ES2257968B1 - Procedimiento y dispositivo para la obtencion de particulas de tamaño micro y nanometrico. - Google Patents
Procedimiento y dispositivo para la obtencion de particulas de tamaño micro y nanometrico. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento y dispositivo para la obtención de partículas de tamaño micro y nanométrico. La presente invención está relacionada con la obtención de partículas poliméricas de tamaño micro y nanométrico de una forma controlable y reproducible. Las partículas tienen forma esférica y una distribución de tamaño muy estrecha y homogénea. Más particularmente, la presente invención describe un nuevo método de formación de emulsiones y su aplicación a técnicas de micro y nanoencapsulación mediante extracción/evaporación del disolvente. Especialmente, la presente invención se refiere a la encapsulación de compuestos fluorescentes y su posterior aplicación.
Description
Procedimiento y dispositivo para la obtención de
partículas de tamaño micro y nanométrico.
La presente invención está relacionada con la
obtención de partículas poliméricas de tamaño micro y nanométrico
de una forma controlable y reproducible. Las partículas tienen
forma esférica y una distribución de tamaño muy estrecha y
homogénea. Más particularmente, la presente invención describe un
nuevo método de formación de emulsiones y su aplicación a técnicas
de micro y nanoencapsulación mediante extracción/evaporación del
disolvente. Especialmente, la presente invención se refiere a la
encapsulación de compuestos fluorescentes y su posterior
aplicación.
Actualmente, la utilización de micropartículas
se ha extendido de forma considerable en campos como el
farmacéutico, biomédico, cosmético, alimentario, agrícola,
veterinario, textil, químico, etc. Entre otras aplicaciones, las
que demuestran más interés son la posibilidad de usar
micropartículas como método de estabilización y protección de un
producto de su entorno y/o como procedimiento para optimizar la
distribución del compuesto encapsulado hasta el punto de
aplicación/interacción.
Uno de los campos en los que está adquiriendo
gran importancia la utilización de micropartículas como nuevo
sistema de estudio de las interacciones entre biomoléculas es en
genómica y proteómica. A pesar de los grandes avances que están
teniendo lugar en la fabricación y utilización de microarrays de
diferente naturaleza, los microarrays tradicionales presentan
algunas desventajas que no se han resuelto. Algunos de los problemas
más importantes son la complejidad de los protocolos de preparación
de las muestras que resultan además algo lentos, y el
encarecimiento que supone la tecnología que se utiliza para el
análisis de los resultados. La reproducibilidad de los resultados
obtenidos y su propia fiabilidad son objetivos aún no conseguidos
plenamente con los arrays tradicionales.
En la actualidad la utilización de arrays de
micropartículas fluorescentes con la superficie modificada se está
imponiendo al uso de los microarrays tradicionales en 2D. En
general, las micropartículas permiten realizar múltiples ensayos en
paralelo, son más baratas, fáciles de almacenar incluso en grandes
cantidades y poseen una gran cantidad de superficie útil por unidad
de volumen para la unión de analitos. Además, las microesferas
pueden prepararse de distintos tamaños y composición química, lo
que les confiere una gran versatilidad para utilizarlas en ensayos
biológicos con moléculas de diferente naturaleza.
Otra de las grandes ventajas que presenta el uso
de "arrays" de micropartículas es la posibilidad de utilizar
la citometría de flujo como técnica de detección de las
interacciones moleculares que tengan lugar. La citometría de flujo
es una técnica muy extendida que está experimentando una gran
evolución en los últimos tiempos aumentando considerablemente la
velocidad de detección, sensibilidad, y fiabilidad de los análisis
por lo que se está imponiendo en el análisis de ensayos de muestras
complejas. El desarrollo de instrumentos de análisis cada vez más
sofisticados y con gran sensibilidad, unido a la mejora en las
técnicas de fabricación de micropartículas cada vez más versátiles,
han generado numerosas expectativas de futuro tanto dentro de la
investigación básica como del diagnóstico clínico.
Por otro lado, la utilización de fluoróforos
encapsulados presenta muchas ventajas frente al uso de moléculas
orgánicas o nanocristales fluorescentes independientes. Los
fluoróforos se encuentran en el interior de una matriz que los
protege de los efectos de los disolventes, el pH, la fuerza iónica,
photobleaching, etc, estabilizando la intensidad de la emisión. La
partícula mantiene libre toda la superficie en la que se encuentran
los grupos funcionales necesarios para su conjugación con
proteínas, ácidos nucleicos u otro tipo de biomoléculas, que al
encontrarse en el exterior no afectan a las propiedades
fluorescentes del marcador. Por lo tanto, la utilización de
micropartículas fluorescentes bioconjugadas permite aumentar
significativamente la sensibilidad de la detección eliminando los
problemas de agregación o inactivación debido al exceso de
marcadores fluorescentes.
Existen numerosas técnicas de encapsulación que
pueden variar según el material fluorescente que se pretenda
encapsular. Entre ellas las más utilizadas son: \sqbullet la
absorción/difusión de fluoróforos orgánicos o nanocristales
fluorescentes hacia el interior de la micropartícula a través de la
matriz polimérica (p. ej. Han, M.Y.; Gao, X.; Su, J.Z.; Nie, S.
"Quantum-dot-tagged microbeads for
multiplexed optical coding of biomolecules" Nat
Biotechnol 2001, 19 631-635; US Pat Nº
6680211, Biocrystal Ltd.; US Pat Nº 5723218, Molecular Probes; L.B.
Bangs, Uniform Latex Particles, Seragen Diagnostics Inc,
1984; US Pat Nº 6649414, Luminex Corp. en la que describen
además la unión covalente de nanopartículas fluorescentes obtenidas
por absorción de los fluoróforos, a micropartículas de mayor
tamaño); \sqbullet la incorporación del material fluorescente
durante la formación de la micropartícula en el proceso de
polimerización y/o recubrimiento, etc (p. ej. US Pat Nº 5073498,
Caribbean Microparticles Corp.; WO0113119, Luminex Corp.);
\sqbullet la deposición una a una de capas de polímero sobre el
material fluorescente
(layer-by-layer) (p. ej. Wang, D.;
Rogach, A.; Carusso, F. Semiconductor quantum
dot-labeled microsphere bioconjugates prepared by
stepwise self-assembly. Nano Lett
2002, 2 857-861).
La deposición de capas de polímero sobre el
material fluorescente implica la generación de la partícula
"in situ" y precisa de un gran control sobre cada paso
del proceso para poder obtener partículas del tamaño requerido con
un alto grado de homogeneidad. Se trata de un proceso laborioso que
implica numerosos pasos.
En el caso en el que el material fluorescente se
introduce en el interior de la partícula por difusión, la partícula
ya está generada pero es necesario tener un gran control sobre la
homogeneidad de la disolución de fluoróforos y los tiempos
requeridos para obtener la carga deseada de cada fluoróforo. Una de
las mayores desventajas de este método es la falta de homogeneidad
en la distribución final de los fluoróforos en el interior de la
micropartícula, de forma que la concentración final del material
fluorescente en la superficie es bastante elevada y disminuye de
forma gradual al acercarnos al núcleo. Además, aunque los
fluoróforos se encuentran protegidos por la matriz, en el caso de
las partículas preparadas por difusión, hay un alto porcentaje de
fluoróforos que se encuentran en la superficie (aproximadamente un
30%) y presentan propiedades diferentes a aquellos que se
encuentran embebidos en el interior de la matriz, llegándose a
producir aglomerados y pérdida de fotoluminiscencia de las
micropartículas fina-
les.
les.
Por último, la incorporación del material
fluorescente durante la formación de la micropartícula es un
proceso que, en general, implica el crecimiento de una partícula
inicial mediante la polimerización de un monómero en presencia de
un fluoróforo, por lo que no es una alternativa que mejore las
anteriores.
Teniendo en cuenta todo lo anterior, se hace
necesario la utilización y optimización de nuevos métodos de
encapsulación que den lugar a la obtención de partículas codificadas
de forma sencilla, permitiendo controlar de forma exhaustiva tanto
la estructura y homogeneidad de la partícula, como la distribución
de los materiales fluorescentes utilizados para su
codificación.
La presente invención se refiere a un nuevo
sistema de fabricación de partículas basado en la generación de
emulsiones mediante un sistema de enfocamiento capilar (Flow
Focusing), que combina la utilización de fuerzas hidrodinámicas y
una geometría específica del sistema. Tras la solidificación de las
gotas se obtienen las partículas que son de tamaño nano y
micrométrico, tienen forma esférica y una distribución de tamaño muy
estrecha y reproducible.
El sistema de fabricación de partículas al que
se refiere la presente invención, está constituido por un
dispositivo de enfocamiento capilar que se encuentra sumergido en un
liquido que constituirá la fase externa de la emulsión generada. En
concreto, el dispositivo de enfocamiento capilar consta (Fig 1) de
una cámara que se encuentra presurizada mediante la entrada
constante de un fluido. En el interior de esta cámara se inyecta un
segundo fluido a través de un punto de alimentación que se encuentra
enfrentado a un orificio practicado en la pared de la cámara. La
corriente del fluido que presuriza la cámara rodea al segundo
fluido y lo impulsa hacia el exterior de la cámara a través del
orificio generando un microchorro fino de forma controlada.
El microchorro capilar que se encuentra en el
seno de un flujo laminar, debido a la inestabilidad capilar se
rompe en el interior del líquido en el que se encuentra sumergido el
dispositivo, formando una emulsión homogénea de gotas de tamaño
controlado. Una vez generada la emulsión y, tras la solidificación
de las gotas, se obtienen las partículas secas con forma esférica.
En este procedimiento los dos fluidos que se describen son,
preferentemente, líquidos suficientemente diferentes entre si de
forma que permita la generación de un microchorro estable.
Generalmente el fluido interno es una disolución de uno o más
componentes, un sólido licuado, una suspensión y/o una emulsión de
componentes de distinta naturaleza.
En un primer procedimiento, un único fluido es
inyectado a través de una única punta de alimentación en el
interior de la cámara presurizada por el segundo fluido y dirigido
hacia el exterior a través de un orificio alineado con el punto de
alimentación existente en la pared de la cámara.
En un segundo procedimiento incluido en esta
invención, el fluido que se inyecta está constituido por fluidos
diferentes que se introducen a través de canales concéntricos. En el
interior de la cámara, estos fluidos se ponen en contacto dando
lugar a un microchorro capilar formado por diferentes capas
concéntricas de fluidos. Este microchorro capilar es presurizado y
dirigido hacia el exterior por el líquido que presuriza la cámara, a
través del orificio que se encuentra enfrentado al punto de
alimentación de los fluidos.
Es un objeto de la presente invención la
utilización de múltiples puntas de alimentación de fluidos en el
interior de una cámara presurizada, generando múltiples microchorros
que salen al exterior a través de los orificios realizados enfrente
de cada punta de alimentación. Constituye un objeto de la invención
el dispositivo y los procedimientos para la generación de múltiples
microchorros capilares para la obtención de emulsiones y
posteriormente partículas en grandes cantidades.
Opcionalmente, se encuentra incluida en esta
invención la posibilidad de aplicar a alguno o varios de los
fluidos perturbaciones externas periódicas y controladas (p.e.
mecánicas, acústicas, etc.), de forma que favorezcan aun más la
obtención de partículas con una distribución de tamaño
homogénea.
Es un objeto de esta invención proporcionar un
nuevo método de obtención de partículas secas de tamaño predecible
y controlado con un grado de dispersión muy bajo. Está incluido en
esta invención un proceso de encapsulación de distintas sustancias
en el interior de partículas. Preferentemente se encuentra incluido
en esta invención un proceso de encapsulación de materiales
fluorescentes de forma controlada en un único paso.
Además está incluido en esta invención un método
de obtención de partículas que posean moléculas de interés
biológico expuestas hacia el exterior.
Otro objeto de esta invención es la obtención de
partículas que puedan ser utilizadas como estándares de calibración
(tamaño, fluorescencia, etc.), en la obtención de arrays de
micropartículas, en aplicaciones farmacéuticas y biomédicas
(encapsulación y liberación de fármacos, encapsulación de células y
microorganismos, diagnosis y análisis clínicos), etc.
Las principales características innovadoras y
ventajosas de esta combinación de geometría y efecto hidrodinámico
frente a cualquier otra metodología existente son:
- a)
- Pueden generarse partículas de tamaño mucho más pequeño que cualquier otra dimensión del dispositivo (orificio, punto de alimentación, etc.), cosa que no es posible mediante las otras técnicas de extrusión existentes que imponen el tamaño mediante el orificio de inyección.
- b)
- El tamaño de partícula es controlable y predecible.
- c)
- La distribución de tamaños de las partículas es muy estrecha sin necesidad de recurrir a otros mecanismos más complejos de excitación del chorro ni llevar a cabo un proceso de selección posterior.
- d)
- Es un proceso totalmente reproducible.
- e)
- No existe contacto entre el fluido interno y el orificio de salida, con lo cual se evitan los problemas de los grandes esfuerzos de cortadura asociados a la extrusión directa. Se evitan asimismo los problemas de obturación.
- f)
- La formación de las partículas tiene lugar en el seno de la fase externa de la emulsión generada evitándose los problemas de deformación de la geometría final de la partícula.
- g)
- Permite el uso de una gran combinación de fluidos con distintas propiedades físico- químicas (viscosidad, composición química, etc).
- h)
- La composición final y la estructura de las partículas es totalmente controlable desde el momento inicial del proceso.
- i)
- Es un sistema de obtención de partículas de forma continua que permite la realización de controles de calidad exhaustivos de cada proceso de producción.
Figura 1: esquema general de los componentes
básicos de un dispositivo de formación de partículas mediante la
inyección de un único fluido según el procedimiento descrito.
Figura 2: esquema general de los componentes
básicos de un dispositivo de formación de partículas mediante la
inyección de dos fluidos de forma concéntrica.
Figura 3: gráfico en el que se representan
d_{50} part/d_{0} frente a Q/Q_{0} de algunos experimentos
realizados y su concordancia con la predicción de Flow Focusing.
Figura 4a: Fotografía del microscopio
electrónico de partículas de poliestireno de 5 micras obtenidas
mediante el procedimiento descrito en la presente invención.
Figura 4b: Fotografía del microscopio
electrónico de partículas de poliestireno de 9 micras obtenidas
mediante el procedimiento descrito en la presente invención.
Figura 5a-c: Fotografías del
microscopio de fluorescencia de una mezcla de partículas
fluorescentes de poliestireno de 51 \mum con dos concentraciones
distintas y diferenciables de rodamina obtenidas mediante el
procedimiento descrito en la presente invención. Fig. 5a:
concentraciones de rodamina 0,006 mM y 0,6 mM, Fig. 5b:
concentraciones de rodamina 0,06 mM y 0,6 mM, Fig. 5c:
concentraciones de rodamina 0,006 mM y 0,06 mM.
Figura 6: Fotografía del microscopio de
fluorescencia de una mezcla de partículas fluorescentes de
poliestireno de 5 \mum con concentraciones de fluoresceína (1 mM)
y rodamina B (0,6 mM). Fig. 6a, se utiliza un filtro (L5) en el que
se ven las dos poblaciones de partículas. Fig. 6b, se utiliza un
filtro (N3) en el que solo se ven las partículas que contienen
rodamina B.
Figura 7: Gráfico del análisis por citometría de
flujo de una mezcla de partículas de poliestireno sin fluorescencia,
con rodamina B y con fluoresceína, obtenidas mediante el
procedimiento descrito en la presente invención.
Previo a la descripción del método y dispositivo
objeto de esta invención hay que aclarar que ésta no está limitada a
los componentes específicos ni a los procedimientos particulares que
se describen, ya que éstos obviamente pueden variar. En principio,
se entiende que toda la terminología que se emplea aquí se utiliza
para describir los distintos aspectos de la invención y en ningún
caso pretende ser limitante.
Dispositivos utilizados para la realización de
esta invención se encuentran descritos en los documentos WO9930833
("Device and method for creating dry particles"), WO9930834
("Device and method for creating aerosols for drug delivery"),
US6234402 ("Stabilized capillary microjet and devices and ethods
for producing the same").
En general y salvo que se indique otra cosa,
todos los términos científicos y técnicos que se emplean en este
documento tienen el mismo significado que lo que se entiende
habitualmente cuando se utilizan en entornos relacionados.
Indicamos aquí que los términos en singular
un, una, el, la, y, pueden también indicar plurales a menos
que el contexto indique lo contrario. Así por ejemplo cuando se
escribe "una partícula" se incluye un conjunto de
partículas y cuando se refiere a "un fluoróforo" se
encuentra incluida una combinación de fluoróforos, etc.
En esta invención los términos esferas,
partículas y cápsulas se utilizan de forma
intercambiable para describir las micro- y
nano-partículas descritas en la patente,
independientemente de si son sólidas, huecas, porosas, con
diferentes capas o multi-capas, etc. Estas
partículas pueden estar constituidas por cualquier material
dependiendo de la aplicación final.
Con el término material fluorescente nos
referimos a cualquier tipo de material que emita una señal
fluorescente, ya sean compuestos orgánicos, biomoléculas,
nanocristales, nanopartículas, líquidos, sólidos, etc, de forma
individual o como mezcla de varios.
Con la denominación superficie reactiva
nos referimos a la superficie de las partículas que, con cualquier
composición, contienen una serie de grupos funcionales susceptibles
de reaccionar con cualquier tipo de molécula que contenga una
funcionalidad química adecuada que le permita formar uno o varios
enlaces covalentes entre la partícula y dicha molécula.
En esta invención el término fluido se
utiliza indistintamente para la denominación de gases o líquidos.
En el caso de líquidos se encuentran incluidos líquidos simples,
mezclas, disoluciones, suspensiones, emulsiones, sólidos licuados,
etc.
Con el término microchorro nos referimos
al filamento capilar que se obtiene del enfocamiento del fluido
interno en el interior de la cámara presurizada y que sale al
exterior a través de un orificio realizado en ella. En este término
se incluyen chorros con un diámetro nano- y micrométrico y de
composición diversa.
El objeto de la presente invención es la
obtención de partículas basado en una nueva metodología para la
generación de emulsiones. Este nuevo procedimiento está basado en un
sistema de enfocamiento capilar, denominado Flow Focusing, que
combina la utilización de fuerzas hidrodinámicas y una geometría
específica del sistema y que tiene lugar en el seno de la fase
externa de la futura emulsión. Una vez obtenida dicha emulsión y
tras la solidificación de la gota se obtienen las partículas que son
de tamaño nano y micrométrico, tienen forma esférica y una
distribución de tamaño muy estrecha y reproducible.
La tecnología básica de la invención consiste en
un sistema de introducción de un primer fluido en el interior de
una cámara presurizada mediante un segundo fluido. El primer fluido
puede ser un líquido o un gas y el segundo fluido es un líquido.
Preferentemente ambos fluidos son líquidos suficientemente
diferentes entre si de forma que permita la generación de un
microchorro estable del primer fluido moviéndose desde el punto de
alimentación en dirección al punto de salida de la cámara
presurizada al exterior. Teniendo en cuenta las dos combinaciones
posibles gas-líquido y
líquido-líquido, en la presente invención se va a
describir de forma general el procedimiento para la combinación
líquido-líquido.
La formación del microchorro, su aceleración y
en última instancia la formación de las partículas está basada en
la abrupta disminución de presión asociada a la brusca aceleración
que experimenta el primer fluido que presuriza la cámara al pasar
por el orificio de salida de dicha cámara. Esto provoca una elevada
diferencia de presiones entre los dos fluidos, que da lugar a la
generación de una zona de alta curvatura en la superficie del
segundo fluido cercana al orificio y a la obtención de un punto
cúspide del que fluirá un microchorro estacionario si se suministra
la misma cantidad de líquido que el orificio succiona. De este
modo, el fluido de la cámara presurizada rodea al primer fluido
enfocándolo, generando un microchorro estable cuyo diámetro es
considerablemente más pequeño que el diámetro del orificio de
salida de la cámara presurizada e impidiendo la obturación del
orificio de salida.
Se utiliza una ventana paramétrica (propiedades
de los fluidos, caudales suministrados, diámetro de la punta de
alimentación, tamaño del orificio de salida, relación de presiones,
etc.) suficientemente amplia como para poder aplicarla a casi
cualquier líquido (viscosidades dinámicas de 10^{-4} a 1
Kg\cdotm^{-1}\cdots^{-1}), de tal forma que el microchorro
capilar que surge del extremo de la fuente de alimentación es
absolutamente estable y las perturbaciones del proceso de rotura del
chorro no pueden evolucionar aguas arriba. Aguas abajo el
microchorro se rompe en gotas de forma regular por simple
inestabilidad capilar (p.ej. Rayleigh "On the inestability of
jets" Proc. London Math. Soc, 4-13,
1878).
El microchorro es generado en el seno de un
fluido en movimiento de tal forma que en el momento en que se
produce la ruptura del microchorro en gotas similares y del tamaño
predicho se obtiene una emulsión. Tras la extracción/evaporación del
disolvente por cualquiera de los métodos conocidos se obtienen las
partículas de tamaño nano- y micrométrico con forma esférica y una
distribución de tamaño muy estrecha y reproducible, según la
predicción de la teoría Flow Focusing.
Constituye un objeto de la presente invención un
sistema compuesto por un dispositivo mediante el que se generan las
gotas y un recipiente de recogida de dichas gotas que contiene la
fase externa de la emulsión. El sistema está compuesto por (Fig
1):
1. El tubo de alimentación, también llamado
fuente o punta o punto de alimentación.
2. Principio del tubo de alimentación que se
utiliza para introducir el fluido interno.
3. Cámara presurizada.
4. Orificio de entrada del fluido que presuriza
la cámara.
5. Final del tubo de alimentación que introduce
el primer fluido en la cámara presurizada.
6. Orificio a través del cual sale el
microchorro de la cámara presurizada.
7. Microgotas.
8. Recipiente en el que se recogen las gotas
generadas.
9. Líquido en el que se sumerge el nebulizador
para la generación de las gotas y que constituirá la fase externa
de la emulsión.
10. Sistema externo de agitación de la emulsión
que se va generando.
D_{0} es el diámetro del tubo de alimentación;
D es el diámetro del orificio de salida de la cámara; e es la
longitud axial del orificio de salida de la cámara; H es la
distancia entre el final del tubo de alimentación al orificio de
salida de la cámara; P_{0} es la presión en el interior de la
cámara; P_{\alpha} es la presión atmosférica.
Este dispositivo incluido en la invención puede
ser diseñado de múltiples formas, de manera que siga conteniendo
los componentes esenciales que se muestran en la Fig. 1, o
componentes que realicen la misma función obteniéndose los
resultados deseados. Específicamente el dispositivo debe contener
una fuente de alimentación (1) para el fluido interno que esté
abierta por ambos lados, uno (2) para introducir el fluido interno y
el otro (5) para sacarlo introduciéndolo en la cámara presurizada
(3) con un diámetro interno de 0,002- 2 mm, preferiblemente
0,01-0,4 mm. El tubo de alimentación (1) o al menos
el extremo de salida (5) ha de estar en el interior de la cámara
presurizada (3). Esta cámara (3) debe tener un orificio (4) que
permita la introducción del fluido presurizante y un orificio de
salida (6) con un diámetro interno de 0,002-2 mm,
preferiblemente 0,01-0,25 mm, a través del cual se
producirá el paso del microchorro capilar. El extremo de salida (5)
del tubo de alimentación (3) debe estar enfrentado al orificio de
salida de la cámara y a una distancia de 0,01-2 mm,
preferiblemente 0,2-0,5 mm.
Adicionalmente es objeto de la presente
invención un dispositivo en el que el diámetro del extremo de
salida de la fuente de alimentación, el diámetro del orificio de
salida de la cámara y la distancia entre ambos puede ser variada y
ajustable con el objeto de obtener unas condiciones de interacción
entre los fluidos que de lugar a un microchorro capilar estable en
el seno de un flujo laminar.
La introducción de los fluidos tendrá lugar
mediante cualquier método que permita el suministro continuo de
fluidos sin oscilaciones en los caudales (compresores, depósitos a
presión, bombas volumétricas, etc).
En la Fig. 1, la fuente de alimentación y la
cámara presurizada están diseñadas para obtener emulsiones en las
que el tamaño de gota es pequeño y de distribución uniforme. Según
la presente invención, la extracción/evaporación del disolvente
tiene lugar de forma que únicamente se produce una disminución de
volumen de la partícula debido a la eliminación del disolvente.
Ésta ocurre rápidamente sin que se produzcan fenómenos de
coalescencia de gotas, agregación o similares por lo que se mantiene
la distribución relativa de tamaños de las gotas y las partículas
finales. El tamaño de partícula obtenido se ajusta al predicho por
la teoría Flow Focusing (Fig. 3). En algunos casos se obtienen
tamaños de partícula algo superiores a los predichos, ya que se
produce una ralentización y ensanchamiento del michochorro del
fluido enfocado antes de su ruptura como consecuencia de la
deceleración que sufre el chorro externo del fluido enfocante.
Preferentemente las partículas finales deben
tener diámetros entre 0,01 y 1000 \mum, más preferiblemente entre
0,01-200 \mum y más preferiblemente entre
0,01-80 \mum. Las partículas finales obtenidas
deben ser iguales en tamaño con una desviación estándar relativa del
10 al 30%, más preferiblemente del 3 al 10% y más preferiblemente
del 3% o
menor.
menor.
Opcionalmente, se encuentra incluida en esta
invención la posibilidad de aplicar a alguno o varios de los
fluidos perturbaciones externas periódicas y controladas (p.e.
mecánicas, acústicas, etc.) de forma que favorezcan aun más la
obtención de partículas con una distribución de tamaño homogénea.
Las perturbaciones deben ser uniformes y controladas y su
frecuencia vendrá determinada por las características del
microchorro generado y el tamaño final de partícula requerido.
Es un objeto de la presente invención un
dispositivo Flow Focusing para la generación de múltiples
microchorros capilares mediante la utilización de múltiples puntas
de alimentación de fluidos enfrentada cada una de ellas a uno de
los múltiples orificios situados en la pared de una cámara
presurizada. Para la obtención de resultados óptimos en el caso de
los dispositivos múltiples, el caudal del fluido a inyectar deberá
ser lo más homogéneo posible en todos los puntos, pudiéndose llevar
a cabo la impulsión del fluido mediante múltiples agujas capilares,
medios porosos o cualquier otro medio capaz de distribuir un caudal
homogéneo entre diferentes puntos de alimentación.
Los materiales de que puede estar fabricado este
atomizador son múltiples (metal, plástico, cerámica, vidrio, etc)
dependiendo fundamentalmente de la aplicación específica en la que
vaya a emplearse el dispositivo.
Constituye otro objeto de la presente invención
un dispositivo cuyo diseño incluya distintos puntos de alimentación
dispuestos de forma concéntrica entre si generando en última
instancia un único microchorro capilar (Fig.2) y que se compone
de:
21. La fluente de alimentación, también llamado
tubo o punta o punto de alimentación.
22. Principio del tubo de alimentación que se
utiliza para introducir los fluidos en la fuente de
alimentación.
23. Cámara presurizada.
24. Orificio de entrada del fluido que presuriza
la cámara.
25. Final del tubo de alimentación que introduce
los fluidos en la cámara presurizada.
26. Orificio a través del cual sale el
microchorro de la cámara presurizada.
27. Microgotas.
28. Fluido que constituirá el núcleo de la
partícula.
29. Fluido que constituirá la corteza de la
partícula.
30. Fluido de presurización de la cámara.
31. Capilar interno de la fuente de
alimentación.
32. Capilar externo de la fuente de
alimentación.
33. Recipiente en el que se recogen las gotas
generadas.
34. Líquido en el que se sumerge el nebulizador
para la generación de las gotas y que constituirá la fase externa
de la emulsión.
35. Sistema externo de agitación de la emulsión
que se va generando.
D_{i} es el diámetro del capilar interno del
tubo de alimentación; D_{0} es el diámetro del capilar externo del
tubo de alimentación; D es el diámetro del orificio de salida de la
cámara; e es la longitud axial del orificio de salida de la cámara;
H es la distancia entre el final del tubo de alimentación al
orificio de salida de la cámara; P_{0} es la presión en el
interior de la cámara; P_{\alpha} es la presión atmosférica.
Este dispositivo incluido en la invención puede
estar diseñado de múltiples formas de manera que siga conteniendo
los componentes esenciales que se muestran en la Fig.2 o
componentes que realicen la misma función obteniéndose los
resultados deseados.
El sistema descrito en la Fig. 2 se utiliza
cuando se quiere obtener una partícula de una sustancia recubierta
por otra u otras diferentes. Este sistema está compuesto por los
mismos elementos que el descrito en la Fig. 1 excepto en lo que se
refiere a la fuente de alimentación que está constituida por dos
capilares concéntricos. El capilar externo puede estar rodeado a su
vez por nuevos capilares dispuestos de forma concéntrica alrededor
de los anteriores.
El procedimiento de formación de la emulsión es
el mismo que el anterior de forma que los fluidos se inyectan por
separado a través de una fuente de alimentación especial (21)
constituida por capilares concéntricos. En el caso en el que las
partículas estén formadas por dos materiales, a través del capilar
interno (31) se inyecta el material que constituirá el núcleo de la
partícula y a través del capilar externo (32) se introduce el
material que recubrirá dicha partícula. Los diámetros internos de
ambos tubos de alimentación tienen de 0,002-2 mm
(preferiblemente de 0,01 a -0,4 mm), siendo D_{i}<D_{o}.
Además la distancia relativa entre los puntos de salida de los tubos
concéntricos puede variar teniendo en cuenta que el tubo interno
(31) no debe introducirse en el interior del externo (32) una
distancia superior al valor del diámetro interior de dicho tubo
externo (32); y que el tubo interno (31) no debe sobresalir del
tubo externo (32) una distancia superior al doble del valor de su
diámetro interior. Estos mismos criterios son válidos si se
utilizan más de dos capilares concéntricos manteniendo dichas
disposiciones relativas entre tubos consecutivos.
En la salida de la fuente de alimentación (25)
los fluidos se juntan dentro de la cámara presurizada, son
acelerados por el fluido que presuriza la cámara generando un
microchorro de dos o más capas concéntricas de fluidos diferentes
que no se mezclan entre sí por difusión al menos durante el proceso
de formación y ruptura del microchorro. La fuente de alimentación
está enfrentada al orificio de salida de la cámara que tiene un
diámetro interno de 0,002-2 mm (preferiblemente
0,01-0,25 mm) y a una distancia de
0,01-2 mm (preferiblemente 0,2-0,5
mm) de dicho orificio. Preferiblemente la distancia entre la punta
de alimentación del capilar interno y el orificio de la cámara
estará comprendida entre cero y tres veces el valor del diámetro
interior del capilar externo. Una vez generado el microchorro y
debido a la inestabilidad capilar, éste se rompe generando gotas
esféricas de tamaños similares de forma homogénea y que estarán
formadas por capas más o menos concéntricas de los distintos
fluidos. El tamaño y grosor de las distintas capas que forman la
micropartícula y su distribución relativa vienen determinados por la
relación de caudales de los distintos fluidos y la relación de los
diámetros internos de sus capilares de alimentación y su
disposición relativa y pueden ser ajustados con precisión.
Adicionalmente es objeto de la presente
invención un dispositivo Flow Focusing en el que los diámetros del
extremo de salida de la fuente de alimentación, el diámetro del
orificio de salida de la cámara y la distancia entre ambos puede
ser variada y ajustable con el objeto de obtener unas condiciones
de interacción entre los fluidos que de lugar a un microchorro
capilar estable en el seno de un flujo laminar.
La introducción de los fluidos tendrá lugar
mediante cualquier método que permita el suministro continuo de
fluidos sin oscilaciones en los caudales (compresores, depósitos a
presión, bombas volumétricas, etc).
En la Fig. 2, la fuente de alimentación y la
cámara presurizada están diseñadas para obtener emulsiones en las
que el tamaño de gota es pequeño y de distribución uniforme. Según
la presente invención, la extracción/evaporación del disolvente
tiene lugar de forma que únicamente se produce una disminución de
volumen de la partícula debido a la eliminación del disolvente. No
se producen fenómenos de coalescencia de gotas, agregación o
similares por lo que se mantiene la distribución relativa de tamaños
de las gotas y las partículas finales. Preferentemente las
partículas finales deben tener diámetros entre 0,01 y 1000 \mum,
más preferiblemente entre 0,01-200 \mum y más
preferiblemente entre 0,01-80 \mum. Las
partículas finales obtenidas deben ser iguales en tamaño con una
desviación estándar relativa del 10 al 30%, más preferiblemente del
3 al 10% y más preferiblemente del 3% o menor.
Opcionalmente, se encuentra incluida en esta
invención la posibilidad de aplicar a alguno o varios de los
fluidos perturbaciones externas periódicas y controladas (p.e.
mecánicas, acústicas, etc.) de forma que favorezcan aun más la
obtención de partículas con una distribución de tamaño homogénea.
Las perturbaciones deben ser uniformes y controladas y su
frecuencia vendrá determinada por las características del
microchorro generado y el tamaño final de partícula requerido.
Es un objeto de la presente invención un
dispositivo para la generación de múltiples microchorros capilares
mediante la utilización de múltiples puntas de alimentación de
fluidos, cada una de ellas constituida por dos o más capilares
concéntricos, enfrentada cada una de ellas a uno de los múltiples
orificios situados en la pared de una cámara presurizada. Para la
obtención de resultados óptimos en el caso de los dispositivos
múltiples, el caudal del fluido a inyectar deberá ser lo más
homogéneo posible en todos los puntos, pudiéndose llevar a cabo la
impulsión del fluido mediante múltiples agujas capilares, medios
porosos o cualquier otro medio capaz de distribuir un caudal
homogéneo entre diferentes puntos de alimentación.
Los materiales de que puede estar fabricado este
atomizador son múltiples (metal, plástico, cerámica, vidrio, etc.)
dependiendo fundamentalmente de la aplicación específica en la que
vaya a emplearse el dispositivo.
La naturaleza y composición de los fluidos a los
que se refiere la presente invención dependerán de la composición y
estructura de las partículas y la aplicación final para la que se
obtienen dichas partículas. En esta invención el término
fluido se utiliza indistintamente para la denominación de
gases o líquidos. En el caso de líquidos se encuentran incluidos
líquidos simples, mezclas, disoluciones, suspensiones, emulsiones,
sólidos licuados, etc.
Teniendo en cuenta la composición final y
estructura de la partícula debe utilizarse una combinación de
fluidos que: - posea las propiedades necesarias para la generación
de un microchorro capilar estable mediante la utilización de alguno
de los dispositivos de enfocamiento capilar incluidos en esta
patente, y - que genere un microchorro capilar cuya ruptura dé
lugar a una emulsión estable que permita, tras la solidificación de
la gota, obtener las partículas del tamaño predicho y con una
distribución homogénea del mismo. Por ejemplo y sin intención de
limitarlo, para la obtención de partículas simples de un material
hidrofóbico, tanto el fluido presurizante como la disolución donde
se produce la formación de las gotas serán soluciones hidrofílicas
no miscibles con el fluido enfocado de forma que se genere una
emulsión que tras la extracción/evaporación del disolvente dé lugar
a las partículas esperadas.
Las partículas pueden fabricarse de distintos
materiales, incluyendo pero no limitado a polímeros, sílica, metal,
cerámica, etc. Preferentemente se encuentran incluidos en esta
invención los materiales poliméricos. Los polímeros pueden ser
sintéticos o naturales, solubles en agua o en disolventes
orgánicos. Son objeto de la presente invención fluidos que
contienen materiales poliméricos entre los que se pueden incluir sin
limitar la presente invención: polialcoholes, poliacetales,
poliéteres, poliésteres (como el ácido poliláctico, ácido
poliglicólico, poli(caprolactona) y similares y sus
copolímeros), poliortoesteres, polianhidridos (como el ácido
polisebácico, ácido polifumárico, poli(carboxifenoxi
propano), poli(carboxifenoxi hexano) y similares y sus
copolímeros), polialdehidos, policetonas, policarbonatos ,
poli(iminocarbonatos), poliamidas, poliimidas, poliacrilatos
y sus derivados y copolímeros, poli(cianoacrilatos),
poliuretanos, poliestirenos, policloruros, polifluoruros, derivados
polivinílicos, poliolefinas, polifosfatos,
poli(organofosfazenos),
poli(anhídridos-co- imidas), polisacáridos y
derivados de carbohidratos, poli(aminoácidos), polímeros
derivados de macromoléculas, y todos los derivados de los
anteriores y sus copolímeros.
Constituye un objeto de esta invención que los
materiales poliméricos que se utilizan en la formación de
partículas presenten grupos funcionales reactivos susceptibles de
reaccionar con cualquier tipo de molécula que contenga una
funcionalidad química adecuada que le permita formar uno o varios
enlaces covalentes entre la partícula y dicha molécula.
Preferentemente constituye un objeto de esta invención que dichos
grupos reactivos se encuentren en la superficie de la partícula
dirigidos hacia el exterior de la misma. Está contenido en esta
invención que entre las moléculas que se unen a la superficie están
incluidas, sin que se consideren limitantes, moléculas de interés
biológico, preferentemente péptidos, oligonucleótidos, ácidos
nucleicos, PNAs, LNAs, proteínas, glicoproteínas, lípidos,
fosfolípidos, carbohidratos, oligosacáridos y mezclas de los
mismos.
Asimismo está incluido en esta invención un
método de obtención de partículas en el que es posible incorporar
en un solo paso durante el proceso de fabricación moléculas de
interés biológico expuestas hacia el exterior.
Además de los componentes principales que
constituirán la matriz o matrices (en el caso de las cápsulas
multicapa) de la partícula, los fluidos pueden estar compuestos de
otras sustancias entre las que se incluyen sin pretensión de
limitarlas: fármacos y compuestos con actividad terapéutica y/o
profiláctica, proteínas, microorganismos, células, biomoléculas,
sustancias con actividad biológica en el mundo animal, metales,
sustancias con propiedades magnéticas, colorantes, fluoróforos,
etc.
Preferentemente está incluido en esta invención
cualquier tipo de sustancia que emita una señal fluorescente, ya
sean compuestos orgánicos, biomoléculas, nanocristales,
nanopartículas, líquidos, sólidos, etc, de forma individual o como
mezcla de varios. Predominantemente está incluido en esta invención
cualquier tipo de material fluorescente que además de poder ser
utilizado de forma individual, puede usarse en combinación con
otros en la misma partícula de tal forma que se cumple que: - tienen
un espectro de excitación en el mismo rango de longitudes de onda
y, - poseen un espectro de emisión que permite distinguirlos cuando
se utilizan simultáneamente. De forma explícita están contenidos en
esta invención aquellos materiales fluorescentes que constituyen una
mezcla (solución, suspensión, emulsión, etc.) homogénea con el
fluido en el que van a ser inyectados durante todo el proceso de
formación de la emulsión. El control de la composición del material
fluorescente de la mezcla de inyección y las condiciones de
generación de las gotas permite obtener partículas del tamaño
deseado y con unas propiedades fluorescentes requeridas,
predecibles y diferenciables. Las partículas fluorescentes
codificadas pueden ser analizadas y diferenciadas utilizando la
tecnología habitual (espectrómetros, microscopios de fluorescencia,
etc.), y preferentemente la citometría de flujo.
Además constituye un objeto de la presente
invención que las partículas que contienen material fluorescente en
su interior posean en su superficie grupos funcionales reactivos
capaces de formar enlaces covalentes entre la partícula fluorescente
y otras moléculas.
Es objeto de la presente invención que durante
el proceso de generación de la emulsión el dispositivo de formación
de las gotas se encuentre sumergido en el interior de un fluido que
constituirá la fase externa de la emulsión de forma que las gotas no
sufren ningún proceso de deformación durante la formación de la
emulsión. Este fluido es un líquido que puede ser de naturaleza
acuosa u orgánica, con propiedades suficientemente diferentes al
fluido o fluidos constituyentes de las gotas como para que tenga
lugar la formación de una emulsión de tamaño de gota igual al
generado por la ruptura del chorro capilar. Además, el fluido en el
que se encuentra sumergido el dispositivo puede contener en
disolución sustancias que favorezcan la formación y mantenimiento
de la uniformidad y homogeneidad de la emulsión durante el proceso
de solidificación de la gota para la obtención de la partícula
(surfactantes, emulsificantes, tensioactivos, etc). Adicionalmente,
el fluido en el que se genera la emulsión está en movimiento.
Se encuentra incluido en esta invención un
procedimiento mediante el cual se obtienen emulsiones de
características muy diferentes según la naturaleza de los fluidos
que se utilicen (p.e. w/o, o/w, o/o, w/o/w, w/o/o, etc.).
Además están incluidos en esta invención los
métodos de extracción/evaporación de disolvente habitualmente
utilizados para la obtención de partículas a partir de emulsiones
sin pérdida de sus características iniciales, sin que haya procesos
de coalescencia, aglomeración, etc. que modifiquen la morfología y
distribución de tamaños de las partículas.
Adicionalmente, la presente invención tiene como
un procedimiento preferente aquel mediante el cual se lleva a cabo
la generación de la partícula con la superficie reactiva y la
encapsulación del material fluorescente en un único paso, utilizando
alguno de los dispositivos descritos e incluidos en la presente
invención. La formación de las partículas fluorescentes tiene lugar
mediante la inyección de la mezcla homogénea, constituida por el
material encapsulante y el fluoróforo o combinación de fluoróforos,
a través de una punta de alimentación en el interior de una cámara
presurizada, la generación de un microchorro capilar estable debido
a la succión que tiene lugar por el cambio de presión que sufre el
fluido presurizante al salir al exterior de la cámara presurizada a
través del orificio existente en dicha cámara y que se encuentra
situado enfrente del punto de alimentación del fluido inyectado, la
ruptura axilsimétrica del microchorro capilar en el seno del fluido
en el que se encuentra sumergido el dispositivo generando una
emulsión y por último, la extracción/evaporación del disolvente
para obtener las partículas fluorescentes. A la superficie de
dichas partículas fluorescentes codificadas se le unen
covalentemente moléculas de interés biológico.
Otro objeto de esta invención es la obtención de
partículas que puedan ser utilizadas como estándares de calibración
(tamaño, fluorescencia, etc.), en la obtención de arrays de
micropartículas, en aplicaciones farmacéuticas y biomédicas
(encapsulación y liberación de fármacos, encapsulación de células y
microorganismos, diagnosis y análisis clínicos), etc.
Preferentemente está incluida en esta invención la obtención de
arrays de partículas fluorescentes codificadas y modificadas
superficialmente para utilizarlas en ensayos biológicos
múltiplex.
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento
de obtención de micropartículas de poliestireno de 5 micras
utilizando la metodología descrita en la presente invención. La
formación de la emulsión se lleva a cabo mediante la utilización de
un dispositivo de enfocamiento capilar (D = 100 \mum) con un
punto de alimentación simple (D_{0} = H = 150 \mum). El
dispositivo de enfocamiento capilar se encuentra sumergido en una
disolución acuosa de PVA al 1% w/v en agitación. A través de la
punta de alimentación se inyecta una disolución al 4% w/v de
poliestireno (Aldrich, Mw = 4.000-200.000) en
acetato de etilo (Panreac Química) con un caudal de 1 mL/h. La
cámara está presurizada mediante la introducción de un caudal
continuo de agua de 3 mL/min. La emulsión o/w generada se mantiene
en agitación durante 16h a temperatura ambiente para que tenga
lugar la extracción/evaporación del disolvente. Las partículas
sólidas se centrifugan (Orto Alresa mod. Digicen 20, 4.000 rpm, 10
min), se lavan con agua tres veces, se liofilizan y se guardan a
4ºC.
El análisis de las micropartículas se llevó a
cabo utilizando un microscopio óptico (Leica DM LS) y un programa
de tratamiento de imágenes (d_{medio} 5,29 \mum, DS 0,509) y un
microscopio electrónico de barrido (Philips XL30) (Fig.4a).
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento
de obtención de micropartículas de poliestireno de 9 micras
utilizando la metodología descrita en la presente invención. Se
utiliza el mismo dispositivo de enfocamiento capilar que en el
ejemplo 1. El procedimiento de obtención de las micropartículas y
la composición de los fluidos son los mismos que los que se
describen en el ejemplo 1, variando únicamente las condiciones de
inyección de los fluidos. La disolución de polímero se inyecta a 2
mL/h y el caudal del agua es 2 mL/min.
El análisis de las micropartículas se llevó a
cabo utilizando un microscopio óptico (Leica DM LS) y un programa
de tratamiento de imágenes (d_{medio} 9,28 \mum, DS 0,86) y un
microscopio electrónico de barrido (Philips XL30) (Fig.4b).
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento
de obtención de micropartículas de poliestireno de 13 micras
utilizando la metodología descrita en la presente invención. La
formación de la emulsión se lleva a cabo mediante la utilización de
un dispositivo de enfocamiento capilar (D = 200 \mum) con un
punto de alimentación simple (D_{0} = H = 150 \mum). El
dispositivo de enfocamiento capilar se encuentra sumergido en una
disolución acuosa de PVA al 1% w/v en agitación. A través de la
punta de alimentación se inyecta una disolución al 4% w/v de
poliestireno (Aldrich, Mw = 4.000-200.000) en
diclorometano (Aldrich) con un caudal de 3 mL/h. La cámara está
presurizada mediante la introducción de un caudal continuo de agua
de 4 mL/min. La emulsión o/w generada se mantiene en agitación
durante 16 h a temperatura ambiente para que tenga lugar la
extracción/evaporación del disolvente. Las partículas sólidas se
centrifugan (Orto Alresa mod. Digicen 20, 4.000 rpm, 10 min), se
lavan con agua tres veces, se secan al baño maría (T = 65ºC, 4 h) y
se guardan a 4ºC.
El análisis de las micropartículas se llevó a
cabo utilizando un microscopio óptico (Leica DM LS) y un programa
de tratamiento de imágenes (d_{medio} 13,58 \mum, DS 1,65) y un
microscopio electrónico de barrido (Philips XL30).
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento
de obtención de micropartículas fluorescentes de poliestireno de 5
micras utilizando la metodología descrita en la presente invención.
Se utiliza el mismo dispositivo de enfocamiento capilar y las mismas
condiciones experimentales que en el ejemplo 1. En este caso los
fluidos a inyectar son mezclas homogéneas de una disolución al 4%
w/v de poliestireno (Aldrich, Mw = 4.000-200.000) en
acetato de etilo (Panreac Química) con distintas concentraciones de
Rodamina B.
El análisis de las micropartículas se llevó a
cabo utilizando un microscopio óptico (Leica DM LS) y un programa
de tratamiento de imágenes (Tabla I), un microscopio de
fluorescencia (Leica DMR) (Fig. 5), un citómetro de flujo
(FACScalibur, Becton Dickinson) y un microscopio electrónico de
barrido (Philips XL30).
En la tabla I se puede observar la
reproducibilidad del método.
| [Rodamina B] mM | D_{medio} \pm DS (\mum) | CV (%) |
| 0.006 | 5.29 \pm 0.50 | 9.45 |
| 0.06 | 5.46 \pm 0.61 | 11.23 |
| 0.6 | 5.29 \pm 0.56 | 10.66 |
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento
de obtención de micropartículas fluorescentes de poliestireno de 5
micras utilizando la metodología descrita en la presente invención.
Se utiliza el mismo dispositivo de enfocamiento capilar y las mismas
condiciones experimentales que en el ejemplo 4 cambiando el
fluoróforo utilizado. En este caso los fluidos a inyectar son
mezclas homogéneas de una disolución al 4% w/v de poliestireno
(Aldrich, Mw = 4.000-200.000) en acetato de etilo
(Panreac Química) con distintas concentraciones de
fluoresceína.
El análisis de las micropartículas se llevó a
cabo utilizando un microscopio óptico (Leica DM LS) y un programa
de tratamiento de imágenes (Tabla II), un microscopio de
fluorescencia (Leica DMR), un citómetro de flujo (FACScalibur,
Becton Dickinson) y un microscopio electrónico de barrido (Philips
XL30).
En la tabla II se puede observar la
reproducibilidad del método.
| [Fluoresceína] mM | D_{medio} \pm DS (\mum) | CV (%) |
| 0.01 | 5.21 \pm 0.55 | 9.99 |
| 0.1 | 5.32 \pm 0.69 | 13.04 |
| 1 | 5.63 \pm 0.64 | 11.38 |
En este ejemplo se pone de manifiesto que es
posible distinguir poblaciones de micropartículas fluorescentes
diferentes, obtenidas mediante el procedimiento de enfocamiento
capilar descrito en esta invención, utilizando las técnicas
habituales de análisis de fluorescencia.
Una mezcla de micropartículas de 5 \mum de
poliestireno, poliestireno con fluoresceína 1 mM y poliestireno con
rodamina B 0,6 mM preparadas según los ejemplo anteriores, se
suspenden en agua, se sonican durante 5 minutos y se analizan en un
microscopio de fluorescencia (Leica DMR) utilizando diferentes
filtros (fig. 6) y en un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton
Dickinson) (fig. 7). Utilizando ambas técnicas se pueden diferenciar
con claridad todas las poblaciones de partículas de la mezcla
simultáneamente.
Claims (46)
1. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro y nanométrico caracterizado porque incluye las
siguientes etapas:
- -
- introducción de dos o más fluidos en un dispositivo de enfocamiento capilar Flow Focusing.
- -
- inmersión del dispositivo de enfocamiento capilar Flow Focusing en el seno de otro fluido igual o distinto a los introducidos en el paso anterior en dicho dispositivo de enfocamiento capilar Flow Focusing.
- -
- generación de una emulsión en la cual la fase continua contiene al menos el fluido en cuyo seno se ha introducido el dispositivo de enfocamiento capilar Flow Focusing, estando la fase dispersa constituida por el fluido o fluidos enfocados a través del dispositivo de enfocamiento capilar Flow Focusing.
- -
- formación de las partículas de tamaño micro y nanométrico a partir de la fase dispersa de la emulsión generada en la etapa anterior, manteniéndose en dichas partículas, respecto a las gotas de la emulsión inicial generada: a) la misma morfología de la distribución estadística de tamaños, es decir, manteniéndose los mismos momentos de orden superior a la media normalizados con la media, pudiendo variar dicha media debido al proceso de formación de la partícula a partir de la gota; y b) la misma estructura y morfología referida a la estructuración interna relativa de los distintos componentes.
2. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 1
caracterizado porque al menos uno de los fluidos enfocados en
el dispositivo de enfocamiento capilar Flow Focusing contiene como
mínimo un disolvente susceptible de ser eliminado mediante
extracción/evaporación para formar dichas partículas de tamaño
micro y nanométrico.
3. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
1-2 caracterizado porque la introducción de
los fluidos tiene lugar mediante cualquier método que permita el
suministro continuo de fluidos sin oscilaciones en los caudales (en
particular mediante compresores, depósitos a presión y bombas
volumétricas).
4. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
1-3 caracterizado porque el diámetro de las
gotas que forman la fase dispersa de la emulsión está comprendida
entre 0,01 y 1000 micras, preferentemente entre 0,01 y 200 micras y
aun más preferentemente entre 0,01 y 80 micras.
5. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 4
caracterizado porque las gotas que forman la fase dispersa de
la emulsión tiene una distribución de tamaños cuya desviación
estándar está comprendida entre el 10 y el 30%, preferentemente
entre el 3 y el 10% y aun más preferentemente menor del 3%.
6. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
1-5 caracterizado porque durante la
introducción de los fluidos en el dispositivo de enfocamiento
capilar Flow Focusing se aplican a alguno o varios de los fluidos
perturbaciones externas periódicas y controladas (en particular
mecánicas y acústicas) para favorecer la formación de gotas con una
distribución de tamaños más homogénea.
7. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
1-6 caracterizado porque los fluidos que se
utilizan pueden ser líquidos o gases.
8. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 7
caracterizado porque todos los fluidos son líquidos.
9. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 8
caracterizado porque los fluidos líquidos pueden ser líquidos
simples, mezclas, disoluciones, suspensiones, emulsiones, sólidos
licuados, etc, elegidos de forma que permitan la generación de un
microchorro estable del fluido o fluidos enfocados por el fluido
enfocante.
10. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 9
caracterizado porque el fluido introducido incluye materiales
poliméricos, silica, metales o cerámicas, que constituyen la matriz
de dichas partículas, y adicionalmente otras sustancias.
11. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 10
caracterizado porque dichas sustancias adicionales quedan
encapsuladas en las partículas que se obtienen.
12. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
10-11 caracterizado porque el fluido enfocado
es preferentemente una disolución, mezcla, suspensión y/o emulsión
homogénea de un material polimérico.
13. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 12
caracterizado porque el material polimérico inyectado puede
ser sintético o natural, soluble en agua o en disolventes
orgánicos.
14. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 13
caracterizado porque el material polimérico se selecciona
preferentemente de entre los siguientes: polialcoholes,
poliacetales, poliéteres, poliésteres (como el ácido poliláctico,
ácido poliglicólico, poli(caprolactona) y similares y sus
copolímeros), poliortoesteres, polianhidridos (como el ácido
polisebácico, ácido polifumárico, poli(carboxifenoxi
propano), poli(carboxifenoxi hexano) y similares y sus
copolímeros), polialdehidos, policetonas, policarbonatos ,
poli(iminocarbonatos), poliamidas, poliimidas,
poliacrilatos, poli(cianoacrilatos), poliuretanos,
poliestirenos, policloruros, polifluoruros, derivados polivinílicos,
poliolefinas, polifosfatos, poli(organofosfazenos),
poli(anhídridos-co-imidas),
polisacáridos y derivados de carbohidratos,
poli(aminoácidos), polímeros derivados de macromoléculas, y
todos los derivados de los anteriores y sus copolímeros.
15. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 14
caracterizado porque el material polimérico es
preferentemente poliestireno y sus derivados y copolímeros.
16. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 12
caracterizado porque los materiales poliméricos utilizados
presentan grupos funcionales reactivos susceptibles de reaccionar
con cualquier tipo de molécula que contenga una funcionalidad
química adecuada que le permita formar uno o varios enlaces
covalentes entre la partícula y dicha molécula.
17. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 16
caracterizado porque los grupos reactivos de los materiales
utilizados se disponen en la superficie de las gotas dirigidos
hacia el exterior de las mismas.
18. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
10-11 caracterizado porque las sustancias
encapsuladas incluyen preferentemente material fluorescente.
19. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 18
caracterizado porque en el material fluorescente encapsulado
está incluido cualquier tipo de sustancia que emita una señal
fluorescente, ya sean compuestos orgánicos, biomoléculas,
nanocristales, nanopartículas, líquidos o sólidos, de forma
individual o como mezcla de varios.
20. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 19
caracterizado porque el material fluorescente se encapsula de
forma individual o en combinación con otros dentro de la misma
partícula de forma que se cumpla:
- que tienen un espectro de excitación en el
mismo rango de longitudes de onda,
- poseen un espectro de emisión que permite
distinguirlos cuando se utilizan simultáneamente.
21. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
18-20 caracterizado porque el fluido con el
material fluorescente que se inyecta constituye una mezcla
(solución, suspensión, emulsión, etc) homogénea de composición
conocida durante todo el proceso de formación de la emulsión.
22. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 10
caracterizado porque las sustancias adicionales presentes en
los fluidos incluyen moléculas de interés biológico,
preferentemente péptidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, PNAs,
LNAs, proteínas, glicoproteínas, lípidos, fosfolípidos,
carbohidratos, oligosacáridos y mezclas de los mismos.
23. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
1-22 caracterizado porque el fluido en el que
está sumergido el dispositivo de enfocamiento capilar Flow Focusing
es un líquido de naturaleza acuosa u orgánica que permite la
formación de la emulsión con el fluido o fluidos constituyentes de
la fase dispersa manteniendo un tamaño de gota de la emulsión igual
al generado por la ruptura del chorro capilar.
24. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 23
caracterizado porque el fluido en el que está sumergido el
dispositivo de enfocamiento capilar Flow Focusing es un líquido que
puede contener opcionalmente en disolución sustancias que
favorezcan el mantenimiento de la uniformidad y homogeneidad de la
emulsión durante todo el proceso de formación y
extracción/evaporación del disolvente, en particular emulsificantes
o tensioactivos.
25. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
1-24 caracterizado porque las partículas
obtenidas pueden ser sólidas, huecas o porosas.
26. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 25
caracterizado porque las partículas tienen una matriz
homogénea.
27. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 25
caracterizado porque las partículas presentan distintas
capas.
28. Procedimiento de obtención de partículas de
tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones 1- 27
caracterizado porque las partículas presentan en la
superficie grupos funcionales reactivos que pueden formar enlaces
covalentes con moléculas de interés biológico, preferentemente
péptidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, PNAs, LNAs, proteínas,
glicoproteínas, lípidos, fosfolípidos, carbohidratos, oligosacáridos
y mezclas de los mismos.
29. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico mediante un procedimiento según las
reivindicaciones 1-28 caracterizado porque es
un dispositivo de enfocamiento capilar Flow Focusing constituido
por: - una cámara que se encuentra presurizada mediante la entrada
constante de un fluido y tiene en la pared un orificio de salida al
exterior y, - una fuente de alimentación de fluidos situada en el
interior de dicha cámara.
30. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 29
caracterizado porque la fuente de alimentación de fluidos
situada en el interior de la cámara está constituida por un único
tubo capilar enfrentado al orificio existente en la pared de dicha
cámara.
31. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico mediante un procedimiento según las
reivindicaciones 1-28 caracterizado porque es
un dispositivo de enfocamiento capilar Flow Focusing constituido
por: - una cámara que se encuentra presurizada mediante la entrada
constante de un fluido y tiene en una pared una pluralidad de
orificios de salida al exterior y, - una fuente de alimentación de
fluidos constituida por múltiples puntas de alimentación situadas
en el interior de una cámara presurizada, y cada una de ellas
constituida por un único tubo capilar enfrentado a uno de los
múltiples orificios situados en la pared de dicha cámara.
32. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 29
caracterizado porque la fuente de alimentación de fluidos
situada en el interior de la cámara está constituida por un
conjunto de tubos capilares situados de forma concéntrica entre si
enfrentados al orificio de salida de dicha cámara.
33. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico según las reivindicación 31
caracterizado porque cada una de las múltiples puntas de
alimentación situadas en el interior de una cámara presurizada está
constituida por un conjunto de capilares concéntricos enfrentados a
uno de los múltiples orificios situados en la pared de dicha
cámara.
34. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones 31 y 33
caracterizado porque cada una de las puntas de alimentación
se encuentra enfrentada a un único orificio de salida de los
situados en la pared de la cámara.
35. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
32-33 caracterizado porque el extremo de
salida del capilar interno que forma parte de la fuente de
alimentación situada en el interior de la cámara, y el orificio de
salida de dicha cámara, se encuentran preferentemente a una
distancia comprendida entre cero y tres veces el valor del diámetro
interior del capilar externo contiguo que forma parte de la fuente
de alimentación.
36. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
32-33 y 35 caracterizado porque la distancia
relativa entre los extremos de salida de los tubos concéntricos que
forman parte de la fuente de alimentación es variable, y
preferentemente el extremo de salida del tubo capilar interno no se
introduce en el interior del tubo capilar externo contiguo una
distancia superior al valor del diámetro interior de dicho tubo
externo.
37. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico según la reivindicación 36
caracterizado porque preferentemente el extremo de salida del
tubo capilar interno no sobresale del tubo capilar externo contiguo
una distancia superior al doble del valor de su diámetro
interior.
38. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
29-37 caracterizado porque los capilares que
forman el extremo de la fuente de alimentación que se encuentra en
el interior de la cámara presurizada tienen preferentemente un
diámetro interno comprendido entre 0,002 y 2 mm, y más
preferentemente entre 0,01 y 0,30 mm.
39. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
29-38 caracterizado porque los orificios de
salida de la cámara tiene preferentemente un diámetro interno
comprendido entre 0,002 y 2 mm, y más preferentemente entre 0,01 y
0,25 mm.
40. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
29-39 caracterizado porque cada orificio de
salida de la cámara y su correspondiente extremo de salida de la
fuente de alimentación de fluidos situada en el interior de la
cámara se encuentra a una distancia comprendida entre 0,01 y 2 mm,
preferentemente entre 0,2-0,6 mm.
\newpage
41. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
29-40 caracterizado porque las fuentes de
alimentación son preferentemente tubos capilares, medios porosos o
cualquier otro medio capaz de distribuir un caudal homogéneo entre
diferentes puntos de alimentación.
42. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
29-41 caracterizado porque los diámetros
internos de los tubos capilares que componen la fuente de
alimentación, el diámetro del orificio de salida de la cámara y la
distancia entre ambos puede ser variada y ajustable con el objeto de
obtener unas condiciones de interacción entre los fluidos que dé
lugar a un microchorro capilar estable en el seno de un flujo
laminar.
43. Dispositivo para la obtención de partículas
de tamaño micro- y nanométrico según las reivindicaciones
29-42 caracterizado porque puede estar
fabricado de diferentes materiales, preferentemente metal,
plástico, cerámica, vidrio.
44. Utilización de partículas obtenidas mediante
un procedimiento según las reivindicaciones 1-28
como estándares de calibración.
45. Utilización de partículas obtenidas mediante
un procedimiento según las reivindicaciones 1-28 en
aplicaciones farmacéuticas y biomédicas, preferentemente
encapsulación y liberación de fármacos, encapsulación de células y
microorganismos, y diagnosis y análisis clínicos.
46. Utilización de partículas obtenidas mediante
un procedimiento según las reivindicaciones 1-28
para formar de arrays de partículas, preferentemente para formar
arrays de partículas codificadas con material fluorescente y la
superficie modificada con compuestos de interés biológico.
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