ES2260413T3 - Procedimientos de identificacion de compuestos que modulan el transporte inverso del colesterol. - Google Patents
Procedimientos de identificacion de compuestos que modulan el transporte inverso del colesterol.Info
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Abstract
Método para la selección, la identificación o la caracterización in vitro de compuestos capaces de modular el transporte inverso del colesterol, que comprende: - la puesta en contacto, en presencia del receptor FXR o de un equivalente funcional del receptor FXR, de un compuesto de prueba con una construcción de ácido nucleico que comprende al menos una copia de un elemento de respuesta al FXR del promotor del gen humano de la apoliproteina AI o de una variante funcional del mismo, y - la determinación del efecto de la presencia del compuesto de prueba sobre el enlace del FXR con el elemento de respuesta.
Description
Procedimientos de identificación de compuestos
que modulan el transporte inverso del colesterol.
La presente invención se refiere a unos métodos
y a unos compuestos susceptibles de modular el transporte inverso
del colesterol en un mamífero así como a unos métodos de cribado que
permiten seleccionar, identificar y/o caracterizar unos compuestos
capaces de modular el transporte inverso del colesterol. La
invención se refiere también a unas células, vectores y
construcciones genéticas utilizables para la realización de estos
métodos, así como a unas composiciones farmacéuticas destinadas al
tratamiento de la arteriosclerosis.
La arteriosclerosis es una causa principal de
morbidez, de mortalidad, de infarto de miocardio, de isquemia
cerebral, de enfermedades cardiovasculares y de la vascularización
periférica. La hipercolesterolemia y la sobrecarga de colesterol de
los macrófagos, implicada en la inflamación vascular, son factores
principales que contribuyen a la arteriosclerosis. La
hipercolesterolemia es tratada actualmente gracias a la combinación
de un régimen alimenticio y de una intervención medicamentosa con,
por ejemplo, estatinas o agentes secuestrantes de los ácidos
biliares. De todas formas es necesario desarrollar nuevas
estrategias terapéuticas para paliar los límites de las terapias
existentes.
El transporte inverso del colesterol, realizado
por las HDL ("High Density Lipoproteins" o lipoproteínas de
alta densidad), permite descargar el colesterol que se acumula en
los tejidos periféricos y asegura su eliminación metabólica a
través del hígado. Contribuye así a la protección del organismo
contra la arteriosclerosis. La apolipoproteina A-I
(apo AI) es un constituyente fundamental de las HDL, responsable de
su eficacidad. A este respecto, el aumento de la expresión de la
apo AI tiene un efecto protector contra la arteriosclerosis. La
expresión de la apo AI es regulada por unas hormonas o agentes
terapéuticos tales como los fibratos. Se ha demostrado la función
crucial de receptores nucleares tales como el HNF4, PPAR\alpha o
ROR\alpha en el control de la transcripción del gen apo AI. El
PPAR\alpha es en particular responsable del aumento de la
expresión de la apo AI por los fibratos observada en el hombre y
utilizada en clínica humana para el tratamiento de las
dislipidemias. La identificación de nuevas vías de señalización
intracelular implicadas en el control de la expresión de la apo AI
permitiría por lo tanto definir nuevas estrategias terapéuticas
susceptibles de aumentar la eficacia del transporte inverso del
colesterol y por lo tanto proteger contra la arterios-
clerosis.
clerosis.
Los receptores nucleares de las hormonas forman
una gran familia de factores de transcripción cuya actividad es
modulable mediante unos ligandos naturales y/o artificiales. Estos
factores de transcripción controlan la expresión de sus genes diana
enlazándose generalmente a unos elementos de respuesta específicos
que actúan en cis y reclutan unas proteínas accesorias necesarias
para la activación de la maquinaria transcripcional.
El receptor FXR, también conocido como RIP14 o
NR1H4, ha sido inicialmente identificado como receptor de los
farnesoides. Actúa formando un heterodímero con el receptor RXR,
también miembro de esta familia de proteínas (cf. Lafitte B A et
al.: Journal of Biological Chemistry. 2000, 275 (14):
10638-10647). El documento
US-A-5 721 096 describe unos
métodos de cribado de unos compuestos capaces de activar la
expresión del gen que codifica para la apo AI y que hace intervenir
unas células hepáticas modificadas para una secuencia promotora del
gen de la apo AI, al que se unen unas proteínas nucleares, y en
particular el receptor RXR\alpha complejado con la proteína
ARP-I. Recientemente, se ha demostrado que varios
ácidos biliares tales como el ácido quenodesoxicólico (CDCA:
Chenodeoxycholic acid) o el ácido desoxicólico (DCA: deoxycolic
acid) así como, en menor medida, el ácido litocólico (LCA:
lithocholic acid) son los verdaderos ligandos de FXR y que estos
compuestos activan el receptor FXR.
FXR se une preferentemente a un elemento de
respuesta constituido por una repetición inversa de dos motivos
AGGTCA separados por un nucleótido. Se une también a unas
repeticiones del motivo AGGTCA separados por 2, 4 o 5 nucleótidos
(DR-2, DR-4, DR-5)
(Lafitte B A et al., J.Biol. Chem., 275:
10638-10647, (2000). Se han identificado varios
genes diana del FXR del tipo
Cyp7\alpha-hidroxilasa (ver WO 00/40965),
I-BABP.PI, TP o CPT-II.
La presente invención se fundamenta en la
observación de la función del FXR en la expresión del gen humano
que codifica para la apo AI así como en la interacción directa que
se produce entre el FXR y dos fragmentos distintos del promotor se
este gen. Se fundamenta también en la observación original de una
represión de la actividad del promotor de la apo AI humana, por la
sobreexpresión del FXR en presencia de ácidos biliares. Se
fundamenta también en la identificación de los lugares C y A del
promotor del gen de la apo AI humana como siendo unos elementos de
respuesta funcionales al FXR y la caracterización de sus secuencia
respectiva. Se fundamenta también en la observación original de que
el FXR unido al lugar C reprime la expresión de la apo AI, que el
FXR se fija también en este lugar de forma inesperada e imprevisible
como monómero y que la represión de la actividad del promotor del
gen de la apo AI humano por FXR vía el lugar C es dominante con
respecto a su acción de activación vía el lugar A.
Así la presente invención demuestra por vez
primera una modulación de la producción de la apo AI por el receptor
nuclear FXR. La presente invención suministra de esta forma nuevas
dianas y nuevas aproximaciones para la búsqueda de compuestos
capaces de regular la expresión de esta proteína, o la actividad de
las HDL, o el transporte inverso del colesterol.
Según un modo de realización particular, los
métodos de cribado según la invención incluyen más particularmente
las siguientes etapas:
- -
- la puesta en contacto de uno o varios compuestos con una construcción de ácido nucleico que comprende al menos un elemento de respuesta al FXR del promotor del gen humano de la apo AI o una variante funcional del mismo, en unas condiciones susceptibles de permitir a dichos compuestos fijarse en dicho elemento de respuesta,
- -
- la determinación del eventual enlace de dichos compuestos con el o los elemento(s) de respuesta, y
- -
- eventualmente la comparación de la medición anterior con una medición realizada en las mismas condiciones pero con una construcción de ácido nucléico que comprende al menos una copia mutada de un elemento de respuesta al FXR del promotor de la apo AI humana.
Según una forma particular de realización del
procedimiento de la invención, las condiciones susceptibles de
permitir a dichos compuestos fijarse en el o los elemento(s)
de respuesta al FXR comprenden la presencia del receptor FXR (por
ejemplo en forma de un monómero) o de un equivalente funcional, y la
determinación del efecto de la presencia del compuesto de prueba en
el enlace de FXR con el elemento de respuesta.
Según otro modo de realización particular
(prueba de actividad transcripcional), se mide el efecto de uno o
varios compuestos prueba sobre la actividad transcripcional de un
promotor que comprende al menos un elemento de respuesta al FXR
según la invención. Se realiza un prueba de este tipo,
preferentemente en un sistema celular, por determinación de la
expresión de un gen indicador puesto bajo el control de un promotor
de este tipo, en particular en una célula que comprende (a.g.,
expresando, de manera natural o recombinante) el receptor FXR o un
equivalente funcional de éste.
Una forma preferida de realización de la
invención consiste en utilizar una cassette de expresión que
combina, según la invención, uno o varios elementos de respuesta al
FXR con un gen indicador. Ventajosamente, dicho gen indicador es
puesto bajo el control de un promotor que comprende al menos una
copia del o de dichos elementos de respuesta, por ejemplo, el
promotor de la apo AI o de las variantes o fragmentos de éste.
Cualquier gen conocido por el experto en la materia cuya actividad
o presencia en extractos biológicos es fácilmente medible puede ser
utilizado como gen indicador par la realización del procedimiento de
cribado.
Los compuestos susceptibles de ser identificados
por el procedimiento de la invención pueden ser unos compuestos de
naturaleza, estructura y orígenes variados, en particular unos
compuestos biológicos, unos factores nucleares, unos cofactores,
etc., unos compuestos químicos, sintéticos, etc., capaces de
modificar la actividad del FXR. Puede tratarse también de unos
bancos, en particular de quimiotecas o de bancos de proteínas,
péptidos o ácidos nucleicos, por ejemplo unos clones que codifican
unas proteínas o péptidos que enlazan con el ADN.
Los métodos según la invención pueden ser
utilizados para seleccionar, identificar o caracterizar unos
compuestos capaces de modificar el enlace del FXR con uno y/o el
otro de sus elemento(s) de respuesta y/o modular (es decir,
aumentar o disminuir) la expresión del gen que codifica para a apo
AI humana y/o modular la actividad de las HDL, y/o modular el
transporte inverso del colesterol.
Con el objetivo de facilitar la comprensión de
la presente solicitud, se proporcionan las siguientes definiciones,
que precisan o completan su significación habitual.
"Apolipoproteína AI" o apo AI: La
apolipoproteína A-I es una proteína de 243 ácidos
aminados que contiene un extremo amino terminal globular y un
extremo carboxi terminal que es capaz de unirse a los lípidos
(Segrest et al., Cur. Op. Lipidol., 11:
105-115(2000)). Esta proteína es un
constituyente principal de las lipoproteínas de alta densidad y
realiza un función fundamental en el transporte inverso del
colesterol (Fruchart et Duriez, Bioquímica, 80:
167-172 (1998), Leroy et al., Cur. Op.
Lipidol, 6: 281-285. El gen, el ADNc y el ARNm de la
apo AI han sido clonados y secuenciados (Breslow et al.,
PNAS 79:6861-6865 (1982), Shoulders et Baralle,
Nuc. Ac. Res., 10: 4873-4882 (1982), Karathanasis
et al., Nature 304:371-373 (1983)), y son
accesibles en bancos de datos Genbank® (por ejemplo en Internet en
la dirección: http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) con los números de
acceso: NM_000039, M20656 (Promotor) y J00098).
"High Density Lipoproteine (HDL)": Las
partículas HDL son unas lipoproteínas de alta densidad
(1,063-1,21 g/ml) que son renombradas
principalmente por tener una función protectora contra la
arteriosclerosis debido a su capacidad de extraer el colesterol de
las células periféricas y promover su retorno hacia el hígado en
dónde es eliminado (Fruchart et Duriez, Biochimie,
80:167-172 (1998)). La apo AI es el constituyente
proteico principal de las HDL, representando hasta 70% de las
proteínas. Comprenden también apo AII, apo CI, apo CII, apo CIII y
apo E en una proporción
menor.
menor.
"FXR": El receptor FXR ha sido aislado,
caracterizado y secuenciado en el hombre y en el ratón (Forman et
al., Cell, 81: 687-693 (1995), Seol Et
al., Mol. Endo, 9: 72-85 (1995)). La secuencia
del ARNm está también disponible en los bancos de datos Genbank®,
con los números de acceso NM_005123, NM_021745 y U18374. La zona de
FXR implicada en la unión con el ADN ("DNA Binding Domain")
está contenida principalmente entre los residuos Cys 124- Met 189
de la proteína humana (correspondiente a 726-953 en
NM_005123) o entre los residuos 423-621 (U18374) de
la proteína del ratón.
La expresión "equivalente funcional" que
hace referencia al receptor FXR, designa cualquier polipéptido
derivado de la estructura del receptor FXR y que conserva la
capacidad de unión con el elemento de respuesta en particular
cualquier elemento de respuesta se las secuencias SEC ID nº: 1 ó 2
de las variantes funcionales de éstas. Los equivalentes funcionales
pueden ser unas variantes naturales (polimorfismo, empalme, etc.),
unos fragmento, mutantes, delecionantes, etc.. Preferentemente, se
trata de polipéptidos que comprenden al menos una zona de ácidos
aminados al menos idéntica al 60% con la del receptor FXR, de forma
preferente al menos del 75% y todavía de forma más preferente al
menos del 90-95%. La expresión incluye también los
fragmentos del receptor FXR, en particular los fragmentos que
contienen el lugar de unión con el ADN del receptor FXR.
El término "transporte inverso" es empleado
para designar el mecanismo fisiológico, que a veces falla, por el
cual unas lipoproteínas de alta densidad se hacen cargo del
colesterol en exceso en los tejidos periféricos, las HDL (High
Density Lipoprotein), transportándolo seguidamente hacia el hígado
dónde es eliminado.
La presente invención demuestra la implicación y
el mecanismo de acción del FXR en la regulación de la expresión de
la apo AI por los ácidos biliares y, haciendo eso, en la regulación
del transporte inverso del colesterol. En presencia de ácidos
biliares, la sobreexpresión del FXR se traduce en una disminución
del la actividad de este último. La invención revela, por otra
parte, la secuencia precisa de dos elementos de respuesta al FXR,
en el seno del promotor del gen codificante para la apo AI
humana.
La invención trata también de unas
construcciones particulares, en particular unos ácidos nucleicos que
comprenden unos elementos de respuesta al FXR, así como unas
cassettes, vectores y células recombinantes que los contienen.
Así la invención proporciona las secuencias (SEC
ID nº: 1 y SEC ID nº: 2) de dos elementos de respuesta al FXR,
identificados inicialmente en el seno del promotor del gen humano de
la apo AI, responsables de una interacción entre el FXR y el
promotor de la apo AI y de la regulación por parte del FXR de la
expresión de la apo AI.
Así la presencia de tres copias del lugar C (SEC
ID nº: 1) provoca una inhibición por parte del FXR y de los ácidos
biliares de la expresión del gen indicador (cf.: ejemplo 5). A la
inversa, la presencia de tres copias del lugar A (SEC ID nº: 2)
provoca la estimulación de dicha expresión (cf.: ejemplo 5).
Un objeto particular de la invención reside en
un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC ID nº: 1 ó 2, o
una variante funcional de la misma ("elemento de respuesta
FXR").
Otro objeto de la invención reside en una
construcción de un ácido nucleico que comprende un elemento de
respuesta FXR tal como el definido anteriormente. Se puede tratar
en particular de una cassette de expresión que comprende al menos
una copia de un elemento de respuesta tal como se ha definido
anteriormente.
La invención se refiere también a cualquier
promotor artificial o quimérico que comprenda un elemento de
respuesta FXR tal como el definido anteriormente.
Las variantes funcionales del elemento de
respuesta según la invención pueden ser cualquier derivado o
fragmento de la secuencia nativa que conserva la capacidad de unir
el receptor FXR. Por lo general, las variantes conservan al menos
50% de los residuos de la secuencia nativa descrita en la presente
solicitud. De forma clásica, las variantes poseen unas
modificaciones que afectan al menos a 5 nucleótidos en la secuencia
considerada. De forma preferente, se trata de una secuencia
idéntica al menos en 60%, preferentemente al menos al 75% y de
manera aún más preferente al menos al 90% a la secuencia nativa
descrita en la presente solicitud.
Las variantes pueden comprender diferentes
tipos de modificaciones tales como una o varias mutaciones puntuales
o no, adiciones, deleciones y/o sustituciones.
Estas modificaciones pueden ser introducidas por
métodos clásicos físicos, químicos o de la biología molecular,
tales como en particular la mutagénesis dirigida o, de forma más
práctica, mediante síntesis artificial de la secuencia en un
sintetizador.
Las variantes pueden ser probadas por su
capacidad de unión al FXR de diferentes maneras, y en
particular:
(i) por puesta en contacto de la secuencia
prueba con el receptor FXR (por ejemplo en un prueba acelular), y
detección de la formación de un complejo (por ejemplo por retraso de
la migración en gel);
(ii) por inserción de la secuencia prueba en una
cassette de expresión que contiene un promotor mínimo y un gen
indicador, introducción de la cassette en una célula, y detección
(en su caso dosificación) de la expresión del gen indicador en
presencia y en ausencia del FXR;
(iii) mediante cualquier otra técnica conocida
por el experto en la materia que permita poner en evidencia la
interacción entre un ácido nucleico y una proteína, por ejemplo.
La invención tiene también por objeto unas
variantes inactivas de los elementos de respuesta definidos
anteriormente, en particular unas variantes incapaces esencialmente
de unirse al receptor FXR. En particular, ejemplos de este tipo de
variantes son las secuencias SEC ID n^{os}: 3 y 4.
Estas variantes inactivas pueden ser preparadas
y probadas en las condiciones descritas anteriormente para las
variantes funcionales.
Las variantes según la invención poseen
ventajosamente la capacidad de hibridar con la secuencia SEC ID
n^{os}: 1 ó 2 o una parte de ésta.
La invención describe unos métodos de
identificación de compuestos que modulan (es decir, aumentan o
disminuyen) el transporte inverso del colesterol. Estos compuestos
pueden actuar alterando la unión del FXR con su o sus ligandos
(ácidos biliares, correpresores y coactivadores, etc.) pueden aun
modificar, incluso suprimir, la unión solamente del FXR o del FXR y
de sus cofactores, con su o sus elemento(s) de respuesta y
así modificar la expresión del gen humano de la apo AI. La fijación
del FXR al elemento de respuesta C (SEC ID nº: 1) disminuye así la
transcripción del gen humano de la apo AI y reduce el transporte
inverso del colesterol. La utilización de compuestos capaces de
inhibir la fijación del FXR a este elemento de respuesta, en donde
el FXR tiene la función de represor permite por lo tanto al
contrario aumentar la transcripción del gen humano de la apo AI y
estimular el transporte inverso del colesterol.
La presente invención demuestra también de
manera sorprendente que la fijación del FXR al elemento de respuesta
A (SEC ID nº: 2) aumenta la transcripción del gen humano de la apo
AI y aumenta el transporte inverso del colesterol. La utilización
de compuestos capaces de estimular la fijación del FXR a este
elemento de respuesta, en donde el FXR tiene esta vez la función de
activador de la transcripción (o de reproducir esta activación por
fijación directa), permite por lo tanto también aumentar la
transcripción del gen humano de la apo AI y estimular el transporte
inverso del colesterol.
La presente invención describe así nuevos
métodos para la selección, la identificación o la caracterización
de compuestos capaces de aumentar el transporte inverso del
colesterol.
La presente invención se refiere a un método
para la selección, la identificación o la caracterización de
compuestos capaces de aumentar el transporte inverso del colesterol,
que comprende:
- la puesta en contacto de un compuesto de
prueba con una célula huésped que comprende una cassette de
expresión de un gen indicador, dicha cassette comprende un gen
indicador puesto bajo el control de un promotor que contiene al
menos una copia de un elemento de respuesta al FXR del promotor del
gen humano de la apo AI o de una variante funcional de éste, y
- la determinación de la expresión del gen
indicador.
Los métodos según la invención prevén mas
específicamente la puesta en contacto de un compuesto de prueba con
una construcción de ácido nucleico o una cassette de expresión que
contiene al menos una copia de un elemento de respuesta al FXR (SEC
ID n^{os}: 1 ó 2). Según otro método de realización de la
invención, la copia del o de los elemento(s) de respuesta al
FXR (lugar C y/o A) puede ser una copia mutada, siendo dicha copia
mutada esencialmente incapaz de unir el receptor FXR, incluso en
presencia de ácidos biliares.
Según un modo de realización particular de los
métodos de la invención, se ha previsto además comparar los
eventuales efectos, determinados gracias a uno de estos métodos con
los, eventuales, determinados gracias a un método realizado en las
mismas condiciones pero con una construcción de ácido nucleico que
comprende al menos una variante inactiva (por ejemplo una copia
mutada) de un elemento de respuesta al FXR del promotor del gen
codificante para la apo AI humana (SEC ID n^{os}: 1 ó 2) o de una
variante funcional de éste último.
Los procedimientos de la invención pueden ser
realizados con diferentes tipos de células, de promotor, de genes
indicadores, y en diferentes condiciones, como se describe
seguidamente.
Ciertos métodos de cribado, descritos por la
invención, prevén así una etapa de puesta en contacto del compuesto
de prueba con unas células huésped, en unas condiciones particulares
que permiten determinar la expresión en dichas células de un gen
indicador y obtener así una información que hace referencia al
efecto del compuesto de prueba. De forma clásica, el efecto del
compuesto de prueba es comparado al nivel de expresión del gen
indicador determinado en ausencia de dicho compuesto (y/o con un
elemento de respuesta mutado).
Estas células, en un modo preferido de la
invención, pueden ser unas células de mamíferos (hepatocito,
fibroblastos, células endoteliales, musculares, etc.).
De forma aún más preferida, estas células pueden
ser células humanas. Puede también tratarse de cultivos primarios o
descendencias establecidas. En otro modo de realización, es también
posible utilizar células procariotas (bacterias), células de
levadura (Saccharomyces, Kluyveromyces, etc.) células
vegetales, etc..
Los compuestos pueden ser puestos en contacto
con las células en diferentes momentos, según su(s)
efecto(s), su concentración, la naturaleza de las células y
la apreciación técnica.
El contacto puede ser realizado sobre cualquier
soporte apropiado y en particular en una placa, en un tubo o un
frasco. Generalmente, la puesta en contacto es realizada en una
placa multipocillos lo que permite realizar, en paralelo, unos
ensayos numerosos y variados. Entre los soportes típicos se
encuentran las placas de microtitulación y más particularmente unas
placas de 96 ó 384 pocillos (o más), fáciles de manipular y en las
que se puede obtener el revelado gracias a una estimulación
clásica.
Según el soporte y la naturaleza del compuesto
de prueba, se pueden utilizar cantidades variables de células
durante la realización de los métodos descritos. De forma clásica,
10^{3} a 10^{6} células son puestas en contacto con un tipo de
compuesto de prueba, en un medio de cultivo apropiado, y de manera
preferente entre 10^{4} y 10^{5} células. A título de ejemplos,
en una placa de 96 pocillos, se pueden incubar 10^{5} células en
cada pocillo con una cantidad deseada de un compuesto de prueba. En
una placa de 384 pocillos menos de 10^{5} células y típicamente
entre 1 x 10^{4} y 4 x 10^{4} células son generalmente
incubadas en cada pocillo con el compuesto de prueba.
La cantidad (o la concentración) del compuesto
de prueba, puede ser ajustada por el usuario según el tipo de
compuesto (su toxicidad, su capacidad de penetración celular, etc.),
el número de células, la duración del periodo de incubación, etc..
Generalmente las células son expuestas a unas cantidades de
compuestos de prueba que varían de 1 nM a 1 mM. Obviamente es
posible probar otras concentraciones sin desviarse de la presente
invención. Cada compuesto puede además ser probado en paralelo a
diferentes concentraciones.
Además si es necesario se pueden utilizar
diferentes adyuvantes y/o vectores y/o productos que facilitan la
penetración de los compuestos en las células tales como liposomas,
lípidos catiónicos, polímeros, penetratina Tat PDT, péptidos
obtenidos de adenovirus (pentón o fibras) u otros virus, etc..
El contacto es mantenido entre 5 y 72 horas,
generalmente entre 12 y 48 horas. En efecto, preferentemente las
células y los diversos reactivos deben permanecer en contacto el
tiempo suficiente para permitir la síntesis de nuevo del producto
de expresión del gen indicador. De manera preferida, la incubación
dura aproximadamente 36 horas.
El método propuesto por la invención para
seleccionar, identificar o caracterizar compuestos capaces de
modular el transporte inverso del colesterol prevé la
transformación de las células huésped con una cassette de expresión
de un gen indicador. En particular dicho gen indicador puede ser
cualquier gen cuyo producto de transcripción o de expresión pueda
ser detectado o dosificado en unos extractos biológicos. Se puede
tratar, por ejemplo, del mismo gen codificante para la apo AI
humana, o también del gen codificante para la luciferasa y más
particularmente para la luciferasa de Luciole o para la de Renilla,
para la fosfatasa alcalina secretada, la galactosidasa, la
lactamasa, la cloranfenicolacetiltransferasa (CAT), la hormona de
crecimiento humana (hGH), la
\beta-glucuronidasa (Gluc) y la Green fluorescent
protein (GFP) etc.. Se entiende que el termino "gen" designa,
en un sentido amplio, cualquier ácido nucleico, en particular un
ADNc, un ADNg, un ADN sintético, un ARN, etc..
El gen indicador, sea cual sea, es puesto bajo
el control de un promotor que comprende al menos una copia de un
elemento de respuesta al FXR del tipo definido anteriormente.
El gen indicador puede por lo tanto ser puesto
bajo el control de cualquier promotor cuya secuencia comprende una
de las secuencias SEC ID n^{os}: 1 y/o 2 o una variante funcional
de las mismas. Estas secuencia particular puede estar presente a
razón de una o varias copias en el promotor (preferentemente de 1 a
10 e incluso más preferentemente de 1 a 6), corriente arriba,
corriente abajo o en interno, en la misma orientación o en una
orientación opuesta. En un modo preferido de realización de la
invención, el gen indicador está colocado bajo el control de un
promotor que comprende una o varias copias del lugar A (SEC ID nº:
2) y ningún lugar C. En otro modo de realización de la invención,
el gen indicador es puesto bajo el control de un promotor que
comprende una o varias copias del lugar C (SEC ID nº: 1) y ningún
lugar A. En otro modo de realización de la invención, el gen
indicador es puesto bajo el control de un promotor que comprende una
o varias copias de los lugares C y A. Preferentemente, se trata de
un promotor cuyo diferencial de actividad se puede detectar en
ausencia y en presencia de FXR o de un equivalente funcional.
Para la realización de un promotor de la
invención, el elemento de respuesta al FXR puede estar asociado a
un promotor mínimo transcripcional. El promotor mínimo es un
promotor transcripcional que tiene una actividad basal baja o
inexistente, y susceptible de ser aumentada en presencia de un
activador transcripcional (la interacción del FXR en presencia de
ácidos biliares con el lugar A). Un promotor mínimo puede por lo
tanto ser un promotor naturalmente débil en las células de
mamífero, es decir que produce una expresión no tóxica y/o no
suficiente para obtener un efecto biológico pronunciado.
Ventajosamente, un promotor mínimo es una construcción preparada a
partir de un promotor nativo, por deleción de zona(s) no
esencial(es) para la actividad transcripcional. Así, se
trata preferentemente de un promotor que comprende esencialmente una
caja TATA, generalmente de un tamaño inferior a 160 nucleótidos,
centrada alrededor del codón de iniciación de la transcripción. Así
se puede preparar un promotor mínimo a partir de unos promotores
víricos, celulares, fuertes o débiles, tales como por ejemplo el
promotor del gen de la timidinquinasa (TK) del virus del Herpes, el
promotor inmediato del CMV, el promotor PGK, el promotor SV40,
etc.. El promotor mínimo puede tener una actividad suficientemente
elevada para permitir identificar unos compuestos que aumentan la
inhibición por FXR, vía el lugar C o aumentan la activación por
FXR, vía el lugar A, por ejemplo.
El promotor (P), el elemento de respuesta FXR
(ER) y el gen indicador (GR) están dispuestos de manera funcional
en la cassette de expresión, es decir de tal manera que el promotor
mínimo controle la expresión de dicho gen y que su actividad sea
regulada por el FXR. Por lo tanto, generalmente, estas zonas están
dispuestas en el siguiente orden, en la orientación 5'>3':
ER-P-GR. De todas formas, el experto
en la materia puede prever cualquier otra disposición funcional sin
salir de la presente invención.
Además, los diferentes campos funcionales
citados anteriormente pueden ser unidos directamente los unos a los
otros, o separados por unos nucleótidos que no afectan
significativamente el carácter funcional de la cassette de
expresión o que permiten conferir unas características o
prestaciones mejoradas al sistema (amplificador, silencer, intron,
lugar de empalmado, etc.).
El método de selección, de identificación y de
caracterización de compuestos capaces de modular el transporte
inverso del colesterol prevé una etapa de determinación de la
expresión del gen indicador. Puede tratarse de una determinación de
la actividad transcripcional. A este fin, el ARN total es extraído
de las células en cultivo en unas condiciones experimentales por un
lado y en una situación testigo por otro. Este ARN es utilizado
como sonda para analizar, por ejemplo, los cambios en la expresión
del o de los gen(es) indicadores.
Puede tratarse también de un revelado de la
expresión del gen indicador con la ayuda de un sustrato adecuado.
Este revelado puede ser obtenido con ayuda de técnicas variadas cuya
naturaleza depende del tipo de gen indicador utilizado. La medición
puede, por ejemplo, corresponder a una densidad óptica o a una
emisión fluorescente en el caso de la utilización como gen
indicador de un gen codificante para la
\beta-galactosidasa o la luciferasa.
En un modo particular, la expresión del gen
indicador es medida a través del nivel de hidrólisis de un sustrato
del producto de expresión del gen indicador. Por ejemplo, numerosos
sustratos pueden ser utilizados para evaluar la expresión de la
\beta-lactamasa. Puede tratarse en particular de
cualquier producto que contenga un núcleo de
\beta-lactama y cuya hidrólisis pueda ser
controlada. Los sustratos preferidos son los específicos de la
\beta-lactamasa (i.e., es decir son generalmente
hidrolizados en las células de mamíferos en ausencia
\beta-lactamasa), los que no son tóxicos con
respecto a las células de los mamíferos y/o cuyo producto de
hidrólisis puede ser controlado fácilmente, por ejemplo mediante
unos métodos basados en la fluorescencia, la radioactividad, una
actividad enzimática o cualquier otro método de detección.
Son aún unos sustratos más preferidos los
sustratos radiométricos. La hidrólisis de estos sustratos puede ser
directamente relacionada con la actividad del producto de expresión
del gen indicador por el número de células. Un sustrato
radiométrico específico y no tóxico utilizable en la presente
invención es el CCF2-AM.
La concentración del sustrato puede ser ajustada
por el experto en al materia en función del número de células, por
ejemplo las células son generalmente mantenidas en contacto con el
sustrato durante aproximadamente 60 minutos.
La presencia del producto del gen indicador (o
del producto de hidrólisis del sustrato) puede ser determinada por
unos métodos clásicos conocidos por el experto en la materia
(fluorescencia, radio..., D.O., luminiscencia, FRET (ver WO
0037077), SPA, biochips, métodos inmunológicos, etc.).
Generalmente, se determina la actividad de un
compuesto de prueba en una célula y este efecto es comparado a
nivel de la actividad en ausencia del compuesto de prueba o con un
valor medio determinado en ausencia de cualquier compuesto de
prueba.
La medición de la hidrólisis implica
esencialmente una medición (o la determinación de la cantidad
relativa) del producto de hidrólisis contenido en cada muestra de
la reacción. Esta medición puede ser realizada gracias a diferentes
técnicas que son conocidas por el experto en la materia, incluyendo
la detección de una fluorescencia, de una radioactividad, de un
color, de una actividad enzimática, de un inmunocomplejo
antígeno-anticuerpo, etc.. De manera preferida, el
producto de la hidrólisis, es detectado y cuantificado gracias a una
técnica de detección de la fluorescencia. Así se pueden utilizar y
controlar unos fluorocromos variados en unas muestras de
células.
También se puede realizar un prueba secundaria
que permita validar la selección de los compuestos, en el animal,
gracias a la determinación de la cantidad de HDL expresadas o
gracias a la determinación de una variación significativa del
transporte inverso del colesterol, a nivel de células tratadas con
dichos compuestos por comparación con unas células no tratadas.
También es posible medir la proporción plasmática de colesterol y/o
determinar la expresión hepática de la apo AI.
De manera preferente, se utiliza en el método
según la invención, una célula huésped que comprende el receptor
FXR o un equivalente funcional.
La presencia del receptor FXR permite reproducir
una situación fisiológica y permite identificar, gracias a los
métodos descritos anteriormente, unos compuestos capaces de modular
las interacciones entre el FXR y uno y/u otro de sus
elemento(s) de respuesta, tal(es) como el (los)
divulgado(s) por la presente invención, o entre el FXR y uno
o varios ligando(s) del FXR.
El receptor FXR puede estar naturalmente
presente o puede haber sido introducido o añadido artificialmente.
Puede tratarse de un equivalente del FXR a saber cualquier secuencia
de ácidos aminados idéntica al menos en un 60% a la del receptor
FXR, de manera preferente al menos en un 75% y de manera aún más
preferente al menos en un
90-95%.
90-95%.
Según un modo preferido, la invención describe
también un método para la selección, la identificación o la
caracterización de compuestos capaces de modular el transporte
inverso del colesterol, que comprende:
\bullet la puesta en contacto de un compuesto
de prueba con una célula huésped que comprende:
- -
- una cassette de expresión de un gen indicador, comprendiendo dicha cassette un gen indicador puesto bajo el control de un promotor que contiene al menos una copia de un elemento de respuesta al FXR del promotor del gen humano de la apo AI o de una variante funcional del mismo, y
- -
- el receptor FXR o un equivalente funcional, y
\bullet la determinación de la expresión del
gen indicador.
Este método permite determinar el nivel de
expresión del gen indicador, según una de las técnicas conocidas
por el experto en la materia descritas anteriormente, en presencia
del compuesto de prueba o en ausencia de dicho compuesto, señalando
un aumento o una disminución del nivel de expresión del gen
indicador la aptitud del compuesto de prueba para modular el
transporte inverso del colesterol.
Todavía según un modo más preferido de la
invención, la célula huésped comprende también un ligando de
FXR.
La designación "ligando del FXR" se aplica
no sólo a los ácidos biliares y derivados sino también a los
factores de transcripción, a los coactivadores y correpresores, así
como a los otros polipéptidos implicados en la maquinaria de
regulación de la expresión de los genes. Se puede tratar, por
ejemplo, de otros receptores como el RXR o los receptores a las
hormonas nucleares.
Como se ha indicado anteriormente, estos métodos
permiten el cribado, rápido y en paralelo, de numerosos compuestos
de prueba en una o varias poblaciones celulares (células de
mamífero, células humanas tales como, por ejemplo, unos
hepatocitos, células procariotas, etc.). Estos métodos son
predictivos, automatizables y adaptados a la selección,
identificación y caracterización de dichos compuestos.
Una forma particular de realización del
procedimiento de cribado utiliza los métodos clásicos de
identificación de clones que expresan unas proteínas que unen el
ADN. Se puede tratar por ejemplo de cribar unos bancos de expresión
de ADNc en \lambda gt11 o de utilizar el método denominado de
"One Hybrid" o de "Phage Display", o incluso de practicar
una purificación por cromatografía de afinidad. La o las
proteína(s) aislada(s) son seguidamente
secuenciadas.
La invención se refiere también a un método para
la selección, la identificación o la caracterización de compuestos
capaces de modular el transporte inverso del colesterol, basado en
la medición del enlace de un compuesto de prueba a uno u otro
incluso a los dos elementos de respuesta. Este método comprende más
particularmente:
- -
- la puesta en contacto de un compuesto de prueba con una construcción de ácido nucleico que comprende al menos una copia de un elemento de respuesta a FXR del promotor del gen humano de la apo AI y/o de una variante funcional de éste, y
- -
- la determinación del enlace eventual de dicho compuesto de prueba con el elemento de respuesta.
El enlace del compuesto de prueba con uno al
menos de los elementos de respuesta a FXR puede ser puesto en
evidencia gracias a una emigración sobre gel, por electroforesis de
unos heterodímeros formados tras la realización del método descrito
más arriba. Algunos compuestos de prueba son efectivamente
susceptibles de llevar un lugar de enlace con el ADN en gran parte
idéntico al del FXR y ejercer así una competencia con éste.
La electroforesis permite distinguir
directamente los heterodímeros FXR/elemento de respuesta a FXR, de
los heterodímeros compuesto de prueba/elemento de respuesta a FXR y
de los elementos de respuesta a FXR.
Para determinar el enlace eventual del compuesto
de prueba con uno y/u otro elemento (s) de respuesta a FXR, se
pueden utilizar, en el marco de la presente invención, otros métodos
basados en la luminiscencia o que utilizan la técnica FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer) bien conocida por el
experto en la materia o la técnica SPA (Scintillation Proximity
Assay).
Este método de selección, de identificación y de
caracterización directa de compuestos capaces de modular el
transporte inverso del colesterol puede, según un modo particular de
realización de la presente invención, ser realizado en presencia
del receptor FXR o de un equivalente funcional de este último. La
etapa posterior de este método consiste entonces en determinar el
efecto de la presencia del compuesto de prueba sobre el enlace de
FXR con su y/o sus elemento(s) de respuesta. Se trata por
ejemplo de establecer la capacidad de dicho compuesto de prueba
para modular el enlace de FXR que el elemento de respuesta,
determinando la cantidad de FXR ligada en presencia del compuesto
de prueba con respecto a esta cantidad en ausencia del compuesto de
prueba. En el marco de esta determinación se puede aplicar una
prueba de competición que utiliza la técnica FP (fluorescente
polarization) que el experto en la materia conoce.
Un compuesto de prueba capaz de modular el
enlace del FXR con el elemento de respuesta podrá ser objeto de un
prueba posterior sobre su capacidad para modular la expresión de un
gen indicador y/o el transporte inverso del colesterol, según uno
de sus métodos descritos anteriormente.
En un modo particular, la construcción de ácido
nucleico comprende al menos 1 copia, preferentemente 2 a 5 copias
de la secuencia SEC ID nº: 1 o de una variante funcional de la
misma. Los compuestos de prueba capaces de inhibir (es decir de
reducir al menos parcialmente) el enlace del FXR con esta
construcción permiten activar la expresión del gen indicador y
constituyen unos candidatos para estimular el transporte inverso del
coleste-
rol.
rol.
Los métodos descritos anteriormente para la
selección, identificación o caracterización de compuestos capaces
de modular la expresión de un gen indicador y/o el transporte
inverso del colesterol pueden, según otro modo de realización de la
invención, ser utilizados para la selección, identificación o la
caracterización de compuestos capaces de modular la actividad de
las HDL y/ o la expresión de la apo AI.
La presente invención puede ser aplicada a
cualquier tipo de compuesto de prueba. Así, el compuesto de prueba
puede ser cualquier producto que se presente en forma aislada o en
mezcla con otros productos. El compuesto puede estar definido en
términos de estructura y/o de composición o no estar definido. El
compuesto puede, por ejemplo, ser un producto aislado y
estructuralmente definido, un producto aislado de estructura
indefinida, una mezcla de productos conocidos y caracterizados o
una composición indefinida que comprende uno o varios productos.
Dichas composiciones indefinidas pueden ser, por ejemplo, muestras
de tejidos, fluidos biológicos, sobrenadantes celulares,
preparaciones vegetales, etc.. Los compuestos de prueba pueden ser
productos inorgánicos u orgánicos y en particular un polipéptido (o
una proteína o un péptido), un ácido nucleico, un lípido, un
polisacárido, un compuesto químico o biológico tal como un factor
nuclear, un cofactor o cualquier mezcla o derivado de estos
últimos. El compuesto puede ser de origen natural o sintético e
incluir un banco combinatorio, un clon o un banco de clones de
ácidos nucleicos que expresan uno o varios polipéptido(s) que
ligan el ADN, etc..
La presente invención está particularmente
adaptada a la selección, identificación o caracterización de un
número importante de compuestos. Este cribado simple y eficaz puede
ser realizado en un lapso de tiempo muy corto. Los métodos
descritos pueden ser en particular ser parcialmente automatizados,
permitiendo así el cribado eficaz y simultáneo de compuestos
diversos y numerosos, o bien en forma de mezcla o bien en forma
separada.
Los compuestos identificados según la invención
presentan unas propiedades ventajosas para una utilización
terapéutica, en particular en el ámbito de la arteriosclerosis. Una
posible aplicación de la invención es la de permitir la
identificación de una sustancia terapéutica susceptible de reducir
el efecto inhibidor de los ácidos biliares sobre la expresión de la
apo AI y aumentar así el transporte inverso del colesterol. La
invención permite así la utilización de un compuesto capaz de
modular (es decir, aumentar o disminuir) el enlace del FXR a los
elementos de respuesta del promotor del gen codificante para la apo
AI humana o de una variante funcional de la misma, para la
preparación de una composición destinada para modular (es decir,
aumentar o disminuir) el transporte inverso del
colesterol.
colesterol.
Esta utilización puede estar destinada para
modular (es decir, aumentar o disminuir) la actividad de las HDL o
para modular la expresión de la apo AI.
Una utilización de un compuesto capaz de
controlar el efecto del FXR sobre la transcripción del gen humano
de la apo AI o de una variante funcional del mismo, puede estar
destinada a acrecentar el transporte inverso del coles-
terol.
terol.
Puede tratarse de un compuesto químico o de un
compuesto biológico. Puede tratarse de un factor nuclear o de un
cofactor. Según un modo aún más preferido, se trata de un clon que
expresa uno o varios polipéptido(s) que ligan el ADN. De
forma general, se puede tratar de cualquier compuesto seleccionado,
identificado o caracterizado según uno de los métodos descritos
anteriormente.
La invención permite la utilización de cualquier
compuesto (o derivados de dichos compuestos) seleccionado,
identificado o caracterizado según uno de los métodos descritos
anteriormente, en el marco de la presente invención, como diana de
investigaciones experimentales o para la fabricación de
composiciones farmacéuticas destinadas a aumentar el transporte
inverso del colesterol o a tratar la hipercolesterolemia, la
arteriosclerosis, los desordenes lipídicos y/o las afecciones
cardiovasculares.
Otras ventajas y aplicaciones de la presente
invención aparecerán con la lectura de los siguientes ejemplos, que
deben de ser considerados como puramente ilustrativos y no
limitativos.
Figura nº 1: el TCA reduce el porcentaje
plasmático de colesterol y de apo AI así como la expresión hepática
de la apo AI en los ratones transgénicos para el gen humano de la
apo AI.
Figura nº 2: El CDCA y el TCA reducen la
expresión de la apo AI en las células HepG2.
Figura nº 3: Efecto transcripcional de los
ácidos biliares.
Figura nº 4: El CDCA y el TCA activan el
FXR.
Figura nº 5: La sobreexpresión del FXR en
presencia de CDCA reduce la actividad del promotor de la apo AI
humana en las células HepG2.
Figura nº 6: La sobreexpresión del FXR en
presencia de CDCA reduce la actividad del promotor de la apo AI
humana en las células HepG2: identificación funcional de los
elementos de respuesta.
Figura nº 7: FXR se liga a los lugares C (SEC
ID nº: 1) y A (SEC ID nº: 2) del promotor de la apo AI como dímero
con RXR mientras que el FXR se liga también como monómero en el
lugar C (SEC ID nº: 1).
Figura nº 8: El GW4064, activador específico
del FXR, reduce la expresión de la apo AI humana así como la
actividad de su promotor en las células HepG2.
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 1 (Lugar C wt)
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 2 (Lugar A wt)
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 3 (Lugar C mt)
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 4 (Lugar A mt)
\newpage
SEC ID nº: 5 (Promotor de la apo
AI-j04066 (apoAI gen) 1819-2167)
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 6 (promotor Tk- M80483
(pBLCAT5)38-204; J02224 (Herpes simplex)
302-462)
Ejemplo
1
El ejemplo 1 muestra el efecto de un régimen
enriquecido con taurocolato sobre el porcentaje sérico de
colesterol y de apo AI humana así como sobre el perfil lipídico y
la expresión hepática de la apo AI humana de ratones transgénicos
que expresan el gen de la apo AI en un fondo genético C57BL.
Diez ratones transgénicos que expresan el gen de
la apo AI en un fondo genético C57BL (IFFA-CREDO,
L'Arbres-
le, Francia) son genotipados por PCR y divididos en dos grupos de cinco animales. El primer grupo recibe un régimen normal durante una semana mientras que el otro es tratado con un régimen enriquecido con TCA (ácido taurocólico) (0,5% P/P). La sangre es recogida después de un ayuno de 12 horas mediante una punción retro orbital bajo anestesia con barbital. Las muestras de suero recogidas son conservadas a -20ºC antes de su análisis. Después de una semana de tratamiento, los animales son sacrificados y se toman unas muestras del hígado que son congeladas para su análisis. Los porcentajes séricos de apo AI humana son medidos antes y después del régimen como se ha descrito anteriormente (Peters, J. Biol. Chem., 272 (43): 27307-12 (1997)). Los porcentajes séricos de colesterol y los perfiles lipídicos después del FPLC son medidos como se ha establecido anteriormente (Raspé et al., J. Lipid Res., 40 (11): 2099-2110 (1999)). Los ARNm totales son extraídos de las muestras de hígado como se ha descrito anteriormente (Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162 (1): 156-9 (1987)) y son cuantificados por hibridación de Northem Blot (Peters, 1997) con ayuda de las sondas apo AI humana y 28S (Peters, J. Biol. Chem., 272 (43): 27307-12 (1997)).
le, Francia) son genotipados por PCR y divididos en dos grupos de cinco animales. El primer grupo recibe un régimen normal durante una semana mientras que el otro es tratado con un régimen enriquecido con TCA (ácido taurocólico) (0,5% P/P). La sangre es recogida después de un ayuno de 12 horas mediante una punción retro orbital bajo anestesia con barbital. Las muestras de suero recogidas son conservadas a -20ºC antes de su análisis. Después de una semana de tratamiento, los animales son sacrificados y se toman unas muestras del hígado que son congeladas para su análisis. Los porcentajes séricos de apo AI humana son medidos antes y después del régimen como se ha descrito anteriormente (Peters, J. Biol. Chem., 272 (43): 27307-12 (1997)). Los porcentajes séricos de colesterol y los perfiles lipídicos después del FPLC son medidos como se ha establecido anteriormente (Raspé et al., J. Lipid Res., 40 (11): 2099-2110 (1999)). Los ARNm totales son extraídos de las muestras de hígado como se ha descrito anteriormente (Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162 (1): 156-9 (1987)) y son cuantificados por hibridación de Northem Blot (Peters, 1997) con ayuda de las sondas apo AI humana y 28S (Peters, J. Biol. Chem., 272 (43): 27307-12 (1997)).
Ejemplo
2
El ejemplo 2 muestra los efectos de
concentraciones crecientes del CDCA y del TCA que disminuyen la
expresión de la apo AI en las células HepG2. Las células HepG2 son
cultivadas en medio DMEM con un suplemento con 10% de suero de
ternera fetal, de penicilina/estreptomicina, de piruvato de sodio y
de ácidos aminados no esenciales, e incubadas a 37ºC, en una
atmósfera húmeda que contiene 5% de CO_{2}/95% de aire. Son
seguidamente tratadas con las concentraciones indicadas de CDCA.
Los ARNm totales son extraídos como se ha descrito anteriormente
(Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162(1):
156-9 (1987)) y cuantificados por hibridación de
Northern Blot (Peters, J. Biol. Chem., 272 (43):
27307-12 (1997)) con ayuda de las sondas apo AI
humanas y 28S (Peters, J. Biol. Chem., 272 (43):
27307-12 (1997)).
Ejemplo
3
El ejemplo 3 muestra que el CDCA probado a una
concentración de 50 \muM reduce considerablemente la expresión de
la apo AI en las células HepG2. Su efecto es compensado por una
preincubación de 12 h en presencia de actinomicina D (5 g/ml), lo
que sugiere que el efecto es transcripcional. Las células HepG2 son
cultivadas en medio DMEM complementado con 10% de suero de ternera
fetal, penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio y ácidos
aminados no esenciales e incubadas a 37ºC, en una atmósfera húmeda
que contiene 5% de CO_{2}/95% de aire. Los ARNm totales son
extraídos como se ha descrito anteriormente (Chomczynski et
al., Anal. Biochem., 162(1): 156-9
(1987)), y cuantificados por hibridación de Northern Blot (Peters,
J. Biol. Chem., 272 (43): 27307-12 (1997)) con
ayuda de las sondas apo AI humana y 28S (Peters, J. Biol. Chem., 272
(43): 27307-12 (1997)).
Ejemplo
4
El ejemplo 4 muestra que la sobreexpresión del
hFRX y el mRXR\alpha en presencia de CDCA reprime la actividad de
los fragmentos -254/+91 (que presenta los lugares AB y C), [(ver SEC
ID nº: 5)], -192/+91 (que presenta los lugares B y C) pero no del
fragmento -40/+91 (que únicamente presenta el promotor mínimo) del
promotor de la apo AI, clonados corriente arriba del gen indicador
luciferasa.
Unas células HepG2 son cotransfectadas mediante
la técnica de lipofección con 300 ng del vector
pCDNA3-hFXR que permite la sobreexpresión del FXR,
300 ng del vector pSG5-mRXR\alpha y 1 \mug de
unos vectores indicadores indicados que permiten la expresión del
gen indicador luciferasa bajo el control de los fragmentos
-254/+91,-192/+91 y -40/+91 del promotor de la apo AI. Estas
construcciones son obtenidas mediante el intercambio del gen
indicador CAT de las construcciones descritas anteriormente (Ngoc
Vu-Dac et al., J.Biol. Chem., 269 (49):
31012-8 (1994)) con el gen indicador Luciferasa
extraído del plásmido pGL3 de Promega (Madison, WI, USA) como se ha
descrito anteriormente (Raspé et al., J.Lipid Res., 40 (11):
2099-2110 (1999)). La cantidad total de ADN es
establecida en 2 \mug con ayuda del plásmido pBKS+. Después de 3
horas de transfección, las células son incubadas en el medio de
cultivo con los ácidos biliares, a las concentraciones indicadas,
durante 36 horas. La actividad de la Luciferasa es seguidamente
medida como se ha descrito anteriormente (Raspé et al., J.
Lipid Res., 40 (11): 2099-2110 (1999)).
Ejemplo
5
El ejemplo 5 muestra que la sobreexpresión del
hFXR en presencia de CDCA reprime la actividad del fragmento
-254/+91 salvaje del promotor de la apo AI (construcción anotada
como wt), clonados corriente arriba del gen indicador Luciferasa
(panel A). Muestra también que la mutación del lugar C presente en
el fragmento -254/+91 del promotor de la apo AI (construcción
anotada como C mut), clonados corriente arriba del gen indicador
luciferasa se traduce en una activación de la actividad
transcripcional de la construcción en respuesta a la sobreexpresión
del hFXR (panel A). La sobreexpresión del hFXR en presencia de CDCA
reprime también la actividad del fragmento -254/+91 del promotor de
la apo AI, clonados corriente arriba del gen indicador luciferasa
cuyo lugar A está mutado (construcción anotada como A mut) (panel
A). Finalmente, la mutación conjunta de los lugares A y C
(construcción anotada como AC mut) del fragmento -254/+91 del
promotor de la apo AI clonados corriente arriba del gen indicador
luciferasa se traduce en una perdida de la respuesta al hFXR.
El ejemplo 5 muestra que la sobreexpresión del
hFXR en presencia de CDCA reprime la actividad de una construcción
que comprende tres copias del lugar C del promotor de la apo AI
humana clonadas corriente arriba del promotor de la timidinquinasa
del virus del Herpes simplex y del gen indicador luciferasa (anotada
C3TK) mientras que una construcción que comprende tres copias del
lugar A del promotor de la apo AI humana clonadas corriente arriba
del promotor de la timidinquinasa del virus del Herpes simplex
(anotada A3TK) es activada por la sobreexpresión del hFXR en
presencia de CDCA y que la actividad de una construcción que solo
comprende el promotor de la timidinquinasa del virus del Herpes
simplexs (anotada TkpGL3) no es afectada por la sobreexpresión del
hFXR en presencia de CDCA (panel B).
Las células HepG2 son cotransfectadas mediante
la técnica de lipofección con 300 ng del vector
pCDNA3-hFXR que permite la sobreexpresión de este
último y 1 \mug de los vectores indicadores indicados que permiten
la expresión del gen indicador luciferasa bajo el control del
fragmento -254/+91 salvaje o mutado del promotor del gen humano de
la apo AI, bajo el control del promotor e la timidinquinasa del
virus del Herpes simplex o bajo el control de tres copias del lugar
A o del lugar C del gen humano de la apo AI clonadas corriente
arriba del promotor de la timidinquinasa del virus del Herpes
simplex. La construcción que comprende el fragmento -254/+91
salvaje del promotor de la apo AI es obtenida mediante el
intercambio del gen indicador CAT de la construcción
correspondiente descrita anteriormente (Ngoc Vu-Dac
et al., J. Biol. Chem., 269(49):
31012-8 (1994)) con el gen indicador Luciferasa
extraído del plásmido pGL3 de Promega (Madison, WI, USA), como se
ha descrito anteriormente (Raspé et al., J. Lipid Res., 40
(11): 2099-2110 (1999)). La construcción que
comprende el fragmento -254/+91 del promotor de la apo AI cuyo
lugar A está mutado es obtenida por mutagénesis dirigida del lugar
A, en la construcción salvaje, con ayuda del kit Quick Change Site
directed mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA, USA), del
oligonucleótido 5'-CCCCACT
GAACCCTTGATTCCTGCTTTGCAGCC-3' (SEC ID nº: 4) y del oligonucleótido complementario. La construcción que comprende el fragmento -254/+91 del promotor de la apo AI cuyo lugar C está mutado es obtenida por mutagénesis dirigida del lugar C, en la construcción salvaje, con ayuda del kit Quick Change Site directed mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA, USA) del oligonucleótido 5'-CAGAGCTATATATTATATATATAAGTTCC-3' (SEC ID nº: 3) y del oligonucleótido complementario. La construcción que comprende el fragmento -254/+91 del promotor de la apo AI cuyos lugares A y C están mutados es obtenida por mutagénesis dirigida del lugar A, en la construcción Cmut, con ayuda del kit Quick Change Site directed mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA, USA) del oligonucleótido 5'-CCCCACTGAACCCTTGATTCCTGCTTTGCAGCC-3' (SEC ID nº: 4) del oligonucleótido complementario. La construcción que comprende el promotor de la timidinquinasa del virus del Herpes simplex clonado corriente arriba del gen indicador luciferasa anotada TkpGL3 ha sido descrita anteriormente (Raspé et al., J. Biol. Chem., 276 (4): 2865-2871 (2001)). La construcción anotada como C3TK que comprende tres copias del lugar C del promotor de la apo AI humana clonadas corriente arriba del promotor de la timidinquinasa del virus Herpes simplex y del gen indicador luciferasa ha sido obtenida por clonado orientado de tres copias del oligonucleótido de doble rama que corresponde a la secuencia del lugar C salvaje (SEC ID nº: 1) en el lugar Smal del vector TkpGL3. la construcción anotada A3TK que comprende tres copias del lugar A del promotor de la apo AI humana clonadas corriente arriba del promotor de la timidinquinasa del virus Herpes simplex y del gen indicador luciferasa ha sido obtenida por clonado orientado de tres copias del oligonucleótido de doble rama correspondiente a la secuencia del lugar A salvaje (SEC ID nº: 2) en el lugar Smal del vector TkpGL3. la cantidad total de ADN es establecida en 2 \mug con ayuda del plásmido pBKS+. Después de 3 horas de transfección, las células son incubadas en el medio de cultivo con los ácidos biliares, a las concentraciones indicadas, durante 36 horas. La actividad Luciferasa es seguidamente medida como se ha descrito anteriormente (Raspé et al., J.Lipids res., 40(11): 2099-2110(1999)).
GAACCCTTGATTCCTGCTTTGCAGCC-3' (SEC ID nº: 4) y del oligonucleótido complementario. La construcción que comprende el fragmento -254/+91 del promotor de la apo AI cuyo lugar C está mutado es obtenida por mutagénesis dirigida del lugar C, en la construcción salvaje, con ayuda del kit Quick Change Site directed mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA, USA) del oligonucleótido 5'-CAGAGCTATATATTATATATATAAGTTCC-3' (SEC ID nº: 3) y del oligonucleótido complementario. La construcción que comprende el fragmento -254/+91 del promotor de la apo AI cuyos lugares A y C están mutados es obtenida por mutagénesis dirigida del lugar A, en la construcción Cmut, con ayuda del kit Quick Change Site directed mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA, USA) del oligonucleótido 5'-CCCCACTGAACCCTTGATTCCTGCTTTGCAGCC-3' (SEC ID nº: 4) del oligonucleótido complementario. La construcción que comprende el promotor de la timidinquinasa del virus del Herpes simplex clonado corriente arriba del gen indicador luciferasa anotada TkpGL3 ha sido descrita anteriormente (Raspé et al., J. Biol. Chem., 276 (4): 2865-2871 (2001)). La construcción anotada como C3TK que comprende tres copias del lugar C del promotor de la apo AI humana clonadas corriente arriba del promotor de la timidinquinasa del virus Herpes simplex y del gen indicador luciferasa ha sido obtenida por clonado orientado de tres copias del oligonucleótido de doble rama que corresponde a la secuencia del lugar C salvaje (SEC ID nº: 1) en el lugar Smal del vector TkpGL3. la construcción anotada A3TK que comprende tres copias del lugar A del promotor de la apo AI humana clonadas corriente arriba del promotor de la timidinquinasa del virus Herpes simplex y del gen indicador luciferasa ha sido obtenida por clonado orientado de tres copias del oligonucleótido de doble rama correspondiente a la secuencia del lugar A salvaje (SEC ID nº: 2) en el lugar Smal del vector TkpGL3. la cantidad total de ADN es establecida en 2 \mug con ayuda del plásmido pBKS+. Después de 3 horas de transfección, las células son incubadas en el medio de cultivo con los ácidos biliares, a las concentraciones indicadas, durante 36 horas. La actividad Luciferasa es seguidamente medida como se ha descrito anteriormente (Raspé et al., J.Lipids res., 40(11): 2099-2110(1999)).
El ejemplo 6 muestra que el complejo
RXR\alpha/hFXR se liga específicamente en los lugares A y C del
promotor de la apo AI humana. Muestra también que el FXR es capaz
de ligarse solo como monómero únicamente al lugar C del promotor de
la apo AI humana.
Las proteínas hFXR y mRXR\alpha son producidas
in vitro con ayuda del kit TNT-T7 de Promega
(Madison, WI, USA) y de los vectores pCDNA3-hFXR y
pSG5-mRXR\alpha. Se han anotado con
[\gamma^{-32}P]-ATP unos oligonucleótidos de
doble rama correspondientes a los lugares A y C del promotor del gen
humano de la apo AI (SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 1) y que han sido
preparados como se ha descrito anteriormente (Ngoc
Vu-Dac et al., J. Biol. Chem., 269 (49):
31012-8 (1994)), con ayuda de la
polinucleótidoquinasa. 2 \mul de lisado de reticulocitos
programados por hFXR y mRXR\alpha son incubados durante 15
minutos a temperatura ambiente en un volumen final de 20 \mul de
tampón que contiene 10 mM HEPES, 2,5 mM de MgCl_{2}, 10% de
glicerol, 2,5 mg/ml de BSA, 50 mM NaCl y 0,5 mM de DTT con 2,5
\mug de polidI-dC y 1 \mug de ADN de esperma de
arenque antes de añadir la sonda marcada (0,5 ng). La mezcla es
incubada durante 15 min. a temperatura ambiente y los complejos son
separados por electroforesis sobre gel no desnaturalizante en
tampón TBE 0,25X. Los experimentos de súper retraso son realizados
añadiendo el anticuerpo anti FXR (Santa Cruz, California, USA) 3
horas antes de añadir el ADN a 4ºC.
Las células HepG2 son cotransfectadas como se ha
descrito anteriormente en el ejemplo 5. Los ARNm de las células son
obtenidos como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 2.
| Nivel relativo de ARNm hapo AI (en %) | |
| Control | 100, \pm 9,4 |
| GW4064 1 \muM | 54,3 \pm 7,3 |
| GW4064 5 \muM | 23,0 \pm 5,5 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Actividad luciferasa relativa (en %) | ||
| Construcción ABC | Control | 100,0 \pm 11,9 |
| GW4064 1 \muM | 56,8 \pm 6,9 | |
| Construcción A3 TK | Control | 100,0 \pm 1,1 |
| GW4064 1 \muM | 1119,9 \pm 28,1 | |
| Construcción C3 TK | Control | 100,0 \pm 12,6 |
| GW4064 1 \muM | 61,8 \pm 2,8 |
El ejemplo 7 muestra que el GW4064 (Goodwin
et al., Mol. Cell., 2000 Sep; 6(3):
517-26), potente activador específico del FXR,
reduce en gran manera la expresión de la apo AI en las células
HepG2.
El ejemplo 7 muestra que la sobreexpresión del
hFXR en presencia de 1 \muM de GW4064 reprime la actividad del
fragmento -254/+91 del promotor de la apo AI humana (construcción
anotada como ABC) así como la de la construcción que comprende tres
copias del lugar C (SEC ID nº: 1) del promotor de la apo AI humana
(anotada como C3TK). Se constata a la inversa que una construcción
que comprende tres copias del lugar A /(SEC ID nº: 2) del promotor
de la apo AI (anotada como A3TK) es activada por la sobreexpresión
del hFXR en presencia de GW4064
<110> GENFIT SA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTOS DE IDENTIFICACIÓN DE
COMPUESTOS QUE MODULAN EL TRANSPORTE INVERSO DEL COLESTEROL
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B0050WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: lugar C wt
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagagctgat ccttgaactc ttaagttcc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Lugar A wt
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccccactgaa cccttgaccc ctgccctgca gcc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Lugar C mt
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagagctata tattatatat ataagttcc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Lugar A mt
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccccactgaa cccttgattc ctgctttgca gcc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Promotor Apo AI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial; Promotor tk
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
Claims (17)
1. Método para la selección, la
identificación o la caracterización in vitro de compuestos
capaces de modular el transporte inverso del colesterol, que
comprende:
- la puesta en contacto, en presencia del
receptor FXR o de un equivalente funcional del receptor FXR, de un
compuesto de prueba con una construcción de ácido nucleico que
comprende al menos una copia de un elemento de respuesta al FXR del
promotor del gen humano de la apoliproteina AI o de una variante
funcional del mismo, y
- la determinación del efecto de la presencia
del compuesto de prueba sobre el enlace del FXR con el elemento de
respuesta.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque el elemento de respuesta al FXR
comprende la secuencia (SEC ID nº: 1) siguiente:
5'-CAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCC-3',
o una variante funcional de la
misma capaz de ligar el receptor
FXR.
3. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque el elemento de respuesta al FXR
comprende la secuencia (SEC ID nº: 2) siguiente:
5'-CCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCC-3',
o una variante funcional de la
misma capaz de ligar el receptor
FXR.
4. Método para la selección, la
identificación o la caracterización in vitro de compuestos
capaces de modular el transporte inverso del colesterol, que
comprende:
- -
- la puesta en contacto de un compuesto de prueba con una célula huésped que comprende el receptor FXR o un equivalente funcional, un ligando del FXR y una cassette de expresión de un gen indicador, comprendiendo dicha cassette un gen indicador puesto bajo el control de un promotor que consiste en al menos una copia de un elemento de respuesta al FXR correspondiente a la secuencia (SEC ID nº: 1) siguiente:
- 5'-CAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCC-3' del promotor del gen humano de la apoliproteina AI o de una variante funcional de éste, y
- -
- la determinación de la expresión del gen indicador.
5. Método según la reivindicación 4, que
comprende la determinación del nivel de expresión del gen indicador
en presencia del compuesto de prueba o en ausencia de dicho
compuesto, un aumento o una disminución del nivel de expresión del
gen indicador que señala la aptitud del compuesto de prueba para
modular el transporte inverso del colesterol.
6. Método según la reivindicación 4 ó 5,
caracterizado porque la célula huésped es una célula de
mamífero.
7. Método según la reivindicación 6,
caracterizado porque la célula de mamífero es una célula
humana.
8. Método según una de las reivindicaciones 4
a 7, caracterizado porque el gen indicador es un gen que
codifica un producto cuya actividad o presencia en unos extractos
biológicos puede ser medida, en particular uno de los genes que
codifican para la luciferasa, la fosfatasa alcalina secretada, la
galactosidasa o la lactamasa.
9. Método según una de las reivindicaciones 4
a 8, caracterizado porque el promotor es escogido entre los
promotores HSV-TK, el promotor inmediato del CMV, el
promotor PGK y el promotor del gen que codifica para la apo AI
humana, el promotor SV40. mamífero.
10. Método según una de las reivindicaciones 1
a 9, caracterizado porque se prueban uno o varios de los
compuestos, mezclados o por separado.
11. Método según una de las reivindicaciones 1
a 10, caracterizado porque el compuesto de prueba es un banco
combinatorio.
12. Método según la reivindicación 11,
caracterizado porque el compuesto de prueba es un clon o un
banco de clones de ácidos nucléicos que expresan uno o varios
polipéptido(s) que ligan el ADN.
13. Método según cualquier de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la puesta
en contacto se realiza en una placa multipocillos.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además, la comparación de
los efectos eventuales determinados gracias a dicho método con los,
eventuales, determinados gracias a un método realizado en las
mismas condiciones pero con un construcción de ácido nucleico que
comprende al menos una copia mutada del elemento de respuesta al
FXR del promotor del gen que codifica para la apo AI humana, siendo
esencialmente incapaz, dicha copia mutada, de ligar el receptor
FXR.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, para la selección, la identificación o
la caracterización de compuestos capaces de aumentar el transporte
inverso del colesterol.
16. Método según cualquier de las
reivindicaciones 1 a 14, para la selección, la identificación o la
caracterización de compuestos capaces de modular la actividad de
las HDL.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, para la selección, la identificación o la
caracterización de compuestos capaces de modular la expresión de la
apolipoproteina AI.
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