s),
para completar el ensayo, se separa el anticuerpo de captura de la
mezcla de prueba líquida, y se mide la marca en al menos una parte
de la fase de anticuerpo de captura separada o el resto de la
mezcla de prueba líquida. Generalmente se mide en la fase de
anticuerpo de captura ya que comprende hK6 unido por
("intercalado" entre) los anticuerpos de captura y de
detección.
En un ensayo inmunométrico de dos sitios típico
para hK6, uno o ambos anticuerpos de captura y de detección son
anticuerpos policlonales. La marca usada en el anticuerpo de
detección puede seleccionarse de cualquiera de las conocidas
convencionalmente en la materia. La marca puede ser una enzima o un
resto quimioluminiscente, pero también puede ser un isótopo
radioactivo, un fluoróforo, un ligando detectable (por ejemplo,
detectable mediante una unión secundaria mediante un componente de
unión marcado para el ligando), y similares. Preferentemente el
anticuerpo está marcado con una enzima que se detecta añadiendo un
sustrato que se selecciona de modo que un producto de reacción de
la enzima y sustrato forma complejos fluorescentes. El anticuerpo de
captura se selecciona de modo que proporciona medios para separarse
del residuo de la mezcla de prueba. Por consiguiente, el anticuerpo
de captura puede introducirse en el ensayo en una forma ya
inmovilizada o insoluble, o puede estar en una forma que puede
inmovilizarse, es decir, una forma que posibilita que se lleve a
cabo la inmovilización tras la introducción del anticuerpo de
captura en el ensayo. Un anticuerpo de captura inmovilizado puede
comprender un anticuerpo unido covalente o no covalentemente a una
fase sólida tal como una partícula magnética, una partícula de
látex, un pocillo de placa de microtitulación, una perla, una cubeta
u otro recipiente de reacción. Un ejemplo de un anticuerpo de
captura que puede inmovilizarse es un anticuerpo que se ha
modificado químicamente con un resto de ligando, por ejemplo, un
hapteno-biotina, o similar, y que puede
inmovilizarse posteriormente mediante la puesta en contacto con una
forma inmovilizada de un componente de unión para el ligando, por
ejemplo, un anticuerpo, avidina o similar. En una forma de
realización, el anticuerpo de captura puede inmovilizarse usando
una especie de anticuerpo específico para el anticuerpo de captura
que está unido a la fase sólida.
Un procedimiento de inmunoensayo de tipo
sándwich particular de la invención emplea dos anticuerpos reactivos
frente a hK6, un segundo anticuerpo que presenta especificidad
frente a un anticuerpo reactivo frente a hK6 marcada con una marca
enzimática, y un sustrato fluorogénico para la enzima. En una forma
de realización, la enzima es fosfatasa alcalina (ALP) y el sustrato
es 5-fluorosalicil-fosfato. La ALP
escinde el fosfato fuera del sustrato fluorogénico,
5-fluorosalicil-fosfato, para
producir ácido 5-fluorosalicílico (FSA). El ácido
5-fluorosalicílico puede formar entonces un complejo
ternario altamente fluorescente de la forma
FSA-Tb(3+)-EDTA, que puede
cuantificarse midiendo la fluorescencia de Tb3+ en un modo de
resolución temporal. La intensidad de fluorescencia se mide usando
un fluorómetro de resolución temporal tal como se describe en la
presente memoria.
Los formatos y procedimientos de inmunoensayo
descritos anteriormente están concebidos para ser a modo de ejemplo
y no son limitativos ya que, en general, se entenderá que cualquier
formato o procedimiento de inmunoensayo puede usarse en la presente
invención.
Los procedimientos de la invención pueden
llevarse a cabo usando un kit de diagnóstico para cuantificar la
hK6 en una muestra. A modo de ejemplo, el kit puede contener
anticuerpos específicos para hK6, anticuerpos frente a los
anticuerpos marcados con una enzima; y un sustrato para la enzima.
El kit puede contener también pocillos de placa de microtitulación,
patrones, diluyente de ensayo, tampón de lavado, tapas de placa
adhesivas y/o instrucciones para llevar a cabo un procedimiento de
la invención usando el kit.
Los anticuerpos específicos para hK6 pueden
usarse también en metodologías de generación de imágenes en el
tratamiento del cáncer de ovario. La invención proporciona un
procedimiento para generar imágenes de tumores asociados con hK6 y
opcionalmente una o más de otras calicreínas, preferentemente
calicreínas asociadas con cáncer de ovario, incluyendo pero sin
limitarse a hK4, hK5, bK8, hK9, hK10 y hK11.
La invención también contempla kits para llevar
a cabo los procedimientos de la invención. Los kits incluyen un
anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a
un epítopo de una calicreína, y medios para detectar la unión del
anticuerpo a su epítopo asociado con células tumorales, o bien como
concentrados (incluyendo composiciones liofilizadas), que pueden
diluirse adicionalmente antes de la utilización o a la
concentración de utilización, en los que los viales pueden incluir
una o más dosificaciones. Cuando los kits están concebidos para su
utilización in vivo, pueden proporcionarse dosificaciones
individuales en envases esterilizados, que presentan la cantidad y
concentración de agentes deseada. Los envases que proporcionan una
formulación para su utilización directa, normalmente no requieren
otros reactivos, tal como por ejemplo, cuando el kit contiene una
preparación de anticuerpo radiomarcada para la generación de
imágenes in vivo.
Los siguientes ejemplos no limitativos son
ilustrativos de la presente invención:
Se sintetizó diflunisal fosfato (DFP) en el
laboratorio (diflunisal, obtenido de Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO). La disolución madre de DFP era 0,01 mol/l en 0,1 mol/l de NaOH.
Las disoluciones madre de DFP son estables a 4ºC durante al menos 6
meses. Se obtuvieron IgG anti-conejo de cabra
marcada con fosfatasa alcalina (GARIg-ALP) e
inmunoglobulina G anti-ratón de oveja (específica
del fragmento Fc) de Jackson Immunoresearch, West Grove, PA. Se
prepararon las disoluciones de trabajo de GARIg-ALP
diluyendo la disolución madre 3.000 veces en el tampón de ensayo
(descrito a continuación). Se obtuvieron bandas de microtitulación
de poliestireno de 12 pocillos, opacas blancas, de Dynatech Labs.,
Alexandria, VA. El tampón sustrato era un tampón Tris (0,1 mol/l,
pH 9,1) que contenía 0,1 mol de NaCl y 1 mmol de MgCl_{2} por
litro. Se preparó la disolución de trabajo de sustrato (DFP, 1
mmol/l en tampón sustrato) justo antes de su utilización diluyendo
la disolución madre de DFP 10 veces en el tampón sustrato. Se
preparó la disolución de lavado disolviendo 9 g de NaCl y 0,5 g de
monolaurato de polioxietilensorbitano (Tween 20) en 1 l de un tampón
Tris 10 mmol/l, pH 7,40. La disolución que se formaba contenía 1
mol de base Tris, 0,4 mol de NaOH, 2 mmol de TbCl_{3} y 3 mmol de
EDTA por litro (sin ajuste de pH). El tampón A de ensayo era un
tampón Tris 50 mmol/l, pH 7,40, que contenía 60 g de BSA, 0,5 g de
azida sódica, 100 ml de suero de cabra normal, 25 ml de suero de
ratón normal, 5 g de IgG bovina y 0,5 g de Tween 20 por litro. El
tampón B de ensayo era el mismo que el tampón A de ensayo excepto
porque se omitió el suero de ratón.
Se usaron varias muestras clínicas para examinar
la presencia de hK6. Éstas incluían muestras de suero y de orina de
individuos masculinos y femeninos (donantes de sangre sanos),
fluidos quísticos mamarios obtenidos mediante aspiración con aguja,
extractos citosólicos de tumor de mama, preparados tal como se
describió previamente (11), líquidos amnióticos, leches de mujeres
en periodo de lactancia, plasmas seminales, fluidos mamarios del
pezón (NAF) y líquidos cefalorraquídeos (CSF). Además, se sometió a
prueba un grupo de extractos citosólicos de tejido humano,
preparados tal como se describió anteriormente (Hassapoglidou, S.
et al Oncogene 1993, 8:1501-1509). Para
establecer condiciones de medición óptimas, se sometieron a prueba
todas las muestras a diversas diluciones. Los procedimientos son
según las normas éticas de la Declaración de Helsinki de 1975, tal
como se revisaron en 1983.
Se almacenaron todas las muestras de fluidos y
de tejidos a -80ºC hasta su utilización.
Se usó un fluorómetro de resolución temporal, el
inmunoanalizador CyberFluor 615 (MDS Nordion, Kanata, ON, Canadá)
para medir la fluorescencia de Tb^{3+} en pocillos de
microtitulación blancos. Se ha descrito este procedimiento en
detalle en otra parte (Christopoulos, TK, et al Anal Chem
1992, 64:342-346; Ferguson RA et al, Clin
Chem 1996 42: 675-684).
Producción y purificación de proteína hK6
recombinante. Se sometieron a selección células 293 humanas
transfectadas con un plásmido que contenían el ADNc de hK6 de 1,4 kb
mediante crecimiento en G418 (400 mg/l) durante tres semanas,
tiempo tras el cual se aislaron transformantes estables. Un clon
generó cantidades identificables de proteína hK6 en el medio de
cultivo. Se cultivó esta línea celular y se recogió el sobrenadante
del cultivo tisular y se concentró usando dispositivos de
ultrafiltración Centricon (Millipore, Waltham, MA 02454). Se
consiguió la purificación de hK6 a partir de sobrenadantes de
cultivo celular concentrado mediante cromatografía de líquidos a
alta presión en fase inversa (C-8, Aquapore
RP-300, 0,45 x 25 cm, Applied Biosystems, Foster
City, CA) usando un gradiente lineal de ácido
trifluoroacético/acetonitrilo al 0,1%. Generalmente, el gradiente
aumentaba a una tasa del 1% de acetonitrilo por min. Se localizaron
las fracciones que contenían hK6 mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida, se recogieron, se liofilizaron y
se almacenaron a -20ºC (Little SP et al, J. Bil Chem
1997:272: 251135-25142).
Desarrollo de anticuerpos policlonales frente
a hK6. Se usó proteína hK6 recombinante purificada para
inmunizar conejos y ratones usando procedimientos convencionales
(Campbell Am, Production and purification of antibodies. En:
Immunoassay. Diamandis EP Christopoulos TK (eds)00.
95-115, Academic Press, San Diego, 1996). Se usaron
los antisueros de conejo y de ratón para el desarrollo del ensayo
inmunofluorométrico sin purificación adicional.
Recubrimiento de placas de microtitulación
con inmunoglobulina anti-ratón de oveja. Se
recubrieron pocillos de microtitulación de poliestireno blancos
incubando durante la noche 500 ng/100 \mul por pocillo del
anticuerpo de recubrimiento diluido en un tampón Tris 50 mmol/l, pH
7,80. Entonces se lavaron los pocillos seis veces con la disolución
de lavado y se bloquearon durante 1 hora con 200 \mul/pocillo de
la disolución de bloqueo (BSA 10 g/l en Tris 50 mmol/l, pH 7,80).
Tras otros seis lavados, los pocillos estaban listos para su
utilización.
Calibración de hK6. Se prepararon los
calibradores de hK6 de 0, 1, 5, 20, 50 y 200 \mug/l diluyendo
proteína hK6 recombinante purificada en un tampón Tris 50 mmol/l, pH
7,80, que contenía 60 g de BSA y 0,5 g de azida sódica por
litro.
Ensayo de hK6. Se pipetearon calibradores
o muestras (100 \mul) en los pocillos de microtitulación y se
añadieron 50 \mul del antisuero anti-hK6 de ratón
policlonal, diluido 5.000 veces en tampón de ensayo B. Entonces se
incubaron los pocillos con agitación a temperatura ambiente durante
2 horas y se lavaron seis veces. A cada pocillo, se le añadieron
100 \mul de anticuerpo anti-hK6 de conejo, diluido
1.000 veces en tampón de ensayo A, se incubaron durante 30 min tal
como se describió anteriormente, y después se lavaron seis veces. A
cada pocillo, se le añadieron 100 \mul de una inmunoglobulina
anti-conejo de cabra, conjugada con fosfatasa
alcalina, diluida 3.000 veces en tampón de ensayo A e incubada
durante 30 min, tal como se describió anteriormente. Entonces se
lavaron los pocillos seis veces; se añadieron 100 \mul de
disolución de sustrato de trabajo de DFP 1 mmol/l, y se incubaron
los pocillos durante 10 min, tal como se describió anteriormente.
Se añadieron 100 \mul de disolución reveladora a cada pocillo, se
mezclaron los pocillos mediante agitación mecánica durante 1 min y
se midió la fluorescencia con el fluorómetro de resolución temporal.
Se realizaron automáticamente la calibración y la reducción de
datos mediante el inmunoanalizador CyberFluor 615.
Cromatografía de líquidos de alta resolución,
(HPLC): Se han fraccionado diversos fluidos biológicos en una
columna de filtración en gel, usando los procedimientos descritos en
otra parte (Yu H, Diamandis EP, Clin Chem 1993:
39:2108-2114; Diamandis, EP et al Clin Chem
1997:43:1365-1371). Se recogieron las fracciones de
HPLC y se analizaron para determinar hK6 con el ensayo
inmunofluorométrico desarrollado.
Se usaron dos anticuerpos policlonales frente a
la proteína hK6 recombinante, uno desarrollado en ratones y otro
desarrollado en conejos. La configuración de ensayo elegida
(recubrimiento indirecto de los pocillos con un anticuerpo
anti-ratón de oveja y detección del inmunocomplejo
con una inmunoglobulina anti-conejo de cabra,
conjugada con fosfatasa alcalina) demostró una buena sensibilidad
(véase a continuación) sin la necesidad de ninguna purificación o
conjugación de los anticuerpos primarios. Se optimizaron las
cantidades de anticuerpos usados, los diluyentes y tiempos de
incubación de las diversas etapas de ensayo. Se seleccionaron las
condiciones óptimas basándose en el límite de detección más bajo
que podía conseguirse y la mejor linealidad de ensayo y el
intervalo dinámico. Las condiciones finales se describen
anteriormente.
Se muestra una curva de calibración típica del
ensayo de hK6 propuesto en la figura 1. El límite de detección,
definido como la concentración de hK6 que corresponde a la
fluorescencia del calibrador cero más dos desviaciones estándar, es
\leq0,5 \mug/l. Se evaluó la precisión dentro de una serie y
entre series a diversas concentraciones de hK6 entre
2-50 \mug/l y con diversas muestras clínicas. En
todos los casos, los coeficientes de variación (CV) estaban entre
el 2 y el 9%, de acuerdo con la precisión de inmunoensayos basados
en placa de microtitulación típicos.
Se detectó proteína hK6 en diversos fluidos
biológicos. Con el fin de garantizar que el ensayo
inmunofluorométrico mide la hK6 con alta sensibilidad y
especificidad, se separaron en una columna de filtración en gel tres
fluidos biológicos con concentración de hK6 relativamente alta,
(concretamente una leche humana de una mujer en periodo de
lactancia, un líquido cefalorraquídeo y una muestra de suero de una
paciente con cáncer de ovario que resultó presentar niveles altos
de este biomarcador en suero) y se midieron en una columna de
filtración en gel. Los resultados se muestran en la figura 2. En
los tres fluidos biológicos sometidos a prueba se detectó una única
especie inmunorreactiva de una masa molecular de \sim30 kDa, lo
que está de acuerdo con la masa molecular de proteína hK6. No se
detectaron complejos de mayor peso molecular, lo que sugiere que la
hK6 está presente en estos fluidos biológicos en su forma libre.
Otras proteinasas séricas (por ejemplo PSA) están presentes en el
suero y otros fluidos en la mayoría de los casos unidas a
inhibidores de proteinasas (Stenman U-H, et
al, Cancer Res. 1991: 51:222-226); Christensson
A et al Cur J Biochem 1990; 194;
755-763).
Para obtener información preliminar sobre la
presencia de hK6 en fluidos biológicos, se analizaron diversas
muestras clínicas, tal como se muestra en la tabla 1. Se encontró la
mayor concentración de hK6 en leche de mujeres en periodo de
lactancia, seguido de líquido cefalorraquídeo, fluido mamario del
pezón y fluido quístico mamario. También se detectó hK6 en muestras
de suero de hombres y de mujeres, en la mayoría de plasmas seminales
y en un porcentaje relativamente pequeño de líquidos amnióticos y
extractos citosólicos de tumor de mama. No se detectó proteína hK6
en la orina.
También se sometieron a prueba varios extractos
citosólicos de tejido humano. Se detectó la mayor concentración de
hK6 en las glándulas salivares, seguido de pulmón, colon, trompa de
Falopio, placenta, mama, pituitaria y riñón. Los siguientes tejidos
dieron resultados negativos: piel, bazo, hueso, tiroides, corazón,
uréter, hígado, músculo, endometrio, testículos, páncreas, vesícula
seminal, ovario, glándulas suprarrenales y próstata (figura 3).
Los presentes inventores han desarrollado
anticuerpos policlonales y un procedimiento inmunofluorométrico
adecuado para cuantificar la proteína hK6 en fluidos biológicos y
extractos de tejidos. Dado que no se conoce una fuente natural rica
de proteína hK6, se usó proteína hK6 recombinante para el desarrollo
de anticuerpos policlonales de ratón y de conejo. Esta proteína
recombinante garantiza una alta pureza sin ninguna proteína
contaminante. La configuración de ensayo elegida no necesita ninguna
purificación adicional o conjugación de los anticuerpos primarios
usados, y es por tanto un procedimiento conveniente para desarrollar
procedimientos inmunofluorométricos sensibles. Previamente se ha
adoptado el mismo principio para medir el supresor tumoral p53 en
fluidos biológicos (Hassapoglidou S et al, Oncogene 1993: 8:
1501-1509).
El inmunoensayo desarrollado para la proteína
hK6 demuestra una sensibilidad, intervalo dinámico y linealidad
buenos (figura 1). Además se ha verificado que este ensayo detecta
una única banda inmunorreactiva en los fluidos biológicos
examinados. En suero, esta proteinasa está presente en su forma
libre, de manera similar a las observaciones con mediciones de hK2
(Black, MH et al Clin Chem 1999; 45:790-799).
Sin embargo, esto está en contraste con la situación con PSA, que
se sabe que está presente en suero unido principalmente a
\alpha_{1}-antiquimotripsina (Stenman
U-H, et al, Cancer Res. 1991:
51:222-226); Christensson A et al Cur J
Biochem 1990; 194; 755-763).
El estudio de un número relativamente grande de
fluidos biológicos ha indicado que la proteína hK6 está presente a
concentraciones relativamente altas en la leche de mujeres en
periodo de lactancia y otras secreciones mamarias, incluyendo
fluido mamario del pezón y fluido quístico mamario (tabla 1).
Previamente, se ha demostrado la presencia de otras calicreínas,
incluyendo PSA y hK2, en estos fluidos biológicos (Yu, H Diamandis;
Clin Chem 1995; 41:54-58; Sauter ER et al
Cancer Epidemiol Biomarkers Prevent 1996 967-970;
Diamandis Ep et al Breast Cancer Res Treat
199638:259-264; Black MH et al Br J Cancer
2000; 82:361-367; Black MH et al Clin Chem
1999;45: 790-799; Yu H. y Diamandis EP Clin Chem
1995:41:204-210; Black MH Diamandis EP, Breast
Cancer Res Treat 2000 59:1-14). Se detectaron
grandes cantidades de proteína hK6 en el líquido cefalorraquídeo,
lo que está de acuerdo con la observación de que la hK6 se expresa a
niveles altos en el tejido cerebral (Little, citado anteriormente).
También se encontró hK6 en sueros de hombre y de mujer y plasmas
seminales y en un porcentaje pequeño de líquidos amnióticos y
citosoles de tumor de mama. Previamente, así mismo se demostró la
presencia de PSA y hK2 en estos fluidos biológicos (Yu, H Diamandis;
Clin Chem 1995: 41:54-58; Sauter ER et al
Cancer Epidemiol Biomarkers Prevent 1996 967-970;
Diamandis Ep et al Breast Cancer Res Treat 199638:
259-264; Black MH et al Br J Cancer 2000;
82:361-367; Black MH et al Clin Chem 1999;45:
790-799; Yu H. y Diamandis EP Clin Chem
1995:41:204-210; Black MH Diamandis EP, Breast
Cancer Res Treat 2000 59:1-14). Es interesante
observar que aunque el plasma seminal contiene niveles
extremadamente altos de PSA y hK2 (Diamandis EP Trends Endocrinol
Metab 1999: 25:14-26' RittenhouseHe et al
Crit Rev Clin Lab Sci 1998: 35:275-368), el ensayo
descrito en la presente memoria detectó cantidades muy pequeñas de
hK6 en este fluido biológico (tabla 1). Esto demuestra además que
las proteínas homólogas PSA y hK2 no presentan ninguna reactividad
cruzada importante con el ensayo de hK6 desarrollado.
El ensayo desarrollado en la presente memoria
representa el primer procedimiento para detectar proteína hK6 en
fluidos biológicos. Los resultados demuestran además que la hK6 es
una proteína secretada, tal como se predijo mediante su secuencia
de aminoácidos deducida (Yousek GM et al Genomics
1999;62:251-259).
Se han descrito los detalles de este ensayo
inmunofluorométrico (véase el ejemplo 1 y la referencia 12). El
ensayo utiliza dos anticuerpos policlonales específicos de hK6, uno
cultivado en ratón y otro cultivado en conejo. Este es un
procedimiento inmunofluorométrico no competitivo que incorpora los
principios de la fluorometría de resolución temporal para la
detección. El ensayo mide la hK6 en el intervalo de 0,5 a 200
\mug/l con precisión <10%. Se analizaron las muestras de suero
sin pretratamiento de la muestra.
Para esta investigación, se usaron muestras de
suero sobrantes obtenidas de pacientes con diversos tumores
malignos (tabla 2). Se incluyeron pacientes con una masa tumoral
relativamente alta (tal como se indica mediante niveles de marcador
tumoral al menos 10 veces mayores que el límite superior de normal)
con el fin de aumentar la posibilidad de detectar posibles aumentos
de hK6 en suero. Se almacenaron todas las muestras de suero a -20ºC
hasta el análisis durante un tiempo máximo de un año. Los
procedimientos son según las normas éticas de la Declaración de
Helsinki de 1975, tal como se revisó en 1983.
Se analizaron los marcadores tumorales CA125,
PSA, CEA y AFP en el analizador de inmunoensayo Elecsys (Roche
Diagnostics, Indianápolis, IN). Se analizaron CA15.3, CA19.9 y hCG
en el analizador de inmunoensayo Immuno 1 (Bayer Diagnostics,
Tarrytown, NY) y se midió la calcitonina con un kit de
radioinmunoanálisis de Diasorin, Italia. Los límites superiores de
valores normales para los marcadores tumorales fueron 35 kU/l
(CA125), 4 \mug/l (PSA), 10 \mug/l (AFP), 5 \mug/l (CEA), 35
kU/l (CA15.3), 37 kU/l (CA19.9), 10 UI/l (hCG) y 100 ng/l
(calcitonina).
Se analizaron un total de 378 muestras de suero
con el ensayo inmunofluorométrico previamente descrito para hK6
(12). Estas muestras eran o bien de individuos normales (hombres y
mujeres) o bien de pacientes con diversos tumores malignos. Se
muestran los datos obtenidos en la tabla 2. Aunque en ninguno de los
controles normales y en sólo dos muestras de pacientes con tumores
malignos no de ovario la concentración de hK6 era superior a 15
\mug/l (en el límite arbitrario), la mayoría de pacientes con
carcinoma de ovario (\sim66%) presentaba concentraciones
altamente elevadas de hK6 en su suero (>15 \mug/l). Se muestra
la distribución de valores de hK6 en suero de pacientes con cáncer
de ovario en la figura 4. Tal como se muestra en la figura 5, la
correlación entre las concentraciones de hK6 y los niveles de CA125
es mala y no significativa estadísticamente.
En la figura 6, se presentan los datos con
respecto a cambios temporales de la concentración de hK6 y CA125 en
suero en serie en cuatro pacientes con cáncer de ovario. La
concentración de hK6 cambia durante el periodo de seguimiento, de
manera similar a CA125, lo que sugiere que este nuevo biomarcador
puede presentar un valor para el tratamiento de pacientes.
Los datos de la tabla 2 resumen los hallazgos y
demuestran que entre todos los tipos de cáncer sometidos a prueba
(hombres y mujeres normales frente a cáncer de mama, de tiroides,
testicular, gastrointestinal, de próstata, de pulmón y de ovario),
sólo las pacientes con cáncer de ovario muestran niveles
significativamente elevados de este biomarcador en la circulación.
Aproximadamente el 66% de los pacientes presentaba niveles
superiores a 15 \mug/l, un límite que da el
98-100% de especificidad para todos los demás
cánceres sometidos a prueba. Aunque estos datos son muy
prometedores, con respecto al valor de hK6 como biomarcador
circulante para carcinoma de ovario, debería tenerse en cuenta que
todas las pacientes con cáncer de ovario presentaban niveles
relativamente altos de CA125 (\geq 372 kU/L, lo que es
aproximadamente 10 veces mayor que el intervalo de referencia
superior). Los datos de la figura 6 indican que los niveles en suero
de hK6 cambian con el tiempo durante el seguimiento del cáncer de
ovario, lo que sugiere que este biomarcador puede ser útil para
hacer el seguimiento de pacientes tras el tratamiento primario.
Tal como resulta evidente a partir de la figura
5, no existe ninguna correlación significativa entre la
concentración de hK6 y CA125, lo que sugiere que estos dos
biomarcadores pueden ser complementarios para el diagnóstico y
tratamiento de carcinoma de ovario.
En conclusión, se proporciona la primera
evidencia de que una concentración de hK6 en suero está aumentada
significativamente en aproximadamente el 66% de las pacientes con
cáncer de ovario. La prueba parece ser específica para el cáncer de
ovario ya que no se observaron tales aumentos en otras diversos
tumores malignos. Por tanto, la hK6 representa un biomarcador en
suero novedoso para el cáncer de ovario lo que puede ser útil para
el diagnóstico y el seguimiento de la enfermedad.
Se incluyeron en este estudio 97 mujeres
aparentemente sanas (con edades de 26 a 72 años; media = 52, mediana
= 49 años), 141 mujeres con enfermedad benigna (edades de 21 a 76
años; media = 46, mediana = 45 años) y 146 pacientes con carcinoma
de ovario primario demostrado histológicamente (edades de 28 a 78
años; media = 56, mediana = 57 años). De las lesiones benignas, 50
se clasificaron como endometriosis, 22 como mucinosis, 10 como
teratomas ováricos, 26 como dermoides, 15 como cuerpo lúteo y 18
como serosos. Se estadificaron los tumores según los criterios de
la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO). Se
basó la clasificación histológica en las recomendaciones de la
Organización Mundial de la Salud y la FIGO. Las características de
las pacientes con cáncer de ovario en cuanto a fase, grado,
histotipo, tumor residual tras la cirugía, éxito de reducción de
masa y respuesta a la quimioterapia se muestran en la tabla 7. Se
recogieron muestras de suero de todas las pacientes antes de la
cirugía, antes del inicio del tratamiento, y se almacenaron a -80ºC
hasta el análisis. Para 105 pacientes con cáncer de ovario, también
hubo suero disponible tras la cirugía. Esta muestra se obtuvo
aproximadamente 2-3 semanas tras la cirugía.
Se obtuvieron sueros de cuatro centros tal como
sigue: La Unidad Oncológica Ginecológica, Universidad de Turín,
Italia (97 normales, 14 benignos, 21 cánceres); Holanda (40
cánceres); Bélgica (13 benignos, 85 cánceres); Departamento de
Química Clínica, Hospital Central Universitario de Helsinki,
Finlandia (114 benignos).
Se hizo un seguimiento de los pacientes para
determinar la supervivencia y evolución de la enfermedad durante
una duración media de 25 meses (intervalo de 1-106
meses). La información de seguimiento estuvo disponible para 131 de
las pacientes con cáncer de ovario. Sesenta y cuatro (49%) de éstas
sufrieron una recidiva y 28 (21%) murieron durante el transcurso
del periodo de seguimiento.
Se midió CA125 con un procedimiento de
inmunoensayo automatizado disponible comercialmente (Immulite 2000,
Diagnostic Products Corporation, Los Ángeles, CA). El límite
superior de normal para este procedimiento es 23 kU/l. Se midió la
concentración de hK6 con un procedimiento descrito en la presente
memoria (12) con algunas modificaciones. Este ensayo emplea un
anticuerpo de ratón anti-hK6 monoclonal, recubierto
directamente sobre pocillos de microtitulación (anticuerpo de
captura), un anticuerpo de detección de conejo policlonal y un
anticuerpo anti-conejo conjugado con fosfatasa
alcalina. Se cuantificó la señal mediante fluorometría de resolución
temporal. El ensayo presenta un límite de detección de 0,1 \mug/l
y un intervalo dinámico de hasta 50 \mug/l. La precisión estaba
<10% dentro del intervalo de medición. Se analizaron las muestras
de suero por duplicado con inclusión de tres muestras de control de
calidad en cada serie.
Para analizar los datos, se dividieron las
pacientes en grupos diferentes según parámetros clínicos y
patológicos. Se realizaron los análisis de diferencias entre la
concentración en suero de hK6 antes y después de la cirugía con la
prueba de McNemar no paramétrica. Se usó la distribución binomial
para calcular el nivel de significación de la prueba de
McNemar.
Se construyeron curvas de las características
operativas del receptor (ROC) para la concentración en suero de hK6
y CA125 representando gráficamente la sensibilidad frente a
(1-especificidad) y se calcularon las áreas bajo
las curvas (ABC) ROC. El grupo sin cáncer incluía los individuos
normales y los pacientes con enfermedad benigna. Se evaluaron las
correlaciones entre diferente variables mediante el coeficiente de
correlación de Spearman. Se usó la prueba U de
Mann-Whitney no paramétrica para determinar las
diferencias entre los dos grupos y se usó la prueba de
Kruskal-Wallis no paramétrica para los análisis de
diferencias entre más de dos grupos. Estas pruebas trataron la
concentración de hK6 en suero como una variable continua. También se
clasificó la concentración en suero de hK6 como o bien
hK6-positiva (>4,4 \mug/l) o
hK6-negativa (\leq4,4 \mug/l). Se estableció la
relación de esta variable dicotómica con otras clinicopatológicas
con la prueba de chi cuadrado (\chi^{2}) o la prueba exacta de
Fisher, según fue
apropiado.
apropiado.
Se construyeron las curvas de supervivencia
global y supervivencia libre de progresión de
Kaplan-Meier para demostrar las diferencias de
supervivencia entre las pacientes hK6-positivas y
hK6-negativas. Se usó la prueba de rango
logarítmico para examinar la significación de las diferencias entre
las curvas de supervivencia. Se evaluó el impacto de la
concentración de hK6 en suero sobre la supervivencia global (SG) de
una paciente y sobre la evolución de la enfermedad (supervivencia
libre de progresión; SLP) con el riesgo relativo, se calculó
mediante modelos de regresión de riesgos proporcionales de Cox tanto
de múltiples variables como de única variable. En el análisis de
múltiples variables, se ajustaron las variables clínicas y
patológicas que pueden afectar a la supervivencia, incluyendo la
fase de la enfermedad, grado del tumor, tumor residual y tipo
histológico.
Concentración de hK6 en suero en pacientes
con cáncer y sin cáncer: Se muestran la media, mediana,
intervalo y percentiles seleccionados de una concentración de hK6
en suero entre pacientes sin cáncer (normal; n = 97), con
enfermedad benigna (n = 141), prequirúrgicos (n = 146) y
posquirúrgicos (n = 105) con cáncer de ovario en la tabla 3. Los
valores de media y mediana entre pacientes sin cáncer (normal) y con
enfermedad benigna no eran estadísticamente significativos. Los
valores de media y mediana de hK6 en pacientes prequirúrgicas con
cáncer de ovario eran significativamente mayores que en los grupos
sin cáncer y benigno (p < 0,001). La distribución de la
concentración de hK6 en los tres grupos de pacientes (normal,
benigno, con cáncer de ovario prequirúrgico) se presenta
adicionalmente en la figura 7 junto con los valores de CA125
correspondientes. Claramente, la concentración prequirúrgica de hK6
en suero no es diferente entre pacientes normales y con enfermedad
benigna pero es significativamente elevada en una proporción de
pacientes con cáncer de ovario (figura 7A). A la inversa, los
valores de CA125 aumentan progresivamente de pacientes normales, a
benignas, a con cáncer (figura 7B).
Para la clasificación dicotómica de esta
población de pacientes como hK6-positiva y
hK6-negativa, se seleccionaron los límites de hK6
de 4,2 \mug/l (el 90% de especificidad diagnóstica) y 4,4 \mug/l
(el 95% de especificidad diagnóstica).
Cambios de la concentración de hK6 en suero
tras la cirugía: Para 105 pacientes con cáncer de ovario, se
seleccionaron muestras de suero prequirúrgicas y posquirúrgicas.
Tal como se muestra en la figura 8, 71 pacientes (68%) mostraron
una disminución en la concentración de hK6 tras la cirugía, 21 (20%)
presentaban valores inalterados y 13 (12%) presentaban niveles en
suero de hK6 superiores tras la operación. Según la prueba de
McNemar, la disminución en la concentración tras la cirugía era
estadísticamente muy significativa (p < 0,001).
Correlación entre la concentración de hK6 y
CA125 en suero: La representación gráfica logarítmica de la
figura 9 muestra que existe una correlación débil entre la
concentración de hK6 y CA125 en suero (correlación de Spearman
r_{s} = 0,44). Aunque la correlación es significativa, todavía hay
muchas muestras con valores bastante variables. Por ejemplo, a
niveles de CA125 de aproximadamente 500 kU/l, la concentración de
hK6 oscila desde 2-40 \mug/l mientras que las
muestras con niveles de hK6 de aproximadamente 6 \mug/l pueden
presentar valores de CA125 que oscilan desde 5 hasta > 5,000
kU/l.
Sensibilidad de diagnóstico y especificidad
de la concentración de hK6 en suero: Para este cálculo, se
consideraron los diversos subgrupos de pacientes, tal como se
muestra en la tabla 4. En el grupo sin cáncer, se incluyeron todas
las pacientes que eran o bien normales o bien presentaban enfermedad
benigna. Cuando se analizó el grupo completo de pacientes, la
sensibilidad de diagnóstico es de aproximadamente el 54% al 90% de
especificidad y del 50% al 95% de especificidad. La curva de las
características operativas del receptor (ROC) de la figura 10
indica una ligera ventaja diagnóstica de CA125, en comparación con
hK6. Sin embargo, los dos marcadores pueden trabajar en
combinación, ya que la concentración de hK6 podía elevarse en un
subconjunto de pacientes con CA125 relativamente baja. En el
subgrupo de pacientes con CA125 >60 kU/l, la sensibilidad de
diagnóstico de hK6 es del 71 y el 65% a especificidades del 90 y el
95%, respectivamente. En el subgrupo de pacientes con CA125 baja
(< 23 kU/l), aproximadamente el 13-17% de
pacientes presentarán todavía hK6 elevada, a límites de hK6 de 4,4
(el 95% de especificidad) o 4,3 \mug/l (el 90% de especificidad),
respectivamente. En el subgrupo de pacientes con CA125 ligeramente
elevada (23-60 kU/l), la sensibilidad de diagnóstico
de hK6 es del 15-26% a especificidades del
95-90%, respectivamente (tabla 4).
En la tabla 5, se calculó la contribución
adicional de hK6 para identificar pacientes con cáncer de ovario
usando o bien CA125 sola o CA125 más hK6. Entre todas las pacientes
con estado conocido (N = 124), el análisis de hK6 aumenta la
sensibilidad de CA125 en el 12% o el 13%, al 90% o al 95% de límites
de especificidad para ambos marcadores. La contribución es todavía
significativa en las fases I/II de cáncer de ovario (43 pacientes).
La adición de hK6 aumenta la sensibilidad de CA125 sola desde el 30%
hasta el 42%, o desde el 26% hasta el 37%, al 90% o el 95% de
límites de especificidad para ambos marcadores, respectivamente.
La tabla 6 resume el riesgo relativo (RR) de
presentar cáncer de ovario, basado en la concentración de hK6 en
suero. El riesgo relativo aumenta exponencialmente con una
concentración creciente de hK6, alcanzando un valor de 20 cuando
hK6 es \geq4,3 \mug/l. El RR es todavía sustancia (RR = 5,3) en
análisis multivariante, tras ajustar para niveles de CA125.
Valor pronóstico de hK6 en suero: la fase
y el grado de cáncer de ovario superiores están asociados
intensamente con una concentración mayor de hK6 en suero (figura 11
y tabla 7). Además, los adenocarcinomas serosos están asociados más
frecuentemente con una concentración alta de hK6 en suero
(positividad del 68%) seguido de tumores endometrioides
(positividad del 33%); los tumores mucinosos están asociados en
pocas ocasiones con una hK6 alta en suero (9%). Además, una
concentración alta de hK6 en suero está asociada con la presencia de
tumor residual, reducción de masa subóptima y una mala respuesta a
la quimioterapia. Todas estas asociaciones eran muy significativas
(p <0,001).
En el análisis de Cox univariante, la
concentración de hK6 en suero está asociada con una menor
supervivencia libre de progresión y global (tabla 8). Estas
asociaciones siguieron siendo estadísticamente significativas en el
análisis multivariante. El valor pronóstico de CA125 ya no era
estadísticamente significativo en el análisis multivariante. Además
de la hK6 en suero prequirúrgica, la fase de la enfermedad era el
otro único parámetro que estaba asociado tanto con la supervivencia
libre de progresión como global en el análisis multivariante (tabla
6).
Se obtuvieron datos similares con el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier (figura 12). Las
pacientes con alta hK6 en suero prequirúrgica presentan una
supervivencia libre de progresión y global mucho más corta que las
pacientes con bajos niveles de hK6 preoperatorios. Aunque
prácticamente todas las pacientes con alta hK6 en suero sufrieron
una recidiva a los 6 años, más del 50% de las pacientes con baja hK6
en suero preoperatorio estaban todavía en remisión.
El descubrimiento de nuevos biomarcadores de
cáncer de ovario para un diagnóstico, pronóstico, seguimiento y
predicción de la respuesta terapéutica tempranos contribuirá
probablemente a una mejora de los desenlaces clínicos. El único
biomarcador de cáncer de ovario ampliamente aceptado, CA125, se
descubrió hace 20 años. Se han identificado otros varios
biomarcadores de cáncer de ovario potenciales pero no se ha
establecido su valor clínico (27). Un nuevo biomarcador de cáncer
de ovario, la calicreína humana 6 (hK6), un miembro de la familia
expandida de genes de la calicreína humana, se describe en la
presente memoria.
El biomarcador de cáncer de ovario tradicional,
CA125, está por debajo de poder diagnosticar de manera temprana el
cáncer de ovario. Además de su baja sensibilidad para la enfermedad
temprana, el CA125 también sufre su baja especificidad, es decir se
observan niveles elevados en muchas enfermedades abdominales
benignas. Actualmente, está ampliamente aceptado que ningún
biomarcador de cáncer individual proporcionará toda la información
necesaria para el diagnóstico y el tratamiento óptimo del cáncer.
La tendencia actual es concentrarse en la identificación de
biomarcadores múltiples que puedan usarse en combinación. Tales
enfoques ya han demostrado presentar un potencial clínico en el
cáncer de ovario (28, 29).
La hK6 en suero representa un nuevo biomarcador
para el carcinoma de ovario. Este biomarcador es más específico
para el cáncer de ovario que la CA125 ya que, a diferencia de la
CA125, no se observaron aumentos en las enfermedades benignas
(figura 7). La sensibilidad de diagnóstico de hK6 es ligeramente
menor que la sensibilidad de diagnóstico de CA125 a los mismos
límites de especificidad (tabla 5 y figura 10). Sin embargo, la hK6
puede aumentar la sensibilidad de diagnóstico de CA125 en todas las
fases de la enfermedad, incluyendo enfermedad en fase I/II (tabla
5). A pesar de la débil correlación entre hK6 y CA125 (figura 9),
hay todavía pacientes con CA125 normal que presentan niveles
elevados de hK6 (tabla 4). Por tanto, CA125 y hK6 podrían usarse en
combinación para aumentar la sensibilidad de diagnóstico de cada
uno de los biomarcadores solos.
De manera similar a la situación con CA125, la
concentración de hK6 es elevada más frecuentemente en el carcinoma
de ovario seroso que en los carcinomas endometrioide y mucinoso
(tabla 7). La concentración de hK6 en suero es también elevada más
frecuentemente en la enfermedad en fase tardía y de mayor grado. La
concentración de hK6 en suero es un predictor potente de los
desenlaces de las pacientes. Las pacientes con una concentración
preoperatoria de hK6 superior a 4,4 \mug/l presentan un pronóstico
significativamente peor que las pacientes con baja hK6
preoperatoria (tabla 8 y figura 12). Una concentración de hK6 en
suero es un indicador pronóstico más potente que la CA125 en suero.
El valor pronóstico de CA125 desaparece en el análisis multivariante
mientras que la hK6 en suero es un indicador pronóstico
independiente, tal como se muestra en el análisis multivariante de
la tabla 8. La hK6 en suero probablemente se origina a partir de
células tumorales, ya que tras la operación, los niveles disminuyen
significativamente (figura 8). En el estudio en el ejemplo 4, que
examina el valor pronóstico del análisis de hK6 en extractos de
tumor de ovario, se verificó la sobreexpresión de hK6 en células
tumorales mediante inmunohistoquímica y además se proporcionaron
evidencias de que la concentración intratumoral de la hK6 es
también un fuerte predictor de pronóstico. De manera interesante,
muchos otros miembros de la familia de genes de la calicreína
humana, incluyendo las enzimas hK4, hK5, hK7, hK8, hK9 y hK10 ya han
demostrado presentar significación de pronóstico en el cáncer de
ovario (34-41). Las serina proteasas que no
pertenecen a la familia de la calicreína también han demostrado
presentar significación de pronóstico en el cáncer de ovario,
incluyendo la tripsina, hepsina y testisina (42-44).
Incluso, se ha sabido durante años que muchas otras enzimas
proteolíticas presentar un valor pronóstico en muchos cánceres (para
revisiones, véanse 45 y 46). Los mecanismos biológicos de la
implicación de las enzimas proteolíticas en el pronóstico del cáncer
incluyen su capacidad para degradar la matriz extracelular,
facilitando así la invasión y metástasis (47-49).
Parece probable que múltiples miembros de la familia de genes de la
calicreína humana estén desregulados en el cáncer de ovario. Así es
posible que otros miembros de esta familia de proteasas puedan
surgir como biomarcadores de cáncer de ovario potenciales. Si estas
proteasas están implicadas en la evolución del cáncer, pueden ser
candidatos adecuados como dianas terapéuticas.
La tabla 7 muestra a modo preliminar que la
concentración de hK6 en suero prequirúrgica puede ser un predictor
de la respuesta a la quimioterapia en pacientes con cáncer de
ovario. Entre las que no respondían, el 81% presentaba una
concentración de hK6 prequirúrgica elevada mientras que el 19% de
estas pacientes presentaba una concentración de hK6 baja. Entre las
pacientes que presentaban una respuesta o bien completa o bien
parcial a la quimioterapia, el 57% presentaba una concentración de
hK6 preoperatoria baja (p < 0,001).
En conclusión, la concentración de hK6 en suero
representa un nuevo biomarcador para el carcinoma de ovario, que
presenta utilidad potencial como herramienta de diagnóstico, de
pronóstico y de predicción. La combinación de hK6 y CA125 mejora la
sensibilidad de diagnóstico del cáncer de ovario en todas las fases,
incluyendo la enfermedad en fase temprana.
Pacientes con cáncer de ovario. Se
incluyeron ciento ochenta pacientes con cáncer de ovario primario en
este estudio. Se sometió a estas pacientes a cirugía para cáncer de
ovario en el Departamento de Ginecología, Universidad de Turín,
Italia. La edad de las pacientes oscilaba desde 25 hasta 82 años con
una mediana de 59 años. La información clínica y patológica
documentada en el momento de la cirugía incluía la fase del cáncer,
grado e histología del tumor, y cantidad de tumor restante. Se
documentó el estado menopáusico y se hizo un seguimiento de la
respuesta a la quimioterapia. Se estadificaron los tumores según los
criterios de la Federación Internacional de Ginecología y
Obstetricia (FIGO). La clasificación histológica se basaba en las
recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud y la FIGO.
De los tumores incluidos en este estudio, 80 se clasificaron como
papilares serosos, 32 como no diferenciados, 27 como
endometrioides, 13 como mucinosos, 14 como de células claras, 10
como de Müller y 4 como otros. El tamaño de los tumores residuales
osciló desde 0 hasta 9 cm, con una mediana de 1,1 cm.
Se hizo un seguimiento de los pacientes para
determinar la supervivencia y evolución de la enfermedad (ninguna
evolución aparente o evolución) para una duración mediana de 62
meses (intervalo de 1-99 meses). La información de
seguimiento estaba disponible para 165 de los pacientes. 97 (54%) de
éstas sufrieron una recidiva y 61 (34%) murieron durante el
transcurso del periodo de seguimiento.
Se llevaron a cabo las investigaciones según las
normas éticas de la Declaración de Helsinki de 1975, tal como se
revisó en 1983, y se aprobaron por el Instituto de Obstetricia y
Ginecología, Turín, Italia.
Preparación de extractos de células
tumorales. Se congeló tejido tumoral en nitrógeno líquido
inmediatamente tras la cirugía y se almacenó a -80ºC hasta la
extracción. Se pulverizaron de 20 a 100 mg de tejido congelado
sobre hielo seco para dar un polvo fino y se añadieron a 10
volúmenes de tampón de extracción (Tris 50 mm, pH 8,0, NaCl 150 mm,
EDTA 5 mm, 10 g/l de tensioactivo NP-40, fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 1 mM, 1 g/l de aprotinina, 1 g/l de
leupeptina). Se incubó la suspensión resultante sobre hielo durante
30 minutos tiempo durante el cual se agitó con vórtex cada diez
minutos. Entonces se centrifugó la mezcla a 14.000 rpm a 4ºC
durante 30 minutos y se recogió el sobrenadante (extracto celular) y
se almacenó a -80ºC hasta el análisis. Se determinó la
concentración de proteína del extracto con el procedimiento de ácido
bicinconínico, con albúmina como patrón (Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL).
Medición de hK6 en extractos de células
ováricas. Se cuantificó la concentración de hK6 en extracto de
células tumorales con un inmunoensayo no competitivo específico y
altamente sensible para hK6 que se ha descrito y evaluado
previamente con detalle (12). El ensayo incorporaba dos anticuerpos
policlonales específicos de hK6, uno cultivado en ratón y otro en
conejo, en un formato inmunométrico secuencial de dos sitios con
detección de fluorescencia de resolución temporal. Se llevó a cabo
el análisis de patrones, extractos de células tumorales y mezclas
control por duplicado en placas de microtitulación de poliestireno
de 96 pocillos con 200 \mul de muestra añadidos al inmunoensayo.
La curva patrón que usaba proteína hK6 recombinante oscilaba desde
0,5 \mug/l hasta 200 \mug/l. La precisión del ensayo era mejor
que el 10%. Se realizaron la detección de señales y la reducción de
datos automáticamente mediante el inmunoanalizador CyberFluor
615.
Localización de hK6 en muestras de tumor de
ovario mediante inmunohistoquímica. Se cultivó un anticuerpo
policlonal de conejo frente a proteína recombinante de tamaño
completo hK6, producida en células de levadura. Se realizó la
tinción inmunohistoquímica para hK6 según un procedimiento de
inmunoperoxidasa convencional. En resumen, se fijaron las secciones
de tejido embebidas en parafina (4 \mum) y se desparafinaron. Se
bloqueó la actividad de la peroxidasa endógena con peróxido de
hidrógeno acuoso al 3% durante 15 minutos. Entonces se trataron las
secciones con pepsina al 0,4% a pH 2,0 durante 5 minutos a 42ºC y se
bloquearon con bloqueador de proteína al 20% (Signet Labs) durante
10 minutos. Entonces se añadió el anticuerpo primario a una dilución
de 1:400 durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras el lavado, se
añadió anticuerpo anti-conejo biotinilado (Signet),
se diluyó 4 veces en tampón de dilución de anticuerpo (DAKO). Tras
la incubación y el lavado, se añadió peroxidasa del rábano marcada
con estreptavidina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras
el lavado, se consiguió la detección con aminoetilcarbazol (AEC)
durante 5-10 minutos. Se hizo una contratinción en
los portaobjetos con hematoxilina y después se taparon con
cubreobjetos.
Análisis estadístico. Se realizó el
análisis estadístico con software de SPSS (SPSS Inc. Richmond, CA).
Para analizar los datos, se dividieron las pacientes en grupos
diferentes según parámetros clínicos y patológicos. Debido a que la
distribución de masa de hK6 por mg de proteína total (es decir,
actividad específica) en los extractos de tumor de ovario no era
gaussiana, se usó la prueba U de Mann-Whitney no
paramétrica para determinar las diferencias entre dos grupos y se
usó la prueba de Kruskal-Wallis no paramétrica para
los análisis de diferencias entre más de dos grupos. Estas pruebas
trataron la actividad específica de hK6 en el extracto tumoral (ng
de hK6/mg de proteína total) como una variable continua. También se
clasificó la actividad específica del extracto tumoral de hK6 como
o bien hK6-positiva (> 35 ng/mg de proteína
total; véase la figura 7B para una explicación) o
hK6-negativa (\leq 35 ng/mg de proteína total). Se
estableció la relación de esta variable dicotómica con las otras
correlaciones clinicopatológicas con la prueba de chi cuadrado
(\chi^{2}) o la prueba exacta de Fisher, según fuera apropiado.
Se evaluó el impacto de la actividad específica de hK6 del extracto
tumoral en la supervivencia de la paciente y en la evolución de la
enfermedad (supervivencia libre de progresión) con la razón de
riesgos calculada tanto mediante modelos de regresión de riesgos
proporcionales de Cox univariantes como multivariantes (30). En el
análisis multivariante, se ajustaron las variables clínicas y
patológicas que pueden afectar a la supervivencia, incluyendo la
fase de la enfermedad, grado del tumor, tumor residual, tipo
histológico y edad. Se construyeron las curvas de supervivencia
global y libre de progresión de Kaplan-Meier (31)
para demostrar las diferencias de supervivencia entre las pacientes
hK6-positivas y hK6-negativas. Se
usó la prueba de rango logarítmico (32) para examinar la
significación de las diferencias entre las curvas de supervivencia.
Tras el análisis del conjunto completo de datos de pacientes como un
todo, se repitió el proceso en subgrupos estratificados por
separado por la fase de la enfermedad, por el grado del tumor y por
la cantidad de tumor que restaba tras la cirugía (éxito de la
reducción de masa). Se determinó el impacto del nivel de hK6
tumoral (positivo o negativo) en la supervivencia y en la evolución
de la enfermedad mediante modelos univariantes y multivariantes
para cada uno de los subgrupos.
Distribución de la actividad específica de
hK6 en extractos de tumor de ovario. La distribución de
actividad específica de hK6 en extractos de tumor de ovario de las
180 pacientes (figura 13A) oscilaba desde 0,04 ng/mg de proteína
total hasta 497 ng/mg de proteína total con una media de 33 ng/mg de
proteína total y una mediana de 13,2 ng/mg de proteína total. Se
identificó un valor de 35 ng/mg de proteína total mediante análisis
de chi cuadrado (\chi^{2} = 7,3; P = 0,007) como el punto de
corte óptimo para distinguir tumores positivos de negativos en
cuanto a predecir la supervivencia global (figura 13B). El treinta
por ciento de los tumores era hK6 positivo según este criterio. Se
trató la actividad específica de hK6 en extractos de tumor tanto
como variable continua como variable dicotómica (\leq 35 ng/mg de
proteína total, > 35 ng/mg de proteína total) en los análisis
que siguen.
\newpage
La actividad específica de hK6 (ng de hK6/mg de
proteína total) era significativamente elevada (P < 0,001 según
la prueba de Kruskal Wallis) en extractos de tumor de ovario (media
32,7, error estándar 3,8, intervalo de 0,04 a 497) en comparación
con extractos preparados de tejidos ováricos normales (media 3,5,
error estándar 2,5, intervalo de 0,05 a 20,8) o de tejido ovárico
con enfermedad benigna (media 3,2, error estándar 2,6, intervalo de
0,03 a 21,5) (figura 14). Un análisis adicional mostró que no había
una diferencia significativa en la actividad específica de hK6
entre los tumores de ovario cuando se estratificaron por histotipo
(es decir seroso frente a no diferenciado frente a endometrioide,
etc.) (datos no mostrados).
Relaciones entre estado de hK6 y otras
variables clinicopatológicas. Se resumen las distribuciones de
diversas variables clinicopatológicas entre pacientes
hK6-positivas y hK6-negativas en la
tabla 9. Se examinaron las relaciones entre el estado de hK6 y
estas variables con o bien la prueba de \chi^{2} o la prueba
exacta de Fisher, según fuera apropiado. No se observó ninguna
relación entre el estado de hK6 y el grado de tumor, el estado
menopáusico y la respuesta a la quimioterapia. Sin embargo, era más
probable que las pacientes hK6-positivas
presentaran enfermedad avanzada (fase II-IV),
histología de tumor seroso y mayor tumor residual (>1 cm) (todos
P<0,05). La actividad específica del extracto de tumor de hK6
cuando se trataba como variable continua también se asociaba
proporcionalmente con la fase de la enfermedad. La figura 15 muestra
la distribución de actividad específica de hK6 estratificada por
fase de la enfermedad. La actividad específica de hK6 era
significativamente mayor en los extractos de fase III/IV de cáncer
de ovario que en los de fase I/II (P = 0,002 según la prueba U de
Mann Whitney).
Análisis de supervivencia univariante y
multivariante. Se presenta el impacto de la actividad específica
de hK6, otras variables clinicopatológicas y la edad sobre la
evolución de la enfermedad y sobre la supervivencia global en la
tabla 10. En un análisis univariante, las pacientes
hK6-positivas presentaban un riesgo
significativamente aumentado de evolución de la enfermedad (razón
de riesgo = 1,71) y muerte (razón de riesgo =1,88) (P<0,05).
Cuando se trató la actividad específica de hK6 como una variable
continua, las razones de riesgo eran muy similares a las de tumores
hK6 negativos (fijados arbitrariamente a 1,00), aunque el ligero
aumento en el riesgo de evolución de la enfermedad (razón de riesgo
= 1,005) era muy significativo a P = 0,001. Las curvas de
supervivencia de Kaplan-Meier demostraron
diferencias de supervivencia entre pacientes
hK6-positivas y hK6-negativas. Tal
como muestra la figura 16, la probabilidad de supervivencia libre de
progresión y global, respectivamente, son menores en las pacientes
hK6-positivas que en pacientes
hK6-negativas.
Los efectos adversos de la positividad de hK6
sobre la evolución de la supervivencia libre de progresión y sobre
la supervivencia global se perdieron en el análisis multivariante.
Tal como se muestra en la tabla 10, cuando se ajustaron los
desenlaces de supervivencia para otras variables clinicopatológicas,
las pacientes hK6-positivas y
hK6-negativas presentaban tasas estadísticamente
similares de evolución de la enfermedad y supervivencia global. El
grado del tumor también perdió su significación de pronóstico
univariante en el análisis multivariante. Sólo la fase de la
enfermedad y el tumor residual que permanecía tras la cirugía
mantuvieron sus efectos independientes sobre el desenlace de
supervivencia en el análisis multivariante.
Análisis de supervivencia univariante y
multivariante en subgrupos de pacientes. Se dividieron las
pacientes en subgrupos diferentes basándose en la fase de la
enfermedad, grado del tumor y el éxito de reducción de masas (tumor
residual). En cada subgrupo, se determinó el impacto de la
positividad de hK6 y la negatividad sobre la evolución de la
enfermedad y sobre la supervivencia global mediante modelos de
regresión de riesgos proporcionales de Cox univariantes y
multivariantes. Se muestran los resultados en la tabla 11. La
actividad específica de hK6 (positiva, negativa) afectaba
significativamente a la supervivencia en el subgrupo de pacientes
con tumor de grado I o II. El análisis univariante reveló que era
aproximadamente 9 veces más probable que las pacientes
hK6-positivas experimentaran la evolución de la
enfermedad y 5 veces más probable que murieran que las pacientes
hK6-negativas. Estas diferencias de supervivencia
siguieron siendo significativas incluso tras someter los datos a
análisis multivariante. El riesgo relativo de ambos desenlaces que
se producían por la positividad de hK6 era ahora aproximadamente de
4 veces (P < 0,03). El estado de hK6 no presentaba tal efecto
entre las pacientes con tumor de grado III, ni podía demostrarse
ningún efecto discernible entre las pacientes con enfermedad en
fase temprana y entre aquellas con más de 1 cm de tumor restante
tras la cirugía. El análisis univariante reveló un aumento de 2
veces en el riesgo de evolución de la enfermedad y de muerte en el
subgrupo de pacientes con enfermedad avanzada (fase III y IV) que
eran hK6 positivas, pero se perdió el efecto en el análisis
multivariante. Lo contrario ocurrió en el subconjunto de pacientes
caracterizado por una reducción óptima de la masa del tumor en el
momento de la cirugía (tumor restante de menos de 1 cm de
diámetro). La positividad de hK6 no tenía ningún efecto adverso
demostrable sobre la evolución de la enfermedad o sobre la
supervivencia mediante análisis univariante, pero se volvió
estadísticamente significativa, dando un aumento de 3,5 y 5,5 veces
en el riesgo adverso, respectivamente, cuando se sometieron los
datos a análisis multivariante. La aparición de efectos en el
modelo multivariante cuando no se genera ninguno en el modelo
univariante se produce cuando las variables ajustadas no tienen
impacto en absoluto sobre el desenlace. En el caso en la presente
memoria, esto significa que la fase de la enfermedad, el grado de
tumor, la histología del tumor y la edad de la paciente no
presentaban un potencial pronóstico sobre la evolución de la
enfermedad y la supervivencia global en este subconjunto particular
de pacientes. Se muestran las curvas de supervivencia de
Kaplan-Meier del subconjunto de pacientes con tumor
de ovario de grado I o II en la figura 17. Tal como se esperaba del
análisis univariante mencionado anteriormente, había una diferencia
significativa en la evolución de la enfermedad y la supervivencia
entre pacientes hK6 positivas y hK6 negativas.
Tinción inmunohistoquímica de hK6 en tumores
de ovario. La tinción inmunohistoquímica de hK6 en secciones de
tumor embebidas en parafina era aproximadamente proporcional a la
actividad específica de hK6 en extractos de tumor (datos no
mostrados). Se ilustra la ubicación inmunohistoquímica de proteína
hK6 en cuatro tejidos ováricos que contenían tumor benigno,
intermedio o maligno en la figura 18. Se restringió la tinción de
hK6 a células epiteliales, estando ausente en elementos
mesenquimatosos incluyendo estroma conjuntivo fibroso. La hK6 se
tiñó dentro del citoplasma de células epiteliales, pero la
intensidad de tinción era variable entre y dentro de las
preparaciones de tumor.
Se encontró que el aumento en la síntesis de hK6
predecía un comportamiento del tumor más agresivo a lo largo del
tiempo. Considerada por separado de otras variables
clinicopatológicas y la edad, se asoció la positividad de hK6 por
toda la población de pacientes en estudio con aproximadamente un
aumento de 2 veces en el riesgo tanto de evolución de la enfermedad
como de muerte. Se perdió este efecto cuando se ajustaron los
desenlaces para las otras variables clinicopatológicas y la edad en
el análisis multivariante de toda la población de pacientes, pero
no cuando se restringió el análisis multivariante a aquellas
pacientes con tumor de grado inferior y con menos tumor residual
restante tras la cirugía (<1 cm de diámetro). Entre el primer
subgrupo de pacientes, la positividad de hK6 predecía
aproximadamente un aumento de 4 veces en el riesgo de evolución de
la enfermedad y de muerte (P < 0,03) mientras que las razones de
riesgo correspondiente en el último subgrupo eran de 3,75 y 5,5,
respectivamente (P < 0,02). Los datos muestran que la positividad
de hK6 presenta un potencial de predicción independiente en estos
dos subgrupos y ayuda a comprender el comportamiento del tumor a lo
largo del tiempo que no puede deducirse de las correlaciones
patológicas y de parámetros clínicos medidos convencionalmente. Por
tanto las pruebas de hK6 podrían contribuir a un tratamiento eficaz
más individualizado de tales pacientes.
Se encontró que la hK6 se sobreexpresaba
frecuentemente en tumores de ovario en comparación con tejido
ovárico sin tumores malignos. Esta sobreexpresión tendía a ser
mayor en tumores de enfermedad en fase tardía que de enfermedad en
fase temprana. Los estudios histoquímicos sugieren que la hK6 se
sintetiza por las células epiteliales del ovario y se distribuye de
manera difusa dentro del compartimento citoplasmático.
El cáncer de ovario epitelial presenta uno de
los peores pronósticos entre los tumores malignos ginecológicos, en
gran parte porque más de las tres cuartas partes de los diagnósticos
se realizan en un momento en el que la enfermedad ya ha establecido
metástasis regionales o distantes (33). La combinación del problema,
la evolución del tumor y la agresividad se correlaciona de manera
variable con marcadores clínicos y patológicos convencionales. Por
tanto existe una necesidad importante de marcadores diagnósticos y
pronósticos adicionales para esta enfermedad y se han identificado
diversos marcadores potenciales.
Las citas completas a continuación se exponen
para las referencias a las que se hace referencia en la memoria
descriptiva.
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Claims (13)
1. Procedimiento in vitro para
diagnosticar o hacer un seguimiento del cáncer de ovario o
determinar el pronóstico de cáncer de ovario en un sujeto que
comprende:
- (a)
- determinar el nivel de calicreína humana 6 en una muestra de suero del sujeto; y
- (b)
- comparar el nivel determinado de calicreína humana 6 con un nivel presente en una muestra de suero control adquirida de un sujeto control que se sabe que no está afectado por cáncer de ovario o con enfermedad benigna o una muestra de suero control tomada del sujeto en un momento diferente, en el que un aumento en el nivel de calicreína humana 6 en la muestra de suero del sujeto en comparación con el nivel de calicreína humana 6 en la muestra de suero control es indicativo de cáncer de ovario en el sujeto o mal pronóstico.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende en la etapa (a):
- (i)
- poner en contacto la muestra de suero con un anticuerpo específico para calicreína humana 6 que está directa o indirectamente marcado con una sustancia detectable;
- (b)
- detectar la sustancia detectable para determinar el nivel de calicreína humana 6 en la muestra.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, que
comprende además:
en la etapa (a), poner en contacto además la
muestra de suero con un segundo anticuerpo específico para hK6 que
está inmovilizado;
tras la etapa (a), separar el primer anticuerpo
del segundo anticuerpo para proporcionar una primera fase de
anticuerpo y segunda fase de anticuerpo;
en la etapa (b), detectar el sustrato detectable
o bien en la primera o bien en la segunda fase de anticuerpo
determinando de este modo el nivel de calicreína humana 6 en la
muestra biológica.
4. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que en la etapa (a) los primer y segundo anticuerpos se ponen en
contacto simultánea o secuencialmente con la muestra biológica.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal, un anticuerpo policlonal, fragmentos de anticuerpo
inmunológicamente activo, anticuerpo humanizado, una cadena pesada
de anticuerpo, una cadena ligera de anticuerpo, una molécula de
F_{v} de cadena sencilla modificada mediante ingeniería genética
o un anticuerpo quimérico.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5, en el que la sustancia detectable es
fosfatasa alcalina.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que la fosfatasa alcalina se detecta usando un sustrato
fluorogénico.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de calicreína humana
6 se determina usando fluorescencia de resolución temporal.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además determinar niveles
de CA125 en la muestra de suero.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, para hacer el seguimiento del sujeto
tras el tratamiento primario.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 para determinar el pronóstico de enfermedad
de cáncer de ovario en el sujeto, en el que un nivel mayor que 4,4
\mug/l indica un pronóstico significativamente peor.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que determinar el pronóstico comprende
predecir el desenlace de la cirugía, la respuesta a la
quimioterapia o las posibilidades de supervivencia del sujeto.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la detección de un nivel de
calicreína humana 6 en la muestra de suero del sujeto mayor que el
nivel determinado en la muestra de suero del sujeto control indica
enfermedad en fase tardía, o un aumento del riesgo de evolución de
la enfermedad y mortalidad.
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