DE60129151T2 - Verfahren zur erkennung von eierstockkrebs mittels menschlichem kallikrein (hk6) - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft diagnostische und prognostische Verfahren für Eierstockkrebs.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Bis in die jüngste Zeit nahm man an, dass die humane Kallikrein-Genfamilie nur aus 3 Genen besteht: pankreatischem/renalem Kallikrein (KLK1, codierend für hK1-Protein), humanem glandulärem Kallikrein 2 (KLK2, codierend für hK2-Protein) und humanem Kallikrein 3 (KLK3, codierend für hK3-Protein oder Prostata-spezifisches Antigen, PSA). Die zwei letztgenannten Kallikreine, PSA und hK2, sind relativ Prostata-spezifisch und haben bereits wichtige Anwendungen als Biomarker für die Diagnose und Überwachung von Prostatakrebs gefunden (1-6).
  • Neue Mitglieder der humanen Kallikrein-Genfamilie sind jüngst entdeckt worden (1). Diese Genfamilie enthält nun wenigstens 14 Gene, die alle für Serinproteasen codieren, eine signifikante Homologie sowohl auf DNA-Ebene als auch auf Aminosäure-Ebene zeigen, und sie sind alle auf dem chromosomalen Lokus 19q13.3-q13.4 in Tandemanordnung angeordnet, und zwar ohne irgendwelche dazwischen liegenden anderen Nicht-Kallikreingene. Dieses Forschungsgebiet ist jüngst übersichtsartig dargestellt worden (1).
  • Das KLK6-Gen (codierend für humanes Kallikrein 6, hK6) ist unabhängig von drei Forschergruppen kloniert worden und wurde zuvor mit den Namen Zyme (7), Protease M (8) und Neurosin (9) belegt. Jüngst ist eine einheitliche Nomenklatur für alle neu entdeckten sowie die traditionellen Kallikreingene etabliert worden (10). Das KLK6-Gen codiert für eine Trypsin-artige Serinprotease von 244 Aminosäuren Länge, wovon 16 Aminosäuren das Signalpeptid und 5 Aminosäuren das Aktivierungspeptid darstellen. Das reife Enzym besteht aus 223 Aminosäuren. Es ist zuvor vorhergesagt worden, dass hK6 ein sekretiertes Protein ist (7-9, 11). Dies wurde jüngst dadurch verifiziert, dass hK6-Protein in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten gefunden wurde, einschließlich Cerebrospinalflüssigkeit, Nipple Aspirate Fluid, Brustzystenflüssigkeit, männlichem und weiblichem Serum, Seminalplasma, Amnionflüssigkeit und Brustkrebs-Zytosolen (12). Little et al. (7) haben gezeigt, dass dieses Enzym amyloidogenes Potential im Gehirn besitzt und eine Rolle in der Entwicklung und beim Voranschreiten der Alzheimer-Erkrankung spielen kann. Andere haben das gleiche Gen durch das Verfahren des Differential Display kloniert und herausgefunden, dass es bei aggressiven Formen von Brustkrebs herunterreguliert wird (8). Das gleiche Gen wurde von Yamashiro et al. aus der humanen Colon-Adenokarzinomzelllinie COLO 201 kloniert (9).
  • Unter den klassischen humanen Kallikreinen hat sich PSA als wertvollster Biomarker für Prostatakrebs erwiesen und wird derzeit für die Diagnose und Überwachung dieser Erkrankung verwendet (2-4). Ein weiterer potentieller Prostata-Biomarker, hK2, ist ebenfalls kürzlich eingeführt worden (5, 6). Unter den neu entdeckten Kallikreinen (1) ist keines davon als ein serologischer Marker für irgendeine maligne Erkrankung untersucht worden, da derzeit keine Verfahren existieren, um die sekretierten Proteine mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität zu messen.
  • Eierstockkrebs ist eine ernste Erkrankung, die mehr Todesfälle verursacht als irgendein anderer Krebs des weiblichen Reproduktionssystems (13). Da das Überleben dramatisch verbessert werden kann, wenn die Erkrankung frühzeitig diagnostiziert wird (14), gibt es ein großes Interesse an der Identifizierung von Biomarkern, die bei der frühen Detektion helfen und eine Einteilung nach Grad und/oder Stadium erleichtern könnten (15). Unglücklicherweise haben die derzeitigen serologischen Marker für Eierstockkrebs, einschließlich CA125 (16-19), Inhibin (20-23), OVX1 (24), ebenso wie viele andere Marker (übersichtsartig dargestellt in 25), eine gewisse Hoffnung geweckt, haben jedoch keine breite klinische Akzeptanz gefunden. Ein weiterer potentieller Marker für Eierstockkrebs, Lysophosphatidsäure, scheint ebenfalls einen gewissen Wert für diesen Zweck zu besitzen (26).
  • Anisowiez et al, Molecular Medicine (1996), 2(5), 624-636 beziehen sich die Isolierung von Protease M (auch bekannt als Kallikrein 6) und offenbaren, dass die mRNA von Protease M in Eierstockkrebsgewebe und -Zelllinien stark exprimiert wird und nützlich als Marker für die Detektion von primärem Eierstockkrebs sein könnte. Jedoch schlussfolgerten die Autoren, dass das Protein primär intrazellulär lokalisiert sei, statt sekretiert zu werden, da sie in der Lage waren, es in Zelllysaten, jedoch nicht in konditionierten Medien zu detektieren. Diese Autoren beobachteten außerdem eine fehlende Korrelation zwischen den (hohen) Expressionsniveaus von Protease M-mRNA und den (niedrigen oder fehlenden) Protease M-Proteinniveaus in Brustkrebszelllinien.
  • Die WO-A-98/11238 bezieht sich auf die Entdeckung von Protease M und offenbart die Verwendung von Antikörpern, um Protease M in einem Zelllysat oder Überstand zu detektieren.
  • Die WO-A-98/41656 betrifft ein Verfahren zum Detektieren von Eierstockkrebs, umfassend das Durchmustern einer Mehrzahl von Protease-Markern in Gewebe. Insbesondere betrifft das Dokument das Detektieren von Proteasen aus Gewebeproben, aus der Gruppe, bestehend aus Stratum Corneum Chymotrypsin Enzyme (SCCE), TADG12, TADG13, TADG14, Hepsin, Pump-1 und Protease M.
  • Es gibt einen dringenden Bedarf für die Entdeckung und Validierung neuer Biomarker für Eierstockkrebs. Eine frühe Diagnose von Eierstockkrebs, insbesondere mit einer serologischen Analyse, kann den klinischen Ausgang durch die Verabreichung einer wirksamen Behandlung verbessern.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es wurde ein hochempfindlicher hK6-Immunoassay für die Messung von hK6 in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten entwickelt (Beispiel 1). Unter Verwendung dieses empfindlichen Tests wurde herausgefunden, dass die hK6-Konzentration im Serum bei einem großen Teil der Patientinnen mit Eierstockkrebs signifikant erhöht war. Insbesondere wurde herausgefunden, dass hK6 bei Eierstockkrebspatientinnen signifikant erhöht war, wenn man dies mit normalen Nicht-Krebs-Patienten und Patienten mit gutartiger Erkrankung verglich. Somit stellt hK6 einen neuen Biomarker für die Diagnose und Überwachung von Eierstockkrebs bereit. hK6 kann verwendet werden, um Eierstockkrebs im späten Stadium zu diagnostizieren und zu überwachen, und es kann als ein Biomarker vor der Chirurgie oder nach einem Rückfall verwendet werden.
  • Die vorliegenden Erfinder haben auch die Menge an hK6 in Extrakten von Eierstocktumoren quantifiziert und festgestellt, dass die Menge an hK6 mit klinisch-pathologischen Variablen korrelierte, die zum Zeitpunkt des chirurgischen Ausschneidens und mit dem progressionsfreiem Überleben und Gesamtüberleben dokumentiert wurden. Es wurde herausgefunden, dass gesteigerte hK6-Niveaus ein aggressiveres Tumorverhalten über den Zeitverlauf vorhersagten. Es wurde herausgefunden, dass Positivität für hK6 mit einer etwa 2-fach gesteigerten Zunahme des Risikos sowohl für das Voranschreiten der Erkrankung als auch für den Tod assoziiert war.
  • hK6 und Mittel, die an hK6 binden, können verwendet werden, um Eierstockkrebs zu detektieren, und sie können insbesondere bei der diagnostischen Bewertung von Eierstockkrebs und bei der Identifizierung von Subjekten mit einer Prädisposition für Eierstockkrebs verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein In vitro-Verfahren zum Diagnostizieren oder Überwachen von Eierstockkrebs oder zum Bestimmen der Prognose für Eierstockkrebs in einem Subjekt, wobei man
    • (a) die Menge an humanem Kallikrein 6 in einer Serumprobe von dem Subjekt bestimmt und
    • (b) die bestimmte Menge an humanem Kallikrein 6 mit einer Menge vergleicht, die in einer Kontroll-Serumprobe vorhanden ist, welche man von einem Kontroll-Subjekt erhalten hat, von dem bekannt ist, dass es nicht von Eierstockkrebs befallen ist, oder dass es an einer benignen Erkrankung leidet, oder in einer Kontroll-Serumprobe, die von dem Subjekt zu einem anderen Zeitpunkt genommen wurde, wobei eine Zunahme der Menge an humanem Kallikrein 6 in der Serumprobe von dem Subjekt im Vergleich zu der Menge an humanem Kallikrein 6 in der Kontroll-Serumprobe ein Hinweis für Eierstockkrebs in dem Subjekt oder für eine schlechte Prognose ist.
  • Die Begriffe „detektieren" oder „detektiert" beinhalten das Messen, Quantifizieren, die Abbildung oder anderweitige Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit von Ziel-hK6, Untereinheiten davon, oder Kombinationen oder Reagenz-gebundenen Zielen und dergleichen, oder das Testen auf, die Bildbestimmung, die Ermittlung oder sonstige Bestimmung einer oder mehrerer tatsächlicher Eigenschaften von Eierstockkrebs, Metastase, des Stadiums oder ähnlicher Zustände. Der Begriff umfasst diagnostische, prognostische und überwachende Anwendungen von hK6.
  • Bei einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren von Eierstockkrebs in einem Subjekt durch Quantifizieren von hK6 in einer biologischen Probe des Subjekts, umfassend (a) das Umsetzen der biologischen Probe von dem Subjekt mit einem für hK6 spezifischen Antikörper, der direkt oder indirekt mit einer detektierbaren Substanz markiert ist; und (b) Detektieren der detektierbaren Substanz.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Diagnostizieren und Überwachen von Eierstockkrebs bei einem Subjekt durch Quantifizieren von hK6 in einer Probe von dem Subjekt, umfassend (a) das Umsetzen einer biologischen Probe von dem Subjekt mit einem für hK6 spezifischen Antikörper, der direkt oder indirekt mit einer detektierbaren Substanz markiert ist; und (b) Detektieren der detektierbaren Substanz.
  • Ausführungsformen der Verfahren der Erfindung beinhalten (a) das Umsetzen einer biologischen Probe von einem Subjekt mit einem für hK6 spezifischen Antikörper, der direkt oder indirekt mit einem Enzym markiert ist; (b) Zugeben eines Substrats für das Enzym, wobei das Substrat so ausgewählt ist, dass das Substrat oder ein Reaktionsprodukt von Enzym und Substrat fluoreszente Komplexe ausbildet; (c) Quantifizieren von hK6 in der Probe durch Messen der Fluoreszenz der fluoreszenten Komplexe; und (d) Vergleichen der quantifizierten Mengen mit der eines Standards. Der Standard kann Mengen entsprechen, die für andere Proben des betreffenden Patienten erhalten wurden, oder für Kontrollsubjekte. Bei einer Ausführungsform werden die quantifizierten Mengen mit Mengen verglichen, die für Subjekte ohne Eierstockkrebs quantifiziert wurden, wobei ein Anstieg der hK6-Mengen im Vergleich zu den Kontrollsubjekten Eierstockkrebs anzeigt, insbesondere späte Stadien von Eierstockkrebs.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst die folgenden Stufen:
    • (a) das Inkubieren einer biologischen Probe mit einem ersten Antikörper, welcher für hK6 spezifisch ist und welcher direkt oder indirekt mit einer detektierbaren Substanz markiert ist, und einem für hK6 spezifischen zweiten Antikörper, welcher immobilisiert ist,
    • (b) das Abtrennen des ersten Antikörpers von dem zweiten Antikörper, um eine Phase des ersten Antikörpers und eine Phase des zweiten Antikörpers zu erhalten,
    • (c) das Feststellen der detektierbaren Substanz in der Phase entweder des ersten oder des zweiten Antikörpers, wodurch hK6 in der biologischen Probe quantifiziert wird; und
    • (d) das Vergleichen des quantifizierten hK6 mit Mengen für einen Standard.
  • Der Standard kann Mengen entsprechen, die quantifiziert wurden für Proben von gesunden Kontrollsubjekten, von Subjekten mit benigner Erkrankung, von Subjekten mit einer Erkrankung im Frühstadium oder von anderen Proben des Subjekts. Erhöhte Mengen an hK6 im Vergleich zum Standard können Eierstockkrebs anzeigen, insbesondere Eierstockkrebs im späten Stadium.
  • Die Erfindung umfasst auch die hier beschriebenen Verfahren unter Verwendung multipler Marker für Eierstockkrebs. Daher fasst die Erfindung ein Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe auf Gegenwart von hK6 und anderen Markern, die spezifische Indikatoren von Eierstockkrebs sind, ins Auge. Andere Marker beinhalten Marker für Kallikreine, wie etwa humanes Stratum corneum chymotryptisches Enzym (HSCCE), Kallikrein 4, Kallikrein 5, Kallikrein 8, Kallikrein 9, Kallikrein 10, Kallikrein 11; CA125, CA15-3, CA19-9, OVX1, Lysophosphatidsäure (LPA) und karzinoembryonales Antigen (CEA). Bevorzugt sind die anderen Marker Marker für Kallikreine. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Marker zwei oder mehr von hK6, hK10 und CA 125. Die hier beschriebenen Verfahren können modifiziert werden durch Einbeziehung von Reagenzien zum Detektieren der zusätzlichen Marker oder der Nukleinsäuren für die Marker.
  • Die Erfindung betrifft auch Kits zum Durchführen der Verfahren der Erfindung.
  • Andere Zielsetzungen, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich werden. Es versteht sich jedoch, dass die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele, obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen, nur zur Veranschaulichung angegeben sind, da zahlreiche Änderungen und Modifikationen im Geist und Schutzumfang der Erfindung Fachleuten aus dieser detaillierten Beschreibung ersichtlich sein werden.
  • BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Erfindung wird nun im Bezug auf die Zeichnungen beschrieben, die wie folgt sind:
  • 1 ist ein Eichkurve für einen hK6-Proteinassay. Die Fluoreszenz des Null-Standards (18.000 willkürliche Fluoreszenzeinheiten) wurde von allen anderen Messungen abgezogen.
  • 2 zeigt die Ergebnisse einer Hochleistungsflüssigchromatographie-Auftrennung von drei biologischen Flüssigkeiten und die Analyse aller Fraktionen mit dem entwickelten hK6-Immunoassay. Bei allen drei Flüssigkeiten wurde ein einzelner immunoreaktiver Peak im Bereich der Fraktionen 38-42 detektiert, der einer Molekülmasse von ~30 kDa entsprach. Die Säule wurde mit Molekulargewichtsstandards kalibriert (oben mit Pfeilen angezeigt; Massen in kDa). Die Milchprobe wurde zehnfach verdünnt, bevor sie in die HPLC-Säule injiziert wurde.
  • 3 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse der Analyse von zytosolischen Extrakten verschiedener humaner Gewebe für das hK6-Protein zeigt.
  • 4 ist ein Diagramm, das die Häufigkeitsverteilung von hK6-Konzentrationen im Serum von 80 Patientinnen mit Eierstockkrebs zeigt. Die Menge von 15 μg/l, die als Ausschlusswert in Tabelle 1 verwendet wurde, ist durch einen Pfeil angezeigt. Etwa 66% der Eierstockkrebspatientinnen besitzen hK6-Serumkonzentrationen, die höher sind als dieser Ausschlusswert. Von weiteren 298 Serumproben von Nicht-Eierstockkrebs-Patienten besaßen nur 2 Seren Werte, die geringfügig höher waren als 15 μg/l (siehe Tabelle 1).
  • 5 ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen der hK6- und der CA125-Konzentration in 96 Serumproben von Eierstockkrebspatientinnen zeigt.
  • 6 sind Graphen, die die Analyse von hK6 und CA125 in seriellen Serumproben von Patientinnen mit Eierstockkrebs zeigen. Diese Daten legen nahe, dass hK6 wertvoll für die Patientenüberwachung sein kann.
  • 7A ist ein Diagramm, das die Verteilung von hK6 bei normalen, bei benignen und bei Krebspatienten zeigt.
  • 7B ist ein Diagramm, das die Verteilung von CA 125 bei normalen, benignen und Krebspatienten zeigt.
  • 8 ist ein Diagramm, das die Konzentration von hK6 in vor-chirurgischen und post-chirurgischen Serumproben von Patientinnen mit Eierstockkrebs zeigt.
  • 9 ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den Serumkonzentrationen von hK6 und CA125 zeigt.
  • 10 ist ein Graph, der die Empfindlichkeit und Spezifität der Serumkonzentrationen von hK6 zeigt.
  • 11A ist ein Diagramm, das die hK6-Konzentration gegenüber dem Stadium von Eierstockkrebs zeigt.
  • 11B ist ein Diagramm, das die hK6-Konzentration gegenüber dem Grad von Eierstockkrebs zeigt.
  • 12A ist ein Graph, der die Überlebenswahrscheinlichkeit gegenüber dem progressionsfreien Überleben (PFS) zeigt.
  • 12B ist ein Graph, der die Überlebenswahrscheinlichkeit gegenüber dem Gesamtüberleben (OS) zeigt.
  • 13(A) ist ein Diagramm, das die Häufigkeitsverteilung der hK6-spezifischen Aktivität in Extrakten von Eierstocktumor zeigt. Der Wert von 35 ng/mg an Gesamtprotein entspricht der Grenze, die gemäß Chi-Quadrat-Analyse die beste Vorhersage des Gesamtüberlebens der Studienpopulation gibt (siehe 13(B) für die Auftragung von Chi Quadrat). Tumore mit hK6, das 35 ng/mg Gesamtprotein überschreitet, wurden als hK6-positiv klassifiziert, und solche mit Werten unterhalb von oder gleich 35 ng/mg Gesamtprotein wurden als hK6-negativ klassifiziert. 30% der Tumore wurden gemäß dieses Kriteriums als positiv klassifiziert. (B) Auftragung der hK6-tumorspezifischen Aktivität gegenüber der Chi-Quadrat-Statistik zur Bestimmung der Grenze zwischen hK6-positiven und hK6-negativen Tumoren, die am vorhersagekräftigsten für das Gesamtüberleben ist. Das vorhersagekräftigste Potential befand sich zwischen 28 bis 40 ng an hK6-Gesamtextraktprotein mit einem Spitzenwert von 35 ng an hK6/mg an Gesamtextraktprotein.
  • 14 ist ein Diagramm, das einen Vergleich der hK6-Konzentration in Extrakten aus normalem Eierstockgewebe („normal") und Eierstockkrebs („Krebs") zeigt. N zeigt die Anzahl der Exemplare in jeder Gruppe an. Die horizontalen Balken stellen den Medianwert der für hK6 spezifischen Aktivität (ng hK6/mg Gesamtextraktprotein) in jeder Gruppe dar. Der Krustal Wallis-Test zeigte, dass die extrahierte, hK6-spezifische Aktivität in den Eierstock-Tumorpräparationen signifikant erhöht war (P < 0,001).
  • 15 ist ein Diagramm, das die Verteilung der hK6-spezifischen Aktivität (ng hK6/mg Gesamtprotein) in Tumorextrakten von Eierstockkrebspatientinnen der Stadien I/II und III/IV zeigt. N zeigt die Anzahl an Tumoren an, die jede Gruppe umfasst. Horizontale Balken stellen den Medienwert der hK6-tumorspezifischen Aktivität dar. Der Mann-Whitney-Test zeigte, dass hK6-spezifische Aktivität in Tumoren von Patientinnen mit Eierstockkrebs der Stadien III/IV signifikant erhöht war (P = 0,002).
  • 16 zeigt Kaplan-Meier-Überlebenskurven der gesamten Patientenpopulation in der Studie: Auswirkung des hK6-Status. Oben: Progressionsfreies Überleben (PFS). Unten: Gesamtüberleben (OS). Die Patientenzahl in jeder Gruppe (n) ist angegeben, ebenso wie die statistische Signifikanz (P-Wert) des Unterschieds im Überleben zwischen hK6-positiven und hK6-negativen Gruppen. Die nachteilige Auswirkung einer Positivität für hK6 sowohl auf die Zeit bis zum Voranschreiten als auch auf das Gesamtüberleben war signifikant.
  • 17 sind Graphen, die die Auswirkung des hK6-Status (positiv oder negativ) auf das progressionsfreie Überleben (PFS) und auf das Gesamtüberleben (OS) unter den Patientinnen mit Eierstockkrebs der Grade I und II zeigen. Die Patientenzahl in jeder Gruppe (n) ist angegeben, ebenso wie die statistische Signifikanz (P-Wert) des Unterschieds im Überleben zwischen hK6-positiven und hK6-negativen Individuen. Die nachteilige Auswirkung einer Positivität für hK6 sowohl auf die Zeit bis zum Voranschreiten als auch auf das Gesamtüberleben war signifikant (P ≤ 0,002).
  • 18 ist ein Blot, der die immunhistochemische Lokalisierung von hK6 in Eierstock-Neoplasien mit variierendem malignem Potential, variierendem Zelltyp und variierender Herkunft (epithelial versus mesenchymal) zeigt. (A) Invasives papilläres seröses Adenokarzinom, der gewöhnliche maligne Epitheltumor des Eierstocks. Zu beachten ist die starke zytoplasmatische Anfärbung vieler Tumorzellen, und die Abwesenheit jeglicher Färbung von Stroms oder Gefäßen. (B) Seröses Zystadenofibrom, eine benigne, gemischt epitheliale und fibröse Neoplasie. Eine Immunofärbung fehlt in der fibrösen Komponente, ist jedoch stark positiv im Zytoplasma der epithelialen Auskleidung der Zysten. (C) Eierstock-Leiomyom, ein benigner glatter Muskeltumor. Zu beachten ist die Abwesenheit von Färbung. (D) Muzinöser epithelialer Tumor von niedrigmalignem Potential, ein Epithel-Tumor von mittlerem Grad. Zu beachten ist eine schwache diffu se zytoplasmatische Färbung des neoplastischen Epithels und eine fehlende Färbung im stützenden Stroms (weit links).
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Wie hier zuvor erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Überwachung, Diagnose und Prognose von Eierstockkrebs in einem Subjekt bereit, indem hK6 in einer biologischen Probe von dem Subjekt detektiert wird. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Umsetzen der Probe mit einem Mittel, das an hK6 bindet, bevorzugt mit einem für hK6 spezifischen Antikörper, der direkt oder indirekt mit einer detektierbaren Substanz markiert ist, und das Detektieren der detektierbaren Substanz.
  • Die Verfahren der Erfindung können für die Detektion entweder einer Unter- oder Überkonzentration von hK6 im Vergleich zu einem nicht erkrankten Zustand oder im Hinblick auf die Gegenwart eines modifizierten (z.B. weniger als die volle Länge besitzenden) hK6 verwendet werden, die mit einem Erkrankungszustand (z.B. Eierstockkrebs) oder der Progression in Richtung eines Erkrankungszustands korreliert. Die hier beschriebenen Verfahren können verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit der Gegenwart maligner oder prämaligner Zellen zu bewerten, z.B. in einer Gruppe von Zellen, die frisch aus einem Wirt entfernt wurden. Solche Verfahren können verwendet werden, um Tumoren zu detektieren, ihr Wachstum zu quantifizieren und bei der Diagnose und Prognose von Erkrankungen zu helfen. Die Verfahren können verwendet werden, um die Anwesenheit von Krebsmetastasen zu detektieren, ebenso um die Abwesenheit oder Entfernung des gesamten Tumorgewebes nach der Chirurgie, Krebschemotherapie und/oder der Bestrahlungstherapie zu bestätigen. Sie können weiterhin verwendet werden, um die Krebschemotherapie und das erneute Auftreten eines Tumors zu überwachen.
  • Die Verfahren der Erfindung sind besonders nützlich bei der Diagnose von Eierstockkrebs im späten Stadium und für die Prognose der Progression und Mortalität der Eierstockkarzinomerkrankung. Wie hier dargestellt, sind erhöhte Mengen an hK6, die im Serum im Vergleich zu einem Standard detektiert werden, ein Anzeichnen für eine Erkrankung im späten Stadium, und erhöhte Mengen an hK6 in Tumorgeweben und in Extrakten davon im Vergleich zu einem Standard sind Indikatoren für ein erhöhtes Risiko der Krankheitsprogression und Mortalität.
  • Die Ausdrücke „Probe", „biologische Probe" und dergleichen bezeichnen ein Material, für das bekannt ist oder von dem vermutet wird, dass es hK6 exprimiert oder enthält. Die Testprobe kann direkt verwendet werden, wie sie aus der Quelle erhalten wurde, oder nach einer Vorbehandlung, um den Charakter der Probe zu modifizieren. Die Probe kann von einer beliebigen biologischen Quelle abgeleitet sein, wie etwa Geweben oder Extrakten, einschließlich Zellen (z.B. Tumorzellen) und physiologischen Flüssigkeiten, wie z.B. Vollblut, Plasma, Serum, Speichel, Augenlinsenflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit, Schweiß, Urin, Milch, Aszitesflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit und dergleichen. Die Probe kann von Tieren, bevorzugt Säugetieren, am bevorzugtesten von Menschen, erhalten werden. Die Probe kann vor der Verwendung behandelt werden, wie etwa bei der Herstellung von Plasma aus Blut, der Verdünnung viskoser Flüssigkeiten und dergleichen. Die Verfahren der Behandlung können Filtration, Destillation, Extraktion, Konzentration, die Inaktivierung störender Komponenten, die Hinzufügung von Reagenzien und dergleichen beinhalten. Die Proteine können aus den Proben isoliert und bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die biologische Probe Serum oder Tumorgewebeextrakt, am bevorzugtesten Serum.
  • Bei Ausführungsformen der Erfindung wird das hier beschriebene Verfahren für das Diagnostizieren und Überwachen, sowie für die Prognose von Eierstockkrebs durch das Detektieren von hK6 in biologischen Proben von einem Subjekt angepasst. Diese Anwendungen erfordern, dass die Menge an hK6, die in einer Probe von einem getesteten Subjekt detektiert wurde, mit Mengen verglichen wird, die für eine andere Probe oder für eine frühere Probe von dem Subjekt detektiert wurden, oder mit Mengen, die für eine Kontrollprobe detektiert wurden. Mengen für Kontrollproben von gesunden Subjekten oder Subjekten mit einer benignen Erkrankung können durch prospektive und/oder retrospektive statistische Studien etabliert werden. Gesunde Subjekte, die keine klinisch evidenten Erkrankungen oder Abnormitäten aufweisen, können für statistische Studien ausgewählt werden. Die Diagnose kann erfolgen, indem statistisch unterschiedliche Mengen an hK6 im Vergleich zu einer Kontrollprobe oder vorherigen Mengen, die für dasselbe Subjekt detektiert wurden, aufgefunden werden.
  • Der Begriff „hK6" bezieht sich auf humanes Kallikrein 6 (auch bekannt als Zyme, Protease M und Neurosin), eine Trypsin-artige Serinprotease von 244 Aminosäuren Länge, wovon 16 Aminosäuren das Signalpeptid und 5 Aminosäuren das Aktivierungspeptid darstellen (7, 8 und 9). Der Begriff beinhaltet alle Homologen, alle natürlich vorkommenden allelischen Varianten, Isoformen und Vorläufer von humanem Kallikrein 6 mit den Genbank-Zugangsummern AF013988, AF149289, HSU62801, D78203 und NM002774. Im allgemeinen z.B. werden natürlich vorkommende allelische Varianten von humanem Kallikrein 6 signifikante Homologie (70-90%) mit den Sequenzen zeigen, wie sie unter den GenBank-Zugangsnummern AF013988, AF149289, HSU62801, D78203 und NM002774 gezeigt sind. Allelische Varianten können konservative Aminosäuresubstitutionen der KLK6-Sequenz enthalten, oder sie werden eine Substitution einer Aminosäure von einer korrespondierenden Position in einem hK6-Homologen, wie z.B. dem murinen Kallikrein-6-Homologen, enthalten.
  • Der Begriff „Subjekt" bezieht sich auf ein warmblütiges Tier, wie etwa ein Säugetier, das von Eierstockkrebs befallen ist oder von dem vermutet wird, dass es befallen ist. Bevorzugt bezieht sich „Subjekt" hier auf einen Menschen.
  • Die für hK6 spezifischen Antikörper, die bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden, können aus wissenschaftlichen oder kommerziellen Quellen erhalten werden. Alternativ kann isoliertes natives hK6 oder rekombinantes hK6 verwendet werden, um Antikörper herzustellen, z.B. monoklonale oder polyklonale Antikörper, sowie immunologisch aktive Fragmente (z.B. ein Fab- oder (Fab)2-Fragment), eine schwere Antikörperkette, eine leichte Antikörperkette, humanisierte Antikörper, ein gentechnisch hergestelltes einzelkettiges Fv-Molekül (Ladner et al, U.S. Pat. Nr. 4,946,778 ) oder beispielsweise ein chimärer Antikörper, z.B. ein Antikörper der die Bindungsspezifität eines murinen Antikörpers enthält, bei dem jedoch die restlichen Teile menschlichen Ursprungs sind. Antikörper, einschließlich monoklonaler und polyklonaler Antikörper, Fragmente und chimärer Antikörper, können unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten bekannt sind. Bevorzugt sind die bei den Verfahren der Erfindung verwendeten Antikörper gegenüber hK6 reaktiv, wenn sie mit einer Ka von größer oder gleich 10–7 M binden. Bei einem Sandwich-Immunoassay der Erfindung werden polyklonale Mausantikörper und polyklonale Kaninchenantikörper verwendet.
  • Antikörper, die spezifisch mit hK6 reaktiv sind, oder Derivate, wie etwa Enzymkonjugate oder markierte Derivate, können verwendet werden, um hK6 in verschiedenen biologischen Proben zu detektieren; z.B. können sie in sämtlichen bekannten Immunoassays verwendet werden, die sich auf die Bindungsinteraktion zwischen einer antigenen Determinante eines Proteins und den Antikörpern stützen. Beispiele solcher Assays sind Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays (z.B. ELISA), Immunfluoreszenz, Immunpräzipitation, Latexagglutination, Hämagglutination und histochemische Tests.
  • Ein für hK6 spezifischer Antikörper kann mit einer detektierbaren Substanz markiert werden und auf Basis der Anwesenheit der detektierbaren Substanz in biologischen Proben lokalisiert und identifiziert werden. Beispiele detektierbarer Substanzen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, die folgenden: Radioisotope (z.B. 3H, 14C, 35S, 125I, 131I), fluoreszente Markierungen (z.B. FITC, Rhodamin, Lanthanoid-Leuchtstoffe), lumineszente Markierungen, wie etwa Luminol, enzymatische Markierungen (z.B. Meerrettich-Peroxidase, beta-Galactosidase, Luciferase, alkalische Phosphatase, Acetylcholinesterase), Biotinylgruppen (die durch markiertes Avidin detektiert werden können, z.B. Streptavidin, das einen fluoreszenten Marker oder eine enzymatische Aktivität enthält, die mittels optischer oder kalorimetrischer Verfahren detektiert werden kann), vorab bestimmte Polypeptidepitope, die durch einen sekundären Reporter erkannt werden (z.B. Leucin-Zipperpaar-Sequenzen, Bindungsstellen für sekundäre Antikörper, Metallbindungsdomänen, Epi top-Tags). Es können auch indirekte Verfahren verwendet werden, bei denen die primäre Antigen-Antikörper-Reaktion durch die Einführung eines zweiten Antikörpers amplifiziert wird, der Spezifität für den Antikörper besitzt, der gegenüber hK6 reaktiv ist. Wenn der Antikörper mit Spezifität gegenüber hK6 z.B. ein Kaninchen-IgG-Antikörper ist, so kann der sekundäre Antikörper ein Ziege-Anti-Kaninchen-Gammaglobulin sein, das mit einer detektierbaren Substanz, wie hier beschrieben, markiert ist.
  • Verfahren zum Konjugieren oder Markieren der oben diskutierten Antikörper können vom Durchschnittsfachmann leicht durchgeführt werden (siehe z.B. Inman, Methods In Enzymology, Band 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Teil B, Jakoby und Wichek (Herausgeber), Academic Press, New York, S. 30, 1974; und Wilchek und Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications", Anal. Biochem. 171: 1-32, 1988 Re Verfahren zum Konjugieren oder Markieren der Antikörper mit Enzym oder Ligandenbindungspartner).
  • Zeitaufgelöste Fluorometrie kann verwendet werden, um ein Signal zu detektieren. Beispielsweise kann das Verfahren, das in Christopoulos TK und Diamandis EP, Anal Chem 1992: 64:342-346 beschrieben ist, mit einem konventionellen zeitaufgelösten Fluorometer verwendet werden.
  • Daher wird gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, bei dem ein hK6-Antikörper mit einem Enzym markiert wird, ein Substrat für das Enzym zugegeben wird, wobei das Substrat so ausgewählt wird, dass das Substrat oder ein Reaktionsprodukt von Enzym und Substrat fluoreszente Komplexe mit einem Lanthanoidmetall ausbildet. Ein Lanthanoidmetall wird hinzugegeben, und das hK6 wird in der Probe quantifiziert, indem die Fluoreszenz der fluoreszenten Komplexe gemessen wird. Die für hK6 spezifischen Antikörper können direkt oder indirekt mit einem Enzym markiert sein. Die Auswahl der Enzyme erfolgt auf Basis der Fähigkeit eines Substrats des Enzyms oder eines Reaktionsprodukts von Enzym und Substrat, mit Lanthanoidmetallen, wie etwa Europium und Terbium, Komplexe zu bilden. Beispiele geeigneter Enzyme beinhalten alkalische Phosphatase und β-Galaktosidase. Bevorzugt ist das Enzym alkalische Phosphatase. Die hK6-Antikörper können auch indirekt mit einem Enzym markiert werden. Beispielsweise können die Antikörper mit einem Partner eines Ligandenbindungspaares konjugiert werden, und das Enzym kann an den anderen Partner des Ligandenbindungspaares gekoppelt werden. Repräsentative Beispiele beinhalten Avidin/Biotin und Riboflavin/Riboflavin-Bindeprotein. Bevorzugt sind die Antikörper biotinyliert, und das Enzym ist an Streptavidin gekoppelt.
  • Bei dem Verfahren wird Antikörper, der an hK6 in einer Probe gebunden wird, durch die Zugabe eines Substrats für das Enzym detektiert. Das Substrat wird so ausgewählt, dass in Ge genwart eines Lanthanoidmetalls (z.B. Europium, Terbium, Samarium und Dysprosium, bevorzugt Europium und Terbium) das Substrat oder ein Reaktionsprodukt von Enzym und Substrat einen fluoreszenten Komplex mit dem Lanthanoidmetall ausbilden wird. Beispielen von Enzymen und Substraten für Enzyme, die solche fluoreszenten Komplexe bereitstellen, sind im US-Patent Nr. 5,3112,922 von Diamandis beschrieben. Wenn der Antikörper beispielsweise direkt oder indirekt mit alkalischer Phosphatase markiert wird, so kann das bei dem Verfahren verwendete Substrat 4-Methylumbelliferylphosphat oder 5-Fluorsalicylphosphat sein. Die Fluoreszenzintensität der Komplexe wird typischerweise unter Verwendung eines zeitaufgelösten Fluorometers gemessen, z.B. eines CyberFluor 615 Immunoanalyzers (Nordion International, Kanata, Ontario).
  • Die Probe, ein für hK6 spezifischer Antikörper oder hK6 können immobilisiert werden. Beispiele für geeignete Träger sind Agarose, Cellulose, Dextran, Sephadex, Sepharose, Liposomen, Carboxymethylcellulose, Polystyrol, Filterpapier, Ionenaustauschharz, Kunststofffilm, Kunststoffröhrchen, Glaskügelchen, Polyamin-Methylvinylether-Maleinsäure-Copolymer, Aminosäure-Copolymer, Ethylen-Maleinsäure-Copolymer, Nylon, Seide usw. Der Träger kann z.B. in Form eines Röhrchens, einer Testplatte, eines Wells, in Form von Kügelchen (Beads), einer Scheibe, einer Kugel etc. vorliegen. Der immobilisierte Antikörper kann hergestellt werden durch Umsetzen des Materials mit einem geeigneten unlöslichen Träger unter Verwendung bekannter chemischer oder physikalischer Verfahren, z.B. mittels Cyanogen-Bromid-Kopplung.
  • In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Mittel zur Bestimmung von hK6 in einer Blutprobe oder einem Tumorgewebeextrakt bereit, bevorzugt in einer Serumprobe, durch Messen von hK6 mittels Immunoassay. Es wird einem Fachmann ersichtlich sein, dass eine Vielzahl von Immunoassay-Verfahren verwendet werden kann, um hK6 zu messen. Im Allgemeinen kann ein hK6-Immunoasssay-Verfahren kompetitiv oder nicht-kompetitiv sein. Kompetitive Verfahren nutzen typischerweise einen immobilisierten oder immobilisierbaren Antikörper gegen hK6 (Anti-hK6) und eine markierte Form von hK6. Das in der Probe befindliche hK6 und das markierte hK6 wetteifern um die Bindung an Anti-hK6. Nach der Abtrennung des resultierenden markierten hK6, das an Anti-hK6 gebunden wurde (gebundene Fraktion) von dem, was ungebunden geblieben ist (ungebundene Fraktion) wird die Menge der Markierung entweder in der gebundenen oder ungebundenen Fraktion gemessen und kann mit der Menge an hK6 in der Testprobe auf jede konventionelle Art korreliert werden, z.B. durch den Vergleich mit einer Standardkurve.
  • Bevorzugt wird ein nicht-kompetitives Verfahren für die Bestimmung von hK6 verwendet, wobei das gebräuchlichste Verfahren das „Sandwich-Verfahren" ist. Bei diesem Test werden zwei Anti-hK6-Antikörper verwendet. Einer der Anti-hK6-Antikörper wird direkt oder indirekt markiert (manchmal bezeichnet als der „Detektionsantikörper"), und der andere wird immobilisiert oder ist immobilisierbar (manchmal bezeichnet als der „Fangantikörper"). Die Fang- und Detektionsantikörper können gleichzeitig oder sequentiell mit der Testprobe in Kontakt gebracht werden. Sequentielle Verfahren können durchgeführt werden durch die Inkubation des Fangantikörpers mit der Probe, und das Zugeben des Detektionsantikörpers nach einer vorab festgelegten Zeitspanne danach (manchmal bezeichnet als das „Vorwärts-Verfahren"); oder der Detektionsantikörper kann zuerst mit der Probe inkubiert werden, wonach dann der Fangantikörper hinzugegeben wird (manchmal bezeichnet als das „reverse" Verfahren). Nachdem die notwendige(n) Inkubation(en) stattgefunden hat/haben, wird zur Fertigstellung des Assays der Fangantikörper von dem flüssigen Testgemisch abgetrennt, und die Markierung wird in wenigstens einem Teil der abgetrennten Phase des Fangantikörpers oder in dem restlichen flüssigen Testgemisch gemessen. Im allgemeinen wird in der Phase des Fangantikörpers gemessen, da diese hK6 umfasst, das durch den Fangantikörper und den Detektionsantikörper gebunden (bzw. „sandwichartig" zwischen diesen befindlich) ist.
  • Bei einem typischen zweiseitigen immunometrischen Assay für hK6 sind einer oder beide von Fangantikörper und Detektionsantikörper polyklonale Antikörper. Die bei dem Detektionsantikörper verwendete Markierung kann aus beliebigen ausgewählt werden, die konventionell in der Technik bekannt sind. Die Markierung kann ein Enzym oder eine chemilumineszente Gruppierung sein, sie kann jedoch auch ein radioaktives Isotop, ein Fluorophor, ein detektierbarer Ligand (z.B. detektierbar durch eine sekundäre Bindung durch einen markierten Bindungspartner für den Liganden) und dergleichen sein. Bevorzugt wird der Antikörper mit einem Enzym markiert, das durch die Zugabe eines Substrats detektiert wird, das so ausgewählt ist, dass ein Reaktionsprodukt von Enzym und Substrat fluoreszente Komplexe bildet. Der Fangantikörper wird so ausgewählt, dass er ein Mittel bereitstellt, um eine Abtrennung vom Rest des Testgemisches zu erlauben. Dem entsprechend kann der Fangantikörper in einer bereits immobilisierten oder unlöslichen Form in den Test eingeführt werden, oder er kann in einer immobilisierbaren Form vorliegen, d.h. einer Form, die die Immobilisierung nachfolgend nach der Einführung des Fangantikörpers in den Test ermöglicht. Ein immobilisierter Fangantikörper kann einen Antikörper umfassen, der kovalent oder nicht-kovalent an eine Festphase angeheftet ist, wie etwa an ein magnetisches Partikel, ein Latexpartikel, ein Mikrotiterplatten-Well, ein Kügelchen (Bead), eine Küvette oder ein anderes Reaktionsgefäß. Ein Beispiel für einen immobilisierbaren Fangantikörper ist ein Antikörper, der chemisch mit einer Ligandengruppierung modifiziert wurde, z.B. einem Hapten, Biotin oder dergleichen, und der nachfolgend durch den Kontakt mit einer immobilisierten Form eines Bindungspartners für den Liganden, z.B. einem Antikörper, Avidin oder dergleichen, immobilisiert werden kann. Bei einer Ausführungsform kann der Fangantikörper unter Verwendung eines Spezies-spezifischen Antikörpers für den Fangantikörper immobilisiert werden, wobei der Spezies-spezifische Antikörper an die Festphase gebunden ist.
  • Ein spezifisches Sandwich-Immunoassay-Verfahren der Erfindung nutzt zwei Antikörper, die gegenüber hK6 reaktiv sind, einen zweiten Antikörper mit Spezifität gegenüber einem Antikörper, der reaktiv gegenüber hK6 ist, das mit einer enzymatischen Markierung markiert ist, und ein fluorogenes Substrat für das Enzym. Bei einer Ausführungsform ist das Enzym alkalische Phosphatase (ALP), und das Substrat ist 5-Fluorsalicylphosphat. ALP schneidet Phosphat aus dem fluorogenen Substrat, 5-Fluorsalicylphosphat, aus, um 5-Fluorsalicylsäure (FSA) zu erzeugen. 5-Fluorsalicylsäure kann dann einen hochgradig fluoreszenten ternären Komplex der Form FSA-Tb(3+)-EDTA ausbilden, der durch Messen der Tb3 +-Fluoreszenz in einer zeitaufgelösten Weise quantifiziert werden kann. Die Fluoreszenzintensität wird unter Verwendung eines zeitaufgelösten Fluorometers, wie hier beschrieben, gemessen.
  • Die oben beschriebenen Immunoassay-Verfahren und -Formate sind als beispielhaft und nicht als einschränkend gedacht, zumal es im allgemeinen verständlich sein wird, dass jedes Immunoassay-Verfahren oder -Format bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
  • Die Verfahren der Erfindung können unter Verwendung eines diagnostischen Kits durchgeführt werden, um hK6 in einer Probe zu quantifizieren. Das Kit kann beispielsweise für hK6 spezifische Antikörper, Antikörper gegen die Antikörper mit einer Enzymmarkierung, und ein Substrat für das Enzym enthalten. Das Kit kann außerdem Mikrotiterplatten-Wells, Standards, Assay-Verdünnungsmittel, Waschpuffer, haftende Plattenabdeckungen und/oder Durchführungsanweisungen für ein Verfahren der Erfindung unter Verwendung des Kits enthalten.
  • Für hK6 spezifische Antikörper können auch bei Abbildungsmethodiken bei der Handhabung von Eierstockkrebs verwendet werden. Die Erfindung stellt ein Verfahren für die Abbildung von Tumoren bereit, die mit hK6 assoziiert sind, und optional mit einem oder mehreren anderen Kallikreinen, bevorzugt mit Kallikreinen, die mit Eierstockkrebs assoziiert sind, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, hK4, hK5, hK8, hK9, hK10 und hK11.
  • Die Erfindung fasst auch Kits für die Durchführung der Verfahren der Erfindung ins Auge. Die Kits beinhalten einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, der/das spezifisch an ein Epitop eines Kallikreins bindet und Mittel zum Detektieren der Bindung des Antikörpers an sein Epitop, das mit Tumorzellen assoziiert ist, entweder als Konzentrate (einschließlich lyophilisierter Zusammensetzungen), die vor der Verwendung bzw. auf die Verwendungskonzentration weiter verdünnt werden können, wobei die Gefäße eine oder mehrere Dosierungen beinhalten können. Dort, wo die Kits für die In vivo-Verwendung gedacht sind, können Einzeldosierungen in sterilisierten Behältern bereitgestellt werden, die die gewünschte Menge und Konzentration der Mittel aufweisen. Behälter, die eine Formulierung für die direkte Verwendung bereitstellen, erfordern im allgemeinen keine anderen Reagenzien, wie z.B. dort, wo das Kit eine radioaktiv markierte Antikörperpräparation für die In vivo-Abbildung enthält.
  • Die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung:
  • Beispiel 1
  • Immunfluorometrischer Assay von humanem Kallikrein 6 (Zyme/Protease M/Neurosin)-Materialien und Methoden
  • Diflunisal-Phosphat (DFP) wurde im Labor synthetisiert (Diflunisal, bezogen von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Die Stammlösung von DFP betrug 0,01 mol/l in 0,1 mol/l NaOH. Die DFP-Stammlösungen sind bei 4°C für wenigstens 6 Monate stabil. Mit alkalischer Phosphatase markierter Ziege-anti-Kaninchen-IgG (GARIg-ALP) und Schaf-anti-Maus-Immunoglobulin G (Fc-Fragment-spezifisch) wurden von Jackson Immunoresearch, West Grove, PA. erhalten.
  • Arbeitslösungen von GARIg-ALP wurden hergestellt, indem man die Stammlösung 3.000-fach in dem Assay-Puffer (unten beschrieben) verdünnte. Weiße, opake 12-Well-Polystyrol-Mikrotiterstreifen wurden von Dynatech Labs., Alexandria, VA erhalten. Der Substratpuffer war ein Tris-Puffer (0,1 mol/l, pH 9,1), enthaltend 0,1 Mol an NaCl und 1 mmol an MgCl2 pro Liter. Die Substrat-Arbeitslösung (DFP, 1 mmol/l in Substratpuffer) wurde unmittelbar vor der Verwendung hergestellt, indem man die DFP-Stammlösung 10-fach in dem Substratpuffer verdünnte. Die Waschlösung wurde hergestellt, indem man 9 g an NaCl und 0,5 g an Polyoxyethylensorbitan-Monolaurat (Tween 20) in 1 l eines 10 mmol/l-Tris-Puffers, pH 7,40 löste. Die Entwicklerlösung enthielt 1 Mol an Tris-Base, 0,4 Mol an NaOH, 2 mmol an TbCl3 und 3 mmol an EDTA pro Liter (keine pH-Einstellung). Der Assay-Puffer A war ein 50 mmol/l-Tris-Puffer, pH 7,40, enthaltend 60 g an BSA, 0,5 g an Natriumazid, 100 ml an Ziegennormalserum, 25 ml an Mausnormalserum, 5 g an Rinder-IgG und 0,5 g an Tween 20 pro Liter. Der Assay-Puffer B war gleich mit dem Assay-Puffer A, mit dem Unterschied, dass das Mausserum weggelassen wurde.
  • Klinische Proben
  • Es wurden verschiedene klinische Proben verwendet, um auf Anwesenheit von hK6 hin zu testen. Diese beinhalteten Serum- und Urinproben von männlichen und weiblichen Individuen (gesunde Blutspender), Brustzystenflüssigkeiten, erhalten durch Nadelaspiration, zytosolische Extrakte von Brusttumor, hergestellt wie zuvor beschrieben (11), Amnionflüssigkeiten, Milch stillender Frauen, Seminalplasmen, Nipple Aspirate Fluids (NAFs) und Cerebrospinalflüssigkeiten (CSFs). Zusätzlich wurde eine Palette humaner zytosolischer Gewebeextrakte, die gemäß vorheriger Beschreibung (Hassapoglidou, S. et al, Oncogene 1993, 8: 1501-1509) hergestellt wurden, getestet. Um optimale Messbedingungen zu etablieren, wurden alle Proben bei verschiedenen Verdünnungen getestet. Die Prozeduren stehen in Übereinstimmung mit den ethischen Standards der Helsinki-Erklärung von 1975, wie revidiert in 1983.
  • Alle Gewebe- und Flüssigproben wurden bis zur Verwendung bei –80°C gelagert.
  • Instrumente
  • Ein zeitaufgelöstes Fluorometer, der CyberFluor 615 Immunoanalyzer (MDS Nordion, Kanata, ON, Kanada) wurde verwendet, um die Tb3 +-Fluoreszenz in weißen Mikrotiter-Wells zu messen. Diese Prozedur ist detailliert an anderer Stelle beschrieben worden (Christopoulos, TK, et al Anal Chem 1992, 64: 342-346; Ferguson RA et al, Clin Chem 1996 42: 675-684).
  • Prozeduren
  • Produktion und Reinigung von rekombinantem hK6-Protein.
  • Humane 293-Zellen, die mit einem Plasmid transfiziert waren, das die 1,4 kb große hK6-cDNA enthielt, wurden der Selektion durch Wachstum in G418 (400 mg/l) für drei Wochen unterzogen, wonach stabile Transformanten isoliert wurden. Ein Klon erzeugte identifizierbare Mengen an hK6-Protein im Kulturmedium. Diese Zelllinie wurde kultiviert, und der Gewebekulturüberstand wurde unter Verwendung von Centricon Ultrafiltrationsvorrichtungen (Millipore, Waltham, MA 02454) gesammelt und konzentriert. Die Reinigung von hK6 aus den konzentrierten Zellkulturüberständen wurde durch Reversphasen-Hochdruckflüssigchromatographie (C-8, Aquapore RP-300, 0,45 × 25 cm, Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Verwendung eines linearen Gradienten aus 0,1% Trifluoressigsäure/Acetonitril erreicht. Allgemein stieg der Gradient mit einer Geschwindigkeitsrate von 1% Acetonitril pro min an. Fraktionen, die hK6 enthalten, wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese lokalisiert, gesammelt, lyophilisiert und bei –20°C gelagert (Little SP et al, J. Bil Chem 1997: 272: 25135-25142).
  • Entwicklung polyklonaler Antikörper gegen hK6.
  • Gereinigtes rekombinantes hK6-Protein wurde verwendet, um Kaninchen und Mäuse unter Verwendung von Standardprozeduren zu immunisieren (Campbell Am, Production and purification of antibodies. In: Immunoassay. Diamandis EP Christopoulos TK (Herausgeber) 00.95-115, Academic Press, San Diego, 1996). Die Kaninchen- und Maus-Antiseren wurden für die Entwicklung des immunfluorometrischen Assays ohne weitere Reinigung verwendet.
  • Beschichtung von Mikrotiterplatten mit Schaf-anti-Maus-Immunglobulin.
  • Weiße Polystyrol-Mikrotiter-Wells wurden beschichtet, indem man über Nacht 500 ng/100 μl pro Well des Beschichtungsantikörpers, der in 50 mmol/l Tris-Puffer, pH 7,80 verdünnt war, darin inkubierte. Die Wells wurden dann 6-mal mit der Waschlösung gewaschen und für 1 Stunde mit 200 μl/Well der Blockinglösung (10 g/l BSA in 50 mmol/l Tris, pH 7,80) geblockt. Nach weiteren sechs Waschschritten waren die Wells bereit zur Benutzung.
  • hK6-Kalibrierung.
  • Es wurden hK6-Kalibrierlösungen mit 0, 1, 5, 20, 50 und 200 μg/l hergestellt, indem man rekombinantes gereinigtes hK6-Protein in einem 50 mmol/l-Tris-Puffer, pH 7,80, enthaltend 60 g an BSA und 0,5 g an Natriumazid pro Liter, verdünnte.
  • hK6-Assay.
  • Kalibrierlösungen oder Proben (100 μl) wurden in die Mikrotiter-Wells pipettiert, und es wurden 50 μl des polyklonalen Maus-anti-hK6-Antiserums, 5.000-fach verdünnt in Assay-Puffer B, hinzugegeben. Die Wells wurden dann unter Schütteln bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert und sechsmal gewaschen. Zu jedem Well wurden 100 μl an Kaninchen-anti-hK6-Antikörper, 1000-fach verdünnt in Assay-Puffer A, hinzugegeben, und es wurde für 30 Minuten gemäß obiger Beschreibung inkubiert, wonach sechsmal gewaschen wurde. Zu jedem Well wurden 100 μl eines Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulins, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, 3000-fach verdünnt in Assay-Puffer A, hinzugegeben, und es wurde, wie oben beschrieben, für 30 min inkubiert. Die Wells wurden dann sechsmal gewaschen; es wurden 100 μl einer 1 mmol/l-DFP-Arbeits-Substratlösung hinzugegeben, und die Wells wurden für 10 min gemäß obiger Beschreibung inkubiert. Es wurden 100 μl Entwicklerlösung zu jedem Well hinzugegeben, die Wells wurden durch mechanisches Schütteln für 1 min durchmischt, und die Fluoreszenz wurde mit dem zeitaufgelösten Fluorometer gemessen. Die Kalibrierung und Datenreproduktion erfolgte automatisch durch den CyberFluor 615 Immunoanalyzer.
  • Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC).
  • Verschiedene biologische Flüssigkeiten wurden auf einer Gelfiltrationssäule unter Verwendung der an anderer Stelle beschriebenen Verfahren (Yu H, Diamandis EP, Clin Chem 1993: 39: 2108-2114; Diamandis, EP at al Clin Chem 1997: 43: 1365-1371)) aufgetrennt. Die HPLC- Fraktionen wurden gesammelt und mittels des entwickelten immunfluorometrischen Assays auf hK6 hin analysiert.
  • Ergebnisse
  • ASSAY-OPTIMIERUNG
  • Es wurden zwei polyklonale Antikörper gegen rekombinantes hK6-Protein verwendet, einer, der in Mäusen entwickelt wurde, und einer, der in Kaninchen entwickelt wurde. Die gewählte Assay-Anordnung (indirekte Beschichtung der Wells mit einem Schaf-anti-Maus-Antikörper und Detektion des Immunkomplexes mit einem Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin, das an alkalische Phosphatase konjugiert ist) zeigte eine gute Empfindlichkeit (siehe unten) ohne die Notwendigkeit irgendeiner Reinigung oder Konjugierung der primären Antikörper. Die Menge an verwendeten Antikörpern und die Verdünnungsmittel und Inkubationszeiten der verschiedenen Assay-Schritte wurden optimiert. Es wurden optimale Bedingungen auf Basis der niedrigsten erreichbaren Nachweisgrenze und der besten Linearität und des besten dynamischen Bereiches des Assays ausgewählt. Die endgültigen Bedingungen sind oben beschrieben.
  • EICHKURVE, NACHWEISGRENZE, PRÄZISION
  • Eine typische Eichkurve des vorgeschlagenen hK6-Assays ist in 1 dargestellt. Die Nachweisgrenze, definiert als Konzentration an hK6, die der Fluoreszenz der Null-Kalibrierlösung plus zwei Standardabweichungen entspricht, ist ≤ 0,5 μg/l. Die „Within-Run"- und „Between-Run"-Präzision wurde bei verschiedenen hK6-Konzentrationen zwischen 2-50 μg/l und mit verschiedenen klinischen Proben bestimmt. In allen Fällen lagen die Variationskoeffizienten (CVs) zwischen 2 und 9%, was konsistent mit der Genauigkeit typischer Mikrotiterplatten-basierter Immunoassays ist.
  • SPEZIFITÄT
  • Das hK6-Protein wurde in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten detektiert. Um sicherzustellen, dass der immunfluorometrische Assay hK6 mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität misst, wurden auf einer Gelfiltrationssäule drei biologische Flüssigkeiten mit relativ hoher hK6-Konzentration (und zwar eine menschliche Milch von einer stillenden Frau, eine Cerebrospinalflüssigkeit und eine Serumprobe von einer Eierstockkrebspatientin, für die ermittelt wurde, dass sie hohe Mengen dieses Biomarkers im Serum hat) aufgetrennt und auf einer Gelfiltrationssäule gemessen. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Bei allen drei getesteten biologischen Flüssigkeiten wurde eine einzelne immunoreaktive Spezies mit einer Molekülmasse von ~30 kDa detektiert, was konsistent mit der Molekülmasse des hK6-Proteins ist. Es wurden keine Komplexe mit höherem Molekulargewicht detektiert, was daraufhin deutet, dass hK6 in diesen biologischen Flüssigkeiten in seiner freien Form vorkommt. Andere Serumproteinasen (z.B. PSA) liegen im Serum und in anderen Flüssigkeiten meist gebunden an Proteinase-Inhibitoren vor (Stenman U-H, et al, Cancer Res. 1991: 51: 222-226); Christensson A et al Cur J Biochem 1990; 194; 755-763).
  • hK6 IN BIOLOGISCHEN FLÜSSIGKEITEN UND GEWEBEEXTRAKTEN
  • Um vorab Informationen über die Gegenwart von hK6 in biologischen Flüssigkeiten zu erhalten, wurden verschiedene klinische Proben analysiert, wie in Tabelle 1 gezeigt. Die höchste Konzentration von hK6 fand sich in der Milch stillender Frauen, gefolgt von Cerebrospinalflüssigkeit, Nipple Aspirate Fluid und Brustzystenflüssigkeit. hK6 wurde außerdem in männlichen und weiblichen Serumproben, in der Mehrzahl der Seminalplasmen und in einem relativ kleinen Prozentanteil bei den Amnionflüssigkeiten und zytosolischen Extrakten von Brusttumor detektiert. Das hK6-Protein wurde in Urin nicht detektiert.
  • Eine Reihe zytosolischer Extrakte von humanen Geweben wurde ebenfalls getestet. Die höchste Konzentration von hK6 wurde in den Speicheldrüsen detektiert, gefolgt von der Lunge, dem Colon, dem Eileiter, der Plazenta, der Brust, der Hypophyse und der Niere. Die folgenden Gewebe zeigten negative Testergebnisse: Haut, Milz, Knochen, Schilddrüse, Herz, Harnleiter, Leber, Muskel, Endometrium, Hoden, Pankreas, Samenbläschen, Eierstock, Nebennieren und Prostata (3).
  • Diskussion
  • Die vorliegenden Erfinder haben polyklonale Antikörper und ein immunfluorometrisches Verfahren entwickelt, das geeignet ist, um hK6-Protein in biologischen Flüssigkeiten und Gewebeextrakten zu quantifizieren. Da keine reiche natürliche Quelle von hK6-Protein bekannt ist, wurde rekombinantes hK6-Protein verwendet, um die polyklonalen Kaninchen- und Mausantikörper zu entwickeln. Dieses rekombinante Protein stellt eine hohe Reinheit ohne irgendwelche kontaminierenden Proteine sicher. Die gewählte Anordnung des Assays erfordert keinerlei weitere Reinigung oder Konjugation der verwendeten primären Antikörper, und es ist somit ein praktisches Verfahren für die Entwicklung empfindlicher immunfluorometrischer Verfahren. Das gleiche Prinzip ist zuvor adaptiert worden, um den Tumorsuppressor p53 in biologischen Flüssigkeiten zu messen (Hassapoglidou S et al, Oncogene 1993: 8: 1501-1509).
  • Der entwickelte Immunoassay für hK6-Protein zeigt eine gute Empfindlichkeit, einen dynami schen Bereich und Linearität (1). Es ist weiterhin verifiziert worden, dass dieser Assay eine einzige immunreaktive Bande in den untersuchten biologischen Flüssigkeiten detektiert. Im Serum liegt diese Proteinase in ihrer freien Form vor, ähnlich Beobachtungen mit hK2-Messungen (Black, MH et al Clin Chem 1999; 45: 790-799). Dies steht jedoch im Gegensatz zur Situation mit PSA, für das bekannt ist, dass es im Serum hauptsächlich an α1-Antichymotrypsin gebunden vorliegt (Stenman U-H, et al, Cancer Res. 1991: 51: 222-226); Christensson A et al Cur J Biochem 1990; 194; 755-763).
  • Die Überprüfung einer relativ großen Anzahl biologischer Flüssigkeiten hat angezeigt, dass hK6-Protein in relativ hohen Konzentrationen in der Milch stillender Frauen und in anderen Brustsekretionen, einschließlich Nipple Aspirate Fluid und Brustzystenflüssigkeit, vorkommt (Tabelle 1). Zuvor ist die Anwesenheit anderer Kallikreine, einschließlich PSA und hK2, in diesen biologischen Flüssigkeiten gezeigt worden (Yu, H Diamandis; Clin Chem 1995; 41: 54-58; Sauter ER et al Cancer Epidemiol Biomarkers Prevent 1996 967-970; Diamandis Ep et al Breast Cancer Res Treat 199638: 259-264; Balck MH et al Br J Cancer 2000; 82: 361-367; Blcak MH et al Clin Chem 1999; 45: 790-799; yu H. und Diamandis EP Clin Chem 1995: 41: 204-210; Black MH Diamandis EP, Breast Cancer Res Treat 2000 59: 1-14). Große Mengen an hK6-Protein wurden in der Cerebrospinalflüssigkeit detektiert, was konsistent mit der Beobachtung ist, dass hK6 in hohen Mengen im Gehirngewebe exprimiert wird (Little, oben). hK6 wurde auch in männlichen und weiblichen Seren und in Seminalplasmen und in einem kleinen Prozentanteil bei den Amnionflüssigkeiten und Brusttumorzytosolen gefunden. Zuvor sind PSA und hK2 ebenfalls in diesen biologischen Flüssigkeiten nachgewiesen worden (Yu, H Diamandis; Clin Chem 1995: 41: 54-58; Sauter ER et al Cancer Epidemiol Biomarkers Prevent 1996 967-970; Diamandis Ep et al Breast Cancer Res Treat 199638: 259-264; Balck MH et al Br J Cancer 2000; 82: 361-367; Blcak MH et al Clin Chem 1999; 45: 790-799; yu H. und Diamandis EP Clin Chem 1995: 41: 204-210; Black MH Diamandis EP, Breast Cancer Res Treat 2000 59: 1-14). Es ist interessant festzustellen, dass, obwohl Seminalplasma extrem hohe Mengen an PSA und hK2 enthält (Diamandis EP Trends Endocrinol Metab 1999: 25: 14-26' Rittenhouse He et al Crit Rev Clin Lab Sci 1998: 35: 275-368), der hier beschriebene Assay nur sehr kleine Mengen an hK6 in dieser biologischen Flüssigkeit detektierte (Tabelle 1). Dies zeigt weiterhin, dass die homologen Proteine PSA und hK2 keine wesentliche Kreuzreaktivität mit dem entwickelten hK6-Assay zeigen.
  • Der hier entwickelte Assay repräsentiert das erste Verfahren zum Detektieren von hK6-Protein in biologischen Flüssigkeiten. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass hK6 ein sekretiertes Protein ist, wie anhand seiner abgeleiteten Aminosäuresequenz vorhergesagt wurde (Yousek GM et al Genomics 1999; 62: 251-259).
  • Beispiel 2
  • Materialien und Methoden
  • Immunfluorometrischer Assay für hK6
  • Die Details dieses immunfluorometrischen Assays sind beschrieben worden (siehe Beispiel 1 und Ref. 12). Der Assay verwendet zwei hK6-spezifische polyklonale Antikörper, einen, der in einer Maus erzeugt wurde, und einen weiteren, der in einem Kaninchen erzeugt wurde. Dies ist ein nicht-kompetitives immunfluorometrisches Verfahren, das die Prinzipien der zeitaufgelösten Fluorometrie für die Detektion einbezieht. Der Assay misst hK6 im Bereich von 0,5-200 μg/l mit einer Präzision von < 10%. Die Serumproben wurden ohne Proben-Vorbehandlung analysiert.
  • Klinische Proben
  • Für diese Untersuchung wurden übrig gebliebene Serumproben, die von Patienten mit verschiedenen malignen Erkrankungen erhalten wurden, verwendet (Tabelle 2). Es wurden Patienten mit einer relativ hohen Tumorlast einbezogen (wie angezeigt dadurch, dass die Mengenniveaus an Tumormarker wenigstens 10-fach höher waren als die Obergrenze des Normalwerts), um die Chance zu steigern, mögliche hK6-Erhöhungen im Serum zu detektieren. Alle Serumproben wurden bis zur Analyse für eine Zeitspanne von maximal einem Jahr bei –20°C gelagert. Die Verfahren stehen in Übereinstimmung mit den ethischen Standards der Helsinki-Erklärung von 1975, wie revidiert in 1983.
  • Analyse von Tumormarkern
  • Die Tumormarker CA125, PSA, CEA und AFP wurden auf dem Elecsys Immunoassay Analyzer (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) analysiert. CA15.3, CA19.9 und hCG wurden auf dem Immuno 1-Immunoassay-Analyzer (Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY) analysiert, und Calcitonin wurde mit einem Radioimmunoassay-Kit von Diasorin, Italien, gemessen. Die Obergrenze der Normalwerte für die Tumormarker betrug 35 KU/l, (CA125), 4 μg/l (PSA), 10 μg/l (AFP), 5 μg/l (CEA), 35 KU/l (CA15.3), 37 KU/l (CA19.9), 10 IU/l (hCG) und 100 ng/l (Calcitonin).
  • Ergebnisse
  • Eine Gesamtheit von 378 Serumproben wurde mit dem zuvor beschriebenen immunfluorometrischen Assay für hK6 (12) analysiert. Diese Proben stammten entweder von normalen Individuen (männlich und weiblich) oder von Patienten mit verschiedenen malignen Erkrankungen. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 2 gezeigt. Während bei keiner der normalen Kontrollen und nur bei zwei Proben von Patienten mit malignen Erkranken an anderer Stelle als den Eierstöcken die hK6-Konzentration oberhalb von 15 μg/l (willkürlicher Ausschlusswert) lag, besaß die Mehrzahl der Patientinnen mit Eierstockkarzinom (~66%) hochgradig erhöhte hK6-Konzentrationen in ihrem Serum (> 15 μg/l). Die Verteilung der hK6-Werte im Serum von Eierstockkrebs-Patientinnen ist in 4 gezeigt. Wie in 5 gezeigt, ist die Korrelation zwischen den hK6-Konzentrationen und den CA125-Mengen gering und nicht statistisch signifikant.
  • In 6 sind Daten über zeitliche Veränderungen serieller Serumkonzentrationen von hK6 und CA125 bei vier Patientinnen mit Eierstockkrebs dargestellt. Die hK6-Konzentration verändert sich während der Überwachungszeitspanne, ähnlich CA125, was nahelegt, dass dieser neue Biomarker wertvoll für die Patientenbehandlung bzw. -Überwachung sein kann.
  • Diskussion
  • Die Daten aus Tabelle 2 fassen die Erkenntnisse zusammen und zeigen, dass unter allen getesteten Krebstypen (normale Männer und Frauen gegenüber Brust-, Schilddrüsen-, Hoden-, Magendarm-, Prostata-, Lungen- und Eierstockkrebs) nur Eierstockkrebspatientinnen signifikant erhöhte Mengen dieses Biomarkers im Blutkreislauf zeigen. Etwa 66% der Patientinnen besaßen höhere Mengen als 15 μg/l, ein Ausschlusswert, der eine Spezifität von 98-100% für alle anderen getesteten Krebsarten erbringt. Obwohl diese Daten hochgradig viel versprechend sind, wenn man den Wert von hK6 als zirkulierenden Biomarker für Eierstockkrebs betrachtet, so sollte berücksichtigt werden, dass alle Patientinnen mit Eierstockkrebs relativ hohe Mengenniveaus an CA125 zeigten (≥ 372 KU/l, was etwa 10-fach höher ist als der obere Referenzbereich). Die Daten aus 6 zeigen an, dass die Serumspiegel von hK6 während der Überwachung von Eierstockkrebs sich mit der Zeit verändern, was darauf hindeutet, dass dieser Biomarker nützlich für die Patientenüberwachung nach der primären Behandlung sein kann.
  • Wie aus 5 ersichtlich ist, gibt es keine signifikante Korrelation zwischen der hK6-Konzentration und CA125, was darauf hindeutet, dass diese zwei Biomarker für die Diagnose und die Handhabung von Eierstockkrebs sich komplementär verhalten könnten.
  • Im Ergebnis wird als erste Erkenntnis bereitgestellt, dass die Serumkonzentration von hK6 bei etwa 66% der Eierstockkrebspatientinnen signifikant erhöht ist. Der Test scheint für Eierstockkrebs spezifisch zu sein, da keine anderen derartigen Anstiege bei verschiedenen anderen malignen Erkrankungen zu sehen waren. Daher stellt hK6 einen neuen Serum-Biomarker für Eierstockkrebs bereit, der nützlich für die Diagnose und Überwachung der Erkrankung sein kann.
  • Beispiel 3
  • Materialien und Methoden
  • Patientenpopulation
  • Es wurden in diese Studie 97 offenbar gesunde Frauen (im Alter von 26 bis 72 Jahren; Mittelwert = 52 Jahre, Medianwert = 49 Jahre), 141 Frauen mit benigner Erkrankung (im Alter von 21 bis 76 Jahren; Mittelwert = 46 Jahre, Medianwert = 45 Jahre) und 146 Patientinnen mit histologisch nachgewiesenem primärem Eierstockkrebs (im Alter von 28 bis 78 Jahren; Mittelwert = 56 Jahre, Medianwert = 57 Jahre) einbezogen. Von den gutartigen Läsionen wurden 50 als Endometriose klassifiziert, 22 als Mucinosum, 10 als Eierstock-Teratome, 26 als Dermoid, 15 als Corpus luteum und 18 als Serosum. Die Einteilung der Tumoren nach Stadium erfolgte gemäß den Kriterien der International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO). Die histologische Klassifizierung erfolgte auf Basis der Empfehlungen der World Health Organization und der FIGO. Die Merkmale der Eierstockkrebs-Patientinnen in Begriffen von Stadium, Grad, Histotyp, restlichem Tumor nach der Chirurgie, Erfolg beim Abbau der Hauptmasse und der Antwort auf die Chemotherapie sind in Tabelle 7 dargestellt. Es wurden von allen Patientinnen vor der Chirurgie, vor Einleitung der Therapie, Serumproben genommen und bis zur Analyse auf –80°C gelagert. Für 105 Eierstockkrebspatientinnen war Serum auch nach der Chirurgie verfügbar. Diese Probe wurde etwa 2-3 Wochen nach der Chirurgie erhalten.
  • Die Seren wurden wie folgt von vier Zentren erhalten: von der gynäkologischen Onkologieeinheit der Universität Turin, Italien (97 normale Fälle, 14 benigne Fälle, 21 Krebsfälle); aus Holland (40 Krebsfälle); Belgien (13 benigne Fälle, 85 Krebsfälle); dem Fachbereich für klinische Chemie, Zentralkrankenhaus der Universität von Helsinki, Finnland (114 benigne Fälle).
  • Die Patientinnen wurden für eine mediane Dauer von 25 Monaten (Bereich von 1-106 Monaten) hinsichtlich Überleben und Voranschreiten der Krankheit überwacht. Folgeinformationen waren für 131 der Eierstockkrebspatientinnen verfügbar. 64 von diesen (49%) erlitten Rückfälle, und 28 (21%) starben im Verlauf der Weiterverfolgungszeitspanne.
  • Analyse von hK6 und CA125
  • CA125 wurde mittels eines kommerziell erhältlichen automatisierten Immunoassay-Verfahrens gemessen (Immulite 2000, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA). Die Obergrenze des Normalwerts für dieses Verfahren beträgt 23 KU/l. Die Konzentration von hK6 wurde mittels einer hier beschrieben Prozedur (12) mit gewissen Modifikationen gemessen. Dieser Assay verwendet einen monoklonalen Anti-hK6-Mausantikörper, der direkt auf Mikrotiter-Wells aufgeschichtet ist (Fangantikörper), einen polyklonalen Kaninchen-Detektionsantikörper und einen mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper. Das Signal wurde durch zeitaufgelöste Fluorometrie quantifiziert. Der Assay besitzt eine Nachweisgrenze von 0,1 μg/l und einen dynamischen Bereich von bis zu 50 μg/l. Die Genauigkeit betrug <10% im Messbereich. Die Serumproben wurden im Doppel analysiert, unter Einbeziehung von drei Qualitätskontrollproben bei jedem Durchlauf.
  • Statistische Analyse
  • Um die Daten zu analysieren, wurden die Patienten gemäß klinischer und pathologischer Parameter in verschiedene Gruppen eingeteilt. Die Analysen der Unterschiede zwischen der hK6-Serumkonzentration vor und nach der Chirurgie wurden mittels des nicht-parametrischen McNemar-Tests durchgeführt. Die binomiale Verteilung wurde verwendet, um das Signifikanzniveau des McNemar-Tests zu berechnen.
  • Es wurden Kurven der Receiver Operating Characteristics (ROC) für die Serumkonzentration von hK6 und CA125 konstruiert, indem man die Empfindlichkeit gegenüber der (1-Spezifität) auftrug, und die Flächen unter den ROC-Kurven (AUC) wurden berechnet. Die Nicht-Krebsgruppe beinhaltete die normalen Individuen und die Patienten mit benigner Erkrankung. Die Korrelationen zwischen den verschiedenen Variablen wurden mittels des Spearman-Korrelationskoeffizienten bestimmt. Es wurde der nicht-parametrische Mann-Whitney-U-Test verwendet, um Unterschiede zwischen zwei Gruppen zu bestimmen, und der nicht-parametrische Kruskal-Wallis-Test wurde für die Analyse von Unterschieden zwischen mehr als zwei Gruppen verwendet. Diese Tests behandelten die hK6-Konzentration im Serum wie eine kontinuierliche Variable. Die hK6-Serum-Konzentration wurde außerdem als entweder hK6-positiv (> 4,4 μg/l) oder hK6-negativ (≤ 4,4 μg/l) klassifiziert. Die Beziehung dieser dichotomen Variablen zu anderen klinisch-pathologischen Korrelationen wurde, so wie es passend war, mittels des Chi-Quadrat(x2)-Tests oder des exakten Fischer-Tests etabliert.
  • Es wurden Kurven des progressionsfreien Überlebens und des Gesamtüberlebens nach Kaplan-Meier konstruiert, um die Unterschiede im Überleben zwischen den hK6-positiven und hK6-negativen Patienten zu demonstrieren. Es wurde der „Log Rank-Test" verwendet, um die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Überlebenskurven zu untersuchen. Die Auswirkung der Serum-hK6-Konzentration auf das Gesamtüberleben des Patienten („Overall Survival", OS) und auf die Progression der Erkrankung (progressionsfreies Überleben; PFS) wurden mittels des Hazardquotienten bewertet, berechnet sowohl durch proportionale Cox-Hazard-Regressionsmodelle mit einer als auch mit mehreren Variablen (univariat bzw. multivariat). Bei der multivariaten Analyse wurden die klinischen und pathologischen Variablen, die das Überleben beeinflussen können, einschließlich des Stadiums der Erkrankung, des Tumorgrads, des restlichen Tumors und des histologischen Typs, angepasst.
  • Ergebnisse
  • Serum-hK6-Konzentration bei Krebspatienten und Nicht-Krebspatienten:
  • Der arithmetische Mittelwert, der Medianwert, der Größenbereich und ausgewählte Perzentile der Serum-hK6-Konzentration zwischen Nicht-Krebs-Patienten (normal; n = 97), Patienten mit gutartiger Erkrankung (n = 141) und Eierstockkrebs-Patientinnen vor der Chirurgie (n = 146) und nach der Chirurgie (n = 105) sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Mittelwerte und Medianwerte zwischen Nicht-Krebs-Patienten (normal) und Patienten mit benigner Erkrankung waren statistisch nicht signifikant. Die Mittelwerte und Medianwerte für hK6 bei Eierstockkrebs-Patientinnen vor der Chirurgie waren signifikant höher als bei der Nichtkrebs-Gruppe und in der benignen Gruppe (p < 0,001). Die Verteilung der hK6-Konzentration bei den drei Patientengruppen (normal, gutartig, Eierstockkrebs vor der Chirurgie) wird weiterhin in 7 zusammen mit den zugehörigen CA125-Werten präsentiert. Offenkundiger Weise unterscheiden sich die vor-chirurgischen Serumkonzentrationen von hK6 nicht zwischen normalen Individuen und Patienten mit gutartiger Erkrankung, sind jedoch bei einem Teil der Eierstockkrebspatientinnen signifikant erhöht (7A). Demgegenüber steigen die CA125-Werte von normal hin zu gutartig hin zu Krebspatienten progressiv an (7B).
  • Für die dichotome Klassifizierung dieser Patientenpopulation als hK6-positiv und hK6-negativ wurden hK6-Ausschlusswerte von 4,2 μg/l (90% diagnostische Spezifität) und 4,4 μg/l (95% diagnostische Spezifität) ausgewählt.
  • Veränderungen der Serumkonzentration von hK6 nach der Chirurgie
  • Für 105 Patientinnen mit Eierstockkrebs wurden vor-chirurgische und nach-chirurgische Serumproben ausgewählt. Wie in 8 dargestellt, zeigten 71 Patienten (68%) einen Abfall der hK6-Konzentration nach der Chirurgie, 21 (20%) besaßen unveränderte Werte, und 13 (12%) hatten nach der Operation höhere hK6-Serumwerte. Gemäß des McNemar-Tests war der Konzentrationsabfall nach der Chirurgie statistisch hochsignifikant (p < 0,001).
  • Korrelation zwischen der Serumkonzentration von hK6 und CA125:
  • Die logarithmische Auftragung von 9 zeigt, dass es eine schwache Korrelation zwischen der Serumkonzentration von hK6 und CA125 gibt (Spearman-Korrelation rs = 0,44). Obwohl die Korrelation signifikant ist, gibt es nach wie vor viele Proben mit recht variablen Werten. Beispielsweise bewegt sich die hK6-Konzentration bei CA125-Mengen um 500 KU/l im Bereich von 2-40 μg/l, wogegen Proben mit hK6-Werten um 6 μg/l CA125-Werte im Bereich von 5 bis >5.000 KU/l aufweisen können.
  • Diagnostische Empfindlichkeit und Spezifität der Serum-hK6-Konzentration:
  • Für diese Berechnung wurden die verschiedenen Untergruppen von Patienten berücksichtigt, wie in Tabelle 4 dargestellt. In die Nicht-Krebs-Gruppe wurden alle Patienten einbezogen, die entweder einen normalen Befund oder eine benigne Erkrankung hatten. Wenn die gesamte Patientengruppe analysiert wurde, so betrug die diagnostische Empfindlichkeit etwa 54% bei 90% Spezifität und etwa 50% bei 95% Spezifität. Die Kurve der Receiver Operating Characteristics (ROC) aus 10 zeigt einen geringfügigen diagnostischen Vorteil von CA125 im Vergleich zu hK6. Jedoch können die beiden Marker in Kombination arbeiten, da die hK6-Konzentration in einer Untergruppe von Patienten mit relativ niedrigem CA125 erhöht sein kann. Bei der Untergruppe von Patienten mit CA125 > 60 KU/l betragen die Werte der diagnostischen Empfindlichkeit von hK6 71% und 65% bei Spezifitäten von 90% bzw. 95%. Bei der Untergruppe von Patienten mit geringem CA125 (< 23 KU/l) werden etwa 13-17% der Patienten nach wie vor einen erhöhten hK6-Wert besitzen, bei hK6-Ausschlusswerten von 4,4 μg/l (95% Spezifität) bzw. 4,3 μg/l (90% Spezifität). In der Untergruppe von Patienten mit leicht erhöhtem CA125 (23-60 KU/l) betrug die diagnostische Empfindlichkeit von hK6 15-26% bei Spezifitäten von 95-90% (Tabelle 4).
  • In Tabelle 5 wurde der zusätzliche Beitrag von hK6 bei der Identifizierung von Eierstockkrebspatientinnen entweder unter Verwendung von CA125 alleine oder unter Verwendung von CA125 plus hK6 berechnet. Unter allen Patienten mit bekanntem Stadium (N = 124) erhöht die Analyse von hK6 die Empfindlichkeit von CA125 um 12% oder 13% bei Spezifitäts-Ausschlusswerten von 90% bzw. 95% für beide Marker. Dieser Beitrag ist bei Eierstockkrebs der Stadien I/II (43 Patientinnen) nach wie vor signifikant. Die Hinzunahme von hK6 erhöht die Empfindlichkeit von CA125 alleine von 30% auf 42% oder von 26% auf 37%, wenn der Spezifitäts-Ausschlusswert für beide Marker 90% bzw. 95% beträgt.
  • Tabelle 6 fasst das relative Risiko (RR), Eierstockkrebs zu haben, auf Basis der Serum-hK6-Konzentration zusammen. Das relative Risiko steigt mit zunehmender hK6-Konzentration exponentiell an und erreicht einen Wert von 20, wenn hK6 ≥ 4,3 μg/l ist. Das RR ist auch bei der multivariaten Analyse nach wie vor beträchtlich (RR = 5,3), nachdem im Hinblick auf die CA125-Spiegel angepasst wurde.
  • Prognostischer Wert von Serum-hK6:
  • Ein höheres Stadium und ein höherer Grad von Eierstockkrebs sind stark mit einer höheren Serum-hK6-Konzentration assoziiert (11 und Tabelle 7). Weiterhin sind seröse Adenokarzinome häufiger mit einer hohen Serum-hK6-Konzentration assoziiert (Positivität 68%), gefolgt von endometrioiden Tumoren (Positivität 33%); muzinöse Tumoren sind selten mit hohem Serum-hK6 assoziiert (9%). Weiterhin ist eine hohe Serum-hK6-Konzentration mit der Gegenwart von restlichem Tumor, einem suboptimalen Massenabbau und einer geringen Antwort auf die Chemotherapie assoziiert. Alle diese Assoziationen waren hochgradig signifikant (p < 0,001).
  • Bei der univariaten Cox-Analyse ist die Serum-hK6-Konzentration mit einem kürzeren progressionsfreien Überleben und Gesamtüberleben assoziiert (Tabelle 8). Diese Assoziationen blieben bei der multivariaten Analyse statistisch signifikant. Der prognostische Wert von CA125 war bei der multivariaten Analyse statistisch nicht länger signifikant. Neben dem vor-chirurgischen Serum-hK6 war das Stadium der Erkrankung der einzige andere Parameter, der bei der multivariaten Analyse sowohl mit dem progressionsfreien Überleben als auch mit dem Gesamtüberleben assoziiert war (Tabelle 6).
  • Ähnliche Daten wurden mit der Kaplan-Meier-Überlebens-Analyse erhalten (12). Patienten mit einem hohen vor-chirurgischen Serum-hK6-Wert zeigen ein viel kürzeres progressionsfreies Überleben und Gesamtüberleben als Patienten mit niedrigen vor-operativen hK6-Spiegeln. Während im wesentlichen alle Patienten mit hohem Serum-hK6 nach 6 Jahren Rückfälle gezeigt hatten, befanden sich über 50% der Patienten mit niedrigem vor-operativem Serum-hK6 nach wie vor in der Rückbildungsphase.
  • Diskussion
  • Die Entdeckung von neuen Eierstockkrebs-Biomarkern für die frühe Diagnose, Prognose, Überwachung und die Vorhersage der therapeutischen Antwort wird wahrscheinlich zu verbesserten klinischen Ausgängen beitragen. Der einzige gut akzeptierte Biomarker für Eierstockkrebs, CA125, wurde vor 20 Jahren entdeckt. Es ist eine Anzahl anderer potentieller Biomarker für Eierstockkrebs identifiziert worden, aber ihr klinischer Wert wurde nicht festgestellt (27). Ein neuer Biomarker für Eierstockkrebs, humanes Kallikrein 6 (hK6), ein Mitglied der erweiterten Familie der humanen Kallikreingene, ist hier beschrieben.
  • Der traditionelle Biomarker für Eierstockkrebs, CA125, ist nur mangelhaft dazu in der Lage, frühen Eierstockkrebs zu diagnostizieren. Zusätzlich zu seiner geringen Empfindlichkeit im Hinblick auf die frühe Erkrankung leidet CA125 auch an einer geringen Spezifität, d.h. erhöhte Spiegel sind bei vielen benignen abdominalen Erkrankungen zu beobachten. Derzeit ist es in breitem Maße akzeptiert, dass kein einzelner Krebsbiomarker alle notwendigen Informationen für eine optimale Diagnose und Handhabung von Krebs liefern wird. Der derzeitige Trend besteht darin, sich auf die Identifizierung mehrerer Biomarker zu fokussieren, die in Kombination verwendet werden können. Für solche Ansätze ist bereits gezeigt worden, dass sie klinisches Potential bei Eierstockkrebs besitzen (28, 29).
  • Serum-hK6 stellt einen neuen Biomarker für Eierstockkrebs dar. Dieser Biomarker ist spezifischer für Eierstockkrebs als CA125, da anders als bei CA125 kein Anstieg bei benignen Erkrankungen beobachtet wurde (7). Bei gleichen Ausschlusswerten der Spezifität ist die diagnostische Empfindlichkeit von hK6 geringfügig kleiner als die diagnostische Empfindlichkeit von CA125 (Tabelle 5 und 10). Jedoch kann hK6 die diagnostische Empfindlichkeit von CA125 bei allen Stadien der Erkrankung erhöhen, einschließlich des Stadiums I/II der Erkrankung (Tabelle 5). Trotz der schwachen Korrelation zwischen hK6 und CA125 (9) gibt es nach wie vor Patienten mit normalem CA125, die erhöhte hK6-Spiegel aufweisen (Tabelle 4). Somit können CA125 und hK6 in Kombination verwendet werden, um die diagnostische Empfindlichkeit jedes der Biomarker alleine zu steigern.
  • Ähnlich der Situation bei CA125 ist die hK6-Konzentration häufiger bei serösem Eierstockkrebs erhöht als bei endometrioiden und muzinösen Karzinomen (Tabelle 7). Die Serum-hK6-Konzentration ist ebenfalls im späten Stadium und bei höherem Grad der Erkrankung häufiger erhöht. Die Serumkonzentration von hK6 ist ein wirkungsstarkes Vorhersagewerkzeug für das Patientenschicksal. Patienten mit einer vor-operativen hK6-Konzentration oberhalb von 4,4 μg/l haben eine signifikant schlechtere Prognose als Patienten mit niedrigem vor-operativem hK6 (Tabelle 8 und 12). Die Serumkonzentration von hK6 ist ein wirkungsstärkerer prognostischer Indikator als der Serumwert von CA125. Der prognostische Wert von CA125 verschwindet bei einer multivariaten Analyse, während der Serumwert von hK6 ein unabhängiger prognostischer Indikator ist, wie in der multivariaten Analyse aus Tabelle 8 gezeigt. Das Serum-hK6 hat seinen Ursprung vermutlich in Tumorzellen, da die Spiegel nach der Operation signifikant abfallen (8). In der Studie aus Beispiel 4, der Untersuchung des prognostischen Werts der hK6-Analyse in Extrakten von Eierstocktumoren, wurde die Überexpression von hK6 in Tumorzellen durch Immunhistochemie verifiziert und lieferte weitere Belege dafür, dass die hK6-Konzentration im Tumor ebenfalls ein starkes Vorhersagewerkzeug für die Prognose darstellt. Interessanter Weise haben viele andere Mitglieder der humanen Kallikrein-Genfamilie, einschließlich der Enzyme hK4, hK5, hK7, hK8, hK9 und hK10, bereits gezeigt, dass sie prognostische Signifikanz bei Eierstockkrebs besitzen (34-41). Für Serinproteasen, die nicht zur Kallikrein-Familie gehören, ist ebenfalls gezeigt worden, dass sie prognostische Signifikanz bei Eierstockkrebs besitzen, einschließlich Trypsin, Hepsin und Testisin (42-44). Dabei ist sogar schon seit Jahren bekannt gewesen, dass viele andere proteolytische Enzyme prognostischen Wert bei vielen Krebsarten besitzen (für Übersichtsartikel siehe 45 und 46). Die Einbeziehung der biologischen Mechanismen proteolytischer Enzyme in die Prognose von Krebs beinhaltet deren Befähigung, extrazelluläre Matrix abzubauen, was somit die Einwanderung und Metastasierung erleichtert (47-49). Es erscheint wahrscheinlich, dass mehrere Mitglieder der humanen Kallikrein-Genfamilie in Eierstockkrebs fehlreguliert sind. Es ist somit möglich, dass weitere Mitglieder dieser Proteasefamilie als potentielle Biomarker für Eierstockkrebs in Erscheinung treten könnten. Wenn diese Proteasen am Fortschreiten der Krebserkrankung beteiligt sind, könnten sie geeignete Kandidaten für therapeutische Ziele sein.
  • Tabelle 7 zeigt einleitend, dass die vor-chirurgische Serumkonzentration von hK6 ein Vorhersagewerkzeug für die Antwort auf die Chemotherapie bei Eierstockkrebspatientinnen sein kann. Unter denen, die keine Antwort zeigen, besaßen 81% eine erhöhte vor-chirurgische hK6-Konzentration, während 19% dieser Patienten eine niedrige hK6-Konzentration aufwiesen. Unter den Patienten, die entweder eine vollständige oder teilweise Antwort auf die Chemotherapie zeigten, besaßen 57% eine niedrige vor-operative hK6-Konzentration (p < 0,001).
  • Als Fazit repräsentiert die Serum-hK6-Konzentration einen neuen Biomarker für Eierstockkrebs, der von potentieller Nützlichkeit als ein diagnostisches, prognostisches und vorhersagendes Werkzeug ist. Die Kombination von hK6 und CA125 verbessert die diagnostische Empfindlichkeit gegenüber Eierstockkrebs in allen Stadien, einschließlich der Erkrankung im Frühstadium.
  • Beispiel 4
  • KLK6-Eierstockgewebe
  • PATIENTEN UND METHODEN
  • Eierstockkrebspatientinnen.
  • Es wurden 180 Patientinnen mit primärem Eierstockkrebs in diese Studie einbezogen. Diese Patientinnen unterzogen sich an der Abteilung für Gynäkologie der Universität Turin, Italien, der Chirurgie für Eierstockkrebs. Das Alter der Patientinnen lag im Bereich von 25 bis 82 Jahren mit einem Medianwert von 59 Jahren. Die klinische und pathologische Information, die zum Zeitpunkt der Chirurgie dokumentiert war, beinhaltete das klinische Stadium des Krebses, den Grad und die Histologie des Tumors, sowie die Menge an restlichem Tumor. Der Menopause-Status wurde dokumentiert, und die Antwort auf die Chemotherapie wurde überwacht. Die Einteilung der Tumoren nach Stadium erfolgte gemäß den Kriterien der International Federation of Gynaecology and Obstetrics (FIGO). Die histologische Klassifizierung basierte auf den Empfehlungen der World Health Organisation und der FIGO. Von den in diese Studien einbezogenen Tumoren wurden 80 als serös-papillär klassifiziert, 32 als undifferenziert, 27 als endometrioid, 13 als muzinös, 14 als „Klarzell" (Clear Cell), 10 als müllerisch, und 4 als anderweitig. Die Größe der verbleibenden Tumoren reichte von 0 bis 9 cm, mit einem Medianwert von 1,1 cm.
  • Die Patienten wurden im Hinblick auf Überleben und Krankheitsprogression (keine erkennbare Progression oder Progression) für einen Medianwert der Dauer von 62 Monaten (Größenbereich von 1-99 Monaten) überwacht. Folgeinformationen waren für 165 der Patienten verfügbar. 97 (54%) hiervon erlitten Rückfälle, und 61 (34%) verstarben im Verlauf dieser Folgezeitspanne.
  • Die Durchführung der Untersuchungen erfolgte in Übereinstimmung mit den ethischen Standards der Helsinki-Erklärung von 1975, wie revidiert in 1983, und diese wurden durch das Institut für Geburtshilfe und Gynäkologie, Turin, Italien, zugelassen.
  • Präparation von Tumorzellextrakten.
  • Das Tumorgewebe wurde unmittelbar nach der Chirurgie in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Extraktion bei –80°C gelagert. 20 bis 100 mg an gefrorenem Gewebe wurden auf Trockeneis zu einem feinen Pulver pulverisiert, und es wurden 10 Volumina an Extraktionspuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10g/l an NP-40 Tensid, 1 mM Phenylmethylsulphonylfluorid, 1 g/l an Aprotinin, 1 g/l an Leupeptin) hinzugegeben.
  • Die resultierende Suspension wurde auf Eis für 30 Minuten inkubiert, wobei sie während dieser Zeit alle zehn Minuten gevortext wurde. Das Gemisch wurde dann bei 14.000 rpm bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert, und der Überstand (Zellextrakt) wurde gesammelt und bis zur Analyse bei –80°C gelagert. Die Proteinkonzentration des Extrakts wurde mittels des Bicinchonin-Säureverfahrens bestimmt, wobei Albumin als Standard verwendet wurde (Pierce Chemical Co., Rockford, IL).
  • Messung von hK6 in Eierstock-Zellextrakten.
  • Die Konzentration von hK6 in Tumorzellextrakten wurde mittels eines hochempfindlichen und hochspezifischen nicht-kompetitiven Immunoassays für hK6 quantifiziert, der zuvor beschrieben und detailliert bewertet wurde (12). Der Assay bezog zwei für hK6 spezifische polyklonale Antikörper ein, einen, der in der Maus erzeugt wurde, und einen anderen, der im Kaninchen erzeugt wurde, in einem sequentiellen zweiseitigen immunometrischen Format mit zeitaufgelöster Fluoreszenzdetektion. Die Analyse von Standards, Tumorzellextrakten und Kontrollpools erfolgte im Duplikat in 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatten mit 200 μl Probe, die zu dem Immunoassay hinzugegeben wurde. Die Standardkurve unter Verwendung von rekombinantem hK6-Protein reichte von 0,5 μg/l bis 200 μg/l. Die Genauigkeit des Assays war besser als 10%. Die Signaldetektion und Datenreduktion wurden automatisch durch den CyberFluor 615 Immunoanalysator durchgeführt.
  • Lokalisierung von hK6 in Eierstocktumor-Proben mittels Immunhistochemie.
  • Ein polyklonaler Kaninchenantikörper wurde gegen rekombinantes HK6-Protein voller Größe erzeugt, das in Hefezellen produziert worden war. Die immunhistochemische Färbung auf hK6 wurde gemäß einem Standard-Immunperoxidase-Verfahren durchgeführt. Kurz dargestellt, wurden in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte (4 μm) fixiert und entwachst. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde mit 3% wässrigem Wasserstoffperoxid für 15 Minuten geblockt. Die Schnitte wurden dann mit 0,4% Pepsin bei pH 2,0 für 5 Minuten bei 42°C behandelt und für 10 Minuten mit 20% Proteinblocker (Signet Labs) geblockt. Der primäre Antikörper wurde dann bei einer Verdünnung von 1:400 für 1 Stunde bei Raumtemperatur hinzugegeben. Nach dem Waschen wurde biotinylierter Anti-Kaninchen-Antikörper (Signet) hinzugegeben, 4-fach verdünnt in Antikörper-Verdünnungspuffer (DAKO). Nach der Inkubation und dem Waschen wurde mit Streptavidin-Tag versehene Meerrettich-Peroxidase für 30 Minuten bei Raumtemperatur hinzugegeben. Nach dem Waschen wurde die Detektion mit Aminoethylcarbazol (AEC) für 5-10 Minuten erreicht. Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt und dann mit Deckgläschen versehen.
  • Statistische Analyse.
  • Die statistische Analyse erfolgte mittels SPSS-Software (SPSS Inc. Richmond, CA). Um die Daten zu analysieren, wurden die Patienten gemäß klinischer und pathologischer Parameter in verschiedene Gruppen eingeteilt. Da die Verteilung der Menge von hK6 pro mg Gesamtprotein (d.h. die spezifische Aktivität) in den Eierstocktumor-Extrakten keiner Gauß-Verteilung folgte, wurde der nicht-parametrische Mann-Whitney-U-Test verwendet, um Unterschiede zwischen zwei Gruppen zu bestimmen, und der nicht-parametrische Kruskal-Wallis-Test wurde verwendet, um Unterschiede zwischen mehr als zwei Gruppen zu analysieren. Diese Tests behandelten die hK6-spezifische Aktivität in den Tumorextrakten (ng hK6/mg Gesamtprotein) als eine kontinuierliche Variable. Die spezifische hK6-Aktivität im Tumorextrakt wurde außerdem als entweder hK6-positiv (> 35 ng/mg Gesamtprotein, siehe 7B zur Erläuterung) oder als hK6-negativ (≤ 35 ng/mg Gesamtprotein) klassifiziert. Die Beziehung dieser dichotomen Variablen zu anderen kli nisch-pathologischen Korrelationsgrößen erfolgte, so wie es passend war, mittels des Chi-Quadrat-(x2)-Tests oder des exakten Fisher-Tests. Die Auswirkung der hK6-spezifischen Aktivität des Tumorextrakts auf das Patientenüberleben und auf die Progression der Erkrankung (progressionsfreies Überleben) wurde mittels des Hazardquotienten, der über proportionale Cox-Hazard-Regressionsmodelle (30) sowohl mit einer Variablen als auch mit mehreren Variablen berechnet wurde, bestimmt. Bei der multivariaten Analyse wurden die klinischen und pathologischen Variablen angepasst, die das Überleben beeinflussen können, einschließlich des Stadiums der Erkrankung, des Tumorgrads, des restlichen Tumors, des histologischen Typs und des Alters. Es wurden Kaplan-Meier-Kurven des progressionsfreien Überlebens und des Gesamtüberlebens (31) konstruiert, um die Überlebensunterschiede zwischen den hK6-positiven und den hK6-negativen Patienten zu zeigen. Es wurde der „Log Rank-Test" (32) verwendet, um die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Überlebenskurven zu prüfen. Nach der Analyse des gesamten Patientendatensatzes im Ganzen wurde der Prozess bei den Untergruppen wiederholt, die getrennt eingeteilt wurden nach Krankheitsstadium, Tumorgrad, und durch die Menge an restlichem Tumor nach der Chirurgie (Erfolg des Massenabbaus). Die Auswirkung der Tumor-hK6-Menge (positiv oder negativ) auf das Überleben und auf die Progression der Erkrankung wurde für jede der Untergruppen durch univariate und multivariate Modelle bestimmt.
  • ERGEBNISSE
  • Verteilung der hK6-spezifischen Aktivität in Eierstocktumorextrakten.
  • Die Verteilung der hK6-spezifischen Aktivität in Eierstocktumorextrakten der 180 Patientinnen (13A) reichte von 0,04 ng/mg Gesamtprotein bis zu 497 ng/mg Gesamtprotein mit einem Mittelwert von 33 ng/mg Gesamtprotein und einem Medianwert von 13,2 ng/mg Gesamtprotein. Ein Wert von 35 ng/mg Gesamtprotein wurde mittels Chi-Quadrat-Analyse (x2 = 7,3; P = 0,007) als die optimale Schnittstelle zur Unterscheidung positiver von negativen Tumoren im Hinblick auf die Vorhersage des Gesamtüberlebens identifiziert (13B). Nach diesem Kriterium waren dreißig Prozent der Tumoren hK6-positiv. Die hK6-spezifische Aktivität in den Tumorextrakten wurde sowohl als kontinuierliche Variable als auch als dichotome Variable (≤ 35 ng/mg Gesamtprotein, > 35 ng/mg Gesamtprotein) bei der folgenden Analyse behandelt.
  • Die hK6-spezifische Aktivität (ng hK6/mg Gesamtprotein) war in Extrakten von Eierstocktumor signifikant (P < 0,001 gemäß dem Kruskal-Wallis-Test) erhöht (Mittelwert 32,7, Standardfehler 3,8, Größenbereich 0,04 bis 497), wenn man dies mit Extrakten verglich, die aus normalen Eierstockgeweben (Mittelwert 3,5, Standardfehler 2,5, Größenbereich 0,05 bis 20,8) oder aus Eierstockgewebe bei benigner Erkrankung (Mittelwert 3,2, Standardfehler 2,6, Größenbereich 0,03 bis 21,5) hergestellt wurden (14). Eine weitere Analyse zeigte, dass es keinen signifi kanten Unterschied bei der hK6-spezifischen Aktivität unter den Eierstocktumoren gab, wenn man diese nach Gewebetyp unterteilte (d.h. serös versus undifferenziert versus endometrioid, etc.) (Daten nicht gezeigt).
  • Beziehungen zwischen dem hK6-Status und anderen klinisch-pathologischen Variablen.
  • Die Verteilung verschiedener klinisch-pathologischer Variablen zwischen hK6-positiven und hK6-negativen Patienten ist in Tabelle 9 zusammengefasst. Die Beziehungen zwischen dem hK6-Status und diesen Variablen wurden entweder mit dem x2-Test oder dem exakten Fischer-Test, so wie es passend war, untersucht. Es wurde keine Beziehung zwischen dem hK6-Status und dem Tumorgrad, dem Menopausestatus und der Antwort auf die Chemotherapie beobachtet. Jedoch war es bei hK6-positiven Patienten wahrscheinlicher, dass diese eine fortgeschrittene Erkrankung (Stadium II-IV), eine seröse Tumorhistologie und einen größeren restlichen Tumor (>1 cm) aufwiesen (in allen Fällen P < 0,05). Die hK6-spezifische Aktivität des Tumorextrakts, wenn sie als eine kontinuierliche Variable behandelt wurde, assoziierte außerdem proportional mit dem Stadium der Erkrankung. 15 zeigt die Verteilung der hK6-spezifischen Aktivität bei Unterteilung nach dem Krankheitsstadium. Die hK6-spezifische Aktivität war bei Extrakten von Eierstockkrebs der Stadien III/IV signifikant höher als bei solchen der Stadien I/II (P = 0,002 gemäß Mann-Whitney-U-Test).
  • Univariate und multivariate Überlebensanalyse.
  • Die Auswirkung der hK6-spezifischen Aktivität, anderer klinisch-pathologischer Variablen und des Alters auf die Progression der Erkrankung und auf das Gesamtüberleben ist in Tabelle 10 präsentiert. Bei der univariaten Analyse besaßen hK6-positive Patienten ein signifikant erhöhtes Risiko für Krankheitsprogression (Hazardquotient = 1,71) und Tod (Hazardquotient = 1,88) (P < 0,05). Wenn die hK6-spezifische Aktivität als kontinuierliche Variable behandelt wurde, so waren die Hazardquotienten nahezu ähnlich zu denjenigen von hK6-negativen Tumoren (willkürlich auf 1,00 gesetzt), obwohl der geringfügige Anstieg des Risikos der Krankheitsprogression (Hazardquotient = 1,005) mit P = 0,001 hochgradig signifikant war. Die Kaplan-Meier-Überlebenskurven zeigten Überlebensunterschiede zwischen hK6-positiven und hK6-negativen Patienten. Wie 16 zeigt, ist die Wahrscheinlichkeit von progressionsfreiem Überleben und Gesamtüberleben bei hK6-positiven Patienten niedriger als bei hK6-negativen Patienten.
  • Die nachteiligen Auswirkungen der hK6-Positivität auf das progressionsfreie Überleben und auf das Gesamtüberleben ging bei der multivariaten Analyse verloren. Wie in Tabelle 10 gezeigt, wenn die Überlebensausgänge im Hinblick auf andere klinisch-pathologische Variablen ange passt wurden, so zeigten hK6-positive und hK6-negative Patienten statistisch ähnliche Raten der Krankheitsprogression und des Gesamtüberlebens. Der Tumorgrad verlor seine univariate prognostische Signifikanz bei der multivariaten Analyse ebenfalls. Nur das Krankheitsstadium und der restliche Tumor, der nach der Chirurgie verblieb, behielten bei der multivariaten Analyse ihre unabhängigen Wirkungen auf den Überlebensausgang.
  • Univariate und multivariate Überlebensanalyse in Untergruppen von Patienten.
  • Die Patienten wurden auf Basis des Krankheitsstadiums, des Tumorgrads und des Erfolgs des Massenabbaus (restlicher Tumor) in verschiedene Untergruppen unterteilt. In jeder Untergruppe wurde die Auswirkung von hK6-Positivität und -Negativität auf die Krankheits-Progression und das Gesamtüberleben mittels eines proportionalen Cox-Hazard-Regressionsmodells mit einer und mehreren Variablen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt. Die hK6-spezifische Aktivität (positiv, negativ) hatte signifikante Auswirkung auf das Überleben in der Untergruppe von Patienten mit Tumorgrad I oder II. Die univariate Analyse deckte auf, dass es bei hK6-positiven Patienten etwa 9-mal wahrscheinlicher war, dass diese eine Krankheitsprogression erleiden und etwa 5-mal wahrscheinlicher, zu sterben, als bei hK6-negativen Patienten. Diese Unterschiede im Überleben blieben signifikant, selbst nachdem die Daten einer multivariaten Analyse unterzogen worden waren. Das relative Risiko beider Ausgänge, die sich aus hK6-Positivität ergeben, betrug nun das etwa 4-fache (P < 0,03). Der hK6-Status besaß keinen derartigen Effekt unter Patienten mit Grad III-Tumor, noch konnte irgendein erkennbarer Effekt unter den Patienten mit einer Erkrankung im Frühstadium und unter denen mit einem nach der Chirurgie verbleibenden Tumor von mehr als 1 cm gezeigt werden. Die univariate Analyse zeigte einen 2-fachen Anstieg des Risikos der Krankheitsprogression und des Todes bei der Untergruppe von Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung (Stadium III und IV), die hK6-positiv waren, jedoch ging der Effekt bei der multivariaten Analyse verloren. Das Gegenteil war bei der Untergruppe von Patienten der Fall, die zum Zeitpunkt der Chirurgie durch einen optimalen Massenabbau des Tumors gekennzeichnet waren (restlicher Tumor mit weniger als 1 cm Durchmesser). Die hK6-Positivität besaß keinen nachweislich nachteiligen Effekt auf die Krankheitsprogression oder das Überleben, wenn eine univariate Analyse erfolgte, wurde jedoch statistisch signifikant und ergab eine 3,5-fache bzw. 5,5-fache Steigerung des nachteiligen Risikos, wenn die Daten einer multivariaten Analyse unterzogen wurden. Das Auftreten von Effekten im multivariaten Modell – wenn keine Effekte durch das univariate Modell erzeugt werden – geschieht, wenn die angepassten Variablen keinerlei Auswirkung auf den Ausgang besitzen. In diesem Fall hier bedeutet dies, dass das Stadium der Erkrankung, der Tumorgrad, die Tumorhistologie und das Patientenalter kein prognostisches Potential für das Voranschreiten der Erkrankung und das Gesamtüberleben bei dieser bestimmten Untergruppe von Patienten besaßen. Kaplan-Meier-Überlebenskurven der Untergruppe von Patienten mit Grad I oder II Eierstocktumor sind in 17 gezeigt. Wie anhand der zuvor erwähnten univariaten Analyse erwartet, gab es zwischen den hK6-positiven und hK6-negativen Patienten einen signifikanten Unterschied beim Voranschreiten der Erkrankung und beim Überleben.
  • Immunhistochemische Färbung von hK6 in Eierstocktumoren.
  • Die immunhistochemische Färbung von hK6 in Paraffin-eingebetteten Tumorschnitten war grob proportional zur hK6-spezifischen Aktivität in Tumorextrakten (Daten nicht gezeigt). Die immunhistochemische Lokalisierung von hK6-Protein in vier Eierstockgeweben, die benignen, im Grenzbereich befindlichen („Borderline") oder malignen Tumor enthielten, ist in 18 dargestellt. Die hK6-Färbung war auf die epithelialen Zellen beschränkt und fehlte in mesenchymalen Elementen einschließlich des fibrösen stützenden Stromas. hK6 wurde im Zytoplasma der epithelialen Zellen angefärbt, jedoch war die Färbungsintensität zwischen und in den Tumorpräparationen variabel.
  • DISKUSSION
  • Es wurde herausgefunden, dass eine gesteigerte hK6-Synthese ein aggressiveres Tumorverhalten über den Zeitverlauf vorhersagte. Wenn man dies abgesehen von anderen klinisch-pathologischen Variablen und dem Alter betrachtete, so war hK6-Positivität über die gesamte Patientenpopulation, die untersucht wurde, mit einer etwa 2-fachen Zunahme des Risikos sowohl von Krankheitsprogression als auch von Tod assoziiert. Dieser Effekt ging verloren, wenn die Ausgänge im Hinblick auf andere klinisch-pathologische Variablen und das Alter bei einer multivariaten Analyse der gesamten Patientenpopulation angepasst wurden, nicht jedoch, wenn die multivariate Analyse auf diejenigen Patienten beschränkt wurde, die einen niedrigeren Tumorgrad und weniger an restlichem, nach der Chirurgie verbleibendem Tumor (< 1 cm Durchmesser) aufwiesen.
  • Bei der erstgenannten Untergruppe von Patienten sagte hK6-Positivität eine etwa 4-fache Erhöhung des Risikos für Krankheitsprogression und Tod voraus (P < 0,03), wobei die zugehörigen Hazardquotienten in der letzteren Untergruppe hierfür 3,75 bzw. 5,5 betrugen (P < 0,02). Diese Daten zeigen, dass hK6-Positivität ein unabhängiges Vorhersagepotential bei diesen zwei Untergruppen besitzt und einen Einblick in das Tumorverhalten über den Zeitverlauf gibt, der über die anderen klinischen Parameter und pathologischen Korrelationen, die konventionell gemessen werden, nicht zusammengetragen werden kann. Somit kann der Test auf hK6 zu einer individualisierteren, wirksameren Behandlung solcher Patienten beitragen.
  • Es wurde herausgefunden, dass hK6 im Vergleich zu nicht-malignem Eierstockgewebe in Eierstocktumoren häufig überexprimiert wird. Diese Überexpression hat die Neigung, in Tumoren eines späten Krankheitsstadiums höher zu sein als bei der Erkrankung im Frühstadium. Die histochemischen Studien deuten darauf hin, dass hK6 in den Epithelzellen des Eierstocks synthetisiert wird und diffus im zytoplasmatischen Kompartiment verteilt wird.
  • Epithelialer Eierstockkrebs hat eine der schlechtesten Prognosen unter den gynäkologischen malignen Erkrankungen, im wesentlichen deshalb, da über Dreiviertel der Diagnosen zu einem Zeitpunkt getroffen werden, wenn die Erkrankung bereits regionale oder entfernte Metastasen abgesiedelt hat (33). Das Problem wird dadurch verkompliziert, dass die Tumorprogression und Aggressivität in variabler Weise mit konventionellen klinischen und pathologischen Markern korreliert. Es gibt somit einen wichtigen Bedarf für zusätzliche diagnostische und prognostische Marker für diese Erkrankung, und eine Anzahl von potentiellen Markern ist identifiziert worden.
  • Die unten stehenden vollen Zitierungen werden für die Referenzstellen angegeben, auf die in der Beschreibung verwiesen wird. Tabelle 1: Analyse von hK6-Protein in verschieden Flüssigkeiten
    Probe hK6, μg/l N2 Positivitätsrate
    Bereich Mittelwert (SD) Medianwert (%)
    Milch1 398-7.638 2.588 (1.607) 2.531 20 100
    Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) 41-2.053 605 (485) 525 21 100
    NAF (normal)3 - 914 - 1 (Pool) 100
    NAF (Krebs)4 - 737 - 1 (Pool) 100
    Brustzystenflüssigkeit 34-97 74 (25) 84 5 (Pools) 100
    Männliches Serum 2,0-12,6 6,9 (2,6) 6,7 18 100
    Weibliches Serum 0-8,1 4,1 (2,0) 4,4 18 100
    Seminalplasma 0-17,7 6,8 (5,5) 5,0 16 81
    Amnionflüssigkeit 0-9,5 1,1 (2,2) 0 21 33
    Brusttumor-Zytosole 0-3 2,1 (7,0) 0 36 17
    Urin 0 0 0 10 0
    1. Von stillenden Frauen 2. Anzahl der getesteten Proben 3. Nipple Aspirate Fluid (NAF) 4. NAF, erhalten von Patientinnen mit Brustkrebs
    Tabelle 2 Konzentration von humanem Kallikrein 6 (hK6) in Serum von normalen Individuen und Patienten mit verschiedenen malignen Erkrankungen.
    hK6, μg/l
    Patientengruppe Anzahl der Proben Min Max Medianwert 95. Perzentil Anzahl der Patienten mit hK6 > 15μg/l (%)
    Normale Männer 41 3,2 11,4 7,5 11,1 0 (0)
    Normale Frauen 40 3,5 13,7 7,0 10,8 0 (0)
    Brustkrebs1 24 1,1 11,9 4,3 9,7 0 (0)
    Medulläres Schilddrüsenkarzinom2 29 0 13,9 5,0 11,8 0 (0)
    Hodenkrebs3 78 2,0 32,2 9,3 14,3 1 (2)*
    Magendarmkrebs4 28 2,6 10,6 5,7 9,6 0 (0)
    Prostatakrebs5 40 1,0 16,1 4,1 9,5 1 (2)**
    Lungenkrebs 18 2,6 7,4 5,2 6,7 0 (0)
    Eierstockkrebs6 80 1,0 206 23,0 148 53(66)
    1. Mit Serum CA 15.3 Mengen ≥ 414 KU/l (oberer Referenzbereich 35 KU/l). 2. Mit Calcitonin-Mengen ≥ 1.135 ng/l (oberer Referenzbereich 100 ng/l). 3. Mit hCG-Mengen ≥ 69 IU/l (oberer Referenzbereich 10 IU/l) oder AFP Mengen ≥ 110 μg/l (oberer Referenzbereich 10 μg/l). 4. Mit CA 19.9 Mengen ≥ 629 KU/l (oberer Referenzbereich 37 KU/l) und CEA Mengen ≥ 1.000 μg/l (oberer Referenzbereich 5 μg/l). 5. Mit PSA ≥ 324 μg/l (oberer Referenzbereich 4 μg/l). 6. Mit CA 125 ≥ 372 KU/l (oberer Referenzbereich 35 KU/l).
    Tabelle 3: Beschreibende Statistik von Serum-hK6 bei Patienten ohne Krebs (gesund), mit benigner Erkrankung und mit Eierstockkrebs.
    Perzentile
    Variable Mittelwert ± SEa Bereich 5 25 50 75 95
    ohne Krebs (N = 97)
    hK6 (μg/l) 2,94±0,099 0,89-6,58 1,49 2,28 2,90 3,54 4,44
    Benigne Erkrankung (N = 141)
    hK6 (μg/l) 3,12±0,074 1,30-6,16 1,99 2,50 3,00 3,60 4,88
    Vor-chirurgischer Eierstockkrebs (N = 146)
    hK6 (μg/l) 6,81±0,57 1,30-38,00 2,19 3,12 4,40 7,15 25,06
    Nach-chirurgischer Eierstockkrebs (N = 105)
    hK6(μg/l) 3,87±0,25 0,80-21,82 1,82 2,66 3,20 4,20 7,72
    a Standardfehler (Standard Error)
    Tabelle 4: Vergleich der Empfindlichkeit und Spezifität der Serum-hK6-Konzentration bei ausgewählten Ausschlusswerten.
    Parameter Ausschlusswert Empfindlichkeit (%) Spezifität (%)
    Gesamtpopulation (N = 384) 2,20 95 19
    hK6 (μg/l)) 2,50 90 29
    4,20 54 90
    4,40 50 95
    CA 125 < 23 KU/l (N = 182) 2,27 95 24
    hK6 (μg/l) 2,40 90 28
    4,30 17 90
    4,40 13 95
    CA125 23-60 KU/l (N = 65) 2,20 95 10
    hK6 (μg/l) 2,40 90 19
    4,00 26 90
    4,20 15 95
    CA 125 > 60 KU/l (N = 110) 2,20 95 16
    hK6 (μg/l) 2,70 90 43
    4,50 71 90
    5,56 65 95
    Tabelle 5: Diagnostische Empfindlichkeiten für Eierstockkrebs mit CA125 alleine, hK6 alleine und CA125 + hK6. Analyse bei 90 und 95% Spezifitäts-Ausschlusswerten für beide Marker.
    Empfindlichkeit bei 90% Spezifität Empfindlichkeit bei 95% Spezifität
    Alle Patienten mit bekanntem Stadium (N = 124)
    CA125 60 56
    hK6 58 53
    CA125 + hK6 72 69
    Stadium IIII Patienten (N = 43)
    CA125 30 26
    hK6 26 21
    CA125 + hK6 42 37
    Tabelle 6: Relatives Risikoa (RR) von Eierstockkrebs gemäß Quartilen von Serum-hK6.
    Quartile (μg/l)
    Parameter 1 2 3 4
    (0,89-2,60) (2,61-3,29) (3,30-4,27) (4,28-38,00)
    n = 96 n = 96 n = 96 n = 96
    hK6 unangepassta
    RR 1,00 1,41 3,12 20,00
    95% Konfidenzintervalle 0,71-2,79 1,43-6,85 7,70-48,46
    p-Wert 0,32 0,003 < 0,001
    hK6 angepasstb
    RR 1,00 1,21 2,31 5,33
    95% Konfidenzintervalle 0,56-2,62 1,05-5,02 2,32-12,24
    p-Wert 0,62 0,036 < 0,001
    a Geschätzt anhand von bedingungslosen logistischen Regressionsmodellen. b Multivariate Modelle wurden mit den CA125-Quartilen angepasst.
    Tabelle 7: Beziehung zwischen dem hK6-Status und anderen Variablen bei Eierstockkrebs-Patienten*
    Anzahl von den Patienten (%)
    Variable Patienten hK6-negativ hK6-positiv p-Wert
    Stadium
    I 32 27 (84,4) 5 (15,6)
    II 11 8 (72,7) 3 (27,3) < 0,001a
    III 73 18 (24,7) 55 (75,3)
    IV 8 3 (37,5) 5 (62,5)
    x 22
    Grad
    G1 39 31 (79,5) 8 (20,5)
    G2 24 7 (29,2) 17 (70,8) < 0,001a
    G3 62 19 (30,6) 43 (69,4)
    x 21
    H istotyp
    Serös 74 24 (32,4) 50 (67,6)
    Endometrioid 15 10 (66,7) 5 (33,3) < 0,001a
    Muzinös 22 20 (90,9) 2 (9,1)
    Andere 27 17 (63,0) 10 (37,0)
    x 8
    Restlicher Tumor (cm)
    0 76 52 (68,4) 24 (31,6)
    1-2 17 3 (17,6) 14 (82,4) < 0,001a
    > 2 35 6 (17,1) 29 (82,9)
    x 18
    Erfolg des Massenabbausc
    SO 49 9 (18,4) 40 (81,6) < 0,001b
    OD 81 53 (65,4) 28 (34,6)
    Erfolg des Massenabbausc
    x 16
    Antwort auf CTXd
    NC/PD 21 4 (19,0) 17 (81,0) <0,001b
    CR/PR 107 61 (57,0) 46 (43,0)
    NE 18
    * hK6-Ausschlusswert = 4,4 μg/l (Medianwert) a x2-Test b Exakter Fisher-Test c OD, Optimaler Massenabbau (0-1 cm); SO, Suboptimaler Massenabbau (>1 cm) d CTX, Chemotherapie; NC, keine Veränderung; PD, progressive Erkrankung; CR, vollständige Antwort; PR, teilweise Antwort; NE, nicht bewertet x Status unbekannt.
    Tabelle 8: Univariate und multivariate Analyse von Serum-hK6 im Bezug auf das progressionsfreie Überleben und das Gesamtüberleben.
    progressionsfreies Überleben Gesamtüberleben
    Variable HRa 95% CIb p-Wert HRa 95% CIb p-Wert
    Univariate Analyse
    hK6 negativ 1,00 1,00
    positiv 4,10 2,28-7,36 < 0,001 3,15 1,36-7,29 0,007
    als eine kontinuierliche Variable 1,068 1,041-1,095 < 0,001 1,075 1,038-1,11 < 0,001
    CA125 negativd 1,00 1,00
    positivd 2,52 1,45-4,38 0,001 2,36 1,03-5,42 0,041
    als eine kontinuierliche Variable 1,001 1,000-1,002 < 0,001 1,001 1,000-1,003 0,018
    Gradeinstufung (ordinal) 2,50 1,71-3,64 < 0,001 2,34 1,53-3,58 < 0,001
    Restlicher Tumor (ordinal) 1,23 1,13-1,34 < 0,001 1,31 1,21-1,41 < 0,001
    Histologischer Typc 2,49 1,37-4,54 0,003 4,25 1,44-12,53 < 0,008
    Multivariate Analyse
    hK6 negativ 1,00 1,00
    positiv 4,86 1,10-21,47 0,036 5,08 1,07-23,69 0,038
    als eine kontinuierliche Variable 1,047 1,007-1,089 0,019 1,063 1,007-1,12 0,025
    CA125 negativd 1,00 1,00
    positivd 2,86 0,69-11,74 0,14 2,17 0,38-63,17 0,38
    Stadium von Erkrankung (ordinal) 2,54 1,37-4,69 0,003 6,34 2,27-17,7 < 0,001
    Gradeinstufung (ordinal) 1,63 0,94-2,82 0,078 1,56 0,66-3,68 0,31
    Restlicher Tumor (ordinal) 1,09 0,42-2,26 0,15 1,01 0,80-1,24 0,98
    Histologischer Typc 1,08 0,75-1,56 0,65 1,18 0,94-1,31 0,18
    a Hazardquotient (HR) geschätzt aus dem proportionalen Cox-Hazard-Regressionsmodell b Konfidenzintervall des geschätzten HR c Serös versus Andere d Ausschlusswert = 98 KU/l (95% Spezifität; 53% Empfindlichkeit; 48. Perzentil).
    Tabelle 9: Beziehung zwischen dem hK6-Status und anderen Variablen bei 180 Eierstockkrebs-Patientinnen.
    Anzahl von den Patienten (%)
    Variable Patienten hK6-negativ hK6-positiv P-Wert
    Stadium
    I 44 38 (86,4) 6 (13,6)
    II 13 8 (61,5) 5 (38,5) 0,034a
    III 110 72 (65,4) 38 (34,5)
    IV 13 7 (53,8) 6 (46,2)
    Grad
    G1 25 21 (84,0) 4 (16,0)
    G2 27 21 (77,8) 6 (22,2) 0,33a
    G3 119 84 (70,6) 35 (29,4)
    x 9
    Histotyp
    Serös 80 52 (65,0) 28 (35,0)
    Undifferenziert 27 17 (63,0) 10 (37,0)
    Endometrioid 32 27 (46,7) 5 (53,3)
    Muzinös 13 10 (76,9) 3 (13,1) 0,31b
    Klarzell 14 11 (78,6) 3 (21,4)
    Müllerisch 10 8 (80,0) 2 (20,0)
    Andere 4 3 (75,0) 1 (25,0)
    Restlicher Tumor (cm)
    0 80 67 (83,2) 13 (16,3)
    1-2 29 16 (55,2) 13(44,8) 0,002a
    > 2 64 40 (62,5) 24 (37,5)
    x 7
    Menopause
    Prä/Peri 50 32 (64,0) 18 (36,0) 0,075b
    Post 130 99 (76,2) 31 (23,8)
    Antwort auf CTXc
    NC/PD 15 11 (73,3) 4 (26,7) 0,99b
    CR/PR 148 104 (70,3) 44 (29,7)
    NE 17
    a x2-Test. b Exakter Fisher-Test c CTX; Chemotherapie, NC; keine Veränderung, PD; progressive Erkrankung, CR; vollständige Antwort, PR; teilweise Antwort, NE; nicht bewertet. x. Status unbekannt.
    Tabelle 10. Univariate und multivariate Analyse des prognostischen Werts von hK6.
    Progressionsfreies Überleben (PFS) Gesamtüberleben (OS)
    Variable
    HRa 95% CIb P-Wert HRa 95% CIb P-Wert
    Univariate Analyse
    hK6
    Negativ 1,00 1,00
    Positiv 1,71 1,11-2,64 0,015 1,88 1,09-3,21 0,022
    als eine kontinuierliche Variable 1,005 1,002-1,007 0,001 1,004 0,999-1,008 0,074
    Stadium der Erkrankung (ordinal) 2,79 2,07-3,79 < 0,001 3,07 2,05-4,61 <0,001
    Gradeinstufung (ordinal) 1,95 1,38-2,75 < 0,001 2,07 1,31-3,29 0,002
    Restlicher Tumor (ordinal) 1,27 1,20-1,34 < 0,001 1,31 1,22-1,41 < 0,001
    Histologischer Typc 0,83 0,68-1,00 0,055 0,88 0,69-1,13 0,34
    Alter 1,012 0,99-1,03 0,14 1,015 0,99-1,03 0,15
    Multivariate Analyse
    hK6
    Negativ 1,00 1,00
    Positiv 1,40 0,84-2,32 0,19 1,08 0,79-1,49 0,62
    als eine kontinuierliche Variable 1,002 0,99-1,006 0,22 1,001 0,99-1,004 0,69
    Stadium der Erkrankung (ordinal) 1,57 1,09-2,27 0,014 1,72 1,053-2,82 0,03
    Gradeinstufung (ordinal) 1,31 0,84-2,32 0,18 1,31 0,75-2,25 0,33
    Restlicher Tumor (ordinal) 1,14 1,05-1,24 0,001 1,21 1,09-1,34 < 0,001
    Histologischer Typc 0,95 0,82-1,11 0,57 1,04 0,86-1,26 0,68
    Alter 1,02 0,99-1,039 0,12 1,02 0,99-1,04 0,21
    a Hazardquotient (HR), geschätzt anhand des proportionalen Cox-Hazard-Regressionsmodells b Konfidenzintervall des geschätzten HR. c Serös versus Andere
    Tabelle 11. Proportionale Cox-Hazard-Regressionsanalyse für Untergruppen von Patienten.
    Progressionsfreies Überleben Gesamtüberleben
    Variable HRa 95% CIb P-Wert HRa 95% CIb P-Wert
    Tumorgrad I-II
    hK6 univariat 9,25 3,33-25,67 < 0,001 5,05 1,63-15,71 0,005
    hK6 multivariatc 4,29 1,17-15,65 0,027 4,05 1,23-16,6 0,023
    Tumorgrad III
    hK6 univariat 1,45 0,87-2,39 0,14 1,69 0,91-3,14 0,091
    hK6 multivariatc 1,03 0,58-1,83 0,91 1,02 0,48-2,13 0,96
    Stadium I-II
    hK6 univariat 0,90 0,18-4,35 0,89 1,49 0,13-16,53 0,74
    hK6 multivariatd 1,83 0,17-19,41 0,61 2,23 0,20-25,04 0,51
    Stadium III-IV
    hK6 univariat 2,04 1,26-3,29 0,004 1,98 1,12-3,47 0,017
    hK6 multivariatd 1,57 0,93-2,68 0,092 1,33 0,71-2,53 0,37
    Optimaler Erfolg des Massenabbause
    Optimaler Erfolg des Massenabbause
    hK6 univariat 1,81 0,72-4,55 0,20 2,61 0,70-9,73 0,15
    hK6 multivariatf 3,75 1,39-10,09 0,019 5,57 1,47-21,04 0,011
    Suboptimaler Erfolg des Massenabbause
    hK6 univariat 1,39 0,83-2,32 0,20 1,16 0,64-2,09 0,62
    hK6 multivariatf 1,27 0,72-2,23 0,40 1,19 0,62-2,27 0,59
    a Hazardquotient(HR), geschätzt anhand des proportionalen Cox-Hazard-Regressionsmodells b Konfidenzintervall des geschätzten HR. c Multivariate Modelle wurden im Hinblick auf das Stadium der Erkrankung, den restlichen Tumor, den histologischen Typ und das Alter angepasst. d Multivariate Modelle wurden im Hinblick auf den Tumorgrad, den restlichen Tumor, den histologischen Typ und das Alter angepasst. e Optimaler Massenabbau (0-1 cm an restlichem Tumor); suboptimaler Massenabbau (> 1 cm an restlichem Tumor) f Multivariate Modelle wurden im Hinblick auf das Stadium der Erkrankung, den Tumorgrad, den histologischen Typ und das Alter angepasst.
  • VOLLE ZITIERUNGEN FÜR DIE REFERENZTEXTE, AUF DIE IN DER BESCHREIBUNG BEZUG GENOMMEN WIRD
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Claims (13)

  1. In vitro-Verfahren zum Diagnostizieren oder Überwachen von Eierstockkrebs oder zum Bestimmen der Prognose für Eierstockkrebs in einem Subjekt, wobei man (a) die Menge an humanem Kallikrein 6 in einer Serumprobe von dem Subjekt bestimmt und (b) die bestimmte Menge an humanem Kallikrein 6 mit einer Menge vergleicht, die in einer Kontroll-Serumprobe vorhanden ist, welche man von einem Kontroll-Subjekt erhalten hat, von dem bekannt ist, daß es nicht von Eierstockkrebs befallen ist, oder daß es an einer benignen Erkrankung leidet, oder in einer Kontroll-Serumprobe, die von dem Subjekt zu einem anderen Zeitpunkt genommen wurde, wobei eine Zunahme der Menge an humanem Kallikrein 6 in der Serumprobe von dem Subjekt im Vergleich zu der Menge an humanem Kallikrein 6 in der Kontroll-Serumprobe ein Hinweis für Eierstockkrebs in dem Subjekt oder für eine schlechte Prognose ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, welches in Stufe (a) folgendes umfaßt: (i) in Kontakt bringen der Serumprobe mit einem für humanes Kallikrein 6 spezifischen Antikörper, welcher direkt oder indirekt mit einer detektierbaren Substanz markiert ist, (b) Feststellen der detektierbaren Substanz zur Bestimmung der Menge an humanem Kallikrein 6 in der Probe.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, welches weiterhin folgendes umfaßt: In Stufe (a) weiterhin das in Kontakt bringen der Serumprobe mit einem für hK6 spezifischen zweiten Antikörper, welcher immobilisiert ist, nach Stufe (a) das Abtrennen des ersten Antikörpers von dem zweiten Antikörper, um eine Phase des ersten Antikörpers und eine Phase des zweiten Antikörpers zu erhalten, in Stufe (b) das Feststellen des detektierbaren Substrates in der Phase entweder des ersten oder des zweiten Antikörpers, wobei die Menge an humanem Kallikrein 6 in der biologischen Probe bestimmt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei in Stufe (a) die ersten und zweiten Antikörper gleichzeitig oder nacheinander mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht werden.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, immunologisch aktive Antikörperfragmente, humanisierter Antikörper, eine schwere Kette eines Antikörpers, eine leichte Kette eines Antikörpers, ein genetisch hergestelltes Einzelketten-Fv-Molekül oder ein chimarer Antikörper ist/sind.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die detektierbare Substanz alkalische Phosphatase ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die alkalische Phosphatase unter Verwendung eines fluorogenen Substrates detektiert wird.
  8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Menge an humanem Kallikrein 6 unter Anwendung von zeitaufgelöster Fluoreszenz bestimmt wird.
  9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, welches weiterhin das Bestimmen der Mengen von CA125 in der Serumprobe umfaßt.
  10. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche zur Überwachung des Subjekts nach einer ersten Behandlung.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zum Bestimmen der Prognose einer Eierstockkrebserkrankung in dem Subjekt, wobei eine Menge von mehr als 4,4 μg/l eine signifikant schlechtere Prognose anzeigt.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Bestimmung der Prognose die Vorhersage über den Ausgang einer chirurgischen Behandlung, über das Ansprechen auf Chemotherapie oder über die Überlebenschancen des Subjekts umfaßt.
  13. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Feststellen einer Menge von humanem Kallikrein 6 in der Serumprobe von dem Subjekt von mehr als der Menge, die in der Serumprobe von dem Kontrollsubjekt bestimmt wird, eine Erkrankung im späten Stadium oder ein erhöhtes Risiko für ein Fortschreiten der Erkrankung und Mortalität anzeigt.
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