ES2273572A1 - Procedimiento de preparacion de particulas de tamaño micro y nanometrico con productos labiles y particulas obtenidas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de preparación de partículas de tamaño micro y nanométrico con productos lábiles y partículas obtenidas. La presente invención está relacionada con la obtención de partículas poliméricas de tamaño micro y nanométrico de una forma controlable y reproducible. Las partículas tienen forma esférica y una distribución de tamaño muy estrecha y homogénea. Más particularmente, la presente invención describe el uso y utilización de un método suave de formación de partículas y su aplicación a la encapsulación de compuestos frágiles de interés biológico, incluyendo desde péptidos y proteínas hasta células y microorganismos.
Description
Procedimiento de preparación de partículas de
tamaño micro y nanométrico con productos lábiles y partículas
obtenidas.
La presente invención está relacionada con la
obtención de partículas poliméricas de tamaño micro y nanométrico
de una forma controlable y reproducible. Las partículas tienen
forma esférica y una distribución de tamaño muy estrecha y
homogénea. Mas particularmente, la presente invención describe el
use y utilización de un método suave de formación de partículas y
su aplicación a la encapsulación de compuestos frágiles de interés
biológico, incluyendo desde péptidos y proteínas hasta células y
microorganismos.
Actualmente, la utilización de micropartículas
se ha extendido de forma considerable en campos como el
farmacéutico, biomédico, cosmético, alimentario, agrícola,
veterinario, textil, químico, etc. Entre otras aplicaciones, las
que demuestran más interés son la posibilidad de usar
micropartículas como método de estabilización y protección de un
producto de su entorno y/o como procedimiento para optimizar la
distribución del compuesto encapsulado hasta el punto de
aplicación/interacción manteniendo su actividad.
La utilización de micropartículas adquiere mayor
importancia cuando los compuestos que se utilizan, como pueden ser
moléculas lábiles, péptidos y proteínas, células, microorganismos,
etc., son inestables o requieren condiciones especificas para
mantener su viabilidad durante todo el proceso de formulación,
distribución, almacenamiento y liberación de los mismos. Por lo
tanto, la inmovilización de compuestos lábiles en el interior de
matrices poliméricas es una metodología cada vez más utilizada en
la investigación medica, farmacéutica, bioingeniería, alimentación,
etc. El tamaño de partícula adquiere además especial relevancia
para que pueda ser factible utilizarlos en alguno de estos campos,
i.e. alimentación, desarrollo de nuevos fármacos, encapsulación
celular, etc.
Los diferentes métodos de microencapsulación
pueden clasificarse en tres grandes grupos: fisicoquímicos,
químicos y mecánicos. El método de microencapsulación lo define el
material de recubrimiento y las propiedades fisicoquímicas del
principio activo, sin embargo, no existe un procedimiento
determinado para un material y un principio activo dados, en
numerosos casos es posible elegir entre varias posibilidades (S.
Gouin, "Microencapsulation: industrial appraisal of existing
technologies", Trends Food. Sci Technol. 2004; V.
R. Sinha, A. Trehan, "Biodegradable microspheres for protein
delivery", J. Control. Rel. 2003, 90,
261-280). En general, los procedimientos más
habituales de encapsulación de compuestos frágiles están basados en
técnicas de emulsificación-gelación iónica del
material encapsulante y/o evaporación del disolvente, y/o
atomización de las mezclas mediante la extrusión de las mismas a
través de un capilar. Sin embargo estos métodos presentan algunos
problemas todavía sin resolver. Entre ellos hay que destacar la
baja viabilidad o actividad final de los compuestos encapsulados
debido a la agresividad de las técnicas utilizadas habitualmente
(Brynjelsen S. et al, US6835396 "Preparation of submicron
sized nanoparticles via dispersion Iyophilization"; Kyekyoon K.
et al, US5344676, "Method and apparatus for producing
nanodrops and nanoparticles and thin film deposits therefrom");
y la imposibilidad de obtener partículas monodispersas de pequeño
tamaño (d \leq 300 \mum), ya que aste viene dado por el
diámetro del capilar de atomización que suele ser especialmente
grande para evitar obturaciones (Pacifico C.J. et al,
W00145835, "Sensitive substance encapsulación";
Pluess-Wenzinge R. et. al, W09944735,
"Method and device for capsuling microbial, plant and animal cells or biological and chemicas substances").
"Method and device for capsuling microbial, plant and animal cells or biological and chemicas substances").
Por lo tanto, la posibilidad de disponer de
métodos de fabricación que combinen tanto el control del tamaño de
partículas como el tratamiento no agresivo de las moléculas de
naturaleza biológica supondría un gran avance en el desarrollo de la
microencapsulación de compuestos lábiles. Teniendo en cuenta las
características de la tecnología Flow Focusing, se han desarrollado
nuevos procedimientos utilizando dispositivos que se encuentran
descritos en los documentos siguientes y en los que en ellos se
incluyen: WO9743048 ("Liquid atomization process") WO9930833
("Device and method for creating dry particles"), WO9930833
("Device and method for creating aerosols for drug delivery"),
WO03066231 ("Device for the production of capillary jets and
micro- and nanometric particles") US6234402 ("Stabilized
capillary microjet and devices and methods for producing the
same"), P200500205 ("Procedimiento y dispositivo para la
obtención de partículas de tamaño micro y nanométrico").
Previo a la descripción detallada de la
invención hay que aclarar que esta no está limitada a los
componentes específicos ni a los procedimientos particulares que se
describen, ya que estos obviamente pueden variar. En principio, se
entiende que toda la terminología que se emplea aquí se utiliza
para describir los distintos aspectos de la invención y en ningún
caso pretende ser limitante.
La presente invención se refiere a la
utilización de un método de fabricación de partículas que contienen
compuestos lábiles, mediante la utilización de un sistema de
enfocamiento capilar (Flow Focusing), que combina la utilización de
fuerzas hidrodinámicas y una geometría especifica del sistema para
dar lugar a gotas con las propiedades deseadas; y la posterior
solidificación de las gotas para obtener las partículas que son de
tamaño nano y micrométrico, tienen forma esférica y una distribución
de tamaño muy estrecha y reproducible.
El sistema de fabricación de partículas al que
se refiere la presente invención este constituido por un
dispositivo de enfocamiento capilar cuya geometría se muestra en la
Fig. 1. Este dispositivo consta de una cámara que se encuentra
presurizada mediante la entrada constante de un fluido (1) que sale
al exterior por el único orificio de salida que tiene la cámara
(D). En el interior de la cámara se introducen uno o mas fluidos (2)
a través de un punto de alimentación que se encuentra enfrentado al
único orificio de salida que tiene la cámara. La corriente del
fluido que presuriza la cámara rodea al segundo fluido que se
inyecta por D0 y lo impulsa hacia el exterior de la cámara a través
del orificio, generando un microchorro fino de forma
controlada.
La producción de este microchorro capilar se
realiza en condiciones de caudal y presión tales que dicho chorro
se encuentra en el seno de un flujo laminar y cuando se produce la
rotura debido a la inestabilidad capilar distribuciones obtienen
gotas de tamaño controlado y distribución homogénea. Una vez
generadas las gotas, estas son sometidas a un proceso de secado y/o
endurecimiento incluyendo procesos de
difusión-extracción-evaporación del
disolvente, gelificación iónica, evaporación por calor,
enfriamiento, etc, Dicho endurecimiento da lugar a la obtención de
partículas secas con forma esférica y una distribución homogénea
igual a la de las gotas generadas inicial-
mente.
mente.
En un primer procedimiento, un único fluido es
inyectado a través de una única punta de alimentación en el
interior de la cámara presurizada por el fluido enfocante y dirigido
hacia el exterior a través de un orificio alineado con el punto de
alimentación existente en la pared de la cámara. En este caso, se
obtienen gotas iguales que, al ser sometidas al proceso de
solidificación, dan lugar a micro y nanopartículas de composición
homogénea a lo largo de toda la matriz que las componen.
En un segundo procedimiento incluido en esta
invención, el fluido que se inyecta este constituido por fluidos
diferentes que se introducen a través de canales concéntricos. En el
interior de la cámara, estos fluidos se ponen en contacto dando
lugar a un microchorro capilar formado por diferentes capas
concéntricas de fluidos. Este microchorro capilar es presurizado y
dirigido hacia el exterior por el liquido que presuriza la cámara, a
través del orificio que se encuentra enfrentado al punto de
alimentación de los fluidos. Utilizando este segundo procedimiento,
se obtienen gotas estructuradas formadas por capas de naturaleza y
composición diferentes que, al ser sometidas al proceso de
solidificación, dan lugar a cápsulas verdaderas con un núcleo y una
corteza diferenciados.
Es un objeto de la presente invención la
utilización de dispositivos que contengan múltiples puntas de
alimentación de fluidos en el interior de una cámara presurizada, de
forma que se generan múltiples microchorros que salen al exterior a
través de los orificios realizados enfrente de cada punta de
alimentación. Estos microchorros rompen en gotas con las mismas
propiedades, de manera que, tras el proceso de solidificación,
permiten obtener partículas iguales en grandes cantidades en poco
tiempo.
Opcionalmente, se encuentra incluida en esta
invención la posibilidad de aplicar a alguno o varios de los
fluidos perturbaciones externas periódicas y controladas (p.e.
mecánicas, acústicas, etc.), de forma que favorezcan aun mas la
obtención de partículas con una distribución de tamaño
homogénea.
En todos los procedimientos descritos los
fluidos que se describen son líquidos o gases. Cuando se utilizan
dos o mas líquidos simultáneamente, éstos son suficientemente
diferentes entre si de forma que es posible la generación de un
microchorro estable. Generalmente el fluido interno es una
disolución de uno o mas componentes, un sólido licuado, una
suspensión y/o una emulsión de componentes de distinta
naturaleza.
Es un objeto de esta invención proporcionar un
nuevo método de encapsulación de moléculas lábiles, péptidos y
proteínas, DNA, compuestos biológicamente activos, células,
microorganismos, etc., en el que las condiciones de trabajo son muy
suaves y permiten tanto la viabilidad y funcionalidad final del
compuesto encapsulado, como el diseño y control de la estructura
interna de la micropartícula y su tamaño.
Además esta incluido en esta invención, que los
productos lábiles encapsulados puedan encontrarse tanto en el
interior de las micropartículas finales, como estar expuestas hacia
el exterior con posibilidad de interactuar con el medio.
Las principales características ventajosas para
la encapsulación de compuestos frágiles que presenta este
procedimiento, es:
- a)
- Se utilizan condiciones experimentales muy suaves (muy bajas presiones, ausencia de esfuerzos de cortadura, secciones de paso del material a encapsular muy grandes, etc) por lo que los productos encapsulados no sufren modificaciones durante el proceso manteniendo su funcionalidad y/o viabilidad.
- b)
- Es posible reducir el tamaño de partícula (500 nm \leq d \leq 1000 \mum) manteniendo el control sobre su distribución y composición sin utilizar condiciones experimentales agresivas (elevadas presiones) ni fuerzas externas (electrostáticas, ultrasónicas, filtración, etc) que afecten a la viabilidad/funcionalidad de los compuestos lábiles encapsulados.
- c)
- Es un procedimiento de obtención de micropartículas muy versátil: Una vez obtenidas las gotas es posible adecuar el proceso de solidificación según la naturaleza del producto a encapsular y el polímero utilizado, pudiendo adaptar el procedimiento a cualquiera de los requerimientos de los materiales de partida y el producto final.
- d)
- Es posible diseñar y controlar, desde el momento inicial del proceso, tanto la estructura interna de las gotas como la composición de cada una de las fases, lo que permite la distribución de los compuestos de interés en la posición mas adecuada para la aplicación final.
- e)
- Es un sistema de obtención de partículas de forma continua que permite la realización de controles de calidad exhaustivos de cada proceso de producción.
Figura 1: esquema general de los componentes
básicos de un dispositivo de formación de partículas mediante la
inyección de un único fluido según el procedimiento descrito: (1)
Fluido enfocante, (2) fluido enfocado, (3) menisco.
Figura 2: esquema general de los componentes
básicos de un dispositivo de formación de partículas mediante la
inyección de dos fluidos de forma concéntrica: (1) Fluido enfocante,
(2) fluidos enfocados, (3) menisco.
Figura 3a: Fotografía de microscopio de
partículas de alginato con BSA-Flu.
Figura 3b: Fotografía del microscopio de
fluorescencia de partículas de alginato con BSA sin marcar.
Figura 3c: Fotografía del microscopio de
fluorescencia de partículas de alginato con BSA marcada con
fluoresceína.
Figura 4a: Fotografía del microscopio de
fluorescencia de las partículas de alginato.
Figura 4b: Fotografía de microscopio de
partículas de alginato con GFP.
Figura 4c: Fotografía del microscopio de
fluorescencia de partículas de alginato con GFP de la Fig. 4b.
Figura 5a: Fotografía del microscopio de
fluorescencia de partículas de poliestireno.
Figura 5b: Fotografía del microscopio de
fluorescencia de partículas de poliestireno con BSA marcada con
fluoresceína.
Figura 6a-c: Fotografía del
microscopio de fluorescencia de la micropartículas de alginato con
distintas concentraciones de una cepa modificada de E. Coli
productora de GFP: a) 2\cdot10^{8} cfu/gr, b) 8\cdot10^{8}
cfu/gr, c) 1,3\cdot10^{9} cfu/gr.
Figura 7a y 7c: Fotografía del microscopio
confocal de las micropartículas de alginato con distintas
concentraciones de una cepa modificad de la levadura
saccharomyces cerevisiae productora de GFP: a) 2.10^{8}
levadura/gr, c) 4,8.10^{9} levadura/gr.
Figura 7b y 7d: Fotografía del microscopio
óptico de las micropartículas de alginato con distintas
concentraciones de una levadura modificada productora de GFP de la
Fig.7a y de la Fig.7c respectivamente.
En general y salvo que se indique otra cosa,
todos los términos científicos y técnicos que se emplean en este
documento tienen el mismo significado que lo que se entiende
habitualmente cuando se utilizan en entornos relacionados.
Indicamos aquí que los términos en singular
un, una, el, la, y, pueden también indicar plurales a menos
que el contexto indique lo contrario. Así por ejemplo cuando se
escribe "una particula" se incluye un conjunto de
partículas y cuando se refiere a "un compuesto" se
encuentra incluida una combinación de compuestos, etc.
En esta invención los términos esferas,
partículas y cápsulas se utilizan de forma
intercambiable para describir las micro- y
nano-partículas descritas en la patente,
independientemente de si son sólidas, huecas, porosas, con
diferentes capas o multi-capas, etc. Estas
partículas pueden estar constituidas por cualquier material
dependiendo de la aplicación final.
Con la denominación superficie reactiva
nos referimos a la superficie de las partículas susceptible de
entrar en contacto con el medio externo, incluyendo además de la
superficie de la esfera externa la de los poros y canales que se
crean, que, con cualquier composición, contienen una serie de
grupos funcionales susceptibles de reaccionar con cualquier tipo de
molécula que contenga una funcionalidad química adecuada que le
permita formar uno o varios enlaces covalentes entre la partícula y
dicha molécula.
\newpage
En esta invención el término fluido se
utiliza indistintamente para la denominación de gases o líquidos.
En el caso de líquidos se encuentran incluidos líquidos simples,
mezclas, disoluciones, suspensiones, emulsiones, sólidos licuados,
etc.
Con el termino microchorro nos referimos
al filamento capilar que se obtiene del enfocamiento del fluido
interno en el interior de la cámara presurizada y que sale al
exterior a través de un orificio realizado en ella. En este término
se incluyen chorros con un diámetro nano- y micrométrico y de
composición diversa.
El objeto de la presente invención es un
procedimiento para la obtención de partículas con moléculas
lábiles, péptidos y proteínas, células, microorganismos, etc., en su
interior. Este procedimiento este basado en un sistema de
enfocamiento capilar, que combina la utilización de fuerzas
hidrodinámicas y una geometría especifica del sistema, de forma que
se produce la formación de un microchorro capilar en el seno de un
flujo laminar que, por inestabilidad capilar, se rompe en gotas de
tamaño controlado y con una distribución muy estrecha y
reproducible. Tras la solidificación de la gota se obtienen las
partículas que son de tamaño nano y micrométrico, tienen forma
esférica y mantienen la distribución de las gotas iniciales
generadas.
La tecnología básica de la invención consiste en
un sistema de introducción de un primer fluido en el interior de
una cámara presurizada mediante un segundo fluido de forma que se
genere un chorro estable del primer fluido, que es el que rompe en
gotas homogéneas. El primer fluido puede ser un líquido o un gas y
el segundo fluido puede ser un gas o un líquido. Cuando ambos
fluidos son líquidos, éstos deben ser suficientemente diferentes
entre si de forma que permita la generación de un microchorro
estable del primer fluido moviéndose desde el punto de alimentación
en dirección al punto de salida de la cámara presurizada al
exterior.
Es un objeto de la presente invención la
utilización de un dispositivo Flow Focusing de forma que el fluido
inyectado a través del capilar sea un líquido y el fluido que
presuriza la cámara sea un líquido o un gas. Asimismo se encuentra
incluida en esta invención la utilización de un dispositivo Flow
Focusing para la generación de múltiples microchorros capilares, de
forma que el fluido inyectado a través de las múltiples puntas de
alimentación sea un liquido y el fluido que presuriza la cámara sea
un liquido o un gas.
Constituye otro objeto de la presente invención
la utilización de un dispositivo cuyo diseño incluya distintos
puntos de alimentación dispuestos de forma concéntrica entre si, de
tal manera que entre los fluidos inyectados a través de dichos
puntos de alimentación al menos uno sea un líquido, y el fluido que
presuriza la cámara sea un liquido o un gas, generando en ultima
instancia un único microchorro capilar que dará lugar a las
partículas. Se encuentra incluida en la presente invención la
utilización de un dispositivo para la generación de múltiples
microchorros capilares mediante la utilización de múltiples puntas
de alimentación de fluidos, cada una de ellas constituida por dos o
más capilares concéntricos, de tal manera que entre los fluidos
inyectados a través de ellas al menos uno de cada punta de
alimentación sea un liquido, y el fluido que presuriza la cámara sea
un líquido o un gas, generando en última instancia un conjunto de
microchorro capilar que dará lugar a las partículas.
La naturaleza y composición de los fluidos a los
que se refiere la presente invención dependerán de la composición y
estructura de las partículas y la aplicación final para la que se
obtienen dichas partículas. En esta invención el término
fluido se utiliza indistintamente para la denominación de
gases o líquidos. En el caso de líquidos se encuentran incluidos
líquidos simples, mezclas, disoluciones, suspensiones, emulsiones,
sólidos licuados, etc.
Teniendo en cuenta la composición final y
estructura de la partícula debe utilizarse una combinación de
fluidos que: - posea las propiedades necesarias para la generación
de un microchorro capilar estable mediante la utilización de alguno
de los dispositivos de enfocamiento capilar incluidos en esta
patente, y - que genere un microchorro capilar cuya ruptura de
lugar a un sistema estable que permita, tras la solidificación de la
gota, obtener las partículas del tamaño predicho y con una
distribución homogénea del mismo.
Igualmente se encuentra incluida en esta
invención la utilización de un procedimiento de obtención de
partículas en el que el microchorro es generado en el seno de un
fluido en movimiento de tal forma que en el momento en que se
produce la ruptura del microchorro en gotas similares y del tamaño
predicho se obtiene una emulsión. Tras la extracción/evaporación
del disolvente por cualquiera de los métodos conocidos se obtienen
las partículas de tamaño nano- y micrométrico con forma esférica y
una distribución de tamaño muy estrecha y reproducible, según la
predicción de la teoría Flow Focusing. Según la presente invención,
la extracción/evaporación del disolvente tiene lugar de forma que
únicamente se produce una disminución de volumen de la partícula
debido a la eliminación del disolvente. Esta ocurre rápidamente sin
que se produzcan fenómenos de coalescencia de gotas, agregación o
similares por lo que se mantiene la distribución relativa de tamaños
de las gotas y las partículas finales. En algunos casos se obtienen
tamaños de partícula algo superiores a los predichos, ya que se
produce una ralentización y ensanchamiento del michochorro del
fluido enfocado antes de su ruptura como consecuencia de la
deceleración que sufre el chorro externo del fluido enfocante.
Opcionalmente, se encuentra incluida en esta
invención la posibilidad de aplicar a alguno o varios de los
fluidos perturbaciones externas periódicas y controladas (p.e.
mecánicas, acústicas, etc.) de forma que favorezcan aun más la
obtención de partículas con una distribución de tamaño homogénea.
Las perturbaciones deben ser uniformes y controladas y su
frecuencia vendrá determinada por las características del
microchorro generado y el tamaño final de partícula requerido.
Se encuentra incluido en la presente invención
la utilización de cualquiera de los sistemas habituales que
permiten la solidificación de las gotas generadas sin que tenga
lugar la perdida de las características iniciales de las gotas, y
sin que haya procesos de coalescencia, aglomeración, etc. que
modifiquen la morfología y distribución de tamaños de las
partículas. Entre estos sistemas de solidificación de las gotas se
incluyen la eliminación de disolvente, gelificación iónica,
gelificación térmica, etc.
Es objeto de la presente invención que en el
caso en el que tiene lugar la generación de una emulsión, el
dispositivo de formación de las gotas se encuentre sumergido en el
interior de un fluido que constituirá la fase externa de la
emulsión de forma que las gotas no sufren ningún proceso de
deformación durante la formación de la emulsión. Este fluido es un
liquido que puede ser de naturaleza acuosa u orgánica, con
propiedades suficientemente diferentes al fluido o fluidos
constituyentes de las gotas como para que tenga lugar la formación
de una emulsión de tamaño de gota igual al generado por la ruptura
del chorro capilar. Además, el fluido en el que se encuentra
sumergido el dispositivo puede contener en disolución sustancias
que favorezcan la formación y mantenimiento de la uniformidad y
homogeneidad de la emulsión durante el proceso de solidificación de
la gota para la obtención de la partícula (surfactantes,
emulsificantes, tensioactivos, etc). Adicionalmente, el fluido en
el que se genera la emulsión está en movimiento.
Se encuentra incluido en esta invención un
procedimiento mediante el cual se obtienen emulsiones de
características muy diferentes según la naturaleza de los fluidos
que se utilicen (p.e. w/o, o/w, o/o, w/o/w, w/o/o, etc.).
Preferentemente las partículas finales que se
obtengan deben tener diámetros entre 0,01 y 1000 \mum, más
preferiblemente entre 0,01-200 \mum y más
preferiblemente entre 0,01-80 \mum. Las
partículas finales obtenidas deben ser iguales en tamaño con una
desviación estándar relativa del 10 al 30%, más preferiblemente del
3 al 10% y más preferiblemente del 3% o menor.
Las partículas pueden fabricarse de distintos
materiales, incluyendo pero no limitado a polímeros, sílica, metal,
cerámica, etc. Preferentemente se encuentran incluidos en esta
invención los materiales poliméricos. Los polímeros pueden ser
sintéticos o naturales, solubles en agua o en disolventes
orgánicos. Son objeto de la presente invención fluidos que
contienen materiales poliméricos entre los que se pueden incluir sin
limitar la presente invención: polialcoholes, poliacetales,
poliéteres, poliésteres (como el ácido poliláctico, ácido
poliglicólico, poli(caprolactona) y similares y sus
copolímeros), poliortoésteres, polianhídridos (como el ácido
polisebácico, ácido polifumárico, poli(carboxifenoxi
propano), poli(carboxifenoxi hexano) y similares y sus
copolímeros), polialdehidos, policetonas, policarbonatos,
poli(iminocarbonatos), poliamidas, poliimidas, poliacrilatos
y sus derivados y copolímeros, poli(cianoacrilatos),
poliuretanos, poliestirenos, policloruros, polifluoruros, derivados
polivinílicos, poliolefinas, polifosfatos,
poli(organofosfazenos),
poli(anhídridos-co-imidas),
polisacáridos y derivados de carbohidratos,
poli(aminoácidos), polímeros derivados de macromoléculas, y
todos los derivados de los anteriores y sus copolímeros.
Constituye un objeto de esta invención que los
materiales poliméricos que se utilizan en la formación de
partículas presenten grupos funcionales reactivos susceptibles de
reaccionar con cualquier tipo de molécula que contenga una
funcionalidad química adecuada que le permita formar uno o varios
enlaces covalentes entre la partícula y dicha molécula.
Preferentemente constituye un objeto de esta invención que dichos
grupos reactivos se encuentren en la superficie de la partícula
dirigidos hacia el exterior de la misma. Este contenido en esta
invención que entre las moléculas que se unen a la superficie están
incluidas, sin que se consideren limitantes, moléculas de interés
biológico, preferentemente péptidos, oligonucleótidos, ácidos
nucleicos, PNAs, LNAs, proteínas, glicoproteínas, lípidos,
fosfolípidos, carbohidratos, oligosacáridos y mezclas de los
mismos.
Asimismo esta incluido en esta invención un
método de obtención de partículas en el que el fluido que confomará
la matriz de la partícula puede llevar unido covalentemente
moléculas de interés biológico que quedaran expuestas hacia la
superficie de las partículas.
Además de los componentes principales que
constituirán la matriz o matrices (en el caso de las cápsulas
multicapa) de la partícula, los fluidos van a estar compuestos de
otras compuestos y sustancias lábiles que necesiten ser protegidos
durante todos o alguno de los siguientes pasos: formulación,
distribución, almacenamiento y/o liberación de los mismos. Entre
estas sustancias se incluyen sin pretensión de limitarlas: fármacos
y compuestos con actividad terapéutica y/o profiláctica, moléculas
y compuestos inestables, péptidos y proteínas, microorganismos,
células, biomoléculas, etc., de forma individual o como mezcla de
varios.
Además constituye un objeto de la presente
invención que las partículas que contienen material lábil en su
interior posean en su superficie grupos funcionales reactivos
capaces de formar enlaces covalentes entre la partícula y otras
moléculas. Adicionalmente, la presente invención tiene como un
procedimiento preferente aquel mediante el cual se lleva a cabo la
generación de la partícula con la superficie reactiva y la
encapsulación del material frágil en un único paso, utilizando
alguno de los dispositivos descritos e incluidos en la presente
invención.
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento
de encapsulación de BSA marcada con fluoresceína.
(BSA-Flu) en micropartículas de alginato de 11
micras utilizando la tecnología Flow Focusing en configuración
liquido-gas. La formación de las partículas se lleva
a cabo mediante la utilización de un dispositivo de enfocamiento
capilar (D = 350 \mum) con un punto de alimentación simple
(D_{0} = 200 \mum; H = 125 \mum). El dispositivo de
enfocamiento capilar se encuentra integrado en un
spray-dryer LabPlant SD-Basic. A
través de la punta de alimentación se inyecta una disolución acuosa
de BSA-Flu (0.17% w/v) en alginato sódico (Sigma)
al 1,7% w/v con un caudal de 10 mL/h. La cámara este presurizada a
300 mbar mediante la entrada de una corriente continua de gas. Las
gotas se secan en el spray dryer a una temperatura de 87ºC,
recogiéndose secas al final del proceso.
El análisis de las micropartículas se llevó a
cabo utilizando un microscopio óptico (Leica DM LS) y un programa
de tratamiento de imágenes (d_{medio}) 10,75 \mum, DS 0,71) y un
microscopio de fluorescencia (Leica DMR), (Fig. 3a, 3c).
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento
de encapsulación de proteína verde fluorescente (GFP) en
micropartículas de alginato de 11 micras utilizando la tecnología
Flow Focusing en configuración líquido-gas. Se
utiliza el mismo dispositivo de enfocamiento capilar que en el
ejemplo 1. Se prepara una disolución acuosa de GFP (0,04% w/v)) en
alginato sódico al 1,7% w/v y se lleva a cabo el mismo procedimiento
de obtención de las micropartículas que el descrito en el ejemplo
1.
El análisis de las micropartículas se llevó a
cabo utilizando el microscopio óptico y un programa de tratamiento
de imágenes (d_{medio} 11.16 \mum, DS 1,36) y el microscopio de
fluorescencia (Fig. 4b, Fig. 4c).
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento
de encapsulación de BSA marcada con fluoresceína. en
micropartículas de poliestireno de 13 micras utilizando la
tecnología Flow Focusing en configuración
líquido-líquido. La formación de la emulsión se
lleva a cabo mediante la utilización de un dispositivo de
enfocamiento capilar (D = 100 \mum) con un punto de alimentación
simple (D_{0} = H = 150 \mum). El dispositivo de enfocamiento
capilar se encuentra sumergido en una disolución acuosa de PVA al
1% w/v en agitación. Sobre una 2 mL de una disolución de
poliestireno (Aldrich, Mw =4.000-200.000) al 4% w/v
en diclorometano (Aldrich) se añade gota a gota y en constante
agitación 0.140 mL de una disolución al 0.5% w/v de BSA marcada con
Fluoresceína en EtOH (Panreac Quimica). Esta disolución se inyecta
a través de la punta de alimentación con un caudal de 1 mL/h. La
cámara esta presurizada mediante la introducción de un caudal
continuo de agua de 3 mL/min. La emulsión o/w generada se mantiene
en agitación durante 16 h a temperatura ambiente para que tenga
lugar la extracción/evaporación del disolvente. Las partículas
sólidas se centrifugan (Orto Alresa mod. Digicen 20, 4.000 rpm, 10
min), se lavan con agua tres veces, se liofilizan y se guardan a
4ºC.
El análisis de las micropartículas se llevó a
cabo utilizando un microscopio óptico (Leica DM LS) y un programa
de tratamiento de imágenes (d_{medio} 13.27 \mum, DS 4.57) y un
microscopio electrónico de barrido (Eclipsar XL30)
(Fig. 5b).
(Fig. 5b).
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento
de encapsulación de una cepa modificada E. Coli que expresa
GFP en micropartículas de alginato de 11 micras utilizando la
tecnología Flow Focusing en configuración
líquido-gas. Se utiliza el mismo dispositivo de
enfocamiento capilar que en el ejemplo 1. A 15 mL de una disolución
acuosa de alginato sódico al 2% w/v se le añaden distintas
cantidades de una suspensión de E. Coli (4E8 c.f.u/mL) en
NaCl (Sigma, 1% w/v) para obtener suspensiones con distintas
concentraciones de bacteria (Tabla 1). La suspensión se homogeneiza
durante 5 minutos) y se lleva a cabo el mismo procedimiento de
obtención de las micropartículas que el descrito en el ejemplo 1
pero secando las gotas a 99ºC.
El análisis de las micropartículas se llevo a
cabo utilizando un microscopio óptico (Leica DM LS) y un programa
de tratamiento de imágenes (Tabla 1) y un microscopio electrónico de
barrido (Eclipsar XL30) (Figuras 6a-c).
| Concentración de | d_{medio} (\mum) | DS (\mum) |
| E. Coli | ||
| 2\cdot10^{8} cfu/gr | 10,3 | 1,16 |
| 8\cdot10^{8} cfu/gr | 11,15 | 1,48 |
| 1,3\cdot10^{9} cfu/gr | 11,51 | 1,60 |
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento
de encapsulación de una levadura modificada que expresa GFP en
micropartículas de alginato de 12 micras utilizando la tecnología
Flow Focusing en configuración líquido-gas. Se
utiliza el mismo dispositivo de enfocamiento capilar que en el
ejemplo 1. A 10 mL de una disolución acuosa de alginato sódico al
2% w/v se le añaden 2 ml de una suspensión acuosa de levadura con
distintas concentraciones de la misma (Tabla 2). La suspensión se
homogeneiza durante 5 minutos y se lleva a cabo el mismo
procedimiento de obtención de las micropartículas que el descrito
en el ejemplo 1 pero secando las gotas a 87ºC.
El análisis de las micropartículas se llevó a
cabo utilizando un microscopio óptico (Leica DM LS) y un programa
de tratamiento de imágenes (Tabla 2) y un microscopio confocal
(Leica TCS SP2) (Figuras 7a-d).
\vskip1.000000\baselineskip
| Concentración de | d_{medio} (\mum) | DS (\mum) |
| levadura | ||
| 2\cdot10^{8}lev/gr | 11,32 | 1,34 |
| 4,8\cdot10^{9} lev/gr | 12,36 | 1,66 |
Claims (23)
1. Procedimiento de preparación de partículas de
tamaño micro y nanométrico con productos lábiles encapsulados
caracterizado por llevarse a cabo en dos etapas: una primera
de enfocamiento capilar flow focusing de al menos un fluido liquido,
seguida de una etapa de solidificación para convertir las gotas en
partículas.
2. Procedimiento de preparación de partículas de
tamaño micro y nanométrico con productos lábiles encapsulados según
las reivindicaciones 1 caracterizado porque los fluidos
líquidos enfocados pueden ser líquidos simples, mezclas,
disoluciones, suspensiones, emulsiones, sólidos licuados, elegidos
de forma que permitan la generación de un micro chorro estable del
fluido o fluidos enfocados por el fluido enfocante.
3. Procedimiento de preparación de partículas de
tamaño micro y nanométrico con productos lábiles encapsulados según
las reivindicaciones 1-2 caracterizado porque
al menos uno de los fluidos líquidos enfocados que se utilizan debe
contener los compuesto lábiles, que quedan encapsulados en las
partículas que los contienen.
4. Procedimiento de preparación de partículas de
tamaño micro y nanométrico con productos lábiles encapsulados según
las reivindicaciones 1-3 caracterizado porque
al menos uno de los fluidos líquidos enfocados que se utilizan
incluye materiales poliméricos., sílica, metales o cerámicas, que
constituyen la matriz de dichas partículas.
5. Procedimiento de preparación de partículas de
tamaño micro y nanométrico con productos lábiles encapsulados según
la reivindicación 4 caracterizado porque al menos uno de los
fluidos líquidos enfocados es preferentemente una disolución,
mezcla, suspensión y/o emulsión homogénea de un material
polimérico.
6. Procedimiento de preparación de partículas de
tamaño micro y nanométrico con productos Miles encapsulados según
la reivindicación 5 caracterizado porque el material
polimérico. inyectado puede ser sintético o natural, soluble en agua
o en disolventes orgánicos.
7. Procedimiento de preparación de partículas de
tamaño micro y nanométrico con productos lábiles encapsulados según
la reivindicación 6 caracterizado porque el material
polimérico. se selecciona preferentemente de entre los siguientes:
polialcoholes, poliacetales, poliéteres, poliéster es (como el
ácido poliláctico, ácido poliglicólico, poli(caprolactona) y
similares y sus copolímeros), poliortoésteres, polianhídridos (como
el ácido polisemias, ácido polifumárico, poli(carboxifenoxi
propano), poli(carboxifenoxi hexano) y similares y sus
copolímeros), polialdehidos, policetonas, policarbonatos,
poli(iminocarbonatos), poliamidas, poliimidas, poliacrilatos,
poli(cianoacrilatos), poliuretanos, poliestirenos,
policloruros, polifluoruros, derivados polivinícos, poliolefinas,
polifosfatos, poli(organofosfazenos),
poli(anhídridos-co-imidas),
polisacáridos y derivados de carbohidratos,
poli(aminoácidos), y polímeros derivados de
macromoléculas.
8. Procedimiento de preparación de partículas de
tamaño micro y nanométrico con productos lábiles encapsulados según
la reivindicación 7 caracterizado porque los materiales
poliméricos utilizados presentan grupos funcionales reactivos
susceptibles de reaccionar con cualquier tipo de molécula que
contenga una funcionalidad química adecuada que le permita formar
uno o varios enlaces covalentes entre la partícula y dicha
molécula.
9. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados obtenidas mediante un procedimiento
según las reivindicaciones 1-4 caracterizado
porque los productos son lábiles incluidos en la invención tienen
inestabilidad térmica, fotosensibilidad, sensibilidad enzimática,
microbiológica y química.
10. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según la reivindicación 9
caracterizado porque los productos lábiles son moléculas
orgánicas, fármacos y compuestos con actividad terapéutica y/o
profiláctica, péptidos, proteínas y complejos proteicos,
oligonucleótidos, ácidos nucléicos, PNA, LNAs, DNA, RNA, virus y
afines, orgánulos, células, microorganismos y mezclas de los
mismos.
11. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según las reivindicaciones
9-10 caracterizado porque la matriz de dichas
partículas incluye materiales poliméricos., sílica, metales o
cerámicas.
12. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según la reivindicación 11
caracterizado porque la matriz es preferentemente una
disolución, mezcla, suspensión y/o emulsión homogénea de un
material polimérico.
13. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según la reivindicación 12
caracterizado porque el material polimérico puede ser
sintético o natural, soluble en agua o en disolventes
orgánicos.
14. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según la reivindicación 13
caracterizado porque el material polimérico. se selecciona
preferentemente de entre los siguientes: polialcoholes,
poliacetales, poliéteres, poliéster es (como el ácido poliláctico,
ácido poliglicólico, poli(caprolactona) y similares y sus
copolímeros), poliortoésteres, polianhídridos (como el ácido
polisebácico, ácido polifumárico, poli(carboxifenoxi
propano), poli(carboxifenoxi hexano) y similares y sus
copolímeros), polialdehidos, policetonas, policarbonatos,
poli(iminocarbonatos), poliamidas, poliimidas,
poliacrilatos, poli(cianoacrilatos), poliuretanos,
poliestirenos, policloruros, polifluoruros, derivados
polivinílicos, poliolefinas, polifosfatos,
poli(organofosfazenos),
poli(anhídridos-co-imidas),
polisacáridos y derivados de carbohidratos,
poli(aminoácidos), polímeros derivados de macromoléculas, y
todos los derivados de los anteriores y sus copolímeros.
15. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según las reivindicaciones
12-14 caracterizado porque los materiales
poliméricos. utilizados presentan grupos funcionales reactivos
susceptibles de reaccionar con cualquier tipo de molécula que
contenga una funcionalidad química adecuada que le permita formar
uno o varios enlaces covalentes entre la partícula y dicha
molécula.
16. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según la reivindicación 15
caracterizado porque los grupos reactivos de los materiales
utilizados se disponen en la superficie de las partículas dirigidos
hacia el exterior de las mismas.
17. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según la reivindicaciones
11-14 caracterizado porque el material que
conformara la matriz de la partícula puede llevar unido
covalentemente moléculas de interés biológico que quedaran
expuestas hacia la superficie de la partículas, preferentemente
péptidos, oligonucleótidos, ácidos nucléicos, PNAs, LNAs,
proteínas, glicoproteínas, lípidos, fosfolípidos, carbohidratos,
oligosacáridos y mezclas de los mismos.
18. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según la reivindicaciones
9-17 caracterizado porque el diámetro de
dichas partículas está comprendido entre 0,01 y 1000 micras,
preferentemente entre 0,01 y 200 micras y aun más preferentemente
entre 0,01 y 80 micras.
19. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según la reivindicaciones
9-18 caracterizado porque dichas partículas
tiene una distribución de tamaños cuya desviación estándar esta
comprendida entre el 10 y el 30%, preferentemente entre el 3 y el
10% y aun más preferentemente menor del 3%.
20. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según la reivindicaciones
9-19 caracterizado porque las partículas
obtenidas pueden ser sólidas, huecas o porosas.
21. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según la reivindicaciones
9-20 caracterizado porque las partículas
tienen una matriz homogénea.
22. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según la reivindicaciones
9-20 caracterizado porque las partículas
presentan una matriz no homogénea constituida por distintas capas
concéntricas.
23. Partículas de tamaño micro y nanométrico con
productos lábiles encapsulados según la reivindicaciones
9-22 caracterizado porque las partículas
presentan en la superficie grupos funcionales reactivos que pueden
formar enlaces covalentes con moléculas de interés biológico,
preferentemente péptidos, oligonucleótidos, ácidos nucléicos, PNAs,
LNAs, proteínas, glicoproteínas, lípidos, fosfolípidos,
carbohidratos, oligosacáridos y mezclas de los mismos.
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