ES2276675T3

ES2276675T3 - Deteccion de una nueva actividad superantigenica en una muestra bilogica.

Info

Publication number: ES2276675T3
Application number: ES00912720T
Authority: ES
Inventors: Herve Perron; Monique Lafont
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1999-03-19
Filing date: 2000-03-20
Publication date: 2007-07-01
Anticipated expiration: 2020-03-20
Also published as: EP1163522B1; DE60031963D1; FR2791140B1; ATE346299T1; CA2366552A1; WO2000057185A1; FR2791140A1; EP1163522A1; US20060088820A1; DE60031963T2; JP2002539804A; AU3437700A

Abstract

Procedimiento de detección de la esclerosis en placas, o de una predisposición a desarrollar la esclerosis en placas, en una muestra biológica, caracterizado por el hecho de que se detecta una actividad superantígena inducida por el producto de expresión del gen env de MSRV-1 ó de un fragmento del gen env del MSRV-1, comprendiendo, o consistiendo, el citado gen env de MSRV-1, en la secuencia referenciada en SEQ ID NO : 1, ó por el hecho de que se detecta una actividad superantigénica inducida por el producto de expresión del gen env de una variante de MSRV-1, ó de un fragmento del gen env de la citada variante, presentando, el citado gen env de la citada variante, una homología de por lo menos un 90%, con el gen env de MRSV-1, evidenciando una expresión o una pérdida de linfocitos elegidos entre los linfocitos portadores de un determinante Va16 y/o Va17, y los linfocitos portadores de un determinante Va17, siendo, la citada expansión o la citada pérdida, de por lo menos un 31%.

Description

Detección de una nueva actividad superantigénica en una muestra biológica.

La esclerosis en placas (SEP), es una enfermedad crónica del sistema nervioso central del hombre, que evoluciona mediante la sucesión de fases de remisión y de rebrote, o según una progresión regular, cuya característica anatomopatológica, consiste en la formación de zonas de desmielinización bien delimitadas en la substancia blanca del cerebro y de la médula espinal.

Al nivel histológico, estas zonas, representan un estado precoz del proceso de lesión, una degradación de la mielina peri-axonal, asociada a una ataque de las células gliales, responsable de esta desmielinización. Una activación mocrófaga inflamatoria que implica las células microgliales (macrófagos de tejidos, residentes del sistema nervioso central), así como, probablemente, macrófagos que proceden de monocitos sanguíneos infiltrados, se encuentra asociada a este proceso de desmielinización y contribuye a la destrucción de las laminillas mielinizadas. En el centro de la zona desmielinizada, se encuentra una depleción relativa en células gliales, mientras que se desarrolla una proliferación de astrocitos en la periferia, y puede invadir la placa desmielinizada, para generar una placa fibrosa o gliótica. Estas estructuras escleróticas, son el origen del nombre que se da a la enfermedad.

Otra característica de estas placas, es su asociación casi sistemática con un elemento vascular, alrededor del cual, éstas se desarrollan.

Al nivel histológico, se observa una alteración frecuente de la barrera hemato-encefálica (BHE), constituida por el endotelio capilar. Unos de los elementos determinantes en el mantenimiento de la BHE, se encuentra constituido por la presencia subyacente de extensiones citoplásmicas de los astrocitos, denominados pies astrocitarios. Probablemente, los pies astrocitarios, inducen la formación o permiten el mantenimiento de estructuras de unión estancas, que aseguran la cohesión de la barrera endotelial capilar, concretizando la BHE. Ahora bien, diferentes modelos patológicos, tienen en cuenta el establecimiento de la alteración de la BHE y de una depleción de los pies astrocitarios.

Además, en el proceso de lesión de la SEP (esclerosis en placas), la alteración de la BHE (barrera hemato-encefálica, contribuye a amplificar la respuesta inflamatoria asociada, por el aflujo de células linfoides procedentes de la circulación sanguínea. La contribución de la inflamación, asociada a las células inmunitarias, es importante en la SEP, y participa en el proceso de lesión.

La etiología de la SEP, es el origen de un debate de actualidad, debido al hecho de que, la enfermedad, podría tener causas múltiples. Se han avanzado argumentos, a favor de una hipótesis bacteriana, vírica o auto-inmune.

Los retrovirus, son candidatos potencialmente interesantes para el estudio histológico de la esclerosis en placas, por analogía con una enfermedad ovina muy próxima de la SEP, inducida en la oveja, mediante un retrovirus exógeno: el virus MAEDI-VISNA. La infección experimental de las ovejas, por inoculación intra-ventricular de cepas neurovirulentas del virus VISNA, ha permitido establecer la responsabilidad de este virus en la génesis de la infección desmielinizante de la oveja.

Se han realizado numerosos trabajos, con objeto de sostener la hipótesis de una etiología vírica de la enfermedad y, el descubrimiento de que el HTLV-1, un oncovirus, se encuentra asociado a una mielopatía crónica y progresiva, la Paraparesia Espástica Tropial (PST), ha relanzado el interés por los virus, sin que haya podido establecerse un vínculo de unión de causalidad entre el virus y la esclerosis en placas.

Recientemente, los trabajos de H. Perron et al. (Res. Virol. 1989; 140, 551-5651; "Current Concepts in Múltiple Sclerosis", -Conceptos actuales de la Esclerois Múltiple-, Wiethöler et al., eds. Amsterdam, Elsevier, 1991, 111-116 et the Lancet; 337-862-863), han permitido aislar, a partir de una punción lumbar de líquido céfalo-raquídeo de un paciente SEP, una línea no inmortalizada de células linfoides, y evidenciar la presencia de un virus que presentan las características de un retrovirus, y que muestra, en particular, un pico correspondiente a una actividad transcriptasa inversa, en el sobrenadante de cultivo de esta línea. Todavía más recientemente, estos mismos autores, han obtenido, a partir de este pico de actividad transcriptaza inversa, un ADN complementario, que corresponde al gen pol, que codifica para la enzima RT (transcriptasa inversa o "reverse transcriptase"). Este retrovirus, denominado MSRV, por parte de los autores, se ha caracterizado, de una forma especial, al nivel genómico, en el documento de prioridad, de solicitud de patente internacional PCT WO 99/02 666. El análisis filogénico, por comparación de la secuencia de la región pol de MSRV con otras secuencias pol disponibles en las bases de los datos, ha permitido mostrar que, el MSRV, se encuentra próximo a la familia ERV-9 (endogenous retrovirus-9-[retrovirus endógeno 9]).

Además, Perron et al (J. Neuroimmunol. 1998; 90, 658, "poster abstract" 380 - resumen de cartel 380), divulga la noción de que, el retrovirus MSRV, podría tener una actividad superantigénica, asociada a la esclerosis en placas.

Además, F. Beseme et al., en el documento de prioridad de la solicitud de patente internacional PCT 99/02 696, han separado un banco de ADNc, con la ayuda de una sonda Ppol-MSRV, y han detectado clones que se traslapan, que les han permitido reconstruir un ARN genómico putativo de 7582 nucleótidos. Este ARN genómico, presenta una estructura R-U5-gag-pol-env-U3-R, característica de los retrovirus, y una interrogación de varias bases de datos, ha permitido mostrar que existe una cantidad importante de secuencias genómicas (ADN) emparentadas, en el genoma humano, que se encuentran sobre varios cromosomas. Los autores, han evidenciado también la existencia de estructuras parciales del tipo retrovírico en el genoma humano, y han considerado su rol interpretativo potencial en las enfermedades auto-inmunes, como la esclerosis en placas. Esta nueva familia de retrovirus endógenos, se ha denominado HERV-W, a raíz de sus características estructurales. El análisis filogénico en la región pol, ha mostrado que, la familia HERV-W, se encuentra filogénicamente próximo a las familias ERV-9- y RTVL-H, y pertenece, por lo tanto, a las familias de los retrovirus endógenos del tipo I. Además, el análisis filogénico del tramo de lectura abierta de env, muestra el hecho de que, éste, se encuentra más próximo a los retrovirus símicos del tipo D y a los retrovirus de la reticuloendoteliosis aviar, que a los retrovirus mamíferos del tipo C, sugiriendo una estructura de genoma quimérica C/D. Los análisis de los árboles filogénicos, muestran el hecho de que, las familias ERV-9 y HERV-W, derivan de dos vagos de inserción independientes.

La proteína de la envoltura de MSRV-1, codificada por el gen env de MSRV-1, y sus variantes, presenta homología muy grande con la proteína env de HERV-W, codificada por el ARN expresado en la placenta humana, tal como el que se describe en el documento de solicitud de patente internacional WO-99/02 696, a nombre del solicitante.

El retrovirus SRV, se encuentra genéticamente emparentado a la familia HERV-W.

Las variantes de MSRV-1, tienen un gen env, el cual presenta, de una forma ventajosa, una homología de por lo menos un 90%, de una forma preferente, de por lo menos un 95%, o incluso de un 98%, con el del MSRV-1.

Todos estos elementos, abogan en favor de la implicación de elementos retrovíricos en la esclerosis en placas.

Parece ser probable, además, ahora, el hecho de que, las manifestaciones auto-inmunes, pueden estar inducidas por la expresión de superantígenos (SAgs).

Los superantígenos, son moléculas susceptibles de poder unirse a moléculas de clase II del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH), y tiene secuencias peptídicas características de ciertas familias de receptores de las células T (V\beta). Estos superantígenos, activan un gran número de clones T, independientemente del péptido antigénico reconocido por su TCR (receptor de células T), en asociación con el CMH de la célula representante de los antígenos. La consecuencia de esta activación, es una proliferación policlonal o una inducción de energía, o incluso apoptosis, en la población linfocítica T, portadora de este (V\beta). Los superantígenos, son productos de expresión de micro-organismos, tales como las bacterias y retrovirus exógenos o endógenos.

Ciertas moléculas que tienen propiedades próximas a ciertos efectos conocidos para los superantígenos, pueden también ser responsables de procesos inmunopatológicos mayores, y se denominan "superantígenes-like" (semejantes a los superantígenos). En la parte que sigue de la presente descripción, éstos se incluyen en el mismo término superantígeno.

El receptor T (TCR), presente en la superficie de los linfocitos e implicado en el reconocimiento de un antígeno o de un superantígeno, se encuentra constituido por dos cadenas, una cadena \alpha de 40 a 50 kDa y una cadena \beta de 35 a 47 KDa, unidas entre ellas, mediante un puente disulfuro. Cada cadena polipeptídica, comprende dos regiones de aproximadamente 110 aminoácidos, cada una, las cuales se encuentra organizada como las regiones de las inmunoglobulinas. Éstas se encuentran ancladas en la membrana plásmica, mediante un péptido transmembranario, y poseen una corta cola citoplásmica. La diferencia de peso molecular entre las dos cadenas \alpha y \beta, es debida a la presencia de una cadena carbohidratada, en posición N-terminal de la cadena \alpha. La variabilidad de secuencias en aminoácidos, reside en la región N-terminal de cada polipéptido \alpha y \beta, homólogos de las regiones variables de las inmunoglobulinas. Cada sector, se encuentra codificado por un orden de redistribución de genes, V, D y J, para la cadena \beta, y V y J, para la cadena \alpha. El análisis de las secuencias de estas diferentes regiones TCR V, revela una gran variabilidad, la cual corresponde a las regiones hipervariables de las inmunoglobulinas (CDRs) (Roitt I. Et al., Immunology 3ª edición, Mosby, Inglaterra).

El orden de redistribución de los genes del TCR, es similar a de los genes de las inmunoglobulinas. La diversidad de los TCR, proviene de una recombinación genética entre los segmentos V, D y J. Los genes V\betas, que incluyen los genes D, J y C, se encuentran agrupados conjuntamente, con la excepción de V\beta 14, el cual se encuentra presente en la extremidad 3' del locus. Se genera una diversidad extensiva, durante los procedimientos de reagrupamiento de las regiones V-D-J, pero también, de las V-J y V-D-D-J.

Un superantígeno, es capaz de activar los linfocitos T, de una forma no específica, contrariamente a un antígeno. Un superantígeno, es capaz de fijarse conjuntamente a las moléculas del CMHII, presentes en la superficie de las células presentadoras del antígeno y a las moléculas V\betas del receptor T presente en la superficie de las células T. La cadena V\beta del TCR, fija el superantígeno al exterior del sitio específico de antígeno del TCR, pero ello es suficiente para activar la célula T. Esta fijación, conlleva una inducción de señales intracelulares en la célula T. Estas cascadas de señales intracelulares, inducen, o bien ya sea la proliferación de la célula T que porta el V\beta de interés, o bien ya sea una anergia o una apoptosis de la célula. Así, de este modo, en función de las condiciones experimentales, el efecto sobre la sub-población de los linfocitos T, activada, puede ser un efecto de proliferación, de anergia o de apoptosis policlonal. Contrariamente a una respuesta T a un antígeno clásico, la estimulación de los linfocitos T, es por lo tanto policlonal y no oligoclonal, incluso monoclonal (Scherer et al., 1993, Annu. Rev. Cell Biology 9: 101-128). Esta inducción de proliferación celular, de anergia o de apoptosis, depende de varios parámetros que actúan en combinación. Ésta depende, de una forma particular, de la concentración del superantígeno y de la existencia de encuentros previos de estimulaciones análogas que pretenden, como diana, el mismo V\beta, mediante el sistema inmunitario del donante de linfocitos T. La puesta en anergia o en apoptosis, puede seguir, entre otros una estimulación o activación prolongada de las células T. Así, de este modo, un superantígeno, tiene un efecto que induce una variación positiva o negativa de una sub-población de células T de V\beta "x" definido. Un superantígeno que pretende, como diana, un determinante antigénico V\beta "x" dado, interactuará con toda la sub-población linfocítica que porte este V\beta. El efecto inducido por esta interacción, acoplada con la que pretende, como diana, el CMHII de las células presentadoras del antígeno (APCs), es una variante significativa del porcentaje de los linfocitos V\beta "x", con relación a los otros linfocitos T V\beta, no "x". Esta variación es, de una forma típica, o bien ya sea una proliferación, o bien ya sea una depleción (Bernal A et al., 1999 J Clin Immunol. 19: 149; Li H et al., 1999 Annu Rev Immunol. 17: 435; Girgis et al., 1999 J Exp Med 189: 265; Lavoie et al., Immunol. Rev. 1999 168 257; Cornwell WD et Rlgers TJ, Immunology 1999 96: 193; Wang ZQ et al., Immunolgy 1998 94: 331; Maier CC et al., PNAS 1998 95: 4499; Michie CA et Cohen J, Trends Microbiol 1998 6: 61; La Bon A et al., Int Immunol 1999 11: 373; Shen X et Konig R, Int. Immunol 1998 10: 247; Noble A et al., J Immunol 1998 160: 559; Yang Y et al., Int Immunol 1998 10: 175; Renno T et al., J. Immunol 1999 162: 6312; Roitt I et al., Immunology third edition (3ª edición) Mosby).

Además, cuando el agente codificante para un superantígeno dado se evidencia en presencia de linfocitos T, y no únicamente en presencia de la molécula modificada que porta la actividad superantigénica, el efecto inmunitario resultante, corresponde a la superposición de un efecto superantigénico y de estimulaciones antigénicas variadas, causadas por los otros antígenos del agente entero. Debe tomarse debida nota en cuanto al hecho de que, contrariamente a la estimulación superantigénica, éstos últimos, pueden diferir, en función del HLA de clase II del donante de linfocitos o del paciente, en un contexto patológico. Esto tiene por consecuencia el hecho de que, la proliferación o la depleción T V\beta "x", se acompaña de un perfil de reactividad (proliferación o inhibición) de otras sub-poblaciones V\betas no "x", eventualmente variables, según el HLII; definiéndose, este perfil, por la naturaleza de los antígenos asociados al agente o a varios agentes (en este caso, de una cascada que conduce a la activación de un retrovirus endógeno que codifica para el superantígeno expresado en estas condiciones). En este último caso, pueden expresarse dos superantígenos, si el agente inductor produce uno y si la infección de una célula diana, reactiva mediante éste, un retrovirus endógeno, que produce entonces un segundo. Estos datos confirman por lo tanto la necesidad de evaluar un perfil completo de respuesta T, en función del V\beta, cuando se estudia un contexto "natural" de infección/reactivación, y no una molécula superantígena purificada fuera de contexto.

El solicitante, ha mostrado ahora que, la expresión de un superantígeno o de una proteína que tenga ciertos efectos del tipo superantígeno (superantigene-like -semejante a un superantígeno-), se encuentra asociada a un estado patológico, por ejemplo, un estado asociado a la esclerosis en placas.

La actividad superantígeno, se induce directamente o indirectamente mediante un agente efector, tal como una proteína o un microorganismo o un agente patógeno, en particular, un retrovirus (MSRV-1) y/o un agente patógeno (MSRV-2) y, en particular, un epítopo comprendido en una proteína env de un retrovirus MSRV-1.

Además, el solicitante, ha evidenciado igualmente una producción estimulada de citocinas, tales como la IL-6, en células mononucleadas sanguíneas procedentes de donantes sanos, y puestas en contacto con un extracto de sobrenadante o una fracción de un extracto de sobrenadante de cultivo celular SEP.

El solicitante, ha evidenciado, también, un perfil de respuesta T, en función de los V\beta, tiene un agente o agentes asociado(s) a la expresión de una molécula de tipo superantígeno.

Finalmente, el solicitante, ha observado el hecho de que, los mismos extractos procedentes de pacientes SEP y/o infectados mediante el retrovirus MSRV-1, inducen una muerte por apoptosis significativamente elevada, en las mismas células mononucleadas sanguíneas.

El solicitante, ha desarrollado, por lo tanto, un procedimiento para evidenciar los efectos anteriormente citados, arriba, en una muestra biológica.

Los criterios requeridos para establecer el hecho de que, una proteína o que un microorganismos, es o contiene un superantígeno o una proteína que tenga ciertos efectos de tipo superantígeno, son:

(i) la capacidad de la proteína o del microorganismo, para inducir la expansión o la pérdida de ciertas familias de linfocitos portadoras al nivel de su TCR de una cadena V\beta particular, y

(ii) una activación de los V\beta independiente del haplotipo del CMH de clase II.

Es conveniente tomar debida nota, en cuanto al hecho de que, cuando se habla de actividad superantígena, en la presente invención, esto significa de una forma indiferente, la expresión de un superantígeno o de una proteína que tenga ciertos efecto de tipo superantígeno (SAg-like).

La invención, se refiere también a un procedimiento de detección de la esclerosis en placas, o de una predisposición a desarrollar la esclerosis en placas, en una muestra biológica, procedimiento éste según el cual:

se detecta una actividad superantígena inducida por el producto de expresión del gen env de MSRV-1 ó de un fragmento del gen env del MSRV-1, comprendiendo, o consistiendo, el citado gen env de MSRV-1, en la secuencia referenciada en SEQ ID NO: 1; ó

se detecta una actividad superantígena inducida por el producto de expresión del gen env de una variante de MSRV-1, ó de un fragmento del gen env de la citada variante, presentando, el citado gen env de la citada variante, una homología de por lo menos un 90%, con el gen env de MSRV-1,

evidenciando una expresión o una pérdida de linfocitos elegidos entre los linfocitos portadores de un determinante V\beta16 y/o V\beta17, y los linfocitos portadores de un determinante V\beta17, siendo, la citada expansión o la citada pérdida, de por lo menos un 31%.

Según una variante ventajosa, se procede a evidenciar una expansión de linfocitos portadores de un determinante V\beta 16.

Según una variante ventajosa, se procede a evidenciar un perfil de una expansión de linfocitos portadores de un determinante V\beta 16 y de una co-expansión de linfocitos portadores de V\betas, elegidos de entre por lo menos uno cualquiera de los V\betas 2, 3, 7, 8, 12, 14, 17 y 22 y, de una forma preferente, los V\betas 3 y 12.

Según otra variante ventajosa, se procede a evidenciar una pérdida de linfocitos portadores de un determinante V\beta16.

Según otra variante ventajosa, se procede a evidenciar una pérdida de linfocitos portadores de un determinante V\beta 16 y una co-disminución de linfocitos portadores de V\betas, elegidos de entre por lo menos uno cualquiera de los V\betas 2, 3, 7, 8, 12, 14, 17 y 22 y, de una forma preferente, los V\betas 7, 14 y 17 y, de una forma ventajosa, de los V\betas 7
y 17.

La detección de la expansión y, eventualmente, de la co-expansión o de la pérdida y, eventualmente, co-disminución, se efectúa mediante la evidenciación de las moléculas V\betas membranarias, asociadas a las células mononucleadas sanguíneas, las cuales son, de una forma preferente, los linfocitos T. Se procede, a continuación, a calcular un porcentaje de variación de las células V\betas detectadas, y procedentes de la totalidad o de una parte del sobrenadante de cultivo de pacientes afectados de SEP, con relación al número de moléculas V\betas detectadas en la totalidad o en una parte de un sobrenadante de cultivo procedente de un donante sano. Es igualmente posible, el prever una mezcla de sobrenadantes de cultivo procedentes de donantes sanos.

El conjunto de las moléculas V\betas, se denomina repertorio V\betas de los linfocitos T. Las diferentes moléculas V\betas, se detectan de una forma específica, mediante la utilización de por lo menos una de las técnicas que se describen abajo, a continuación:

(a) bien ya sea mediante la utilización de por lo menos un ligando, es decir, toda molécula capaz de reconocer específicamente el V\beta a detectar mediante, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal anti-V\beta, o un fragmento de anticuerpo monoclonal o policlonal, o una molécula inhibidora de la función V\beta considerada. El porcentaje de la moléculas V\betas del repertorio, se lleva, entonces, a un porcentaje de las células que presentan la molécula CD3 en su superficie, siendo, ésta última, también detectada, de una forma específica, mediante la utilización de por lo menos un ligando. Por ligando, se entiende, especialmente, un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento de los citados anticuerpos, de una forma preferente, un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra un V\beta de interés, se producen mediante técnicas convencionales utilizadas para producir anticuerpos contra los antígenos de superficie. Se inmunizan ratones o conejos (i) bien ya sea con una proteína natural o recombinante, (ii) bien ya sea con un péptido inmunógeno, (iii) o bien ya sea con células murinas (múridas) que expresan la proteína o péptido de interés y las moléculas del CMHII. La línea murina Balb/c, es la que se utiliza, de una forma más frecuente. El inmunógeno, puede ser, igualmente, un péptido elegido entre los péptidos definidos a partir de las secuencias primarias de los V\betas de interés. Las proteínas o péptidos, se acoplan a la hemocianina de Lymphet Keyhole (péptido-KLH), como soporte para su utilización en inmunización, o se acoplan a la albúmina sérica humana (péptido-HSA). Los animales, son animales sometidos a una inyección del péptido-KLH ó del péptido-HSA, utilizando el adyuvante completo de Freund (IFA). Los sueros y los sobrenadantes de cultivo de hibridoma, procedentes de los animales inmunizados con cada péptido, se analizan para la presencia de anticuerpos, mediante el test de ensayo ELISA, utilizando las moléculas iniciales. Las células esplénicas de estos ratones, se recuperan y se fusionan con las células de mieloma. El polietilenglicol (PEG), es el agente de fusión más frecuentemente utilizado. Se seleccionan los hibridomas que producen los anticuerpos que son los más específicos y los más sensibles. Los anticuerpos monoclonales, pueden producirse in vitro, mediante cultivo celular de los hibridomas producidos, o mediante recuperación de líquido de ascitis murina, después de la inyección intraperitoneal de los hibridomas, en los ratones. Sea cual fuere el modo de producción en sobrenadante o en ascitis, es importante el proceder, a continuación, a purificar el anticuerpo monoclonal. Los procedimientos de purificación utilizados son, esencialmente, la purificación, sobre gel intercambiador de iones, o mediante cromatografía de exclusión, incluso la inmunoprecipitación. Para cada anticuerpo, hace falta elegir el procedimiento que permitirá obtener el mejor rendimiento. Se criba un número suficiente de anticuerpos, en estos tests de ensayo funcionales, para identificar los anticuerpos que presentan mejores prestaciones, para fijar la molécula de interés y/o para bloquear la actividad de la molécula de interés. Los anticuerpos monoclonales seleccionados, se humanizan, mediante procedimientos standard de "CDR grafting" (injerto de CDR) (protocolo realizado por numerosas compañías, en forma de servicio). Estos anticuerpos inmunizados, pueden someterse a tests de ensayo, clínicamente, en el paciente. La eficacia de estos anticuerpos, puede seguirse mediante parámetros clínicos. La producción in vitro de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos o de derivados de anticuerpos, tales como los anticuerpos quiméricos humanizados, o no producidos mediante ingeniería genética, en las células eucariotas, se ha descrito ya (patentes europeas EP 120 694 ó EP 125 023), y es también aplicable a la presente invención;

b) o bien ya sea mediante biología molecular después de la extracción de los ácidos nucleicos de las células mononucleadas sanguíneas, entre otras, los linfocitos T, puestos en presencia de sobrenadantes o de una fracción de sobrenadante de cultivo SEP, y en presencia de un cultivo de sobrenadante o de una fracción de sobrenadante de cultivo testigo, amplificación de sus ARN V\beta transcritos por RT-PCR, estudio del perfil de los productos de amplificación sobre gel y/o secuenciación y/o electroforesis. Para la etapa de RT-PCR y/o para detectar de forma específica los productos de amplificación, se utilizan fragmentos de ADN y/o de ARN, que codifican para el determinante V\beta estudiado o para un fragmento de este determinante, y/o de fragmentos de ADN y/o de fragmentos de ARN, capaces de hibridarse y de amplificar fragmentos de ácidos nucleicos que codifican para el determinante V\beta estudiado por complementariedad de las bases nucleicas. El perfil de los fragmentos amplificados, en donde, la talla, varía en función de la reordenación de la cadenas específicas de cada clon, se determina mediante análisis electroforético y permite objetivizar una policlonalidad. La detección de los fragmentos amplificados de ADN y/o de ARN, que codifican para el determinante V\beta estudiado, puede también realizarse mediante hibridación nucleotídica, según las técnicas bien conocidas por parte de las personas expertas de este arte especializado de la técnica (Southern Blot, Northern Blot, ELOSA, "Enzyme-Linked Oligosorbent Assay" -Ensayo de oligosorbente enlazado por enzimas-) [Katz JB et al., Am. J. Vet. Res. diciembre de 1993; 54 (12): 2021-6 y François Mallet et al., Journal of Clinical Microbiology, Junio de 1993, páginas 1444-1449]).

También, la presente invención, tiene por objeto un procedimiento ventajoso para evidenciar la actividad superantigénica anteriormente citada, arriba, el cual comprende las etapas siguientes:

(i) se extrae un sobrenadante de cultivo de células mononucleadas sanguíneas o de células de plexos coroideos o de células leptomeníngeas, procediendo, las citadas células, de pacientes afectados de esclerosis en placas, o sospechosos de tener una predisposición a desarrollar la esclerosis en placas, o de una línea celular establecida, tales como las células de las líneas celulares PLI-2, depositada en el ECACC, el 22 de julio de 1992, con el número 92072201 y LM7PC, depositada en el ECACC, el 8 de enero de 1993, con el número 93010817, en conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest, y

(ii) se pone en contacto el citado sobrenadante de cultivo o una parte del sobrenadante de cultivo, con una serie de cultivos, de una forma preferente, por lo menos tres, de las células mononucleadas sanguíneas procedentes de donantes sanos, y

(iii) se detecta la citada expansión y, eventualmente, una co-expansión o la citada pérdida y eventualmente, co-disminución de las células mononucleadas sanguíneas de la etapa (ii).

Las células mononucleadas sanguíneas productoras de moléculas superantigénicas y procedentes de pacientes afectados de SEP, se eligen principalmente de entre los linfocitos B y los monocitos.

La células mononucleadas sanguíneas que responden a la estimulación y proceden de donantes sanos, se eligen principalmente de entre los linfocitos T.

Otro procedimiento ventajoso de la invención, consiste en:

(i) extraer células mononucleadas sanguíneas, procedentes de pacientes afectados de esclerosis en placas, o de pacientes sospechosos de tener un riesgo de desarrollar la esclerosis en placas y de individuos sanos,

(ii) poner en contacto las citadas células mononucleadas sanguíneas procedentes de pacientes o de individuos sanos, con sobrenadantes de cultivo o una fracción de sobrenadante de cultivo de células elegidas de entre las células mononucleadas sanguíneas, las células de plexos coroideos y las células leptomeníngeas, las células procedentes de líneas celulares establecidas, tales como las células de las líneas celulares PLI-2, depositada en el ECACC, el 22 de julio de 1992, con el número 92072201 y LM7PC, depositada en el ECACC, el 8 de enero de 1993, con el número 93010817, en conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest, y

(iii) detectar la citada expansión y, eventualmente, una co-expansión o la citada pérdida y eventualmente, co-disminución, a partir de las células mononucleadas sanguíneas de la etapa (i).

La evidenciación de la citada expansión y, eventualmente, co-expansión, o la citada pérdida y, eventualmente, co-disminución, se realiza

(a) bien ya sea mediante la utilización de ligandos, de una forma particular, un anticuerpo y, de una forma preferente, un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo, siendo, cada ligando, específico de un determinante elegido de entre los V\betas 16, 2, 3, 7, 8, 12, 14, 17 y 22, de una forma preferente, los V\beta 16, 3 y 12, o de un ligando, de una forma particular, un anticuerpo y, de una forma preferente, un anticuerpo monoclonal, siendo cada ligando específico de un determinante elegido de entre los V\betas 16, 2, 3, 7, 8, 12, 14, 17 y 22, de una forma preferente, los V\beta 16, 7, 14 y 17.

(b) o bien ya sea según el protocolo descrito anteriormente, arriba, procediendo a realizar:

(i): una extracción de los ARN totales de las células mononucleadas sanguíneas puestas en presencia de sobrenadante o de una fracción de sobrenadante de cultivo SEP, y en presencia de sobrenadante o de una fracción de sobrenadante de cultivo testigo,

(ii): una transcripción inversa de los citados ARN,

(iii): una amplificación específica de cada familia de V\betas, con la ayuda de un par de cebadores determinados,

(vi): un marcaje mediante todo tipo de marcador apropiado de los productos de amplificación obtenidos,

(v): una electroforesis de los citados productos de amplificación y análisis de los perfiles de electroforesis obtenidos, con la ayuda de un detector apropiado.

La predisposición a un estado patológico, se evalúa procediendo a someter a test de ensayo, experimentalmente, la sensibilización inmunológica de un paciente, que evidencia una expansión o una pérdida mayoritaria de linfocitos portadores de un determinante V\beta y/o 17 y, eventualmente, una co-expresión o una co-disminución de linfocitos portadores de los V\betas elegidos de entre por lo menos uno cualquiera de los V\beta 2, 3, 7, 8, 12, 14, 17 y 22, de una forma preferente, los V\beta 3 y 12 ó los V\beta 7, 14 y 17, de una forma preferente, 7 y 17.

La predisposición detectada, puede ser una predisposición natural o una predisposición adquirida, por ejemplo, después de una fuerte estimulación, en un individuo, de los linfocitos T portadores de determinantes V\beta 16 ó V\beta 17, de una forma preferente, V\beta 16, mediante la exposición del organismo del individuo, a un antígeno. Este antígeno, puede ser, por ejemplo, por lo menos una proteína o un péptido del virus de la Hepatitis B.

Así, de este modo, la presente invención, se refiere a un procedimiento de detección de la SEP, o de una predisposición a la SEP, según la cual:

se evidencia una expansión o una pérdida mayoritaria de linfocitos portadores de un determinante V\beta 16 y/o V\beta 17, de una forma preferente, V\beta 16, o expansión o pérdida mayoritaria de linfocitos portadores de un determinante V\beta 16 y una co-expansión o co-disminución de linfocitos portadores de V\betas de los linfocitos T elegidos de entre por lo menos uno cualquiera de los V\beta 2, 3, 7, 8, 12, 14, 17 y 22 y, de una forma preferente, los V\beta 3 y 12 ó los V\beta 7, 14 y 17, de una forma preferente, 7 y 17, siendo, la citada expansión o pérdida, de por lo menos un 31%,

se calcula un porcentaje de variación del número de V\betas detectados en un paciente afectado de SEP, con relación al obtenido con los linfocitos T de un donante sano, en unas condiciones tales como se han determinado precedentemente, arriba.

Si el porcentaje de variación, en valor absoluto, es significativamente diferente de 0, se puede deducir de ello, el hecho de que, el paciente, presenta una predisposición para la enfermedad SEP y/o desarrolla la enfermedad. Si este porcentaje es, en valor absoluto, igual a 0, esto puede significar que, el donante, no presenta una predisposición para la enfermedad SEP y/o no ha desarrollado la enfermedad, en el momento en el se ha aplicado el procedimiento.

La invención, tiene igualmente por objeto, un procedimiento de detección de un estado patológico o de un predisposición a un estado patológico, en una muestra biológica, según el cual, se evidencian los parámetros siguientes:

una actividad superantigénica, tal como se ha definido precedentemente, arriba,

y por lo menos una de entre

una estimulación de la producción de citocinas, tales como la IL-6,

y una inducción de apoptosis celular.

De una forma preferente, se detectan los tres parámetros en asociación.

El estado patológico, se encuentra asociado, de una forma particular, a una enfermedad auto-inmune, tal como la esclerosis en placas.

La actividad superantigénica detectada según los procedimientos de la invención, puede estar inducida, principalmente, de una forma directa o indirecta, por un agente efector, elegido de entre las proteínas, los microorganismos, los agentes patógenos, y por ejemplo, las bacterias y/o los retrovirus, de una forma preferente, los retrovirus humanos, tales como el MSRV1 y/o los agentes patógenos, tales como el MSRV-2.

De una forma particular, la actividad superantigénica, se induce mediante la proteína de envoltura de MSRV-1, referenciada en la SEQ ID NO: 2, o mediante un fragmento de la citada proteína, o bien, mediante el producto de expresión del gen env de MSRV-1 referenciado en la SEQ ID NO: 1, ó de un fragmento del citado gen.

Para mejor comprender la invención, se definen ciertos términos:

- Un retrovirus humano, de una forma particular, retrovirus endógeno, que tiene una actividad superantigénica y que se encuentra asociado a una enfermedad auto-inmune, según el cual, el retrovirus, es MSRV-1 y la actividad superantigénica se induce mediante la expresión del gen env de MSRV-1 ó de un fragmento del citado gen, en particular, un fragmento del citado gen que codifica para por lo menos un marco de lectura de la proteína env de MSRV-1 (SEQ ID NO: 2) o bien ésta se induce mediante la proteína env de MSRV-1, ó mediante un fragmento de la citada proteína, de una forma particular, mediante un fragmento correspondiente a por lo menos un marco de lectura de la citada proteína (SEQ ID NO: 2).

- Una molécula de ácido nucleico, que comprende por lo menos un fragmento o fragmentos de ARN o de ADN, del gen env de MSRV-1, identificado por SEQ ID NO: 1, teniendo, el citado fragmento, una longitud de por lo menos 18 nucleótidos y, de una forma preferente, de por lo menos 24 nucleótidos; principalmente, ésta comprende por lo menos un fragmento que codifica por lo menos un marco de lectura y que contiene eventualmente un codón estop; pudiendo codificar, esta molécula, para una actividad superantigénica.

- Una molécula polipeptídica, de una forma particular, proteína o fragmento de proteína, que comprende por lo menos un fragmento o fragmentos de la citada proteína env de MSRV-1, identificada por SEQ ID NO: 1, teniendo, el citado fragmento, una longitud de por lo menos 6 aminoácidos y, de una forma preferente, de por lo menos 8 aminoácidos: de una forma ventajosa, la molécula polipeptídica, comprende por lo menos un marco de lectura, y posee, eventualmente, una actividad superantigénica.

Según una variante de la invención, adicionalmente,

(i) se produce o se sintetiza una proteína recombinante, tal como la que se identifica mediante SEQ ID NO: 2, o un fragmento de la citada proteína,

(ii) se pone en contacto la citada proteína con una serie de cultivos, de una forma preferente, por lo menos tres, de células mononucleadas sanguíneas procedentes de donantes sanos, y

O bien,

(i) se extraen células mononucleadas sanguíneas, procediendo, las citadas células, de pacientes de la SEP o de pacientes sospechosos de tener un riesgo de desarrollar la SEP, y de individuos sanos,

(ii) se ponen en contacto, las citadas células mononucleadas sanguíneas procedentes de pacientes o de individuos sanos, con un polipéptido o una proteína recombinante, tal como la que se identifica en SEQ ID NO: 2, ó un fragmento del citado polipéptido o de la citada proteína, y

(iii) se detecta la citada expansión y, eventualmente, co-expansión o la citada pérdida y, eventualmente, co-disminución, a partir de las células mononucleadas sanguíneas de la etapa (i).

De una forma preferente, se utiliza un polipéptido de la invención, tal como se ha definido precedentemente, arriba. De una forma ventajosa, éste se codifica por un gen env, tal como el que se ha definido anteriormente, arriba.

Los procedimientos tales como los que se han definido anteriormente, arriba, pueden utilizarse para el seguimiento terapéutico de pacientes y/o de evaluación de la eficacia de moléculas de uso terapéutico, con respecto a los parámetros identificados.

Con objeto de evaluar la eficacia de las moléculas de uso terapéutico, es decir, una de las molécula(s) susceptibles de inhibir la expansión o la pérdida de linfocitos T de un V\beta determinado, se extrae un sobrenadante de cultivo de células mononucleadas sanguíneas o de células de plexos coroideos o de células leptomeníngeas, procediendo, las citadas células, de pacientes afectados de una enfermedad auto-inmune, de una forma particular, de SEP, ó de células procedentes de líneas celulares establecidas, tales como las células de las líneas celulares PLI-2 y LM7PC,

(i) se extraen células mononucleadas sanguíneas, procediendo, las citadas células, de individuos sanos,

(ii) se ponen en contacto las citadas células mononucleadas sanguíneas, con el citado sobrenadante de cultivo, o una fracción de sobrenadante de cultivo, y

\newpage

(iii) se detecta la inhibición de la citada expansión y, eventualmente, co-expansión o la inhibición de la citada pérdida y, eventualmente, co-disminución, a partir de las células mononucleadas sanguíneas de la etapa (i), en presencia del citado agente o de la citada composición a dosis determinadas, de los linfocitos portadores de por lo menos un determinante, elegido entre los V\betas 16, 7 y 17, mediante la utilización de un ligando tal como el que se ha descrito ante-
riormente, arriba, o de una amplificación asociada a una electroforesis, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba.

Se calcula, de este modo, un porcentaje de variación del número de los V\betas detectados, en presencia de la molécula o de las moléculas de uso terapéutico, y en ausencia de una molécula o moléculas o de este tipo.

La molécula o las moléculas de uso terapéutico, se someten igualmente a tests de ensayo in vivo, según un procedimiento que consiste:

\bullet en utilizar un sobrenadante de cultivo de células mononucleadas, de una forma preferente, los linfocitos B y los monocitos, o de células de plexos coroideos o de células leptomeníngeas, aislándose, las citadas moléculas, a partir de una muestra biológica de un paciente afectado de SEP, o en utilizar el sobrenadante de una línea celular establecida, tal como la línea celular PLI-2 y la línea celular LM7PC, o en utilizar la totalidad o parte de por lo menos una molécula obtenida a partir de uno de los sobrenadantes anteriormente citados,

\bullet en poner en contacto la totalidad o parte de por lo menos uno de los sobrenadantes anteriormente citados, arriba, o por lo menos una molécula contenida en por lo menos uno de entre éstos, con un cultivo de células mononucleadas sanguíneas, de una forma preferente, linfocitos T, extraídos de un individuos y/o un animal, antes y después de la administración de la molécula o las moléculas a someter a test de ensayo y, paralelamente, después de la administración de un agente y/o composición placebo, en un paciente SEP o en un animal,

\bullet en evidenciar, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba, la expansión o la pérdida de los linfocitos que tengan el determinante V\beta, antes y después de la administración de la molécula o de las moléculas de uso terapéutico o del agente y/la composición placebo, en el individuo o el animal,

\bullet en detectar la citada expansión y, eventualmente, una co-expansión y/o la pérdida y, eventualmente, una co-disminución de los linfocitos T que expresan, en su superficie, una molécula V\beta dada, mediante purificación de por lo menos un ligando o mediante biología molecular, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba, y

\bullet en calcular un porcentaje (X) de expansión o de pérdida de determinantes V\beta, detectados en las células mononucleadas puestas en cultivo y procedentes de un individuo o de un animal que haya recibido una o varias administraciones de la molécula o de las moléculas a someter a test de ensayo, con relación al número de determinantes V\beta detectados en la células puestas en cultivo y procedentes del individuo o del animal que no haya recibido ninguna administración y/o un porcentaje (Y) de expansión o de pérdida de determinantes V\beta detectados en las células mononucleadas puestas en cultivo y procedentes del individuo o del animal que haya recibido una o varias administraciones de la molécula o de las moléculas a someter a test de ensayo, con relación al número de determinantes detectado en las células puestas en cultivo y procedentes del paciente o del animal que haya recibido una o varias de la administraciones de la molécula o moléculas y/o de una composición o de un agente placebo, respetando las mismas condiciones de administración que las utilizadas para la molécula o las moléculas a evaluar.

Si |X| y/ó |Y| y/ó |X| + |Y| son significativamente diferentes de 0, ello puede significar que, la molécula o las moléculas, inhiben totalmente o parcialmente la expansión o la pérdida de células mononucleadas con el determinante V\beta considerado; si |X| ó |Y| ó |X| + |Y|, son iguales o próximas a 0, ello puede significar que, el agente, no inhibe totalmente
o sólo parcialmente, la expansión o la pérdida de las células mononucleadas, con el determinante V\beta considerado.

Se entiende, por agente y/o combinación placebo, todo agente y/o composición que no conlleve una disminución de las células mononucleadas sanguíneas que tengan el determinante V\beta considerado.

La invención, se refiere, asimismo, a un procedimiento de evaluación de la eficacia de un agente o de una composición, para inhibir una actividad superantigénica en una muestra biológica, que comprende las etapas siguientes:

(i) se produce o se sintetiza un polipéptido, de una forma particular, una proteína recombinante, tal como la que se identifica por SEQ ID NO: 2, ó un fragmento del citado polipéptido o de la citada proteína,

(ii) se pone en contacto, el citado polipéptido o proteína recombinante, con una serie de cultivos, de una forma preferente, por lo menos tres, de las células mononucleadas sanguíneas procedentes de donantes sanos, en presencia del citado agente o de la citada composición, a dosis predeterminadas,

(iii) se detecta la inhibición de la citada expansión y, eventualmente, co-expansión o la inhibición de la citada pérdida y, eventualmente, co-disminución, a partir de los linfocitos portadores de por lo menos un determinante, elegido entre los V\betas 16, 2, 3, 7, 8, 12, 14, 17 y 22, de una forma particular, los V\betas 16 y/ó 17, los V\betas 16, 3 y 12, ó los V\betas 16, 7, 14 y 17, de una forma particular, los V\betas 16, 7 y 17, mediante la utilización de un ligando o de una amplificación asociada a una electroforesis, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba.

La eficacia terapéutica de varios agentes y/o composiciones, puede evaluarse en combinación, en un mismo ensayo.

Un procedimiento in vivo ventajoso, para someter a teste de ensayo la eficacia de un agente terapéutico, en la esclerosis en placas, comprende las etapas siguientes:

\bullet se determinan los porcentajes X e Y, de la forma que se ha descrito y se ha definido anteriormente, arriba. X e Y, se determinan después de la administración de un agente y/o composición a evaluar, en paciente afectado por la SEP.

\bullet se determinan, asimismo, X' e Y'; éstos se determinan como X e Y, respectivamente, pero después de la administración del mismo compuesto, a un individuo sano,

\bullet se calculan los porcentajes x e y, con x = X/X' e y = Y/Y'. Estos porcentajes, reflejan la disminución del número de células mononucleadas sanguíneas que presentan el determinante V\beta, debido a la administración del compuesto terapéutico a someter a test de ensayo, en un paciente afectado de esclerosis en placas, con relación a un individuo sano.

Si |x| y/ó |y| y/ó |x| + |y| son significativamente diferentes de 0, ello puede significar que, el agente y/o la composición sometida a test de ensayo, tienen un efecto terapéutico, con respecto al patología SEP; si |x| y/ó |y| y/ó |x| + |y, son iguales o próximas a 0, ello puede significar que, el agente y/o la composición sometidos a test de ensayo, no tiene un efecto terapéutico, o tiene poco efecto terapéutico, con respecto a la patología SEP.

Por composición de uso terapéutico y/o profiláctico, se entiende una composición que comprende, entre otros, un agente terapéutico capaz de inhibir, directamente o indirectamente, una actividad superantigénica, en una muestra biológica, tal y como se ha definido anteriormente, arriba, eventualmente, en asociación con un vehículo/o un excipiente y/o un adyuvante y/o un diluyente farmacéuticamente aceptables, es decir, que permiten la administración al animal y al ser humano. Todos estos datos, hacen parte de los conocimientos generales de la persona experta en el arte especializado de la técnica, (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición, 1980, Marck Publishing Co). El vehículo farmacéuticamente aceptable es, de una forma preferencial, isotónico, hipotónico o presenta una débil hipertonicidad y presenta una fuerza iónica relativamente baja, tal como, por ejemplo, una solución de sucrosa. Además, la citada composición puede contener disolventes, vehículos acuosos o parcialmente acuosos, tales como el agua estéril, libre de agentes pirógenos, y medios de dispersión, por ejemplo. El pH de estas composiciones farmacéuticas, se ajusta y se tampona, de una forma conveniente, según las técnicas convencionales.

Se entiende, por eficacia terapéutica, el beneficio clínico y biológico adquirido después de la administración de un agente terapéutico, en vistas a una mejora, o incluso a una curación de la enfermedad. Este beneficio, se traduce, entre otros, por una disminución de los signos clínicos, biológicos y de los efectos patológicos de la enfermedad, después de un análisis clínico por parte del médico y/o de los análisis biológicos, tales como los análisis de la imagen mediante resonancia magnética, análisis por bandas oligoclonales en líquido céfalo-raquídeo, análisis de potenciales... Esta disminución de signos clínicos y efectos patológicos, debe conllevar un benéfico para el paciente (Schwartz y Lazar, 1995 Elements de estadistique médical et biologique, -Elementos de estadística médica y biológica-, eds Flammarion; Lazar y Schwartz, 1995 Elements de estadistique médical et biologique, -Elementos de estadística médica y biológica-, eds Flammarion). La enfermedad estudiada de preferencia, es la esclerosis en placas. Estos agentes terapéuticos, son capaces (i) de influenciar de una forma cualitativa y/o cuantitativa, la actividad superantigénica, tal y como se ha descrito en la presente invención y/o (ii) de modular y/o de inhibir la expresión de los determinantes V\betas identificados en la presente invención. Se producen diferentes agentes terapéuticos, siguiendo estudios clásicos ampliamente descritos en la literatura. Los diferentes grupos de agentes terapéuticos de la presente invención, se describen abajo, a continuación.

Tal y como se ha descrito anteriormente, arriba, el agente terapéutico, es capaz de inhibir o de disminuir, directamente o indirectamente, una actividad superantigénica, tal y como se define en la presente invención, para uno o varios V\betas determinados y/o para uno o varios retrovirus MSRV. El agente terapéutico, consiste en un material químico o biológico o en una composición que presenta una eficacia terapéutica que puede evidenciarse según las modalidades descritas precedentemente, arriba.

Con objeto de simplificar la exposición, se hablará, de una forma general, de moléculas de interés de la invención, tanto para designar el o los diferente(s) V\betas asociado(s), a la actividad superantigénica, como para designar las proteínas de MSRV-1, de una forma particular, la proteína env de MSRV-1.

Por agente terapéutico, se entiende:

- por lo menos una molécula natural y/o una molécula recombinante o sus fragmentos, en donde, la secuencia, corresponde a la totalidad o a parte de la secuencia de las moléculas de interés, es decir:

- por lo menos una proteína natural y/o una proteína recombinante y/o un polipéptido de síntesis, elegido de entre las moléculas de interés de la invención,

- por lo menos un fragmento natural y/o sintético de estas moléculas de interés, por ejemplo, un fragmento inmunógeno, capas de inducir una respuesta inmune contra un polipéptido procedente de por lo menos una de las moléculas de interés de la invención,

- por lo menos un péptido mimotopo, definido a partir de las secuencias de las moléculas de interés de la invención, o una combinación de mimotopos, capaces de inducir una respuesta inmune contra un polipéptido procedente de por lo menos una de las moléculas de interés de la invención,

- por lo menos una proteína o un péptido que pueda regular in vivo la transcripción y/o la traducción de las moléculas de interés de la invención y las secuencias polipeptídicas o los fragmentos de las citadas secuencias.

La respuesta inmune dirigida contra un antígeno específico, puede dividirse en dos categorías diferentes, una de ellas, poniendo en juego los anticuerpos (respuesta inmune de tipo tumoral), la otra poniendo en juego las células efectoras citotóxicas, tales como, por ejemplo, los macrófagos, los linfocitos citotóxicos (CTL) o las células agresoras (NK), así como los linfocitos T "helper", especialmente, los linfocitos T CD4 + (respuesta inmune de tipo celular). De una forma más particular, los dos tipos de respuesta, se distinguen por el hecho de que, los anticuerpos, reconocen a los antígenos bajo su forma dimensional, mientras que, los linfocitos T, por ejemplo, reconocen a porciones peptídicas de los citados antígenos, asociados a gliproteínas codificadas por los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), especialmente, los genes del complejo mayor de histocompatibilidad de tipo I, que se expresan de forma ubiquitaria en la superficie de las células o los genes del complejo mayor de histocompatibilidad de tipo II que se expresan de forma específica en la superficie de las células implicadas en la presentación de los antígenos (APC). 1) Según un primer aspecto, la respuesta inmune de tipo celular, se caracteriza por el hecho de que, las células T de tipo CD4+ (células T "helper"), a consecuencia de un fenómeno de activación bien conocido (para una revisión, ver Alberola-lia 1997, Annu Rev Immunol 15, 125-154), producen citocitos que, a su vez, inducen la proliferación de células APC, capaces de producir los citados citocitos, la diferenciación celular de los linfocitos B capaces de producir los anticuerpos específicos del antígeno, y la estimulación de los linfocitos T citotóxicos (CTL). 2) Según un segundo aspecto de la respuesta inmune celular, las células afectoras citotóxicas tales como, por ejemplo, los linfocitos del tipo CD8 + (CTL), se activan, a) después de la interacción con péptidos antigénicos fijados sobre, y presentados por, las glicoproteínas portadas por las células ubiquitarias, y codificadas por los genes que pertenecen al sistema CMHI, y b) eventualmente por las citocinas producidas por las CD4+.

A partir de la secuencia en aminoácidos de las moléculas de interés de la invención, las secuencias peptídicas de estas moléculas, correspondientes a la totalidad o a parte de la secuencia primaria de estas moléculas, pueden sintetizarse mediante procedimientos clásicos de síntesis peptídica u obtenerse mediante recombinación genética.

Las proteínas recombinantes correspondientes a las moléculas de interés de la invención, producidas en un sistema celular procariota o eucariota, pueden producirse por parte de la persona experta en el arte especializado de la técnica, a partir del conocimiento de las secuencias de los genes correspondientes, descritos en la literatura, y teniendo en cuenta la degeneración del código genético. Todas las secuencias proteicas identificadas en la presente invención, son también susceptibles de poderse obtener mediante recombinación genética. Los genes, se clonan en vectores adaptados. Se utilizan vectores diferentes, para transformar las células procariotas (por ejemplo E. coli) y células eucariotas (por ejemplo, células COS, CHO y células Similiki). Las proteínas recombinantes que corresponden a las moléculas de interés de la invención o a fragmentos de esas proteínas, pueden también producirse, en sistemas celulares procariotas y/o eucariotas. En las células E. coli, las proteínas recombinantes, se producen con una cola poli-histidina. La fracción proteica insoluble, se solubiliza en urea 8M. En enriquecimiento del producto, se efectúa sobre resina quelada con níquel (Qiagen). La columna, se lava con concentraciones decrecientes de urea. La elución, se realiza con imidazol, en ausencia de urea. La secuencia completa de las moléculas de interés de la invención, pueden igualmente clonarse, en un plásmido adaptado y, a continuación, transferirse en el virus vacunal, para obtener un virus recombinante;

- por lo menos un ligando específico de por lo menos una de las citadas moléculas de interés de la invención o de sus fragmentos, que es capaz de fijarse a las moléculas de interés o a los receptores de la citadas moléculas de interés, o incluso de interferir para el enlace de la molécula de interés a la célula presentadora de antígeno, e inhibir la actividad superantigénica, es decir:

- por lo menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo policlonal o monoclonal específico de por lo menos una de las citadas moléculas de interés de la invención o de sus fragmentos. Este anticuerpo, puede ser neutralizante, o no serlo, es decir, capaz, o no, de inhibir la actividad de la proteína de interés. El ligando, puede elegirse entre cualquier tipo de molécula o fragmento de molécula, capaz de fijarse a las moléculas de interés, por ejemplo, los receptores, los co-factores de las moléculas, los anticuerpos policlonales o monoclonales capaces de fijarse a la moléculas de interés o a cualquier fragmento.

Estos anticuerpos, son muy útiles, especialmente, para permitir la puesta en práctica de las composiciones terapéuticas, puesto que, éstos, conducen, por ejemplo, a reacciones inmunes, dirigidas específicamente al encuentro de epítopos inmunodominantes o contra antígenos que presentan una gran viabilidad. Se administran, al paciente, bien ya sea anticuerpos solubles neutralizantes para inhibir su función, o bien ya sea anticuerpos solubles específicos, para eliminar el péptido, mediante formación de complejos inmunes. La invención, describe la utilización de anticuerpos capaces de reconocer específicamente por lo menos una molécula de interés descrita en la presente invención, para el tratamiento y/o mediante el seguimiento terapéutico de la enfermedad, de una forma preferente, la esclerosis en placas. Estos anticuerpos, son policlonales y, de una forma preferente, monoclonales. De una forma preferible, este anticuerpo, inhibe la función de la proteína, al fijarse. La capacidad del anticuerpo para fijarse específicamente a la proteína, se analiza mediante técnicas convencionales descritas, como por ejemplo, los tests de ensayo ELISA o de Western Blot, utilizando la molécula o el péptido inmunógeno natural o sintético. Se procede, a continuación, a determinar el título del anticuerpo. La capacidad del anticuerpo para neutralizar la función de la proteína, puede analizarse mediante diferentes medios, por ejemplo, determinando la disminución de la actividad de la molécula o del péptido inmunógeno, en presencia del anticuerpo.

Así, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la molécula de interés de la invención, o una parte de esta molécula, se producen mediante técnicas convencionales utilizadas para producir anticuerpos contra antígenos de superficie. Se inmunizan ratones o conejos, (i) bien ya se con la proteína natural o recombinante de interés, (ii) bien ya sea con cualquier péptido inmunógeno de esta proteína de interés, (iii) o bien ya sea con células murinas que expresan la proteína o péptido de interés y las moléculas del CMHII. Las línea murina Balb/c, es la más frecuentemente utilizada. El inmunógeno, puede ser igualmente un péptido elegido entre los péptidos definidos a partir de secuencias primarias de las moléculas de interés. La proteínas o péptidos, se acoplan a la hemocianina de Lymphet Keyhole, resumido, péptido -KHL, como soporte para su utilización en inmunización, o se acoplan a la albúmina sérica humana, resumido, péptido -HSA, utilizando el adyuvante completo de Freund (IFA). Los sueros y los sobrenadantes de cultivo de hibridoma procedentes de animales inmunizados con cada péptido, se analizan para la presencia de anticuerpos anti-moléculas mediante un test de ensayo ELISA, utilizando las moléculas iniciales. Las células esplénicas de estos ratones, se recuperan y se fusionan con células de mieloma. El polietilenglicol (PEG), es el agente de fusión más frecuentemente utilizado. Se seleccionan los hibridomas que producen los anticuerpos más específicos y los más sensibles. Los anticuerpos monoclonales, pueden producirse in vitro, mediante cultivo celular de los hibridomas producidos o mediante recuperación de líquido de ascitis múrida (murina), después de la inyección intraperitoneal de hibridomas en el ratón. Sea cual fuere el modo de producción en sobrenadante o en ascitis, es importante el proceder, a continuación, a purificar el anticuerpo monoclonal. Los procedimientos de purificación utilizados son, esencialmente, la filtración sobre gel intercambiador de iones, o mediante cromatografía de exclusión, o también inmunoprecipitación. Para cada anticuerpo, debe elegirse el procedimiento que permitirá obtener el mejor rendimiento. Un número suficiente de anticuerpos anti-proteínas, se criban, en los tests de ensayo funcionales, con objeto de identificar los anticuerpos que proporcionan las mejores prestaciones para fijar la molécula de interés y/o para bloquear la actividad de la molécula de interés. Los anticuerpos monoclonales seleccionados, se humanizan mediante procedimientos standard de "CDR-grafting" ("injerto de CDR" - protocolo éste realizado por parte de numerosas empresas, en forma de servicios). Estos anticuerpos humanizados, pueden someterse a tests de ensayo, clínicamente, en el paciente. La eficacia de estos anticuerpos, puede seguirse mediante parámetros clínicos.

La producción in vitro de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos o de derivados de anticuerpos, tales como los anticuerpos quiméricos humanizados o no, producidos mediante ingeniería genética, en las células eucariotas, se ha descrito ya (patentes europeas EP 120 694 ó EP 125 023), y es también aplicable a la presente invención,

- por lo menos una molécula inhibidora de la función de por lo menos una molécula elegida entre las moléculas de interés de la invención o sus fragmentos,

- por lo menos una molécula reguladora de la expresión de por lo menos una molécula elegida entre las moléculas de interés de la invención, o sus fragmentos, por ejemplo, para bloquear la transcripción o la traducción de estas moléculas,

- por lo menos una molécula reguladora del metabolismo de por lo menos una proteína elegida entre las moléculas de interés de la invención o sus fragmentos,

- por lo menos una molécula reguladora de la expresión y/o del metabolismo de un ligando de por lo menos una proteína elegida entre las moléculas de interés de la invención o sus fragmentos, por ejemplo, un receptor o un co-factor;

- por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos que comprendan por lo menos un gen de interés terapéutico, en donde, la secuencia nucleica, se deduce de las secuencias de ADN y de ARN que codifican para la totalidad o parte de las moléculas de interés de la invención, en asociación con elementos que aseguren la expresión del citado gen de interés terapéutico, in vivo, en las células diana destinadas a ser genéticamente modificadas mediante la secuencia nucleica del gen de interés terapéutico. Los genes, pueden estar mutados o no. Éstos pueden igualmente consistir en ácidos nucleicos modificados, de tal forma que no sea posible que se integren en el genoma de la célula diana, o en ácidos nucleicos estabilizados con la ayuda de agentes, tales como la espermina. Un gen de interés terapéutico, de este tipo, codifica principalmente para:

- por lo menos una proteína elegida entre las moléculas de interés identificadas en la presente invención, o sus fragmentos, y/o

- por lo menos un ligando o cualquier parte de un ligando, capaz de fijarse a por lo menos una proteína o un fragmento de proteína elegido entre la células de interés identificadas en la presente invención, o sus fragmentos, pudiendo inhibir, o no, la función de la molécula de interés. Puede tratarse, principalmente, de un anticuerpo transmembranario nativo, o de un fragmento o derivado de un fragmento de este tipo, siempre y cuando el citado anticuerpo, fragmento o derivado de anticuerpo, se exprese en la superficie de la célula diana del mamífero genéticamente modificado, y sea capaz de fijarse a un polipéptido presente en la superficie de una célula efectora citotóxica o de un linfocito T "helper", implicado en el procedimiento de activación de una célula de este tipo, y/o

- por lo menos una molécula inhibidora de por lo menos una proteína o de sus fragmentos, eligiéndose, la citada proteína, entre las moléculas de interés identificadas en la presente invención, pudiendo inhibir la función y/o el metabolismo y/o la fijación de las moléculas de interés o de sus fragmentos.

Adicionalmente, además, el citado ácido nucleico, puede comprender por lo menos dos secuencias, idénticas o diferentes, que presenten una activad de promotor transcripcional y/o por lo menos dos genes, idénticos o diferentes, situados, el uno con respecto al otro, de una forma contigua, alejada, en el mismo sentido, o en sentido inverso, siempre y cuando la función de promotor transcripcional o la transcripción de los citados genes, no se vea afectada.

Del mismo modo, en este tipo de construcción de ácido nucleico, es posible introducir secuencias nucleicas "neutras" o intrones, los cuales no perjudican a la transcripción, y que se empalman antes de la etapa de traducción. Secuencias de este tipo y sus utilizaciones, se encuentran descritas en la literatura especializada (referencia: documento de prioridad, de solicitud de patente internacional PCT WO 94/29 471).

El citado ácido nucleico, puede igualmente comprender secuencias requeridas para el transporte intracelular, para la replicación y/o para la integración, para la transcripción y/o la traducción. Tales tipos de secuencias, son bien conocidas por parte de la persona experta en el arte especializado de la técnica.

Además, los ácidos nucleicos utilizables según la presente invención, pueden igualmente ser ácidos nucleicos modificados, de tal forma que no sea posible el integrarse en el genoma de la célula diana, o ácidos nucleicos estabilizados con la ayuda de agentes, tales como, por ejemplo, la espermina, los cuales, por sí mismos, no tienen efecto sobre la eficacia de la transfección.

La secuencia de ácido nucleico es, de una forma preferente, una secuencia de ADN o ARN desnuda, es decir, libre de cualquier tipo de compuesto que facilite su introducción en las células (transferencia de la secuencia de ácido nucleico). No obstante, según una segunda forma de presentación de la presente invención, con el fin de favorecer su introducción en las células diana, y con el fin de obtener las células genéticamente modificadas de la invención, esta secuencia de ácido nucleico, puede ser en forma de un "vector" y, de una forma más particular, en forma de un vector vírico, tal como por ejemplo un vector adenoviral, retroviral, un vector derivado de un poxvirus, principalmente, derivado del virus vacunal o del Modified Virus Ankara (MVA -[virus Ankara modificado]-), o de un vector no vírico, tal como, por ejemplo, un vector consistente en por lo menos una denominada molécula o substancia portadora seleccionada entre el grupo consistente en un anfifilo catiónico, especialmente, un polímero catiónico o neutro, un compuesto polar prótico, principalmente, elegido entre el propilenglicol, el polietilenglicol, el glicerol, el etanol, la 1-metil-L-2-pirrolidona o sus derivados, y un compuesto polar aprótico, principalmente, elegido entre el dimetilsulfóxido (DMSO), el dietilsulfóxido, el di-n-propilsulfóxido, el dimetil-sulfóxido, el sulfolano, la dimetilformamida, la dimetilacetamida, la tetrametilurea, el acetonitrilo o sus derivados. La literatura especializada, proporciona un número importante de ejemplos de tales tipos de vectores víricos y no víricos.

Tales tipos de vectores, pueden además comprender, de una forma preferente, elementos de objetivización de dianas, que pueden dirigir la transferencia de secuencia de ácido nucleico, hacia ciertos tipos celulares o ciertos tejidos particulares, tales como las células T helpers, las células T citotóxicas y las células presentadoras del antígeno. Éstos pueden permitir, igualmente, el dirigir la transferencia de una substancia activa hacia ciertos compartimientos intracelulares preferidos, tales como el núcleo, las mitocondrias o los peroxisomas, por ejemplo. Puede tratarse, además, de elementos que facilitan la penetración al interior de la células o la lisis de compartimientos intracelulares. Tales tipos de elementos de objetivización de dianas, se encuentran ampliamente descritos en la literatura especializada. Puede tratarse, por ejemplo, de la totalidad o parte de lectinas, de péptidos, principalmente, el péptido JTS-1 (véase el documento de prioridad de la solicitud de patente internacional PCT WO 94/40 958), de oligonucleótidos, de lípidos, de hormonas, de vitaminas, de antígenos, de anticuerpos, de ligandos específicos de receptores membranarios, de anticuerpos, de ligandos específicos de receptores membranarios, de ligandos susceptibles de poder reaccionar con un anti-ligando, de péptidos fusógenos, de péptidos de localización nuclear, o de una composición de tales tipos de compuestos,

o también,

- por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos, capaz de hibridarse a una secuencia de ácidos nucleicos que codifican para las moléculas de interés para la invención o sus fragmentos. Los fragmentos, corresponden, de una forma particular, a moléculas anti-sentido o ribozima, y pueden sintetizarse con la ayuda de sintetizadores automáticos, tales como los que se comercializan por parte de la sociedad Applied Biosystem. Los oligonucleótidos anti-sentido, son capaces de interferir específicamente con la síntesis de una proteína diana de interés, mediante inhibición de la formación y/o del funcionamiento del polisoma, según el posicionamiento del ARNm, en la diana. Así, por lo tanto, la elección frecuente de la secuencia que circunda el codón de iniciación de la traducción como diana, para una inhibición mediante un oligonucleótido anti-sentido, pretende prevenir la formación del complejo de iniciación. Otros mecanismos, en la inhibición mediante los oligonucleótidos anti-sentido, implican una activación de la ribonucleasa H, que digiere los híbridos oligonucleótidos anti-sentido (ARNm, o una interferencia al nivel de sitios de empalme mediante oligonucleótidos anti-sentido, en donde, la diana, es un sitio de empalme del ARNm. Los oligonucleótidos anti-sentido, son igualmente complementarios de secuencias de ADN y pueden, por lo tanto, interferir al nivel de la transcripción, mediante la formación de una triple hélice, aparejándose, el oligonucleótido anti-sentido, mediante enlaces hidrógeno, denominados de Hoogsteen, al nivel del gran surco de la doble hélice de ADN. En este caso particular, se habla, de una forma más precisa, de oligonucleótidos antígenos. Se entenderá el hecho de que, los oligonucleótidos anti-sentido, pueden ser estrictamente complementarios de la diana ADN o ARN, al cual éstos deben hibridarse, pero también, no estrictamente complementarios, con la condición de que éstos se hibriden a la diana. Así mismo, puede tratarse de oligonucleótidos anti-sentido, no modificados, o modificados al nivel de los enlaces inter-nucleotídicos. Todas estas nociones, forman parte de los conocimientos generales de la persona experta en el arte especializado de la técnica. En el bien entendido, tales tipos de moléculas anti-sentido, pueden constituir vectores, en sí mismas. Pueden igualmente utilizarse vectores que comprendan una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un anti-sentido. Estas moléculas de ácidos nucleicos, son capaces de hibridarse, en condiciones astringentes, al ADN y/o ARN que codifica para las proteínas de la invención, o para su(s) fragmento(s). Condiciones de astringencia características, son aquéllas correspondientes a una combinación de la temperatura y de la concentración salina, elegida aproximadamente entre 12 a 20°C, bajo la TM ("melting temperature" -[temperatura de fusión]-) del híbrido a estudio. Tales tipos de moléculas, se sintetizan y pueden marcarse, utilizando procedimientos de marcaje convencionales utilizados para las sondas moleculares, o pueden utilizarse como cebadores, en las reacciones de amplificación. Las secuencias que presentan por lo menos un 90% de homología, con relación a una secuencia de referencia, forman igualmente parte de la invención, de la misma forma que los fragmentos de estas secuencias que presentan por lo menos 20 nucleótidos y, de una forma preferente, 30 nucleótidos contiguos homólogos, con relación a la secuencia de referencia.

Las moléculas o secuencias de ácidos nucleicos ADN ó ARN, consisten en un fragmento de ADN y/o de ARN de doble hebra o de simple hebra, lineal o circular, natural o aislado o de síntesis, correspondiente a un encadenamiento preciso de nucleótidos, modificados o no, y que permiten definir un fragmento o una región de ácido nucleico elegido entre el grupo consistente en un ADNc; un ADN genómico; un ADN plasmídico; un ARN mensajero. Las secuencias de ácidos nucleicos, se deducen de la secuencia de aminoácidos de las moléculas de interés de la invención, o de sus fragmentos, utilizando el código genético. A raíz de la degeneración del código genético, la invención, engloba igualmente secuencias equivalentes u homólogas. Estas secuencias definidas, permiten, a la persona experta en el arte especializado de la técnica, el definir, él mismo, las moléculas adaptadas. Éste puede también definir y utilizar moléculas de ácidos nucleicos complementarios de las secuencias de ADN y/de ARN, que codifican para las moléculas de interés de la invención, o de su(s) fragmento(s).

Estas secuencias de ácidos nucleicos y/o vectores, permiten objetivizar como diana las células, en las cuales, la proteína o el fragmento de proteína, se expresa, bien ya sea mediante la utilización de una molécula de objetivización como diana, introducida sobre el vector, o bien ya sea mediante la utilización de una propiedad particular de la célula;

- por lo menos una célula de mamífero que no produzca, de una forma natural, por lo menos una molécula de interés de la invención, o cualquier fragmento de estas moléculas, o de los anticuerpos específicos de por lo menos una de las citadas moléculas de interés de la invención o de sus fragmentos, modificándose, la citada célula de mamífero, genéticamente, in vitro, mediante por lo menos una secuencia de ácido nucleico o un fragmento de una secuencia nucleica o una asociación de secuencias de ácidos nucleicos que corresponden a fragmentos de ácidos nucleicos procedentes de un mismo gen o de genes diferentes, deduciéndose, la(s) citada(s) secuencia(s) nucleica(s), de las secuencias de ADN y de ARN que codifican para las moléculas de interés de la invención o de cualquier fragmento, codificando, el citado gen de interés terapéutico, para la totalidad o parte de la molécula de interés de la invención, de un fragmento de la molécula o de un anticuerpo específico de la molécula que se expresará en la superficie de la citada célula de mamífero (Toes et al., 1997, PNAS 94: 14660-14665). Así, de esta forma, la citada célula, contiene por lo menos un gen que codifica in vivo para:

- por lo menos un péptido elegido entre las moléculas de interés de la invención y/o sus fragmentos, y/o

- por lo menos un péptido definido a partir de la secuencia primaria de por lo menos una proteína elegida entre las moléculas de interés de la invención y/o sus fragmentos, y/o

- por lo menos cualquier molécula inhibidora de la actividad y/o de la expresión de estas moléculas, y/o

- por lo menos un péptido procedente de la secuencia primaria de una proteína elegida entre las moléculas de interés de la invención y/o sus fragmentos, y capaz de fijarse sobre por lo menos una glicoproteína del CMHI y/o CMHII, y/o

- por lo menos un ligando y/o cualquier anticuerpo y/o cualquier parte de anticuerpo capaz de fijarse a por lo menos una proteína elegida entre las moléculas de interés de la invención.

De una forma más particular, la citada célula diana, proviene, bien ya sea del mamífero a tratar, o bien ya sea de otro mamífero que el que se va a tratar. En este último caso, conviene tomar debida nota en cuanto al hecho de que, la citada célula diana, habrá seguido un tratamiento que la convierte en compatible con el mamífero a tratar. Según un aspecto preferido, por "mamífero", se entiende designar un mamífero humano. Estas células, se establecen en líneas celulares y son, de una forma preferible, CMHII+ ó CMHII- inducibles como los linfocitos, los monocitos, los astrocitos, los oligodendrocitos.

La invención, se refiere igualmente a las células modificadas y a un procedimiento de preparación de una célula tal como la que se ha descrito anteriormente, arriba, caracterizado por el hecho de que se procede a introducir, en una célula de mamífero, mediante cualquier medio apropiado, por lo menos una secuencia de ácido nucleico que contenga por lo menos un gen de interés terapéutico, y elementos que aseguren la expresión del citado gen en la citada célula, conteniendo, el citado gen de interés, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula o un fragmento de molécula in vivo, como se ha descrito anteriormente, arriba. De una forma más particular, ésta se refiere a células procariotas, células de levaduras y células de animales, de una forma particular, células de mamíferos transformados mediante por lo menos una secuencia nucleotídica y/o un vector tal y como se ha descrito precedentemente.

Según una forma de realización particular, las células (células dendríticas, macrófagos, astrocitos, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+) del paciente o alogénicas, se ponen en contacto con una preparación purificada del polipéptido diana, internalizándose, preparándose y presentándose éste, en la superficie celular asociada a las moléculas del CMHI y/o CMHII. Éstas pueden inducir, además, una respuesta inmune específica contra el péptido. Las células "activadas", se administran a continuación al paciente, en el cual, éstas pueden inducir, entre otras cosas, una respuesta inmune específica de los antígenos (se utiliza una vía natural de la respuesta inmune, pero se controla lo que la célula presentadora del antígeno va a presentar).

Según una forma de realización particular, las células presentadoras del antígeno (célula dendrítica, macrófago, astrocitos,...) se modifican in vivo, para expresar los antígenos, en la célula transformada, que pueden secretarse por la célula y/o asociarse a las moléculas del CMHI y/o CMHII y presentarse en la superficie de las células, para inducir, en el paciente al cual se le administra la célula modificada, una reacción inmune perfectamente objetivizada como diana.

Todos los estudios vacunales, no son siempre satisfactorios y conducen, por ejemplo, a reacciones inmunes limitadas, dirigidas únicamente al encuentro de los epítopos inmunodominantes o contra antígenos que presentan una gran variabilidad. Así mismo, la presentación incorrecta de los antígenos mediante las glicoproteínas del sistema CMH en la superficie de las células, no permite desarrollar, en el paciente tratado, una inmunidad anti-proteína de interés conveniente. Con la finalidad de paliar estos problemas, ciertos autores, han propuesto, en el ámbito de tales tipos de procedimientos vacunales, el seleccionar fragmentos mínimos antigénicos, que corresponden a las porciones de péptido susceptibles de ser reconocidas específicamente por los linfocitos T citotóxicos, el expresarlos en las células con el fin de que éstos se asocien a las moléculas del CMHI y que se presenten en la superficie de las células, para inducir, en el paciente tratado, una reacción inmunitaria perfectamente objetivizada como diana (Toes et al., 1997, PNAS 94: 14660-14665). De una forma más particular, se ha mostrado que, los epítopos de tamaños muy pequeños (que varían de 7 a aproximadamente 13 aminoácidos), que se expresan a partir de minigenes introducidos en un virus vacunal, pueden inducir una inmunización de tipo celular. Se ha mostrado, además, que varios minigenes, podían expresarse conjuntamente, a partir de un mismo vector (esta construcción particular, se denomina "string of beads" -[cuerda de perlas]. Una construcción de este tipo, presenta la ventaja de inducir una reacción inmune de tipo CTL sinérgico (Whitton et al.; 1993 J. of Virology 67: 348-352).

Protocolo de puesta en contacto de las células y del fragmento antigénico

La presentación de los fragmentos antigénicos mediante las moléculas CMHI y/o CMHII, se basa en un procedimiento intracelular identificado (véase Groettrup et al., 1996 Inmunology Today 17: 429-435, para una revisión), y durante cuyo transcurso, se producen péptidos antigénicos de muy corto tamaño (de aproximadamente 7-13 aminoácidos), mediante degradación de un polipéptido más complejo, contra el cual se dirigirá la reacción inmune final. Estos péptidos cortos, se asocian, a continuación, a las moléculas del CMHI o de CMHII, para formar un complejo proteico que se transporta a la superficie celular, con el fin de presentar los citados péptidos a los linfocitos T citotóxicos circulantes o a los linfocitos T citotóxicos circulantes, respectivamente. Es conveniente, además, el tomar debida nota en cuanto al hecho de que, la especificidad de las moléculas CMHI o CMCHII, con respecto a los péptidos antigénicos, varía en función de las moléculas CMHI o CMHII (ejemplo para la CMHI: HLA-A, HLA-B,...) y del alelo (ejemplo para el CMH I: HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11) considerados. En el seno de una misma especie animal, de un individuo al otro, existe una gran variabilidad de los genes que codifican para las moléculas del sistema CMH (a dicho efecto, véase, especialmente, George et al., 1995, Immunology Today 16: 209-212).

Según una forma de realización particular, las células, tales como las células dendríticas, los macrófagos, los astrocitos, los linfocitos T CD4+, los linfocitos T CD8+, se modifican de forma que expresen, en su superficie, anticuerpos específicos del péptido diana. El péptido, se neutraliza mediante anticuerpos expresados en la superficie de las células. Las células son, de una forma preferente, inmunes, de una forma preferente, del paciente, de una forma preferente, citotóxicas, modificadas, para expresar la totalidad o parte de un anticuerpo específico del polipéptido diana.

Aislamiento de células mononucleadas, a partir de sangre periférica

En 1968, Boyum, describió una técnica rápida que permite, mediante centrifugación de la sangre, sobre gradiente de densidad, separar las células mononucleadas (linfocitos y monocitos), con un buen rendimiento (rendimiento teórico del 50%, es decir, 10^{6} células/ml de sangre). Se centrifugan 50 ml de sangre periférica, extraídos de una forma estéril, en tubos heparinados, durante un transcurso de tiempo de 20 minutos a 150 g de fuerza de centrifugación, a una temperatura de 20°C. Las células recuperadas, se diluyen en dos volúmenes de sangre periférica inicial, de PBS estéril. Se procede a depositar 10 ml de esta suspensión, sobre 3 ml de una solución de ficoll-Hypaque (medio de separación de los linfocitos, Flow). Después de la centrifugación, durante un transcurso de tiempo de 20 minutos, a una fuerza de centrifugación de 400 g y a 20°C de temperatura, sin frenado de desaceleración, las células mononucleadas, sedimentan en la interfase PBS-ficoll, en una capa densa, opalescente, mientras que, la casi totalidad de los glóbulos rojos y de los polinucleares, sedimentan al fondo del tubo. Las células mononucleadas, se recuperan y se lavan en PBS estéril.

Internalización de los antígenos mediante las células presentadoras del antígeno

Tratamiento previo de las células presentadoras del antígeno: las células presentadoras del antígeno, se lavan previamente, con un tampón PBS-BSA a un 0,5% de concentración (peso/volumen) y, a continuación, se enumeran y, después, éstas se preincuban, en presencia de diferentes inhibidores de reducción, tres veces, en PBS-BSA al 0,5%, que contiene de 10 \muM a 10 mM final de DTNB (ácido 5,5'-ditio-bis-2-nitrobenzóico) de NEM (N-etilmaleimida). Las etapas ulteriores de fijación de antígenos en la superficie celular o de internalización de antígenos, se realizan, también, en presencia de diferentes tipos de inhibidores.

Protocolo de internalización de los antígenos mediante las células presentadoras del antígeno

Se procede a incubar 8\cdot10^{6} células, en presencia de una cantidad saturante de proteínas radiomarcadas con yodo 125 (1 \mug), en micro-hoyos, en 70 \mul. Después de la incubación, durante un transcurso de tiempo de una hora, a una temperatura de 4°C, bajo régimen de agitación, los antígenos, se fijan en la superficie de las células. La suspensión celular, se lava dos veces en PBS-BSA y, las tortas celulares, se recogen en 70 \mul de tampón, y se incuban a una temperatura de 37°C, durante diferentes períodos de tiempo, que van hasta un tiempo de 2 horas. Se procede a separar las células y los sobrenadantes, mediante centrifugación, a una fuerza de 800 g, durante un transcurso de tiempo de 5 minutos, a una temperatura de 4°C. Para períodos de tiempo de incubación más largos, se procede a eliminar la etapa preliminar de prefijación de los antígenos, en la superficie de las células. Las células, se diluyen en un medio RPMI-10% SVF, en presencia de 20 mM Hepes, a una concentración de 10^{6} células/ml. Las células, se incuban en presencia de un exceso de antígeno, durante diferentes períodos de tiempo, a una temperatura de 37°C (1 \mug de moléculas/5\cdot10^{7} células B-EBV).

A partir de los conocimientos de las secuencias de aminoácidos de interés para la invención, se encuentra al alcance de la persona experta en el arte especializado de la técnica, el definir y utilizar las moléculas descritas anteriormente, arriba, y/o cualquier molécula capaz de fijarse a las citadas moléculas, y/o cualquier molécula capaz de inhibir la actividad de las citadas moléculas de interés.

El agente terapéutico se elige, de una forma preferente, entre una molécula natural y/o una molécula recombinante, o un fragmento de las citadas moléculas, cuya secuencia proteica, corresponde a la secuencia de las moléculas V\betas 16 y/o V\betas 17, de una forma preferente V\beta 16, eventualmente, en asociación con una molécula o con moléculas naturale(s) y/o recombinante(s), o un fragmento de la(s) citada(s) molécula(s), cuya secuencia proteica, corresponde a la secuencia de las moléculas V\betas 2, 3, 7, 8, 12, 14, 17 y 22 y, de una forma preferente, de las moléculas V\betas 3 y 12, o de las moléculas V\betas 7, 14 y 17 y, de una forma ventajosa, 7 y 17;

entre las moléculas naturales, y/o recombinantes y/o de síntesis, o un fragmento de las citadas moléculas que codifican para las moléculas tales como las que se han definido precedentemente, más arriba.

De una forma particular, el agente terapéutico y/o profiláctico, se elige entre las moléculas ADN y/o ARN; los oligonucleótidos anti-sentido y los oligonucleótidos antígenos; por lo menos un ligando susceptible de poder interactuar con los V\betas 16 y 17, de una forma particular, V\beta 16, eventualmente, en asociación con por lo menos un ligando susceptible de poder actuar con por lo menos uno de los V\betas 2, 3, 7, 8, 12, 14, 16 y 22 y, de una forma preferente, los V\betas 3 y 12; entre los anticuerpos, de una forma preferente, los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos de los TCRs de diferentes V\betas anteriormente citados, arriba; por lo menos un ligando susceptible de poder interactuar con los V\betas 16 y/ó 17, eventualmente, en asociación con por lo menos un ligando susceptible de poder interactuar con por lo menos uno de los ligandos V\betas 7, 14 y 17 y 22 y, de una forma preferente, los V\betas 7 y 17, en particular, los anticuerpos, y de una forma preferente, los anticuerpos monoclonales o los fragmentos de los citados anticuerpos y los anti-receptores de los TCRs de diferentes V\betas anteriormente citados, arriba; un agente susceptible de bloquear la interacción del superantígeno a las células presentadoras del antígeno; por lo menos una célula modificada genéticamente in vitro, de una forma preferente, una célula de origen mamífero, mediante un agente terapéutico que consista en por lo menos una molécula de ácido nucleico, que codifica para por lo menos una molécula, cuya secuencia proteica, corresponda a la secuencia que codifica para las moléculas tales como las que se han definido anteriormente, arriba; de una forma particular, una molécula ADN y/o ARN; por lo menos una célula modificada genéticamente in vitro, de una forma preferente, una célula de origen mamífero, mediante un agente terapéutico que consista en por lo menos una molécula de ácido nucleico, que codifique para por lo menos un ligando tal y como se ha definido anteriormente, arriba, de una forma particular, una molécula de ADN y/o ARN.

El agente terapéutico, se elige, de una forma preferente,

entre una molécula natural y/o una molécula recombinante, o un fragmento de las citadas moléculas, cuya secuencia proteica, corresponda a la secuencia de las proteínas MSRV-1 y, de una forma ventajosa, a la secuencia de la proteína env de MSRV-1, y

entre las moléculas naturales y/o recombinantes de síntesis o un fragmento de las citadas moléculas, que codifiquen para las moléculas tales como las definidas anteriormente, arriba.

De una forma particular, el agente terapéutico y/o profiláctico, se elige entre las moléculas ADN y/o ARN; los oligonucleótidos anti-sentido y los oligonucleótidos antígenos; por lo menos un ligando susceptible de interactuar con las proteínas MSRV-1, de una forma particular, la proteína env de MSRV-1, entre los anticuerpos, de una forma preferente, los anticuerpos monoclonales y las anti-proteínas de MSRV-1, de una forma particular, las anti-proteínas env de MSRV-1; por lo menos una célula modificada genéticamente in vitro, de una forma preferente, una célula de origen mamífero, mediante un agente terapéutico que consista en por lo menos una molécula de ADN que codifique para por lo menos una molécula cuya secuencia proteica corresponda a la secuencia codificante para las moléculas tales como las que se han definido precedentemente, de una forma particular, una molécula de ADN y/o ARN; por lo menos una célula modificada genéticamente in vitro, de una forma preferente, una célula de origen mamífero, mediante un agente terapéutico que consista en por lo menos una molécula de ADN que codifique para por lo menos un ligando tal como el que se ha definido anteriormente, de una forma particular, una molécula de ADN y/o
ARN.

Así, de este modo, el agente terapéutico es, de una forma preferente, un agente antivírico, de una forma más particular, antivírico, en particular, humano, de una forma preferente, anti-MSRV-1, tal como un inhibidor del ciclo de replicación y/o de la expresión de un retrovirus, tal como un anticuerpo anti-proteína retroviral, de una forma particular, anti-envoltura, tal como los oligonucleótidos anti-sentido, de una forma más particular, que bloqueen la expresión retroviral.

De una forma ventajosa, el ligando, es susceptible de poder interactuar con un retrovirus, de una forma particular, un retrovirus humano, tal como MSRV-1, sus proteínas y/o sus ácidos nucleicos. De una forma particular, el ligando, se elige entre los anticuerpos anti-MSRV-1, de una forma preferente, los anticuerpos monoclonales.

Los agentes terapéuticos tal como se definen precedentemente, se utilizan para la preparación de una composición profiláctica y/o terapéutica y, la invención, se refiere, también, a una composición de este tipo, que comprende por lo menos uno de los citados agentes terapéuticos, eventualmente, en asociación con un vehículo y/o excipiente y/o un adyuvante y/o un diluyente farmacéuticamente aceptable. Puede tratarse, entre otros, de composiciones vacunales a base de moléculas proteína(s) o de péptido(s) o de secuencias de ácidos nucleicos derivados de las moléculas de interés o de sus fragmentos, tal y se ha descrito precedentemente, para la profilaxis y/o la terapia de una enfermedad auto-inmune, de una forma particular, la esclerosis en placas. Entre estas moléculas, se pueden encontrar las antivirales (antivíricas). Estas proteínas y péptidos administrados, se caracterizan por el hecho de que, éstos, no deben ser tóxicos para el organismo en el cual éstos se administran, o deben haber perdido su capacidad de fijarse a un ligando, y pueden inducir significativamente una respuesta inmune mediatizada por los linfocitos T y/o los anticuerpos dirigidos contra esta proteína. Tales tipos de proteínas, se denominan "modificadas", mientras tanto, su inmunogenicidad, se conserva. Tales tipos de moléculas inmunogénicas modificadas, se obtienen mediante un gran número de tratamientos convencionales, como por ejemplo, la desnaturalización química o al calor, la división o segmentación, o la mutación con deleción, inserción o reemplazo de aminoácidos. Un ejemplo de segmentación, consiste en la segmentación de aminoácidos en la extremidad carboxi-terminal, que puede ir hasta 5-30 aminoácidos. Las moléculas modificadas, pueden obtenerse mediante técnicas sintéticas y/o recombinantes o mediante tratamientos químicos o físicos de las moléculas naturales.

Las moléculas de interés, naturales y/o recombinantes identificadas en la presente invención, y las secuencias peptídicas o los fragmentos de las citadas moléculas, se utilizan en la vacunación profiláctica y terapéutica, contra las enfermedades, de una forma preferente, la esclerosis en placas. Una vacuna, comprende una cantidad inmunogénica efectiva de la molécula inmunógena, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, eventualmente, un adyuvante y/o un diluyente. Los vehículos, adyuvantes y diluyentes farmacéuticamente aceptables, son bien conocidos por parte de la persona experta en el arte especializado de la técnica. Se puede citar, a título de referencia, el Remington's Pharmaceutical Sciences [Ciencias farmacéuticas de Remington]. La utilización de las composiciones vacunales, es perfectamente ventajosa, en asociación con un diagnóstico precoz de la enfermedad. La proteína inmunógena, se utiliza en la preparación de medicamento para la vacunación profiláctica o terapéutica. Las proteínas de interés, pueden eliminarse del organismo, sin inducir los efectos secundarios indeseables. La identificación de tales tipos de moléculas o péptidos, se realiza de la forma que sigue: se procede a verificar el hecho de que, las moléculas candidatas modificadas como se ha descrito precedentemente, (proteínas naturales, recombinantes, péptidos), no son tóxicas para el organismo, a continuación, se verifica su inmunogenicidad (i) realizando un test in vitro de la proliferación de linfocitos T CD4+ específicos del antígeno administrado (T cell assay - ensayo de células T) o un test de ensayo in vitro de citotoxicidad de los linfocitos CD8+ específicos del antígeno administrado y (ii) midiendo, además, su tasa de anticuerpos circulantes dirigidos contra la proteína natural. Estas formas modificadas, se utilizan para inmunizar hombres, mediante los procedimientos standard, con adyuvantes apropiados.

Las vacunas apropiadas, son inyectables, es decir, en solución líquida o en suspensión. Opcionalmente, la preparación, puede también emulsionarse. La molécula antigénica, puede mezclarse con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los ejemplos de excipientes favorables, son el agua, una solución salina, la dextrosa, el glicerol, el etanol, o equivalentes de sus combinaciones. Si se desea, la vacuna, puede contener cantidades menores de substancias auxiliares, como los agentes "wetting"(humectantes) o emulsionantes, agentes que tamponan el pH o adyuvantes tales como el hidróxido de aluminio, el dipéptido muramil, o sus variaciones. En el caso de los péptidos, su acoplamiento a una molécula más grande (KLH, toxina tetánica) aumenta algunas veces al inmunogenicidad. Las vacunas, se administran convencionalmente mediante inyección, por ejemplo, subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales favorables con otros modos de administración, incluyen a los supositorios y, algunas veces, a las formulaciones orales.

En general, la concentración en proteína, en la composición utilizada, para una administración in vivo, es por ejemplo de 0,1 \mug/ml, a 20 mg/ml.

La presente invención, se refiere igualmente a la utilización de vacunas que incluyen moléculas de ácidos nucleicos, que codifican para las moléculas de interés de la invención, o péptidos inmunógenos o su(s) fragmento(s), no activos. Las vacunas de ácidos nucleicos, en particular, las vacunas ADN, se administran, generalmente, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en inyección intramuscular.

Otro aspecto de la invención, se refiere a composiciones profilácticas y/o terapéuticas que comprenden, entre otras, substancias naturales y/o sintéticas y/o recombinantes (i) capaces de bloquear y/o de inhibir la actividad de las moléculas de interés de la invención y/o de sus fragmentos, y/o (ii) capaces de inhibir su metabolismo, y/o (iii) capaces de regular la expresión de los ligandos de las moléculas de interés de la invención, o sus fragmentos, y/(iv) capaces de inhibir la función y/o la expresión de los ligandos de interés de la invención, o sus fragmentos. Estas substancias, pueden utilizarse en tratamientos profilácticos y terapéuticos de la enfermedad, por ejemplo, la SEP, administrando cantidades efectivas. Las substancias, pueden ser pequeñas moléculas sintéticas o naturales, derivados de las proteínas identificadas en esta invención, lípidos, glicolípidos, compuestos químicos, etc... Las pequeñas moléculas, pueden cribarse e identificarse en gran cantidad, utilizando librerías combinatorias químicas, La invención, se refiere igualmente a composiciones farmacéuticas que comprenden substancias en asociación con vehículos y/o adyuvantes y/o excipientes y/o diluyentes fisiológicamente aceptables, y a procedimientos para la preparación de medicamentos a utilizar en terapia o en prevención de enfermedades auto-inmunes, de entre las cuales, la SEP.

Con objeto de identificar tales tipos de moléculas, se utilizan tests de ensayo y protocolos in vitro e in vivo, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba, utilizando muestras extraídas de pacientes y/o de animales no tratados o tratados. Las moléculas seleccionadas, se someten a test de ensayo, a diferentes concentraciones. Estos inhibidores, se someten también a tests de ensayo de toxicidad y de farmacocinética, para saber si éstos pueden representar drogas candidatas válidas. Las pequeñas moléculas, pueden cribarse e identificarse en gran cantidad, utilizando librerías combinatorias químicas.

La presente invención, se refiere asimismo a la utilización de células transformadas in vivo, después de la inyección de vectores que contengan por lo menos un gen de interés terapéutico, definido a partir de moléculas de interés identificadas o sus fragmentos, para la preparación de una composición. Se recuerda que, para la simplicidad de la exposición, se hablará generalmente de moléculas de interés de la invención, para designar el o los diferente(s) V\beta asociado(s) a la actividad superantigénica y la o las proteínas de MSRV-1, en particular, la proteína env de MSRV-1.

La composición, comprende por lo menos un vector que contiene un gen terapéutico como se ha descrito anteriormente, arriba, capaz de introducirse en una célula diana in vivo, y de expresar el gen de interés terapéutico in vivo. La ventaja, se basa en la posibilidad de mantener, a largo plazo, un nivel basal de moléculas expresadas en el paciente tratado. Se inyectan vectores o ácidos nucleicos que codifican para los genes de interés terapéutico. Estos vectores y ácidos nucleicos, deben ser transportados hasta las células diana, y transfectar las células en la cuales, éstos deben expresarse in vivo.

La invención, se refiere a la expresión in vivo de secuencias nucleotídicas y/o de vectores tales como los que se han descrito precedentemente, arriba, es decir, a secuencias que corresponden a genes de interés terapéutico que codifican, especialmente:

- bien ya sea por lo menos para una proteína elegida entre las moléculas de interés identificadas en la presente invención, o sus fragmentos, y/o

- bien ya sea por lo menos para la totalidad o parte de un anticuerpo policlonal o monoclonal, capaz de fijarse a por lo menos una proteína elegida entre las moléculas de interés identificadas en la presente invención, y sus fragmentos. Puede tratarse de un anticuerpo transmembranario nativo, o de un fragmento o derivado de un cuerpo de este tipo, siempre y cuando, el citado anticuerpo, fragmento o derivado de anticuerpo, se exprese sobre la superficie de la célula diana de mamífero, genéticamente modificada, y que el citado anticuerpo, sea capaz de fijarse a un polipéptido presente en la superficie de una célula efectora citotóxica o de un linfocito T "helper", y de inhibir la actividad de por lo menos una molécula de interés de la invención. Puede tratarse de fragmentos de anticuerpos expresados por células capaces de secretar los citados anticuerpos en la circulación sanguínea del mamífero o paciente portador de las células genéticamente modificadas por el gen que codifica para el anticuerpo, y/o

- bien ya sea para una molécula inhibidora de por lo menos una proteína elegida entre las moléculas identificadas en la presente invención, o sus fragmentos, y/o

- bien ya sea para un ligando o cualquier parte del ligando, capaz de fijarse a por lo menos una proteína elegida entre las moléculas de interés identificadas en la presente invención, o sus fragmentos, y/o de inhibir su función. A partir de las secuencias de aminoácidos de las moléculas de interés de la invención, o de sus fragmentos, se encuentra al alcance de la persona experta en el arte especializado de la técnica, el deducir las secuencias nucleotídicas ADN y ARN correspondientes a las moléculas de interés o a sus fragmentos, sirviéndose del código genético y teniendo en cuenta su degeneración. Así, de este modo, la presente invención, se refiere a la utilización de estas secuencias nucleotídicas en forma de secuencias anti-sentido, de secuencias que codifican para un gen terapéutico, de secuencias que pueden estar contenidas en un vector para la realización de la transformación celular ex vitro y/o in vivo (terapia genética).

Según una forma particular de realización, se trata de utilizar la terapia genética, de tal forma que se dirija la respuesta inmune contra la proteína, el péptido o la molécula de interés como diana, es decir, contra cualquier molécula elegida entre las moléculas de interés para la invención y/o sus fragmentos y/o contra cualquier molécula inhibidora de la actividad y/o de la expresión, y/o del metabolismo de las citadas moléculas de interés, y/o de los ligandos de las citadas moléculas. Para ello, es evidente el hecho de que, las células a objetivizar como diana, para la transformación con un vector, son células que pertenecen al sistema inmune, bien ya sea células presentadoras del antígeno (células dendríticas, macrófagos,...) o bien ya sea células de tipo linfocito (CD4/CD8).

Según una forma de realización particular, se procede a modificar genéticamente, especialmente, in vivo, las células presentadoras del antígeno (APC). Las APCs como los macrófagos, las células dendríticas, los microgliocitos, los astrocitos, juegan un rol interpretativo en la iniciación de la respuesta inmune. Éstas son los primeros componentes celulares que capturan el antígeno, los preparativos en la célula, y expresan las moléculas del CMHI y CMHII transmembranarias implicadas en la presentación del inmunógeno a las células T CD4+ y CD8+, éstas producen proteínas accesorias específicas que participan en la activación de las células T, vía el reconocimiento de determinantes V\beta del receptor T en la superficie de los linfocitos T (Debrick et al.; 1991, J. Immunol 147: 2846; Reis et al., 1993, J Ep Med 178: 509; Kovacsovics-bankowski et al., 1993, PNAS 90: 4942; Kovacsovics-bankowski et al., 1995 Science 267-243; Svensson et al., 1997, J. Immunol 158: 4229; Norbury et al.; 1997, Eur J Immunol 27: 280). Para una vacunación, puede ser ventajoso el disponer de un sistema de terapia genética que pueda objetivizar como diana la transferencia de tales tipos de células APC.

Se elige expresar, en la superficie de las células APCs in vivo, la totalidad o parte de un anticuerpo y/o de un ligando, capaz de reaccionar con la proteína o el péptido diana elegidos entre las moléculas de interés de la invención y/o sus fragmentos. Tales tipos de células, procederán entonces específicamente a fagocitar la citada proteína o el citado péptido, a prepararla de tal forma que los fragmentos de estos péptidos se encuentren presentes en la superficie de las células presentadoras del antígeno.

La literatura, propone un gran número de ejemplos de genes que codifican para anticuerpos capaces de reaccionar con los polipéptidos o receptores. Está al alcance de la persona experta en el arte especializado de la técnica, el obtener secuencias de ácidos nucleicos que codifican para tales tipos de anticuerpos. Citemos, por ejemplo, a los genes que codifican para las cadenas ligeras y pesada del anticuerpo YTH 12.5 (anti-CD3) (Routledge et al. 1991, Eur J Immunol 21: 2717-1725), del anti-CD3 según Arakawa et al.; 1996, J. Biochem. 120: 657-662. Las secuencias de ácidos nucleicos de tales tipos de anticuerpos, son fácilmente identificables, a partir de las bases de datos comúnmente utilizadas por la persona experta en el arte especializado de la técnica. Es igualmente posible, a partir de hibridones disponibles en la ATCC, el clonar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para las cadenas pesadas y/o ligeras de estos diferentes anticuerpos, mediante procedimientos de amplificación tales como la RT-PCR, con la ayuda de oligonucleótidos específicos o las técnicas que ponen en práctica bancos de cDNA (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning. A laboratory manual CSH Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Las secuencias clonadas de este modo, se encuentran entonces disponibles para su clonación en vectores. Según un caso preferido de la invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena pesada de anticuerpos, se fusiona mediante recombinación homóloga con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido transmembranario (Polydefkis et al., 1990 J Exp Med 171: 875-887). Estas técnicas de biología molecular, han sido perfectamente descritas.

Se elige el expresar, en la superficie de las células APCs in vivo, fragmentos inmunógenos correspondientes a por lo menos una proteína elegida entre las moléculas de interés de la invención y/o sus fragmentos. Para ello, se puede elegir el proceder a expresar, mediante el vector, bien ya sea el polipéptido completo, o bien ya sea, de una forma preferible, polipéptidos seleccionados para reaccionar con ligandos y/o receptores específicos. El péptido inmunógeno codificado por el polinucleótido introducido en la célula del vertebrado in vivo, puede introducirse y/o secretarse, prepararse y, a continuación, presentarse a una célula presentadora del antígeno (APC) en el contexto de las moléculas del CMH. Las APC de esta forma transferidas in vivo, introducen una respuesta inmune, dirigida contra el inmunógeno expresado in vivo. Las APC, poseen diferentes mecanismos para capturar los antígenos: (a) la captura de los antígenos mediante receptores membranarios como los receptores a las inmunoglobulinas (Fc), o para el complemento, disponibles en la superficie de los granulocitos, monocitos o macrófagos, que permiten un suministro eficaz del antígeno en los compartimientos intracelulares, después de fagocitosis mediatizada por los receptores, (b) la entrada en las APC, mediante pinocitosis, en fase fluida, implicando diferentes mecanismos: la micropinocitosis, es decir, la captura de péptidos vesículas (0,1 \mum), mediante los hoyos recubiertos con clatrina, y la macropinocitosis, es decir, la captura de vesículas más grandes (con un tamaño que varía entre los 0,5 \mum y aproximadamente 6 \mum)(Sallusto et al., 1995, J. Exp Med 182: 389-400). Mientras que, la micropinocitosis, existe de una forma constitutiva en todas las células, la macropinocitosis, se limita a tipos celulares, como por ejemplo, los macrófagos, las células dendríticas, los astrocitos, las células epiteliales estimuladas por factores de crecimiento (Racoosin et al., J. Cell Sci 1992, 102: 867-880). En esta invención, se entiende, por células capaces de macropinocitosis, las células que pueden realizar sucesos descritos anteriormente, arriba, y las células que pueden capturar macromoléculas, de una forma preferente, entre 0,5 \mum y aproximadamente 6 \mum, en el citoplasma.

Según una forma de realización particular, se procede a modificar genéticamente, especialmente, in vivo, las células efectoras citotóxicas o los linfocitos T "helper" de tal forma que, éstas, expresen, en su superficie, ligandos de por lo menos una de las citadas moléculas de interés de la invención, naturalmente, no expresadas por estas moléculas, y capaces de fijarse a la totalidad o parte de por lo menos una de las moléculas de interés de la invención, en la superficie de la misma célula o de otras células, y de inhibir la actividad de por lo menos una molécula de interés de la invención, mediante la introducción, en estas células, de secuencias de ácido nucleico, que encierran el gen que codifica para un polipéptido de este tipo. En conformidad con la presente invención, es igualmente posible el seleccionar una secuencia de ácido nucleico que contenga un gen de interés terapéutico que codifique para la totalidad o parte de un anticuerpo dirigido contra una proteína elegida entre las moléculas de interés de la invención y las secuencias peptídicas y/o los fragmentos de las citadas secuencias, susceptibles de expresarse en la superficie de las células diana del paciente a tratar, siendo capaces, los citadas anticuerpos, de fijarse a un polipéptido, mediante células efectoras de interés de la invención, presentes en la superficie de lo linfocitos citotóxicos y/o linfocitos T "helper", o incluso de inhibir la actividad de estas moléculas de interés.

Se han desarrollado numerosas herramientas, para introducir diferentes genes heterólogos y/o vectores, en las células, de una forma particular, células de mamíferos. Estas técnicas, pueden dividirse en dos categorías, la primera categoría, implica técnicas físicas, como la micro-inyección, la electroporación, o el bombardeo de partículas. La segunda categoría, se basa en la utilización de técnicas en biología molecular y celular, con las cuales, el gen, se transfiere con un vector biológico o sintético que facilita la introducción del material en la célula in vivo. Hoy en día, los vectores más eficaces, son los vectores víricos, de una forma particular, los adenovirus y retrovirus. Estos virus, poseen propiedades naturales para atravesar las membranas plásmicas, evitar la degradación de su material genético e introducir su genoma en el núcleo de la célula. Estos virus, han sido ampliamente estudiados y, algunos de ellos, se utilizan ya de una forma experimental, en aplicaciones humanas y vacunación, en inmunoterapia, o para compensar deficiencias genéticas. Mientras tanto, este estudio viral, tiene limitaciones, especialmente debido a la capacidad de clonación restringida en estos genomas virales, el riesgo de diseminar las partículas virales producidas en el organismo y el entorno medioambiental, el riesgo de mutagénesis artefactual mediante la inserción en las células huésped, en el caso de los retrovirus, y la posibilidad de inducir una fuerte respuesta inmune inflamatoria in vivo, durante el tratamiento, lo cual limita el número de inyecciones posibles (Mc Coy et al.,11995, human Gen Therapy, -Terapia genética humana-, 6: 1553-1560; Yang et al., 1996 Immunity 1: 433-422). Existen otros vectores humanos alternativos a estos vectores víricos. La utilización de procedimientos no víricos, como por ejemplo, la co-precipitación, con el fosfato de calcio, la utilización de receptores que imitan los sistemas víricos (para un resumen, véase Cotten et Wagner 1993, Current Opinion in Biotechnology, -Opinión actual en Biotecnología-, 4: 705-710), o la utilización de polímeros como las poliamindoaminas (Haensler et Szoka, 1993, Biconjugate Chem 4: 372-379). Otras técnicas no víricas, se basan en la utilización de los liposomas, cuya efectividad para la introducción de macromoléculas biológicas, como el ADN, el ARN de las proteínas o de las substancias farmacéuticas activas, se han descrito ampliamente en la literatura científica. En este sector, hay equipos que han propuesto la utilización de lípidos catiónicos que tienen una fuerte afinidad para las membranas celulares y/los ácidos nucleicos. Finalmente, se ha mostrado el hecho de que, una molécula de ácido, en sí misma, podía atravesar la membrana plásmica de ciertas células in vivo (documento de patente internacional WO 90/11 092), siendo la eficacia dependiente, de una forma particular, de la naturaleza polianiónica del ácido nucleico. Desde 1989 (Felgner et al.; Nature 337: 37-388), se han propuesto los lípidos catiónicos, para facilitar la introducción de grandes moléculas aniónicas, lo cual neutraliza las cargas negativas de estas moléculas y favorece su introducción en las células. Diferentes equipos, han desarrollado tales tipos de lípidos catiónicos: el DOTMA (Felgner et al., 1987, PNAS 84: 7413-7417), el DOGS o Transfectam® (Behr et al., 1989, PNAS 86: 6982-6986), el DMRIE y el DORIE (Felgner et al., 1993 methods 5: 67-75), el DC-CHOL (Gao et Huang 1991, BBRC 179: 280-285), el DOTAP® (MaLachlan et al., 1995, Gen therapy 2: 674-622) o la Lipfectamina®, y las otras moléculas descritas en los documentos de patente internacional WO 91/16 024, WO 95/14 651, WO 94/05 624. Otros grupos, han desarrollado polímeros catiónicos que facilitan la transferencia de macromoléculas, en particular, macromoléculas aniónicas en las células. El documento de patente internacional WO 95/24 221, describe la utilización de la polietilenimina o la polipropilenimina y los documentos de solicitud de patente estadounidense US-A 5.595.897 y de patente francesa FR 2 719 316, la utilización de conjugados polilisina.

Puesto que se desea el obtener in vivo una transformación objetivizada como diana, hacia un tipo de célula determinada, es evidente el hecho de que, el vector utilizado, debe, éste mismo, poderse objetivizar como diana (tal y como se ha descrito anteriormente, arriba).

El material biológico definido en la presente invención, puede administrarse in vivo, especialmente, en forma inyectable. Se puede igualmente pretender como objetivo una inyección por vía epidérmica, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracerebral, mediante jeringa, o mediante cualquier otro medio perfectamente conocido por parte de las personas expertas en el arte especializado de la técnica. La administración, puede tener lugar en dosis única o repetida, una o varias veces, después de una cierta demora de intervalo. La vía de administración y la dosificación más apropiadas, varían en función de diferentes parámetros, tales como, por ejemplo, el individuo o la enfermedad a tratar, del estado y/o la evolución de la enfermedad, o también, todavía, del ácido nucleico y/o de la proteína y/o péptido y/o molécula y/o célula a transferir o del órgano/tejido diana.

Otros objetos de la invención, son los siguientes:

- un procedimiento para identificar substancias capaces de bloquear la transcripción y/o la transducción de un retrovirus humano, de una forma particular, el MSRV-1 ó una variante de MSRV-1, tal y como se ha definido precedentemente, y que presente una actividad superantigénica, estando asociada, la citada actividad superantigénica, a una enfermedad auto-inmune, según el cual,

se pone en contacto la substancia, con células que expresan un polipéptido retrovírico, tal como se ha definido anteriormente, y que tenga una actividad superantigénica, y

se detecta una pérdida o disminución de la actividad superantigénica según la invención.

- un equipo, a modo de "kit", para el cribado de substancias capaces de bloquear la actividad superantigénica de un retrovirus, de una forma particular, el retrovirus MSRV-1 ó una variante de MSRV-1, tal como se ha definido precedentemente, asociado a una enfermedad auto-inmune, o capaz de bloquear la transcripción y/la traducción del citado retrovirus, que comprende:

células que expresan, en su superficie, productos del MHC de clase II, transformados con, y que expresan funcionalmente, un superantígeno retrovírico,

células portadoras de cadenas del receptor de un V\beta o de V\betas, estimuladas por el superantígeno retrovírico, y

medios para detectar una pérdida o disminución de la actividad superantigénica según la invención.

Definiciones

Por fragmento de anticuerpo, se entienden los fragmentos F(ab)2, Fab', Fab, sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159: 5821-5833; Bird et al., 1988 Science 242: 423-426) de un anticuerpo nativo y, por derivado, se entiende, por ejemplo, un derivado quimérico de un anticuerpo de este tipo (véanse, por ejemplo, los químeros de los anticuerpos anti-CD3 Ratones/Hombre, en Arakawa et al., 1996 J Biochem 120: 657-662, o las inmunotoxinas, tales como la sFv-toxina de Chaudary et al., 1989, Nature 339: 394-397).

Por anticuerpo transmembranario, se entiende un anticuerpo, en donde, por lo menos la región funcional capaz de reconocer y de fijarse a su antígeno específico, se expresa en la superficie de las células diana, para permitir los citados reconocimiento y fijación. De una forma más particular, los anticuerpos según la presente invención, consisten en péptidos de fusión que comprenden los aminoácidos que definen a la citada región funcional y una secuencia de aminoácidos (polipéptido transmembranario) que permite el anclaje en el seno de la doble capa lipípica membranaria, de la célula diana, o en la superficie externa de esta bi-capa. Las secuencias nucleicas que codifican para numerosos polipéptidos transmembranarios, se describen en la literatura. Según un caso del todo ventajoso, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena pesada del anticuerpo, se fusiona con la secuencia de ácido nucleico que codifica para un denominado polipéptido transmembranario.

Por elementos que aseguran la expresión de un gen in vivo, se hace especialmente referencia a los elementos necesarios para asegurar la expresión del citado gen, después de su transferencia al interior de una célula diana. Se trata, especialmente, de secuencias promotoras y/o de secuencias de regulación eficaces en la citada célula y, eventualmente, las secuencias requeridas para permitir la expresión, en la superficie de las células diana, de dicho polipéptido. El promotor utilizado, puede ser un promotor vírico, ubiquitario o específico de tejido o, incluso, un promotor sintético. A título de ejemplo, se mencionarán los promotores tales como los promotores de los virus RSV (Rous Sarcoma Virus), MPSV, SV40 (Simian Virus), CMV (Cytomegalovirus), o del virus vacunal, codificando, los promotores del gen, para la creatina-cinasa muscular, para la actina. Es también posible, además, el elegir una secuencia promotora específica de un tipo celular dado, o activable en las condiciones definidas. La literatura, procura un gran número de información relativa a todas estas secuencias promotoras.

Por células efectoras citotóxicas, se entienden los macrófagos, los astrocitos, los linfocitos T citotóxicos (TCL) que expresan, en su superficie, las moléculas CD8, y las células agresoras (NK), así como sus derivados tales como, por ejemplo, las LAK (Versteeg 1992 Immunology today 13: 244-247; Brittende et al 1996, Cancer 77: 1226-1243). Por "linfocitos T helper", se entiende designar, especialmente, las células que expresan, en su superficie, las moléculas CD4, que permiten, después de la activación, la secreción de factores de activación de las células efectoras de la respuesta inmune. Los polipéptidos y, especialmente, los receptores expresados en la superficie de las células y que están implicadas en la activación de tales tipos de células, consisten, especialmente, en la totalidad o parte del complejo TCR que comprende los determinantes Vb y/o el CD3, la totalidad o parte de los complejos CD8, CD4, CD28, LFA-1, 4-1BB (Melero et al., 1998, Eur J Immunol 28: 1116-1121), CD47, CD2, CD1, CD8, CD9, CD45, CD30, CD40, la totalidad o parte de los receptores de citocinas (Finke et al., 1998, Gene therapy 5: 31-39), tales como IL-7, IL-4, IL-2, IL-15 ó GM-CSF, la totalidad o parte del complejo receptor de las células NK, tal como, por ejemplo, NKAR, Nkp46,...; (Kawano et al., 1998 Immunology 95: 5690-5693: Passino et al., 1998 J Exp Med 188: 953-960), NKp44, la totalidad o parte de los receptores de macrófagos, tales como, por ejemplo, el receptor Fc (Deo et al., 1997, Immunology Today 18: 127-135).

Por eficacia terapéutica, de una forma general, se entiende el efecto inhibidor de la actividad de tipo superantigénico tal como se define por los perfiles V\betas de la invención, y la capacidad de inhibir y/o de bloquear las interacciones moleculares y/o inmunológicas de las V\betas de la invención, que conducen a su expansión o disminución, tal como se ha descrito precedentemente.

Por sobrenadante o fracción sobrenadante, se entiende el sobrenadante o una fracción de éste último, hasta las moléculas, péptidos y/proteínas que éstos comprenden.

Las experiencias, se realizaron a partir:

1) de células mononucleadas sanguíneas, procedentes de once donantes sanos, y purificadas sobre un gradiente de Ficoll. Se efectuó, previamente, la tipificación HLA DR de cada donante.

2) (i) de una comunidad (pool) de sobrenadantes de cultivo, concentrada mediante ultracentrifugación (100 000 g x 2 horas) de linfocitos B humanos, procedentes de pacientes SEP (LBSEP) o de testigos no-SEP (LBTE), y (ii) de sobrenadante de cultivo de células de plexos coroideos humanos, procedentes de un paciente SEP (GRE) y de un testigo no-SEP (LES).

3) de proteínas recombinantes.

Ejemplo 1 Preparación de extractos de sobrenadantes de cultivo de células procedentes de pacientes afectados de SEP o de testigos no SEP

Los protocolos de cultivo de estas células de plexos coroideos, se han descrito en el documento de prioridad de la solicitud de patente internacional PCT WO 93/20 188.

1) Cultivo de células de plexos coroideos

Las células de plexos coroideos, se obtienen a partir de explantes extraídos post-mortem, y se ponen en cultivo, eventualmente, después de disociación mecánica y/o enzimática de los tejidos extraídos. Las células que proliferan en el cultivo, son de un aspecto fibroblástico, y corresponden a células de origen leptomeníngeas, a veces denominadas "fibroblastos de plexos coroideos". Éstas, pueden cultivarse durante un cierto número de pasadas y congelarse en el momento de pasadas intermediarias y descongelarse ulteriormente para un nuevo cultivo.

Las células LES (testigo no-SEP) y GRE (SEP) se descongelaron y, a continuación, se pusieron en cultivo, en medio F-12 "completo", que contiene:

Penicilina	200 U/ml
Estreptomicina	20 mg/l
L-glutamina	6 mM
Pivurato de sodio	1%
Aminoácidos esenciales	1%
\begin{minipage}[t]{150mm} Anticuerpos anti-IFN lecocitario (anti-interferón alfa Policlonal, comercializado por la firma Sigma), añadido a 10 U/ml final.\end{minipage}

Este medio, se suplementa con un 30% de SVF (suero vacuno fetal), y se descomplementa a una temperatura de 56°C, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos. El cultivo celular, se hace en una estufa, a una temperatura de 37°C, humidificada, en presencia de un 5% de CO_{2}. El cambio del medio, se efectúa dos veces por semana. Si las células adherentes se encuentran en confluencia en el fondo del frasco, el cultivo, se desdobla. Con objeto de realizar este cometido, el sobrenadante de cultivo (SC), se elimina y se reemplaza por medio F12 completo-SVF 30% "fresco". Con la ayuda de un rascador, o de una mezcla de tripsina-EDTA, las células, se desprenden de la pared del frasco. A continuación, éstas se resuspenden cuidadosamente, antes de repartirse en dos frascos de cultivo. Se dice que, el cultivo, se desdobla, o que éste sigue una pasada.

Los SC, se recogen y se congelan, a una temperatura de -80°C, para la ultracentrifugación, después de la eliminación de los residuos celulares, por centrifugación, a una velocidad angular de 3000 revoluciones por minuto, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos. Para el estudio, se descongeló un volumen total de aproximadamente 400 ml, se reagrupó y se homogeneizó, antes de la ultracentrifugación, para cada cultivo (SEP/GRE y NO-SEP/LES).

2) Cultivo de las líneas B-linfoblastoides - Obtención de linfocitos B, a partir de la sangre periférica y establecimiento de líneas B linfoblastoides inmortalizadas por el EBV (Virus de Epstein Barr)

Los linfocitos humanos, se aíslan, a partir de 50 ml de sangre heparinada diluida a una mitad, con RPMI 1640, mediante centrifugación sobre un gradiente de Ficoll. Éstos se recogen delicadamente del anillo, así como los eventuales agregados celulares, pudiendo flotar hasta por encima del anillo. Las células, se lavan dos veces, a continuación, en el medio RPMI 1640. Después de estos lavados, las células, se resuspenden a la concentración de 2 x 10^{6} células/ml, en medio RPMI, que contiene:

\newpage

Este medio, se suplementa con un 30% de SVF (suero vacuno fetal), y se descomplementa a una temperatura de 56°C, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos.

Los frascos de cultivo, se incuban, en estufas, a una temperatura de 37°C, en una atmósfera humidificada, que contiene un 5% de CO_{2}, antes de haber añadido, al medio de cultivo, 1 ml de sobrenadante filtrado de cultivo productor EBV B95-8 (a saber, 10^{5} partículas vírales EBV para 4 a 5 x 10^{6} linfocitos totales) en presencia de 200 \mul de una solución de CSA-Sandoz (2 \mug de CSA para 4 a 5x10^{6} linfocitos totales) y, esto, hasta el primer cambio de medio de cultivo. Los frascos, se mantienen durante tres meses, después de lo cual, si no ha empezado ninguna proliferación linfocítica, el frasco, se tira. Cuando la proliferación celular ha comenzado en el frasco, las células, se conservan en el mismo frasco, hasta que, un número significativo de colonias proliferativas, formen amas o montones. El "desdoblamiento" de cultivo (pasada o trasplante), se efectúa después de la disociación mecánica de las amas, mediante trasplante y rechazo (inhibición) vigoroso. Los cultivos de esta forma obtenidos, corresponden a líneas de linfocitos B (líneas Linfoblastoides). En estas condiciones, se obtuvieron cuatro líneas procedentes de SEP ciertas, y dos líneas procedentes de testigos no-SEP.

- Congelación de las células

Las células, se lavan en medio RPMI-SVF-20%. La tarta, se lava en SVF (1 ml aproximadamente para 8 x 10^{6} células) y se transfiere a un criotubo, para la congelación. Se procede a añadir 200 \mul de una solución de SVF DMSO, preparada previamente, y conservada a una temperatura de -20°C, a la solución celular (concentración final de DMSO = 10%), la cual se agita entonces ligeramente. Las células, se congelan de este modo, a una temperatura de -80°C, en algodón cardado y, después, al día siguiente, se almacenan en DMSO.

Las células descongeladas, a la temperatura ambiente, se lavan dos veces en 10 ml de medio RPMI-SVF 20%, antes de la puesta en cultivo.

Los cuatros cultivos SEP y los dos cultivos testigo, se ponen en cultivo, al mismo tiempo, con los mismos reactivos y los mismos lotes de medio, pero se cultivan en laboratorios de cultivo separados (P3 y P2, respectivamente). Los cultivos individuales, se condujeron en paralelo, durante un transcurso de tiempo de aproximadamente un mes, con el fin de recoger un volumen, del pool o comunidad de los SC separados, de cada paciente SEP y de cada testigo, de aproximadamente 600-800 ml de cada tipo (LBSEP y LBTE). Este volumen, se reunió mediante congelación sistemática, a una temperatura de -80°C, de los sobrenadantes extraídos dos veces por semana, después de una pre-centrifugación, a una velocidad angular de 1800 revoluciones por minuto, durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, para sedimentar y recuperar las células en suspensión, seguido de una segunda pre-centrifugación a una velocidad angular de 3000 revoluciones por minuto, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, con objeto de eliminar los residuos celulares.

Los sobrenadantes SEP y no-SEP, se descongelaron y se reagruparon separadamente, y se mezclaron (SEP = pool LBSEP y testigo = pool LBTE) antes de la centrifugación (pools de 650 ml). Las tortas de ultracentrifugación de un mismo pool centrifugado después del reparto en los tubos separados de 40 ml, se reagruparon y se mezclaron, también, antes del alicuotado y congelación del extracto a someter a test de ensayo, con el fin de obtener un extracto homogéneo sobre los alícuotos de un mismo origen.

3) Detección de micoplasmas que pueden contener un cultivo

Se utilizó un equipo, a modo de "kit" (Boehringer), basado en la técnica ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay -[Ensayo de inmunosorbentes enlazados a enzimas]-), para la detección de micoplasmas, con el fin de garantizar la ausencia de contaminación micoplásmica en los cultivos.

4) Obtención de un concentrado de sobrenadante de cultivo mediante ultracentrifugación sobre cojín de glicerol

Se procede a transferir los sobrenadantes descongelados y previamente desembarazados de los residuos celulares, al interior de tubos, para la ultracentrifugación. Se procede, entonces, a depositar un cojín de glicerol (PBS - glicerol 30%), de algunos cm, en el fondo del tubo. Después de un tiempo de 2 horas de ultracentrifugación, a 100 000 x g (calculado en la parte media del tubo), a una temperatura de 4°C y desaceleración lenta (30 minutos), se elimina el sobrenadante, se recoge al torta en un tampón de PBS con un 10% de glicerol, se reagrupa con las tortas de los otros tubos del mismo pool de origen y, se procede a alicuotar la totalidad, en 100 \mul. Un alícuoto, sirve para la dosificación de la transcriptasa inversa (RT) y, los otros, se conservan a una temperatura de -80°C. Los alícuotos necesarios, se descongelan, sobre células mononucleadas sanguíneas.

Ejemplo 2 Preparación de células mononucleadas sanguíneas procedentes de once donantes, de los cuales de ha establecido su tipificación HLA DR

Donantes	Tipificación HLA DR

1-		DR2-DR4
2-		DR1-DR1 -> DR1
3-		DR3-DR11 (5)
4-		DR13-DR8
5-		DR13(6)-DR14 -> DR6
6-		DR2-DR2 -> DR2
7-		DR3-DR12 (5)
8-		DR3-DR7
9-		DR3-DR13
10-		DR4-DR5
11-		DR4-DR4 -> DR4

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Las células mononucleadas sanguíneas de 100 ml de sangre, procedentes de los once donantes anteriormente citados, arriba, se separan de los hematíes, sobre gradiente de Ficoll (15 ml de Ficoll/25 ml de sangre), mediante centrifugación, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, a una fuerza de centrifugación de 800 g. Las células, se lavan, a continuación, con medio RPMI 1640, y se vuelven a centrifugar en las mismas condiciones, con otros alícuotos, y se congelan en nitrógeno gaseoso, a una concentración final de 2 x 10^{7} células/ml, en una solución de 90% de suero humano descomplementado y 10% de DMSO.

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Ejemplo 3 Cultivo de células mononucleadas sanguíneas de donantes sanos

Después de descongelación rápida, los linfocitos de donantes sanos (5 x 10^{6} células), se ponen en contacto, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 37°C, con 100 \mul de sobrenadantes de cultivo concentrados (i) de LBSEP o de LBTE ó (ii) de GRE o de los LES.

Después de la puesta en contacto, las células, se resuspenden en medio de cultivo (RPMI, suplementado de un 10% de suero humano AB descomplementado y de gentamicina) y se distribuyen en cúpulas de placas de cultivo, en 24 hoyos, a razón de 2 x 10^{6} células por ml. La viabilidad de las células y su inmunocompetencia, se verifican, introduciendo, en control, una activación mediante un mitógeno clásico (PHA, a 5 \mug/2 x 10^{6} células).

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Ejemplo 4 Análisis del repertorio V\beta de los linfocititos CD3, mediante inmuno-detección

Se procedió a realizar el análisis de los repertorios de los CD3, utilizando un anticuerpo anti-CD3, acoplado al isotiocianato de fluoresceína y 12 anticuerpos anti-V\beta, acoplados a la biotina (Immunotech-Coulter-Beckman). Estos doce anticuerpos, se recopilan en la tabla 1 que se facilita abajo, a continuación.

TABLA 1

1

Después de 24 horas de cultivo, el contenido de las cúpulas, se cultivó, respectivamente, en presencia de LBSEP, LBTE y PHA, ó GRE, LES, y PHA, y se recolectó. El sobrenadante, se convierte en alícuotos, y se conserva a una temperatura de -80°C, para la detección ulterior de las citocinas. Las células, se lavan en tampón fosfato, se reparten en microtubos, y se incuban con un anticuerpo anti-CD3, marcado con isotiocianato de fluoresceína (0,5 \mug para 5 x 10^{5} células), y con cada cuerpo anti-V\beta biotinilado (1 \mug de anticuerpo, por 2 x 10^{6} células), durante un tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 4°C, simultáneamente. Se procede, a continuación, a lavar las células en un tampón fosfato, y se incuban durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 4°C, con estreptovidina acoplada a la ficoeritrina (\mu1 en 50 \mul de suspensión celular). Al cabo de este tiempo de incubación, las células, se lavan y se resuspenden en 250 \mug de Cell Fix (nombre comercial), antes de analizarse en citofluorimetría. La inmuno-fluorescencia, se mide con la ayuda de un citofluorímetro FACSCALIBUR (nombre comercial), equipado con un logicial CellQUEST II (nombre comercial) (Becton-Dickinson).

Se procede a calcular para cada cultivo y cada anticuerpo, los porcentajes de células que expresan un V\beta particular, entre las células CD3+ totales. Se procede a comparar el tamaño de estas células, en los cultivos activados mediante LBSEP, LBTE, LES y GRE). Un aumento de un porcentaje del 31% de una familia V\beta, en un cultivo LBSP ó GRE, con relación a los testigos negativos, se considera como un aumento significativo.

Ejemplo 5 Protocolo de análisis del repertorio V\beta de los linfocitos T, mediante biología molecular

Se preparan extractos de sobrenadante de cultivo de células procedentes de pacientes afectados de SEP o de testigos no SEP, tal y como se ha descrito en el ejemplo 1, y se preparan células PBL de donantes sanos, tal y como se ha descrito en el ejemplo 2. Las dos preparaciones, se ponen en cultivo, de la forma que se ha descrito en el ejemplo 3 y, las células T, se recuperan con los PBL de cultivo. El análisis del repertorio V\beta del receptor T presente en la superficie de estas células, se realiza mediante biología molecular, de la forma que se describe abajo, a continuación:

Se procede a extraer los ARN totales de las células linfoides recuperadas, utilizando técnicas convencionales de extracción, bien conocidas por parte de la persona experta en el arte especializado de la técnica. Se realiza una transcripción inversa; se sintetizan, de este modo, los ADN complementarios (por ejemplo, utilizando el equipo a modo de "kit", RT-Expand, Roche). A continuación, se realiza una amplificación específica de una familia de transcritos V\beta (TCRBV), eligiendo cebadores específicos descritos en la literatura). (Lue C et al., Am J Clin Pathol 1999 111: 683; Akatsuka Y et al., Tissue Antigens 1999 53: 122; Ryan DK et al., Mol Pathol 1997 50: 77; Lang R et al., J Immunol Methods 1997, 203: 181; Dreitz MJ et al. Vet Immunol Immunopathol 1999 69: 113; Mima T et al., Biochem Biophys Res Commun 1999 263: 172; Aifantis I et al., Immunity 1998 9: 649; Deng X et al., J. Biol Chem 1998 273: 23709; Lobashevsky A et al., Tansplantation 1996 62: 1332; Hawke NA et al., J Immunol 1996 156: 2458; Lim SH et al, Cancer Immunol Immunother 1996 42: 69). Se procede, a continuación, a realizar extensiones de amplicones, utilizando, por una parte, oligonucleótidos TCR-BC fluorescentes y, por otra parte, oligonucleótidos TCR-BJ fluorescentes (13 J beta). Estos productos de amplicones marcados con fluorescencia, presentan tallas diferentes, debido a las redistribuciones de los genes específicos de cada clon T V\beta "x", y se analizan sobre un gel de electroforesis, y se lee y se cuantifica la fluorescencia asociada a cada banda sobre el gel, con la ayuda de un "Phosfphorlmager"

Se obtienen, de este modo, grafos cuyo perfil traduce la amplificación de una familia de V\beta, presente en la superficie de las células T (figura 3). Cuando la activación de las células T es de tipo policlonal, se observan varios picos, sobre el mismo grafo, traduciendo la presencia de numerosas moléculas de la familia V\beta, en la superficie de las células T.

Ejemplo 6 Detección de las citocinas producidas

Se procedió a medir las citocinas inflamatorias (IL-6, TNF-\alpha e INF-\gamma), con la ayuda de equipos, a modo de "kit", ELISA, de inmunocaptura Optalia (nombre comercial), de la firma Pharmingen-Becton-Dickinson, sobre placas de titrimetría, de 96 hoyos, según las recomendaciones del fabricante. Se incluye una referencia constituida por una gama de diluciones de citocina recombinante de concentración conocida (en pg/ml), sobre cada placa de ensayo. La densidad óptica, se mide mediante espectrofotómetro, a la longitud de onda de 405 nm, para la lectura del cromógeno ABTS (Boehringer Mannheim). La búsqueda de citocinas, se efectúa en 50 \mul de sobrenadantes de cultivo, 24 horas después de la puesta en contacto para 8 donantes, estimulados con LBSEP ó LBTE, y en sobrenadantes de cultivo, 24 horas y 72 horas después de la puesta en contacto para 6 donantes estimulados con LES ó GRE.

Los resultados, se expresan en pg/ml de sobrenadante, correspondientes a la producción de 2 x 10^{6} células.

TABLA 2

2

Ejemplo 7 Estimulación del porcentaje de células en apoptosis

Se procedió a medir el porcentaje de linfocitos entrados en apoptosis, en las poblaciones de PBL puestas en cultivo, durante un transcurso de tiempo de 24 horas, con LBSEP ó LBTE-, para 8 donantes, por una parte, y en las poblaciones puestas en cultivo con LES ó GRE, para 9 donantes, por otra parte.

La apoptosis, se estimó con un citofluorímetro, teniendo en cuenta las características de tamaño y de granulometría existente entre las células vivas y las células en apoptosis, tal y como se describe para los linfocitos Jurkat (Thoulouze et al J. Virol. 17, 7372-7380, 1997).

El porcentaje de apoptosis en los cultivos de linfocitos estimulados con LBSEP, es significativamente superior al obtenido en las células de linfocitos estimuladas por LBTE. (media de porcentaje de apoptosis de 38,35, para LBSEP, contra 28% para LBTE.

Ejemplo 8 Detección de antígenos virales en los cultivos de linfocitos

Se utilizaron dos mezclas de anticuerpos, con objeto de detectar la presencia de antígenos virales en los linfocitos humanos cultivados en presencia de extractos de SC de plexos coroideos LES y GRE, en las mismas condiciones que para el análisis de expresión de las familias TCR (receptor de las células T) V\beta.

Se procedió a realizar (i) un primer pool (pool 1) de anticuerpos policlonales obtenidos con el conejo, con 1 \mul de cada uno de los tres anticuerpos policlonales, y (ii) un segundo pool (pool 2) de anticuerpos monoclonales obtenidos después de inmunización de ratones, con 1 \mul de cada uno de los tres anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos policlonales y monoclonales, se dirigen contra las proteínas codificadas para las secuencias env, gag y pol de MSRV-1, descritas en los documentos de solicitud de patentes internacionales WO-A-98/23755 y WO-A-99/02 666.

Se procede a poner en contacto linfocitos humanos procedentes de donantes sanos (10^{6} células de coloración) durante un transcurso de tiempo de 24 horas, con sobrenadantes ultracentrifugados de células de plexos coroideos LES ó GRE. Los linfocitos, se lavan, a continuación, en medio RPMI. La torta celular, se recoge en 500 \mul de tampón de fijación (tampón fosfato 3% de paraformaldehído), y se incuba durante un transcurso de tiempo de 20 minutos, a una temperatura de 4°C. Después de dos lavados con tampón de permeabilización (tampón fosfato que contiene un 1% de suero bovino fetal, 0,1% de azida sódica, 0,1% de saponina), las células fijadas, se incuban durante un tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 4°C. con 3 \mul de cada uno de los pools anti-MSRV-1, en un volumen final de 50 \mul de tampón de permeabilización. Después de un lavado en tampón de permeabilización, las células incubadas con los anticuerpos anti-MSRV del pool 1, se incuban durante un tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 4°C, con anticuerpos biotinilidos, dirigidos contra las inmunoglobulinas del conejo (Strep-FITC 1/50®, Immunotech Coulter-Beckman). Las células incubadas con los anticuerpos anti-MSRV-1 del pool 2, se incuban con anticuerpos acoplados a la biotina, dirigidos contra los antígenos de ratones (Amersham, 1/500), a continuación, después de lavado, con la Strep-FITC. Las células resuspendidas en 250 \mul de Cell-fix, se analizan, a continuación, mediante citofluorimetría.

Ejemplo 9 Análisis de los repertorios V\beta de los linfocitos CD3

Se procedió a realizar el análisis de los repertorios de ocho donantes, mediante doble marcaje, sobre células puestas en contacto, durante un tiempo de 24 horas, bien ya sea con LBSEP, o bien ya sea con LBTE. Estos mismos donantes, se sometieron a test de ensayo, en presencia de LES y GRE.

El porcentaje de células que expresan un V\beta particular, entre los linfocitos CD3, en los cultivos de linfocitos estimulados por LBSEP, se compara al obtenido en las células estimuladas mediante LBTE. Los repertorios V\beta utilizados por dos donantes (donante 1 y donante 5), en reacción a LBSEP (histogramas oscuros), y a LBTE (histogramas claros), se encuentran representados en las figuras 1 (donante 1) y 2 (donante 5). Para el donante 1, los porcentajes de V\beta utilizados para responder a LBSEP, son idénticos a los utilizados para responder a LBTE, con la excepción de V\beta7. Por el contrario, para el donante 5, el porcentaje de V\beta3 y de V\beta16 recopilados por LBSEP, es diferente de los recopilados por LBTE (respectivamente, 8,2 y 13,6, para V\beta3 y 2,1 y 4,1 para V\beta 16).

Un aumento de un 31% de una familia de V\beta con respecto al porcentaje obtenido en los cultivos de linfocitos LBTE, se considera como la falta de una expresión significativa de una familia de V\beta particular, mediante LBSEP.

El análisis comparativo, que utiliza este criterio, se presenta en la tabla 3, la cual se facilita abajo, a continuación.

TABLA 3

3

Después de un contacto con los LBSEP, se observa el hecho de que:

75% (6/8) de los donantes, presentan una expresión de la familia V\beta 16,

37,5% (3/8) de los donantes, presentan una expresión de la familia V\beta 12,

37,5% (3/8) de los donantes, presentan una expresión de la familia V\beta 3, y

12,5% (1/8) de los donantes, presentan una expresión de las familias V\beta 2, 7, 8, 14, 17, ó 22.

Los resultados obtenidos con las preparaciones LES y GRE, pueden ilustrarse mediante los análisis de los repertorios obtenidos con los donantes 10 y 11. GRE, induce la expansión de V\beta 16. Las expansiones obtenidas con GRE, son del mismo orden y de la misma naturaleza que las obtenidas con LBSEP.

La expansión V\beta 16, no se encuentra ligada a la presencia de un DR particular, puesto que, ésta, puede obtenerse, de la misma forma, en un entorno medioambiental DR3, como en un entorno medioambiental DR4, DR5, DR8, DR13 ó DR14, es decir, con un número de 6 a 8 haplotipos expresados por los 6 donantes.

LBSEP, no induce, generalmente, en los donantes de expansión mayoritaria, más que una de las familias V\beta, excepto en dos casos: que un donante presente, a la vez, una expansión de los V\beta 3, 12, 14, 16 y 22, y que otro presente, a la vez, los V\beta 12 y V\beta 16. Los haplotipos de estos dos donantes, son DR4/4 y FR4/5, respectivamente.

Ejemplo 10 Análisis del repertorio V\beta de los linfocitos T, mediante biología molecular

La experimentación, se realizó de la misma forma como la que se ha descrito en el ejemplo 5. Se procede a recuperar células PBL de donantes sanos diferentes (donante 7, 14, 19 y 18), y éstas, se ponen en contacto con tortas centrifugadas de sobrenadantes de células B procedentes de pacientes SEP o de individuos sanos. Se realizan amplificaciones del determinante V\beta16 ó V\beta17, (véase la figura 4a y 4B).

Amplificación del determinante V\beta16

A:: Donante sano y células B de testigos sanos

B:: Donante sano 7 y células B de pacientes SEP

C:: Donante sano 14 y células B de pacientes SEP

D:: Donante sano 14 y medio de cultivo

E:: Donante sano 19 y células B de pacientes SEP

F:: Donante sano 19 y células de individuo sano

G:: Donante sano 19 y medio de cultivo

H:: Donante sano 18 y células B de paciente SEP

I:: Donante sano 18 y células de individuo sano

J:: Donante sano 18 y células B de individuo sano

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Amplificación del determinante Vb17

A:: Donante sano 17 y células B de paciente SEP

B:: Donante sano 17 y células B de individuo sano

C:: Donante sano 17 y medio de cultivo

Los gráficos, nos muestran que tenemos un perfil diferente de la misma familia de V\beta16, véase, V\beta17, amplificada después de la incubación con las células B de pacientes SEP o con las células B de individuos sanos, para un mismo donante sano de PBL. Estos perfiles, son policlonales. Esto traduce perfectamente la activación policlonal de las células del donante sano, después de una incubación con tortas concentradas de sobrenadantes de células B de pacientes SEP, diferente de la de las tortas concentradas de sobrenadantes de las células B de individuo sano. Esta activación policlonal, traduce la presencia de uno o de varios superantígeno(s) o "superantigen-like" (semejante a antígeno), en las tortas concentradas de SEP. Este análisis mediante biología molecular, de la expansión de células T de determinante Vb16, a continuación de la incubación en presencia de residuos concentrados de SEP, confirma la observación realizada después de análisis por inmuno-detección, detectando directamente los determinantes V\betas membranarios, mediante dos anticuerpos específicos, tal y como se describe en el ejemplo 9.

Ejemplo 11 Evidenciación de la expansión o de la pérdida de los linfocitos portadores de V\beta asociados a la SEP

Se procede a poner en contacto suspensiones de PBL "Peripherical Blood Lymphocytes", -linfocitos de sangre periférica-, a partir de donantes sanos (donantes 5, 7, 14, 15, 19), con tortas concentradas de sobrenadantes de líneas celulares B (ACX, FEX, BUX), establecidas a partir de extracciones sanguíneas de pacientes SEP, tal y como se ha descrito en el ejemplo 3. De una forma paralela, estas suspensiones, se ponen en contacto con tortas concentradas de sobrenadantes de líneas celulares B (T8, T9), establecidas a partir de extracciones sanguíneas de pacientes sanos. Después de la incubación, el repertorio V\beta de las células CD3, se analiza, mediante inmuno-detección, tal y como se ha descrito en el ejemplo 4. Se observa una proliferación mayor de las células T que presentan el determinante V\beta 16, así como una proliferación de las células T con V\beta 7, 14, 17 (tabla 4); tal y como se ha descrito precedentemente, se evidencia una actividad superantigénica, inducida mediante las tortas concentradas de sobrenadantes de líneas B, procedentes de pacientes SEP. Los porcentajes de proliferación de las células T in vitro, se estima, tal y como se ha descrito precedentemente. De una forma paralela, se muestra claramente el hecho, en este ejemplo, de que puede existir igualmente, con los donantes sanos diferentes, una disminución de sub-poblaciones de células T que porten estos mismos V\beta 16, 7, 14, 17, por parte de otros donantes. Esta disminución, puede reflejar una puesta en anergia o en apoptosis de las células, debido al efecto superantigénico inducido por las tortas concentradas de sobrenadantes celulares, procedentes de pacientes SEP. Se prestará debida nota en cuanto al hecho de que, un 100% de las suspensiones PBL sanas sometidas a test de ensayo, responden a, bien ya sea mediante una expansión celular, o bien ya sea mediante una disminución del número de células T que presentan el determinante V\beta16, a consecuencia de una incubación con las tortas concentradas de sobrenadantes de células B procedentes de pacientes SEP, y que posean una actividad superantigénica.

Los resultados, se presentan en la tabla que se facilita abajo, a continuación.

TABLA 4

4

Ejemplo 6 Estimulación de la producción de citocinas

Los cultivos de linfocitos estimulados por LBSEP, se distinguen mediante producciones significativamente superiores de IL-6 y de INF-\gamma, comparadas a las células estimuladas por LBTE. Los títulos de TNF-\alpha, son por el contrario muy reducidos, y equivalentes, para los dos tipos de cultivos.

Los resultados, que se expresan en pg/ml cultivo, correspondientes a la producción de 2 x 10^{6} células, se presentan en la tabla 5 se facilita abajo, a continuación.

TABLA 5

5

Ejemplo 13 Detección de antígenos víricos, en los cultivos de linfocitos

Se procedió a investigar la presencia de antígenos retrovíricos, con la ayuda de dos pools o comunidades de anticuerpos, dirigidos contra proteínas de MSRV-1. Los resultados de inmunofluorescencia sobre los cultivos inoculados con SC ultracentrifugado de LES ó GRE, obtenidos con los dos pools (pool 2 = monoclonados de ratones, pool 1 = policlonados de conejo), se presentan en la tabla 6, para los donantes 10 y 11. Las cifras, representan los porcentajes de células que presentan intensidades de fluorescencia comprendidas entre los canales (bandas) 100 y 1000.

TABLA 6

6

Los resultados, se presentan como porcentajes de población que expresan una intensidad de fluorescencia comprendida entre los canales (bandas) 100 y 1000.

La expansión, paralela a estos resultados referentes a los antígenos MSRV-1, de un número restringido de familias V\beta, en una mayoría de donantes, en ausencia de restricción HLA, indica el hecho de que la respuesta, se parece a una respuesta del tipo superantígeno. La producción de citocinas del tipo inflamatorio (IL-6, INF-\gamma), conforta la existencia de un entorno medioambiental favorable al reclutamiento linfocitario.

La ausencia de producción de TNF-\alpha, es un argumento a favor de la ausencia de contaminación, mediante superantígenos bacterianos o del LSP.

Ejemplo 14 Producción de anticuerpos monoclonales

La producción de anticuerpos monoclonales mediante ascitis, impone una compatibilidad del sistema H-2, entre el hibridoma y el ratón productor. Ratones hembras Balb/c, de una edad de 6 semanas, se someten a una inyección de 0,5 ml de Pristane (2-6-10-4 ácido tetrametilpentadecano), en su cavidad peritoneal, para la producción de ascitis (Porter et al., 1972). De una semana a 10 días más tarde, se inyectan de 5\cdot10^{6} a 10\cdot10^{6} hibridomas, diluidos en aproximadamente 0,5 ml de tampón estéril NaCl 0,145 M, Na_{2}HPO_{4} 10 mM, KCl 2,7 mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM, a un pH de 7,4, por vía intraperitoneal. La ascitis, aparece de una a dos semanas más tarde. Los líquidos de ascitis, presentes en la cavidad peritoneal, se recogen, a continuación, con una jeringa, después de incisión del peritoneo. El líquido recogido, se centrifuga a 300 g, durante un tiempo de 15 minutos, a la temperatura ambiente, se filtra sobre gasa, para eliminar la grasa y, a continuación, se tampona, utilizando una 1/20ª parte de su volumen, de tris-HCl 1M, a un pH 8,0. Este procedimiento, permite obtener cantidades de anticuerpos 10 veces superiores a las obtenidas mediante cultivo de hibridomas.

Las inmunoglobulinas presentes en el líquido de ascitis, se liberan mediante las sales (sulfato de amonio o sulfato de sodio). El líquido de ascitis, se precipita mediante sulfato amónico al 40%. Después de un tiempo de 20 minutos, en frío, la solución, se centrifuga durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, a 8000 g, a una temperatura de 4°C. El precipitado, se lava y se resuspende en frío, en una solución de sulfato amónico al 40% y, a continuación, se vuelve a centrifugar. El nuevo precipitado, enriquecido con IgG, se pone en solución, en tampón PBS, se dializa durante el transcurso de toda la noche, contra el tampón Tris-HCl 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. De una forma paralela, se procede a lavar, de una forma extensiva, una columna de agarosa-Proteína A (o proteína G)(comercializada en forma de liofilizado, Pierce), con el tampón Tris-HCl 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. La solución, enriquecida en IgG, se deposita sobre la columna y, a continuación, la columna, se lava. Los IgG retenidos por la columna, se eluyen a un pH ácido (glicina 200 mM, pH 2,8). Las fracciones eludías, se neutralizan con un volumen de Tris-Base 1M, pH 10,5. Se procede a cuantificar el contenido en inmunoglobulinas de cada fracción recogida, mediante lectura de absorbancia, a 280 nm(e 1%, 1 cm = 14,0 Prahl y Porter, 1968). Las fracciones líquidas se asocian. El grado de purificación de los IgGs sometidos a asociación, se analiza mediante electroforesis en gel de acrilamida, en presencia de SDS. Los igGs purificados, se dializan durante el transcurso de una noche, contra el tampón Tris-HCl 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, se filtran de una forma estéril, se convierten en alícuotos, y se conservan a una temperatura de -20°C. Su concentración final, se determina mediante lectura de la absorbancia, a 280 nm, o mediante dosificación BCA.

Pero, se encuentra al alcance de la persona experta en el arte especializado de la técnica, el definir otros protocolos para la producción de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, a partir de técnicas descritas por parte de Köhler et Milstein, y por Galfre G. et al., precedentemente citadas, o mediante técnicas derivadas de éstas.

Ejemplo 15 Medición de la actividad de las células T, mediante proliferación celular (Sredni et al., 1981)

Las células T, se lavan dos veces, en medio de cultivo, para eliminar cualquier traza de IL2, presente en el medio inicial de cultivo. Los linfocitos B (EBV-LCL) o monocitos/macrófagos, tomados como células presentadoras del antígeno, se irradian, a 10000 rads, se lavan dos veces con medio de cultivo (RPMI). Se procede a incubar 2\cdot10^{4} células T/2\cdot10^{5} células/ml) y 2\cdot10^{4} células B autólogas irradiadas (2\cdot10^{5} células/ml), conjuntamente, en presencia de una gama de concentración creciente del antígeno, en un volumen final de 200 \mul, en micro-hoyos. Después de 48 horas de cultivo, a una temperatura de 37°C, se añade 1 \muCi de 3H-timidina en 50 \mul de medio RPMI, en cada hoyo. Las células T, solas, a dividirse, incorporan la timidina medida por titrimetría, en el ADN. Después de 18 horas de cultivo, las células de cada micro-hoyo, se recolectan, sobre pastillas de lana de vidrio, mediante aspiración. Después de lisis osmótica de las células, la radioactividad incorporada en el ADN, se absorbe sobre las pastillas (cell Harvester 530, Inotech). Cada pastilla, una vez secada, se emplaza en un tubo de plástico, el cual contiene 2 ml de centelleante; la radioactividad b absorbida sobre cada una de las pastillas, se cuantifica en un contador beta, de centelleo líquido (LKB Rackbeta 1217). Los resultados, se expresan como media aritmética de cpm/cultivo (disparos por minuto).

Ejemplo 16 Protocolo de detección de la asociación entre péptidos y moléculas de histocompatibilidad (estudio de las APC transformadas mediante un péptido que se fija a las moléculas del CMHI ó CMHII) 1) Material (ejemplo para la molécula de CMHII)

Las fuentes de moléculas de histocompatibilidad, son actualmente de dos tipos principales: las células mutantes y las moléculas de histocompatibilidad purificadas.

La célula mutante utilizada, es la célula humana T2, la cual es una variante de la línea T1 producida mediante fusión del linfocito T CEM y del linfoma B 721.174 (Salter y Cresswall Embo J 1986, 5: 943-949). Esta célula, la cual se encuentra desprovista de transportadores de péptidos, contiene cadenas pesadas de moléculas de clase I, libres de péptidos, que podrán aceptar péptidos exógenos.

Pueden igualmente utilizarse moléculas de histocompatibilidad de clase I, purificadas mediante cromatografía de afinidad, a partir de células B humanas, transformadas mediante el EBV. En este caso, los péptidos endógenos, deben eliminarse mediante un tratamiento con urea 1,5 M y sosa 12,5 mM (ph 11,7), durante un tiempo de 1 hora, a una temperatura de 4°C, seguido de su eliminación mediante una columna de desalado (PDLO, Pharmacia). Las moléculas de histocompatibilidad, se ponen inmediatamente en presencia de los péptidos a someter a test de ensayo, en un tampón PBS, con 0,05 Tween 20,2 mM EDTA, 0,1% NP40 y 6 mM CHAPS, en presencia de 2 \mu20,2 mM EDTA, 0,1% NP40 y 6 mM CHAPS, en presencia de 2 \mug/ml B2m, para facilitar la reasociación (Gnjatic et al., Eur J Immunol 1995 25-1638-1642). Los péptidos sometidos a test de ensayo, tienen, en general, de 8 a 10 residuos, a veces 11 ó 12. Éstos se sintetizaron por parte de Néosystems (Strasburg), o por parte de Chiron mimotopos (Victoria, Australia). Éstos se utilizan a concentraciones que varían de 100 \muM a 0,1 nM.

2) Protocolo del ensamblaje (Connan et al., Eur J Immunol 1994, 24: 777; Coullin et al. Eur J Immunol 1995, 25: 728-732).

Alícuotos de 8\cdot10^{5} células, en un volumen de 64 \mul, repartidos en tubos microfuga Eppendorf, se ponen en presencia de un tampón de lisis que contiene 10 mM PBS, pH 7,5 1% NP40, inhibidores de proteasas (1 mM PMSF, 100 \muM yodoacetamida, 2 \mug/ml aprotinina, 10 \muM leupeptina, 10 \muM pepstatina y 10 \mug/ml inhibidor de aprotinina. La lisis, se realiza en presencia de los péptidos a someter a test de ensayo, durante un tiempo de 30 minutos ó 1 hora, a una temperatura de 37°C. Después de la eliminación del material no solubilizado, mediante una centrifugación a 15000 revoluciones por minuto, a una temperatura de 4°C, el sobrenadante, se adiciona con 140 \mul de PBS que contiene 0,05% de Tween 20, 3 mM de azida sódica, 1 mM PMSF y 10 mg/ml de albúmina bovina. Cada muestra, se incuba durante un tiempo de 20 horas, a una temperatura de 4°C, en 2 hoyos de una placa de microtitrimetría del tipo Nunc,Maxisorb, previamente recubiertos con un anticuerpo monoclonal (10 \mug/ml en PBS), que reconoce las moléculas de histocompatibilidad que tengan una conformación o conformaciones conforme(s) para la presentación de péptidos, y que se parezca(n) a la(s) presentada(s) en la superficie de las células. La placa recubierta con anticuerpos, se satura previamente mediante albúmina de suero bovino, a 10 mg/ml, en PBS-Tween, antes de la puesta de la muestra. El segundo anticuerpo, permite la detección del ensamblaje de las moléculas de histocompatibilidad objetivizadas como diana. Éste se acopla, bien ya sea con la biotina (NHS-LC biotin, Pierce), o bien ya sea con la fosfatasa alcalina (P-552, Sigma) y se incuba durante un transcurso de tiempo de una hora, a una temperatura de 37°C. En el caso del empleo de la biotina, se realiza una incubación de un tiempo de 45 minutos, a una temperatura de 20-25°C, con la estreptavidina acoplada con la fosfatasa alcalina (E-2636, Sigma). La actividad de la fosfatasa alcalina, se mide utilizando, como substrato, el 4-metil-umbelilferil-fosfato (M-8883, Sigma), a 100 \muM, en la dietanolamina 50 mM, pH 9,5 con MgCl_{2}, 1 mM. La lectura, se realiza a 340/460 nm, con la ayuda de un citofluorímetro.

3) Estabilidad de los complejos HLA/péptidos

Se procedió a estudiar la estabilidad de los complejos anteriormente citados, arriba, puesto que, ésta, condiciona la buena presentación del antígeno y la inducción de la respuesta T. A dicho efecto, se utilizó, bien ya sea HLA purificado, o bien ya sea el lisado de la célula. Con el HLA purificado, los péptidos endógenos, se eliminaron de la forma que se ha descrito en 2) y, a continuación, se pusieron en presencia del péptido a someter a test de ensayo, en tubo Eppendorf, a una temperatura de 37°C, durante transcursos de tiempos variables, de algunos minutos a varios días. La fase siguiente de incubación, sobre placa de 96 hoyos (tal y como se ha descrito en 2)), con el anticuerpo anti-HLA, se realiza durante un tiempo de una hora, a una temperatura de 37°C. La revelación, se efectúa de una forma clásica. Con el lisado de la célula, todas las incubaciones, se realizan, igualmente, a una temperatura de 37°C, después de añadir todos los inhibidores de proteasas.

Ejemplo 17 La proteína de envoltura MSRV, reproduce la estimulación dominante de la población de linfocitos T, portadores de las cadenas V\betas 16, observadas previamente en la infección mediante la fracción que contiene las partículas víricas

El análisis de la expansión o de la depleción (pérdida) de sub-poblaciones de linfocitos T, ser realizó mediante FACS, sobre células mononucleadas sanguíneas de donantes sanos, globalmente, según los protocolos descritos en los ejemplos 2, 3, 4, 9 y 11.

La tabla 7, muestra los resultados obtenidos con un nuevo lote de virión SEP, producido en cultivos de plexos coroideos de SEP, sometido a test de ensayo, sobre una nueva serie de diferentes donantes sanos. Ésta muestra la reproductividad de la estimulación mayoritaria V\beta16, en la mayor parte de los donantes sanos (Don 12, 15, 16, 19 y 20). La débil reactividad de dos donantes (Don 14 y 18), corresponde a un reducido porcentaje de donantes "no respondedores", regularmente observado, en las series sucesivas. La caída paralela en todos los V\betas, en el donante 13, evoca un problema de viabilidad de sus células, almacenadas en nitrógeno, y descongeladas, para el cultivo. Como consecuencia de ello, a continuación, éste último donante, no se utilizó ya más.

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TABLA 7

7

La modificación realizada a los protocolos descritos en los ejemplos anteriormente nombrados, arriba, consistió en reemplazar la adición de la fracción que contenía los viriones producidos, por cultivos de células SEP mediante proteínas recombinantes producidas a partir de las secuencias retrovíricas MSRV, asociadas a estas mismas fuentes de viriones o mediante el tampón de solubilización solo.

Este análisis, ha permitido ya evidenciar propiedades inmunológicas de la proteína de envoltura del retrovirus MSRV (env MSRV) que reproduce la estimulación mayor de la sub-población linfocitaria T V\beta 16 positiva, y una estimulación menor de las su-población minoritaria T V\beta 17 positiva.

Para realizar este cometido, se obtuvo un plásmido de expresión bacteriano, con el inserto ADN que codifica para el marco de lectura de una proteína env MSRV, según las técnicas de biología molecular bien conocidas por parte de las personas expertas en el arte especializado de la técnica.

La secuencia del inserto, es la referenciada en SEQ ID NO 1.

La secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante, expresada a partir de este plásmido, de la que se encuentra referenciada en la SEQ ID NO 2:

El plásmido de expresión, permitió reproducir la proteína env MERS, en fusión con una terminación "polihistidina" (HIS-Tag), que ha permitido purificarla sobre columna de afinidad, a partir del extracto de bacterias E. coli recombinantes, en las cuales se ha efectuado la expresión de la proteína.

La proteína env recombinante, se purificó y se analizó, mediante electroforesis SDS PAGE, en presencia de marcadores de pesos moleculares. Se recuperaron las fracciones de elución específica de la proteína recombinante producida en la fracción insoluble retenida por el HIS-Tag, sobre columna de afinidad. Se confirmó la correspondencia de la proteína fusionada al HIS-Tag, mediante transferencia de Western blot, con un anticuerpo específico de HIS-Tag, que marcaba la proteína de 60 KD, encontrada sola en la fracción eluída, después de visualización sobre un gel de electroforesis SDS PAGE. La fracción más rica (aproximadamente 0,5 mg/ml), se utilizó para añadirse a las células de donantes sanos, en el test de ensayo inmunológico que representa el objeto de este ejemplo.

Se procedió a incubar las células mononucleadas sanguíneas de tres donantes (12, 15 y 16), paralelamente, durante un transcurso de tiempo de 3 días, en presencia de 10 ng/ml y de 100 ng/ml de la proteína env MSRV recombinante, así como de una dilución equivalente del tampón de solubilización solo.

Después de tres días de incubación, el análisis del repertorio de las V\betas, mostró, según los criterios de análisis ya descritos en los ejemplos precedentes, que los donantes 12 y 16, habían respondido significativamente, mediante una expansión de las V\beta 16 y V\beta 17, a la presencia de la proteína env MSRV.

El donante 16, mostró, además, una expansión V\beta2. No pudo encontrarse una respuesta V\beta orientada, en el donante 15.

TABLA 8

8

Esto indica el hecho de que, la proteína env MSRV, puede ser responsable de la estimulación dominante de las sub-poblaciones V\beta 16, observada con la fracción vírica total que contiene las partículas MSRV-1, utilizada en los ejemplos precedentes, pero también de las co-estimulaciones o estimulaciones alternativas de algunas otras sub-poblaciones (ejemplos V\betas 17 y 2), observadas con una frecuencia menor, sobre el conjunto de los donantes sanos sometidos a test de ensayo, hoy en día.

Estos resultados, indican, también, que las frecuencias MSRV-1 que codifican para la proteína env, son susceptibles de poder ser extraídas entre las secuencias nucleotídicas descritas precedentemente, y que las variantes proteicas env MSRV-1, son susceptibles de poder ser extraídas entre las secuencias descritas anteriormente, dado que, la variabilidad de las secuencias retrovíricas, no excluye la estabilidad de una propiedad biológica particular sobre una mayoría de variantes.

Ejemplo 18 Abolición de la estimulación de tipo superantigénico de las sub-poblaciones de linfocitos T, mediante la adición de medicamentos anti-víricos

El análisis de la expansión o de la depleción de sub-poblaciones de linfocitos T, se efectuó, mediante FACS, sobre células mononucleadas sanguíneas de donantes sanos, según la descripción realizada en los ejemplos 2, 3, 4, 9 y 11.

La modificación realizada sobre el protocolo descrito en los ejemplos anteriormente nombrados, consistió en inocular, en paralelo, en hoyos que contenían las células sanguíneas de un mismo donante sano: 1) una fracción que contenía los viriones producidos por cultivos de células SEP, 2) la misma fracción vírica, en presencia de AZT 12,5 \muM (Sigma), 3) la misma fracción vírica, en presencia de DDI (Sigma) 20 \muM. Estos cultivos, se efectuaron sobre las células de un donante cuyas células mononucleadas sanguíneas, se habían congelado por alícuotos, y en donde, uno o varios alícuotos, habían mostrado un efecto del tipo superantigénico, en presencia de viriones procedentes de cultivos SEP (véase la tabla 7).

Además, se procedió a realizar tests de ensayo de toxicidad con el AZT (Azido Desoxitimidina) sola, y el DDI (DiDesoxilnosina) sola, sobre las mismas células, y no mostraron ninguna mortalidad celular significativa.

El estudio con los medicamentos anti-retrovíricos, ha permitido ya evidenciar la acción inhibidora de este tipo de medicamento, sobre la inducción de una estimulación del tipo superantigénico, mediante una fracción concentrada de sobrenadantes de cultivo de células procedentes de pacientes afectados de SEP, y que contienen partículas retrovíricas asociadas al ARN de MSRV-1. Los resultados correspondientes, se presentan en la tabla 10 que se facilita abajo, a continuación. La línea titulada "medio", corresponde al medio que contiene el virión SEP sin anti-retrovirus, y las líneas tituladas DDI y AZT, hacen referencia a los tests de ensayo efectuados en presencia de estos inhibidores. El análisis con FACS, realizado según los ejemplos precedentes, de sub-poblaciones T, en diferentes medios de cultivo, muestran:

- Una expansión significativa V\beta 16 de los linfocitos incubados en presencia del virión "SEP" solo, que no se había encontrado en presencia de la fracción "testigo virión", procedente de cultivos testigos "no-SEP".

- Una ausencia o una inhibición de expansión V\beta 16, de los linfocitos incubados en presencia del virión "SEP" y del AZT.

- Una ausencia de expansión V\beta 16 de los linfocitos incubados en presencia del virión "SEP" y del DDI.

TABLA 10

9

A la vista de estos resultados, parece ahora que, cualquier medicamento, molécula o procedimiento terapéutico que tenga un efecto inhibidor, bloqueante o modulador sobre la expresión retrovírica, especialmente, infecciosa y/o endó-
gena, puede utilizarse para inhibir el efecto inmunopatológico inducido mediante el agente o los agentes patógeno(s) asociados a la producción de estas partículas retrovíricas. Las características generales de este efecto inmunopatológico, se encuentran descritas en la presente invención.

A la vista estos resultados y de los de los ejemplos 8 y 17, parece ahora que, estos agentes o procedimientos terapéuticos, pueden elegirse entre los compuestos activos sobre la expresión del retrovirus MSRV-1.

SEQ ID NO 1:

10

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SEQ ID NO 2:

11

Referencias biográficas sobre los V\betas

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mientos de la expresión diferencial de MHC, para la selección positiva de familias TCR Vb separadas-. Immunogenetics. Enero de 1999; 49 (1): 1-6.

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<110> BIO MERIEUX

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<120> Procedimiento de detección de una actividad superantigénica en una muestra, y composición terapéutica o farmacéutica.

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<130> SEP21-SAg

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<140>

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<141>

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<150> FR-9903622

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<151> 1999-03-19

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1629

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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12

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<210> 2

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<211> 542

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<212> PTR

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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14

15

16

Claims

1. Procedimiento de detección de la esclerosis en placas, o de una predisposición a desarrollar la esclerosis en placas, en una muestra biológica, caracterizado por el hecho de que se detecta una actividad superantígena inducida por el producto de expresión del gen env de MSRV-1 ó de un fragmento del gen env del MSRV-1, comprendiendo, o consistiendo, el citado gen env de MSRV-1, en la secuencia referenciada en SEQ ID NO: 1, ó por el hecho de que se detecta una actividad superantigénica inducida por el producto de expresión del gen env de una variante de MSRV-1, ó de un fragmento del gen env de la citada variante, presentando, el citado gen env de la citada variante, una homología de por lo menos un 90%, con el gen env de MRSV-1, evidenciando una expresión o una pérdida de linfocitos elegidos entre los linfocitos portadores de un determinante V\beta16 y/o V\beta17, y los linfocitos portadores de un determinante V\beta17, siendo, la citada expansión o la citada pérdida, de por lo menos un 31%.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que se procede a evidenciar una expansión de linfocitos portadores de un determinante V\beta 16.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que se procede a evidenciar una pérdida de linfocitos portadores de un determinante V\beta 16.

4. Procedimiento, según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que se procede a evidenciar una expansión de linfocitos portadores de un determinante V\beta 16 y de una co-expansión de linfocitos portadores de V\betas, elegidos de entre por lo menos uno cualquiera de los V\betas 2, 3, 7, 8, 12, 14, 17 y 22 y, de una forma preferente, los V\betas 3 y 12.

5. Procedimiento, según la reivindicación 3, caracterizado por el hecho de que se procede a evidenciar una pérdida de linfocitos portadores de un determinante V\beta 16 y de una co-expansión de linfocitos portadores de V\betas, elegidos de entre por lo menos uno cualquiera de los V\betas 2, 3, 7, 8, 12, 14, 17 y 22 y, de una forma preferente, de entre por lo menos uno cualquiera de los V\betas 7, 14 y 17 y, de una forma ventajosa de los 7 y 17.

6. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que, la actividad superantigénica, se induce mediante el producto de expresión del gen env de MSRV-1 referenciado en la SEQ ID NO: 1 ó de un fragmento del citado gen de MSRV-1.

7. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que, la actividad superantigénica, se induce mediante la proteína de envoltura de MSRV-2 referenciada en la SEQ ID NO: 2 ó mediante un fragmento del citado gen de MSRV-1.

8. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por el hecho de que, la muestra biológica, se elige entre las células mononucleadas sanguíneas.

9. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por el hecho de que, el producto de expresión del gen env o del fragmento del gen env de MSRV-1, o de la variante de MSRV-1, se obtiene a partir de células infectadas por MSRV-1 ó por la variante de MSRV-1, elegidas entre las células de plexos coroideos o las células leptomeníngeas, las células de líneas celulares establecidas, tales como las células de las líneas celulares PLI-2, depositada en el ECACC, el 22 de julio de 1992, con el número 92072201 y LM7PC, depositada en el ECACC, el 8 de enero de 1993, con el número 93010817, en conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest, o a partir de un vector de expresión que comprende el gen env o un fragmento del gen env de MSRV-1 ó de una variante de MSRV-1, ó por el hecho de que, el producto de expresión del gen env o del fragmento del gen env de MSRV-1 ó de la variante del MSRV-1, es una molécula polipeptídica, elegida entre una proteína o un fragmento de proteína consistente en, o comprendiendo, la SEQ ID NO: 2.

10. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada por el hecho de que:

(ii) se pone en contacto el citado sobrenadante de cultivo o una parte del sobrenadante de cultivo, con una serie de cultivos, de una forma preferente, por lo menos tres, de células mononucleadas sanguíneas procedentes de donantes sanos, y

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11. Procedimiento, según la reivindicación 10, caracterizada por el hecho de que, las células mononucleadas sanguíneas procedentes de pacientes afectados de esclerosis en placas (SEP), se eligen de entre los monocitos y los lin-
focitos B y, las células mononucleadas sanguíneas procedentes de donantes sanos, se eligen de entre los linfocitos T.

12. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada por el hecho de que:

(i) se extraen células mononucleadas sanguíneas, procediendo, las citadas células, de pacientes afectados de esclerosis en placas, o de pacientes sospechosos de tener una predisposición a desarrollar la esclerosis en placas, y de individuos sanos,

(ii) se ponen en contacto las citadas células mononucleadas sanguíneas procedentes de pacientes o de individuos sanos, con sobrenadantes de cultivo o una fracción de sobrenadante de cultivo de células elegidas de entre las células mononucleadas sanguíneas, las células de plexos coroideos y las células leptomeníngeas, las células procedentes de líneas celulares establecidas, tales como las células de las líneas celulares PLI-2, depositada en el ECACC, el 22 de julio de 1992, con el número 92072201 y LM7PC, depositada en el ECACC, el 8 de enero de 1993, con el número 93010817, en conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest, y

(iii) se detecta la citada expansión y, eventualmente, co-expansión o la citada pérdida y eventualmente, co-disminución, a partir de las células mononucleadas sanguíneas de la etapa (i).

13. Procedimiento, según las reivindicaciones 10, 11 y 12, caracterizado por el hecho de que, la citada expansión y, eventualmente, co-expansión, se evidencia mediante la utilización de ligandos, siendo cada ligando, específico de un determinante elegido entre los V\betas 16, 2, 3, 7, 8, 12, 14, 17 y 22 y, de una forma preferente, de los V\betas 16, 3 y 12, y por el hecho de que, la citada pérdida y, eventualmente, co-disminución, se evidencia mediante la utilización de ligandos, siendo cada ligando, específico de un determinante elegido entre los V\betas 16, 2, 3, 7, 8, 12, 14, 17 y 22 y, de una forma preferente, de los V\betas 16, 7, 14 y 17.

14. Procedimiento, según la reivindicación 13, caracterizado por el hecho de que, el ligando, es un anticuerpo, de una forma preferente, un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo.

15. Procedimiento, según la reivindicación 10, 11 y 12, caracterizada por el hecho de que, para evidenciar la citada expansión y, eventualmente, co-expansión, o la citada pérdida y eventualmente co-disminución, se procede a realizar:

(i) una extracción de los ARN totales de las células mononucleadas sanguíneas puestas en presencia de sobrenadante o de una fracción de sobrenadante de cultivo SEP, y en presencia de sobrenadante o de una fracción de sobrenadante de cultivo testigo,

(ii) una transcripción inversa de los citados ARN,

(iii) una amplificación específica de cada familia de V\betas, con la ayuda de un par de cebadores determinados,

(vi) un marcaje mediante todo tipo de marcador apropiado de los productos de amplificación obtenidos,

(v) una electroforesis de los citados productos de amplificación y análisis de los perfiles de electroforesis obtenidos, con la ayuda de un detector apropiado.

16. Procedimiento, según la reivindicación 15, caracterizado por el hecho de que, las células mononucleadas sanguíneas procedentes de pacientes afectados se SEP, se eligen de entre los linfocitos.

17. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado por el hecho de que, se evidencia, además, por lo menos uno de los parámetros siguientes:

una estimulación de la producción de citocinas, tales como la interleucina-6 (IL-6) y el interferón \gamma (INF-\gamma)

una inducción de apoptosis celular.

18. Procedimiento, según la reivindicación 17, caracterizado por el hecho de que se procede a detectar los dos parámetros en asociación.

19. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que:

(i) se extraen células mononucleadas sanguíneas, procediendo, las citadas células, de pacientes afectados de SEP o de pacientes sospechosos de tener un riesgo de desarrollar la SEP, y de individuos sanos,

(ii) se ponen en contacto las citadas células mononucleadas sanguíneas procedentes de los pacientes o de individuos sanos, con un polipéptido o una proteína recombinante, tal y como se identifica en la SEQ ID NO: 2, ó un fragmento del citado polipéptido o de la citada proteína, y

(iii) se detecta la citada expansión y, eventualmente, co-expansión, o la citada pérdida y eventualmente co-disminución, a partir de las células mononucleadas sanguíneas de la etapa (i).

21. Procedimiento, según la reivindicación 20, caracterizado por el hecho de que, el citado polipéptido, o la citada proteína, se codifica por un gen env, tal y como se identifica en la SEQ ID NO: 1.

22. Procedimiento de evaluación de la eficacia de un agente o de una composición, para inhibir, en una muestra biológica, una actividad superantigénica inducida por el virus MSRV-1 ó una variante de MRSV-1, mediante la expresión de su gen env o de un fragmento del citado gen env, comprendiendo, el citado gen env de MSRV-1, la secuencia referenciada en la SEQ ID NO: 1, y presentando, el gen env de la citada variante, una homología de por lo menos un 90%, con el gen env de MSRV-1, caracterizado por el hecho de que

(i) se pone en contacto un sobrenadante de cultivo de células mononucleadas sanguíneas o de células de plexo coroideos o de células leptomeníngeas, procediendo, las citadas células, de pacientes afectados de una enfermedad auto-inmune, o de células de una línea celular establecida, tales como las células de las líneas PLI-2 y LM7PC, con células mononucleadas sanguíneas procedentes de donantes sanos, en presencia del citado agente, o de la citada composición, a dosis predeterminadas, y

(iii) se detecta la inhibición de la citada expansión y, eventualmente, co-expansión, o la inhibición de la citada pérdida y eventualmente, co-disminución, de los linfocitos portadores de por lo menos un determinante elegido entre los V\betas 16, 7 y 17, mediante la utilización de un ligando tal y como se ha descrito en la reivindicación 14 ó de una amplificación asociada a una electroforesis tal y como se ha descrito en la reivindicación 15.

23. Procedimiento, según la reivindicación 22, caracterizado por el hecho de que, las células, proceden de un paciente afectado de esclerosis en placas.

24. Procedimiento, según la reivindicación 22 ó 23, caracterizado por el hecho de que, las células mononucleadas sanguíneas procedentes de pacientes aquejados de SEP, se eligen de entre los linfocitos B y los monocitos.

25. Procedimiento de evaluación de la eficacia profiláctica y/o terapéutica de un agente o de una composición, con respecto a la esclerosis en placas, y/o de una predisposición a la esclerosis en placas, caracterizado por el hecho de que se procede a evidenciar una inhibición de una actividad superantigénica en una muestra biológica, tal y como se describe en las reivindicaciones 22 a 24.

26. Procedimiento, según la reivindicación 25, caracterizado por el hecho de que se procede a evidenciar la inhibición de la pérdida mayoritaria de linfocitos portadores de un determinante V\beta 16, y de la co-disminución de linfocitos portadores de V\betas 7 y 17.

27. Procedimiento, según la reivindicación 25, caracterizado por el hecho de que se procede a evidenciar la inhibición de la expansión mayoritaria de linfocitos portadores de un determinante V\beta 16, y de la co-expansión de linfocitos portadores de V\betas 3 y 12.

28. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, caracterizado por el hecho de que, las células, proceden de un paciente afectado de esclerosis en placas.

29. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, caracterizado por el hecho de que, las células mononucleadas sanguíneas procedentes de pacientes afectados de SEP, se eligen de entre los linfocitos B y los monocitos.

30. Procedimiento para identificar substancias capaces de bloquear la transcripción y/o la transducción del retrovirus humano MSRV-1 ó de una variante de MSRV-1, que induce una actividad superantigénica en la esclerosis en placas, mediante la expresión de su gen env o de un fragmento del citado gen env, comprendiendo, el citado gen env de MSRV-1, la secuencia referenciada en la SEQ ID NO: 1, y presentando, el gen env de la citada variante, una homología de por lo menos un 90%, con el gen env de MSRV-1, procedimiento éste, según el cual,

se pone en contacto la substancia, con células que expresan un polipéptido retrovírico identificado en la SEQ ID NO: 2, ó un fragmento del citado polipéptido, y que tiene una actividad superantigénica, y

se detecta una pérdida o disminución de la actividad superantigénica, tal y como se ha descrito en las reivindicaciones 1 a 5.

31. Equipo, a modo de "kit", para el cribado de substancias capaces de bloquear la actividad superantigénica del MSRV-1 ó una variante de MSRV-1, que induce la citada actividad, mediante la expresión de su gen env o de un fragmento del citado gen env, comprendiendo, el citado gen env de MSRV-1, la secuencia referenciada en la SEQ ID NO: 1, y presentando, el gen env de la citada variante, una homología de por lo menos un 90%, con el gen env de MSRV-1, con respecto a la esclerosis en placas, o capaz de bloquear la transcripción y/o la traducción del citado retrovirus, comprendiendo, el citado equipo a modo de "kit":

células que expresan, en su superficie, productos del MHC de clase II, transformados con, y que expresan funcionalmente, un superantígeno retrovírico que comprende por lo menos el fragmento referenciado en la SEQ ID NO: 2,

células portadoras de cadenas del receptor de un V\beta o de V\betas, estimuladas por el superantígeno retrovírico, eligiéndose, las citadas células, de entre los linfocitos portadores de un determinante V\beta16 y/ó V\beta17 y los linfocitos portadores de un determinante V\beta17, y

medios para detectar una pérdida o disminución de la actividad superantigénica tal y como se ha descrito en las reivindicaciones 1 a 5, eligiéndose, los citados medios, de entre un ligando tal y como se ha descrito en la reivindicación 14, y una amplificación asociada a una electroforesis, tal y como se ha descrito en la reivindicación 15.