ES2278965T3 - Metodos de determinacion de los efectos de toxinas botulinicas. - Google Patents
Metodos de determinacion de los efectos de toxinas botulinicas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2278965T3 ES2278965T3 ES02773168T ES02773168T ES2278965T3 ES 2278965 T3 ES2278965 T3 ES 2278965T3 ES 02773168 T ES02773168 T ES 02773168T ES 02773168 T ES02773168 T ES 02773168T ES 2278965 T3 ES2278965 T3 ES 2278965T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- muscle
- toxin
- botulinum toxin
- botulinum
- injected
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Método para determinar un efecto de una toxina botulínica, comprendiendo el método la etapa de administrar una toxina botulínica a un músculo de un mamífero no humano, y determinar una densidad de núcleos o una zona de núcleos de una muestra del músculo al que se ha administrado la toxina botulínica.
Description
Métodos de determinación de los efectos de
toxinas botulínicas.
Esta solicitud reivindica prioridad para la
solicitud provisional de número de serie 60/309.988, presentada el
3 de agosto de 2001.
La presente invención se refiere a métodos para
determinar los efectos de toxinas, por ejemplo toxinas
clostridiales. En particular, la presente invención se refiere a
métodos histológicos/morfológicos para determinar los efectos de
una toxina botulínica.
En una realización, la presente invención
proporciona un método para cuantificar y definir los efectos de las
toxinas en cuanto a "potencia". Adicionalmente, la presente
invención proporciona un método para determinar el alcance de
atrofia provocada por las toxinas.
En la actualidad, la potencia biológica de
preparaciones terapéuticas de una toxina botulínica, tal como una
toxina botulínica tipo A, se expresa normalmente en cuanto a
unidades de DL_{50} para ratón. Al contrario de lo que
generalmente se cree, la unidad de ratón no es una unidad
normalizada. Está bien documentado que el ensayo para determinar la
potencia de la toxina botulínica tipo A en unidades de DL_{50}
para ratón tiene tendencia a una variabilidad interlaboratorios
significativa (Schantz y Kautter, J Ass of Anal Chem 1978,
61:96-99). Un estudio diseñado para normalizar un
ensayo de toxina botulínica tipo A implicó 11 laboratorios
diferentes (Sesardic et al, Pharacol Toxico 1996, 78:
283-288). En este estudio se encontró que la
diferencia en los resultados era hasta 10 veces. Esta variabilidad
en la DL_{50} para ratón no es exclusiva a ensayos que implican
la toxina botulínica. De hecho, debido a la variabilidad de este
ensayo, varias agencias reguladoras han dejado de requerir el uso
rutinario de la DL_{50} para pruebas de toxicidad para varias
sustancias químicas, disolventes, cosméticos y fármacos (Pearce
et al, Toxicol App Pharm 1994, 128:69-77;
patente de los EE.UU. número 5.401.243 y patente de los EE.UU.
Número 5.183.462).
La importancia médica en expansión de toxinas
botulínicas ha aumentado la necesidad de, y ha puesto mucha
importancia en, el análisis preciso de la actividad biológica
contenida en preparaciones de toxina botulínica tipo A, tanto para
uso clínico como para investigación de laboratorio.
El género Clostridium tiene más de ciento
veintisiete especies, agrupadas según su morfología y funciones. La
bacteria gram-positiva, anaeróbica Clostridium
botulinum produce una neurotoxina polipeptídica potente, toxina
botulínica, que provoca una enfermedad neuroparalítica en seres
humanos y animales denominada en lo sucesivo como botulismo. Las
esporas de Clostridium botulinum se encuentran en la tierra y
pueden crecer en recipientes de alimentos sellados y esterilizados
de manera inapropiada de conservas caseras, que son la causa de
muchos de los casos de botulismo. Los efectos del botulismo
normalmente aparecen de 18 a 36 horas después de comer los
productos alimenticios infectados con esporas o un cultivo de
Clostridium botulinum. La toxina botulínica puede pasar
aparentemente no atenuada a través de la pared interna del intestino
y atacar a las neuronas motoras periféricas. Los síntomas de
intoxicación por toxina botulínica pueden progresar desde la
dificultad para caminar, tragar y hablar hasta la parálisis de los
músculos respiratorios y muerte.
La toxina botulínica tipo A es el agente
biológico natural más letal conocido para el hombre. Aproximadamente
50 picogramos de una toxina botulínica tipo A comercialmente
disponible (complejo de neurotoxina purificado)^{1}
es una DL_{50} en ratones (es decir, 1
unidad).
Una unidad de BOTOX® contiene aproximadamente 50
picogramos (aproximadamente 56 atomoles) de complejo de toxina
botulínica tipo A. De manera interesante, en base molar, la toxina
botulínica tipo A es aproximadamente 1,8 billones de veces más
letal que la difteria, aproximadamente 600 millones de veces más
letal que el cianuro de sodio, aproximadamente 30 millones de veces
más letal que la toxina del veneno de cobra y aproximadamente 12
millones de veces más letal que el cólera. Singh, Critical
Aspects of Bacterial Protein Toxins, páginas
63-84 (capítulo 4) de Natural Toxins II, editado por
B.R. Singh et al., Plenum Press, Nueva York (1976) (en el
que la DL_{50} indicada de la toxina botulínica tipo A de 0,3 ng
es igual a 1 U se corrige por el hecho de que aproximadamente 0,05
ng de BOTOX® es igual a 1 unidad). Una unidad (U) de la toxina
botulínica se define como la DL_{50} por inyección
intraperitoneal en ratones Swiss Webster hembra que pesan de 18 a 20
gramos cada uno.
Se han caracterizado siete neurotoxinas
botulínicas, siendo éstas, respectivamente serotipos de neurotoxina
botulínica A, B, C_{1}, D, E, F y G cada uno de los cuales se
diferencia mediante la neutralización con anticuerpos de tipo
específico. Los diferentes serotipos de toxina botulínica pueden
variar en las especies animales a las que afectan y
\newpage
en la gravedad y duración de la
parálisis que provocan. La toxina botulínica se une aparentemente
con alta afinidad a neuronas motoras colinérgicas, se transloca en
la neurona y bloquea la liberación de
acetilcolina.
A pesar del serotipo, el mecanismo molecular de
la intoxicación por toxina parece ser similar e implicar al menos
tres etapas o fases. En la primera etapa del proceso, la toxina se
une a la membrana presináptica de la neurona diana a través de una
interacción específica entre la cadena pesada, cadena H, y un
receptor de superficie celular, se piensa que el receptor es
diferente para cada tipo de toxina botulínica y para la toxina
tetánica. El segmento del extremo carboxilo de la cadena H, H_{C},
parece ser importante para dirigir la toxina hacia la superficie
celular.
En la segunda etapa, la toxina atraviesa la
membrana plasmática de la célula envenenada. Primero, la toxina se
envuelve por la célula a través de endocitosis mediada por receptor,
y se forma un endosoma que contiene la toxina. Entonces, la toxina
escapa del endosoma en el citoplasma de la célula. Se piensa que
esta etapa está mediada por el segmento del extremo amino de la
cadena H, H_{N}, que provoca un cambio conformacional de la
toxina en respuesta a un pH de aproximadamente 5,5 o inferior. Se
sabe que los endosomas tienen una bomba de protones que disminuye
el pH intraendosómico. El desplazamiento conformacional expone los
residuos hidrófobos en la toxina, lo que permite que la toxina se
inserte por sí misma en la membrana endosómica. Luego la toxina (o
como mínimo la cadena ligera) se transloca a través de la membrana
endosómica en el citoplasma.
La última etapa del mecanismo de actividad de la
toxina botulínica parece implicar la reducción de enlace disulfuro
que une la cadena pesada, cadena H, y la cadena ligera, cadena L.
Toda la actividad tóxica de las toxinas botulínicas y tetánicas
está contenida en la cadena L de la holotoxina; la cadena L es una
endopeptidasa de zinc (Zn++) que escinde de manera selectiva
proteínas esenciales para el reconocimiento y acoplamiento de
vesículas que contienen neurotransmisores con la superficie
citoplásmica de la membrana plasmática, y fusión de las vesículas
con la membrana plasmática. La neurotoxina tetánica, toxina
botulínica tipos B, D, F, y G provocan la degradación de
sinaptobrevina (también denominada proteína de membrana asociada a
vesícula (VAMP)), una proteína de membrana sinaptosómica. La
mayoría de las VAMP presentes en la superficie citoplásmica de la
vesícula sináptica se elimina como resultado de uno cualquiera de
estos casos de escisión. Los serotipos de toxina botulínica A y E
escinde la SNAP-25. Originariamente se pensó que la
toxina botulínica serotipo C_{1} escindía sintaxina, pero se
encontró que escindía sintaxina y SNAP-25. Cada una
de las toxinas botulínicas escinde de manera específica una unión
diferente, excepto la toxina botulínica tipo B (y toxina tetánica)
que escinde la misma unión.
Las toxinas botulínicas se han usado en la
práctica clínica para el tratamiento de trastornos neuromusculares
caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos. Se ha
aprobado un complejo de toxina botulínica tipo A (BOTOX®) por Food
and Drug Administration (administración de fármacos y alimentos) de
los EE.UU. para el tratamiento de blefaroespasmo, estrabismo y
espasmo hemifacial, distonía cervical y tratamiento de arrugas
glabelares. También se ha aprobado una toxina botulínica tipo B
(MYOBLOC™) por la FDA para el tratamiento de distonía cervical. Los
serotipos de toxina botulínica que no son de tipo A aparentemente
tienen una potencia inferior y/o una duración más corta de
actividad en comparación con la toxina botulínica tipo A. Los
efectos clínicos de la toxina botulínica tipo A intramuscular
periférica se observan normalmente en el plazo de un día o de unas
pocas horas tras la inyección. La duración típica del alivio
sintomático a partir de una única inyección intramuscular de toxina
botulínica tipo A es en promedio aproximadamente de tres a cuatro
meses.
Aunque todos los serotipos de toxinas
botulínicas inhiben aparentemente la liberación de la acetilcolina
neurotransmisora en la unión neuromuscular, lo hacen afectando
diferentes proteínas neurosecretoras y/o escindiendo estas proteínas
en diferentes sitios. Por ejemplo, tipos botulínicos A y E escinden
ambos la proteína asociada al sinaptosoma de 25 kilodalton (kD)
(SNAP-25), pero seleccionan como diana diferentes
secuencias de aminoácidos dentro de esta proteína. La toxina
botulínica tipos B, D, F y G actúan sobre la proteína asociada a
vesícula (VAMP, también denominada sinaptobrevina), escindiendo
cada serotipo la proteína en un sitio diferente. Finalmente, se ha
demostrado que la toxina botulínica tipo C_{1} escinde tanto
sintaxina como SNAP-25. Estas diferencias en el
mecanismo pueden afectar a la duración y/o potencia relativa de la
acción de los diversos serotipos de toxina botulínica.
Aparentemente, puede encontrarse un sustrato para una toxina
botulínica en una variedad de diferentes tipos de células. Véase
por ejemplo Biochem, J 1; 339 (pt 1): 159-65:
1999, y Mov Disord, 10 (3): 376: 1995 (células B del islote
pancreático contienen al menos SNAP-25 y
sinaptobrevina).
El peso molecular de la molécula de proteína de
toxina botulínica, para los siete serotipos de toxina botulínica
conocidos, es aproximadamente 150 kD. De manera interesante, las
toxinas botulínicas se liberan por la bacteria clostridial como
complejos que comprenden la molécula de proteína de toxina
botulínica junto con proteínas que nos son toxinas asociadas. Por
tanto, el complejo de toxina botulínica tipo A puede producirse por
la bacteria clostridial como formas de 900 kD, 500 kD y 300 kD. La
toxina botulínica tipos B y C_{1} se produce aparentemente sólo
como un complejo de 700 kD o 500 kD. La toxina botulínica tipo D se
produce tanto como complejos de 300 kD como de 500 kD. Finalmente,
la toxina botulínica tipos E y F se producen sólo como complejos
aproximadamente de 300 kD. Se cree que los complejos (es decir, peso
molecular superior a aproximadamente 150 kD) contienen una proteína
hemaglutinina que no es toxina y una proteína que no es
hemaglutinina que no es tóxica y que no es toxina. Estas dos
proteínas que no son toxina (que junto con la molécula de toxina
botulínica comprenden el complejo de neurotoxina relevante) pueden
actuar para proporcionar estabilidad frente a la desnaturalización
de la molécula de toxina botulínica y protección frente a los ácidos
digestivos cuando se ingiere toxina. Adicionalmente, es posible que
los complejos de toxina botulínica más grandes (mayores que
aproximadamente 150 kD de peso molecular) pueden dar como resultado
una velocidad de difusión más lenta de la toxina botulínica lejos
de un sitio de inyección intramuscular de un complejo de toxina
botulínica.
Estudios in vitro han indicado que la
toxina botulínica inhibe la liberación inducida por el catión
potasio de tanto acetilcolina como norepinefrina de cultivos de
células primarios de tejido del tronco encefálico. Adicionalmente,
se ha informado que la toxina botulínica inhibe la liberación
provocada tanto de glicina como de glutamato en cultivos primarios
de neuronas de médula espinal y que, en preparaciones de sinaptosoma
de cerebro la toxina botulínica inhibe la liberación de cada uno de
los neurotransmisores acetilcolina, dopamina, norepinefrina
(Habermann E., et al., Tetanus Toxin and Botulinum A and C
Neurotoxins Inhibit Noradrenaline Release From Cultured Mouse
Brain, J Neurochem 51 (2);522-527: 1988) CGRP,
sustancia P y glutamato (Sanchez-Priato, J., et
al., Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From Guinea Pig
Cerebral Cortical Synaptosomes, Eur J. Biochem
165;675-681:1897. Por tanto, cuando se usan las
concentraciones adecuadas, la liberación provocada por estímulo de
la mayoría de los neurotransmisores se bloquea mediante la toxina
botulínica. Véase por ejemplo, Pearce, L.B., Pharmacologic
Characterization of Botulinum Toxin For Basic Science y
Medicine, Toxicon 35(9);1373-1412 en
1393; Bigalke H., et al., Botulinum A Neurotoxin Inhibits
Non-Cholinergic Synaptic Transmission in Mouse
Spinal Cord Neuronas in Culture, Brain Research
360;318-324:1985; Habermann E., Inhibition by
Tetanus y Botulinum A Toxin of the release of [^{3}H]
Noradrenaline and [^{3}H] GABA From Rat Brain Homogenate,
experiencia 44;224-226:1988, Bigalke H., et al.,
Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin Inhibit Release and Uptake of
Various Transmitters, as Studied with Particulate Preparations From
Rat Brain and Spinal Cord,
Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol
316;244-251:1981, y; Jankovic J. et al.,
Therapy With Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc., (1994),
página 5.
La toxina botulínica tipo A puede obtenerse
estableciendo y haciendo crecer cultivos de Clostridium
botulinum en un fermentador y luego recogiendo y purificando la
mezcla fermentada de acuerdo con los procedimientos conocidos.
Todos los serotipos de toxina botulínica se sintetizan inicialmente
como proteínas de cadena simple inactivas que deben escindirse o
cortarse por proteasas para convertirse en neuroactivas. Las cepas
bacterianas hacen que los serotipos de toxina botulínica A y G
tengan proteasas endógenas y que los serotipos A y G puedan por
tanto recuperarse de los cultivos bacterianos predominantemente en
su forma activa. Por el contrario, los serotipos de toxina
botulínica C_{1}, D y E se sintetizan mediante cepas no
proteolíticas y por tanto están normalmente desactivadas cuando se
recuperan del cultivo. Los serotipos B y F se producen tanto
mediante cepas proteolíticas como no proteolíticas y por tanto
pueden recuperarse o bien en la forma activa o bien inactiva. Sin
embargo, incluso las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo,
el serotipo de toxina botulínica tipo B sólo escinde una parte de
la toxina producida. La proporción exacta de moléculas cortadas con
respecto a las no cortadas depende de la duración de la incubación
y de la temperatura del cultivo. Por tanto, un porcentaje
determinado de cualquier preparación de, por ejemplo, la toxina
botulínica tipo B es probable que sea inactivo, posiblemente
explicando la potencia significativamente inferior de la toxina
botulínica tipo B comparada con la toxina botulínica tipo A.
Puede producirse toxina botulínica tipo A
cristalina de alta calidad a partir de la cepa Hall A de
Clostridium botulinum con características de \geq3 X
10^{7} U/mg, un A_{260}/A_{278} inferior a 0,60 y un modelo
definido de bandeo sobre electroforesis en gel. Puede usarse el
proceso conocido de Shantz para obtener toxina botulínica tipo A
cristalina, tal como se expone en Shantz, E.J., et al, Properties
and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in
Medicine, Microbiol Rev. 56;80-99:1992.
Generalmente, el complejo de toxina botulínica tipo A puede
aislarse y purificarse a partir de una fermentación anaeróbica
cultivando Clostridium botulinum tipo A en un medio
adecuado. El proceso conocido puede usarse también, en la separación
a parte de las proteínas que no son toxina, para obtener toxinas
botulínicas puras, tales como por ejemplo: toxina botulínica tipo A
purificada con un peso molecular de aproximadamente 150 kD con una
potencia específica de 1-2 X 10^{8} DL_{50}
U/mg o mayor; toxina botulínica tipo B purificada con un peso
molecular de aproximadamente 156 kD con una potencia específica de
1-2 X 10^{8} DL_{50} U/mg o mayor, y; toxina
botulínica tipo F purificada con un peso molecular de
aproximadamente 155 kD con una potencia específica de
1-2 X 10^{7} DL_{50} U/mg o mayor.
Las toxinas botulínicas y/o complejos de toxina
botulínica pueden obtenerse de Allergan Inc (Irvine, California),
Ipsen Beaufour (Francia), Elan Pharmaceuticals (Irlanda), List
Biological Laboratories, Inc., Campbell, California; the Centre for
Applied Microbiology and Research, Porton Down, R.U.; Wako (Osaka,
Japón), Metabiologics (Madison, Wisconsin) así como en Sigma
Chemicals of St Louis, Missouri.
Aunque de algún modo la toxina botulínica pura,
lábil, puede usarse para preparar una composición farmacéutica y
como los complejos de toxina botulínica, tales como el complejo de
toxina tipo A, es susceptible a la desnaturalización debido a la
desnaturalización de superficie, calor, y condiciones alcalinas. La
toxina inactivada forma proteínas toxoides que pueden ser
inmunógenas. Los anticuerpos resultantes pueden hacer que un
paciente sea resistente a la inyección de toxina.
Tal como con las enzimas, generalmente, las
actividades biológicas de las toxinas botulínicas (que son
peptidasas intracelulares) dependen, al menos en parte, de su
conformación tridimensional. Por tanto, la toxina botulínica tipo A
se destoxifica mediante calor, secado de la superficie y extensión
superficial de diversas sustancias químicas. Adicionalmente, se
sabe que la dilución del complejo de toxina obtenido mediante el
cultivo, fermentación y purificación conocidos hasta
concentraciones de toxina mucho, mucho más inferiores usadas para la
formulación de composición farmacéutica da como resultado una
destoxificación rápida de la toxina, a menos que esté presente un
agente estabilizante adecuado. La dilución de la toxina desde
cantidades de miligramo hasta una disolución que contiene
nanogramos por mililitro presenta dificultades significativas debido
a la pérdida rápida de la toxicidad específica en una gran dilución
de este tipo. Ya que la toxina puede usarse meses o años después de
que se formule la composición farmacéutica que contiene la toxina,
la toxina puede estabilizarse con un agente estabilizante tal como
albúmina y gelatina.
Una composición farmacéutica que contiene toxina
botulínica comercialmente disponible se vende bajo la marca BOTOX®
(disponible de Allergan, Inc., de Irvine, California). BOTOX®
consiste en un complejo de toxina botulínica tipo A purificado,
albúmina y cloruro de sodio empaquetado de forma estéril, secada al
vacío. La toxina botulínica tipo A se produce a partir de un
cultivo de la cepa Hall de Clostridium botulinum que crece en
un medio que contiene extracto de levadura y amina
N-Z. El complejo de toxina botulínica tipo A se
purifica a partir de la disolución de cultivo mediante una serie de
precipitaciones ácidas para obtener un complejo cristalino que
consiste en la proteína que es toxina de alto peso molecular activa
y una proteína hemaglutinina asociada. El complejo cristalino se
vuelve a disolver en una disolución que contiene solución salina y
albumina y se filtra de manera estéril (0,2 micras) antes del
secado a vacío. El producto secado a vacío se almacena en un
congelador a, o por debajo de -5°C. BOTOX® puede reconstituirse con
solución salina estéril, no conservada antes de la inyección
intramuscular. Cada vial de BOTOX® contiene aproximadamente 100
unidades (U) de complejo de neurotoxina purificada de toxina
Clostridium botulinum tipo A, 0,5 miligramos de albúmina
sérica humana y 0,9 miligramos de cloruro de sodio en forma
estéril, secada al vacío sin un conservante.
Para reconstituir BOTOX® secado al vacío, se usa
solución salina estéril normal sin un conservante; (inyección de
cloruro de sodio al 0,9%) preparando la cantidad apropiada de
diluyente en la jeringuilla de tamaño apropiado. Ya que BOTOX®
puede desnaturalizarse mediante burbujeo o agitación violenta
similar, el diluyente se inyecta cuidadosamente en el vial. Por
razones de esterilidad, BOTOX® se administra preferiblemente en el
plazo de cuatro horas después de que el vial se retira del
congelador y se reconstituye. Durante estas cuatro horas, BOTOX®
reconstituido puede almacenarse en un refrigerador a de
aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C. Se ha informado de que
BOTOX® refrigerado, reconstituido, conserva su potencia durante al
menos cuatro semanas. Dermatol Surg enero de 1996;
22(1):39-43.
Se ha informado que la toxina botulínica tipo A
se ha usado en prácticas clínicas tal como sigue:
(1) aproximadamente 75-125
unidades de BOTOX® por inyección intramuscular (múltiples músculos)
para tratar distonía cervical;
(2) 5-10 unidades de BOTOX® por
inyección intramuscular para tratar líneas glabelares (arrugas en la
frente) (5 unidades inyectadas por vía intramuscular en el músculo
procerus y 10 unidades inyectadas por vía intramuscular en cada
músculo superciliar);
(3) aproximadamente 30-80
unidades de BOTOX® para tratar estreñimiento mediante inyección
dentro del esfínter del músculo puborectal;
(4) aproximadamente 1-5 unidades
por músculo de BOTOX® inyectado por vía intramuscular para tratar
blefaroespasmo inyectando el músculo orbicularis oculi pretarsal
lateral del párpado superior y el orbicularis oculi pretarsal
lateral del párpado inferior.
(5) para tratar estrabismo, se han inyectado los
músculos extraoculares por vía intramuscular con entre
aproximadamente 1-5 unidades de BOTOX®, variando la
cantidad inyectada basándose tanto en el tamaño del músculo que ha
de inyectarse como en el alcance de la parálisis del músculo
deseado (es decir, cantidad de corrección de dioptría deseada);
(6) para tratar la espasticidad de miembro
superior tras accidente cerebrovascular mediante inyecciones
intramusculares de BOTOX® en cinco músculos flexores diferentes del
miembro superior, tal como sigue:
- (a)
- flexor profundo de los dedos: de 7,5 U a 30 U
- (b)
- flexor superficial de los dedos: de 7,5 U a 30 U
- (c)
- flexor cubital del carpo: de 10 U a 40 U
- (d)
- flexor radial del carpo: de 15 U a 60 U
- (e)
- bíceps braquial: de 50 U a 200 U. Cada uno de los cinco músculos indicados se ha inyectado en la misma sesión de tratamiento, de modo que el paciente recibe desde 90 U hasta 360 U de BOTOX® en el músculo flexor de la extremidad superior mediante inyección intramuscular en cada sesión de tratamiento.
(7) para tratar migraña, la inyección de 25 U de
BOTOX® inyectadas por vía pericraneal, (inyectadas simétricamente
en los músculos glabelar, frontal y temporal) ha mostrado un
beneficio significativo como tratamiento profiláctico de migraña
comparado con el vehículo tal como se mide mediante medidas
disminuidas de frecuencia de migraña, gravedad máxima, vómitos
asociados y uso de medicación aguda durante el periodo de tres meses
tras la inyección de 25 U.
Adicionalmente, la toxina botulínica
intramuscular se ha usado en el tratamiento del temblor en pacientes
con la enfermedad del Parkinson, aunque se ha informado que los
resultados no han sido excelentes. Marjama-Jyons,
J., et al., Tremor-Predominant Parkinson's
Disease, Drugs & Aging
16(4);273-278:2000.
Se conoce que la toxina botulínica tipo A puede
tener una eficacia durante hasta 12 meses (European J.
Neurology 6 (Supp 4): S111-S1150:1999), y en
algunas circunstancias durante tanto como 27 meses. The
Laryngoscope 109:1344-1346:1999. Sin embargo,
la duración habitual de una inyección intramuscular de Botox® es
normalmente de aproximadamente 3 a 4 meses. El éxito de la toxina
botulínica tipo A para tratar una variedad de estados clínicos ha
conducido al interés por otros serotipos de toxina botulínica.
Véase por ejemplo Eur J Neurol 1999 Nov; 6 (Suppl 4):
S3-S10.
La neurotoxina tetánica actúa principalmente en
el sistema nervioso central, mientras que la neurotoxina botulínica
actúa en la unión neuromuscular; ambas actúan inhibiendo la
liberación de acetilcolina del axón de la neurona afectada en la
sinapsis, dando como resultado parálisis. El efecto de la
intoxicación sobre la neurona afectada es de larga duración y hasta
recientemente se ha pensado que era irreversible. Se conoce que la
neurotoxina tetánica existe en un serotipo inmunológicamente
distinto.
Normalmente se libera solamente un único tipo de
neurotransmisor de molécula pequeña por cada tipo de neurona en el
sistema nervioso de los mamíferos. La acetilcolina neurotransmisora
se secreta por las neuronas en muchas zonas del cerebro, pero
específicamente por las células piramidales grandes de la corteza
motora, por diversas neuronas diferentes en los ganglios basales,
por las neuronas motoras que inervan a los músculos esqueléticos,
por las neuronas preganglionares del sistema nervioso autónomo
(tanto simpático como parasimpático), por las neuronas
postganglionares del sistema nervioso parasimpático, y por algunas
de las neuronas postganglionares del sistema nervioso simpático.
Esencialmente, solamente las fibras del nervio simpático
postganglionar son colinérgicos para las glándulas sudoríparas, los
músculos piloerectores y unos pocos vasos sanguíneos y la mayoría
de las neuronas postganglionares del sistema nerviosos simpático
secretan el neurotransmisor norepinefrina. En la mayoría de los
casos la acetilcolina tiene un efecto excitador. Sin embargo, se
conoce que la acetilcolina tiene efectos inhibidores en algunos de
los extremos de los nervios parasimpáticos periféricos, tales como
la inhibición del corazón mediante el nervio vago.
Las señales eferentes del sistema nervioso
autónomo se transmiten al organismo a través o bien del sistema
nervioso simpático o del sistema nervioso parasimpático. Las
neuronas preganglionares del sistema nervioso simpático se
extienden a partir de los cuerpos celulares de la neurona simpática
preganglionar localizados en el asta intermedio lateral de la
médula espinal. Las fibras del nervio simpático preganglionar que se
extiende a partir del cuerpo celular, realiza sinapsis con las
neuronas simpáticas localizadas o bien en un ganglio simpático
paravertebral o bien en un ganglio paravertebral. Ya que las
neuronas preganglionares tanto del sistema nervioso simpático como
del parasimpático son colinérgicas, la aplicación de acetilcolina a
los ganglios excitará a las neuronas postganglionares tanto
simpáticas como parasimpáticas.
La acetilcolina activa dos tipos de receptores,
receptores muscarínicos y nicotínicos. Los receptores muscarínicos
se encuentran en todas las células efectoras estimuladas por
neuronas postganglionares del sistema nervioso parasimpático, así
como en las estimuladas por las neuronas colinérgicas
postganglionares del sistema nervioso simpático. Los receptores
nicotínicos se encuentran en las sinapsis entre las neuronas
preganglionares y postganglionares tanto del simpático como del
parasimpático. Los receptores nicotínicos están presentes también en
muchas membranas de fibras del músculo esquelético en la unión
neuromuscular.
La acetilcolina se libera de las neuronas
colinérgicas cuando las vesículas intracelulares, claras, pequeñas
se fusionan con la membrana celular neuronal presináptica. Una
amplia variedad de células secretoras no neuronales, tales como las
células de la médula suprarrenal (así como la línea celular PC12) y
células del islote pancreático, liberan catecolaminas e insulina,
respectivamente, de las vesículas grandes de núcleo denso. La línea
celular PC12 es un clon de células feocromocitoma de rata usada
extensivamente como modelo de cultivo tisular para estudios del
desarrollo simpatosuprarrenal. La toxina botulínica inhibe la
liberación de ambos tipos de compuesto de ambos tipos de células
in vitro, permeabilizados (tal como mediante electroporación)
o mediante inyección directa de la toxina en la célula desnervada.
También se conoce que la toxina botulínica bloquea la liberación
del neurotransmisor glutamato de los cultivos celulares de
sinaptosomas corticales.
Sería ventajoso proporcionar una medición más
precisa de la actividad de la toxina basándose en una exposición no
letal de una toxina botulínica, tal como una toxina botulínica tipo
A, a un mamífero tal como una rata. Esta invención proporciona un
mejor método de determinación de la potencia de una toxina.
La figura 1 ilustra una curva de respuesta a la
dosis de muestra construida trazando el índice nuclear frente a la
dosis de toxina, por ejemplo toxina botulínica.
\newpage
La figura 2 muestra que la zona de núcleos
(dentro de una zona diferenciada) en un músculo es inversamente
proporcional a la masa muscular.
La figura 3 muestra que el número de núcleos
(dentro de una zona diferenciada) en un músculo es inversamente
proporcional a la masa muscular.
La figura 4 muestra que un aumento en la zona de
núcleos corresponde a una masa muscular inferior.
Las figuras 5, 6, 7 y 8 muestran un análisis y
reconocimiento por ordenador de los núcleos en cortes microscópicos
de músculo. Los músculos de las figuras 5 y 7 no se tratan con
toxina botulínica. Los músculos de las figuras 6 y 8 se tratan con
toxina botulínica.
La figura 9 muestra la relación entre el peso
muscular y la dosis de toxina botulínica inyectada.
La figura 10 muestra la relación del peso
muscular y el grado de atrofia.
La figura 11 es un gráfico que muestra el
resultado de un experimento en el que se inyectaron en el músculo
gemelo izquierdo de diferentes ratas cantidades variantes de una
toxina botulínica tipo A. El eje y muestra la razón (como
porcentaje) del peso del músculo gemelo izquierdo de la rata al que
se le inyecta toxina con respecto al peso del músculo gemelo
derecho inyectado de la misma rata. El eje x muestra la cantidad en
unidades de la toxina botulínica tipo A que se inyectó en el
músculo gemelo izquierdo.
La figura 12 es un gráfico que muestra el
resultado de un experimento en el que se inyectaron en el músculo
gemelo izquierdo de diferentes ratas cantidades variantes de una
toxina botulínica tipo A. El eje y muestra la razón (como
porcentaje) del peso del músculo bíceps femoral izquierdo no
inyectado (que está adyacente al músculo gemelo izquierdo de la
rata al que se le inyecta toxina) con respecto al peso del músculo
bíceps femoral derecho no inyectado de la misma rata. El eje x
muestra la cantidad en unidades de la toxina botulínica tipo A que
se inyectó en el músculo gemelo izquierdo.
La figura 13 es un gráfico que muestra el
resultado de un experimento en el que se inyectaron en el músculo
gemelo izquierdo de diferentes ratas cantidades variantes de una
toxina botulínica tipo A. El eje y muestra la razón (como
porcentaje) del peso del músculo sóleo izquierdo no inyectado (que
está adyacente al músculo gemelo izquierdo de la rata al que se le
inyecta toxina) con respecto al peso del músculo sóleo derecho no
inyectado de la misma rata. El eje x muestra la cantidad en unidades
de la toxina botulínica tipo A que se inyectó en el músculo
gemelo
izquierdo.
izquierdo.
"Potencia" una medida de una masa de una
determinada sustancia química, es decir, una toxina, para inducir
un cierto grado de efecto químico o fisiológico. Por ejemplo,
potencia de una toxina botulínica indica el alcance o la duración
de inhibición de la liberación de acetilcolina de un tejido diana.
Alternativamente, una potencia de una toxina botulínica indica el
alcance que una dosis determinada de toxina provoca ciertos cambios
del índice nuclear.
"Atrofia" es una reducción en la masa
muscular. El grado de atrofia muscular puede medirse mediante un
cambio en el porcentaje de masa muscular, circunferencia y/o
longitud.
"Índice nuclear" indica el número núcleos
por zona del músculo (densidad de núcleos), la suma de la zona de
los núcleos individuales dentro de un campo (zona de núcleos), y/o
el nivel de factores acoplados eléctricamente.
"Factores acoplados eléctricamente" pueden
ser proteínas (por ejemplo, factores de transcripción) o secuencias
de ácidos nucléicos [por ejemplo ARNm] de MyoD, miogenina,
Myr-5, MRF4, sTnl, y/o tTnl.
"Peso muscular" es la masa del músculo.
"Grado de atrofia" es el porcentaje de
atrofia de una fibra muscular, en relación con una fibra muscular de
control análoga, que puede determinarse mediante inspección visual.
Cada "grado" corresponde aproximadamente a la reducción del
25% en masa muscular en relación con el control.
La presente invención abarca un método para
determinar un efecto de una toxina clostridial, comprendiendo el
método la etapa de administrar la toxina clostridial a un músculo de
un mamífero, y determinar un índice nuclear del músculo inyectado.
La toxina clostridial puede seleccionarse del grupo que consiste en
bacterias Clostridial beratti, Clostridia butyricum, Clostridial
tetani y Clostridial botulinum. La toxina clostridial puede
seleccionarse del grupo que consiste en toxina botulínica tipos A,
B, C_{1}, D, E, F, G y mezclas de los mismas y es preferiblemente
una toxina botulínica tipo A.
El efecto de una toxina clostridial puede
determinarse determinando una potencia o difusión de la toxina y
esto puede llevarse a cabo determinando el índice nuclear que
comprende medir la densidad de núcleos. La etapa de determinar del
índice nuclear puede comprender medir la zona de núcleos.
Adicionalmente, la etapa de determinar el índice nuclear comprende
medir la densidad de núcleos y la zona de núcleos. La etapa de
determinar el índice nuclear puede comprender medir el nivel
factores acoplados eléctricamente. La etapa de determinar el índice
nuclear puede comprender medir el nivel de los factores acoplados
eléctricamente y la densidad de núcleos. La etapa de determinar del
índice nuclear puede comprender medir el nivel de factores acoplados
eléctricamente y la zona de núcleos.
Adicionalmente, la etapa de determinar el índice
nuclear puede comprender medir el nivel de factores acoplados
eléctricamente, la densidad de núcleos, y la zona de núcleos. Los
factores acoplados eléctricamente pueden comprender proteínas. Los
factores acoplados eléctricamente pueden comprender secuencias de
ácidos nucleicos. Los factores acoplados eléctricamente pueden
comprender los ARNm de MyoD, miogenina, Myr-5, MRF4,
sTnl,
tTnl.
tTnl.
Una realización adicional de la presente
invención es un método para determinar la atrofia muscular inducida
por la administración de una toxina Clostridium, el método comprende
la etapa de comparar un índice nuclear del músculo al que se le
inyecta toxina clostridial con el de un músculo que no se ha
inyectado con toxina clostridial. El índice nuclear puede ser la
medición del nivel de factores acoplados eléctricamente, la densidad
de núcleos, y la zona de núcleos.
La presente invención abarca también un método
para determinar un efecto de una toxina clostridial, comprendiendo
el método la etapa de administrar la toxina clostridial a un músculo
de un mamífero, y determinar una atrofia de un músculo. El efecto
de una toxina clostridial puede determinarse determinando una
potencia de la toxina. La etapa de determinar la atrofia puede
comprender medir una reducción en la masa muscular de o bien el
músculo al que se le inyecta la toxina o bien de un músculo
adyacente.
Una realización detallada de la presente
invención incluye un método para determinar un efecto de una toxina
clostridial, comprendiendo el método la etapa de administrar la
toxina clostridial a un músculo de un mamífero, y determinar una
atrofia de un músculo comparando una masa muscular del músculo al
que se le inyecta una toxina clostridial con la de un músculo que
no se inyecta con una toxina clostridial.
La presente invención se basa, en parte, en el
descubrimiento de que un índice nuclear de un músculo puede
emplearse para evaluar la potencia de la toxina y la atrofia
muscular.
En una amplia realización, el método para
determinar el efecto de una toxina clostridial comprende la etapa
de administrar la toxina a un músculo de un mamífero y determinar el
índice nuclear del músculo inyectado. El efecto de una toxina puede
definirse mediante su potencia. En una realización, la presente
invención proporciona un método de determinación de la potencia de
una toxina clostridial sobre un músculo. "Mamíferos" tal como
se usan en el presente documento incluyen, por ejemplo, ratas,
conejos, ratones y perros.
La toxina clostridial pueden ser bacterias
Clostridial beratti, Clostridial butyricum, Clostridial
botulinum, y Clostridial tetani. En una realización
preferida, el método mide la potencia de las toxinas botulínicas,
por ejemplo toxina botulínica A, B, C_{1}, D, E, F, G, y mezclas
de los mismas.
La etapa de determinar el índice nuclear incluye
una medida del número de núcleos por zona de tejido, una medida de
la suma de la zona individual de los núcleos sobre una zona de
tejido, y/o una medida del nivel de factores acoplados
eléctricamente. Ejemplos de factores acoplados eléctricamente
incluyen ARNm de MyoD, miogenina, Myr-5, MRF4, sTnl
y/o tTnl. Véase Voytik et al., Developmental Dynamics
198:214-224 (1993).
Se descubre que el número y tamaños de los
núcleos, en particular los núcleos del sarcolema, aumentan con un
aumento de la dosis de toxina, por ejemplo toxina botulínica tipo A,
que se administra a un músculo. Además cambia el nivel de factores
acoplados eléctricamente en el músculo, por ejemplo aumenta o
disminuye, con un aumento de la dosis de toxina. De este modo,
puede construirse una curva de respuesta a la dosis para determinar
una potencia de una toxina. La potencia tal como se determina
mediante este método se denomina DE_{50} (dosis efectiva al 50%).
Se cree que la potencia tal como se determina mediante este método
es más exacta y más fidedigna que la tradicional DL_{50}, tal
como se describió anteriormente.
La figura 1 muestra una curva de respuesta a la
dosis a modo de ejemplo construida trazando la densidad nuclear
frente al incremento de dosis de toxina, por ejemplo toxina
botulínica. La DE_{50} es la concentración que corresponde al
punto medio entre la densidad de núcleos más inferior y más
superior. Por ejemplo, la DE_{50} de la figura 1 es la dosis de
toxina botulínica que corresponde a la zona de 450 núcleos/unidad,
que es la mitad de la zona de 1000 y 100 núcleos/unidad.
En otra realización, puede trazarse la zona de
núcleos frente a la dosis variante de una toxina clostridial,
preferiblemente toxina botulínica, para obtener una DE_{50}.
En una realización, pueden emplearse técnicas de
tinción de núcleos habituales para identificar los núcleos con
fines de contar el número de núcleos o determinar la suma de sus
zonas. A continuación en el presente documento se enumeran diversos
ejemplos no limitativos de técnicas de tinción.
Tras la tinción de los núcleos, puede obtenerse
con ayuda de un ordenador el índice nuclear, por ejemplo, el número
de núcleos por zona del tejido muscular o la suma de los núcleos
individuales sobre una zona del tejido muscular. Pueden emplearse
diversos programas informáticos conocidos en la técnica según esta
invención. En una realización, estos programas se usan para
ordenarle a un ordenador que reconozca ciertos patrones,
preferiblemente el de un núcleo, en un corte microscópico del
músculo teñido. Tras identificar los núcleos, el programa además
ordenará al ordenador que clasifique núcleos según su tamaño o
volumen y que los agrupe en recipientes de volumen o tamaños
similares. Un ejemplo de un programa de este tipo que puede usarse
según esta invención incluye Image Pro 4.1 (MediaCybemetics,
Inc.).
La figura 5B una imagen de reconocimiento por
ordenador de los núcleos de un corte microscópico del músculo. La
figura 5D muestra que hay diez recipientes. El recipiente nº 1 tiene
54 objetos (o núcleos) que tienen la zona media de 7,5 um. La
figura 5C muestra que hay un total de 106 núcleos. La figura 6
muestra que cuando se trata un músculo análogo con toxina
botulínica, los núcleos son más grandes, más hinchados y más
numerosos. Por ejemplo, la figura 6D muestra que hay núcleos tan
grandes como 58 um. Además, la figura 6C muestra que el número de
núcleos aumenta hasta 192. La figura 7 se refiere a la figura 8 tal
como la figura 5 se refiere a la figura 6.
Se prepara un lote de toxina botulínica tipo A
mediante una metodología habitual. Se realiza una dilución en serie
de la toxina mediante una metodología habitual. Se fija la
disolución madre de la toxina a una concentración apropiada de 50
picogramos de toxina botulínica tipo A/microlitro. Se realizan
diluciones cinco veces con los factores de dilución en serie
finales que oscilan desde 1,0 (disolución madre) hasta 1,0 x
10^{-4}. Además, se prepararon ratas, una para cada dilución en
serie, para un ensayo de potencia. Se inyecta 1,0 microlitro de
cada una de las nueve diluciones en el músculo gemelo de cada una de
las ratas tal como sigue:
- Rata número 1, factor de dilución = 1,0
- Rata número 2, factor de dilución = 5,0 x 10^{-1}
- Rata número 3, factor de dilución = 1,0 x 10^{-1}
- Rata número 4, factor de dilución = 5,0 x 10^{-2}
- Rata número 5, factor de dilución = 1,0 x 10^{-2}
- Rata número 6, factor de dilución = 5,0 x 10^{-3}
- Rata número 7, factor de dilución = 1,0 x 10^{-3}
- Rata número 8, factor de dilución = 5,0 x 10^{-4}
- Rata número 9, factor de dilución = 1,0 x 10^{-4}
- Rata número 10 (rata control), solución salina estéril/no toxina.
Tras 14 días, se sacrificaron las ratas. Se
elimina el músculo gemelo de cada rata, se prepara y se coloca
sobre portaobjetos para su análisis. Se determina la densidad de
núcleos (o zona de núcleos) del músculo de la rata.
Se traza la densidad de núcleos frente a la
dosis inyectada en los músculos de las ratas. Se determina la
DE_{50} a partir del trazado. Véase la figura 1.
Se conocen bien las técnicas de tinción para los
núcleos de los músculos. Éstas incluyen la hematoxilina y eosina
(H&E), yoduro de propidio, DAPI, y Hoechst. Véase Manual of
Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of
Pathology (tercera edición). American Registry of Pathology (Luna,
Lee G., HT(ASCP) (editor)), McGraw Hill Publishers, Nueva
York 1960. Wang and Gerdes, J Mol Cell Cardiol 29,
1553-1565 (1997). Lim and
Alvarez-Buylla, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96,
7526-7531, (1999).
El procedimiento de tinción implica usar
secciones desparafinadas, tras las que vuelve a hidratarse. Si las
secciones están fijadas en Zenker, se eliminan los cristales de
cloruro de mercurio con yodo y se aclara con (hipo) tiosulfato de
sodio. A continuación, se añade hematoxilina de Mayer durante 15
minutos. Se lava con agua corriente durante 20 minutos.
Se somete a contratinción con eosina desde 15
segundos hasta 2 minutos dependiendo de la antigüedad de la eosina,
y la intensidad de la contratinción deseada. Para resultados de
tinción uniformes, se sumergen los portaobjetos varias veces antes
de dejarlos reposar en la eosina durante el tiempo deseado. Luego se
deshidratan en alcoholes absolutos y al 95%, dos cambios de dos
minutos cada uno o hasta que se elimine el exceso de eosina. Se
controlan con un microscopio. Se aclaran en xileno, dos cambios de 2
minutos cada uno, y se montan en Permount o Histoclad.
Los tintes aparecen tal como sigue: los núcleos
aparecen en azul, con parte del citoplasma con metacromasia y
diversas sombras en rosa que identifican los diferentes componentes
del tejido.
Los adhesivos que se usan para unir las
secciones a los portaobjetos (gelatina, albúmina de huevo) algunas
veces se tiñen, en zonas alrededor de la sección, con hematoxilina
de Mayor. Esto proporciona a los cortes microscópicos una
apariencia ligeramente oscura pero no afecta de ningún modo a la
tinción nuclear. Para remediar esto, se usa ácido acético glacial
al 10-12% en alcohol al 95%, para "limpiar" los
cortes microscópicos tras la hematoxilina de Mayor. Siguiendo con
unas pocas inmersiones en carbonato de litio acuoso saturado, los
núcleos se vuelven azules inmediatamente. Esto es opcional, el
lavado con agua corriente durante 20 minutos es suficiente para
teñir de azul los núcleos.
En una realización, puede usarse el tinte Sakura
Finetek DRS-60 según la presente invención.
Pueden fijarse las células del músculo con PFA
al 4% durante 30 min a temperatura ambiente. Luego han de lavarse
las células 3 veces, 5 min con PBS. A continuación, se incuban las
células durante 5 min a temperatura ambiente en yoduro de propidio
1,25 ug/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
En primer lugar, se repiten las tres etapas de
tinción con PI excepto que se realiza la contratinción con DAPI. Se
prepara la disolución madre de DAPI
(4'-6-diamidino-2-fenilindol
2HCl') (Serva) con 0,2 mg/ml de agua destilada. Se preparan las
disoluciones de tinción con 0,2 - 0,4 \mug/ml de tampón PBS.
Se anega con disolución de DAPI, se cubre con
cubreobjeto y se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente
durante 5-15 minutos. Luego se aclara brevemente con
PBS.
Se fijan las células del músculo con PFA al 4%
durante 30 min a temperatura ambiente. Se lavan las células 3 veces
durante 5 min con PBS. Luego se incuban las células durante 5 min a
temperatura ambiente en Hoechst 33258 0,5 ug/ml. Se lavan
brevemente con PBS.
Se realizaron procedimientos de hibridación de
tipo Northern y de aislamiento de ARN habituales para determinar la
abundancia relativa de ARNm específicos para troponina I lenta
(TNIs), troponina rápida I (fTnl), y cada factor regulador del
músculo (MRF). Se aísla el ARN de las muestras de músculo congeladas
mediante extracción ácida con isotiocianato de
guanidinio/fenol/cloroformo seguida de precipitación con isopropanol
(Chomczynski y Sacchi, 1987). Se obtiene el ARN de mamíferos, por
ejemplo ratas o seres humanos.
Se reúnen músculos análogos de 4 a 6 sujetos
diferentes. Se aísla el ARN del músculo total de una manera similar
y sirve como control negativo. Se fraccionan las muestras de ARN (20
ug) mediante electroforesis a través de geles de
formaldehído/agarosa al 1% (Lehrach et al., 1977), se
transfieren a Nytran (Schleicher y Schuell, Keene, NH) y se
inmovilizan mediante entrecruzamiento con UV. Se seleccionan al azar
sondas de ADNc cebadas (actividad específica \geq 1 x 10*8
cpm/ug) entonces se hibridan a las membranas a 65 C en 6 x SSC (1 x
SSC consiste en Tris-Cl, 15 M, pH 7,5, 5 x
disolución de Denhardt, AEDT 2 mM, pH 8,0, SDS al 0,5%) y ADN de
esperma de salmón desnaturalizado 100 ug/ml. Las sondas de ADNc
usadas en este estudio incluyen MRF4 de rata (Davis et al.,
1987), miogenina de rata (Wright, et al., 1989),
Myf-5 humano (Braun et al., 1989), y
troponina I lenta y rápida de ratón (Koppe et al., 1989).
Tras la hibridación, se lavan todas las membranas durante 1 h a 65C
en 0,1 x SSC, SDS al 0,2%, excepto para las sondas con
Myf-5 y MyoD que se lavan en 0,5 x SSC, SDS al
0,2%. En algunos casos, se eliminan las sondas hibridadas de los
filtros lavando las membranas en Tris-Cl 5 mM, pH
7,5, EDTA 0,2 mM, pH 8,0, pirofosfato al 0,05%, y 0,1 x Denhardt a
65C durante de 1 a 2 h. Luego se aclaran los filtros brevemente en
2 x SSPE (1 x SSPE consiste en NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 10 mM,
EDTA 1 mM, pH 7,4) tras lo que se realizan hibridaciones
adicionales. Para cuantificar los autorradiogramas obtenidos de los
análisis de hibridación de tipo Northern, se realizó una evolución
densitométrica usando un densitómetro láser Ultrascan XL (Pharmacia
LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Se exploran múltiples
exposiciones a autorradiograma para garantizar que las densidades
de banda permanecen dentro del intervalo de respuesta lineal de la
película.
La presente invención proporciona un método más
rápido, más sencillo, más sensible y más preciso para evaluar la
atrofia muscular como parámetro para determinar la difusión y/o la
potencia de la toxina. El método comprende la etapa de comparar un
índice nuclear del músculo que se sospecha que está atrofiado con el
de un músculo que es normal. Preferiblemente, la presente invención
proporciona un método de evaluar la atrofia muscular debida a los
efectos de la toxina Clostridium comparando un índice nuclear del
músculo al que se le inyecta toxina clostridial con el de un
músculo análogo al que no se le inyecta toxina clostridial.
Se descubre actualmente que el índice nuclear
varía proporcionalmente con el grado de atrofia muscular. Por
ejemplo, la figura 2 (y 3) muestra que la zona de núcleos (y número
de núcleos) en un músculo es inversamente proporcional a la masa
muscular. La figura 4 muestra que un aumento en la zona de núcleos
corresponde a una masa muscular inferior. Por tanto, el alcance de
los cambios en el índice nuclear revela el alcance de la atrofia
muscular. Por ejemplo, un pequeño aumento en la densidad de núcleos
tras una administración de toxina botulínica es indicativo de que
el músculo no se ha atrofiado mucho. Mientras que, un gran
incremento en núcleos es indicativo de que el músculo se ha
atrofiado significativamente.
En una realización, el alcance de los cambios en
el índice nuclear, que es el cambio en peso muscular y diámetro de
la fibra, de los diversos músculos inyectados, demostrará la
actividad inherente de una toxina, por ejemplo toxina botulínica,
en un sitio terapéuticamente relevante. Además, puede cuantificarse
el potencial de difusión de la proteína toxina en una formulación
dada dentro de los mismos mamíferos mediante el alcance de la
atrofia muscular de los músculos (de diversos tipos de fibras)
periféricos al sitio de inyección.
Puede determinarse el alcance de la atrofia
muscular en respuesta al tratamiento con toxina botulínica en
cuanto a disminuciones en peso muscular y diámetro de la fibra
muscular usando los métodos de esta invención.
Se inyectan a ratas adultas por vía
intramuscular una dosis única de toxina botulínica en la zona del
centro del vientre (ubicación de la lámina terminal motora) de cada
músculo gemelo izquierdo de rata. Las dosis están a un nivel bajo
de 0 a 2,5 U por rata (hasta \sim10 U/kg) para minimizar la
toxicidad sistémica que puede ser un factor de confusión para la
evaluación de los efectos farmacológicos locales. En un punto de
tiempo determinado en el plazo de las dos semanas desde la
administración, se recogerán varios músculos de las patas traseras
inyectadas para evaluaciones histopatológicas y gravimétricas. La
recogida de músculo incluye músculos de diferentes tipos de fibras:
el músculo inyectado (gemelo), dos músculos inmediatamente
adyacentes al sitio de inyección (bíceps femoral y sóleo), y dos
músculos más alejados del sitio de inyección (perineo y tibial).
Los cambios en el peso muscular pueden
normalizarse frente al peso corporal de cada rata. El alcance de las
disminuciones en peso muscular puede expresarse mediante
comparación con los músculos de cada músculo no inyectado de rata,
pata contralateral o con controles a los que se inyecta placebo.
La evaluación histopatológica puede implicar la
evaluación cualitativa sobre una escala convencional (grado 1 a 5,
correspondiente a la reducción mínima hasta máxima en diámetro de la
fibra) o medición cuantitativa con evaluación morfométrica asistida
por ordenador. Véanse las figuras 9 y 10.
Se inyectó ratas Sprague Dawley hembra (adultas
jóvenes, de aproximadamente 250 gramos de peso corporal) una dosis
única de un complejo de toxina botulínica tipo A (BOTOX®) solamente
en el músculo gemelo izquierdo. Las dosis individuales inyectadas
en los músculos gemelos izquierdos de ratas separadas fueron 0,04
unidades, 0,07 unidades, 0,12 unidades, 0,21 unidades, 0,37
unidades, 0,65 unidades y 1,1 unidades. Adyacente al músculo gemelo
izquierdo al que se le inyectó toxina estaban los músculos bíceps
femoral no inyectado y sóleo izquierdo no inyectado. El músculo
gemelo derecho, el músculo bíceps femoral derecho y el músculo sóleo
derecho de cada rata no se inyectaron y por tanto se conservaron
como controles. Los músculos (músculo gemelo) de las patas traseras
tanto izquierda como derecha (inyectada y no inyectada), así como
los músculos sóleo y bíceps femoral derecho no inyectado e
izquierdo no
inyectado, se extrajeron a los 14 días tras la administración en los músculos gemelos izquierdos y luego se pesaron.
inyectado, se extrajeron a los 14 días tras la administración en los músculos gemelos izquierdos y luego se pesaron.
La figura 11 muestra el resultado de este
experimento en el que se inyectó al músculo gemelo izquierdo de
diferentes ratas cantidades variantes de una toxina botulínica tipo
A. El eje y muestra la razón (como porcentaje) del peso del músculo
gemelo izquierdo al que se inyectó toxina de la rata con respecto al
peso del músculo gemelo derecho no inyectado de la misma rata. El
eje x muestra la cantidad en unidades de la toxina botulínica tipo
A que se inyectó en el músculo gemelo izquierdo.
La figura 12 muestra el resultado de este
experimento en el que se inyectaron en el músculo gemelo izquierdo
de diferentes ratas cantidades variantes de una toxina botulínica
tipo A. El eje y muestra la razón (como porcentaje) del peso del
músculo bíceps femoral izquierdo no inyectado (que está adyacente al
músculo gemelo izquierdo de la rata al que se le inyectó toxina)
con respecto al peso del músculo bíceps femoral derecho no
inyectado de la misma rata. El eje x muestra la cantidad en unidades
de la toxina botulínica tipo A que se inyectó en el músculo gemelo
izquierdo.
La figura 13 muestra el resultado de este
experimento en el que se inyectaron en el músculo gemelo izquierdo
de diferentes ratas cantidades variantes de una toxina botulínica
tipo A. El eje y muestra la razón (como porcentaje) del peso del
músculo sóleo izquierdo no inyectado (que está adyacente al músculo
gemelo izquierdo de la rata al que se le inyectó toxina) con
respecto al peso del músculo sóleo derecho no inyectado de la misma
rata. El eje x muestra la cantidad en unidades de la toxina
botulínica tipo A que se inyectó en el músculo gemelo
izquierdo.
Tal como se muestra en las figuras
11-13, la inyección de BOTOX® provocó atrofia
muscular (y disminución del peso muscular) en el músculo de la
inyección (músculo gemelo izquierdo) y sitios adyacentes (músculos
bíceps femoral izquierdo y sóleo izquierdo). El músculo gemelo
izquierdo inyectado mostró una excelente disminución relacionada
con la dosis en el peso muscular que se modeló bien con una función
estadística (regresión logística de 4 parámetros). Se calculó una
DE_{50} (la dosis requerida para alcanzar el 50% del nivel máximo
posible de respuesta) para la respuesta del peso muscular (0,47
U/rata) y se asocia con un intervalo de confianza muy bueno (error
estándar = 0,03), que muestra, por tanto, que éste es un método
in vivo preciso y viable para evaluar la potencia
farmacológica de una toxina botulínica tal como BOTOX®. La reducción
del peso muscular es un criterio de valoración más sensible que la
letalidad, ya que la dosis DE_{50} para el peso muscular de rata
(0,47 U) es más de 2 veces inferior al ensayo de DL_{50} de ratón
basándose en unidades por animal. Los músculos que se inyectaron
mostraron una DE_{50} inferior que los músculos adyacentes (0,65 U
para bíceps femoral izquierdo y 1,16 U para sóleo izquierdo) en los
que la toxina se difundió desde el músculo gemelo inyectado. La
razón de DE_{50} de un músculo adyacente con respecto al músculo
gemelo puede usarse como medida de la difusión de BOTOX®. Estos
datos sostienen el uso del peso muscular para evaluar la difusión y
la potencia en un único sistema de prueba.
Una evaluación de la potencia de una toxina
botulínica con los ensayos descritos en el presente documento para
medir la atrofia muscular y peso muscular posterior a una inyección
intramuscular (i.m.) de una toxina botulínica es más clínicamente
relevante que el criterio actual. El criterio actual (ensayo de la
potencia de DL_{50} i.p. de ratón) implica una inyección
intraperitoneal (i.p.) seguida de monitorización de la mortalidad
en el ratón. Sin embargo, ya toxina botulínica se usa normalmente de
manera i.m. (nunca i.p.), la exposición intramuscular es más
clínicamente relevante. Además, el enfoque i.m. permite la
evaluación de una dosis eficaz por unidad de masa muscular (dosis
por gramo de músculo), que puede permitir a los médicos determinar
cuánto de una toxina botulínica han de inyectar en los músculos de
diversos tamaños.
Adicionalmente, el ensayo de la atrofia y peso
muscular descrito en el presente documento es una herramienta útil
para evaluar la difusión de una toxina botulínica, que es una
propiedad importante a evaluar en el desarrollo de nuevas
formulaciones para toxinas botulínicas. Es necesaria una difusión
leve dentro del músculo inyectado para lograr una respuesta
terapéutica completa, mientras que siempre es indeseable la difusión
extensa a sitios distales debido a que esto puede dar como
resultado efectos secundarios adversos graves. Para optimizar la
formulación, ha de entenderse el grado de difusión deseable para
tratar un estado clínico específico. Una determinación del peso y
la atrofia de los músculos adyacentes y distales al sitio de
inyección puede proporcionar información crítica sobre si una
formulación nueva es potencialmente útil.
Claims (6)
1. Método para determinar un efecto de una
toxina botulínica, comprendiendo el método la etapa de administrar
una toxina botulínica a un músculo de un mamífero no humano, y
determinar una densidad de núcleos o una zona de núcleos de una
muestra del músculo al que se ha administrado la toxina
botulínica.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la toxina botulínica es una toxina botulínica tipo A, B, C_{1},
D, E, F o G.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
la toxina botulínica es una toxina botulínica tipo A.
4. Método para determinar una atrofia
muscular, comprendiendo el método la etapa de administrar una toxina
botulínica a un músculo de un mamífero, y determinar una densidad
de núcleos o una zona de núcleos de una muestra del músculo al que
se ha administrado la toxina botulínica.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
la toxina botulínica es una toxina botulínica tipos A, B, C_{1}
D, E, F o G.
6. Método según la reivindicación 4, en el que
la toxina botulínica es la toxina botulínica tipo A.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US30998801P | 2001-08-03 | 2001-08-03 | |
| US309988P | 2001-08-03 | ||
| US208165 | 2002-07-29 | ||
| US10/208,165 US6984375B2 (en) | 2001-08-03 | 2002-07-29 | Nuclei density and nuclei area methods for determining effects of a botulinum toxin on muscles |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2278965T3 true ES2278965T3 (es) | 2007-08-16 |
Family
ID=26902958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02773168T Expired - Lifetime ES2278965T3 (es) | 2001-08-03 | 2002-08-02 | Metodos de determinacion de los efectos de toxinas botulinicas. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6984375B2 (es) |
| EP (1) | EP1411991B1 (es) |
| JP (1) | JP4214053B2 (es) |
| AT (1) | ATE350067T1 (es) |
| DE (1) | DE60217357T2 (es) |
| ES (1) | ES2278965T3 (es) |
| WO (1) | WO2003015829A2 (es) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6859652B2 (en) | 2000-08-02 | 2005-02-22 | Mobile Satellite Ventures, Lp | Integrated or autonomous system and method of satellite-terrestrial frequency reuse using signal attenuation and/or blockage, dynamic assignment of frequencies and/or hysteresis |
| US7792488B2 (en) | 2000-12-04 | 2010-09-07 | Atc Technologies, Llc | Systems and methods for transmitting electromagnetic energy over a wireless channel having sufficiently weak measured signal strength |
| US6984375B2 (en) * | 2001-08-03 | 2006-01-10 | Allergan, Inc. | Nuclei density and nuclei area methods for determining effects of a botulinum toxin on muscles |
| US7691394B2 (en) * | 2002-05-28 | 2010-04-06 | Botulinum Toxin Research Associates, Inc. | High-potency botulinum toxin formulations |
| JP4979690B2 (ja) | 2006-04-28 | 2012-07-18 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | 神経毒素の定量方法 |
| US20090076342A1 (en) * | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Corventis, Inc. | Adherent Multi-Sensor Device with Empathic Monitoring |
| US8506970B2 (en) * | 2008-10-14 | 2013-08-13 | Dt Scimed, Llc | Dose and localization of botulinum toxins in skin and muscle |
| JP5703508B2 (ja) * | 2009-07-09 | 2015-04-22 | 株式会社Ｕｂｅ科学分析センター | 毒性試験法 |
| CA2801421A1 (en) * | 2010-06-11 | 2012-04-12 | Synaptic Research, Llc | N-end rule protease activity indication methods and uses thereof |
| KR101640694B1 (ko) | 2011-09-29 | 2016-07-18 | 셀스냅, 엘엘씨 | 독소생산능 시험용 조성물 및 방법 |
| RU2704808C2 (ru) | 2013-06-28 | 2019-10-31 | Мерц Фарма Гмбх Энд Ко. Кгаа | Средства и способы для определения биологической активности полипептидов нейротоксина в клетках |
| US20190030118A1 (en) * | 2017-07-27 | 2019-01-31 | Ipsen Biopharm Limited | Treatment of lower limb spasticity |
| US11752335B1 (en) | 2018-02-07 | 2023-09-12 | Mary Kay Inc. | Method for determining facial muscle responses |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5183462A (en) * | 1990-08-21 | 1993-02-02 | Associated Synapse Biologics | Controlled administration of chemodenervating pharmaceuticals |
| US5401243A (en) * | 1990-08-21 | 1995-03-28 | Associated Synapse Biologics | Controlled administration of chemodenervating pharmaceuticals |
| US5158976A (en) * | 1990-10-29 | 1992-10-27 | The Children's Medical Center Corporation | Controlling glutamine/glutamate related neuronal injury |
| US6485413B1 (en) * | 1991-04-29 | 2002-11-26 | The General Hospital Corporation | Methods and apparatus for forward-directed optical scanning instruments |
| US5548661A (en) * | 1991-07-12 | 1996-08-20 | Price; Jeffrey H. | Operator independent image cytometer |
| US5314805A (en) * | 1991-10-28 | 1994-05-24 | Molecular Probes, Inc. | Dual-fluorescence cell viability assay using ethidium homodimer and calcein AM |
| WO1994000481A1 (en) * | 1992-06-23 | 1994-01-06 | Associated Synapse Biologics | Pharmaceutical composition containing botulinum b complex |
| US6309883B1 (en) * | 1994-02-17 | 2001-10-30 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
| US5766605A (en) * | 1994-04-15 | 1998-06-16 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Treatment of autonomic nerve dysfunction with botulinum toxin |
| US6416959B1 (en) * | 1997-02-27 | 2002-07-09 | Kenneth Giuliano | System for cell-based screening |
| JP3692033B2 (ja) * | 1997-07-15 | 2005-09-07 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド | 泌尿器疾患及び関連疾患の治療のための神経毒治療法の使用 |
| JP2002512977A (ja) * | 1998-04-29 | 2002-05-08 | アラーガン・セイルズ・インコーポレイテッド | クロストリディウム属細菌の神経毒の作用を延長させる組成物および方法 |
| US6113915A (en) * | 1999-10-12 | 2000-09-05 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating pain |
| US6265379B1 (en) * | 1999-10-13 | 2001-07-24 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating otic disorders |
| US6429189B1 (en) * | 1999-12-10 | 2002-08-06 | Botulinum Toxin Research Associates, Inc. | Cytotoxin (non-neurotoxin) for the treatment of human headache disorders and inflammatory diseases |
| US6143306A (en) * | 2000-01-11 | 2000-11-07 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating pancreatic disorders |
| US6337075B1 (en) * | 2000-01-11 | 2002-01-08 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating diabetes |
| US6306403B1 (en) * | 2000-06-14 | 2001-10-23 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating parkinson's disease with a botulinum toxin |
| WO2002010745A2 (en) * | 2000-07-28 | 2002-02-07 | Cytyc Health Corporation | Cytological evaluation of breast duct epithelial cells retrieved by ductal lavage |
| US7273722B2 (en) * | 2000-11-29 | 2007-09-25 | Allergan, Inc. | Neurotoxins with enhanced target specificity |
| AU2002320127A1 (en) * | 2001-06-21 | 2003-01-08 | Surromed, Inc. | Covalent coupling of botulinum toxin with polyethylene glycol |
| AU2002318437A1 (en) * | 2001-06-29 | 2003-03-03 | Clinomics Biosciences, Inc. | Evaluating neuropsychiatric diseases using a specimen-linked database |
| US6984375B2 (en) * | 2001-08-03 | 2006-01-10 | Allergan, Inc. | Nuclei density and nuclei area methods for determining effects of a botulinum toxin on muscles |
-
2002
- 2002-07-29 US US10/208,165 patent/US6984375B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-02 JP JP2003520786A patent/JP4214053B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-08-02 ES ES02773168T patent/ES2278965T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-02 EP EP02773168A patent/EP1411991B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-02 DE DE60217357T patent/DE60217357T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-02 AT AT02773168T patent/ATE350067T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-08-02 WO PCT/US2002/024478 patent/WO2003015829A2/en active IP Right Grant
-
2004
- 2004-08-13 US US10/918,845 patent/US7229605B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-05-16 US US11/749,427 patent/US20070218005A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6984375B2 (en) | 2006-01-10 |
| ATE350067T1 (de) | 2007-01-15 |
| JP4214053B2 (ja) | 2009-01-28 |
| US7229605B2 (en) | 2007-06-12 |
| EP1411991A2 (en) | 2004-04-28 |
| JP2005509145A (ja) | 2005-04-07 |
| WO2003015829A3 (en) | 2003-12-18 |
| US20030026760A1 (en) | 2003-02-06 |
| EP1411991B1 (en) | 2007-01-03 |
| DE60217357D1 (de) | 2007-02-15 |
| DE60217357T2 (de) | 2007-11-15 |
| US20050019338A1 (en) | 2005-01-27 |
| WO2003015829A2 (en) | 2003-02-27 |
| US20070218005A1 (en) | 2007-09-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20070218005A1 (en) | Nuclei density and nuclei area methods for determining the effects of a botulinum toxin on muscles | |
| ES2287117T3 (es) | Uso de una toxina botulinica pra la fabricacion de un medicamento de administracion periferica para tratar dolor no asociado al espasmo muscular ni al dolor de cabeza. | |
| Simpson | The life history of a botulinum toxin molecule | |
| US9629904B2 (en) | Botulinum toxin compositions | |
| US6328977B1 (en) | Method for treating hyperparathyroidism | |
| US20070140968A1 (en) | Method for determining botulinum potency | |
| JP2004503504A (ja) | 運動障害の処置法 | |
| US20040060569A1 (en) | Surface topography method for determining effect of a botulinum toxin upon a muscle | |
| ES2278196T3 (es) | Toxinas botulinicas para tratar el priapismo. | |
| Ferrari et al. | Synthetic self-assembling clostridial chimera for modulation of sensory functions | |
| US20040219619A1 (en) | Methods of identifying compounds that alter toxin persistence and/or protease activity | |
| US20050129677A1 (en) | Lipid rafts and clostridial toxins | |
| US20050013850A1 (en) | Device to assist hyperhydrosis therapy | |
| Rossetto et al. | Tetanus, botulinum and snake presynaptic neurotoxins | |
| AU2012202204B2 (en) | Improved botulinum toxin compositions | |
| Torrado | Molecular Targets of Botulinum Toxin Serotypes A and C: An Experimental in-vitro and in-vivo Study |