ES2268984B1 - Inoculante aseptico de micorrizacion y procedimientos de aplicacion en condiciones in vitro y ex vitro. - Google Patents
Inoculante aseptico de micorrizacion y procedimientos de aplicacion en condiciones in vitro y ex vitro. Download PDFInfo
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Abstract
Inoculante aséptico de micorrización y procedimientos de aplicación en condiciones in vitro y ex vitro. El objeto de la presente invención es un inoculante aséptico de micorrización producido in vitro y envasado y distribuido en condiciones estériles, y que por tanto resulta apto para micorrizar plantas tanto en condiciones in vitro (con aplicación en la producción viverística de plantas, especialmente en el caso de plantas micropropagadas) como ex vitro (con aplicación en la producción de plantas mediante planteras y semilleros, utilización en explotaciones agrícolas, así como en programas de revegetación de suelos). Para ello se utiliza un medio de cultivo base de tipo gelosado y semisólido, ligero, de baja viscosidad que facilita la penetración de la raíz en el inoculante, además de potenciar y preservar la infectividad del HMA. El inóculo objeto de la invención presenta numerosas ventajas frente a los inóculos comerciales ya existentes en el mercado, ya que su aplicación resulta más fácil, más rápida y más limpia, sus efectos más inmediatos, además de permitir su utilización directa en cultivos in vitro, así como la certificación continua de asepsia hasta el mismo momento de su aplicación.
Description
Inoculante aséptico de micorrización y
procedimientos de aplicación en condiciones in vitro y ex
vitro.
Agricultura ecológica, producción viverística,
revegetación. Biofertilizante natural para la mayoría de plantas de
interés económico y ecológico (horto-frutícolas,
ornamentales, utilizadas para revegetación, etc.) que aumenta su
supervivencia, vitalidad y producción, y reduce la necesidad de
aplicación de fertilizantes químicos, pesticidas y
fitosanitarios.
Las prácticas agrícolas utilizadas en los países
desarrollados han tendido, en los últimos años, hacia la
explotación intensiva de los recursos disponibles (e.g. riegos
localizados, cultivos bajo plástico, etc.) con vistas a optimizar
los rendimientos minimizando los costes tanto económicos como
medioambientales (López-Gorgé, 1991). El riesgo de
sobreexplotación derivado de estas prácticas intensivas ha dado la
voz de alarma frente al impacto negativo que sobre la calidad de
los suelos y acuíferos naturales tiene el empleo masivo, y
frecuentemente indiscriminado, de fertilizantes químicos y productos
fitosanitarios. Es por ello que va tomando cada vez mas fuerza la
denominada "agricultura sostenible" (Harwood, 1991), que se
integra dentro de un concepto mas amplio, el de los llamados
"ecosistemas sostenibles" (Jeffries y Barea, 2001). La
"sostenibilidad" se podría definir como el arte de gestionar
con éxito los recursos naturales disponibles de manera que
satisfagan las necesidades sociales, y al mismo tiempo mantengan o
aumenten la calidad del medio natural y la conservación de sus
recursos (Gianinazzi y Schüepp, 1994). El incremento continuo de la
degradación e inestabilidad medioambiental, y particularmente de la
fragilidad de los suelos naturales y agrícolas están propiciando una
progresiva concienciación sobre la necesidad de desarrollar
prácticas de utilización más racional y sostenible de los
agroecosistemas. Es precisamente en estas situaciones donde se ha
descrito la importancia fundamental de los microorganismos
rizosféricos en general, y de los simbióticos mutualistas en
particular, como estabilizadores naturales de los suelos. Entre
dichos microorganismos destacan los hongos formadores de micorrizas
arbusculares (HMA), simbiontes obligados habitantes comunes de los
suelos que establecen asociaciones mutualistas con las raíces de
mas del 80% de las plantas, y cuya importancia en la mejora
nutritiva de las plantas, así como en la superación por éstas de
todo tipo de estreses bióticos y abióticos está ampliamente
documentada (Smith y Read, 1997). Estos efectos beneficiosos son
especialmente notorios para la práctica totalidad de plantas de
interés horto-frutícola, ornamental, así como para
plantas utilizadas en programas de revegetación y recuperación de
suelos degradados.
Teóricamente la utilización extensiva de los HMA
como biofertilizantes naturales tendría enorme interés, puesto que
mejoraría en mucho el desarrollo y producción de plantas con
mínimas enmiendas agroquímicas (Mosse, 1986). De hecho los HMA han
demostrado ampliamente su eficacia incrementando la supervivencia y
producción vegetal en muchas y muy diversas plantas de alto interés
económico en ensayos científicos y a escala piloto (Gianinazzi et
al. 2002), Sin embargo, la aplicación e inoculación a gran
escala de HMA se ha visto siempre paralizada por i) la dificultad
en la obtención de un inóculo puro, ligero, libre de contaminantes
y con alta densidad de propágulos infectivos; ii) los resultados
muy variables obtenidos con los inoculantes micorrícicos hasta ahora
utilizados, producidos por un sistema "convencional" (ver
siguiente párrafo), y cuya aplicación ha de realizarse en plantas
relativamente maduras y ya preaclimatadas. En efecto, la ausencia
en el mercado de inoculantes micorrícicos asépticos hace imposible
que la planta salga micorrizada inmediatamente después del
enraizamiento in vitro y previamente a su aclimatación, en el
caso de plantas micropropagadas.
Los escasos inoculantes con base HMA existentes
hoy en día en el mercado provienen, en su inmensa mayoría, de
cultivos hongo-planta producidos en invernadero o
cámara de cultivo, y utilizan como soporte diversos tipos de
sustratos "sucios" tipo suelo, arena, atapulgita, sepiolita,
vermiculita, etc. La producción de inoculantes HMA mediante estos
métodos encuentra tres problemas fundamentales: i) bajo esas
condiciones (cultivos abiertos) es prácticamente imposible
controlar la presencia en el sustrato de microorganismos
acompañantes (generalmente indeseados) además de los HMA, lo que
dificulta la validación y controles de calidad de estos productos;
ii) la manipulación de sustratos como los arriba mencionados es
engorrosa y laboriosa, requiriendo de grandes superficies para su
preparación, alto coste de transporte en su comercialización y
dificultándose su incorporación masiva en explotaciones agrícolas a
gran escala; y iii) al retener parte del sustrato en que fueron
producidos (se trata de inóculos "brutos"), los inoculantes
arriba mencionados retienen una gran cantidad de los ya mencionados
microorganismos acompañantes, por lo que queda excluido su empleo
para la micorrización en condiciones estériles, como podría ser
deseable en el caso de la preparación de semilleros, y de plantas
obtenidas por técnicas masivas de producción (i.e. micropropagación
de plantas por cultivo in vitro).
Precisamente la técnica de micropropagación de
plantas in vitro representa en la actualidad la mejor
alternativa existente en el mercado para la clonación rápida y
producción masiva y certificada de plantas de interés
horto-frutícola. Basada en la multiplicación a gran
escala de plantas dentro de vasos de cristal que contienen medio de
cultivo estéril, la técnica consta de cinco fases: multiplicación,
elongación, enraizamiento, aclimatación y endurecimiento, debiendo
realizarse las tres primeras fases in vitro y las dos
siguientes ex vitro. Como se deduce de lo expuesto
anteriormente, en la actualidad la introducción de inoculantes
micorrícicos en plantas micropropagadas sólo puede realizarse en la
fase de aclimatación o endurecimiento (es decir, ex vitro;
e.g. Estrada-Luna et al. 2000; Marin et
al. 2003), ya que esos inoculantes proceden de condiciones no
estériles que impiden su introducción en las fases in vitro
anteriores. Esto supone un gran retraso en la introducción de la
micorriza, y un estrés añadido a la planta micropropagada, que
además de tener que adaptarse a las nuevas y duras condiciones
externas, debe soportar el drenaje de carbono que le demanda el
HMA, inicialmente importante hasta que el equilibrio simbiótico
queda establecido (Bago et al. 2000).
Se hace necesario, por tanto, encontrar
soluciones técnicas que permitan micorrizar plantas tanto al inicio
del semillero (producción de plantas ex vitro), o bien antes
de la fase de aclimatación (plantas micropropagadas, producción
in vitro), es decir, poder diseñar un inoculo estéril de HMA
que compatibilice micorrización y enraizamiento. De esta manera se
disminuiría el estrés y las consiguientes pérdidas que se producen
durante la fase de aclimatación de las plantas (se han fijado en
hasta un 60% en el caso de micropropagadas) al medio natural.
Además, la formación de la micorriza a tan temprana edad supondría
la producción de plantas preparadas ("vacunadas") para
resistir otros tipos de estreses bióticos y abióticos, con la
consiguiente reducción en el uso de fitosanitarios; y minimizaría
los retrasos en el establecimiento de la micorriza, principal
determinante de la alta variabilidad obtenida en los resultados de
campo, que dependen en gran medida del porcentaje de éxito en el
establecimiento de la simbiosis. Por último, el transplante a medio
natural de plantas pre-micorrizadas haría a éstas
mas competitivas a la hora de adquirir nutrientes del medio
natural, con los consiguientes beneficios en términos de reducción
de aplicación fertilizantes químicos y/o adaptación a suelos pobres
o degradados.
En 1975 se ideó un sistema de
co-cultivo in vitro de raíces de plantas y
HMA (Mosse y Hepper, 1975), más tarde desarrollado y patentado
(Mugnier y Mosse, 1987; FR-2528865). Este sistema,
conocido en la actualidad como "cultivo monoxénico de micorrizas
arbusculares" (CMMA) (Williams, 1992; Bago, 1998), consiste en
co-cultivar en condiciones estériles explantos de
raíz in vitro ("root organ cultures", ROC), junto con
propágulos de HMA aislados del suelo y esterilizados en superficie.
En estas condiciones controladas HMA y ROC establecen la simbiosis
micorrícica produciendo como consecuencia de ello, un gran número
de propágulos fúngicos (esporas de resistencia, trozos de raíz
micorrizada, micelio extrarradical) in vitro (Bago y Cano,
2005). Esta técnica ha sido después modificada en diversas
ocasiones (Declerck et al. 2005), dando lugar a diversas
patentes mas recientes: obtención de propágulos HMA en ausencia
física de la raíz utilizando compartimentos de medio
(St-Arnaud et al, 1996;
US-5554530); la replicación como material de partida
de trozos de raíz micorrizada conteniendo vesículas de HMA (Strullu
y Romand, 1987; FR-2568094); y el establecimiento de
micorrizas in vitro utilizando células vegetales
indiferenciadas (callos vegetales, WO2005000008). Sin embargo,
ninguna de las patentes o productos arriba mencionados se ha
comercializado o se comercializa en el presente en CONDICIONES
ESTERILES, siendo la producción del HMA in vitro sólo un
sistema de producción a gran escala de propágulos HMA que, en el
procesado pre-venta, se diluyen con sustratos no
estériles. Con esto se pierde una de las ventajas fundamentales de
estos productos, que siguen sin poder ser aplicados en condiciones
asépticas en la cadena viverística de producción de plantas. El
único intento de micorrizar plantas micropropagadas en condiciones
in vitro (Elmeskaoui et al. 1995) se llevó a cabo
utilizando un medio de cultivo sólido en el que se superponían
plantas cuyas raíces iban envueltas en cilindros de celulosa, lo
que dificultaba su crecimiento y reducía de manera importante el
contacto de la raíz con el inoculante.
La presente invención aprovecha el potencial del
cultivo monoxénico mejorándolo hasta diseñar un inoculante aséptico
apto para micorrizar plantas en fase de enraizamiento, tanto en
condiciones in vitro (producción viverística) como ex
vitro (desde planteras o semilleros hasta explotaciones
agrícolas y revegetación de suelos degradados). Para ello utiliza
un medio de cultivo base de tipo gelosado y semisólido, ligero, de
baja viscosidad que facilita la penetración de la raíz en el
inoculante, además de potenciar la infectividad del HMA. El inóculo
objeto de la presente invención presenta además numerosas ventajas
frente a los inóculos comerciales ya existentes en el mercado, ya
que su aplicación resulta más fácil, más rápida y más limpia,
además de permitir la certificación de asepsia hasta el mismo
momento de su aplicación.
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Tal como se ha mencionado anteriormente, sería
conveniente disponer de un inóculo estéril de HMA para micorrizar
planta eficazmente, que se mantenga aséptico hasta por lo menos el
momento de su aplicación. La presente invención describe un
inoculante de micorrización producido in vitro de
consistencia semisólida, con un alto contenido en propágulos de
HMA, con alta infectividad y capacidad de colonización de las
raíces, para micorrizar planta tanto in vitro como ex
vitro, que garantiza sus condiciones asépticas hasta el mismo
momento de su aplica-
ción.
ción.
Constituye, por tanto, un objeto de la presente
invención un inoculante de micorrización producido in vitro
de consistencia semisólida y viscosidad baja (inferior a 2700
centipoises/minuto). Dicho inoculante puede originarse a partir de
cultivos monoxénicos o polixénicos de micorrizas que se mantiene en
condiciones asépticas al menos hasta el mismo momento de su
aplicación. El inoculante comprende al menos un hongo
endomicorrícico arbuscular (HMA), perteneciente a distintas
familias de hongos (Glomeraceae, Gigasporaceae, Acaulosporaceae,
Archaeosporaceae, Paraglomaceae, etc.), pudiendo comprender también
una combinación de dos o más hongos endomicorrícicos y otros
microorganismos beneficiosos del suelo. Dichos hongos micorrícicos
pueden provenir de zonas con características ecofisiológicas
similares a la de aplicación final, o bien haber sido
específicamente aislados de la misma zona en la que se van a
reintroducir.
El contenido medio de propágulos de HMA
(esporas, raíces micorrizadas y micelio extrarradical) es muy alto,
al menos 500 propágulos/mL, preferentemente entre 2000 y 5000
propágulos/mL, con una gran infectividad (hasta un 20% de
colonización MA (micorrizas arbusculares) en las raíces inoculadas
a las dos semanas de su aplicación).
El inoculante objeto de la invención puede
presentarse en forma de polvo deshidratado y mezclado con sustratos
inertes habitualmente utilizados en el cultivo viverístico de
plantas. Asimismo el inoculante puede constituir un medio aséptico
de micorrización que presente una, dos o más fases de distintas
características.
Otro aspecto de la presente invención es la
utilización del inoculante descrito anteriormente para micorrizar
plantas in vitro (plantas micropropagadas durante o
inmediatamente después de su fase de enraizamiento, y antes de la
fase de aclimatación), y ex vitro (plantas micropropagadas
durante la fase de aclimatación, y semilleros, alvéolos, plantones,
plantas de vivero o cualquier otra planta obtenible a partir de
técnicas convencionales viverísticas).
Otro aspecto de la invención incluye la
aplicación del inóculo junto con el agua de riego, al mismo tiempo
que la siembra de semillas, y/o tras la siembra de semillas
mediante riego por goteo, camiones de riego o aspersores. Igualmente
la aplicación del inóculo puede realizarse tanto en semilleros
estándar o semilleros hidropónicos, como en explotaciones
agrícolas.
Las plantas susceptibles de ser micorrizadas con
el presente inóculo son, entre otras, plantas leñosas, arbustivas,
de interés hortofrutícola, ornamentales, flores, vid, plantas
aromáticas, plantas medicinales, leguminosas, etc.
Otro aspecto de la presente invención es la
utilización del inoculante para recuperación y restauración
mediante cubierta vegetal de suelos degradados, y para la
revegetación de zonas alteradas sometidas a estreses bióticos y
abióticos, destacando como suelos y zonas degradadas, entre otros,
taludes de carreteras, zonas mineras, zonas quemadas, zonas
desertificadas, suelos contaminados, suelos infestados, suelos
degradados por exceso de sales, suelos calcáreos, suelos de pH
extremos, etc.
Fig. 1. Micorrización arbuscular en raíces de
olivo (izquierda) y melocotonero (derecha) micropropagados tras dos
meses y medio de su inoculación con el objeto de la invención.
Fig. 2. a. Comparación entre viñas
micropropagadas tras seis meses de cultivo en un suelo agrícola
calizo-arenoso en ausencia (control) y presencia (+
inoculante) del inoculante objeto de la invención. b. Micorrización
arbuscular en raíces de viña micropropagada tras año y medio de su
inoculación con el objeto de la invención. Izquierda, vista general
de la colonización HMA. Derecha, detalle de las estructuras
fúngicas simbióticas.
Fig. 3. Comparación entre plantas de lechuga
obtenidas de semilla y cultivadas durante tres meses en un suelo
agrícola en ausencia (control) y presencia (+ inoculante) del
inoculante objeto de la invención.
Fig. 4. Comparación entre plantas de puerro
obtenidas de semilla y cultivadas durante tres meses en un suelo
agrícola en ausencia (control) y presencia (+ inoculante) del
inoculante objeto de la invención.
El objeto de la presente invención es un
inoculante de micorrización producido in vitro, de
consistencia semisólida, con una viscosidad inferior a 2700
centipoises/minuto, preferentemente comprendida entre 1800 y 100
centipoises/minuto, y más preferentemente comprendida entre 800 y
200 centipoises/minuto. Dicha viscosidad reducida es una de las
novedades mas interesantes de la invención, puesto que incrementa
la viabilidad e infectividad del inoculante, facilitando su
aplicación final en sus diversas formas (gel, agua de riego, medio
aséptico de micorrización para plantas micropropagadas o polvo seco
diluido con diversos sustratos inertes). La consistencia semisólida
y la viscosidad del inoculante son mejoras fundamentales con
respecto a los medios sólidos (viscosidad superior a 2700 c/minuto)
descritos originariamente para los cultivo monoxénicos de
micorrizas, puesto que con esta modificación se facilita la
penetración de las raíces en el inoculante, propiciándose un
contacto mayor y más inmediato de éstas con el HMA. Así mismo, el
elevado contenido en agua del inoculante tipo gel potencia la
germinación de semillas en él incluidas, acelerando el contacto
HMA-raíz, y por tanto acelerando también el
establecimiento de la micorriza.
El inoculante objeto de la invención puede
originarse a partir de un cultivo monoxénico o polixénico de
micorrizas, y se mantiene en condiciones asépticas al menos hasta
el mismo momento de su aplicación, lo que es otra de las novedades
fundamentales de esta invención. El mantenimiento de dichas
condiciones asépticas durante toda la producción y hasta la
aplicación por parte del usuario hacen que este inoculante sea
superior a todos los existentes en la actualidad a nivel de pureza,
certificación, infectividad y validación.
El inoculante de micorrización objeto de la
invención comprende al menos una cepa de hongo endomicorrícico
(preferentemente un hongo endomicorrícico arbuscular, HMA) que
puede pertenecer al Phylum Glomeromycota, preferentemente a
las Familias Glomaceae, Acaulosporaceae, Archaeosporaceae,
Paraglomaceae o Gigasporaceae, y en particular a los Géneros
Glomus, Entrophospora, Acaulospora, Archaeospora, Paraglomus,
Gigaspora, Pacispora o Scutellospora. En una realización particular
de la invención el hongo endomicorrícico pertenece al género
Glomus, y en otra realización particular de la invención el
hongo endomicorrícico pertenece al género Gigaspora. En otra
realización particular de la invención las siguientes cepas, de
forma aislada o en combinaciones variables, pueden formar parte del
inoculante: MUCL 44632, MUCL 44633, CIMA10, CIMA12, CIMA13,
CIMA07.
Igualmente el inoculante de micorrización objeto
de la invención puede comprender una combinación de dos o más HMA,
preferentemente dentro de las familias, géneros y cepas arriba
mencionados, así como en una combinación de uno o más hongos
endomicorrícicos y otros microorganismos beneficiosos del
suelo.
Es importante reseñar que el hongo o combinación
de hongos micorrícicos presentes en dicho inoculante provienen de
zonas de características ecofisiológicas similares a la de
aplicación final, o bien han sido específicamente aislados de la
misma zona en la que se van a reintroducir, lo que supone otra de
las novedades y puntos fuertes de la invención objeto de esta
patente. En efecto, numerosos estudios científicos han demostrado
que la eficacia de las cepas microbianas en general, y de los HMA
en particular.
El contenido medio de propágulos de HMA
(esporas, raíces micorrizadas y micelio extrarradical) del
inoculante objeto de la invención es de al menos 500 propágulos/mL,
y preferentemente entre 2000 y 5000 propágulos/mL, lo que supone un
incremento sustancial con respecto a otros inoculantes micorrícicos
existentes. Otro de los aspectos novedosos de la presente invención
consiste en la elevada infectividad del inoculante objeto de esta
patente, que es siempre mayor que la de los inoculantes
micorrícicos secos en cualquiera de sus formulaciones (e.g.
vermiculita, sepiolita, terragreen, perlita, arena, turba,
minerales de arcilla, etc.), presentando las raíces puntos de
entrada y hasta un 30% de colonización MA (micorrizas arbusculares)
tras dos semanas de aplicación del inoculante. La obtención de
dicho porcentaje de micorrización a tiempos tan cortos supone una
mejora sustancial otorgada por el inoculante objeto de la invención
con respecto a otros inoculantes HMA, y asegura el establecimiento
funcional de la micorriza en la planta, y por tanto la obtención de
los beneficios que de ello se derivan, cuando dicha planta sea
transplantada a su sustrato definitivo.
El inoculante aséptico de micorrización objeto
de la invención puede también presentarse bajo la forma de polvo
deshidratado, proveniente de la mezcla del
inoculante-gel descrito arriba, con cualquier
sustrato inerte habitualmente utilizado en el cultivo viverístico
de plantas. En una realización particular de la invención se mezcló
el inoculante con vermiculita en una proporción inoculante:
sustrato inerte de 1:2.
Constituyen asimismo objetos de la presente
invención cualquier composición de micorrización y medio aséptico
de micorrización que comprendan un inoculante con las
características descritas anteriormente.
Dicho medio aséptico de micorrización puede
presentar más de una fase, de las que al menos una es el inoculante
objeto de la invención. En el caso de consistir en dos o mas fases,
la fase que contiene el inoculante está debajo de otra, consistente
bien en un medio gelosado, o bien en un sustrato inerte del tipo
vermiculita, sepiolita, terragreen, perlita, arena, turba, suelo,
minerales de la arcilla, etc. La razón de superponer una fase encima
del inoculante objeto de la invención tiene su base en varios
motivos, de los cuales tres son fundamentales: i) el ahorro de
inoculante que ello supone; ii) puesto que el HMA presente en la
fase inoculante está vivo, durante el proceso de micorrización su
micelio externo crecerá y colonizará la fase superior, con hifas en
pleno crecimiento y ávidas por encontrar una nueva raíz que
micorrizar, incrementándose así más aun el potencial infectivo del
inoculante; y iii) la fase superior actuaría como una especie de
"tampón antiestrés" permitiendo que las raíces se aclimaten a
su nuevo medio de cultivo antes de entrar en contacto con el HMA en
la fase inoculante.
Constituye otro objeto de la presente invención
la utilización del inoculante, la composición de micorrización y el
medio aséptico de micorrización para micorrizar plantas, ya sean
éstas micropropagadas o no, de diversas maneras:
- \bullet
- In vitro , durante o inmediatamente después de la fase de enraizamiento, y antes de la fase de aclimatación de las plantas.
- \bullet
- Ex vitro , durante la fase de aclimatación de plantas micropropagadas, plantones, plantas de vivero o cualquier otra planta obtenible a partir de técnicas convencionales viverísticas.
- \bullet
- Como medio aséptico de micorrización, en cuyo caso se presenta en frascos estériles de los habitualmente utilizados en la micropropagación de plantas. El procedimiento de micorrización mediante medio aséptico está caracterizado porque las raíces de las plantas se embeben en el medio de micorrización. La presentación de este medio aséptico de micorrización en frascos estériles permite su utilización dentro de la cadena de producción viverística de plantas, con el consiguiente beneficio, en términos de incremento mínimo de costes, por parte del viverista. Además, el elevado potencial del medio aséptico de micorrización permite su reutilización en condiciones estériles por al menos dos veces sucesivas.
El inoculante objeto de la invención se puede
utilizar para su inclusión en semilleros, alvéolos, macetas,
contenedores, etc. en los que se vayan a cultivar cualquier
tipo de planta, preferentemente en sus estadios más juveniles. Su
aplicación se puede llevar a cabo mediante la aplicación de
alícuotas individualizadas de inoculante, preferentemente menores
de 2 mL, y más preferentemente menores de 1 mL, al sustrato donde
se coloca la semilla o el plantón de vivero, siendo dicho sustrato
cualquiera de los utilizados habitualmente en los viveros, por
ejemplo turba, arena, suelo, vermiculita, perlita, sepiolita,
terragreen, minerales de la arcilla y sus derivados, y las mezclas
de dichos sustratos en proporciones variables. El inoculante objeto
de la invención también se puede aplicar mediante su distribución
por agua de riego, o bien mediante la breve inmersión de las raíces
de las plantas en él antes de su transplante al
semillero.
semillero.
Es de reseñar que como plantas susceptibles de
ser micorrizadas con el inoculante objeto de la invención se
encuentran, entre otras: plantas leñosas, arbustivas, de interés
hortofrutícola, ornamentales, flores, vid, plantas aromáticas,
plantas medicinales, leguminosas, etc.
La utilización del inoculante objeto de la
invención en las formas arriba indicadas promoverá el
establecimiento temprano de la simbiosis micorrícica arbuscular,
con el consiguiente beneficio en términos de viabilidad,
supervivencia, resistencia a estreses bióticos y abióticos, mejora
nutricional, adaptabilidad, productividad, etc. que presentan las
plantas micorrizadas con respecto a las que no lo están.
El inoculante objeto de la invención se puede
utilizar también para micorrizar plantas en explotaciones
agrícolas, en cuyo caso su aplicación se podrá llevar a cabo: i) al
mismo tiempo que la siembra de semillas y mezclado con ellas en la
tolva de aplicación; ii) tras la siembra de semillas mediante riego
por goteo, camiones de riego o aspersores; iii) mediante la siembra
de plántulas pre-micorrizadas procedentes de
semilleros estándar o hidropónicos en los que se habría incluido
previamente el inoculante objeto de la invención, según se ha
descrito; iv) mediante la breve inmersión de las raíces de las
plantas en el inoculante objeto de la invención antes de su
transplante a campo. La aplicación del inoculante se efectuará
preferentemente en proporción no inferior a 50 propágulos por
semilla o plántula, y más preferentemente en proporción no inferior
a 100 propágulos por semilla o plántula.
El inoculante objeto de la invención se puede
aplicar así mismo como potenciador del reestablecimiento
(recuperación y restauración) de la cubierta vegetal de suelos
degradados, y para la revegetación de zonas alteradas sometidas a
estreses bióticos y abióticos. En este sentido los suelos a
revegetar pueden ser, entre otros, taludes de carreteras, zonas
mineras, zonas quemadas, zonas desertificadas, suelos contaminados,
suelos infestados, suelos degradados por exceso de sales, suelos
calcáreos, suelos de pH extremos, etc. La inoculación de plantas
con aislados HMA originarios de los suelos a recuperar, y su
reintroducción en esos mismos suelos, asegura el mantenimiento de
la biodiversidad de los mismos, así como de sus condiciones
fisico-químicas, favoreciendo la reinstauración de
la cubierta vegetal propia del área en cuestión.
Asimismo, constituye otro objeto de la presente
invención los procedimientos de micorrización, in vitro y
ex vitro, que utilicen al menos un inoculante, composición
de micorrización y medio aséptico de micorrización objetos
igualmente de la presente invención.
Con el fin de comprobar los efectos del objeto
de la invención descrito anteriormente, se realizaron diversas
pruebas aplicando el inoculante sobre semillas y plantas
micropropagadas en condiciones in vitro y ex vitro.
Los resultados se muestran en los siguientes ejemplos.
Con este ensayo se pretende confirmar la
infectividad del inoculante objeto de la invención en condiciones
asépticas. En condiciones estériles, veinte plántulas pregerminadas
(a partir de semillas esterilizadas en superficie y germinadas in
vitro) de trébol y tomate con radículas incipientes se
introdujeron en frascos de cultivo in vitro que contenían
100 ml del inoculante aséptico objeto de la invención ("medio de
micorrización"), producido según la técnica descrita, de manera
que las radículas estuviesen totalmente embebidas en él. El
inoculante se analizó previamente mediante conteo
estereomicroscópico directo de acuerdo con el "gridline intersect
method" de Giovanetti y Mosse (1980, con modificaciones),
resultando su contenido medio de propágulos de HMA por ml de
producto en 935\pm75 esporas, 637\pm88 fragmentos colonizados
de raíz, y >1000 fragmentos de micelio externo, lo que en
conjunto supone >2500 propágulos HMA/mL.
Las plántulas de trébol se mantuvieron en los
frascos durante dos semanas, a 24ºC y 12 h de luz solar, tras las
cuales se analizó el tipo y porcentaje de colonización MA. Después
de dos semanas de cultivo in vitro se encontró una
colonización MA superior al 30%, siendo dicha colonización
predominantemente joven y arbuscular, con alguna vesícula en las
áreas mas maduras de la raíz. Las plántulas de tomate se dejaron en
los frascos durante tres semanas, a 24ºC y 12 h de luz solar, tras
las cuales se llevaron a aclimatar ex vitro en una mezcla
estéril de suelo agrícola:arena de cuarzo (1:9 v:v), manteniéndose
así durante aproximadamente un mes. La supervivencia a la
aclimatación fue del 100%, y el porcentaje de colonización MA
superior al 50%.
Los porcentajes de micorrización obtenidos con
las dos especies utilizadas aseguran la eficacia del inoculante
objeto de la invención para el rápido establecimiento de la
simbiosis micorrícica, con el consiguiente beneficio para la
planta.
\newpage
En condiciones limpias se prepararon 20 alvéolos
comerciales de unos 50 ml de capacidad con turba de baja
fertilización a los que se transplantaron plántulas micropropagadas
de olivo y melocotonero, listas para iniciar su fase
de aclimatación. A las radículas incipientes de cada planta se le
adicionó 1 ml del inoculante aséptico objeto de la invención de
manera que quedaran totalmente mojadas por él. Dicho inóculo
presenta las mismas características que el utilizado en el ejemplo
1. Las plántulas se cultivaron durante un mes en túnel de
aclimatación, y posteriormente (un mes y medio) en condiciones de
invernadero, con riego por goteo. Al final del ensayo se evaluaron
parámetros de crecimiento (peso fresco, altura) así como el
porcentaje y tipo de micorrización HMA (Fig. 2), y se compararon
con sus correspondientes plantas controles (no inoculadas). En la
tabla 2 puede observarse cómo las plantas micorrizadas mostraban
mayor crecimiento que los controles.
Asimismo, se prepararon, en condiciones limpias,
80 macetas de unos 200 ml de capacidad con una mezcla estéril de
suelo agrícola:arena de cuarzo (1:9 v:v) adicionado con un
fertilizante granulado de lenta liberación (Osmocote, 1 g/l). A
dichas macetas se transplantaron plántulas de viña
micropropagada, listas para iniciar su fase de aclimatación. A las
radículas incipientes de cada planta se le adicionó 1 ml del
inoculante aséptico objeto de la invención de manera que quedaran
totalmente mojadas por él. Las plántulas se cultivaron durante seis
meses en cámara de cultivo de plantas (24ºC, 12 horas luz), y
posteriormente fueron transplantadas a macetas de 2kg que contenían
un suelo agrícola arenoso, con un contenido de CO_{3}Ca no
inferior al 20%. Las plantas se cultivaron durante seis meses a
campo abierto, con un régimen hídrico de tres riegos por semana. Al
año del inicio de este ensayo, que todavía se mantiene en curso, se
realizó la evaluación de parámetros no destructivos de crecimiento
(altura), así como un muestreo parcial de raíces para la evaluación
del porcentaje y tipo de micorrización HMA, y su comparación con
las plantas controles (sin inocular). Los resultados se muestran en
la Figura 3 y Tabla 1. Es importante notar que las diferencias
obtenidas en términos de parámetros fisiológicos para la viña se
mantienen tras seis meses de cultivo en condiciones de campo, lo
que refuerza la consistencia de los datos obtenidos para olivo y
melocotonero e indica la prevalencia de los efectos beneficiosos del
inoculante objeto de la invención en condiciones agronómicas
reales.
| Parámetro | Incremento medio | Incremento máximo |
| Peso seco parte aérea | 127% | 203% |
| Altura | 123% | 165% |
| % colonización micorrícica | 57.8% |
\vskip1.000000\baselineskip
| Parámetro | Incremento medio | Incremento máximo |
| Peso seco parte aérea | 140% | 231% |
| Diámetro de tallo | 160% | 282% |
| % colonización micorrícica | 59.7% |
\vskip1.000000\baselineskip
| Parámetro | Incremento medio | Incremento máximo |
| Peso fresco parte aérea | 194% | 241% |
| % colonización micorrícica | 68.0% |
En condiciones limpias, se prepararon 30 macetas
de 300 ml de capacidad con una mezcla estéril de suelo
agrícola:arena de cuarzo (1:9 v:v) adicionado con un fertilizante
granulado de lenta liberación (Osmocote, 1 g/l). Aproximadamente a
6 cm de la superficie se sembraron semillas de puerro y
lechuga, a las que se les adicionó 1 ml del inoculante
aséptico objeto de la invención por maceta, de manera que las
semillas quedaran totalmente incluidas en él. El inoculante
utilizado es el mismo que en los ejemplos 1 y 2. Tras la germinación
se redujo el número de plántulas a una por maceta. Las plantas se
cultivaron durante dos meses y medio en condiciones de invernadero,
con un régimen hídrico de tres riegos por semana. Al final del
ensayo se evaluaron parámetros de crecimiento de la planta (peso
fresco, diámetro, altura) así como el porcentaje y tipo de
micorrización HMA, y se compararon con sus correspondientes plantas
controles (no inoculadas). Los resultados aparecen en las Figuras 4
y 5 y en la Tabla 2, donde puede observarse que las plantas
micorrizadas presentaban mayor crecimiento que los controles.
| Parámetro | Incremento medio | Incremento máximo |
| Peso fresco parte aérea | 153% | 198% |
| % colonización micorrícica | 51.5% |
\vskip1.000000\baselineskip
| Parámetro | Incremento medio | Incremento máximo |
| Peso fresco parte aérea | 226% | 308% |
| Diámetro de tallo | 153% | 198% |
| % colonización micorrícica | 68.4% |
Claims (46)
1. Inoculante de micorrización producido in
vitro, caracterizado porque su consistencia es
semisólida, con una viscosidad inferior a 2700 centipoises/minuto,
preferentemente comprendida entre 1800 y 100 centipoises/minuto, y
más preferentemente comprendida entre 800 y 200
centipoises/minuto.
2. Inoculante de micorrización según la
reivindicación 1 caracterizado porque dicho inoculante se
origina a partir de un cultivo monoxénico de micorrizas.
3. Inoculante de micorrización según la
reivindicación 1 caracterizado porque dicho inoculante se
origina a partir de un cultivo polixénico de micorrizas.
4. Inoculante de micorrización según las
reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque dicho inoculante
se mantiene en condiciones asépticas al menos hasta el mismo
momento de su aplicación.
5. Inoculante de micorrización según las
reivindicaciones de la 1 a la 4 caracterizado porque dicho
inoculante comprende al menos un hongo endomicorrícico,
preferentemente un hongo endomicorrícico arbuscular (HMA).
6. Inoculante de micorrización según la
reivindicación 5 caracterizado porque dicho hongo
endomicorrícico pertenece a una única cepa, preferentemente una
cepa de hongo endomicorrícico arbuscular.
7. Inoculante de micorrización según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el
hongo endomicorrícico pertenece al Phylum Glomeromycota,
preferentemente a la Clase Glomeromycetes, y más preferentemente a
la Familia Glomeraceae.
8. Inoculante de micorrización según la
reivindicación 7 caracterizado porque el hongo
endomicorrízico pertenece al género Glomus, preferentemente a
la especie G. intraradices.
9. Inoculante de micorrización según la
reivindicación 8 caracterizado porque el hongo
endomicorrízico se selecciona entre las siguientes cepas: MUCL
44633, CIMA10, CIMA12, CIMA13, CIMA07.
10. Inoculante de micorrización según cualquiera
de las reivindicaciones de la 1 a la 6 caracterizado porque
el hongo endomicorrícico pertenece a la Familia Gigasporaceae,
preferentemente al género Gigaspora, y más preferentemente a
la especie G. margarita.
11. Inoculante de micorrización según la
reivindicación 10 caracterizado porque el hongo
endomicorrízico de la especie G. margarita pertenece a la
cepa MUCL 44632.
12. Inoculante de micorrización según cualquiera
de las reivindicaciones de la 1 a la 6 caracterizado porque
el hongo endomicorrízico pertenece, entre otras, a una de las
siguientes Familias: Glomaceae, Acaulosporaceae, Archaeosporaceae,
Paraglomaceae o Gigasporaceae, y preferentemente a los Géneros
Glomus, Entrophospora, Acaulospora, Archaeospora, Paraglomus,
Gigaspora, Pacispora o Scutellospora.
13. Inoculante de micorrización según las
reivindicaciones de la 1 a la 4 caracterizado porque dicho
inoculante comprende una combinación de dos o más hongos
endomicorrícicos, preferentemente hongos endomicorrícicos
arbusculares de los citados en las reivindicaciones de la 1 a la
12.
14. Inoculante de micorrización según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13 caracterizado porque
comprende una combinación de uno o más hongos endomicorrícicos y
otros microorganismos beneficiosos del suelo.
15. Inoculante de micorrización según cualquiera
de las reivindicaciones 1-14 caracterizado
porque el hongo o combinación de hongos micorrícicos presentes en
dicho inoculante provienen de zonas de características
ecofisiológicas similares a la de aplicación final, o bien han sido
específicamente aislados de la misma zona en la que se van a
reintroducir.
16. Inoculante de micorrización según cualquiera
de las reivindicaciones de la 1 a la 15 caracterizado porque
su contenido medio de propágulos de HMA (esporas, raíces
micorrizadas y micelio extrarradical) es de al menos 500
propágulos/mL, preferentemente entre 2000 y 5000 propágulos/mL.
17. Inoculante de micorrización según cualquiera
de las reivindicaciones de la 1 a la 16 caracterizado porque
su infectividad es siempre mayor que la de un inoculante
micorrícico seco en cualquiera de sus formulaciones (e.g.
vermiculita, sepiolita, terragreen, perlita, arena, turba,
minerales de arcilla, etc.), presentando puntos de entrada y hasta
un 30% de colonización MA (micorrizas arbusculares) en las raíces
inoculadas a las dos semanas de su aplicación.
18. Inoculante aséptico de micorrización
caracterizado porque dicho inoculante se presenta en forma
de polvo deshidratado, proveniente de la mezcla del inoculante
descrito en las reivindicaciones 1-17 y sustratos
inertes habitualmente utilizados en el cultivo viverístico de
plantas.
19. Inoculante aséptico de micorrización según
la reivindicación 18 caracterizado porque el sustrato inerte
es vermiculita y la proporción de la mezcla (inoculante:
vermiculita) es al menos de (1:2).
20. Composición de micorrización
caracterizada porque comprende al menos un inoculante según
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 19.
21. Medio aséptico de micorrización
caracterizado porque comprende al menos un inoculante según
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 17.
22. Medio aséptico de micorrización
caracterizado porque comprende dos o más fases de las que al
menos una de ellas es un inoculante según cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 17.
23. Medio aséptico de micorrización según la
reivindicación 22 caracterizado porque la fase que contiene
el inoculante está debajo de otra fase consistente en un medio
gelosado o un sustrato inerte.
24. Medio aséptico de micorrización según la
reivindicación 23 caracterizado porque el sustrato inerte es
del tipo vermiculita, sepiolita, terragreen, perlita, arena, turba,
suelo, minerales de la arcilla, etc.
25. Utilización de un inoculante según las
reivindicaciones de la 1 a la 20 para micorrizar plantas in
vitro.
26. Utilización de un inoculante según la
reivindicación 25 para micorrizar in vitro plantas
micropropagadas durante o inmediatamente después de su fase de
enraizamiento, y antes de la fase de aclimatación.
27. Utilización de un medio de micorrización
según las reivindicaciones de la 21 a la 24 para micorrizar plantas
in vitro.
28. Utilización de un medio de micorrización
según la reivindicación 27 para micorrizar in vitro plantas
micropropagadas durante o inmediatamente después de su fase de
enraizamiento, y antes de la fase de aclimatación.
29. Utilización de un inoculante según las
reivindicaciones de la 1 a la 20 para micorrizar plantas ex
vitro.
30. Utilización de un inoculante según la
reivindicación 29 para micorrizar plantas micropropagadas durante
la fase de aclimatación.
31. Utilización de un inoculante según la
reivindicación 29 para micorrizar semilleros, alvéolos, plantones,
plantas de vivero o cualquier otra planta obtenible a partir de
técnicas convencionales viverísticas.
32. Utilización de un inoculante según las
reivindicaciones de la 1 a la 20 caracterizado porque dicho
inoculante se aplica junto con el agua de riego.
33. Utilización de un inoculante según
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 20
caracterizado porque dicho inoculante se aplica en
explotaciones agrícolas.
34. Utilización de un inoculante según la
reivindicación 33 caracterizado porque la aplicación de
dicho inoculante se realiza al mismo tiempo que la siembra de
semillas y mezclado con ellas en la tolva de aplicación.
35. Utilización de un inoculante según la
reivindicación 33 caracterizado porque la aplicación de
dicho inoculante se realiza tras la siembra de semillas mediante
riego por goteo, camiones de riego o aspersores.
36. Utilización de un inoculante según
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 20
caracterizado porque la aplicación de dicho inoculante se
realiza tanto en semilleros estándar como en semilleros
hidropónicos.
37. Utilización de un inoculante según las
reivindicaciones 34 a 36 caracterizado porque el inoculante
se aplica preferentemente en proporción no inferior a 50 propágulos
por semilla o plántula, y más preferentemente en proporción no
inferior a 100 propágulos por semilla o plántula.
38. Utilización de un inoculante según las
reivindicaciones de la 25 a la 37 caracterizado porque las
plantas que se micorrizan son, entre otras, plantas leñosas,
arbustivas, de interés hortofrutícola, ornamentales, flores, vid,
plantas aromáticas, plantas medicinales, leguminosas, etc.
39. Utilización de un inoculante según las
reivindicaciones de la 25 a la 38 para recuperación y restauración
mediante cubierta vegetal de suelos degradados, y para la
revegetación de zonas alteradas sometidas a estreses bióticos y
abióticos.
40. Utilización de un inoculante según las
reivindicación 39 caracterizado porque los suelos y zonas
degradadas que se tratan son, entre otros, taludes de carreteras,
zonas mineras, zonas quemadas, zonas desertificadas, suelos
contaminados, suelos infestados, suelos degradados por exceso de
sales, suelos calcáreos, suelos de pH extremos, etc.
41. Procedimiento de micorrización in
vitro caracterizado porque se utiliza al menos un
inoculante o medio aséptico de micorrización según las
reivindicaciones de la 1 a la 24.
42. Procedimiento de micorrización ex
vitro caracterizado porque se aplica al menos un
inoculante según las reivindicaciones de la 1 a la 20.
43. Procedimiento de micorrización según la
reivindicación 42 caracterizado porque se añade una alícuota
del inoculante, preferentemente menor de 2 mL, y más
preferentemente menor de 1 mL, al sustrato donde se coloca la
semilla o el plantón de vivero, siendo dicho sustrato cualquier
sustrato usado habitualmente en los viveros, por ejemplo turba,
arena, suelo, vermiculita, perlita, sepiolita, terragreen,
minerales de la arcilla y sus derivados, y las mezclas de dichos
sustratos en proporciones variables.
44. Procedimiento de micorrización in
vitro caracterizado porque las raíces de las plantas se
embeben en un medio de micorrización según las reivindicaciones de
la 21 a la 24.
45. Procedimiento de micorrización ex
vitro caracterizado porque las raíces de las plantas se
sumergen brevemente en un medio de micorrización según las
reivindicaciones de la 1 a la 20, antes de ser transplantadas a
semillero o a su medio definitivo.
46. Procedimiento de micorrización ex
vitro caracterizado porque se aplica un inoculante según
las reivindicaciones 1 a la 20, directamente al suelo de la
explotación agrícola según las reivindicaciones de la 32 a la
37.
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