ES2260213T3

ES2260213T3 - Agente para el tratamiento de las enfermedades del tracto traqueobronquial, en particular de la bronconeumonia cronica obstructiva.

Info

Publication number: ES2260213T3
Application number: ES01925440T
Authority: ES
Inventors: Marion Frankenberger; Konrad Maier; Gerhard Scheuch; Hans-Werner Ziegler-Heitbrock
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2000-03-13
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2021-03-13
Also published as: WO2001068081A1; US20030064094A1; EP1263422B1; EP1263422A1; US20050220859A1; US7074389B2; AU2001252192A1; US7476380B2; JP2003528055A; ATE319439T1; DE10012151A1; DE50109156D1

Abstract

Composición farmacéutica en forma de aerosol inhalable, que contiene como principios activos vitamina A y/o sus derivados y/o sus ésteres en una cantidad terapéuticamente activa, caracterizada por el hecho de que los principios activos se encuentran dentro de liposomas unilamelares con un tamaño de 0, 1 m a 2 m y que los liposomas comprenden como mínimo fosfatidilcolina y un fosfolípido, dicho fosfolípido seleccionado entre el grupo formado por fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico y cardiolipina en su doble capa lipídica y que la relación de la fosfatidilcolina respecto el resto de fosfolípidos es de 65:35 hasta 75:25.

Description

Agente para el tratamiento de las enfermedades del tracto traqueobronquial, en particular de la bronconeumonía crónica obstructiva.

La invención se refiere a un agente para la profilaxis y la terapia de enfermedades del tracto traqueobronquial, en particular, de la COPD ("chronic obstructive pulmonary disease" - enfermedad pulmonar obstructiva crónica).

La COPD se manifiesta típicamente en fumadores. Se caracteriza por una inflamación crónica de las vías respiratorias estrechas (< 2 mm), lo cual conduce a la reconstrucción del tejido y al estrechamiento irreparable (obstrucción) de dicho tramo de las vías respiratorias.

La exploración a fondo del tejido de dichas vías respiratorias estrechas muestra un aumento en la formación de mucílago, un aumento de las células mucílapaspaloma formadoras de mucosa, una hipertrofia de la musculatura lisa, así como una infiltración de macrófagos cargados de pigmentos y de linfocitos T CD8-positivos. Con el avance del proceso se produce la reconstrucción de tejido y una deposición más intensa de fibras de tejido conjuntivo.

Patofisiológicamente, la inflamación se encuentra en primer término. En conexión con lo anterior, se infiltran neutrófilos, granulocitos, macrófagos y linfocitos en el tejido de las vías respiratorias estrechas. Esta infiltración en el tejido se facilita mediante la formación de proteasas por los leucocitos. En el tejido se forman mediadores, los cuales promueven la formación de mucílago, estimulan las células musculares y provocan la formación de fibras de tejido conjuntivo (colágeno) por parte de los fibroblastos.

En la exploración mecánica de la respiración, la COPD muestra un flujo expiratorio máximo (FEV_{1}) disminuido y un vaciamiento forzado aminorado de los pulmones. La COPD se encuentra a menudo asociada con una bronquitis crónica y un enfisema. Sin embargo, ambas enfermedades pueden desmarcarse claramente de la COPD.

La bronquitis crónica se define clínicamente como una tos productiva crónica durante como mínimo 3 meses por año en como mínimo 2 años consecutivos. Dicha enfermedad resulta afectada por infecciones, mayoritariamente bacterianas, y puede, aunque no tiene por qué, conducir a una obstrucción irreversible.

El enfisema se define como una dilatación irreversible de las cavidades pulmonares distales respecto a los bronquios terminales, provocada por una degradación de los septos alveolares, junto a una degradación de fibras elásticas. En el enfisema no se produce fibrosis.

Por este motivo, la COPD se diferencia de la bronquitis crónica y del enfisema como entidad, incluso cuando la COPD pueda asociarse a ambas enfermedades.

La COPD afecta predominantemente a las vías respiratorias estrechas, la bronquitis crónica a las amplias y medias, y el enfisema a los alveolos.

La COPD es un proceso irrefrenable, el cual conduce a la reconstrucción de tejido con fibrilación (aumento de fibras). La bronquitis crónica no conduce a una reconstrucción de tejido. En el enfisema se produce la destrucción de las paredes alveolares, en particular de la porción elástica de la matriz extracelular.

En la COPD se pone de manifiesto un aumento tópico de granulocitos neutrófilos, de macrófagos y de células CD8 en las vías respiratorias estrechas; en el caso de la bronquitis crónica se pone de manifiesto una participación de todas las células inflamatorias; y en el enfisema los leucocitos no se encuentran en primer plano.

En la patente EP 0 352 412 ya se describe la utilización de ésteres del ácido retinoico y/o un éster del retinol como preparación en forma de un aerosol inhalable de aplicación tópica para la profilaxis y para el tratamiento de enfermedades de la mucosa del tracto traqueobronquial de humanos y animales. Dichas enfermedades, denominadas bronquitis, se tratan de bronquitis agudas y crónicas, que no muestran obstrucción. Por ejemplo, la mayoría de los fumadores sufren de bronquitis, pero no muestran obstrucción de las vías respiratorias y por lo tanto no muestran COPD. Las broncoectasias son irreversibles, cilíndricas, en forma de bolsa o en forma de dilataciones varicosas de los bronquios, un cuadro clínico que no pertenece a la enfermedad obstructiva crónica, es decir, COPD.

Por lo tanto, las enfermedades de la mucosa del tracto traqueobronquial mencionadas en la patente EP 0 352 412 no son enfermedades que puedan catalogarse bajo el término COPD. En particular se diferencian de la COPD en cuanto a que falta la típica obstrucción irreversible de la COPD.

Hasta ahora, la COPD se trataba por ejemplo mediante la toma de \beta-adrenérgicos/anticolinérgicos, teofilina y/o glucocorticoides. Las desventajas de los mencionados medicamentos son que actúan sólo sintomáticamente y que no tienen ninguna influencia sobre el transcurso de la COPD, cuyo transcurso es de fatal destino. Los espasmolíticos tienen el efecto de acortar la vida. La teofilina provoca alteraciones del ritmo cardíaco. Un importante efecto secundario de los glucocorticoides es la osteoporosis.

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La patente EP 0 450 991 describe una preparación que contiene fosfolípidos para el tratamiento de enfermedades obstructivas de las vías respiratorias, bien en forma aislada o conjuntamente con otros excipientes. Como principios activos adicionales se mencionan los derivados del ácido retinoico. Como fosfolípidos se mencionan la fosfatidilcolina, la fosfatidilglicerina y los ácidos fosfatídicos. Los fosfolípidos se presentan en forma de suspensiones miscelares o suspensiones liposómicas; también como aerosoles.

La patente WO 98/25587 describe la utilización de composiciones antioxidantes lipófilas para impedir reacciones oxidativas inducidas por el ácido retinoico y mediadas por irradiación UVA, aplicándose típicamente sobre la piel un retinoide y una cantidad activa de un agente antioxidante lipófilo.

La patente WO 96/04891 describe la utilización de una preparación que contiene un carotenoide, la cual se presenta en forma de partículas portadoras de lípidos, para el tratamiento de enfermedades tumorales. Como carotinoide se menciona por ejemplo el ácido retinoico.

La patente EP 0 848 949 describe una preparación farmacéutica en forma de aerosol para la utilización sobre las mucosas de las vías respiratorias, que contiene un principio activo del grupo de los retinoides y carotenoides, un gas de arrastre licuado o una mezcla de gas de arrastre licuado, así como eventualmente coadyuvantes con acción antioxidante y otros coadyuvantes farmacéuticos habituales.

Es objeto de la presente invención preparar un nuevo agente para el tratamiento de la COPD que evite las desventajas del estado de la técnica descritas.

Dicho objeto se resuelve según la invención utilizándose vitamina A y/o sus derivados y/o sus ésteres en una cantidad terapéuticamente activa para la terapia de la COPD, la cual se aplica en forma de un aerosol inhalable. Otras características de la composición se resultan evidentes a partir de la reivindicación 1.

Bajo la expresión "derivados" de la vitamina A se encuentran el retinol, el retinal y el ácido retinoico, cada uno de ellos con sus derivados y ésteres, así como la \beta-carotina y sus derivados como precursores de la vitamina A. Por ejemplo, el retinol puede encontrarse esterificado con al ácido linoleico, el ácido esteárico, el ácido palmítico, el ácido oleico como ácidos grasos saturados e insaturados. Esto engloba también modificaciones químicas de los mencionados ácidos grasos y alcoholes (véase también la patente EP 0 352 412 B1; S.11, reivindicación 4 + reivindicación 6). A modo de ejemplo, se remite a Martindale, The Extra Pharmacopeia (la farmacopea extra), 1982, Londres, The Pharmaceutical Press y las ediciones subsiguientes. Se refiere a dicho documento en su totalidad.

Para la administración por inhalación, la vitamina A se aplica en forma de aerosol, para lo cual se utilizan en particular nebulizadores e inhaladores. De esta manera se divide el principio activo en partículas diminutas y se transporta al lugar de acción terapéutica.

La Vitamina A y sus derivados y ésteres se presentan según la invención en forma de aerosol. Los aerosoles son neblinas finas, la cuales se obtienen mediante sistemas que permanecen bajo presión. Pueden obtenerse por ejemplo mediante el rociado o de líquidos pero también de polvo seco. Los aerosoles de inhalación se diferencian de los sistemas designados habitualmente como aerosoles en que las partículas de aerosol se encuentran en un orden de magnitud por debajo de 10 \mum, preferentemente en el rango de 1-10 \mum.

Los componentes base de los sistemas de aerosol en forma de nebulizador son por ejemplo un contenedor con un agente de arrastre, aunque entre tanto se han desarrollado también sistemas de aerosol sin agente de arrastre. Además, el sistema de aerosol contiene el o los principios activos junto a aditivos habituales como por ejemplo agentes transportadores y lactosa. La preparación de dichos componentes cumple las características de los aerosoles inhalables, por ejemplo la distribución de tamaños de partícula, la velocidad de transporte, la viscosidad, etc.

Los aerosoles pueden presentarse como aerosoles de dos fases (gas y líquido). Los aerosoles de dos fases constan de una disolución de los principios activos en un gas de arrastre licuado y el gas de arrastre nebulizado. El disolvente consta por ejemplo del gas de arrastre o de una mezcla del gas de arrastre y codisolventes como por ejemplo alcohol, propilenglicol, polietilenglicoleno, cuyo codisolvente se utiliza frecuentemente para mejorar la solubilidad de los principios activos.

Los sistemas de tres fases constan de una suspensión o emulsión del principio activo, por ejemplo el principio activo junto a los gases de arrastre nebulizados. Una suspensión consta del principio activo, dispersado en el sistema de gas transportador con ayuda de coadyuvantes habituales, por ejemplo agentes de reticulación y/o excipientes compactos como por ejemplo talco o ácido silícico coloidal. Los gases de arrastre son conocidos y comprenden diferentes hidrocarburos, en la medida de lo posible sin efectos perjudiciales para la capa de ozono.

Sólo es posible la inhalación si la disolución de inhalación se divide en partículas lo más finas posible, en el rango de orden de magnitud de 1 – 10 \mum. Sólo los aerosoles finamente divididos de la manera descrita pueden inhalarse. En los aerosoles habituales, se contradice una inhalación. Información adicional sobre aerosoles inhalables se cita por ejemplo en la farmacopea EEUU, haciéndose referencia a ella en su totalidad en la presente invención.

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En una realización preferida de la invención se presenta la vitamina A incluida en liposomas. Los liposomas son compartimentos acuosos, los cuales están envueltos de una doble capa lipídica totalmente cerrada. Los liposomas se producen por ejemplo mediante la suspensión de lípidos apropiados en disoluciones acuosas. Los liposomas se dispersan de manera que se creen vesículas cerradas del mismo tamaño aproximadamente. En las disoluciones acuosas, o bien en las membranas lipídicas, pueden introducirse entonces moléculas extrañas, según la invención vitamina A. Se ha puesto de manifiesto que la vitamina A empaquetada en liposomas aumenta el efecto terapéutico y puede disminuir de forma eficiente los efectos secundarios. Las particularidades sobre lo anterior se describen con mayor detalle a continuación.

Se ha podido demostrar que los liposomas, que contienen como mínimo fosfatidilcolina junto a como mínimo otro fosfolípido, seleccionado entre el grupo formado por fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico y cardiolipina, son particularmente apropiados para el tratamiento de la COPD. La utilización de dichas preparaciones de liposomas consigue una absorción selectiva a través de los macrófagos alveolares, una mayor especificidad en la terapia y una disminución de la dosis terapéuticamente activa unido a una reducción de los efectos secundarios.

La relación entre la proporción de fosfatidilcolina respecto la proporción de fosfolípidos habituales es de 65:35 – 75:25, haciendo referencia cada una de dichas proporciones a un 100% de fosfolípidos. Por lo tanto, la fosfatidilcolina es un componente esencial de los liposomas, mientras que el resto podrían ser uno o varios de los fosfolípidos mencionados más arriba. Los liposomas de la presente invención contienen además antioxidantes en una proporción del 10 – 50%. Preferentemente, se utiliza en la presente invención la vitamina E o sus derivados, como por ejemplo el acetato de (+)-\alpha tocoferol, el acetato de (\pm)-\alpha tocoferol, el succinato del ácido del (\pm)-\alpha tocoferol. La proporción de fosfolípidos es del 50% - 90%.

Un experto medio en la técnica puede determinar la cantidad de vitamina A a incluir en los liposomas mediante los ensayos médico-terapéuticos habituales, los cuales evidentemente deben realizarse previamente en el marco animal. Razonablemente, las formulaciones de liposomas descritas también pueden utilizarse como contenido de un aerosol, con el objeto de alcanzar la acción terapéutica óptima.

Las preparaciones de vitamina A como aerosol inhalable especialmente compuestas en forma de liposomas, tal como se ha descrito en la presente invención, no se habían descrito hasta el momento. Dicha preparación farmacéutica no sólo puede utilizarse para el tratamiento de la COPD, sino que también puede utilizarse por ejemplo para el tratamiento de bronquitis crónicas, de enfisemas y de enfermedades de los pulmones malignas y también benignas; en general puede utilizarse para el tratamiento de enfermedades del tracto traqueo-bronquial.

Los liposomas utilizados según la invención se diferencian de los liposomas multilamelares conocidos en el estado de la técnica no sólo por su composición, sino también por el hecho de que se encuentran en forma unilamelar. La especial combinación de conformación liposómica, principio activo y estructura conduce a la actividad sorprendente descubierta según la invención para el tratamiento de enfermedades del tracto traqueobronquial.

Preferentemente se utilizan aquellos fosfolípidos que hacen posible el direccionamiento selectivo hacia los macrófagos alveolares mediante la unión a receptores específicos presentes sobre los macrófagos alveolares, los mencionados receptores scavenger. A dicho grupo pertenecen los siguientes fosfolípidos:

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1. Fosfatidilinositol (1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfo-[1-D-mioinositol]

Los restos acílicos pueden derivarse Del ácido araquidónico o del ácido linoleico, del ácido palmítico, del ácido esteárico y de otros ácidos grasos insaturados o saturados.

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2. Fosfatidilserina (1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoserina)

Los restos acílicos pueden derivarse del ácido araquidónico o del ácido oleico, del ácido palmítico y de otros ácidos grasos insaturados y saturados.

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3. Ácido fosfatídico (1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfato)

Los restos acílicos pueden derivarse del ácido araquidónico o del ácido esteárico, del ácido decanoílico, del ácido heptadecanoílico, del ácido láurico, del ácido mirístico, del ácido octanoílico, del ácido oleílico, del ácido palmítico y de otros ácidos grasos insaturados o saturados.

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4. Cardiolipina (difosfatidilglicerol)

La cardiolipina contiene como máximo 4 restos acídicos, los cuales derivan de ácidos grasos insaturalos y saturados.

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5. Fosfatidilcolina (L-\alpha-lecitina, 1,2-decail-sn-glicero-3-fosfocolina) (parcialmente oxidada)

Los restos acílicos pueden derivarse del ácido araquidónico o de ácidos grasos insaturados y saturados. Aquí como mínimo un ligando acílico es insaturado. El resto acílico insaturado se encuentra parcialmente oxidado y permite la unión de los liposomas a receptores scavenger.

Los liposomas utilizados según la invención presentan un tamaño en el rango de 0,1 \mum a 2 \mum, en particular preferentemente de 0,4 \mum. Se utilizan liposomas unilamelares. La preparación de los mismos se lleva a cabo mediante un tipo de filtración a elevada presión, por ejemplo con una extrusora comercial de la compañía Lipex Biomembranes, Canadá. Los liposomas convencionales, descritos por ejemplo en el artículo de Parthasarathy et al., Cancer Chemother. and Pharmacol., 1999, 43(4), 277-283, se preparan mediante la reconstitución de un film lipídico seco en el líquido deseado. De esta manera se forman los denominados liposomas multilamelares, es decir, liposomas con varias capas lipídicas alrededor del núcleo acuoso. Dichos liposomas tienen un tamaño muy heterogéneo y pueden conducirse a un tamaño uniforme mediante ultrasonidos, tal y como se muestra en Parthasarathy et al. Sin embargo, los liposomas multilamelares descritos en Parthasarathy et al. tienden a formar agregados o a fusionarse para dar liposomas todavía más grandes. La utilización de dichos liposomas ha mostrado ser inapropiada según la presente invención. Por un lado, mediante la utilización de la extrusora descrita más arriba, la cual sólo se ha mencionado a modo de ejemplo, los liposomas ya reconstituidos pueden lavarse extensivamente antes de su utilización, es decir, se separan las substancias no incorporadas; por otro lado los liposomas unilamelares, los cuales sólo presentan una capa lipídica alrededor del núcleo acuoso, pueden continuar procesándose, lo cual les confiere una estabilidad particular. La combinación de la composición lipídica descrita en la presente invención y la utilización de liposomas unilamelares ya conduce a una eficiencia terapéutica remarcable.

Sólo la preparación de liposomas proporcionada por la presente invención posibilita la resolución del objeto de la invención, es decir, direccionar el principio activo hacia células diana específicas, en concreto los macrófagos alveolares. Sólo dicha composición especial de los liposomas asegura que son reconocidos por células diana determinadas y que son incorporados a las mismas de forma activa. De esta manera es posible producir un un efecto de la vitamina A no conocido y no descrito hasta el momento en macrófagos alveolares como células diana relevantes.

Mediante la composición farmacéutica según la invención tiene lugar la intervención en el metabolismo de un tipo determinado de leucocitos en los pulmones, en concreto los macrófagos alveolares, de manear que se influencia de forma duradera el proceso de inflamación, en particular de la COPD.

En el estado de la técnica se desconocía que era posible un direccionamiento celular mediante una preparación liposómica particular, de manera que se abren nuevas posibilidades terapéuticas. El direccionamiento celular de la preparación de liposomas seleccionada según la invención es un prerrequisito para solucionar el objeto planteado por la presente invención; de hecho es concebible que en otras células, es decir, en células distintas de los macrófagos alveolares se observe un efecto de la vitamina A contraproducente para el objeto mencionado. Un efecto de este tipo se ha descrito por ejemplo en los osteoblastos de rata.

En Kirilenko V.N. y Gregoriadis G., J. Drug Targeting, 1993, 1 (4), 361-368 se ha descrito la utilización de lípidos como emulgentes, los cuales mejoran una reabsorción inespecífica de vitaminas en el marco de la ingestión de alimentos. No se describe la composición particular proporcionada por la presente invención ni se sugiere su utilización para el tratamiento de enfermedades del tracto traqueobronquial, en particular de la COPD. Sólo la composición especial proporcionada por la invención comprende la posibilidad de que la vitamina A se transporte a determinadas células objetivo y que pueda introducirse de forma activa en las mismas.

En la solicitud de patente EP-A-0 229 561 se utilizan liposomas como transportadores, para llevar la vitamina A a células cutáneas. La preparación utilizada presenta exclusivamente un efecto cosmético y no terapéutico. La utilización de dichas composiciones en el tracto traqueobronquial es impensable. Los liposomas mencionados en la solicitud de patente EP-A-0 229 561 tampoco poseen la propiedad de reconocer un tipo de célula diana especial en los pulmones para ser introducidos de forma altamente específica en dichas células.

La solicitud de patente EP-A-0 352 412 tampoco anticipa la invención y tampoco la sugiere. Ciertamente se describe en dicha solicitud el tratamiento del epitelio bronquial mediante vitamina A, pero dicho tratamiento no se realiza utilizando la preparación liposómica especial de la invención.

A continuación se describe la invención con mayor detalle con la ayuda de las figuras adjuntas. Las figuras muestran:

Figura 1: células BAL +/- liposomas con vitamina A – paciente E.S.: MMP-9 día 3;

Figura 2: células BAL +/- liposomas con vitamina A – paciente E.S.: TIMP-1 día 3;

Figura 3: células BAL +/- liposomas con vitamina A – relación MMP-9/TIMP-1: paciente E.S. día 3;

Figura 4: TNF- ELISA a partir de células BAL del paciente: F (proceso de andamiaje);

Figura 5: TNF- ELISA a partir de células BAL del paciente: E (proceso de andamiaje);

Figura 6: TNF- ELISA a partir de células BAL del paciente: M (EAA- pulmón de granjero);

Figura 7: TNF- ELISA a partir de células BAL del paciente: A (pneumonía de células gigantes).

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BAL: = lavado bronquioalveolar

TNF: = factor de necrosis tumoral

AM: = macrófagos alveolares

ELISA: = ensayo de inmunoabsorción enzimática.

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A continuación se describe con mayor detalle la invención con la ayuda de algunos ejemplos de realización. Sin embargo, la invención no se restringe a los siguientes ejemplos.

Cada vez existen más indicios de que alteraciones en el equilibrio proteasas/inhibidores de proteasas puedan estar implicadas etiológicamente en la patogénesis de enfermedades de los pulmones de transcurso crónico. De esta manera ha podido demostrarse que las metaloproteasas de la matriz (MMPs) secretadas por los macrófagos alveolares ocasionan lesiones irreversibles en el tejido pulmonar y de esta manera producen limitaciones de la función respiratoria. Esto afecta en particular a los pacientes con bronquitis obstructiva crónica (COPD). En la COPD, entre las diferentes MMPs se secreta en particular una gran cantidad de la metaloproteasa MMP-9 en las vías respiratorias y en los alveolos, cuya MMP-9 no puede ser completamente neutralizada mediante el antagonista natural TIMO-1 (inhibidor de tejido de la metaloproteasa). Los principales productores de la MMP-9 en los pulmones son los macrófagos alveolares, los cuales se discuten como principal responsable de la formación de enfisema en rata en las nuevas investigaciones (y no los granulocitos neutrófilos, como se ha asumido hasta el momento). Algunas investigaciones muestran también una elevación de MMP-9 en el suero de los pacientes de COPD. La relación entre proteinasa e inhibidor: MMP-9/TIMP-1 es un criterio decisivo para la medida de una alteración del equilibrio proteasas-antiproteasas.

Según la invención, pudo mostrarse en un sistema in vitro con macrófagos alveolares que la vitamina A no sólo contrarresta de forma significativa la expresión de MMP-9, sino que estimulaba también de forma significativa, al mismo tiempo, la expresión del inhibidor específico TIMP-1, lo cual era completamente sorprendente. Dichos efectos se discernían aún más claramente si la vitamina A se empaquetaba en composiciones liposómicas especiales, tal como se ha descrito más arriba, lo cual aseguraba una incorporación específica en los macrófagos alveolares.

Mediante la utilización de vitamina A empaquetada en liposomas, pudo reducirse sorprendentemente y de forma marcada la relación MMP-9/TIMP-1, en concreto aproximadamente en un factor de 12. Esto significa una disminución eficiente del potencial lesivo para tejido del sistema proteolítico mediante la utilización de vitamina A. En base a dichas investigaciones se estableció la presente composición terapéutica para el tratamiento de la COPD y del enfisema pulmonar. La preparación de liposomas se ha descrito ya más arriba. La preparación exacta de los liposomas se en los siguientes ejemplos de realización.

El efecto de la vitamina A sobre las metaloproteasas es conocido. Sin embargo, los resultados que se alcanzan mediante la administración de vitamina A son extremadamente contradictorias. Mientras que algunos sistemas investigados describen una disminución de la concentración de metaloproteasas mediante la detención de la expresión de los genes que la codifican, en otros trabajos se describe una expresión aumentada y por tanto una concentración aumentada de metaloproteasas. En Park y Kim, Mol. Cells, 1999, 9 (2): 119-26 se describe que por influencia del ácido retinoico, las enzimas con actividad gelatinasa, las cuales se encuentran entre las metalopropeasas, aumentaron su actividad, en particular aumentó la expresión de dichas metaloproteasas. En la publicación de Overall, JouARNl of Cellular Physiology, 1995, 164 (1):17-25 se describe que el ácido retinoico aumenta la expresión de metaloproteasas en los osteoblastos de rata, mientras que al mismo tiempo el nivel de ARNm de TIMP-1 se reduce marcadamente, dependiendo de la dosis de ácido retinoico administrado. En el trabajo de Heath et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 1990, 168 (3): 1171-1176 se describe que el nivel de TIMP cayó a 0 bajo la influencia de retinol.

Analizando el estado de la técnica descrito más arriba, es un resultado sorprendente para un experto medio en la técnica, el hecho de que bajo la influencia de la vitamina A, es decir, el ácido retinoico y del retinol, no sólo se alcanza una marcada detención de la expresión de la metaloproteasa MMP-9 en los macrófagos alveolares y en los monocitos sanguíneos, sino que al mismo tiempo se alcanza también una estimulación del inhibidor TIMP-1.

En el marco de los experimentos de incorporación de los liposomas según la invención en los monocitos sanguíneos, se analizó también la capacidad de incorporación de liposomas de diferentes líneas celulares de uso corriente de diferente origen, como sistemas de control. Entre todas las células se utilizaron células de origen mielomonocítico, por ejemplo las líneas celulares HL-60, U937, THP-1 y Mono Mac 6 (ordenadas en la enumeración según grado de madurez creciente). Así pues, la línea celular humana Mono Mac 6 monocítica se encuentra en el grado de madurez más desarrollado en dirección a macrófagos. Sin embargo, dichas células apenas incorporaron liposomas, lo cual contradice la presunción de que una célula más diferenciada también presenta una mayor expresión de receptores de fosfatidilserina. A este respecto, tampoco se sugiere que los macrófagos alveolares incorporen de forma selectiva dichos liposomas. Además, no era previsible hacia qué tipo de macrófago se desarrollará un monocito sanguíneo, dado que que existen diferencias relevantes no sólo relacionadas con la morfología y la función. Además, no se había descrito qué células se emparejan con qué tipo de receptor de fosfatidilserina. En particular era desconocido que estuviera presente en los macrófagos alveolares un receptor de fosfatidilserina. Así pues, no sólo era sorprendente el efecto de la vitamina A en el tratamiento de la COPD y del enfisema pulmonar, sino también el efecto aumentado de la vitamina A al administrarse en forma de liposomas, en particular las preparaciones de liposomas especiales, tal como se ha descrito más arriba.

Mediante el tratamiento de la COPD y del enfisema pulmonar con la vitamina A, puede tratarse el desequilibrio entre las MMPs y los TIMPs, es decir, se detiene la expresión de las primeras y se estimula la expresión de las últimas.

La terapia descrita en la presente invención contrarresta la destrucción de tejido y ofrece una preparación nueva y prometedora para el tratamiento de enfermedades obstructivas crónicas. Las ventajas especiales de la invención son, entre otras:

-: utilización de una dosis inferior, dado que tiene lugar la incorporación selectiva de la vitamina A empaquetada en liposomas en los macrófagos alveolares, los cuales representan la mayor fuente de metaloproteasas.

-: Actuando simultáneamente sobre dos agonistas que se encuentran en equilibrio en el sistema proteolítico de los pulmones, se alcanza un efecto altamente eficiente de la vitamina A.

-: Se normaliza en equilibro proteasas-antiproteasas en los pulmones.

-: La vitamina A empaquetada en liposomas se almacena en forma de depósito;

-: De esta manera cede una cantidad inferior de vitamina A en el torrente sanguíneo, la sustancia efectora permanece directamente en el lugar de acción, los pulmones, y se disminuyen los efectos secundarios sistémicos.

Los siguientes ensayos documentan los sorprendentes efectos de la administración de vitamina A, en particular en forma liposómica. Se extrajeron macrófagos alveolares (AM) a través de un lavado bronquioalveolar. Los AM se sembraron en medio Mono Mac 6 + 10% FCS a 1 x 10^{6} células por 1 ml de volumen por muestra en una placa de 24 pozos de baja adhesión (Costar). A continuación se adicionaron liposomas con vitamina A o bien las substancias puras. Se recolectaron de cada una de las muestras paralelas, células en el día 1, día 3 y día 4 para la RT-PCR así como el sobrenadante de cultivo para la determinación de proteínas en ELISA. Específicamente, se prepararon las siguientes muestras:

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\bullet: \beta = muestra control, sólo AM en el medio

\bullet: Lip vacío = liposomas vacíos

\bullet: Lip VitA = liposomas con vitamina A (ácido retinoico, sigma R-2625), concentración final 5 \muM

\bullet: Vit A = vitamina A pura (ácido retinoico, sigma R-2625), concentración final 5 \muM

\bullet: Lip Palm = liposomas con palmitato de retinol todo trans (Sigma R-3375), concentración final 3 \muM

\bullet: Palmitato = palmitato de retinol todo trans (Sigma R-3375), concentración final 3 \muM.

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Se analizó el contenido en MMP-9 y en TIMP-1 en los sobrenadantes de cultivo con kits ELISA comerciales (Amersham Pharmacia). Los resultados se indican en ng/ml de sobrenadante de cultivo relativo a 1 x 10^{6} células.

Los datos indicados muestran los resultados en el día 3 tras la adición de vitamina A. En el día 1 no se puso de manifiesto ningún efecto en el marco de las proteínas (aunque sí en el marco del ARNm); los datos del día 4 concuerdan con los del día 3: mientras que la expresión de MMP-9 se reduce fuertemente mediante la vitamina A liposómica y libre, al mismo tiempo se registra un aumento de TIMP-1. El efecto de la vitamina A liposómica es siempre superior al de la libre. Dicha regulación en sentido contrario de MMP-9 y TIMP-1 explica también el enorme efecto sobre la relación MMP-9/TIMP-1 del tratamiento con vitamina A.

El cultivo de las células BAL y de PBMC con vitamina A liposómica se llevó a cabo como se indica a continuación:

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Material:

\bullet: RPMI 1640 (Biochrom # F1415, Berlin), L-Glutamina 2 mM (Gibco # 25030-024), penicilina 200 U/ml estreptomicina 200 \mug/ml (Gibco # 15140-114), aminoácidos no esenciales (NEAA) 1-2 x (Gibco # 11140-35), suplemento OPI (contiene oxalacetato, piruvato sódico e insulina) 10 ml para 1 l (Sigma # O-5003). Después de una filtración a través de un ultrafiltrador Gambo U 2000 (Martinsried, Alemania) para separar LPS, se adicionó un 10% de FKS, en el cual se había comprobado la ausencia de LPS.

\bullet: Placas Costar de baja adhesión de 24 pozos # 3473 (Bodenheim, Alemania).

Por cada muestra se utilizan 1 x 10^{6} células BAL (= células provenientes de lavado bronquioalveolar, con aproximadamente un 80% de de macrófagos alveolares) o bien 1,5 x 10^{6} PBMC (= células mononucleares de sangre periférica, aisladas en un gradiente LymphoPrep (Nycomed, Noruega)) en 1 ml de volumen. Las placas de cultivo celular de baja adhesión de 24 pozos se pretratan según las especificaciones del fabricante. Para ello se llenaron los pozos necesarios con 1 ml de medio y se incubó durante 20 min a 37ºC en la incubadora. Después se separó de nuevo el medio y se reemplazó por la suspensión celular. Los liposomas cargados con vitamina A se añadieron en una concentración final de 5 x 10^{-6} M. Como control, se ensayaron muestras paralelas con vitamina A pura y con liposomas vacíos. Las células para la medida de MMP-9 y TIMP-1 en el sobrenadante de cultivo y las células para la determinación de la expresión de ARNm se incubaron en la incubadora durante tres días a 37ºC. Entonces se resuspendieron bien las células y a continuación se extrajeron 2 x 10^{6} células por cada lisado para PCR y se lisaron en un recipiente de reacción Eppendorf en 200 \mul de ARNclean (AGS, Heidelberg, Alemania). Dichos lisados para PCR se almacenaron a -20ºC hasta su utilización. El resto de la suspensión celular se transfirió a un recipiente Eppendorf y se centrifugó a 14.000 x g durante 5 min. Se extrajo el sobrenadante, se introdujo en un recipiente nuevo y se almacenó a -80ºC hasta su medición.

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Sumario de muestras

1. Células BAL ó PBMC: sin nada más

2. Células BAL ó PBMC: + liposomas vacíos

3. Células BAL ó PBMC: + liposomas con vitamina A en una concentración final de 5 \muM

4. Células BAL ó PBMC: + vitamina A pura en una concentración final 5 \muM.

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Medida de MMP-9 y TIMP-1 a nivel de proteínas en ELISA

Para la medida de MMP-9 y TIMP-1 en los sobrenadantes del cultivo celular, se utilizaron kits ELISA comerciales de la empresa Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg, Alemania). Más específicamente, son las siguientes:

Metaloproteinasa de la matriz-9 (MMP-9) humana, sistema ELISA: código RPN 2614.

Inhibidor de tejido de metaloproteinasas-1 (TIMP-1) humano, sistema ELISA: código RPN 2611.

Metaloproteinasa de la matriz-9 (MMP-9) humana, sistema de actividad: código RPN 2630.

Cada uno de los ensayos ELISA se llevó a cabo exactamente según las especificaciones del fabricante.

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Determinación de la expresión de m-ARN de MMP-9 y TIMP-1 mediante RT-PCR semicuantitativa

El procedimiento utilizado está bien establecido y y ya ha sido publicado en varias ocasiones. Por lo tanto, se describe sólo de forma esquemática:

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\bullet: Aislamiento del ARN total según el procedimiento ARNclean

\bullet: Transcripción del ARN en ADNc utilizando oligo-dT

\bullet: Amplificación del ADNc con cebadores específicos para MMP-9, TIMP-1 y \alpha-enolasa como control

\bullet: Análisis en un gel de agarosa.

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Preparación de liposomas con ácido retinoico todo trans 2 x 10^{-4} M

Reactivos:

\bullet: Fosfatidilcolina:1-palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfocolina = POPC

\bullet: Fosfatidilserina: 1,1-dioleil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina, sal monosódica = OOPS

\bullet: Ácido retinoico todo trans (vitamina A): Sigma # R-2625 (Deisenhofen, Alemania) 10 mM, disolución madre en etanol absoluto

\bullet: (\pm)-\alpha-tocoferol (vitamina E): Sigma # T-3251 (Deisenhofen), disolución madre 20 mg/ml en etanol absoluto.

Todos los reactivos utilizados tienen en cuenta la ausencia de endotoxina (libre de LPS), es decir, se eliminó LPS de todos los recipientes de vidrio mediante horneo a 3h a 180ºC. Para la preparación de 1 ml de liposomas, se pesa 17,5 mg de POPC y 7,5 mg de OOPS en un tubo de refrigeración estéril (NUNC). Mediante la adición de 1 ml de cloroformo (Merck), se disuelven los lípidos. La disolución total se transfiere a un matraz de fondo redondo de vidrio Duran y se pipetean en la misma 50 \mul de vitamina A. Como protección de oxidación de los lípidos y de la vitamina A, se adicionan además 10 \mul de solución madre de vitamina E. Bajo condiciones estériles, con calentamiento suave (que no supere los 42ºC) y bajo rotación del matraz, se evapora el cloroformo hasta que se forme un film lipídico blanco en el fondo del matraz. Se reconstituyen los liposomas mediante la adición de 1 ml de tampón fosfato (PBS) libre de LPS bajo agitación del matraz. Para reconstituir completamente los liposomas, se deja reposar la preparación durante aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente (protegida contra la luz). Después, los liposomas multilamelares formados de esta manera se transfieren a un recipiente de reacción Eppendorf estéril de 1,5 ml. Como control se utilizan liposomas vacíos sin adición de vitamina A. Para separar la vitamina A no empaquetada en los liposomas, la preparación de liposomas se centrifuga a 14.000 x g en una centrífuga de mesa para tubos tipo Eppendorf. Se separa el sobrenadante con una pipeta y se completa el volumen con PBS nuevo hasta 1 ml. Esta etapa de lavado se repite en total 6 veces.

Para finalizar, se lleva a cabo un proceso de extrusión para convertir los liposomas multilamelares en liposomas unilamelares de 0,4 \mum de diámetro. Para ello, se ensambla la extrusionadora según las especificaciones del fabricante (Lípez Biomembranes, Vancouver, Canadá). Para obtener liposomas de 0,4 \mum se coloca en el prefiltro (Drain Disc, Costar # 230 300) un filtro de tamaño de poro 0,4 \mum (Costar Nulepore # 110 407). El volumen de liposomas total se vierte sobre el montaje con una pipeta Pasteur. Los liposomas se extruyen bajo presión (aproximadamente 5-10 bar, no superior a 40 bar) y se recogen en un recipiente de reacción Eppendorf. Dichos liposomas se vierte de nuevo sobre el montaje y se repite el procedimiento (el filtro de membrana puede utilizarse hasta 9 veces). Debe llevarse a cabo dicho ciclo para cada preparación de liposomas como mínimo tres veces (mejor cinco veces). Los liposomas unilamelares preparados se filtran en condiciones de esterilidad para su utilización en cultivos celulares a través de un filtro Millipore # SLGV 013 OS. Una preparación de liposomas preparada de esta manera puede utilizarse durante un período de como mínimo cuatro semanas.

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Caracterización de los liposomas

\bullet: Unilamelares

\bullet: Diámetro de 0,4 \mum

\bullet: Es posible comprobar la funcionalidad con ayuda de un procedimiento de tinción especial y análisis en un citómetro de flujo (en caso de necesidad puede describirse más detalladamente).

Claims

1. Composición farmacéutica en forma de aerosol inhalable, que contiene como principios activos vitamina A y/o sus derivados y/o sus ésteres en una cantidad terapéuticamente activa, caracterizada por el hecho de que los principios activos se encuentran dentro de liposomas unilamelares con un tamaño de 0,1 \mum a 2 \mum y que los liposomas comprenden como mínimo fosfatidilcolina y un fosfolípido, dicho fosfolípido seleccionado entre el grupo formado por fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico y cardiolipina en su doble capa lipídica y que la relación de la fosfatidilcolina respecto el resto de fosfolípidos es de 65:35 hasta 75:25.

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que la vitamina A es retinol, retinal y/o ácido retinoico y sus derivados y ésteres, y \beta-carotina y sus derivados como precursores de vitamina A.

3. Composición farmacéutica según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que los liposomas comprenden un estabilizador.

4. Composición farmacéutica según la reivindicación 3, caracterizada por el hecho de que se utiliza un agente antioxidante como estabilizador.

5. Composición farmacéutica según la reivindicación 3 ó 4, caracterizada por el hecho de que se utiliza vitamina E como estabilizador.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 3, 4 ó 5, caracterizada por el hecho de que el estabilizador se utiliza en una cantidad del 0,1% - 10%, preferentemente 0,8%, relativo a 25 mg de lípidos.

7. Composición farmacéutica según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que además de fosfatidilcolina se encuentra presente fosfatidilserina.

8. Composición farmacéutica según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que los liposomas comprenden desde 5,0 mg hasta 0,0015 mg de vitamina A y/o sus derivados y ésteres, relativo a 25 mg de lípidos, preferentemente 0,05 mg - 0,30 mg de vitamina A por 25 mg de lípidos.

9. Composición farmacéutica según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que comprende adicionalmente excipientes y/o coadyuvantes.

10. Composición farmacéutica según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que además de vitamina A comprende principios activos adicionales.

11. Utilización de la vitamina A y/o sus derivados y/o ésteres como principios activos en una cantidad terapéuticamente activa, según la cual dichos principios activos se encuentran dentro de liposomas unilamelares con un tamaño de 0,1 \mum a 2 \mum y dichos liposomas comprenden como mínimo fosfatidilcolina y otro fosfolípido, dicho fosfolípido seleccionado entre el grupo formado por fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico y cardiolipina en su doble capa lipídica y la relación de la fosfatidilcolina respecto el resto de fosfolípidos es de 65:35 hasta 75:25, para la preparación de una composición farmacéutica en forma de aerosol inhalable para la profilaxis y terapia de enfermedades del tracto traqueobronquial.

12. Utilización según la reivindicación 11 para la terapia de la COPD, las bronquitis crónicas, los enfisemas y las enfermedades de los pulmones tanto malignas como benignas.

13. Utilización de una composición farmacéutica en forma de aerosol inhalable, que comprende como mínimo vitamina A y/o sus derivados y/o sus ésteres como principio activo en una cantidad terapéuticamente activa para el tratamiento de la COPD.

14. Utilización según la reivindicación 13, caracterizada por el hecho de que como vitamina A se utiliza retinol, retinal y/o ácido retinoico y sus derivados y ésteres, y/o \beta-carotina y sus derivados como precursores de vitamina A.