ES2282285T3 - Procedimiento de mutagenesis dirigida masiva. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de mutagénesis de un gen diana, que consiste en preparar una serie de N oligonucleótidos, presentando cada oligonucleótido una secuencia complementaria de una región diferente del gen diana y de una a tres mutaciones colocadas en el centro de la secuencia del oligonucleótido, luego en hacer reaccionar dicha serie de oligonucleótidos con dicho gen diana en condiciones que permiten la producción de copias del gen diana que lleva al menos una mutación, caracterizado porque el gen diana es llevado por un plásmido circular de doble hebra, el conjunto N de dichos oligonucleótidos de la serie, con N superior a 5, cubriendo la totalidad o parte de la secuencia de dicho gen diana, y porque se hace reaccionar dicha serie de oligonucleótidos con el gen diana en presencia de una polimerasa de tal modo que genere después de la selección por una enzima de restricción que permite suprimir las moléculas de ADN metiladas sobre las dos hebras y conservar las que no están metiladas o hemi-metiladas, un banco de genes mutados donde cada mutación procedente de un oligonucleótido diferente está presente en término medio en menos de 1/5 de los genes del banco.
Description
Procedimiento de mutagénesis dirigida
masiva.
La invención se refiere al ámbito de la biología
molecular y más concretamente el de la mutagénesis. Tiene por
objeto un procedimiento de mutagénesis dirigida altamente
productiva, es decir, la constitución de numerosos mutantes
dirigidos en un tiempo y un número de etapas reducidos. Por lo tanto
este procedimiento será calificado de "mutagénesis
masiva".
La mutagénesis es una técnica destinada a
modificar artificialmente la secuencia nucleotídica de un fragmento
de ADN con el fin de modificar la actividad biológica que origina.
La mutagénesis ha tomado esta última década un lugar importante en
numerosos trabajos de biología molecular.
El término de mutagénesis se puede asociar a
tres modificaciones distintas de un fragmento de ADN:
- -
- la deleción, que consiste en eliminar nucleótidos del fragmento de ADN de interés,
- -
- la inserción, que consiste en añadir, y
- -
- la sustitución, que consiste en sustituir una o varias bases por el mismo número de bases de diferente naturaleza.
Las técnicas de mutagénesis se pueden separar en
dos grandes grupos: la mutagénesis aleatoria por una parte, y la
mutagénesis dirigida por otra parte.
La mutagénesis aleatoria tiene por objeto
introducir sustituciones de naturaleza y de posición aleatorias en
un fragmento de ADN. Históricamente, la mutagénesis aleatoria se
realizaba por medio de procedimientos químicos que alteraban la
estructura del ADN. Más recientemente, la amplificación de una
molécula que utiliza una polimerasa en condiciones particulares a
menudo sustituyó los procedimientos químicos. Estas condiciones
particulares se caracterizan porque alteran las capacidades de la
enzima para replicar exactamente el ADN. Ésta introduce al hilo
ciclos de las mutaciones, es decir, diferencias con respecto a la
secuencia inicial. Al final de la reacción, se obtiene un gran
número de copias de la molécula inicial, incluyendo cada una de
estas moléculas mutaciones diferentes. Estas moléculas están
presentes en forma de un banco, es decir de una mezcla de moléculas
de distinta naturaleza (que difiere por la naturaleza y la posición
de sus mutaciones).
La mutagénesis dirigida tiene por objeto
introducir una o algunas mutaciones (sustituciones, pero también
deleciones o inserciones) de naturaleza y de posición conocidos en
un fragmento de ADN. Se utiliza un oligonucleótido para introducir
esta mutación. Este oligonucleótido está constituido clásicamente
por una veintena de bases. La secuencia de este oligonucleótido es
homóloga en cualquier punto de la secuencia que actúa como diana
sobre el fragmento de ADN a excepción de una o de algunas
posiciones localizadas en su parte mediana.
Este oligonucleótido se utiliza a continuación
para activar una reacción de replicación (o de amplificación, es
decir, de múltiples replicaciones) utilizando el fragmento de ADN
como matriz. La secuencia nuevamente sintetizada contiene la
modificación buscada.
Las primeras técnicas de mutagénesis dirigida se
basaban en la amplificación únicamente del fragmento de ADN de
interés (en forma de un fragmento de ADN lineal), que debía a
continuación ser introducido en un plásmido. Estas técnicas eran
fastidiosas y se debían adaptar a cada sistema de estudio.
Más recientemente, el oligonucleótido mutante se
utilizó para replicar directamente el plásmido que contiene el
fragmento de ADN de interés. Se minimiza así el número de
manipulaciones que se deben realizar.
La realización práctica de la mutagénesis
dirigida está, sin embargo, lejos de ser simple. Se plantea, en
particular, el problema del aislamiento de las moléculas que hayan
incorporado la mutación con respecto a las moléculas que no la
hayan incorporado. La única replicación de un fragmento de ADN
circular (que corresponde al caso clásico de un gen clonado en un
plásmido) por medio de un oligonucleótido mutante no permite, en
ausencia de sistema de selección, observar una tasa de mutagénesis
detectable. El ADN sintetizado "in vitro" pudiendo ser
distinguido del ADN sintetizado en bacterias según el criterio de su
contenido en bases metiladas, se puso a punto y se generalizó un
sistema de cribado basado en este criterio. Se trata de utilizar la
enzima DpnI, específica de sitios presentes sobre el ADN metilado
pero no sobre el ADN no metilado (Lacks et al, 1980, Methods
in Enzymology, 65: 138). Se eliminaron así las moléculas que no
habían sido sometidas a replicación "in vitro". Pero
incluso al utilizar este sistema de cribado de mutantes, la eficacia
de la reacción de mutagénesis sigue siendo baja y cercana a 5%
solamente de moléculas mutantes.
Esta baja tasa de mutantes se debe, en
particular, al hecho de que después de la reacción de mutagénesis
dirigida, se introducen las moléculas circulares en bacterias que
contienen un sistema de reparación del ADN que elimina una gran
parte de las mutaciones si éstas no son llevadas por una de las
hebras de ADN.
Se propusieron numerosos sistemas para intentar
mejorar la eficacia de estas técnicas de mutagénesis. Estas
técnicas necesitan a menudo un segundo oligonucleótido que permite
mejorar la frecuencia de las moléculas mutantes antes del cribado
(solicitud de patente europea nº 96942905 y solicitud de patente
internacional nº WO 9935281). Otros sistemas utilizan igualmente un
segundo oligonucleótido que permite un sistema de cribado
particular y a veces más eficaz (solicitud de patente europea nº
0938552, Catálogo Clontech 2000, página 45). Finalmente otros
sistemas utilizan cepas bacterianas particulares, estos sistemas
teniendo por objeto minimizar la pérdida de rendimiento debida a la
actividad reparadora de las bacterias (solicitud de patente de
EE.UU. nº 4.873.192 y solicitud de patente europea nº 0938552).
Por último, la mayoría de las técnicas
existentes permiten integrar simultáneamente varios oligonucleótidos
en una secuencia de ADN. Por regla general, hasta tres
oligonucleótidos se pudieron introducir simultáneamente en
distintos lugares del fragmento que se debe mutar (solicitud de
patente internacional nº WO 9935281 y solicitud de patente europea
nº 0938552). Un artículo hace incluso referencia a la obtención de
moléculas que simultáneamente hayan integrado hasta siete
oligonucleótidos en una única etapa (Perlak et al, 1990,
Nucleic Acid Research,
18 : 7457).
18 : 7457).
El concepto de banco, en la técnica según el
estado de la técnica anterior, no se adapta para caracterizar los
productos obtenidos al final de una reacción de mutagénesis
dirigida. En efecto, en la gran mayoría de los casos, se obtiene un
único producto al final de la reacción, conteniendo una única
mutación. La solicitud de patente de EE.UU. nº 5.798.208 describe
un método de mutagénesis en el cual un aminoácido elegido de
antemano se introduce en todas las posiciones posibles de una
región seleccionada de una proteína con el fin de producir un banco
de mutantes de esta proteína, siendo el objetivo evaluar la función
de un aminoácido específico en la estructura o la función de una
proteína dada. En los casos en que se introducen varias mutaciones
simultáneamente por medio de varios oligonucleótidos (solicitud de
patente internacional nº WO 9935281; Perlak et al, 1990,
Nucleic Acid Research,
18 : 7457), los únicos productos buscados son los que hayan incorporado la totalidad de las mutaciones, y la técnica tiende a ser optimizada con el objetivo de maximizar la frecuencia de estos productos. Los productos que no hayan incorporado más que una pequeña fracción de las mutaciones se minimizan y están en estas relaciones considerados como productos secundarios.
18 : 7457), los únicos productos buscados son los que hayan incorporado la totalidad de las mutaciones, y la técnica tiende a ser optimizada con el objetivo de maximizar la frecuencia de estos productos. Los productos que no hayan incorporado más que una pequeña fracción de las mutaciones se minimizan y están en estas relaciones considerados como productos secundarios.
La mutagénesis puede tener por objetivo la
ganancia o la pérdida de una actividad.
La ganancia de una actividad, o más
frecuentemente su simple mejora, es especialmente interesantes en
los ámbitos de la enzimología o de la asociación ligando/receptor.
Así, poder disponer de una enzima de actividad mejorada puede
permitir la reducción de los costes de los procedimientos
industriales que utilizan estas enzimas. Incluso, la afinidad del
enlace entre un ligando y su receptor se puede mejorar gracias a
algunas mutaciones localizadas a nivel del sitio de reconocimiento
de uno al otro.
La búsqueda de estas mejoras de la actividad se
designa a menudo de manera genérica por "evolución molecular".
Se trata de simular la evolución durante las reacciones "in
vitro", introduciendo mutaciones en un fragmento de ADN y
seleccionando las que tienen actividades mejoradas. Varias vueltas
de mutagénesis/selección favorecen así la evolución de una molécula
en presencia de una presión selectiva.
El tipo de mutagénesis utilizado más
frecuentemente en este contexto es la mutagénesis aleatoria. En
efecto, ningún elemento que no permite generalmente definir a
priori la naturaleza y la posición de las mutaciones
susceptibles de aportar una mejora de la actividad estudiada, es
necesario en este contexto producir un gran número de moléculas que
tienen cada una mutaciones de posición y de naturaleza diferentes,
con el fin de maximizar las oportunidades que entre ellas se
encuentre una molécula que corresponde a una actividad mejorada.
La pérdida de la actividad biológica asociada a
un fragmento de ADN que haya sido sometido a mutagénesis aporta
informaciones particulares sobre los aminoácidos que soportan su
actividad. Así, si la modificación de un aminoácido implica la
pérdida de la actividad biológica, es probable que este aminoácido
interviene en la constitución del sitio activo que soporta esta
actividad biológica. Estos resultados se deben, sin embargo,
considerar con muchos matices: es por ejemplo posible que este
aminoácido no intervenga directamente en el sitio activo de la
actividad biológica, sino que tome parte en las actividades
adjuntas, tal como el direccionamiento intracelular de la proteína
por ejemplo. Por otra parte, es posible que la modificación
introducida desestabilice el conjunto de la proteína, siendo el
efecto de la sustitución introducida entonces indirecta y no
directa. Por estas dos razones, es importante saber reconocer sobre
un gen codificador para una proteína los restos que soportan las
actividades de direccionamiento, de localización membranal, de
enlace de cofactores … Por otra parte, es esencial que las
modificaciones introducidas inducen lo menos posible la
desestabilización la proteína. A menudo, son pequeños aminoácidos
hidrófobos, la Alanina o la Valina, que se introducen en sustitución
de los aminoácidos de origen. Estos pequeños aminoácidos se conocen
para conservar la mayoría de las estructuras secundarias proteicas
(Hélice \alpha u hoja \beta), y por lo tanto, para minimizar las
desestabilizaciones globales de las proteínas.
Los trabajos realizados en este ámbito implican
la creación de un gran número de mutantes puntuales que llevan,
cada uno, una sustitución diferente de un aminoácido de la proteína
por una alanina. Estos trabajos necesitan un volumen de trabajo muy
importante, debiendo cada mutante ser realizado
independientemente.
\newpage
Existen excepciones en los casos generales
anteriormente presentados. La mutagénesis dirigida se utilizó en el
contexto de la búsqueda de una ganancia de actividad. En el caso en
que la región del sitio activo se conoce bien, se puede en efecto
esperar que la modificación dirigida de los aminoácidos el
constituyente es susceptible de implicar una mejora de la
actividad. Así, se propone en la solicitud de patente europea nº
527809 sustituir secuencialmente los aminoácidos, de una región
activa por un aminoácido frecuentemente implicado en los sitios
activos (la serina por ejemplo) utilizando una técnica vinculada con
la mutagénesis dirigida. Esta técnica presupone sin embargo
disponer de informaciones precisas que se refieren al sitio activo
de la molécula estudiada, y utiliza una tecnología que no permite
introducir un gran número de modificaciones sobre un fragmento de
ADN.
A la inversa, se realizaron algunas experiencias
de mutagénesis aleatoria en un contexto de búsqueda de pérdida de
actividad (Loeb et al, 1989, Nature, 340 : 397). En este
caso, numerosos clones se deben analizar para obtener resultados
concordantes y así liberarse de los límites establecidos por la
sustitución aleatoria.
La presente invención es una técnica intermedia
entre la mutagénesis dirigida y la mutagénesis aleatoria. En
efecto, su objeto no es como en el caso de la mutagénesis dirigida
simple de obtener un único producto al final de la reacción que
contiene la o las mutaciones deseadas, sino de obtener una mezcla de
moléculas que contienen, cada una, una o varias de las mutaciones
deseadas. El objeto del procedimiento objeto de la presente
invención no es tampoco introducir a nivel de una posición dada
cualquier sustitución, tal como en el caso de la mutagénesis
aleatoria, sino al contrario de introducir un tipo de sustitución
particular y predefinido.
Este procedimiento combina así las ventajas de
la mutagénesis dirigida (control de la naturaleza de las
modificaciones obtenidas en una posición dada), y de la mutagénesis
aleatoria (obtención de un gran número de mutaciones diferentes
distribuidos sobre numerosas posiciones del fragmento de ADN que se
debe mutar). Permite realizar en un tiempo muy corto un gran número
de mutaciones dirigidas.
Estos objetivos se alcanzan según la invención
gracias a un procedimiento de mutagénesis de un gen diana que
consiste en preparar una serie de N oligonucleótidos de secuencia
sustancialmente complementaria de al menos una región del gen
diana, luego en hacer reaccionar dicha serie de oligonucleótido con
dicho gen diana en condiciones que permiten la producción de copias
del gen diana que lleva al menos una mutación. El gen diana es
llevado por un plásmido circular de doble hebra. Cada
oligonucleótido presente una secuencia complementaria de una
diferente región del gen diana y al menos una mutación colocada en
el centro de la secuencia del oligonucleótido. El conjunto N de
dichos oligonucleótidos de la serie, con N superior a 5, cubre la
totalidad o parte de la secuencia de dicho gen diana. Se hace a
continuación reaccionar dicha serie de oligonucleótidos con el gen
diana en presencia de una polimerasa de tal modo que genere un banco
de genes mutados donde cada mutación procedente de un
oligonucleótido diferente está presente en término medio en menos de
1/5 parte de los genes del banco.
El procedimiento de la invención es notable
porque se disocia la dificultad unida a la posición de la mutación
y la unida a su naturaleza; es por ejemplo posible realizar
mutaciones de un tipo particular (por ejemplo cualquier codón hacia
Alanina) sobre toda una secuencia codificadora. En este ejemplo,
cada uno de los mutantes obtenidos al final de la reacción contiene
una o varias mutaciones de naturaleza conocida (codón alanina),
pero de posición no conocida. A la inversa, el procedimiento de la
invención permite incorporar sobre algunas posiciones particulares
oligonucleótidos que contienen bases degeneradas. En este ejemplo,
las posiciones son relativamente conocidas (el número de posiciones
es limitado), y la naturaleza de las mutaciones introducidas es
desconocida.
Estas características contrastan con respecto a
las técnicas de mutagénesis aleatoria, donde ni la naturaleza ni la
posición de las mutaciones se conocen, y la mutagénesis dirigida
clásica, donde la naturaleza y la posición de la mutación
introducida son, conocidas.
El procedimiento de la invención es igualmente
notable por el hecho de que al final de la reacción de mutagénesis,
se dispone de un gran número de moléculas de ADN diferentes,
constituyendo, por lo tanto, un banco. Estas moléculas corresponden
a todas las moléculas de ADN que hayan incorporado al menos una
mutación en los sitios previamente señalados. El número de
moléculas mutantes diferentes es muy importante ya que todas las
combinaciones de mutaciones son posibles.
El procedimiento de mutagénesis según la
invención se puede igualmente aplicar a un banco de genes mutados.
Se utiliza este banco entonces como matriz en lugar del gen diana.
Se prepara una serie de N oligonucleótidos de secuencia
sustancialmente complementaria de al menos una región de los genes
mutados dianas, luego se hace reaccionar dicha serie de
oligonucleótidos con dichos genes mutados dianas en condiciones que
permiten la producción de copias de los genes mutados dianas que
llevan al menos una mutación. Los genes mutados dianas se llevan
por plásmidos circulares de doble hebra, y cada oligonucleótido
presenta una secuencia complementaria de una diferente región de
los genes mutados dianas y al menos una mutación colocada en el
centro de la secuencia del oligonucleótido, el conjunto N de dichos
oligonucleótidos de la serie, con N superior a 5, cubre la totalidad
o parte de la secuencia de dichos genes mutados dianas. Se hace a
continuación reaccionar dicha serie de oligonucleótidos con los
genes mutados dianas en presencia de una polimerasa de tal modo que
genere un banco de genes mutados donde cada mutación procedente de
un oligonucleótido diferente está presente en término medio en menos
de 1/5 de los genes del
banco.
banco.
\newpage
Otra aplicación del procedimiento según la
invención consiste en que el banco de genes mutados dianas utilizado
como matriz fue previamente obtenido por el procedimiento de
mutagénesis masiva. El número medio de mutaciones por molécula
aumenta con el número de vueltas en mutagénesis masiva
realizadas.
Según una forma ventajosa de realización del
procedimiento de la invención, N está comprendido entre 5 y 10^{6}
y preferentemente entre 50 y 500, y cada mutación procedente de un
oligonucleótido diferente está presente en término medio entre 1/5
y 1/10^{6} y preferentemente entre 1/50 y 1/500 de los genes del
banco.
El procedimiento de la invención prevé muy
especialmente el caso donde la serie de oligonucleótidos comprende
N oligonucleótidos diferentes y donde cada mutación procedente de un
oligonucleótido diferente está presente en término medio
aproximadamente 1/N de los genes del banco, con N teniendo el valor
citado más arriba.
Esta característica distingue el procedimiento
de la invención del estado de la técnica anterior, donde los
ejemplos de mutagénesis múltiple que utiliza simultáneamente varios
oligonucleótidos se basan, al contrario, sobre tasas de
incorporación de cada oligonucleótido superior a 75%. En efecto,
estas aproximaciones tienen por objetivo aislar solamente el
mutante que haya incorporado todos los oligonucleótidos, y las
elevadas tasas de incorporación permiten fácilmente llegar a este
objetivo. Al contrario, en el procedimiento según la invención, la
frecuencia de mutación al nivel de cada una de las mutaciones que se
deben introducir se controla de tal manera para no obtener
moléculas de ADN que contienen un excesivo número de mutaciones. El
objetivo consiste en disponer de mutantes que contienen cada una
una mutación o una combinación de algunas mutaciones diferentes.
Para ello, la relación entre la cantidad de cada oligonucleótido
mutante y la cantidad de matriz que se debe mutar se debe
controlar. Está relación está comprendida entre 0,01 y 100, y
preferentemente entre 0,1 y 10 según los casos.
La reacción entre la serie de oligonucleótidos
con el gen diana o con el banco de genes mutados dianas se puede
realizar con distintos tipos de polimerasa, ventajosamente
termoestables. Un primer modo de realización consiste en utilizar
una polimerasa que tiene una actividad de desplazamiento de hebra
tal como la Taq polimerasa, o una actividad exonucleásica 3'
\rightarrow 5' tal como la Pfu polimerasa. En este modo de
realización, la reacción puede comprender la presencia de una
ligasa. Un segundo modo de realización consiste en utilizar una
polimerasa que no tiene actividad de desplazamiento de hebra o
exonucleásica 3' \rightarrow 5' tal como la T4 polimerasa, y en
este caso la reacción se realiza en ausencia de ligasa.
Los oligonucleótidos de la serie tienen un
tamaño comprendido entre 10 y 100 y preferentemente entre 15 y 25
nucleótidos. Cada uno de ellos es homólogo de una parte de la
secuencia de ADN que debe mutar, con exclusión de una o de algunas
posiciones localizadas en su parte interna, que constituyen la o las
mutaciones que se deben introducir. Estos oligonucleótidos pueden
estar solapados, es decir, comprender secuencias comunes de dos
regiones diferentes adyacentes. Los oligonucleótidos son
preferentemente todos con la misma orientación, de tal modo que una
única hebra del gen diana se replique, lo que permite obtener una
tasa de mutagénesis baja.
En un modo de realización particular, los
oligonucleótidos se reconstruyen a partir de dos oligonucleótidos,
según el procedimiento descrito en la patente de EE.UU. nº
5.858.731.
Ventajosamente, cada oligonucleótido comprende 1
o varias mutación(ones) y preferentemente de 1 a 3
mutación(ones) colocada(s) en el centro de su
secuencia.
Dichas mutaciones de cada oligonucleótido se
pueden elegir entre deleciones y/o inserciones de uno o varios
nucleótido(s).
Una forma particular de mutaciones consiste en
utilizar oligonucleótidos degenerados. Es decir cada oligonucleótido
de la serie está presente en varios ejemplares, poseyendo cada
ejemplar un nucleótido diferente a nivel de la o de dichas mutación
(ones).
Otra forma particular de mutación consiste en
que cada mutación es del tipo que permite introducir un codón
idéntico en cada oligonucleótido o un codón que corresponde al mismo
aminoácido, en sustitución del codón original del gen diana.
Ventajosamente, dicho codón corresponde a un aminoácido elegido en
el grupo que comprende Ala, Val, Gly, Leu, lle.
El procedimiento de la invención se puede
describir más precisamente con la ayuda de las siguientes
etapas:
- -
- Se prepara la matriz, preferentemente un plásmido que contiene el o los fragmentos de ADN que se deben mutar.
- -
- Se sintetizan los oligonucleótidos mutantes diferentes preferentemente entre 5 y 10^{6}, y más preferentemente entre 50 y 500, luego se mezcla el conjunto de los oligonucleótidos mutantes. La concentración final de cada uno de los oligonucleótidos en la mezcla es así dividida durante esta etapa por el número de oligonucleótidos.
- -
- Se les añade a la matriz, es decir, al plásmido que contiene el o los fragmentos de ADN que deben mutar, a una concentración de tal modo que la relación entre el número de moléculas de matriz y el número de moléculas de cada uno de los oligonucleótidos mutantes este comprendida entre 0,01 y 100, y preferentemente entre 0,1 y 10.
- -
- Se desnaturaliza la matriz por el calor (aproximadamente 95°C), de tal modo que disponga temporalmente de ADN de simple hebra. Durante la vuelta a una temperatura más baja, algunos o todos oligonucleótidos presentes en la mezcla se fijan en la matriz a nivel de su sitio de homología.
- -
- Se añaden todos los elementos necesarios para a realizar una replicación de la matriz a partir de los oligonucleótidos mutantes, y, en particular, una polimerasa, permitiendo el tampón su actividad, de los nucleótidos trifosfatos en cantidad suficiente, los eventuales cofactores necesarios. La reacción de replicación tiene a continuación lugar en las condiciones de temperatura que corresponden a la actividad máxima de la polimerasa. Eventualmente, una ligasa se puede añadir en la etapa de replicación, de tal modo que las hebras de ADN neosintetizadas se liguen a nivel del extremo 5' de otro oligonucleótido, unido sobre la matriz en 3' del primero. En este caso, los oligonucleótidos son previamente fosforilados.
- -
- Eventualmente, se repiten las etapas de desnaturalización y de replicación varias veces. En este caso, es preferible que la polimerasa sea termoestable, con el fin de evitar la necesidad de añadir enzima en cada ciclo. Al final de esta reacción, las moléculas de ADN presentes en la mezcla son de varios tipos:
- -
- Por una parte, permanece la matriz inicial de doble hebra que no ha sido eficazmente replicada,
- -
- Por otra parte, una parte de las moléculas fue replicada, es decir que contienen una hebra de origen y una hebra neosintetizada a partir de una o de varios cebadores que constituyen los oligonucleótidos mutantes.
- -
- Se somete la mezcla obtenida a la digestión por la enzima DpnI, u otra enzima de restricción que permite suprimir las moléculas de ADN metiladas sobre las dos hebras y conservar las que no son metiladas o hemi-metiladas.
- -
- Se transforman bacterias competentes por la mezcla precedente, se extienden a continuación estas bacterias sobre un medio que contiene un agente selectivo de tal modo que se seleccionen las bacterias que integran un plásmido. Se eliminan las moléculas de ADN que hayan sido escindidas en la etapa anterior ya que la presencia de un plásmido circular completo es indispensable para la supervivencia de la bacteria en medio selectivo.
- -
- Se toman muestras individualmente de las colonias bacterianas obtenidas y se utilizan para sembrar un medio nutritivo selectivo. Se realiza a continuación una preparación de ADN plásmido de estos cultivos con el fin de aislar una gran cantidad de ADN plásmido potencialmente mutante. Un examen de las distintas moléculas de ADN plásmidos en esta fase permite calcular la tasa media de incorporación de cada oligonucleótido, y verificar que ésta es cercana al valor buscado.
- -
- Eventualmente, se ensaya la actividad biológica que corresponde a los distintos lotes de preparaciones plásmidas mutantes. La actividad medida puede ser superior a la del fragmento no mutado, igual, o inferior. En el caso en que la actividad es modificada, el plásmido correspondiente es secuenciado de tal modo que pueda localizar la posición de la mutación introducida. En un modo de realización preferido, se ensaya la actividad biológica que corresponde a las moléculas mutantes, y se compara esta medida con la de la actividad biológica que corresponde a la molécula de ADN plásmido no mutada. Cuando la observación de estas medidas evidencia una diferencia significativa, las moléculas mutantes están secuenciadas con el fin de poner de relieve la posición de la mutación en el origen de esta modificación de actividad. El orden de estas dos últimas etapas se invierte con respecto a las técnicas habituales de mutagénesis dirigida, que implican generalmente la obtención y la comprobación de la molécula mutante previo al ensayo de su actividad biológica.
Así, una forma de realización del procedimiento
de mutagénesis según la invención comprende las siguientes
etapas:
- a)
- se prepara una matriz constituida de un plásmido que contiene el gen diana o el banco de genes mutados dianas y un gen de resistencia,
- b)
- se prepara una serie equimolecular de oligonucleótidos que presentan una secuencia complementaria de una región diferente del gen diana o el banco de genes mutados dianas y al menos una mutación colocada en el centro de la secuencia del oligonucleótido, cubriendo el conjunto de los oligonucleótidos de la serie la totalidad o parte de la secuencia de dicho gen diana,
- c)
- se mezcla la serie de oligonucleótidos preparada en la etapa (b) con el plásmido de la etapa (a) según una relación molar de cada oligonucleótido con respecto al plásmido comprendida entre 0,01 y 100 y preferentemente entre 0,1 y 10,
\newpage
- d)
- se desnaturaliza la mezcla de la etapa (c) por la temperatura de tal modo que se obtenga una matriz de simple hebra,
- e)
- se somete la mezcla de la etapa (d) a una temperatura que permite la hibridación de los oligonucleótidos sobre la matriz,
- f)
- se añade a la mezcla al menos una polimerasa, su tampón y sus cofactores, y una cantidad suficiente de cada uno de los nucleótidos trifosfatos, para permitir la replicación de las hebras de la matriz a partir de una cualquiera de los oligonucleótidos,
- g)
- eventualmente se repiten las etapas (d), (e) y (f),
- h)
- se seleccionan mediante cualquier medio apropiado los productos de la etapa (f) o (g) que hayan sido sometidos a la replicación,
- i)
- se transforman los productos seleccionados en la etapa (h) en bacterias competentes, y se seleccionan los productos que llevan un plásmido sobre un medio selectivo que corresponde a un gen de resistencia llevado por el plásmido de la etapa (a).
Ventajosamente, la etapa (h) anteriormente
mencionada consiste en someter los productos de la etapa (f) a la
acción de una enzima de restricción que selecciona los productos que
hayan sido sometidos a la replicación, tal como la enzima DpnI.
Los oligonucleótidos se pueden fosforilar en su
extremo 5' cuando en la etapa (f) se añade una ligasa,
ventajosamente una ligasa termoestable.
El procedimiento de mutagénesis según la
invención es especialmente útil para medir la actividad biológica
de las proteínas mutadas codificadas por los genes dianas mutados.
En consecuencia, el gen diana es una molécula de ácido nucléico
codificador de una proteína de interés con o sin sus propias
secuencias de regulación. Si el gen diana no comprende las
secuencias de regulación, tal como un promotor, éstas están
presentes a nivel del plás-
mido.
mido.
Por lo tanto, la invención se refiere también a
un procedimiento de mutagénesis de una proteína diana o de un banco
de proteínas mutadas dianas, caracterizado porque comprende la
preparación de un banco de expresión de genes mutados a partir de
un gen diana codificador para dicha proteína según el procedimiento
de mutagénesis descrito anteriormente, luego la expresión de dichos
genes mutados para producir un banco de proteínas mutadas, y
eventualmente el cribado de dichas proteínas mutadas para una
función deseada, ventajosamente con respecto a la proteína
diana.
diana.
Por lo tanto, la invención permite la
realización de un procedimiento de selección de proteínas mutadas
que presentan una actividad modificada con respecto a la misma
proteína no mutada, o del gen mutado que corresponde a dicha
proteína mutada, que comprende un procedimiento de mutagénesis
citado más arriba, luego después del cribado de dichas proteínas
mutadas para una función deseada, ventajosamente con respecto a la
proteína diana, presentando la selección de la proteína mutada la
función deseada, y eventualmente el secuenciado del gen mutado que
corresponde a dicha proteína mutada.
Estos procedimientos de mutagénesis de una
proteína diana o de un banco de proteínas mutadas dianas o de
selección de una proteína mutada o del gen que corresponde según la
invención se caracterizan porque comprenden la preparación de un
banco de expresión de genes mutados a partir de un gen diana
codificador de dicha proteína, luego las siguientes etapas:
- j)
- se incuba el medio selectivo a la temperatura adecuada durante el tiempo suficiente al crecimiento de colonias bacterianas individuales,
- k)
- se siembran cultivos de bacterias individuales a partir de las colonias de la etapa (j),
- l)
- se efectúan preparaciones de ADN plásmido de los cultivos de la etapa (k),
- m)
- se mide la actividad biológica asociada a cada preparación de ADN plásmido de la etapa (1) y se compara el resultado obtenido con respecto al medido utilizando el ADN plásmido no mutado.
- n)
- eventualmente, se secuencian las preparaciones de ADN plásmido que hayan permitido observar modificaciones significativas de la actividad biológica.
\newpage
La invención tiene igualmente por objeto una
serie de oligonucleótidos mutados con respecto a un gen diana o al
banco de genes mutados dianas tal como se define anteriormente.
La invención tiene también por objeto un banco
de genes mutados susceptibles de ser obtenido por un procedimiento
descrito anteriormente caracterizado porque cada mutación diferente
está presente en término medio en menos de 1/5 parte de los genes
del banco y preferentemente en término medio en aproximadamente 1/N
partes de los genes del banco, con N superior a 5, preferentemente
con N comprendido entre 5 y 10^{6} y muy preferentemente con N
comprendido entre 50 y 500. Preferentemente, este banco se obtiene,
de acuerdo con el procedimiento de la invención, gracias al empleo
de N oligonucleótidos con N superior a 5, preferentemente con N
comprendido entre 5 y 10^{6} y muy preferentemente con N
comprendido entre 50 y 500.
Otras ventajas y características de la invención
aparecerán en los ejemplos que siguen y dibujos adjuntos en los
cuales:
La figura 1 representa una repartición de los
oligonucleótidos mutantes sobre la secuencia de la molécula CD4.
Cada uno de los oligonucleótidos contiene tres mutaciones como
máximo, representadas aquí por el fragmento de la línea de la
flecha, localizadas en su centro, destinadas a cambiar el codón
pretendido en Alanina. Los oligonucleótidos se solapan los unos con
los otros, y están representados aquí sobre tres niveles como medida
de claridad. En el ejemplo de la figura 1, solamente 24
oligonucleótidos mutantes están representados. En el ejemplo 1
siguiente, 95 oligonucleótidos se han utilizado simultáneamente. En
este ejemplo, los oligonucleótidos que llevan las mutaciones son
todos de la misma orientación.
La figura 2 es un resumen esquemático de las
etapas del procedimiento de mutagénesis según la invención a partir
de los oligonucleótidos mutantes de la figura 1. Las mutaciones en
las moléculas de ADN están representadas por una barra vertical.
Las letras significan:
- -
- (a) polimerización (polimerasa, dNTP, Tampón y cofactores);
- -
- (b) digestión por DpnI para eliminar las matrices iniciales;
- -
- (c) transformación de bacterias competentes después de la extensión sobre medio selectivo;
- -
- (d) siembra de cultivos bacterianos a partir de las colonias aisladas después de la preparación de ADN plásmido.
- -
- (e) ensayo fenotípico después de la selección y secuenciado de los mutantes que tienen el fenotipo buscado.
La figura 3 representa un ejemplo de
construcción de oligonucleótidos mutantes a partir de
semi-oligonucleótidos que comprende una ligación
por la T4 ligasa.
La figura 4 da ejemplos de representación
esquemática de los oligonucleótidos que contienen bases degeneradas
a nivel de los puntos de mutación. La letra N significa que una
cualquiera de las 4 bases puede estar presente en este lugar. Así,
el oligonucleótido en cuestión está realmente constituido por una
mezcla de 4^{N} especies moleculares.
Ejemplo
1
Se introdujo un gen codificador de la molécula
CD4 en el vector SK+. Los 95 primeros codones de este gen fueron la
diana de una reacción de mutagénesis masiva según la técnica de la
invención.
Para ello, se sintetizó una serie de 95
oligonucleótidos de 21 bases. Cada uno de estos oligonucleótidos era
complementario de una secuencia del gen CD4 centrada sobre un
codón. Así, el primer oligonucleótido era homólogo de una secuencia
centrada en el codón 1. Era perfectamente homólogo a 9 bases de cada
lado de dicho codón, y contenía 3 mutaciones, destinadas a
transformar el primer codón en codón Alanina (Figura 1).
Del mismo modo, el segundo oligonucleótido fue
centrado en el segundo codón y contenía tres mutaciones adyacentes
en su medio.
Los 95 oligonucleótidos, solapados entre sí y
todos con la misma orientación, se mezclaron a continuación de
manera equimolar y fosforilados utilizando la quinasa de T4 en
condiciones normales de utilización.
La reacción siguiente se realizó a
continuación:
| Matriz SK-CD4 (250 \mug/\mul): | 1 \mul |
| MIX de los 95 oligonucleótidos 5' P (0,5 \muM cada uno) | 2 \mul |
| dNTP Trifosfatos (2,5 mM) | 10 \mul |
| Tampón 10X de Pfu Polimerasa | 2,5 \mul |
| ATP 10 mM | 0,5 \mul |
| Pfu Polimerasa (2,5 U/\mul) | 1 \mul |
| Pfu Ligasa (4 U/\mul) | 1 \mul |
| H_{2}O | 7 \mul |
| Total | \overline{25 \ \mu l} |
Se someta la mezcla a una reacción de 12 ciclos
de temperaturas [(94°C, 1'); (35°C, 1'); (68°C, 20')].
La mezcla de la reacción ha sido sometida a
continuación a una digestión por 5 unidades de la enzima DpnI en
condiciones de tampón adaptadas, durante 30' a 37°C.
Algunas bacterias competentes fueron
transformadas por esta mezcla utilizando un protocolo de choque
térmico, y fueron extendidas sobre una placa de Petri que contiene
el agente selectivo.
El día siguiente, se obtuvo miles de
bacterias.
En la figura 2 se presenta un esquema que resume
las etapas de la técnica.
En esta fase, se realizó un ensayo estadístico
de algunas moléculas de ADN del banco para medir la tasa de
integración de las mutaciones, es decir, la sustitución de uno de
los 95 codones por un codón Alanina. Este examen revelaba que la
frecuencia de incorporación de cada oligonucleótido fue próximo a
1%, lo que ha sido en este caso el valor buscado (1/N con N =
95).
Las moléculas mutantes fueron ampliadas a
continuación por cultivo bacteriano y preparación de ADN plásmido.
Cada uno de los lotes de ADN plásmido, que corresponde a un único
tipo de molécula mutante, se utilizó para transfectar las células
eucariotas, y éstas fueron ensayadas para el mantenimiento o la
pérdida de los epítopos llevados por la molécula CD4, siendo esta
actividad medida por el enlace de un anticuerpo
anti-CD4.
Ejemplo
2
Se reconstruyó una serie de 11 oligonucleótidos
a partir de dos semi-oligonucleótidos de doble
hebra. La ligación de los dos semi-oligonucleótidos
fue efectuada por una reacción que utilizaba la T4 ligasa. Estando
solo uno de los dos semi-oligonucleótidos
fosforilado a nivel de uno de sus extremos 5', esta reacción tuvo
como efecto permitir la obtención de un único oligonucleótido
completo, compuesto de 18 bases (8 de cada lado perfectamente
homólogos, y dos en su medio invariablemente constituidas a los
nucleótidos GT (figura 3).
Estas mutaciones, destinadas a sustituir a los
dos primeros nucleótidos de cualquier codón, permiten sustituir a
este codón por un codón Valina. En efecto, estando el código
genético degenerado, los codones valina se pueden escribir bajo la
forma GTN, donde N representa una cualquiera de las cuatro
bases.
Una vez obtenidos estos 11 oligonucleótidos
reconstruidos, homólogos a 11 regiones distintas de la molécula
CD4, pero llevando la misma mutación (cambio en Valina), por otra
parte, orientados en el misma sentido, el protocolo era idéntico al
expuesto en el ejemplo 1.
Se buscó una frecuencia media de incorporación
de los oligonucleótidos mutantes de aproximadamente 9% (1/11) en
este ejemplo.
Ejemplo
3
Una vez conocidos los aminoácidos que forman
parte directamente en el sitio activo de una proteína, por ejemplo
gracias a datos de mutagénesis masiva tal como se presenta en los
ejemplos anteriores, estos aminoácidos se pueden someter a una
mutagénesis masiva de saturación, es decir, que pretende introducir
un gran número de codones diferentes en sustitución de un codón
particular. Así, 6 codones del gen codificador para la proteína
agaB, enzima implicada en la síntesis de los azúcares, se identificó
como que forma parte directamente de la actividad de la enzima.
Se sintetizaron seis oligonucleótidos centrados
en estos codones. Por cada lado, eran completamente homólogos de 9
bases de la secuencia. A nivel de los dos primeros nucleótidos de
los codones que se deben mutar, la secuencia salvaje fue sustituida
por la secuencia NN (figura 4). De esta forma, cada uno de los 6
codones podía ser sustituido por distintos codones específicos de
otros aminoácidos.
Una vez obtenidos estos oligonucleótidos, la
reacción de mutagénesis masiva era idéntica a la descrita en el
ejemplo 1.
Se buscaba una frecuencia media de incorporación
de los oligonucleótidos mutantes de aproximadamente 17% (1/6) en
este ejemplo.
Estas moléculas de ADN plásmido estaban
destinadas a ser cribadas de tal modo que midieran un aumento de la
actividad de la enzima.
Este ejemplo, aunque no utiliza más que un
número reducido de oligonucleótidos mutantes que contienen bases
degeneradas, demuestra la viabilidad de la adaptación de la técnica
de la invención en la mutagénesis de naturaleza aleatoria (cambio
de un codón en un gran número de otros codones) pero de posiciones
determinadas.
Ejemplo
4
Los genes contienen generalmente codones que son
desfavorables a la expresión de las proteínas para las cuales están
codificados. Estos codones desfavorables se pueden ver como un
mecanismo de regulación de la expresión de un gen. Estos codones
desfavorables se identifican relativamente bien, y puede ser
necesario modificarlos en un codón más favorable a la expresión de
la proteína pero que no induce cambio de aminoácido.
Por regla general, aproximadamente el 5% de los
codones de un gen son desfavorables, y limitan el nivel de
expresión de la proteína correspondiente. La modificación de estos
codones puede permitir la obtención de mejores niveles de expresión
del gen durante la producción "in vitro" de la proteína
correspondiente.
No obstante, la modificación simultánea de todos
los codones no permite obtener esta mejora del nivel de expresión,
probablemente a causa de la desestabilización general de la
secuencia por un excesivo número de modificaciones.
Los mejores niveles de expresión se obtienen a
menudo cuando se modifican una parte solamente de los codones
desfavorables.
En este caso, se puede realizar un banco de
mutaciones que llevan sobre estos codones desfavorables utilizando
la técnica de la invención, y se seleccionan entonces las moléculas
mutantes que presentan las mejores tasas de expresión. Para ello,
se debe sintetizar un oligonucleótido mutante para cada codón
desfavorable, estando las mutaciones llevadas por estos
oligonucleótidos definidas por el hecho de que cambian un codón
desfavorable a la expresión en codón que le es favorables, sin
cambiar la secuencia primaria de la proteína correspondiente.
En este contexto, la frecuencia media de
incorporación de los oligonucleótidos mutantes se puede buscar en
una horquilla relativamente amplia, por ejemplo entre 1 y 20%. En
efecto, no se conoce el número de mutaciones simultáneas que
permite la obtención del mejor nivel de expresión. En este contexto,
varios bancos que corresponde a frecuencias de incorporación
diferentes pueden ser realizados. Para realizar estos bancos que
tienen tasas de mutaciones diferentes, es posible bien sea realizar
el procedimiento descrito utilizando concentraciones variables de
oligonucleótidos, o bien realizar varias veces seguidas el
procedimiento de mutagénesis masiva, es decir, utilizar el banco de
mutantes producido durante una primera etapa de mutagénesis masiva
como matriz de una segunda etapa de mutagénesis masiva.
El procedimiento es similar al presentado en el
ejemplo 1. Las moléculas mutantes se criban a continuación según el
criterio de su nivel de expresión: se seleccionan las moléculas que
presentan los mejores niveles de expresión.
Claims (23)
1. Procedimiento de mutagénesis de un gen diana,
que consiste en preparar una serie de N oligonucleótidos,
presentando cada oligonucleótido una secuencia complementaria de una
región diferente del gen diana y de una a tres mutaciones colocadas
en el centro de la secuencia del oligonucleótido, luego en hacer
reaccionar dicha serie de oligonucleótidos con dicho gen diana en
condiciones que permiten la producción de copias del gen diana que
lleva al menos una mutación, caracterizado porque el gen
diana es llevado por un plásmido circular de doble hebra, el
conjunto N de dichos oligonucleótidos de la serie, con N superior a
5, cubriendo la totalidad o parte de la secuencia de dicho gen
diana, y porque se hace reaccionar dicha serie de oligonucleótidos
con el gen diana en presencia de una polimerasa de tal modo que
genere después de la selección por una enzima de restricción que
permite suprimir las moléculas de ADN metiladas sobre las dos hebras
y conservar las que no están metiladas o
hemi-metiladas, un banco de genes mutados donde cada
mutación procedente de un oligonucleótido diferente está presente
en término medio en menos de 1/5 de los genes del banco.
2. Procedimiento de mutagénesis de un banco de
genes mutados dianas, que consiste en preparar una serie de N
oligonucleótidos, presentando cada oligonucleótido una secuencia
complementaria de una región diferente de los genes mutados dianas
y de una a tres mutaciones colocadas en el centro de la secuencia
del oligonucleótido, luego en hacer reaccionar dicha serie de
oligonucleótidos con dichos genes mutados dianas en condiciones que
permiten la producción de copias de los genes dianas que llevan al
menos una mutación, caracterizado porque los genes mutados
dianas se llevan por plásmidos circulares de doble hebra, el
conjunto N de dichos oligonucleótidos de la serie, con N superior a
5, cubriendo la totalidad o parte de la secuencia de dichos genes
mutados dianas, y porque se hace reaccionar dicha serie de
oligonucleótidos con los genes mutados dianas en presencia de una
polimerasa de tal modo que genere después de la selección por una
enzima de restricción que permite suprimir las moléculas de ADN
metiladas sobre las dos hebras y conservar las que no están
metiladas o hemi-metiladas, un banco de genes
mutados donde cada mutación procedente de un oligonucleótido
diferente está presente en término medio en menos de 1/5 de los
genes del banco.
3. Procedimiento de mutagénesis según la
reivindicación 2, en el cual el banco de genes mutados dianas se
obtuvo según el procedimiento de la reivindicación 1.
4. Procedimiento de mutagénesis según las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque N está
comprendido entre 5 y 10^{6}, y porque cada mutación procedente
de un oligonucleótido diferente está presente en término medio en
entre 1/5 y 1/10^{6}.
5. Procedimiento de mutagénesis según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado
porque la serie de oligonucleótidos comprende N oligonucleótidos
diferentes y porque cada mutación procedente de un oligonucleótido
diferente está presente en término medio en aproximadamente 1/N de
los genes del banco.
6. Procedimiento de mutagénesis según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado
porque se hace reaccionar la serie de oligonucleótidos con el gen
diana o el banco de genes mutados dianas según una relación molar
de cada oligonucleótido con respecto al gen diana o al banco de
genes mutados dianas comprendido entre 0,01 y 100.
7. Procedimiento de mutagénesis según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado
porque se hace reaccionar la serie de oligonucleótidos con el gen
diana o el banco de genes mutados dianas en presencia de una
polimerasa que tienen una actividad de desplazamiento de hebra tal
como la Taq polimerasa o una actividad exonucleásica 3'
\rightarrow 5' tal como el Pfu polimerasa.
8. Procedimiento de mutagénesis según la
reivindicación 7, caracterizado porque se hace reaccionar la
serie de oligonucleótidos con el gen diana o el banco de genes
mutados dianas en presencia de una polimerasa que tiene una
actividad de desplazamiento de hebra o una actividad exonucleásica
3' \rightarrow 5' y una ligasa.
9. Procedimiento de mutagénesis según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado
porque se hace reaccionar la serie de oligonucleótidos con el gen
diana o el banco de genes mutados dianas en presencia de una
polimerasa que no tiene actividad de desplazamiento de hebra o
actividad exonucleásica 3' \rightarrow 5', tal como la T4
polimerasa, y en ausencia de ligasa.
10. Procedimiento de mutagénesis según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado
porque los oligonucleótidos de la serie se solapan o no y presentan
un tamaño comprendido entre 10 y 100.
11. Procedimiento de mutagénesis según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado
porque cada oligonucleótido comprende de 1 a 3
mutación(ones) colocada(s) en el centro de su
secuencia.
12. Procedimiento según una cualquier de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las
mutaciones de cada oligonucleótido se eligen entre deleciones y/o
inserciones de uno o varios nucleótido(s).
13. Procedimiento de mutagénesis según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado
porque cada oligonucleótido de la serie está presente en varios
ejemplares, poseyendo cada ejemplar un nucleótido diferente a nivel
de la o de dichas mutación(ones).
14. Procedimiento de mutagénesis según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado
porque cada mutación es del tipo que permite introducir un codón
idéntico en cada oligonucleótido o un codón que corresponde al
mismo aminoácido, en sustitución del codón original del gen
diana.
15. Procedimiento de mutagénesis según la
reivindicación 14, caracterizado porque dicho codón
corresponde a un aminoácido elegido de entre el grupo que comprende
Ala, Val, Gly, Leu, lle.
16. Procedimiento de mutagénesis según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado
porque comprende las siguientes etapas:
- a)
- se prepara una matriz constituida de un plásmido que contiene el gen diana o el banco de genes mutados dianas y un gen de resistencia,
- b)
- se prepara una serie equimolecular de oligonucleótidos que presentan una secuencia complementaria de una región diferente del gen diana o del banco de genes mutados dianas y al menos una mutación colocada en el centro de la secuencia del oligonucleótido, cubriendo el conjunto de los oligonucleótidos de la serie la totalidad o parte de la secuencia de dicho gen diana o de dicho banco de genes mutados dianas,
- c)
- se mezcla la serie de oligonucleótidos preparada en la etapa (b) con el plásmido de la etapa (a) según una relación molar de cada oligonucleótido con respecto al plásmido comprendida entre 0,01 y 100,
- d)
- se desnaturaliza la mezcla de la etapa (c) por la temperatura de tal modo que se obtenga una matriz de simple hebra,
- e)
- se somete la mezcla de la etapa (d) a una temperatura que permite la hibridación de los oligonucleótidos sobre la matriz,
- f)
- se añade a la mezcla una polimerasa, su tampón y sus cofactores, y una cantidad suficiente de cada uno de los nucleótidos trifosfatos, para permitir la replicación de las hebras de la matriz a partir de uno cualquier de los oligonucleótidos,
- g)
- eventualmente se repiten las etapas (d), (e) y (f),
- h)
- se seleccionan mediante cualquier medio apropiado los productos de la etapa (f) o (g) que hayan sido sometidos a la replicación,
- i)
- se transforman los productos seleccionados en la etapa (h) en bacterias competentes, y se seleccionan los productos que llevan un gen mutado sobre un medio selectivo que corresponde a un gen de resistencia llevado por el plásmido de la etapa (a).
17. Procedimiento de mutagénesis según la
reivindicación 16, caracterizado porque la etapa (h) consiste
en someter los productos de la etapa (f) a la acción de una enzima
de restricción que selecciona los productos que hayan sido
sometidos a la replicación.
18. Procedimiento de mutagénesis según la
reivindicación 17, caracterizado porque la enzima de
restricción que selecciona los productos que hayan sido sometidos a
la replicación es la enzima DpnI.
19. Procedimiento de mutagénesis según una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado
porque los oligonucleótidos están fosforilados en su extremo 5' y
porque a la etapa (f) se añade una ligasa.
20. Procedimiento de mutagénesis según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado
porque el gen diana es una molécula de ácido nucléico codificador
para una proteína de interés con o sin sus propias secuencias de
regulación.
21. Procedimiento de mutagénesis de una proteína
diana o de un banco de proteínas mutadas dianas,
caracterizado porque comprende la preparación de un banco de
expresión de genes mutados a partir de un gen diana codificador
para dicha proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
20, luego porque se expresan dichos genes mutados para producir un
banco de proteínas mutadas, y eventualmente porque se criban dichas
proteínas mutadas para una función deseada.
22. Procedimiento de selección de proteínas
mutadas que presentan una actividad modificada con respecto a la
misma proteína no mutada, o del gen mutado que corresponde a dicha
proteína mutada, caracterizado porque comprende un
procedimiento de mutagénesis según la reivindicación 21, porque
después del cribado de dichas proteínas mutadas para una función
deseada, se selecciona la proteína mutada que presenta la función
deseada, y eventualmente se secuencia el gen mutado que corresponde
a dicha proteína mutada.
23. Procedimiento de mutagénesis de una proteína
diana o de un banco de proteínas mutadas dianas según la
reivindicación 21 o de selección de una proteína mutada o del gen
correspondiente según la reivindicación 22, caracterizado
porque comprende la preparación de un banco de expresión de genes
mutados a partir de un gen diana codificador para dicha proteína
según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20,
caracterizado porque comprende después de la etapa (i), las
siguientes etapas:
- j)
- se incuba el medio selectivo a la temperatura adecuada durante el tiempo suficiente al crecimiento de colonias bacterianas individuales,
- k)
- se siembran cultivos de bacterias individuales a partir de las colonias de la etapa (j),
- l)
- se efectúan preparaciones de ADN plásmido de los cultivos de la etapa (k),
- m)
- se mide la actividad biológica asociada a cada preparación de ADN plásmido de la etapa (1) y se compara el resultado obtenido con respecto al medido utilizando el ADN plásmido no mutado,
- n)
- eventualmente, se secuencian las preparaciones de ADN plásmido que hayan permitido observar modificaciones significativas de la actividad biológica.
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