ES2268789T3 - Receptor de estrogeno. - Google Patents
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Abstract
Un receptor de estrógeno aislado que comprende la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 1 (figura 1).
Description
Receptor de estrógeno.
La invención se refiere a un nuevo receptor de
estrógeno y a las secuencias de polinucleótidos que codifican este
receptor. La presente invención también se refiere a procedimientos
para identificar ligandos que se unen a este receptor, los ligandos
así identificados, las composiciones farmacéuticas que comprenden
tales ligandos y también se contemplan las composiciones útiles para
el tratamiento o la prevención de afecciones o enfermedades medidas
por receptores de estrógeno.
Los receptores nucleares son una gran extensa
clase de proteínas que son responsables de la regulación de eventos
celulares complejos que incluyen la diferenciación celular, la
homeostasis, el crecimiento y el funcionamiento de diversos órganos
y tejidos y la trascripción. Se cree que los receptores nucleares
funcionan transduciendo señales químicas extracelulares a partir de
hormonas en una respuesta de transcripción.
Los receptores de estrógeno son una subclase de
la mayor clase de receptores nucleares. Los receptores de estrógeno
son proteínas que son sensibles a las moléculas de estrógeno y de
tipo estrógeno. Se cree que los receptores de estrógeno desempeñan
un papel importante en el sistema endocrino de los mamíferos, los
órganos reproductivos, el tejido del seno, el tejido óseo y el
sistema vascular y se cree que está implicado en el desarrollo y la
progresión de diversos estados de enfermedad tales como la resorción
ósea anormal, la enfermedad cardiovascular, el cáncer y trastornos
del sistema nervioso central. Se cree que se pueden tratar o
prevenir diversos estados de enfermedad y diversas afecciones
mediante el desarrollo de ligandos apropiados, es decir, fármacos,
para modificar la actividad de los receptores de estrógeno. Por
consiguiente, hay una necesidad de identificar los receptores de
estrógeno y su modo de acción y también de identificar ligandos para
modificar la acción de estos receptores.
Se han presentado al menos dos tipos distintos
de receptores de estrógeno. Un receptor de estrógeno que tiene 595
aminoácidos es descrito en Green, S. et al., Science,
231, pp. 1150-1154 (1986). Estas referencias
presentan también las secuencias correspondientes de ADN para el
receptor.
El otro tipo de receptor de estrógeno ha sido
presentado por dos grupos de investigación y ha sido denominado
"\beta" (beta). Un grupo de investigación presenta un
receptor \beta de 485 aminoácidos que se obtiene a partir de
fuentes de ratas, humanos y ratones, así como las correspondientes
secuencias de ADN. Véase la solicitud de PCT número WO 97/09348, de
Kuiper, G.G.J.M. et al., publicada en 13 de Marzo de 1997. el
segundo grupo de investigación presenta un receptor de estrógeno
similar que contiene 483 aminoácidos. Igualmente se presenta la
correspondiente secuencia de ADN. Véase, Mosselman, S. et
al., ER\beta: identification and characterization of
a novel human estrogen receptor, FEBS Letters, 392, pp.
49-53 (1996).
En la presente invención, un nuevo receptor de
estrógeno que tiene 548 unidades de aminoácidos, y que es distinto
de los receptores de estrógeno de 595 aminoácidos, 485 aminoácidos y
483 aminoácidos descritos, ha sido identificado y asilado a partir
de tejido humano. Se cree que este nuevo receptor de estrógeno
desempeña un papel clave en la fisiología de los mamíferos. Este
nuevo receptor de estrógeno es una herramienta importante de
investigación para identificar y designar ligandos para su uso en
composiciones farmacéuticas para tratar y/o prevenir una amplia
gama de afecciones o enfermedades mediadas por receptores de
estrógeno.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención
es proporcionar un nuevo receptor aislado de estrógeno.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar la secuencia de aminoácidos de un nuevo receptor de
estrógeno.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar la secuencia de polinucleótidos que codifica un nuevo
receptor de estrógeno.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar procedimientos para producir un nuevo receptor de
estrógeno.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar procedimientos para identificar ligandos capaces de
unirse aun nuevo receptor de estrógeno.
Igualmente se describen composiciones
farmacéuticas que comprenden ligandos capaces de unirse a un nuevo
receptor de estrógeno.
También se presentan procedimientos para tratar
y/o prevenir afecciones o enfermedades mediadas por receptores de
estrógeno.
Estos y otros objetos serán fácilmente
comprensibles a partir de la descripción detallas que sigue.
La presente invención se refiere a un receptor
aislado de estrógeno que comprende la secuencia de aminoácidos de la
figura 1 (que corresponde también a la SEQ ID NO: 1).
Igualmente se describe un receptor aislado de
estrógeno que tiene una secuencia de aminoácidos, que es
sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos de la figura
1, en la que el receptor de estrógeno comprende al menos 531
aminoácidos.
También se presenta un receptor aislado de
estrógenos que comprende al menos 531 aminoácidos y que tiene
sustancialmente las mismas propiedades de unirse a los ligandos o
sustancialmente las mismas propiedades de unirse al ADN que el
receptor de estrógeno de la figura 1.
En otras realizaciones, la presente invención se
refiere a un receptor aislado de estrógeno que se deriva de células
de mamífero, preferiblemente células humanas.
En otras realizaciones, la presente invención se
refiere a un polinucleótido aislado que es un ADN o un ADNc.
También se describe un polinucleótido aislado
que se híbrida a y es complementario del polinucleótido que codifica
el receptor de estrógeno que tiene la secuencia de aminoácidos de la
figura 1.
Igualmente se presenta un polinucleótido aislado
que comprende un polinucleótido que codifica un polinucleótido
maduro codificado por el polinucleótido del receptor de estrógeno
contenido en un Depósito ATCC seleccionado entre el grupo
constituido por el Depósito ATCC número 209238, el Depósito ATCC
número 209239, y el Depósito ATCC número 209240.
En otras realizaciones, la presente invención se
refiere a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia
nucleotídica de la figura 2 (que corresponde también a la SEQ ID,
NO: 2).
Se describe igualmente un polinucleótido aislado
que se híbrida a y es complementario del polinucleótido de la figura
2, en la que dicho polinucleótido comprende al menos 1.593
nucleótidos.
En otras realizaciones, la presente invención se
refiere a un vector que comprende el ADN.
En otras realizaciones, la presente invención se
refiere a una célula huésped transformada o trasfectada con el
vector de la presente invención.
En otras realizaciones, la presente invención se
refiere a un procedimiento para producir un receptor de estrógeno de
la presente invención.
En otras realizaciones, la presente invención se
refiere a un procedimiento para determinar si un ligando se puede
unir al receptor de estrógeno de la presente invención.
Igualmente se presenta un ligando detectado por
los procedimientos de la presente invención.
Se presenta también una composición farmacéutica
que comprende un ligando de la presente invención.
También se presenta un procedimiento para tratar
o prevenir una afección o enfermedad mediada por receptores de
estrógeno tal como se describe en la presente memoria
descriptiva.
Los depósitos a los que se refiere la presente
memoria descriptiva se mantendrán bao el Tratado de Budapest sobre
el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para
el Procedimiento de Patente. La secuencia de los polinucleótidos
contenidos en los materiales depositados, así como la secuencia de
aminoácidos de los polipéptidos codificados por los mismos, se
pueden en caso de cualquier conflicto con la descripción de la
secuencia de la presente memoria descriptiva.
Todos los porcentajes y relaciones usadas en la
presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario,
son en peso. La presente invención puede comprender, estar
constituida por, o constituida esencialmente por los ingredientes
esenciales así como los ingredientes opcionales, los componentes, y
los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva.
La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos
del receptor de estrógeno, es decir, el polipéptido, de la presente
invención.
La figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos,
es decir, el polinucleótido de ADNc que codifica el receptor de
estrógeno de la presente invención. Esta secuencia incluye el codón
de terminación de la traducción "TGA"
Los fragmentos, análogos y derivados de tal
receptor de estrógeno también son contemplados.
Los términos "fragmentos", "derivados"
y "análogos" cuando se refieren al receptor de estrógeno de la
figura 1 o cuando están codificados por el ADN depositado,
significan que tienen esencialmente la misma función o actividad
biológica que tal receptor de estrógeno. De este modo, un análogo
incluye una proproteína que se puede activar por escisión de la
parte proproteínica para producir un receptor de estrógeno activo y
maduro.
El receptor de estrógeno de la presente
invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido
natural o un polipéptido sintético de la secuencia de la figura 1.
Igualmente se contemplan variantes del receptor de la figura 1.
Los fragmentos, derivados o análogos del
receptor de estrógeno de la figura 1 o el codificado por ADN
depositado puede ser (i) uno en el cual uno o diversos residuos de
aminoácidos son sustituidos con un residuo de aminoácidos conservado
o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácidos
conservado) y tal residuo de aminoácidos sustituido puede ser uno
que está o no, codificado por el código genético o (ii) uno en el
cual uno o diversos de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo
sustitutivo, o (iii) uno en el que el receptor de estrógeno maduro
está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para
incrementar la semivida del receptor de estrógeno (por ejemplo
polietilenglicol) o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales
están fusionados al receptor de estrógeno maduro, tal como una
secuencia conductora o secretoria o una secuencia que se emplea para
la purificación del receptor de estrógeno maduro o una secuencia
proproteínica. Se considera que tales fragmentos, derivados y
análogos están al alcance de los expertos en la técnica a partir de
las enseñanzas de la presente memoria descriptiva.
También se presentan receptores de estrógeno que
tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que el
receptor de estrógeno de la figura 1.
Igualmente se presentan receptores de estrógeno
que comprenden al menos 531 aminoácidos y que tienen sustancialmente
las mismas propiedades de unión de ligandos o sustancialmente las
mismas propiedades de unión de ADN que las del receptor de estrógeno
de la figura 1. En otras palabras, los dominios de unión respectivos
de ligandos y ADN de los receptores tienen al menos aproximadamente
el 75% de homología, preferiblemente aproximadamente el 90% de
homología y más preferiblemente, aproximadamente el 95% de
homología, y más preferiblemente, aproximadamente el 99% de
homología con cada uno de los dominios de unión respectivos de
ligando y ADN en el receptor de la figura 1.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un ácido nucleico aislado, es decir, el
polinucleótido, que codifica el receptor de estrógeno maduro que
tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la figura 1.
Un polinucleótido que codifica un receptor de
estrógeno de la presente invención se puede obtener llevando a cabo
las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) sobre ADNc de
testículos humanos y subclonando en un vector en E. coli JM
109. Alternativamente, el polinucleótido se puede obtener cribando
una biblioteca de ADN genómico humano derivada de testículo
humano.
El polinucleótido de la presente invención puede
estar en forma de ARN o en forma de ADN, dicho ADN incluye ADNc, ADN
genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de doble cordón o de
cordón único, y si es de cordón único puede ser el cordón de
codificación o no codificación (antisentido). La secuencia de
codificación que codifica el receptor de estrógeno maduro puede ser
idéntica a la secuencia de codificación mostrada en la figura 2 o a
la de los clones depositados o puede ser una secuencia de
codificación diferente, cuya secuencia de codificación, como
resultado de redundancia o degeneración del código genético,
codifica los mismos receptores de estrógeno maduro que el ADN de la
figura 2 o el ADN depositado.
El polinucleótido que codifica el receptor de
estrógeno maduro de la figura 1 o el polipéptido maduro codificado
por el ADN depositado puede incluir; solamente la secuencia de
codificación para el polipéptido maduro; la secuencia de
codificación para el polipéptido maduro y una secuencia de
codificación adicional tal como una secuencia conductora o
secretoria o una secuencia proproteínica; o la secuencia de
codificación para el polipéptido maduro (y opcionalmente una
secuencia de codificación adicional) y la secuencia de
no-codificación, tal como las intrones o la
secuencia de no-codificación 5' y/o 3' de la
secuencia de codificación para el polipéptido maduro.
De este modo, el término "polinucleótido que
codifica un polipéptido" comprende un polinucleótido que incluye
una secuencia de codificación para el polipéptido así como un
polinucleótido que incluye secuencias de codificación y/o
no-codificación adicionales.
También se presentan variantes de los
polinucleótidos descritos anteriormente que codifican fragmentos,
análogos y derivados del polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos deducida de la figura 1 o el polipéptido codificado por
el ADN de los clones depositados. La variante del polinucleótido
puede ser una variante alélica que se genera de manera natural del
polinucleótido. También se presentan sondas de polinucleótidos
construidas a partir de la secuencia de polinucleótidos de la figura
2 o un segmento de la secuencia de la figura 2 amplificada por el
procedimiento PCR, que se puede utilizar para cribar una biblioteca
de ADNc para deducir el receptor de estrógeno de la presente
invención.
De este modo, también la presente invención
incluye polinucleótidos que codifican el mismo receptor de estrógeno
maduro mostrado en la figura 1. Igualmente se presentan variantes de
tales polinucleótidos, dichas variantes codifica fragmentos,
derivados o análogos del polipéptido de la figura 2. Tales variantes
de nucleótidos incluyen variantes de deleción, variantes de
sustitución y variantes de adición o inserción.
Son se ha indicado anteriormente, el
polinucleótido puede tener una secuencia de codificación que es una
variante alélica generada de manera natural de la secuencia de
codificación mostrada en la figura 2 o la secuencia de codificación
de los clones depositados. Como es conocido en la técnica, una
variante alélica es una forma alternativa de una secuencia de
polinucleótidos que puede tener una sustitución, deleción o adición
de uno o más nucleótidos, que no altera sustancialmente la función
del polipéptido codificado.
Igualmente se presentan polinucleótidos que se
hibridan a los polinucleótidos que codifican el receptor de
estrógeno que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 1. Se
presenta un polinucleótido aislado que se híbrida a y es al menos
complementario a aproximadamente el 75% con el polinucleótido que
codifica el receptor de estrógeno que tiene la secuencia de
aminoácidos de la figura 1. Se presenta un polinucleótido aislado
que se híbrida a y es al menos complementario aproximadamente al 90%
con el polinucleótido que codifica el receptor de estrógeno que
tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 1. Se presenta un
polinucleótido aislado que se híbrida a y es al menos complementario
aproximadamente al 95% con el polinucleótido que codifica el
receptor de estrógeno que tiene la secuencia de aminoácidos de la
figura 1. Se presenta un polinucleótido aislado que se híbrida a y
es al menos complementario aproximadamente al 99% con el
polinucleótido que codifica el receptor de estrógeno que tiene la
secuencia de aminoácidos de la figura 1.
Se presenta un polinucleótido aislado que
comprende al menos 1.593 nucleótidos. Se presenta un polinucleótido
aislado que comprende al menos 1.593 nucleótidos que se híbridan a y
es al menos complementario a aproximadamente el 75% con el
polinucleótido de la figura 2. Se presenta un polinucleótido aislado
que comprende al menos 1.593 nucleótidos que se híbrida a y es al
menos complementario aproximadamente al 90% con el polinucleótido de
la figura 2. Se presenta un polinucleótido aislado que comprende al
menos 1.593 nucleótidos que se híbrida a y es al menos
complementario aproximadamente al 95% con el polinucleótido de la
figura 2. Se presenta un polinucleótido aislado que se híbrida a y
es al menos complementario aproximadamente al 99% con el
polinucleótido que codifica el receptor de estrógeno que tiene la
secuencia de aminoácidos de la figura 2.
Los polinucleótidos que se hibridan a los
polinucleótidos descritos anteriormente codifican los receptores de
estrógeno que tiene sustancialmente la misma función o actividad
biológica que los receptores de estrógeno maduros codificados por el
ADNc de la figura o el ADN depositado. La hibridación está descrita
en la Patente de los Estados Unidos número 5.501.969, de Hastings
et al., concedida el 26 de Marzo de 1996.
Los polipéptidos y los polinucleótidos de la
presente invención se proporcionan en una forma aislada, y
preferiblemente se purifican hasta la homogeneidad.
El término "aislado" significa que el
material se retira de su medio original (por ejemplo, el medio
natural si es generado de manera natural). Por ejemplo un
polinucleótido o un polipéptidos generaos de manera natural
presentes en un animal vivo no está aislado, pero el mismo
polinucleótido o ADN o polipéptido separado de algunos o todos los
materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tal
polinucleótido podría ser parte de una composición, y seguir estando
aislado porque tal vector o composición no forma parte de su medio
natural.
La presente invención se refiere también a
vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención,
células huésped que son modificadas genéticamente con vectores de la
invención y la producción de receptores de estrógeno de la invención
por técnicas recombinantes.
Las células huésped son modificadas
genéticamente (trasducidas o transformadas o transfectadas) con los
vectores de la invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de
clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por
ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc.
Las células huésped modificadas se pueden cultivar en medios
nutrientes convencionales modificados para activar promotores,
seleccionar transformantes o amplificar los generes de receptor de
estrógeno. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH
y similares, son las previamente usadas con la célula huésped
seleccionada para su expresión, y estas serán evidentes para el
experto ordinario en la técnica.
El polinucleótido de la presente invención se
puede usar para producir un polipéptido por técnica recombinantes.
De este modo, por ejemplo, la secuencia de polinucleótidos puede
estar incluida en uno cualquiera de una variedad de vehículos de
expresión, en particular vectores o plásmidos para expresar un
receptor de estrógeno. Tales vectores incluyen secuencias de ADN
cromosómico, no-cromosómico y sintético, por
ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fagos,
plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de
plásmidos y ADN de fagos; ADN viral tal como vacunas, adenovirus,
virus aviar, virus de la viruela y pseudorabia. Sin embargo, se
puede usar cualquier otro plásmido o vector mientras se puede
reclicar y es viable en el huésped.
Como se ha descrito anteriormente, la secuencia
de ADN apropiada se puede insertar en el vector por diversos
procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en sitios
de restricción de endonucleasa apropiados por procedimientos
conocidos en la técnica. Se considera que tales procedimientos y
otros están al alcance de los técnicos en la materia.
La presente invención incluye también
construcciones recombinantes que comprenden una o más de las
secuencias de la presente invención. Las construcciones comprenden
un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el cual se ha
insertado una secuencia de la invención, en una orientación hacia
delante o inversa. Muchísimos vectores o promotores apropiados son
conocidos por los expertos en las técnicas y están disponibles
comercialmente.
En otra realización, la presente invención se
refiere a células huésped que contienen la construcción
anteriormente descrita. La célula huésped puede ser una célula
eucariótica superior tal como una célula de mamífero o una célula
eucariótica inferior, tal como una célula de levadura,, o la célula
huésped puede ser una célula procariótica, tal como una célula
bacteriana. La introducción de la construcción en la célula huésped
se puede efectuar por transfección de fosfato de calcio,
transfección mediada por DEAE-Dextrano o
electroporación (Davis, L. Dibner, M. Battey, I. Basic Methods in
Molecular Biology 1986, que se incorpora por referencia
íntegramente a la presente memoria descriptiva).
Las construcciones en células huésped se pueden
usar de una manera convencional para producir el producto genético
codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los
receptores de estrógeno de la presente invención se pueden producir
sintéticamente por sintetizadores convencionales de péptidos.
Los receptores de estrógeno maduros pueden ser
expresados en células de mamíferos, levaduras, bacterias u otras
células bajo el control de promotores apropiados. Los sistemas de
traducción libres de células también pueden ser empleados para
producir tales receptores de estrógeno usando ARN derivados de las
construcciones de ADN de la presente invención. Los vectores
apropiados de clonación y expresión para su uso con huésped
procarióticos y eucarióticos son descritos por Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
Segunda Edición (Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Los receptores de estrógeno de la presente
invención puede ser productos purificados de manera natural
expresados a partir de una línea celular muy expresiva, o un
producto de procedimientos sintéticos químicos o producidos por
técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o
eucariótico (por ejemplo, por células bacterianas, de levadura, de
vegetales superiores, insectos o mamíferos en cultivo).
Alternativamente, se puede emplear también un sistema de expresión
de células de vaculovirus/insectos.
Los receptores de estrógeno, sus fragmentos y
otros derivados o los análogos de los mismos, o las células que los
expresan se pueden usar como un inmunógeno para producir anticuerpos
a los mismos. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos
policlonales o monoclonales. Igualmente se presentan anticuerpos
quiméricos, de cadena única y humanizados, así como fragmentos Fab,
o el producto de una biblioteca de expresión de Fab. Se pueden usar
diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción
de tales anticuerpos.
Igualmente se presentan ligandos, es decir,
fármacos, de los receptores de estrógeno de la presente memoria
descriptiva. El término "ligando" como se usa en la presente
memoria descriptiva significa cualquier molécula que se une al
receptor de estrógeno de la presente invención. Estos ligandos
pueden tener bien propiedades agonistas, agonistas parciales,
antagonistas, antagonistas parciales, agonistas inversas o mezclas
de estas propiedades. De este modo, por ejemplo, un ligando que se
une a un receptor de estrógeno de la presente invención podría
modificar, inhibir o eliminar su función. De esta manera, el ligando
se puede usar para tratar o prevenir una enfermedad en la que está
implicado el receptor de estrógeno. Los ligandos contemplados en la
presente memoria descriptiva son los que tienen selectividad para
activar o inhibir específicamente los genes que están normalmente
regulados por los receptores de estrógeno de la presente
invención.
La presente invención se refiere también a
procedimientos para determinar si un ligando no conocido por su
capacidad de unirse a un receptor de estrógeno humano puede unirse a
un receptor de estrógeno humano. Estos procedimientos comprenden
poner en contacto una célula de mamífero que comprende una molécula
de ADN aislada que codifica un receptor de estrógeno humano con el
ligando en condiciones que permiten la unión de ligandos conocidos
para enlazarse a un receptor de estrógeno, detectar la presencia de
cualquiera del ligando unidos a un receptor de estrógeno humano, y
de este modo determinar si el ligando se une a un receptor de
estrógeno humano. En estos procedimientos, la célula de mamífero
está de hecho expresando las moléculas de ADN aisladas. La
metodología general para llevar a cabo tal procedimiento es bien
conocida por los expertos en la técnica. Véase el documento EP
787.797, de Weinshank et al., publicado el 6 de Julio de
1997. Alternativamente, el ARN que codifica finalmente el receptor
de estrógeno podría inyectarse en, por ejemplo en oocitos de
Xenopus, y se expresa y usa en experimentos análogos de ensayo.
También se presentan composiciones farmacéuticas
que comprenden los ligandos. Tales composiciones comprenden una
cantidad farmacéuticamente efectiva del ligando. El término
"cantidad farmacéuticamente efectiva", tal como se usa en la
presente memoria descriptiva, significa la cantidad del ligando que
elicitará la respuesta o el efecto terapéuticamente deseado cuando
se administra según el régimen de tratamiento deseado. El ligando se
administra típicamente mezclado con diluyentes, excipientes o
vehículos farmacéuticamente apropiados, denominados colectivamente
en la presente memoria descriptiva como "materiales
portadores", seleccionados apropiadamente respecto del modo de
administración, es decir, oral, intravenoso, nasal, parenteral,
ocular, etc. Se puede usar una gran variedad de formas de producto y
de dosificación bien conocidas por el experto en la técnica para
administrar estos ligandos.
Igualmente se presentan procedimientos para
tratar y/o prevenir enfermedades o afecciones mediadas por
receptores de estrógeno. Por "enfermedades o afecciones mediadas
por receptores de estrógeno" se entiende un estado fisiológico o
patológico en el cual está implicado un receptor de estrógeno. Los
ejemplos no limitativos de enfermedades o afecciones mediadas por
receptores de estrógeno incluyen las del sistema endocrino, los
órganos reproductivos, el tejido del seno, tejido óseo y el sistema
vascular, especialmente las enfermedades más extendidas en los
machos y hembras mayores. Más específicamente, tales enfermedades y
afecciones incluyen las seleccionadas del grupo constituido por
resorción ósea anormal, enfermedad cardiovascular, cáncer,
trastornos metabólicos y trastornos del sistema nervioso central.
Incluso más específicamente, tales enfermedades y afecciones
incluyen las seleccionadas a partir del grupo constituido por la
osteoporosis, cáncer de mama, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer
de próstata, diabetes y enfermedad de Alzheimer.
Los siguientes ejemplos describen y muestran,
además, realizaciones dentro del alcance de la presente
invención.
Ejemplo
1
La amplificación rápida 5' del producto de
extremos de ADNc (RACE) fue identificada realizando dos vueltas de
reacciones en cadena de polimerasa (PCR) sobre ADNc Maratón Ready de
testículos humanos (Producto #7114-1 de Clontech)
usando Vent Polymerase (Producto #254S de New England Biolabs). La
primera vuelta de PCR se llevó a cabo usando el oligonucleótido,
GGAGAAAGGTGCCCAGGTGTTGGCC (SEQ ID NO: 3) en la región de
codificación 5' del recepto beta de estrógeno humano (Número de
secuencia del Banco de Genes X99101) y el cebador Clontech AP1,
según las instrucciones del fabricante. La segunda vuelta de PCRT se
llevó a cabo usando uno de dos diferentes cebadores incrustados que
tienen las secuencias GTGGTCTGCCGACCAGGCCCACC (SEQ ID NO: 4) o
GGTGTTGGCCACAACACATTTGG (SEQ ID NO: 5) número de secuencia X99101
del bancos de genes) y el cebador Clontech AP2, según las
instrucciones del fabricante. El producto de PCR se subclonó en el
vector PCRAmScript (Producto #211188 de Stratagene) en E.
coli JM109 E. Este clon se secuenció sobre ambos cordones por
secuenciación de ciclo (Producto
#27-1694-01 de Pharmacia) según las
instrucciones del fabricante usando cebadores que corresponden a la
secuencia de vectores que tiene la siguiente secuencia
GTAATACGACTCACTATAGGGC (SEQ ID NO: 6) así como un cebador en el
extremo 5' del gen receptor beta del receptor de estrógeno humano
que tiene la siguiente secuencia GTTAGTGACATTGCTGGGAATGC (SEQ ID NO:
7). Se llevó a cabo otra secuenciación con cuatro cebadores
adicionales que tienen las siguientes secuencias:
- GATCAGAGGCTTCAGCGAAACAG (SEQ ID NO:8),
- GAACGCGTGGATTAGTGACTAGCC (SEQ ID NO:9),
- GGAGGAAGGAGAATTAAGGCTAG (SEQ ID NO:10), y
- GAGATAACAGCTGAGAAAACACC (SEQ ID NO:11).
Estos cuatro cebadores se derivaron del análisis
inicial de las secuencias. Las alineaciones y los análisis de
secuencias de las secuencias de nucleótidos y de proteínas se
llevaron a cabo usando los programas MacVector y Assem-
blyuLign (Oxford Molecular Group) así como el GCG Séquense Analyse Software Package (Madison, WI pileup).
blyuLign (Oxford Molecular Group) así como el GCG Séquense Analyse Software Package (Madison, WI pileup).
Ejemplo
2
Para obtener una sonda para su uso en el cribado
de una biblioteca de ADN genómico humano, se generó en primer lugar
ADNc de ARNm de testículo humano (producto #6535-1
de Clontech) usando un cebado oligo-dT y MMLV
Transcriptasa Inversa (producto #200420 de Stratagene según las
instrucciones del fabricante. El ADNc se amplificó por PCR usando el
soistema Boehringer Mannheim'sExpand High fidelity PCR system
(producto @#1732641) y dos cebadores que tienen las mismas
secuencias:
- GTGATGAATTACAGCATTCCCAGCAATGTCACTAACTTGGAAGG (SEQ ID NO: 12) y
- ATGGCCAAGCTTGGGTTCCAGTTCACCTCAGGGCCAGGCG (SEQ ID NO: 13).
El producto de PCR fue clonado en el vector TGEM
(producto # A3600 de Promega) en E. coli JM109. El producto
se secuenció en un cordón con un kit de secuenciación de ciclo de
Pharmacia (producto #27-1694-01)
según las instrucciones del fabricante usando nueve cebadores que
tienen las mismas secuencias:
- CTTGGAAGGTGGGCCTGGTCGGC (SEQ ID NO:14),
- GGAGAAAGGTGCCCAGGTGTTGGCC (SEQ ID NO: 15 que es idéntica a SEQ ID NO:3)
- CCGTTGCGCCAGCCCTGTTAACTGG (SEQ ID NO: 16),
- CGCAAGAGCTGCCAGGCCTGCCG (SEQ ID NO: 17),
- CCCCGAGCAGCTAGTGCTCACCC (SEQ ID NO: 18),
- CTTGGAGAGCTGTTGGATGGAGG (SEQ ID NO: 19).
- CTCTGTGTCAAGGCCATGATCC (DEQ ID NO: 20),
- CGTCAGGCATGCGAGTAACAAGGG (SEQ ID NO: 21), y
- GCAAGTCCTCCATCACGGGGTCCG (SEQ ID NO: 22),
que corresponde a la secuencia de
ADN publicada (Mosselman, S et al.,: Er\beta:
identification and characterization of a novel human estrogen
receptor, FEBS Letters 392, pp. 49-53 (1996).
Las alineaciones y análisis de secuencias de las secuencias de
nucleótidos y de proteínas se llevaron a cabo usando usando los
programas MacVector y AssemblyuLign (Oxford Molecular Group) así
como el GCG Séquense Analyse Software Package (Madison, WI
pileup).
El clon de ADNc obtenido fue digerido con las
enzimas de restricción Ncol y Kpnl para obtener un fragmento de
aproximadamente 500 pares de bases que corresponde al extremo 5' del
ADNc beta del receptor beta de estrógeno humano número X99101 de la
secuencia de banco de genes). Este fragmento se marcó con
P-32 y se usó para cribar una biblioteca de ADN
genómico humano (producto #946206 de Stratagene) según las
instrucciones del fabricante. Se cribaron un millón de placas de
bacteriofgagos y se eligieron diecisiete fagos hibridantes
potenciales. Estos fagos se reamplificaron y se cribaron usando una
sonda ligeramente más pequeña (es decir, un fragmento de
aproximadamente 300 pares de bases generado digiriendo el Clon
Erbeta humano con Ncol y PstI). Dos fagos positivos se purificaron
en placas y se usaron para la producción de ADN. Los fagos se
digirieron con NotI y BamHI para generar fragmentos más pequeños que
codifican la mayor parte del ADN de fago y estos se subclonaron en
pBluescript (Stratagene; #52324 del banco de genes). Hubo dos
fragmentos de un fago de aproximadamente 8,5 y 6 kb. Los subclones
genómicos de 8,5 y 7,7 kb se secuenciaron sobre ambos cordones con
un kit de secuenciación de ciclo de Pharmacia (producto
#27-1694-01) según las instrucciones
del fabricante usando cebadores derivados de la secuenciación del
producto 5'RACE (Ejemplo 1) Las alineaciones y análisis de
secuencias de las secuencias de nucleótidos y de proteínas se
llevaron a cabo usando los programas MacVector y AssemblyuLign
(Oxford Molecular Group) así como el GCG Séquense Analyse Software
Package (Madison, WI pileup).
<110> WILKINSON, HILARY
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> RECEPTOR DE ESTRÓGENO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 20047 Y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/058,271
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-09-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/060,520
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-09-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 548
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1647
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMAN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagaaaggt gcccaggtgt tggcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggtctgcc gaccaggccc acc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgttggcc acaacacatt tgg
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaatacgac tcactatagg gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> HUMANO
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttagtgaca ttgctgggaa tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcagaggc ttcagcgaaa cag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaacgcgtgg attagtgact agcc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaggaagga gaattaaggc tag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> HUMANO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipgagataacag ctgagaaaac acc
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 44
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<212> ADN
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<213> HUMANO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgatgaatt acagcattcc cagcaatgtc actaacttgg aagg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggccccaag cttgggttcc agttcacctc agggccaggc g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttggaaggt gggcctggtc ggc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagaaaggt gcccaggtgt tggcc
\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> HUMANO
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<400> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgttgcgcc agccctgtta ctgg
\hfill24
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> HUMANO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaagagct gccaggcctg ccg
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 23
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\hskip-.1em\dddseqskipccccgagcag ctagtgctca ccc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> DNA
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<213> HUMANO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttggagagc tgttggatgg agg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctgtgtca aggccatgat cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
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<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtcaggcat gcgagtaaca aggg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaagtcctc catcacgggg tccg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Un receptor de estrógeno aislado que
comprende la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 1 (figura
1).
2. Un receptor de estrógeno asilado según la
reivindicación 1 que se deriva de células de mamífero.
3. Un receptor de estrógeno asilado según la
reivindicación 1 que se deriva de células humanas.
4. Un polinucleótido aislado que codifica el
receptor de estrógeno que tiene la secuencia de amino ácidos SEQ ID
NO: 1.
5. El polinucleótido según la reivindicación 4
en el que el polinucleótido es ADN.
6. El ADN según la reivindicación 5 en el que el
ADN es ADNc.
7. Un polinucleótido aislado que comprende la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2: (figura 2).
8. Un vector que contiene el ADN según la
reivindicación 5.
9. Una célula huésped transformada o
transfectada con un vector según la reivindicación 8.
10. Un procedimiento para producir un receptor
de estrógeno que comprende:
expresar a partir de una célula huésped según la
reivindicación 9 el receptor de estrógeno codificado par dicho
ADN.
11. Un procedimiento para determinar si un
ligando no conocido por su poder de unión a un receptor de estrógeno
humano se puede unir a un receptor de estrógeno humano,
comprendiendo dicho procedimiento:
- (a)
- poner en contacto una célula de mamífero, que comprende una molécula de ADN aislada que codifica un receptor de estrógeno humano que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, con el ligando en condiciones que permiten la unión de ligandos conocidos por su unión a un receptor de estrógeno.
- (b)
- Detectar la presencia de cualquiera del ligando unido a un receptor de estrógeno humano, y
- (c)
- Determinar si el ligando se une a un receptor de estrógeno humano.
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