ES2268682T3 - Marcadores de adn de polimorficos conteniendo tres secuencias repetitivas de microsatelites con alta capacidad de informacion. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A MARCADORES POLIMORFICOS (DOS POLIMORFISMOS DE REPETICION DE UN DINUCLEOTIDO, Y DOS TETRANUCLEOTIDOS Y 27 MARCADORES CARACTERIZADOS POR PARES DE CEBO 1A-27A) QUE SON UTILES PARA LA INDIVIDUALIZACION HUMANA. SUS APLICACIONES SE DAN EN MEDICINA FORENSE Y PRUEBAS PRENATALES Y DE PATERNIDAD ASI COMO EN CARTOGRAFIA GENETICA. ESTOS MARCADORES SE CARACTERIZA POR JUEGOS DE CEBOS OLIGONUCLEOTIDOS DE ACUERDO CON LA INVENCION UTILES EN LA AMPLIFICACION DE PCR Y RESOLUCION DE SEGMENTOS DE ADN. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A UNA PRUEBA PAR MEDIR LAS DIFERENCIAS SUTILES EN MATERIAL GENETICO RESPECTO DE UN JUEGO AÑADIDO O OMITIDO DE POLIMORFISMOS DE REPETICION DE DINUCLEOTIDOS O TETRANUCLEOTIDOS QUE CONSISTE EN OBTENER UNA CANTIDAD DE SEGMENTOS DE NUCLEOTIDO EFECTIVAS PARA PROBAR, AMPLIFICAR LOS SEGMENTOS POR EL PROCESO DE PCR USANDO AL MENOS UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDA DE CEBO DE ACUERDO CON LA PRESENTE INVENCION, RESOLVER LOS SEGMENTOS AMPLIFICADOS USANDO ELECTROFORESIS, Y COMPARAR LOS SEGMENTOS RESUELTOS POR AUTORRADIOGRAFIA PARA OBSERVAR LAS DIFERENCIAS EN MODELOS DE MIGRACIONES DEBIDAS A LAS DIFERENCIAS ESTRUCTURALES. EN ENSAYO DE ACUERDO CON LA INVENCION ES FACIL DE REALIZAR Y LOS RESULTADOS SE PUEDEN OBTENER EN 24 HORAS. NO ES EXTRAÑO QUE LOS RESULTADOS ESTEN DISPONIBLES EN 3-4 HORAS. POR CONSIGUIENTE, LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UN PROCESO PCR MEJORADO Y UN ENSAYO PCR QUE COMPRENDE NUCLEOTIDOS SEGUN LA INVENCION.
Description
Marcadores de ADN de polimórficos conteniendo
tres secuencias repetitivas de microsatélites con alta capacidad de
información.
Esta solicitud se refiere a pruebas genéticas
con marcadores de ADN polimórficos con secuencias repetidas a fin
de lograr un proceso de alta resolución idóneo para distinguir los
segmentos objetivo de ácido nucleico sobre la base de las
diferencias nucleótidas según la individualización humana por la
que los segmentos de ácido nucleico difieren en tamaño.
La ciencia se ha interesado mucho en la
identificación de la individualización humana y las relaciones
genéticas entre individuos. Cada individuo posee un material
hereditario (ADN, "nucleótidos") que es único de dicho
individuo y de un material hereditario que está relacionado con el
de otros. Se han desarrollado procedimientos que están basados en
la identificación y la caracterización de los cambios en el ADN,
que son cambios en el ADN (polimorfismos de ADN) debidos a una
substitución, inserción o supresión nucleótida dentro de las
cadenas de ADN.
En el campo de la medicina forense, por ejemplo,
ha habido mucho interés por dichos polimorfismos a efectos de
identificación. Los genetistas forenses han desarrollado muchas
técnicas para comparar segmentos de ADN homólogos a fin de
determinar si dichos segmentos son idénticos o si difieren en uno o
más nucleótidos. Las aplicaciones prácticas de estas técnicas están
relacionadas también con otros campos, además de la medicina
forense, por ejemplo, el diagnóstico de enfermedades genéticas y el
mapeado del genoma humano.
Actualmente, en esta especialidad la manera más
precisa e informativa de comparar segmentos de ADN requiere un
método que proporciona la secuencia de nucleótido completa de cada
segmento de ADN. Se han desarrollado técnicas específicas para la
determinación de las secuencias reales a fin de estudiar las
mutaciones en los genes humanos. (Véase, por ejemplo, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 85, 544-548 (1988) y
Nature 330, 384-386 (1987). Sin embargo,
debido a la gran cantidad de tiempo y a los altos costes necesarios
para determinar, interpretar y comparar la información de las
secuencias, actualmente no es práctico utilizar la secuenciación
extensiva si no es para comparar sólo unos pocos segmentos de
ADN.
En el mapeo genético, la exploración que se
suele utilizar con mayor frecuencia para los polimorfismos de ADN
derivados de mutaciones consiste en digerir la cadena de ADN con
endonucleasas de restricción y en analizar los fragmentos
resultantes mediante Southern blots. Véase Am. J. Hum. Genet.
32, 314-331 (1980) o Sci. Am. 258,
40-48 (1988). Puesto que las mutaciones suelen
ocurrir de forma aleatoria, pueden afectar a la secuencia de
reconocimiento de la endonucleasa y excluir la segmentación
enzimática en ese lugar. El mapeo de polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción (RFLPS) se basan en los cambios en
el lugar de restricción. Son precisos pero no muy informativos (CIP
[0,3]). El principal problema de los RFLP es que ninguna prueba
puede detectar los cambios que no afectan a la adhesión con una
endonucleasa de restricción. Como en muchos de los métodos de
prueba de la ciencia del ADN, los métodos utilizados para detectar
los RFLP exigen una gran cantidad de trabajo y son caros,
especialmente las técnicas que incluyen un análisis Southern
blot.
Otra técnica para detectar mutaciones
específicas en segmentos determinados de ADN implica la
hibridización de los segmentos de ADN que se están analizando (ADN
objetivo) con una sonda oligonucleótida etiquetada complementaria.
Véase Nucl. Acids Res. 9, 879-894 (1981).
Puesto que las dobles cadenas de ADN que contienen aunque sea un
único mal apareamiento presentan una inestabilidad térmica elevada,
su puede utilizar la temperatura diferencial de fusión para
distinguir ADN objetivo, que son perfectamente complementarios con
la sonda del ADN objetivo, que únicamente difiere en un sólo
nucleótido. Este método ha sido adaptado para detectar la presencia
o la ausencia de un lugar de restricción específico, patente
estadounidense Nº 4.683.194. Este método implica utilizar una sonda
oligonucleótida de etiquetado final que abarque un lugar de
restricción que es hibridizado para que dé un objetivo de ADN.
Después se incuba la doble cadena de ADN hibridizada con la enzima
de restricción apropiada para este lugar. Los lugares de
restricción reformados serán adheridos por digestión en el par de
dobles cadenas entre la sonda y el objetivo utilizando la
endonucleasa de restricción. Si se detectan moléculas de sonda
acortadas, el lugar de restricción específico está presente en el
ADN objetivo.
Otro proceso para estudiar las diferencias en la
estructura del ADN es el proceso de extensión del iniciador, que
consiste en hibridizar un iniciador oligonucleótido etiquetado a
una plantilla de ADR o ADN y luego utilizar una polimerasa de ADN y
desoxinucleósidos trifosfatos para extender el iniciador al extremo
5' de la plantilla. Entonces se efectúa la resolución del producto
de extensión del iniciador etiquetado, mediante fraccionamiento
basado en el tamaño, p. ej., mediante electroforesis mediante
un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Este proceso se suele
utilizar para comparar segmentos de ADN homólogos y para detectar
diferencias debidas a la inserción o la supresión nucleótida. Las
diferencias debidas a la substitución nucleótida no se detectan,
puesto que el tamaño es el único criterio utilizado para
caracterizar el producto de extensión del iniciador.
\newpage
Otro proceso explota el hecho de que la
incorporación de algunos análogos nucleótidos al ADN causa un
cambio incremental de movilidad cuando el ADN está sujeto a un
proceso de fraccionamiento del tamaño, como la electroforesis. Loa
análogos nucleótidos se pueden utilizar para identificar cambios,
puesto que pueden provocar un cambio de movilidad electroforética.
Véase, la patente estadounidense Nº 4.879.214.
Desgraciadamente, las técnicas precedentes
utilizadas para la identificación de polimorfismos o bien no son
muy informativas, o bien requieren un largo tiempo de ejecución.
Por ejemplo, las técnicas que identifican cambios en nucleótidos
individuales de una cadena de ADN específica, suelen requerir de
tres a cuatro días de ejecución como mínimo. Por lo tanto, tales
pruebas requieren mucho trabajo y son caras.
Además, las diferencias genéticas sutiles entre
individuos relacionados relativas a los nucleótidos que son
substituidos en las cadenas de ADN son difíciles de detectar. Las
sondas de VNTR o Jeffrey (que utiliza el FBI para someter a prueba
e identificar las cadenas de ADN) son muy informativas pero exigen
mucho trabajo, a diferencia de los microsatélites como los
nuestros, que son PCR igualmente informativos basados en
polimorfos.
Weber & May 89 Am Hum Genet 44:388, Litt
& Luthy '89 Am Hum Genet 44:397 han descrito el uso de cierto
polimorfismo de repetición de nucleótidos para la identificación o
la comparación de segmentos de ADN. Sin embargo, antes no se
conocían ni intuían los segmentos e iniciadores específicos de
polimorfismo genético utilizados para identificar los
polimorfismos(a efectos de identificación y comparación) de
la presente invención.
EMBO J., vol. 2 1983, pp.
757-761, Moos et al. describen un pseudo gen
parecido a la \beta^{2}actina,
H\beta^{2}Ac-\psi2, que está precedido por
una región de 230 bp donde la secuencia simple
5'-GAAA-3' se repite más de 40
veces.
Por lo tanto, esta ciencia necesita una técnica
rápida, simple, económica y precisa, con un valor de resolución muy
alto, para determinar las relaciones entre individuos y las
diferencias de grado de las relaciones. Además, esta ciencia
también necesita un procedimiento de prueba muy preciso de las
relaciones genéticas que utilice cantidades muy pequeñas de muestra
de ADN original, pero que produzca resultados muy precisos. Esto es
particularmente cierto en el ámbito de la medicina forense y la
criminología, puesto que muchas veces las muestras de ADN de que se
dispone para las pruebas son muy pequeñas.
Un propósito de la presente invención es
proporcionar una prueba rápida y precisa que permita medir las
diferencias sutiles entre individuos mediante pruebas
genéticas.
Otro propósito de la invención se refiere a los
marcadores polimórficos que se pueden utilizar para la
individualización humana.
Otro propósito más de la invención es
proporcionar una técnica rápida y precisa para medir las
diferencias sutiles entre individuos mediante pruebas genéticas que
puedan ser aplicadas en múltiples campos, p. ej., búsquedas
forenses, exploraciones de paternidad y prenatales, y mapeo
genético.
Aún otro propósito más es proporcionar un método
mejorado para llevar a cabo un procedimiento de PCR mediante la
utilización de una cantidad efectiva de un nucleótido de acuerdo
con la presente invención y proporcionar un conjunto de ensayos de
PCR que comprenda una cantidad efectiva de un nucleótido de acuerdo
con la presente invención y a los reactivos secundarios del
PCR.
La Figura 1 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 1.
La Figura 2 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 2.
La Figura 3 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 3.
La Figura 4 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 4.
La Figura 5 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 5.
La Figura 6 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 6.
La Figura 7 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 7.
La Figura 8 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 8.
La Figura 9 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 9.
La Figura 10 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 10.
La Figura 11 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 11.
La Figura 12 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 12.
La Figura 13 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 13.
La Figura 14 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 14.
La Figura 15 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 15.
La Figura 16 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 16.
La Figura 17 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 17.
La Figura 18 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 18.
La Figura 19 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 19.
La Figura 20 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 20.
La Figura 21 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 21.
La Figura 22 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 22.
La Figura 23 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 23.
La Figura 24 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 24.
La Figura 25 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 25.
La Figura 26 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 26.
La Figura 27 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 27.
La Figura 28 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 28.
La Figura 29 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 29.
La Figura 30 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 30.
La Figura 31 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 31.
La Figura 32 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 32.
La Figura 33 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 33.
La Figura 34 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 34.
La Figura 35 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 35.
La Figura 36 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 36.
La Figura 37 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 37.
La Figura 38 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 38.
La Figura 39 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 39.
La Figura 40 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 40.
La Figura 41 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 41.
La Figura 42 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 42.
La Figura 43 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 43.
La Figura 44 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 44.
La Figura 45 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 45.
La Figura 46 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 46.
La Figura 47 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 47.
La Figura 48 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 48.
La Figura 49 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 49.
La Figura 50 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 50.
La Figura 51 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 51.
La Figura 52 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 52.
La Figura 53 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 53.
La Figura 54 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 54.
La Figura 55 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 55.
La Figura 56 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 56.
La Figura 57 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 57.
La Figura 58 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 58.
La Figura 59 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 59.
La Figura 60 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 60.
La Figura 61 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 61.
La Figura 62 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 62.
La Figura 63 se refiere a una secuencia de
nucleótido según el Nº ID SEC: 63.
La presente invención proporciona una prueba
rápida y precisa para medir las diferencias genéticas sutiles en
los individuos mediante pruebas genéticas. La invención se refiere
además a los marcadores polimórficos (polimorfismos de repetición
de dos tetranucleótidos y un dinucleótido) que se pueden utilizar
para la individualización humana. Esta técnica y estos marcadores,
según la invención, se puede aplicar, por ejemplo, en búsquedas
forenses, exploraciones de paternidad y prenatales, y también en el
mapeo genético.
La invención se refiere a marcadores
polimórficos (polimorfismo de repetición de dos tetranucleótidos, y
de un dinucleótido) que son útiles para la individualización
humana de la búsqueda forense, y para exploraciones de paternidad y
prenatales, así como también para el mapeo genético. Los marcadores
según la presente invención tienen un alto valor en contenido de
información sobre polimorfismos (CIP). Los marcadores se
caracterizan por conjuntos de iniciadores oligonucleótidos, como
sigue:
- 1.
- Conjunto 1, CIP 0,92
- a.
- Una secuencia de nucleótido según el Nº ID SEC: 1.
- b.
- Una secuencia de nucleótido según el Nº ID SEC: 2.
- 2.
- Conjunto 2, CIP 0,91
- a.
- Una secuencia de nucleótido según el Nº ID SEC: 3.
- b.
- Una secuencia de nucleótido según el Nº ID SEC: 4.
- 3.
- Conjunto 3, CIP 0,92
- a.
- Una secuencia de nucleótido según el Nº ID SEC: 5.
- b.
- Una secuencia de nucleótido según el Nº ID SEC: 6.
Estos marcadores polimórficos (polimorfismos de
repetición de dos tetranucleótidos y un dinucleótido que también
van acompañados de secuencias nucleótidas de principio y final),
que pueden ser utilizados para la individualización humana, se
caracterizan además por las siguientes secuencias de marcador.
- 1.
- Una secuencia de nucleótido que tiene un polimorfismo repetido de acuerdo con el Nº ID SEC: 7.
- 2.
- Una secuencia de nucleótido que tiene un polimorfismo repetido de acuerdo con el Nº ID SEC: 8.
- 3.
- Una secuencia de nucleótido que tiene un polimorfismo repetido de acuerdo con el Nº ID SEC: 9.
Puesto que un marcador polimórfico y un carácter
dominante raro se producen como "par", el incorporar un
iniciador oligonucleótido según la presente invención al marcador
polimórfico permite una amplificación PCR del par segmental.
Entonces, el segmento de ADN amplificado se puede resolver mediante
electroforesis y autoradiografía. Después, la autoradiografía
resultante se puede analizar para ver su similitud con la
autoradiografía de otro segmento de ADN. Después del procedimiento
de amplificación PCR, se pueden utilizar opcionalmente análogos de
ADN potenciadores de la movilidad electroforética a fin de
incrementar la precisión de la etapa de electro-
foresis.
foresis.
Otras veintisiete secuencias de par primario
para la detección de polimorfismos únicos son secuencias según el
Nº ID SEC: 10 y hasta el Nº ID SEC: 63, y aquí se revelan solamente
a efectos comparativos y no forman parte de la invención.
Los polimorfismos descritos son útiles para la
individualización de muestras humanas, gracias a sus altos valores
de CIP. Puesto que los polimorfismos descritos se basan en la
reacción de la cadena de polimerasa, para cada prueba sólo se
necesitan cantidades mínimas de ADN genómico. Las secuencias
objetivo van de 69 a 260 bps de longitud, de manera que no se
requiere un ADN de alto peso molecular y los problemas usuales,
tales como cizalla del ADN, tendrán un impacto mínimo en la
ejecución del ensayo. El ensayo es fácil de realizar y se pueden
obtener los resultados en 24 horas. Se ha demostrado que los
polimorfismo de repetición de microsatélite son herramientas útiles
para los análisis de ADN. Los 27 polimorfismos comparativos aquí
descritos son originales y se basan en genes humanos previamente
secuenciados. La técnica de uso más común en las búsquedas forenses
se basa en los marcadores de minisatélite, a diferencia de los
microsatélites para PCR aquí descritos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los 27 marcadores comparativos se caracterizan
por conjuntos de iniciadores oligonucleótidos, como sigue:
Además, la invención se refiere a un método para
ejecutar un procedimiento de PCR que implica utilizar una cantidad
efectiva de un nucleótido por lo menos, según la invención, como se
establece más arriba, donde el nucleótido es parte de un par
iniciador de nucleótidos seleccionado entre el grupo de pares
nucleótidos consistente en
- a)
- una secuencia de nucleótido que tiene la secuencia según se establece en Nº ID SEC: 1 y una secuencia de nucleótido según se establece en Nº ID SEC: 2;
- b)
- una secuencia de nucleótido que tiene la secuencia según se establece en Nº ID SEC: 3 y una secuencia de nucleótido según se establece en Nº ID SEC: 4; y
- c)
- una secuencia de nucleótido que tiene la secuencia según se establece en Nº ID SEC: 5 y una secuencia de nucleótido según se establece en Nº ID SEC: 6.
Por lo tanto, la invención se refiere además a
un ensayo para medir las diferencias sutiles en material genético
referentes a un conjunto añadido u omitido de polimorfismo de
repetición de dinucleótidos o tetranucleótidos seleccionados entre
el grupo consistente en una secuencia según Nº ID SEC: 7, una
secuencia según Nº ID SEC: 8 y una secuencia según Nº ID SEC: 9, que
incluye
- a.
- obtener segmentos nucleótidos que comprendan dichos polimorfismos de repetición en una cantidad efectiva para las pruebas,
- b.
- amplificar dichos segmentos mediante un procedimiento de PCR utilizando un par de iniciadores oligonucleótidos capaces de amplificar dichos segmentos contenedores de polimorfismos,
- c.
- resolver los segmentos amplificados utilizando electroforesis con geles PAGE, y
- d.
- comparar los segmentos resueltos mediante autoradiografía a fin de observar las diferencias en los patrones de migración debidas a variaciones de longitud.
Preferiblemente, la invención se refiere además
a un ensayo para medir las diferencias sutiles en material
genético referentes a un conjunto añadido u omitido de polimorfismo
de repetición de dinucleótidos o tetranucleótidos seleccionados
entre el grupo consistente en una secuencia según Nº ID SEC: 7, una
secuencia según Nº ID SEC: 8 y una secuencia según Nº ID SEC: 9, que
incluye
- a.
- obtener segmentos nucleótidos que comprendan dichos polimorfismos de repetición en una cantidad efectiva para las pruebas,
- b.
- amplificar dichos segmentos mediante un procedimiento de PCR utilizando el par de iniciadores oligonucleótidos seleccionados entre el grupo consistente en una secuencia según Nº ID SEC: 1, una secuencia según Nº ID SEC: 2, una secuencia según Nº ID SEC: 3, una secuencia según Nº ID SEC: 4, una secuencia según Nº ID SEC: 5, o una secuencia según Nº ID SEC: 6,
- c.
- resolver los segmentos amplificados utilizando electroforesis con geles PAGE, y
- d.
- comparar los segmentos resueltos mediante autoradiografía a fin de observar las diferencias en los patrones de migración debidas a variaciones de longitud.
Todavía más, la invención se refiere a un
conjunto de ensayos para ejecutar un procedimiento de PCR que
comprenda una cantidad efectiva de por lo menos un nucleótido con
una secuencia según la invención, como se establece más arriba,
donde el nucleótido es parte de un par de iniciadores nucleótidos
seleccionado del grupo de un par de iniciadores oligonucleótidos
consistente en
- a)
- una secuencia de nucleótido que tiene la secuencia según se establece en Nº ID SEC: 1 y una secuencia de nucleótido según se establece en Nº ID SEC: 2;
- b)
- una secuencia de nucleótido que tiene la secuencia según se establece en Nº ID SEC: 3 y una secuencia de nucleótido según se establece en Nº ID SEC: 4; y
- c)
- una secuencia de nucleótido que tiene la secuencia según se establece en Nº ID SEC: 5 y una secuencia de nucleótido según se establece en Nº ID SEC: 6;
donde dicho nucleótido es una combinación de una
cantidad efectiva de reactivos secundarios del PCR.
Por lo tanto, los polimorfismos descritos más
arriba son útiles para la individualización de muestras humanas,
gracias a sus altos valores de CIP. Puesto que los sistemas
polimórficos descritos se basan en la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), para cada prueba sólo se requieren cantidades muy
pequeñas (40 nanogramos) de ADN genómico. Las secuencias objetivo
van de 92 a 310 pares base de manera que no se requiere ADN de alto
peso molecular, y los problemas normales tales como cizalla del ADN
tendrán un impacto mínimo en la ejecución del ensayo. El ensayo es
fácil de realizar y se pueden obtener los resultados en 24 horas.
No es raro que se pueda disponer de los resultados en 3 o 4 horas.
En comparación, los anteriores métodos de esta ciencia requieren
varios días antes de que se pueda disponer de los resultados, por
lo general, 3 o 4 días.
Además, el ensayo según la invención es capaz de
detectar diferencias muy pequeñas en las secuencias nucleótidas.
Una única omisión o adición de la secuencia de repetición cambiará
la movilidad debido a la naturaleza eléctrica y al peso molecular
de la secuencia de nucleótido objetivo. Estas diferencias se ven
claramente en las autoradiografías posteriores a la
electroforesis.
Se ha demostrado que los polimorfismo de
repetición de microsatélite son herramientas útiles para los
análisis de ADN. Los tres polimorfismos aquí descritos son
originales y se basan en genes previamente secuenciados. Los dos
marcadores tetranucleótidos de repetición descritos, se pueden
computar fácilmente puesto que los tamaños de los alelos difieren
en cuatro pares. La técnica más comúnmente utilizada en las
búsquedas forenses se basa en marcadores de minisatélite, a
diferencia de los microsatélites para PCR descritos en la presente
invención.
La etapa general de la técnica PCR generalmente
se realiza como se describe en la patente estadounidense Nº
4.683.195 para Mullis et al. y en la patente estadounidense
Nº 4.683.202 para Mullis et al. Además, durante el
procedimiento de réplica y amplificación de PCR, se pueden utilizar
opcionalmente los análogos de potenciación de la motilidad
eléctrica del ADN.
El grado de polimorfismo en los segmentos
genéticos según la presente invención, unos polimorfismos que
producen unos resultados muy informativos de la prueba de
identificación, es sorprendente e inesperado. El alto valor CIP
(aproximadamente 0,9) es totalmente inesperado.
En consecuencia, el uso de un procedimiento de
PCR y de pares iniciadores de PCR, tales como las secuencias de
iniciador según el Nº ID SEC: 1 y hasta el Nº ID SEC: 6, para
detectar el segmento de polimorfismo del ADN según la presente
invención, produce unos resultados excelentes. Tales resultados son
suficientemente precisos e informativos como para identificar con
precisión los segmentos de ADN y determinar grados de relación entre
los segmentos de ADN de los individuos. Además, el llevar a cabo
tres series de procedimientos de PCR con las mismas muestras de
segmentos de ADN, utilizando al mismo tiempo un par iniciador de
PCR diferente según la presente invención para cada uno de los tres
procedimientos, produce unos resultados de la prueba
extraordinariamente precisos e informativos. La comparación de las
tres series de datos resultado de las pruebas proporciona una
identificación de los segmentos de ADN extremadamente precisa.
Se presentan los siguientes ejemplos a fin de
describir más específicamente la invención, aunque ésta no se
limita a los siguientes ejemplos.
Los iniciadores oligonucleótidos descritos se
utilizan para amplificar las secuencias objetivo mediante PCR, bajo
las condiciones siguientes:
Las muestras de ADN se preparan como sigue.
Se utilizan como plantillas para PCR 60 ng de
ADN genómico con 80 ng de cada iniciador oligonucleótido, 0,6
unidades de Taq Polymerase 50 mM KCL, 10 mM Tris (pH 8,3), 1,5 mM
MgCl_{2}, 0,01% de gelatina, 200uM de cada dGTP, dATP, dTTP, 2,5
uM dCTP y 10 microcuries de alfa P32 dCTP., en un volumen de
reacción final de 15 microlitros. Las muestras se cubren con 15
microlitros de aceite mineral para evitar la evaporación.
Se lleva a cabo el PCR para cada una de las
muestras e iniciadores descritos en el Ejemplo 1, más arriba.
El PCR se lleva a cabo en un termociclador de
microplacas Techne MW-1 bajo las siguientes
condiciones: desnaturalización de 94ºC durante 1,4 min.,
emparejamiento a 55ºC durante 2 min., y extensión a 72ºC durante 2
min. Se repite el ciclo 30 veces con una extensión final a 72ºC
durante 10 min.
Los segmentos de ADN amplificados para cada una
de las muestras descritas en el Ejemplo 2 más arriba se resuelven
mediante electroforesis, como sigue.
Se somete a electroforesis dos microlitros de
cada muestra de mezcla de reacción de PCR en un gel de
secuenciación PAGE al 6% y se los visualiza mediante
autoradiografía. Los tiempos de exposición para la autoradiografía
van de 3 a 16 horas.
La descripción precedente de las
ejemplificaciones específicas revelará de forma tan completa la
naturaleza general de la invención que otros podrán, aplicando los
conocimientos actuales, modificar y/o adaptar rápidamente dichas
ejemplificaciones específicas a las diferentes aplicaciones sin
desviarse del concepto genérico y, por lo tanto, se pretende que
dichas adaptaciones queden comprendidas dentro del significado y el
rango de equivalencias de una ejemplificación divulgada. Hay que
entender que la fraseología o la terminología empleadas aquí lo son
solamente a efectos descriptivo, y no limitativos.
Claims (11)
1. Un método para preparar una secuencia de
nucleótido seleccionada entre el grupo consistente en una secuencia
según Nº ID SEC: 1, una secuencia según Nº ID SEC: 2, una secuencia
según Nº ID SEC: 3, una secuencia según Nº ID SEC: 4, una secuencia
según Nº ID SEC: 5, o una secuencia según Nº ID SEC: 6.
2. Un método según la Reivindicación 1, en donde
la secuencia es una secuencia según Nº ID SEC: 1.
3. Un método según la Reivindicación 1, en donde
la secuencia es una secuencia según Nº ID SEC: 2.
4. Un método según la Reivindicación 1, en donde
la secuencia es una secuencia según Nº ID SEC: 3.
5. Un método según la Reivindicación 1, en donde
la secuencia es una secuencia según Nº ID SEC: 4.
6. Un método según la Reivindicación 1, en donde
la secuencia es una secuencia según Nº ID SEC: 5.
7. Un método según la Reivindicación 1, en donde
la secuencia es una secuencia según Nº ID SEC: 6.
8. Un método para llevar a cabo un procedimiento
de reacción en cadena de la polimerasa para detectar un conjunto
añadido u omitido de polimorfismos de repetición dinucleótidos o
tetranucleótidos, donde dicho método resulta en un contenido de
información sobre el polimorfismo del 0,9 aproximadamente, incluido
el uso de una cantidad efectiva de un par de iniciadores
oligonucleótidos que comprendan como mínimo un fragmento de ADN
según la Reivindicación 1, donde dicho par de iniciadores
oligonucleótidos se selecciona entre el grupo que consiste en
- a)
- una secuencia según se establece en Nº ID SEC: 1 y secuencia según se establece en N4 ID SEC: 2;
- b)
- una secuencia según se establece en Nº ID SEC: 3 y una secuencia según se establece en Nº ID SEC: 4; y
- c)
- una secuencia según se establece en Nº ID SEC: 5 y una secuencia según se establece en Nº ID SEC: 6.
9. Un ensayo in vitro para medir las
diferencias del material genético a fin de detectar un conjunto
añadido u omitido de polimorfismos de repetición dinucleótidos o
tetranucleótidos en búsquedas forenses, exploraciones de paternidad
y prenatales, o mapeo genético, donde dicha prueba resulta en un
contenido de información de polimorfismo del 0,9 aproximadamente y
donde dicho material genético comprende un fragmento de ADN que
comprende una secuencia de nucleótido seleccionada entre el grupo
consistente en una secuencia según Nº ID SEC: 7, una secuencia
según Nº ID SEC: 8 y una secuencia según Nº ID SEC: 9, cuya prueba
comprende
- a.
- obtener un fragmento de ADN que comprenda dichos polimorfismos de repetición en cantidad suficiente para las pruebas,
- b.
- amplificar dicho fragmento de ADN mediante un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa utilizando un par de iniciadores oligonucleótidos que amplifican dicho fragmento de ADN,
- c.
- resolver el fragmento de ADN amplificado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, y
- d.
- comparar los fragmentos de ADN resueltos mediante autoradiografía a fin de observar las diferencias en los patrones de migración debidas a variaciones de longitud.
10. Un ensayo según la Reivindicación 9, en
donde dicho par de iniciadores oligonucleótidos se selecciona del
grupo consistente en una secuencia según Nº ID SEC: 1, una
secuencia según Nº ID SEC: 2, una secuencia según Nº ID SEC: 3, una
secuencia según Nº ID SEC: 4, una secuencia según Nº ID SEC: 5, o
una secuencia según Nº ID SEC: 6.
11. Un método para preparar un conjunto de
ensayos para llevar a cabo un procedimiento de reacción en cadena
de la polimerasa para detectar un conjunto añadido u omitido de
polimorfismos de repetición dinucleótidos o tetranucleótidos, donde
dicho ensayo resulta en un contenido de información sobre el
polimorfismo del 0,9 aproximadamente, que incluye preparar una
cantidad efectiva de un par de iniciadores oligonucleótidos que
comprendan como mínimo un fragmento de ADN que tiene una secuencia
según la Reivindicación 1, donde dicho par de iniciadores
oligonucleótidos se selecciona entre el grupo que consiste en
- a)
- una secuencia según se establece en Nº ID SEC: 1 y secuencia según se establece en Nº ID SEC: 2;
- b)
- una secuencia según se establece en Nº ID SEC: 3 y una secuencia según se establece en Nº ID SEC: 4; y
- c)
- una secuencia según se establece en Nº ID SEC: 5 y una secuencia según se establece en Nº ID SEC: 6, en combinación con una cantidad efectiva de reactivos secundarios de reacción de la cadena de polimerasa.
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