ES2272551T3 - Tratamiento de semillas de maiz transgenicas con clotianidina. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para proteger una planta transgénica de maíz contra daño por alimentación por una plaga de Coleópteros, comprendiendo el procedimiento proporcionar una semilla para la planta de maíz transgénica, semilla que comprende un suceso transgénico que codifica la expresión de una delta-endotoxina Cry3B que tiene actividad contra una plaga de Coleópteros; y tratar la semilla con una cantidad de clotianidina que, en combinación con el suceso transgénico, es eficaz para proteger una planta de maíz que crece a partir de la semilla de maíz contra daño por alimentación por la plaga de Coleópteros en un grado mayor que el que se esperaría debido a la clotianidina o al suceso transgénico en solitario.
Description
Tratamiento de semillas de maíz transgénicas con
clotianidina.
La presente invención se refiere generalmente al
control de plagas que causan daño a plantas de maíz mediante sus
actividades de alimentación, y más particularmente al control de
dichas plagas de la planta de maíz mediante la combinación de una
semilla de maíz que tiene un suceso transgénico y el tratamiento de
dicha semilla con el pesticida clotianidina antes de plantar la
semilla.
Se estima que los insectos y artrópodos
relacionados destruyen un 15% de los cultivos agrícolas en los
Estados Unidos e incluso más en países en desarrollo. Además, la
competencia de malas hierbas y plantas parásitas y saprofitas
supone pérdidas de rendimiento aún más potenciales.
Parte de este daño se produce en el suelo cuando
los patógenos de la planta, insectos y otros tales como plagas del
suelo atacan la semilla después de plantarla. En la producción de
maíz, gran cantidad del daño restante está causado por gusanos de
la raíz, plagas de insectos que se alimentan de o dañan de otra
manera las raíces de la planta; y por gusanos cortadores,
Barrenadores europeos del maíz, y otras plagas que se alimentan de
o dañan las partes de la planta que están por encima del suelo. Las
descripciones generales del tipo y mecanismos de ataque de plagas
sobre cultivos agrícolas se proporcionan por, por ejemplo, Metcalf,
en Destructive and Useful Insects, (1962); y Agrios, en
Plant Pathology. 3ª Ed., Academic Press (1988).
El maíz es el cultivo de cereales más importante
en el Medio Oeste de los Estados Unidos. Entre las plagas de
insectos del maíz más graves en esta región está la forma larvaria
de tres especies de escarabajos del género Diabrotica. Esto
incluye el gusano de la raíz del maíz del oeste Diabrotica
vergifera vergifera Le Conte, el gusano de la raíz del maíz del
norte, Diabrotica berberi Smith y Diabrotica berberi
Lawrence, y el gusano de la raíz del maíz del sur, Diabrotica
undecimpuctata howardi Barber. De hecho, se usa más insecticida
para el control del gusano de la raíz del maíz que para cualquier
otra plaga del maíz, y la superficie en acres total es mayor que
para cualquier otra plaga en los Estados Unidos.
Los gusanos de la raíz del maíz (CRW) hibernan
en estado de huevo en campos donde se plantó maíz la temporada
anterior. Los huevos eclosionan de finales de mayo a junio. Si un
cultivo de maíz no es seguido por otro cultivo de maíz al año
siguiente, las larvas morirán. Por consiguiente, el impacto de los
gusanos de la raíz del maíz se siente de forma más directa en áreas
donde el maíz sigue sistemáticamente al maíz, como es típico en
muchas áreas del Medio Oeste de los Estados Unidos.
Después de salir del huevo, las larvas pasan a
través de tres etapas larvarias o Instares, durante los cuales se
alimentan del sistema radicular del maíz. Se requieren
aproximadamente tres semanas para completar la etapa larvaria. El
daño al sistema radicular causado por la alimentación de las larvas
es la causa principal de pérdida de cosechas de maíz debidas al
gusano de la raíz del maíz. Las plantas de maíz que caen y se quedan
en el campo después del debilitamiento o la destrucción de una
parte muy importante del sistema radicular son la causa de una
porción muy importante de esta pérdida, puesto que este maíz caído
no puede recogerse mediante maquinaria mecanizada convencional y se
deja en el campo.
Después de que se completa el desarrollo
larvario, las larvas se transforman en pupas inmóviles, y desde allí
en los escarabajos adultos que surgen del suelo durante todo el
verano, con el periodo de aparición dependiendo del lugar de
crecimiento. Después de la aparición, los escarabajos adultos se
alimentan durante aproximadamente dos semanas antes de que las
hembras comiencen a poner huevos. Inicialmente, los adultos se
alimentan en su mayoría en el mismo campo del que surgieron, pero
más tarde emigrarán a otros campos. La actividad máxima de los
adultos se produce normalmente en el Cinturón del Maíz de los
Estados Unidos durante finales de julio o principios de agosto en
campos plantados de forma continua con maíz, pero la actividad puede
alcanzar su punto más alto en el primer año o en campos de maíz de
maduración final. Los escarabajos de gusanos del maíz empiezan a
depositar huevos en campos de maíz aproximadamente dos semanas
después de que surgen. (Para más información, véase, por ejemplo,
Corn Rootworms, Field Crops Pest Management Circular Nº 16,
Ohio Pest Management & Survey Program, The Ohio State
University, Extension Division, Columbus, OH; disponible en Internet
en
www.ag.ohio-state.edu/\simohioline/icm-fact/fc-16.htlm,
13 de septiembre de 2000; y McGahen y col., Com Isect Control:
Corn Rottworm, número PENpages 08801502, Factsheet disponible
de Pennsylvania State University, State College, PA, 1989).
En la práctica agrícola convencional actual, en
casos en los que el maíz sigue al maíz, es normal que se aplique un
insecticida para proteger el sistema radicular del maíz de
alimentación grave por las larvas del gusano de la raíz. La
práctica convencional es tratar contra los escarabajos adultos o
tratar contra las larvas. Ejemplos de formulaciones de tratamiento
convencional para escarabajos adultos incluyen la aplicación de
insecticidas de carbarilo (por ejemplo, SEVIN® 80S a 1,0 - 2,0
libras (0,45 - 0,90 kilos) de ingrediente activo/acre (4046,85
m^{2})); fenvalerato o esfenvalerato (por ejemplo, PYDRIN® 2,4EC a
0,1 a 0,2 libras (0,45 - 0,90 kilos) de ingrediente activo/acre
(4046,85 m^{2}), o ASANA® 0,66EC a 0,03 a 0,05 libras (0,0135 a
0,0225 kilos) de ingrediente activo/acre (4046,85 m^{2}));
malatión (57% E a 0,9 libras (0, 405 kilos) de ingrediente
activo/acre (4046,85 m^{2})); permetrin (por ejemplo, AMBUSH® 2,0
EC a 0,1 a 0,2 libras (0,045 - 0,090 kilos) de ingrediente
activo/acre (4046,85 m^{2}), o POUNCE® 3,2EC a 0,1 a 0,2 libras
(0,045 - 0,090 kilos) de ingrediente activo/acre (4046,85
m^{2})); o PENNCAP-M® a 0,25 - 0,5 libras (0,1125
- 0,225 kilos) de ingrediente activo/acre (4046,85 m^{2}).
Para tratar contra larvas de CRW, la práctica
convencional es aplicar un insecticida de suelo en el momento de
plantar o después, pero preferiblemente tan cerca de la eclosión de
los huevos como sea posible. Los tratamientos convencionales
incluyen insecticidas de carbofurano (por ejemplo, FURADAN® 15G a 8
onzas (226,80 gramos)/1000 pies (304,80 metros) de hilera);
cloropirifos (por ejemplo, LORSBAN® 15G a 8 onzas (226,80
gramos)/1000 pies de hilera (304,80 metros)); fonofos (por ejemplo,
DYFONATE® 20G a 4,5 a 6,0 onzas (127,57 a 170,10 gramos)/1000 pies
de hilera (304,80 metros)); forato (por ejemplo, THIMET® 20G a 6
onzas (170,10 gramos)/1000 pies de hilera (304,80 metros));
terbufos (por ejemplo, COUNTER® 15G a 8 onzas (226,80 gramos)/1000
pies de hilera (304,80 metros)), o
\hbox{teflutrin (por
ejemplo, FORCE® 3G a 4 a 5 onzas (113,40 a 141,75 gramos)/1000 pies
de hilera (304,80 metros)).}
Se sabe que muchos de los pesticidas químicos
enumerados anteriormente son perjudiciales para los seres humanos y
para los animales en general.
El daño medioambiental que causan estos
pesticidas se empeora a menudo debido a la práctica de aplicar los
pesticidas mediante pulverización sobre las hojas o aplicación
directa a la superficie del suelo. El cambio en la dirección del
viento, lixiviado, y escorrentía pueden causar la migración de una
gran fracción del pesticida fuera de la zona de actividad deseada y
a aguas superficiales y en contacto directo con aves, animales y
seres humanos.
Por causa de la preocupación sobre el impacto de
los pesticidas químicos sobre la salud pública y la salud del medio
ambiente, se han hecho esfuerzos significativos para encontrar
maneras de reducir la cantidad de pesticidas químicos que se usan.
Recientemente, gran parte de este esfuerzo se ha centrado en el
desarrollo de cultivos transgénicos que se manipulan para expresar
toxicantes contra insectos obtenidos de microorganismos. Por
ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.877.012 de Estruch y
col. describe la clonación y expresión de proteínas de
organismos tales como Bacillus, Pseudomonas, Clavibacter y
Rhizobium en plantas para obtener plantas transgénicas con
resistencia a plagas tales como gusanos cortadores grasientos,
gusanos soldado, algunos barrenadores y otras plagas de insectos.
La Publicación WO/EP97/07089 de Privalle y col. muestra la
transformación de monocotiledóneas, tales como maíz, con una
secuencia de ADN recombinante que codifica peroxidasa para la
protección de la planta de la alimentación por barrenadores de maíz,
gusanos cogolleros y gusanos cortadores. Jansens y col, en
Crop Sci., 37(5): 1661 - 1624 (1997), presentaron la
producción de maíz transgénico que contenía un gen que codificaba
una proteína cristalina de Bacillus thuringiensis (Bt) que
controlaba las dos generaciones del Barrenador europeo del maíz.
Las Patentes de Estados Unidos Nº 5.625.136 y 5.859.336 de Koziel
y col. informaron de que la transformación de maíz con un gen
de B. thuringiensis que codificaba
delta-endotoxinas proporcionó al maíz transgénico
resistencia mejorada al Barrenador europeo del maíz. Se ha
proporcionado un informe exhaustivo de ensayos de campo de maíz
transgénico que expresa una proteína insecticida de B.
thuringiensis por Armstrong y col., en Crop
Science, 35(2): 550 - 557 (1995).
Se sabía que las
\delta-endotoxinas de Bt de tipo silvestre tenían
poca actividad contra insectos coleópteros, y Kreig y col.,
en 1983, presentaron el primer aislado de una cepa de B.
thuringiensis tóxica para coleópteros. (Véase, Patente de
Estados Unidos Nº 4.766.203). Las Patentes de Estados Unidos Nº
4.797.279 y 4.910.016, también describían cepas silvestres e
híbridas de B. thuringiensis que producían proteínas que
tenían alguna actividad contra coleópteros. Más recientemente, sin
embargo, procedimientos de manipulación genética más precisos se
han mostrado prometedores en el desarrollo de proteínas de B.
thuringiensis modificadas que tienen niveles significativamente
más altos de actividad contra el gusano de la raíz del maíz que las
producidas por parentales de tipo silvestre (véase, por ejemplo, el
documento WO 99/31248 de Ecogen, Inc. y Monsanto Company).
Sin embargo, no se conoce actualmente si
cualquier suceso transgénico en solitario sería suficientemente
eficaz para proteger al maíz del daño por gusano de la raíz del
maíz en campos muy infestados que están dedicados al maíz en serie.
De hecho, el control total del daño por gusano de la raíz del maíz
mediante cualquier otro suceso transgénico puede no ser deseable a
largo plazo, por causa del potencial de desarrollo de cepas
resistentes de la plaga diana.
Otra alternativa a las formas convencionales de
aplicación de pesticida es el tratamiento de semillas de la planta
con pesticidas. El uso de fungicidas para proteger semillas del
ataque después de plantar, y el uso de niveles bajos de
insecticidas para la protección de, por ejemplo, la semilla de maíz
del gusano alambre, se han usado durante algún tiempo. El
tratamiento de semillas con pesticidas tiene las ventajas previstas
para la protección de las semillas, aunque minimizando la cantidad
de pesticida que se requirió y limitando la cantidad de contacto
con el pesticida y la cantidad de aplicaciones de campo diferentes
que fueron necesarias.
Otros ejemplos del control de plagas aplicando
insecticidas directamente a la semilla de la planta se proporcionan
en, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.696.144, que
describe que el Barrenador europeo del maíz causó menos daño por
alimentación al cultivo de plantas de maíz de semillas tratadas con
un compuesto de 1-arilpirazol a una tasa de 500 g
por quintal de semillas que a plantas de control cultivadas de
semillas no tratadas. Además, la Patente de Estados Unidos Nº
5.876.739 de Turnblad y col. (y su parental, Patente de
Estados Unidos Nº 5.849.320) describen un procedimiento para
controlar insectos de suelo que implica tratar semillas con un
revestimiento que contiene uno o más aglutinantes poliméricos y un
insecticida. Esta referencia proporciona una lista de insecticidas
a los que identifica como candidatos para uso en este revestimiento
y también nombra varios potenciales insectos diana. Sin embargo,
aunque la Patente 5.876.739 afirma que tratar semillas de maíz con
un revestimiento que contiene un insecticida particular protege las
raíces del maíz de daño por el gusano de la raíz del maíz, no
indica o sugiere de otra manera que dicho tratamiento pudiera usarse
con una semilla que tenga un suceso transgénico.
Se ha mencionado el tratamiento de semillas que
tienen un suceso transgénico con pesticidas de compuesto de
nitroimino o nitroguanidino (Véase, por ejemplo, el documento WO
99/35913), sin embargo, no se ha encontrado dirección a la utilidad
o eficacia potencial de dichos tratamientos, o los detalles de cómo
pueden realizarse dichos tratamientos -tales como las cantidades de
ingrediente activo que serían necesarias por cantidad unitaria de
semillas- ni ejemplos que podrían dar razones para
\hbox{creer
que el tratamiento propuesto podría proporcionar realmente
protección adecuada.}
Por lo tanto, aunque los desarrollos recientes
en la manipulación genética de plantas ha mejorado la capacidad de
proteger plantas de plagas sin usar pesticidas químicos, y aunque
técnicas tales como el tratamiento de semillas con pesticidas han
reducido los efectos perjudiciales de los pesticidas en el
medioambiente, quedan numerosos problemas que limitan la aplicación
con éxito de estos procedimientos en condiciones reales de campo.
Por consiguiente, sería útil proporcionar un procedimiento mejorado
para la protección de plantas, especialmente plantas de maíz, del
daño por alimentación de plagas. Sería particularmente útil si dicho
procedimiento pudiera reducir la tasa de aplicación de pesticidas
químicos requerida, y también si limitara la cantidad de operaciones
de campo diferentes que se requerirían para el cultivo y plantación
de cultivos.
En resumen, por lo tanto, la presente invención
se refiere a un nuevo procedimiento para proteger una planta
transgénica de maíz contra el daño por alimentación por una o más
plagas, comprendiendo el procedimiento proporcionar una semilla
para la planta transgénica de maíz, semilla que comprende un suceso
transgénico que tiene actividad contra al menos una de las una o
más plagas; y tratar la semilla con una cantidad eficaz de pesticida
clotianidina.
La presente invención también se refiere a una
nueva semilla transgénica de maíz que se ha tratado proporcionando
una semilla para la planta transgénica de maíz, semilla que
comprende un suceso transgénico que tiene actividad contra al menos
una de las una o más plagas, y tratando la semilla con una cantidad
eficaz de pesticida clotianidina.
La presente invención también se refiere a una
nueva semilla de una planta transgénica de maíz que proporciona
resistencia aumentada a la planta de maíz resultante contra daño por
alimentación por una o más plagas, que comprende un suceso
transgénico que tiene actividad contra al menos una de las una o más
plagas, semilla que se ha tratado con una cantidad eficaz de
pesticida clotianidina.
Entre las diversas ventajas que se ha
descubierto que alcanza la presente invención, por lo tanto, puede
apuntarse el suministro de un procedimiento para la protección de
plantas, especialmente plantas de maíz, de daño por alimentación
por plagas; el suministro de un procedimiento que reduciría la tasa
de aplicación de pesticidas químicos convencionales requerida; y el
suministro de un procedimiento que limitaría la cantidad de
operaciones de campo diferentes que se requerirían para el cultivo
y plantación de cultivos.
De acuerdo con la presente invención, se ha
descubierto que las plantas de maíz pueden protegerse contra daño
por alimentación por una o más plagas mediante un procedimiento que
incluye proporcionar una semilla de maíz que tiene un suceso
transgénico que tiene actividad contra al menos una de las plagas y
después tratar la semilla transgénica de maíz con una cantidad
eficaz de pesticida clotianidina. En realizaciones preferidas de
esta invención, se ha descubierto que la combinación de un suceso
transgénico que tiene actividad contra el gusano de la raíz del
maíz y tratamiento de la semilla con clotianidina proporciona
ventajas inesperadamente sinérgicas a las semillas que tienen dicho
tratamiento, incluyendo eficacia inesperadamente superior para la
protección contra el daño a la planta de maíz resultante por el
gusano de la raíz del maíz. En particular, se descubrió que la
combinación de la presente invención fue inesperadamente superior al
suceso transgénico en solitario, o al tratamiento de la semillas
con clotianidina en solitario, protegiendo las plantas de maíz
contra niveles de daño más graves por gusano de la raíz del maíz -
niveles de daño que se sabe que reducen la producción de maíz.
Se conocen plantas y semillas de maíz que se han
manipulado para incluir genes exógenos obtenidos de Bacillus
thuringiensis que codifican la expresión de
\delta-endotoxinas Cry3 que tienen actividad
contra plagas de Coleópteros, así como procedimientos para el
tratamiento de semillas (incluso algunas semillas transgénicas) con
pesticidas. Sin embargo, no se ha comprendido hasta la presente
invención que podrían usarse ciertas cantidades eficaces de
pesticida clotianidina para tratar semillas de maíz que tengan
dichos sucesos Cry3, con el resultado de que esta combinación
podría ser eficaz, y preferiblemente inesperadamente superior,
aumentando la eficacia del pesticida y el suceso transgénico, y
proporcionaría las ventajas adicionales de aumentar la capacidad de
ajustar la actividad pesticida a la presión de la plaga,
disminuyendo el coste del tratamiento y/o aplicación, aumentando la
seguridad del manejo de semillas, y disminuyendo el impacto
medioambiental del suceso o el pesticida o de ambos.
En particular, se ha descubierto en
realizaciones preferidas que el tratamiento de semillas transgénicas
de maíz que son capaces de expresar ciertas proteínas de Cry3Bb
modificadas con de aproximadamente 100 g a aproximadamente 400 g de
clotianidina por 100 kg de semillas, proporcionó protección
inesperadamente superior contra el gusano de la raíz del maíz.
Además, se cree que dicha combinación también es eficaz para
proteger las plantas de maíz emergentes contra daño por el gusano
cortador grasiento. También se cree que las semillas de la presente
invención tienen la propiedad de disminuir el coste del uso de
pesticida, puesto que puede usarse menos pesticida para obtener una
cantidad requerida de protección que si no se usa el procedimiento
innovador. Además, puesto que se usa menos pesticida y puesto que
se aplica antes de plantar y sin ninguna aplicación de campo
diferente, se cree que el presente procedimiento es por lo tanto
más seguro para el operario y para el medioambiente, y es
potencialmente menos caro que los procedimientos convencionales.
Cuando se dice que algunos efectos son
"sinérgicos", se pretende incluir los efectos sinérgicos de la
combinación sobre la actividad pesticida (o eficacia) de la
combinación del suceso transgénico y el pesticida. Sin embargo, no
se pretende que dichos efectos sinérgicos se limiten a la actividad
pesticida, sino que también deben incluir ventajas inesperadas
tales como alcance de la actividad aumentado, perfil de actividad
ventajoso como en relación al tipo y cantidad de reducción del
daño, coste del pesticida y aplicación disminuido, distribución del
pesticida en el medioambiente disminuida, exposición al pesticida
disminuida del personal que produce, maneja y planta semillas de
maíz, y otras ventajas conocidas por los especialistas en la
técnica.
La presente invención proporciona también la
ventaja de aumentar la capacidad de ajustar la actividad pesticida
a la presión de la plaga. Esto se refiere a la capacidad de diseñar
la combinación del suceso transgénico y el tratamiento con
pesticida de modo que la semilla de la planta resultante esté
provista de actividad pesticida eficaz durante el periodo en el que
la presión de alimentación de la plaga diana sobre la semilla o la
planta alcanza su máximo. A modo de ejemplo, cuando se aplica
clotianidina a una semilla de maíz que tiene un suceso transgénico
contra gusano de la raíz del maíz, el pesticida puede aplicarse en
un revestimiento diseñado para proporcionar liberación controlada
de la clotianidina. La tasa de liberación puede seleccionarse de
modo que la clotianidina proporcione protección contra otras plagas
tales como, por ejemplo, el gusano cortador grasiento, en la etapa
de post surgimiento del maíz, mientras que el suceso transgénico
proporciona protección contra el gusano de la raíz del maíz en una
etapa tardía del desarrollo de la planta - cuando se necesite dicha
protección.
Como se usan en este documento, las expresiones
"efecto pesticida" y "actividad pesticida", o
"actividad" se refiere a un efecto toxico contra una plaga. La
expresión "actividad contra (una o más) plagas", tiene también
el mismo significado. Cuando se dice que una semilla o planta está
"protegida contra daño por alimentación por una o más plagas",
se entiende que dicha semilla o planta posee una característica que
tiene acción directa o indirecta sobre una o más plagas que da como
resultado un daño por alimentación reducido por dicha plaga o
plagas sobre las semillas, raíces, brotes y hojas de plantas que
tienen dicha característica en comparación con el daño por
alimentación causado en las mismas condiciones a plantas que no
tienen dicha característica. Dichas acciones directas o indirectas
incluyen inducir la muerte de la plaga, repeler la plaga de las
semillas, raíces, brotes y/o hojas de la planta, inhibiendo la
alimentación de la planta en, o la puesta de sus huevos en las
semillas, raíces, brotes y/o hojas de la planta, e inhibir o
prevenir la reproducción de la plaga.
La expresión "actividad insecticida" tiene
el mismo significado que actividad pesticida, excepto que se limita
a los casos en los que la plaga es un insecto. Excepto donde se
indique específicamente, cuando el término "pesticida" se usa
en este documento, este término se refiere a un pesticida químico
que se suministra externamente a la semilla, y no se entiende que
incluya agentes activos que se produzcan por la semilla o la planta
que crezca a partir de la semilla particular. Sin embargo, las
expresiones "actividad pesticida" y "actividad
insecticida" pueden usarse en referencia a la actividad de un
pesticida suministrado externamente y/o un agente que se produzca
por la semilla o la planta, o a ambos.
Una característica de la presente invención es
una semilla de una planta transgénica de maíz. Como se usa en este
documento, la expresión "planta transgénica de maíz" significa
una planta de maíz o progenie de la misma obtenida a partir de una
célula o protoplasto de una planta de maíz transformada, en la que
el ADN de la planta contiene una molécula de ADN exógeno
introducido que no estaba presente originalmente en una planta
nativa, no transgénica de la misma cepa.
La semilla transgénica de maíz es una que
contiene un gen exógeno que codifica una proteína pesticida. Las
proteínas pesticidas de este tipo se describen por Schnepf y
col., en Microbiology & Molecular Biology Reviews,
62:775 - 806 (1998), y por ffrench-Constant y Bowen,
en CMSL Cell. Mol. Life Sci., 57:828 - 833 (2000). En una
aplicación de la invención, la proteína pesticida es una proteína
insecticida.
Se prefiere que la semilla contenga un gen
exógeno obtenido de una cepa de Bacillus thuringiensis, y en
particular, se prefiere que el gen exógeno sea uno que codifique
una \delta-endotoxina obtenida de B.
thuringiensis. Dichas \delta-endotoxinas se
describen en los documentos WO 99/312489 y Patente de Estados Unidos
Nº 6.063.597, e incluyen las toxinas Cry3. Los segmentos de ácidos
nucleicos que codifican proteínas cristalinas de B.
thuringiensis tóxicas para coleópteros modificadas que son
útiles en la presente invención se describen en la Patente de
Estados Unidos Nº 6.060.594, y las plantas transgénicas resistentes
a insectos que incluyen secuencias de ácidos nucleicos que
codifican dichas proteínas insecticidas se describen el la Patente
de Estados Unidos Nº 6.023.013. Se prefiere que las
\delta-endotoxinas de la presente invención
incluyan las proteínas Cry3B, y se prefiere más aún que las
\delta-endotoxinas incluyan las proteínas Cry3Bb
activas contra coleópteros. La nomenclatura de las proteínas
cristalinas insecticidas de B. thuringiensis fue establecida
por Höfte y Whitley, Microbial. Rev., 53: 242 - 255, 1989.
Esta nomenclatura se ha revisado y la nomenclatura revisada se
puede encontrar en
http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/bt/index.htlm.
La nomenclatura revisada se usará en este documento para describir
las características de los sucesos transgénicos y las proteínas
\delta-endotoxinas codificadas por el suceso
transgénico.
Cuando la expresión "suceso transgénico" se
usa en este documento, se entiende que dicha expresión se refiere
al ADN manipulado genéticamente que se ha descrito anteriormente,
pero también incluye la proteína(s) que están codificadas
por el gen modificado. Un suceso transgénico en una semilla de maíz,
o planta de maíz, por lo tanto, incluye la capacidad de expresar
una proteína. Cuando se dice que "un suceso transgénico tiene
actividad contra una plaga", se debe entender que es la proteína
que está codificada por el gen la que realmente tiene dicha
actividad cuando la proteína se expresa y se pone en contacto con la
plaga.
El documento WO 99/31248 y la Patente de Estados
Unidos Nº 6.063.597 describen procedimientos para manipular
genéticamente genes de \delta-endotoxina de B.
thuringiensis de modo puedan expresarse dichas
\delta-endotoxinas modificadas. Las
\delta-endotoxinas modificadas difieren de las
proteínas de tipo silvestre en que tienen sustituciones adiciones o
deleciones de aminoácidos específicas en comparación con las
proteínas producidas por el organismo de tipo silvestre. Dichas
\delta-endotoxinas modificadas se identifican en
este documento mediante el uso de un asterisco (*), o mediante
referencia a una proteína específica mediante su número de
identificación. Por tanto una \delta-endotoxina
Cry3 modificada genéticamente se expresaría como Cry3*, ejemplos de
las cuales incluyen, aunque sin limitación: Cry3Bb.11230,
Cry3Bb11231, Cry3Bb.11232, Cry3Bb11233, Cry3Bb.11234, Cry3Bb11235,
Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb.11238, Cry3Bb.11239,
Cry3Bb.11241, Cry3Bb.11242, y Cry3Bb.11098.
Se descubrió que algunas de las
\delta-endotoxinas modificadas que se describieron
en el documento WO 99/31248 y en la Patente de Estados Unidos Nº
6.063.597 tienen actividad potenciada contra insectos coleópteros, y
en particular contra Diabrotica spp., incluyendo el gusano
de la raíz del maíz. Como se usa en este documento, la expresión
"actividad potenciada" se refiere a la actividad insecticida
aumentada de una toxina modificada en comparación con la actividad
de la misma toxina sin las modificaciones de aminoácidos cuando las
dos se ensayan en las mismas condiciones. En particular, se
descubrió que las \delta-endotoxinas Cry3* tenían
actividad potenciada contra el gusano de la raíz del maíz, y se
preferían por lo tanto para uso en la presente invención. Se
prefieren más las \delta-endotoxinas Cry3B*, y se
prefieren incluso más las \delta-endotoxinas
Cry3Bb*. Sucesos transgénicos aún más preferidos son los que
comprenden la capacidad de expresar las
\delta-endotoxinas modificadas que se enumeran en
la siguiente tabla. También se muestran en la tabla cepas de B.
thuringiensis transgénicas que incluyen genes para expresión de las
respectivas nuevas endotoxinas, y la fecha y número de acceso de su
depósito con la Agricultural Research Service Collection (NRRL) en
1815 N. University Street, Peoria, IL 91904.
También se ha descubierto que un uso preferido
para la presente invención es reducir el daño por alimentación de
plagas cuando se usa en combinación con semillas que tienen sucesos
transgénicos que tienen ciertos niveles de eficacia contra dichas
plagas. Para ilustrar que niveles de eficacia se prefieren, el
siguiente ejemplo usará el Iowa Root Rating Method (Hills y Peters,
J. Econ. Entomol., 64: 764 - 765, 1971), que mide el daño
por alimentación del gusano de la raíz del maíz a las raíces de maíz
en una escala de 1 - 6. En el índice, 1 = ningún daño o solamente
unas pocas marcas menores de alimentación; 2 = marcas de
alimentación evidentes pero ninguna raíz comida hasta 1 pulgada y
media (3,81 cm) de la planta; 3 = varias raíces comidas hasta 1
pulgada y media (3,81 cm) de la planta, pero nunca el equivalente a
un nudo completo de raíces destruido; 4 = un nudo de raíces
completamente destruido; 5 = dos nudos de raíces completamente
destruidos; y 6 = tres o más nudos de raíces completamente
destruidos. Un nudo destruido se define como una raíz que se ha
recortado hasta una pulgada y media (3,81 cm) de la base. Las
raíces recortadas no tienen que originarse a partir de un solo
nudo, pero todas las raíces recortadas deben igualar el equivalente
de un nudo completo para contar como un nudo completo.
Como se usa en este documento, un suceso
transgénico está dentro del intervalo preferido de nivel de eficacia
contra una plaga diana, si el suceso reduce el daño de alimentación
por esta plaga en cierta cantidad en comparación con el mismo
cultivo sin el suceso transgénico, pero no previene sustancialmente
todo el daño por la plaga diana. Por ejemplo, si el 10% del maíz
transgénico sufrió daño por gusano de la raíz del maíz de 4 o más en
la escala 1 - 6 de Iowa, mientras que el 80% del maíz no
transgénico sufrió daño de 4 o más, entonces podría decirse que el
daño al maíz transgénico fue del (10/80) x 100 = 12,5% del maíz no
transgénico. Para los fines de la presente invención, se entenderá
que un suceso transgénico en maíz está dentro del intervalo
preferido de nivel de eficacia si el maíz que tiene dicho suceso
sufre de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 50% del daño
sufrido por el maíz no transgénico debido a la misma plaga en las
mismas condiciones. Se prefriere más que el maíz que tiene dicho
suceso transgénico sufra de aproximadamente el 10% a aproximadamente
el 40% del daño sufrido por el maíz no transgénico por la misma
plaga en las mismas condiciones, se prefiere aún más un daño de
aproximadamente el 15% a aproximadamente el 30% y se prefiere
todavía más un daño de aproximadamente el 20% a aproximadamente el
30% del daño sufrido por el maíz no transgénico por la misma plaga
en las mismas condiciones. Como se usa en este documento, cuando el
término "aproximadamente" se usa para describir el grado de
daño al maíz, se debe entender que el grado de daño puede estar por
encima o por debajo de los límites descritos en como mucho el 1% o
el 2% y todavía considerarse dentro de los intervalos descritos. A
modo de ejemplo, un nivel del 4,5% de daño se contemplaría como
"aproximadamente el 5%".
Sin el deseo de limitarse por esta o cualquier
otra teoría, se cree que el tratamiento de semillas con pesticida
puede proporcionar ventajas significativas cuando se combina con un
suceso transgénico que proporciona protección que esté dentro del
intervalo de eficacia preferido contra una plaga diana. Además, se
cree que hay situaciones que conocen bien los especialistas en la
técnica, donde es ventajoso tener dichos sucesos transgénicos dentro
del intervalo de eficacia preferido.
La presente invención también incluye semillas y
plantas que tienen más de un suceso transgénico. Dichas
combinaciones se denominan sucesos transgénicos "apilados".
Estos sucesos transgénicos apilados puede ser sucesos que se
dirijan a la misma plaga diana, o pueden dirigirse a plagas diana
diferentes. En un procedimiento preferido, una semilla que tiene la
capacidad de expresar una proteína Cry3 tiene también la capacidad
de expresar al menos otra proteína insecticida que sea diferente de
una proteína Cry3.
En otro procedimiento preferido, la semilla que
tiene la capacidad de expresar una proteína Cry3 tiene también un
suceso transgénico que proporciona tolerancia a herbicidas. Se
prefiere más que el suceso transgénico que proporciona tolerancia a
herbicidas sea un suceso que proporcione tolerancia a glifosato,
N-(fosfonometil)glicina, incluyendo la forma de sal
de isopropilamina de dicho herbicida, se prefiere aún más el suceso
transgénico que es eficaz para proporcionar la resistencia a
herbicidas de plantas y semillas ROUNDUP READY® disponibles de
Monsanto Co., St. Louis, MO.
En el presente procedimiento, una semilla de
maíz que tiene un suceso transgénico se trata con un pesticida que
se identifica como clotianidina,
(N-[(2-cloro-5-tiazolil)metil]-N'-metil-N''-nitro[C(E)]-(9Cl)-guanidina,
CAS RN 210880-92-5, que tiene un
número de desarrollo de TI-435).
Cuando se describe en este documento el
insecticida clotianidina, debe entenderse que la descripción
pretende incluir formas de sal del insecticida así como cualquier
forma isomérica y/o tautomérica del insecticida que muestre la
misma actividad insecticida que se ha descrito. El insecticida
clotianidina que es útil en el presente procedimiento puede ser de
cualquier grado de pureza que se considera en el mercado como
insecticida. Pueden tolerarse otros que acompañan al insecticida en
preparaciones comerciales, tales como impurezas, en los
procedimientos y composiciones, siempre que dichos otros materiales
no desestabilicen la composición o reduzcan o destruyan de manera
significativa la actividad de cualquiera de los componentes
insecticidas o del suceso transgénico contra la(s)
plaga(s) diana. Un especialista en la técnica de la
producción de insecticidas puede identificar fácilmente las
impurezas que pueden tolerarse y las que no.
Se ha descubierto que el presente procedimiento
es útil para proteger semillas y plantas contra una amplia serie de
plagas agrícolas, incluyendo insectos, ácaros, hongos, levaduras,
mohos y bacterias.
Cuando un insecto es la plaga diana para la
presente invención, dichas plagas incluyen aunque sin
limitación:
Del orden Lepidoptera, por ejemplo,
Acleris spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp.,
Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia
gemmatalis, Archis spp., Argyotaenia spp., Autographa spp.,
Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp.,
Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp.,
Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleophora spp., Crocidolomia
binotalis, Cryptophlebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp.,
Diparopsis castanea, Earias spp., Ephesia spp., Eucosma spp.,
Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp.,
Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphantria
cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis
spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma
spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia
Nubilalis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea,
Pectinophora gossypiella, Phothorimaea operculella, Pieris rapae,
Pieris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp.,
Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp.,Synanthedon spp.,
Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni e
Yponomeuta spp.;
Del orden Coleoptera, por ejemplo,
Agrotes spp., Anthonomus spp., Atomaria
linearis, Chaetonecma tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp.,
Dermitestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp.,
Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp.,
Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia
spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitotroga
spp., Tenebrio spp., Tribolium spp., y Trogoderma
spp.;
Del orden Orthoptera, por ejemplo,
Blatta spp., Blattella spp., Gryllotalpa
spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta spp., y
Schistocerca spp.;
Del orden Isoptera, por ejemplo,
Reticuliternes spp.,
Del orden Psocoptera, por ejemplo, Liposcelis
spp.,
Del orden Anoplura, por ejemplo,
Haematopinus spp., Licognathus spp.,
Pediculus spp., Pemphigus spp., y Phylloxera spp.;
Del orden Mallophaga, por ejemplo,
Damalinea spp. y Trichodectes
spp.;
Del orden Thysanoptera, por ejemplo,
Frankinella spp., Hercinothrips spp.,
Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci y Scirtothrips
aurantii;
Del orden Heteroptera, por ejemplo,
Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus
spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa spp., Nezara
spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis,
Scotinophara spp., y Triatoma spp.;
Del orden Homoptera, por ejemplo,
Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae,
Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bemisia
tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus
dictyospermi, Coccus hesperidum, Empoasca spp., Eriosoma larigerum,
Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lacanium corni,
Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nehotettix spp.,
Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp., Planococcus spp.,
Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla spp., Pulvinaria
aethiopica, Quadraspisiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia
spp., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Stiobion spp., Trialeurodes
vaporariorum, Trioza erytreae y Unapsis citri;
Del orden Hymenoptera, por ejemplo,
Acromymex, Atta spp., Cephus spp., Diprion
spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius spp.,
Monomorium pharaonis, Neodiprion spp., Solenopsis spp., y
Vespa spp.;
Del orden Diptera, por ejemplo,
Aedes spp., Antherigona soccata, Bilbo
hortulanis, Calliphora erytrocepahala, Ceratitis spp., Chrysomyia
spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila
melanogaster, Fannia spp., Gastrophillus spp., Glossina spp.,
Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomysa spp., Lucilia spp.,
Melanagromyza spp., Musca spp., Oestrus spp., Orseolia spp.,
Oscinella frit, Pegomya hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis
pomonella, Sciara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia
spp., y Tipula spp.,
Del orden Siphonaptera, por ejemplo,
Ceratophyllus spp., y Xenopsylla
cheopsis y
Del orden Thysanura, por ejemplo,
Lepisma saccharina.
Se ha descubierto que la presente invención es
particularmente eficaz cuando la plaga de insecto es Diabrotica
spp., y especialmente cuando la plaga es Diabrotica
virgifera, Diabrotica barberi, o Diabrotica
undecimpunctata.
En el procedimiento de la presente invención, la
clotianidina se aplica a una semilla transgénica de maíz. Aunque se
cree que el presente procedimiento puede aplicarse a una semilla
transgénica de maíz en cualquier estado fisiológico, se prefiere
que la semilla esté en un estado suficientemente duradero que no
provoque daños durante el procedimiento de tratamiento.
Típicamente, la semilla sería una semilla que se había recogido del
campo; retirado de la planta; y separada de cualquier mazorca,
tallo, cáscara externa, y pulpa a su alrededor u otro material de
la planta no de semilla. La semilla también sería preferiblemente
biológicamente estable hasta el punto de que el tratamiento no
causaría daño biológico a la semilla. En una realización, por
ejemplo, el tratamiento puede aplicarse a una semilla de maíz que
se ha recogido, limpiado y secado hasta un contenido de humedad por
debajo de aproximadamente el 15% en peso. En una realización
alternativa, la semilla puede ser una que se ha secado y después
cebado con agua y/u otro material y después secada de nuevo antes o
durante el tratamiento con el pesticida. Dentro de las limitaciones
recién descritas, se cree que el tratamiento puede aplicarse a la
semilla en cualquier momento entre la recogida de la semilla y la
siembra de la semilla. Como se usa en este documento, la expresión
"semilla no sembrada" pretende incluir semillas en cualquier
periodo entre la recogida de la semilla y la siembra de la semilla
en la tierra para el fin de germinación y crecimiento de la
planta.
Cuando se dice que la semilla no sembrada está
"tratada" con el pesticida, dicho tratamiento no pretende
incluir las prácticas en las que el pesticida se aplica al suelo,
en lugar de a la semilla. Por ejemplo, tratamientos tales como la
aplicación del pesticida en bandas, bandas "T", o en surcos, al
mismo tiempo que la semilla se siembra, no se considera que está
incluida en la presente invención.
El pesticida, o combinación de pesticidas, puede
aplicarse "solo", esto es, sin ningún diluyente o componentes
adicionales presentes. Sin embargo, el pesticida se aplica
típicamente a las semillas en forma de una formulación de
pesticida. Esta formulación puede contener uno o mas componentes
deseables diferentes incluyendo aunque sin limitación diluyentes
líquidos, aglutinantes para servir como matriz para el pesticida,
cargas para proteger a las semillas durante condiciones de estrés,
y plastificantes para mejorar la flexibilidad, adhesión y/o la
propagabilidad del revestimiento. Además, para formulaciones de
pesticida oleosas, que contienen poca o ninguna carga, puede ser
deseable añadir a la formulación agentes desecantes tales como
carbonato cálcico, caolina o arcilla bentonita, perlita, tierra de
diatomeas o cualquier material absorbente. El uso de dichos
componentes en el tratamiento de semillas se conoce en la técnica.
Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.876.739. El
especialista en la técnica puede seleccionar fácilmente componentes
deseables para uso en la formulación de pesticida dependiendo del
tipo de semilla a tratar y el pesticida particular que se ha
seleccionado. Además, pueden usarse formulaciones de pesticidas
conocidos disponibles fácilmente en el mercado, como se demuestra
en los ejemplos a continuación.
Las semillas también pueden tratarse con uno o
más de los siguientes ingredientes: otros pesticidas, incluyendo
compuestos que actúan solamente bajo tierra; fungicidas, tales como
captano, tiram, metalaxil, (metoxam = isómero resuelto de
metalaxil), fludioxonil, oxadixil, e isómeros de cada uno de esos
materiales, y similares; herbicidas, incluyendo compuestos
seleccionados entre carbamatos, tiocarbamatos, acetamidas,
triazinas, dinitroanilinas, éteres de glicerol, piridazinonas,
uracilos, fenoxis, ureas, y ácidos benzoicos; herbicidas curativos
tales como benzoxazina, derivados de benzhidrilo,
N,N-dialquil dicloroacetamida, diversos compuestos de
dialoacilo, oxazolidinilo, y tiazolidinilo, etenona, compuestos de
anhídrido naftálico, y derivados de oxina; fertilizantes; y agentes
de biocontrol tales como bacterias y hongos de producción natural o
recombinantes de los géneros Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas,
Serratia, Trichoderma, Glomus, Gliocladium, y hongos con
micorriza. Estos ingredientes pueden añadirse en forma de una capa
diferente sobre la semilla o como alternativa pueden añadirse como
una parte de la composición pesticida.
Preferiblemente, la cantidad de la nueva
composición u otros ingredientes usados en el tratamiento de
semillas no debe inhibir la generación de la semilla, o causar daño
fitotóxico a la semilla.
La formulación de pesticida que se usa para
tratar semillas transgénicas de maíz en la presente invención puede
estar en forma de una suspensión; emulsión; fluidización de
partículas en un medio acuoso (por ejemplo, agua); polvo
humidificable, gránulos humidificables (flujo seco); y gránulos
secos. Si se formula en forma de una suspensión o fluidización, la
concentración del ingrediente activo en la formulación es
preferiblemente de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 99%
en peso (p/p), preferiblemente 5 - 40%.
Como se ha mencionado anteriormente, pueden
incorporarse otros ingredientes inactivos o inertes convencionales
a la formulación. Dichos ingredientes inertes incluyen aunque sin
limitación: agentes adherentes convencionales, agentes de
dispersión tales como metilcelulosa (Methocel A15LV o Methocel A15C,
por ejemplo, sirven como agentes dispersantes/adherentes combinados
para uso en tratamientos de semillas), alcohol polivinílico (por
ejemplo, Elvanol 51 - 05), lecitina (por ejemplo, Yelkinol P),
dispersantes poliméricos (por ejemplo, polivinilpirrolidona/acetato
de vinilo PVP/VA S-630), espesantes (por ejemplo,
espesantes de arcilla, tales como Van Gel B para mejorar la
viscosidad y reducir el depósito de suspensiones de partículas),
estabilizantes de emulsión, tensioactivos, compuestos
anticongelantes (por ejemplo, urea), tintes, colorantes, y
similares. Otros ingredientes inertes útiles en la presente
invención pueden encontrarse en el vol. 1 de McCutcheon
"Emulsifiers and Detergents", MC Publishing Company,
Glen Rock, New Jersey, U.S.A., 1996. Pueden encontrarse ingredientes
inertes adicionales útiles en la presente invención el vol. 2 de
McCutcheon, "Functional Materials", MC Publishing
Company, Glen Rock, New Jersey, U.S.A., 1996.
Los pesticidas y formulaciones de pesticidas de
la presente invención pueden aplicarse a semillas mediante
cualquier metodología de tratamiento de semillas convencional,
incluyendo aunque sin limitación, mezclado en un recipiente (por
ejemplo, un frasco o bolsa), aplicación mecánica, volteado,
pulverización, e inmersión. Puede usarse cualquier material activo
o inerte convencional para poner en contacto semillas con pesticidas
de acuerdo con la presente invención, tales como materiales de
formación de películas de revestimiento convencionales incluyendo
aunque sin limitación materiales formadores de películas de
revestimiento basados en agua tales como Sepiret (Seppic, Inc.,
Fairfield, NJ) y Opacoat (Berwind Pham. Services, Westpoint,
PA).
Los presentes pesticidas pueden aplicarse a una
semilla en forma de componentes de un revestimiento de semillas.
Los procedimientos de revestimiento de semillas y composiciones que
se conocen en la técnica son útiles cuando se modifican mediante la
adición de una o más de las realizaciones de la combinación de
pesticidas de la presente invención. Dichos procedimientos de
revestimiento y aparatos para su aplicación se describen por ejemplo
en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.918.413, 5.891.246,
5.554.445, 5.389.399, 5.107.787, 5.080.925, 4.759.945 y 4.465.017.
Las composiciones de revestimiento de semillas se describen por
ejemplo en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.939.356, 5.882.713,
5.876.739, 5.849.320, 5.834.447, 5.791.084, 5.661.103, 5.622.003,
5.580.544, 5.328.942, 5.300.127, 4.735.015, 4.634.587, 4.383.391,
4.372.080, 4.339.456, 4.272.417 y 4.245.432, entre otras.
Los revestimientos de semillas útiles contienen
uno o más aglutinantes y al menos una de las presentes combinaciones
de pesticidas.
Los aglutinantes que son útiles en la presente
invención comprenden preferiblemente un polímero adhesivo que puede
ser natural o sintético y sin efecto fitotóxico sobre la semilla a
revestir. El aglutinante puede seleccionarse entre acetatos de
polivinilo; copolímeros de acetato de polivinilo; copolímeros de
acetato de etilenvinilo (EVA); alcoholes polivinílicos; copolímeros
de alcoholes polivinílicos; celulosas, incluyendo etilcelulosas,
metilcelulosas, hidroximetilcelulosas, hidroxipropilcelulosas, y
carboximetilcelulosa; polivinilpirrolidona; polisacáridos,
incluyendo almidón, almidón modificado, dextrinas, maltodextrinas,
alginato y chitosan; grasas; aceites; proteínas, incluyendo
gelatina y zeinas; gomas arábigas; gomas shellac; cloruro de
vinilideno y copolímeros de cloruro de vinilideno; lignosulfonatos
de calcio; copolímeros acrílicos; polivinilacrilatos; óxido de
polietilieno; polímeros y copolímeros de acrilamida; acrilato de
polihidroxietilo, monómeros de metilacrilamida; y
policloropreno.
Se prefiere que el aglutinante se seleccione de
modo que pueda servir como una matriz para los pesticidas objeto.
Aunque los aglutinantes descritos anteriormente pueden todos ser
útiles en forma de matriz, el aglutinante específico dependerá de
las propiedades de la combinación de pesticidas. La expresión
"matriz", como se usa en este documento, significa una fase
sólida continua de uno o más compuestos aglutinantes por toda la
cual se distribuye en forma de una fase discontinua uno o más de
los pesticidas objeto. Opcionalmente, también pueden estar
presentes en la matriz una carga y/o otros componentes. Debe
entenderse que la expresión matriz incluye lo que puede verse como
un sistema matriz, un sistema de reserva o un sistema
microencapsulado. En general un sistema de matriz está constituido
por pesticidas de la presente invención y cargas dispersas
uniformemente dentro de un polímero, mientras que un sistema de
reserva está constituido por una fase diferente que comprende los
presentes pesticidas, que está dispersa físicamente dentro de una
fase polimérica limitante de la velocidad que la rodea. La
microencapsulación incluye el revestimiento de pequeñas partículas o
gotas de líquido, pero también dispersiones en una matriz
sólida.
La cantidad de aglutinante en el revestimiento
puede variar, pero estará en el intervalo de aproximadamente el
0,01 a aproximadamente el 25% del peso de la semilla, más
preferiblemente de aproximadamente el 0,05 a aproximadamente el
15%, y aún más preferiblemente de aproximadamente el 0,1% a
aproximadamente el 10%.
Como se ha mencionado anteriormente, la matriz
puede incluir opcionalmente una carga. La carga puede ser una carga
absorbente o inerte, tal como se conocen en la técnica, y muchas
incluyen harinas de madera, arcillas, carbón activado, azúcares,
tierra de diatomeas, harinas de cereales, sólidos inorgánicos de
textura fina, carbonato cálcico, y similares. Las arcillas y
sólidos inorgánicos, que pueden usarse, incluyen bentonita de
calcio, caolina, arcilla china, talco, perlita, mica, vermiculita,
sílices, polvo de cuarzo, montmorillonita y mezclas de las mismas.
Los azúcares, que pueden ser útiles, incluyen dextrina y
maltodextrina. Las harinas de cereales incluyen harina de trigo,
harina de avena, y harina de cebada.
La carga se selecciona de modo que proporcionará
un microclima adecuado para la semilla, por ejemplo, la carga se
usa para aumentar la tasa de carga de los ingredientes activos para
ajustar el control - liberación de los ingredientes activos. La
carga puede ayudar en la producción o procedimiento de revestimiento
de la semilla. La cantidad de carga puede variar, pero generalmente
el peso de los componentes de la carga estará en el intervalo de
aproximadamente el 0,05 a aproximadamente el 75% del peso de la
semilla, más preferiblemente de aproximadamente el 0,1 a
aproximadamente el 50%, y aún más preferiblemente de aproximadamente
el 0,5% al 15%.
Los pesticidas que son útiles en el
revestimiento son los pesticidas que se describen en este documento.
La cantidad de pesticida que se usa para el tratamiento de la
semilla variará dependiendo del tipo de semilla y el tipo de
ingredientes activos, pero el tratamiento comprenderá poner en
contacto las semillas con una cantidad de la combinación de
pesticidas que sea eficaz como pesticida. Cuando los insectos son la
plaga diana, esta cantidad será una cantidad del insecticida que
sea eficaz como insecticida. Como se usa en este documento, una
cantidad eficaz como insecticida significa esa cantidad de
insecticida que matará plagas de insectos en la etapa de
crecimiento larvaria o pupal, o reducirá o retardará
sistemáticamente la cantidad de daño producida por plagas de
insectos.
En general, la cantidad de clotianidina que se
aplica a la semilla en el tratamiento variará de aproximadamente 10
g a aproximadamente 2000 g del ingrediente activo del pesticida por
100 kg del peso de la semilla. Preferiblemente, la cantidad de
pesticida estará en el intervalo de aproximadamente 50 g a
aproximadamente 1000 g de ingrediente activo por 100 kg de
semillas, más preferiblemente dentro del intervalo de
aproximadamente 100 g a aproximadamente 600 g de ingrediente activo
por 100 kg de semillas, y aún más preferiblemente dentro del
intervalo de aproximadamente 200 g a aproximadamente 500 g de
ingrediente activo por 100 kg de peso de semillas. Como alternativa,
se ha descubierto que se prefiere que la cantidad del pesticida
esté por encima de aproximadamente 60 g del ingrediente activo del
pesticida por 100 kg de la semilla, y más preferiblemente por encima
de aproximadamente 80 g por 100 kg de semillas.
El pesticida que se usa en el tratamiento no
debe inhibir la germinación de la semilla y debe ser eficaz
protegiendo la semilla y/o la planta durante el tiempo en el ciclo
vital del insecto diana en el que éste causa daño a la semilla de
la planta. En general, el revestimiento será eficaz durante
aproximadamente 0 a 120 días después de la siembra.
El pesticida de la presente invención puede
aplicarse a la semilla en forma de un revestimiento. El uso de un
revestimiento es particularmente eficaz para alojar grandes cargas
de pesticida, como puede requerirse para tratar plagas típicamente
refractarias, tales como el gusano de la raíz del maíz, mientras que
previene al mismo tiempo fitotoxicidad inaceptable debida a la
carga de pesticida aumentada.
Opcionalmente, puede usarse un plastificante en
la formulación de revestimiento. Los plastificantes se usan
típicamente para hacer más flexible a la película formada por la
capa de revestimiento, para mejorar la adhesión y propagabilidad, y
para mejorar la velocidad del procesado. La flexibilidad de la
película mejorada es importante para minimizar la formación de
gravilla, rotura o desconchado durante los procedimientos de
almacenamiento, manejo, o siembra. Pueden usarse muchos
plastificantes, sin embargo, los plastificantes útiles incluyen
polietilenglicol, glicerol, ftalato de butilbencilo, benzoatos de
glicol y compuestos relacionados. La tasa de plastificante en la
capa de revestimiento estará en el intervalo de aproximadamente el
0,1 a aproximadamente el 20% en peso.
Cuando el pesticida usado en el revestimiento es
una formulación de tipo aceitoso y está presente poca o ninguna
carga, puede ser útil acelerar el procedimiento de secado secando la
formulación. Esta etapa opcional puede realizarse por medios bien
conocidos en la técnica y puede incluir la adición de carbonato
cálcico, caolina o arcilla bentonita, perlita, tierra de diatomeas,
o cualquier material absorbente que se añade preferiblemente de
forma concurrente con la capa de revestimiento pesticida para
absorber el aceite o el exceso de humedad. La cantidad de carbonato
cálcico o compuestos relacionados necesaria para proporcionar
eficazmente un revestimiento seco estará en el intervalo de
aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 10% del peso de la
semilla.
Los revestimientos formados con el pesticida son
preferiblemente del tipo que son capaces de realizar una tasa de
liberación lenta del pesticida mediante difusión o movimiento a
través de la matriz al medio que la rodea.
Además de la capa de revestimiento, la semilla
puede tratarse con uno o más de los siguientes ingredientes: otros
pesticidas incluyendo fungicidas y herbicidas; herbicidas curativos;
fertilizantes y/o agentes de biocontrol. Estos ingredientes pueden
añadirse en forma de una capa diferente o como alternativa pueden
añadirse en la capa de revestimiento de pesticida.
La formulación de pesticida puede aplicarse a
las semillas usando técnicas y máquinas de revestimiento
convencionales, tales como técnicas de lechos fluidizados, el
procedimiento del molino de rodillos, tratadores de semillas
rotoestáticos, y revestidores de bidones. Otros procedimientos,
tales como lechos de borboteo también pueden ser útiles. Las
semillas pueden clasificarse por tamaños previamente antes del
revestimiento. Después del revestimiento, las semillas típicamente
se secan y se transfieren a una máquina clasificadora por tamaños
para la clasificación por tamaños. Dichos procedimientos se conocen
en la técnica.
Las semillas tratadas con pesticida también
pueden envolverse con una película de sobrerrevestimiento para
proteger el revestimiento de pesticida. Dichos sobrerrevestimientos
se conocen en la técnica y pueden aplicarse usando técnicas
convencionales de lecho fluidizado y revestimiento con películas de
bidón.
En otra realización de la presente invención, un
pesticida puede introducirse sobre o dentro de una semilla mediante
el uso de cebado de una matriz sólida. Por ejemplo, puede mezclarse
una cantidad del pesticida con un material de matriz sólida y
después la semilla puede ponerse en contacto con el material de
matriz sólida durante un periodo para permitir que el pesticida se
introduzca en la semilla. La semilla puede separase opcionalmente
del material de matriz sólida y almacenarse o usarse, o la mezcla de
material de matriz sólida más la semilla puede almacenarse o
plantarse directamente. Los materiales de matriz sólida que son
útiles en la presente invención incluyen poliacrilamida, almidón,
arcilla, sílice, alúmina, tierra, arena, poiliurea, poliacrilato, y
cualquier otro material capaz de absorber o adsorber el pesticida
durante un tiempo y liberar este pesticida dentro de o sobre la
semilla. Es útil asegurarse de que el pesticida y el material de
matriz sólida son compatibles entre sí. Por ejemplo, el material de
matriz sólida debe elegirse de modo que pueda liberar el pesticida a
una tasa razonable, por ejemplo durante un periodo de minutos,
horas, o días.
La presente invención abarca además inhibición
como otro procedimiento para tratar semillas con el pesticida. Por
ejemplo, la semilla de la planta puede combinarse durante un periodo
de tiempo con una solución que comprende de aproximadamente el 1%
en peso a aproximadamente el 75% en peso del pesticida en un
disolvente tal como agua. Preferiblemente la concentración de la
solución es de aproximadamente el 5% en peso a aproximadamente el
50% en peso, más preferiblemente de aproximadamente el 10% en peso a
aproximadamente el 25% en peso. Durante el periodo en que la
semilla se combina con la solución, la semilla capta (se empapa de)
una porción del pesticida. Opcionalmente, la mezcla de semilla de
la planta y solución puede agitarse, por ejemplo sacudiéndola,
girándola, volteándola, o por otros medios. Después del empapado,
la semilla puede separarse de la solución y opcionalmente secarse,
por ejemplo, mediante golpecitos o secado al aire.
En otra realización más, un pesticida en polvo
puede mezclarse directamente con la semilla. Opcionalmente, puede
usarse un agente adherente para adherir el polvo a la superficie de
la semilla. Por ejemplo, puede mezclarse una cantidad de semillas
con un agente adherente y agitarse opcionalmente para fomentar el
revestimiento uniforme de la semilla con el agente adherente. La
semilla revestida con el agente adherente puede mezclarse después
con el pesticida en polvo. La mezcla puede agitarse, por ejemplo
volteándola, para fomentar el contacto del agente adherente con el
pesticida en polvo, provocando de este modo que el pesticida en
polvo se adhiera a la semilla.
La presente invención proporciona también una
semilla transgénica de maíz que se ha tratado con un pesticida
mediante el procedimiento descrito anteriormente.
Las semillas tratadas de la presente invención
pueden usarse para la propagación de plantas de maíz de la misma
manera que semillas de maíz tratadas convencionales. Las semillas
tratadas pueden almacenarse, manejarse, sembrarse y cultivarse de
la misma manera que cualquier otra semilla tratada con pesticida.
Deben tomarse medidas de seguridad apropiadas para limitar el
contacto de la semilla tratada con seres humanos, comida o
materiales alimenticios, agua y aves o animales salvajes o
domésticos.
En los siguientes ejemplos se describen
realizaciones preferidas de la invención. Otras realizaciones dentro
del alcance de las reivindicaciones en este documento serán
evidentes para un especialista en la técnica a partir de la
consideración de la memoria descriptiva o la práctica de la
invención como se ha descrito en este documento. Se pretende que la
memoria descriptiva, junto con los ejemplos, se consideré solamente
ejemplar, con el alcance y espíritu de la invención estando
indicado por las reivindicaciones que siguen a los ejemplos.
Los siguientes ejemplos describen realizaciones
preferidas de la invención. Otras realizaciones dentro del alcance
de las reivindicaciones en este documento serán evidentes para un
especialista en la técnica a partir de la consideración de la
memoria descriptiva o la práctica de la invención como se ha
descrito en este documento. Se pretende que la memoria descriptiva,
junto con los ejemplos, se consideré solamente ejemplar, con el
alcance y espíritu de la invención estando indicado por las
reivindicaciones que siguen a los ejemplos. En los ejemplos todos
los porcentajes se dan en base al peso a menos que se indique otra
cosa.
Ejemplo
1
Las semillas de maíz se prepararon para expresar
la endotoxina de Bacillus thuringiensis Cry3Bb.11231 mediante
el procedimiento descrito en el documento WO 99/31248 o la Patente
de Estados Unidos N 6.023.013
Las semillas de maíz de las mismas especies
híbridas, con y sin el suceso transgénico se trataron con
clotianidina en agua como un vehículo y aplicando la formulación
durante un minuto a temperatura ambiente hasta un peso medido de
semillas de maíz en un tratador de semillas rotoestático. Los pesos
respectivos de la preparación de pesticida y la semilla de maíz se
calcularon para proporcionar la tasa deseada de tratamiento de
pesticida en la semilla. El pesticida se mezcló en agua suficiente
para permitir la distribución eficaz de la formulación a todas las
semillas en el lote mientras se minimizaba la pérdida de formulación
de tratamiento debida a la falta de captación de la formulación por
las semillas. Las semillas tratadas se dejaron sin tapar durante al
menos cuatro horas antes de plantarlas.
Ejemplo
2
Ensayos de campo para la determinación de la
eficacia del suceso transgénico Cry3Bb.11231 en semillas de maíz en
combinación con tratamientos de semillas con clotianidina contra el
gusano de la raíz del maíz del oeste y del norte.
Se realizó un ensayo de campo de acuerdo con los
protocolos pertinentes y en conformidad con los requisitos de
notificación del USDA. El fin del ensayo era determinar la eficacia
del suceso transgénico Cry3Bb.11231 en semillas de maíz en
combinación con tratamientos de semillas contra el gusano de la raíz
del maíz usando clotianidina.
Para cada sitio de cultivo que se seleccionó, el
diseño del terreno incluía lo siguiente:
- Separación de las hileras:
- 30 pulgadas (76,20 cm)
- Tamaño del terreno:
- 1 hilera x 20 pies (6,10 m)
- Densidad de plantado:
- 1,5 - 2, semillas/pie (0,30 m), dependiendo del lugar
- Híbrido usado:
- MO17XA1
- Réplicas:
- 4
- Diseño:
- Bloque completo al azar
- Lugares:
- 5
- Fuente de larvas:
- infestaciones naturales suplementadas mediante infestación artificial de huevos de gusano de la raíz del maíz a 1200 huevos/pie (etapa de crecimiento V2)
Se usaron las siguientes combinaciones de
tratamientos de semillas para cada área de crecimiento:
Todos los tratamientos de semillas con
pesticidas se realizaron como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las
semillas que recibieron los tratamientos número 1 y 2 no tuvieron
tratamiento con pesticida que se podría esperar fuera eficaz contra
el gusano de la raíz del maíz.
Para las semillas que tenían los tratamientos
numerados del 3 al 7, los pesticidas se aplicaron mediante los
procedimientos descritos en el Ejemplo 1. En el tratamiento de
semillas número 8 se aplicó Force® 3G disponible en el mercado al
suelo en una banda de 5'' (12,70 cm) en el momento de la siembra.
Los niveles de aplicación son como se muestran y están dentro de
los intervalos recomendados para la práctica comercial
convencional.
Las semillas de maíz a ensayar se plantaron y
cultivaron en cinco lugares diferentes a través de los estados del
medio oeste en el cinturón del maíz de los Estados Unidos de acuerdo
con el protocolo descrito anteriormente.
La determinación del daño por el gusano de la
raíz del maíz se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo. En
la etapa Vt - R1, se realizó una evaluación del daño por el gusano
de la raíz del maíz mediante procedimientos que se conocen bien en
la industria, y el daño por gusano de la raíz del maíz se presentó
de acuerdo con el sistema de valoración de 1 - 6 de Iowa. En ese
sistema, se recuperan los sistemas radiculares de 10 plantas de
maíz por terreno y se valoran usando la escala de valoración 1 - 6,
donde: 1 = ningún daño o solamente unas pocas marcas menores de
alimentación; 2 = daño de alimentación evidente pero ninguna raíz
comida hasta 1 pulgada y media (3,81 cm) de la planta; 3 = al menos
una raíz comida hasta 1 pulgada y media (3,81 cm) de la planta,
pero nunca un nudo completo de raíces destruido; 4 = un nudo de
raíces comido hasta 1 pulgada y media (3,81 cm) de la planta; 5 =
dos nudos (círculos) de raíces completamente comidos hasta 1 pulgada
y media (3,81 cm) de la planta; y 6 = tres nudos (círculos) de
raíces completamente comidos hasta 1 pulgada y media de la planta
(3,81 cm).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos mostraron que tanto el suceso
transgénico como la clotianidina proporcionaron algún nivel de
protección contra el daño por gusano de la raíz del maíz. En los
niveles más altos de daño (es decir, niveles 4 - 6), el suceso
transgénico sufría el 14,5% del daño del control no transgénico. Por
lo tanto, se considera que el suceso Cry3Bb.11231 está dentro de un
intervalo de eficacia preferido.
La clotianidina fue eficaz contra el daño por
gusano de la raíz del maíz a todos los niveles ensayados, pero la
eficacia de la clotianidina a todos los niveles era menor que la
eficacia del suceso transgénico en solitario. Todas las
combinaciones de tratamiento con clotianidina de la semilla
transgénica fueron más eficaces contra el daño por gusano de la
raíz que cualquier tratamiento con pesticida en solitario o el
suceso transgénico en solitario. La combinación de Cry3Bb.11231 con
clotianidina a 300 g/100 kg de semillas proporcionó esencialmente
la misma protección que el tratamiento comercial convencional de
4,25 g de FORCE® 3G por 100 pies (30,48 m) de hilera aplicado como
una banda de superficie al plantar. El tratamiento de semillas
transgénicas con solamente 100 g/100 kg de clotianidina proporcionó
casi el mismo nivel de protección.
Las ventajas del presente tratamiento de
semillas transgénicas con clotianidina incluyen la simplificación
del plantado, retirando la necesidad de aplicación por separado del
pesticida. Además, plantar es más fácil y seguro, puesto que el
agricultor no tiene que manejar un pesticida concentrado.
\newpage
Se ensayó la posible sinergia en las
combinaciones de tratamiento de semillas con clotianidina con
semillas de maíz que tienen un suceso transgénico CryBb.11231 a
tres niveles de daño por gusano de la raíz. En el primer ensayo,
mostrado en la Tabla 2(a), se determinó el porcentaje de
plantas de ensayo que tenían niveles de daño de 3 a 6, en la escala
1 - 6 de Iowa, para el control y para semillas tratadas con el
pesticida a dos niveles, y para semillas que tenían el suceso
transgénico, en solitario o en combinación. Se usó después la
siguiente fórmula para calcular un "umbral de sinergia":
(% de
Cry3Bb.11231 de control)*(% de tratamiento clotianidina de control)/
100.
Este umbral se comparó con el porcentaje de
control para las combinaciones de tratamiento (es decir,
Cry3Bb.11231 con clotianidina a 100 g/100 kg y Cry3Bb.11231 con
clotianidina a 300 g/100 kg). Si el porcentaje de la combinación de
tratamiento de control estaba por debajo del umbral, entonces se
concluía que había sinergia. Si el porcentaje de la combinación de
tratamiento de control estaba por encima del umbral, entonces se
concluía que la sinergia no estaba demostrada para esa combinación.
Este cálculo se repitió para los niveles de daño 4 - 6 y 5 - 6, y
los resultados de los cálculos se muestran en las tablas 2(b)
y 2(c).
Se creía que la medida del daño por gusano de la
raíz en los niveles más altos (es decir, niveles 3 - 6, niveles 4 -
6 y niveles 5 y 6) es un indicador útil que se correlaciona con la
pérdida de producción subsiguiente debida a dicho daño. La razón
para esto es que el daño por gusano de la raíz en los niveles 1 y 2
rara vez provoca que las plantas de maíz caigan y se queden en el
suelo, y no se cree que esa mínima pérdida de raíz reduzca la
cantidad o el peso de granos por espiga. Sin embargo, el daño a la
raíz en los niveles 3 y superiores provoca cada vez más caída y
pérdida de producción. Por lo tanto, se cree que los niveles de daño
3 - 6, 4 - 6 y 5 - 6 sumados, proporcionan una indicación útil del
efecto del daño por gusano de la raíz del maíz sobre la
subsiguiente producción de
maíz.
maíz.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este análisis indicaba que la combinación del
suceso transgénico de maíz Cry3Bb.11231 con tratamiento de semillas
con clotianidina a 100 g/100 kg o a 300 g/100 kg era sinérgica e
inesperadamente eficaz contra el daño por el gusano del maíz en el
nivel 3 - 6. En el nivel de daño 4 - 6, ningún nivel de clotianidina
con el suceso transgénico indicaba sinergia, aunque la combinación
del nivel más bajo del tratamiento de clotianidina (100 g/100 kg de
semillas) mostró un nivel de protección que se aproximaba al
necesario para mostrar sinergia. En el nivel de daño 5 - 6, la
combinación del nivel más bajo de tratamiento de clotianidina (100
g/100 kg de semillas) con el suceso Cry3Bb.11231 indicaba sinergia,
mientras que la combinación en el nivel más alto de clotianidina
no. Sin embargo, el daño en el nivel 5 - 6 era muy bajo para
cualquiera de las combinaciones que se ensayaron, y estaba muy por
debajo del sufrido por maíz no transgénico tratado con formación de
bandas de superficie (aproximadamente el 5,6% del daño en los
niveles 5 - 6).
Por consiguiente, se concluyó que la combinación
del suceso transgénico con el tratamiento de semillas con
clotianidina proporcionó ventajas significativas sobre el uso de
cualquier procedimiento en solitario, y que dicha protección era
inesperadamente superior en eficacia contra daños graves por gusano
de la raíz del maíz.
Claims (19)
1. Un procedimiento para proteger una planta
transgénica de maíz contra daño por alimentación por una plaga de
Coleópteros, comprendiendo el procedimiento
proporcionar una semilla para la planta de maíz
transgénica, semilla que comprende un suceso transgénico que
codifica la expresión de una \delta-endotoxina
Cry3B que tiene actividad contra una plaga de Coleópteros; y
tratar la semilla con una cantidad de
clotianidina que, en combinación con el suceso transgénico, es
eficaz para proteger una planta de maíz que crece a partir de la
semilla de maíz contra daño por alimentación por la plaga de
Coleópteros en un grado mayor que el que se esperaría debido a la
clotianidina o al suceso transgénico en solitario.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la proteína Cry3B es una
\delta-endotoxina modificada que tiene
sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en comparación
con las proteínas producidas por un Bacillus thuringiensis
de tipo silvestre (una proteína Cry3B*).
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que la proteína Cry3B* se selecciona entre
el grupo constituido por Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11232,
Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11234, Cry3Bb.11235, Cry3Bb.11236,
Cry3Bb.11237, Cry3Bb.11238, Cry3Bb.11239, Cry3Bb.11241,
Cry3Bb.11242, y Cry3Bb.11098.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que la proteína Cry3B* es Cry3Bb.11231.
5. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que la proteína Cry3B* es Cry3Bb.11098.
6. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la semilla que tiene la capacidad de
expresar la proteína Cry 3B tiene también la capacidad de expresar
al menos una otra proteína insecticida que es diferente de una
proteína Cry 3B.
7. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la semilla que tiene la capacidad de
expresar la proteína Cry 3B tiene también el suceso transgénico que
proporciona tolerancia a herbicidas.
8. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el suceso transgénico proporciona
tolerancia a herbicidas contra glifosato.
9. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el insecto es una Diabrotica
spp.
10. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que el insecto comprende al menos un miembro
seleccionado entre el grupo constituido por Diabrotica
virgifera, Diabrotica barberi y Diabrotica
undecimpunctata.
11. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la cantidad eficaz de clotianidina es de al menos
aproximadamente 10 gramos a aproximadamente 2000 gramos del
ingrediente activo pesticida por 100 kilogramos de la semilla.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que la cantidad eficaz de clotianidina es de al menos
aproximadamente 70 gramos a aproximadamente 1000 gramos del
ingrediente activo pesticida por 100 kilogramos de la semilla.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que la cantidad eficaz de clotianidina es de al menos
aproximadamente 100 gramos a aproximadamente 600 gramos del
ingrediente activo pesticida por 100 kilogramos de la semilla.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que la cantidad eficaz de clotianidina es de al menos
aproximadamente 200 gramos a aproximadamente 500 gramos del
ingrediente activo pesticida por 100 kilogramos de la semilla.
15. Una semilla de una planta transgénica de
maíz que proporciona resistencia aumentada a la planta de maíz
resultante contra daño por alimentación por una plaga de
coleópteros, comprendiendo la semilla un suceso transgénico que
codifica la expresión de una \delta-endotoxina
Cry3B que tiene actividad contra una plaga de Coleópteros, en la
que la semilla se ha tratado con clotianidina en una cantidad de al
menos 10 gramos a 2000 gramos de ingrediente activo pesticida por
100 kilogramos de la semilla.
16. La semilla de acuerdo con la reivindicación
15, en la que el suceso transgénico comprende un gen que codifica
una proteína Cry3 obtenida de Bacillus thuringiensis.
17. La semilla de acuerdo con la reivindicación
16, en la que el suceso transgénico comprende un gen que codifica
una proteína Cry3Bb obtenida de Bacillus thuringiensis.
18. La semilla de acuerdo con la reivindicación
17, en la que el suceso transgénico comprende un gen que codifica
una proteína seleccionada entre una proteína Cry3Bb.11230,
Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11232, Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11234,
Cry3Bb.11235, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb.11238,
Cry3Bb.11239, Cry3Bb.11241,
Cry3Bb.11242, y Cry3Bb.11098 obtenida de Bacillus thuringiensis.
Cry3Bb.11242, y Cry3Bb.11098 obtenida de Bacillus thuringiensis.
19. La semilla de acuerdo con la reivindicación
15, en la que la cantidad eficaz de clotianidina es de al menos
aproximadamente 200 gramos a aproximadamente 500 gramos del
ingrediente activo pesticida por 100 kilogramos de la semilla.
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