ES2259293T3 - Uso de mamiefros no humanos deficientes en ship2. - Google Patents
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Abstract
Uso de un mamífero deficiente no humano que comprende una deleción parcial o total homocigótica o heterocigóticamente en su genoma en la secuencia de nucleótidos de la inositol polifosfato 5-fosfatasa SHIP2 como un modelo para el estudio de enfermedades en las que dicha enfermedad se produce por la presencia de hipersensibilidad a la insulina en un paciente, así como un modelo para el estudio del tratamiento de dichas enfermedades en dicho paciente.
Description
Uso de mamíferos no humanos deficientes en
SHIP2.
La presente invención se refiere generalmente a
los campos de la diabetes. Más particularmente, se refiere a la
identificación de genes y proteínas responsables de la diabetes y a
sus inhibidores para uso en el tratamiento.
La insulina es la principal hormona implicada en
la homeostasis de la glucosa. Una deficiencia parcial o total en la
secreción o la acción de la insulina conduce a una alteración del
metabolismo de la glucosa y diabetes.
La diabetes es una causa muy importante dentro
de los problemas sanitarios en el mundo. La diabetes mellitus no
dependiente de insulina (NIDDM también llamada diabetes de tipo 2)
es un trastorno de salud pública muy importante de la homeostasis
de la glucosa que afecta aproximadamente al 5% de la población
general en los Estados Unidos. No se comprenden bien las causas de
la hiperglucemia en ayunas y/o la intolerancia a la glucosa
asociadas con esta forma de diabetes.
Clínicamente, la NIDDM es un trastorno
heterogéneo caracterizado por hiperglucemia crónica que conduce a
lesiones micro y macrovasculares progresivas en el aparato
cardiovascular, los sistemas renal y visual, así como a neuropatía
diabética. Por estas razones, la enfermedad puede asociarse con
morbilidad y mortalidad precoces.
En el campo de la genómica, se identificaron
diversas mutaciones en los genes de propensión a la diabetes, por
ejemplo en la familia de genes de factor nucleótido del hepatocito
(HFN-1, HFN-4 y
HFN-6) tal como se describe en los documentos WO
98/11254 y WO 98/23780.
Se ha identificado el papel de dichos genes en
las rutas bioquímicas que afectan a la síntesis o secreción de
insulina por parte de las células beta de los islotes de Langerhans
mediante el análisis fenotípico de ratones deficientes en los que
eliminó de su genoma dichos genes o parte de los mismos.
Dicho mamífero deficiente se ha utilizado a
partir de entonces como modelos para la identificación de nuevos
compuestos o métodos de tratamiento que podrían utilizarse para
reducir los síntomas resultantes de la diabetes.
También es posible utilizar los genes
identificados correspondientes, que estarán presentes en una
cantidad suficiente en una composición farmacéutica, para el
tratamiento y/o prevención de dicha enfermedad.
Sin embargo, en este campo, existe una necesidad
por identificar nuevas dianas y rutas biológicas que pudieran
utilizarse para mejorar el tratamiento y/o la prevención de la
diabetes.
El dominio SH2 de tipo 2 que contiene inositol
polifosfato 5 fosfatasa o SHIP2 está estrechamente relacionado con
los acontecimientos de señalización mediados por la
fosfatidilinositol 3' cinasa y Shc/ras/MAP cinasa en respuesta a la
estimulación por parte de factores de crecimiento específicos.
Pesesse et al. (1997 y 1998) y Erneux
et al. (1998) ya han descrito la estructura del dominio SH2
que contiene enzimas y presenta una actividad catalítica
fosfatasa.
Se sabe que dicho dominio SH2 que contiene
proteínas muestra similitud con otra inositol polifosfato
5-fosfatasa identificada como molécula SHIP1 y
también muestra una identidad del 99% con respecto a una secuencia
previamente notificada (INPPL-1). Sin embargo,
INPPL-1, no contenía un dominio SH2.
Dicha nueva secuencia se identificará en lo
sucesivo como molécula SHIP2. Se ha sometido la otra inositol 5
fosfatasa SHIP1 conocida a una intensa investigación porque
posiblemente puede estar implicada en señalización negativa de las
células inmunológicas B y por tanto podría utilizarse como diana
para la selección de nuevas moléculas que posiblemente tengan
propiedades terapéuticas y/o profilácticas en el tratamiento de
diversos síntomas y enfermedades inmunológicas inflamatorias o
alérgicas.
Toshiyasusasaoka et al. (Diabetes vol.
84, Nº PPA 60 (1999) (XP 000905226)) describe la caracterización por
clonación de una molécula SHIP2 de rata que no tiene presente el
dominio SAM en la SHIP2 humana. Muestran que la sobreexpresión de
la molécula SHIP2 inhibe la activación de PKB inducida por insulina
mediante la actividad 5-inositol fosfatasa de
SHIP2. Los autores sugieren que SHIP2 juega un papel regulador
negativo en diversas acciones biológicas de la insulina y que la
regulación dual del complejo SHC-Grb2 y la molécula
hacia 3' de PI3-cinasa proporciona posibles
mecanismos de la molécula SHIP2 para participar en la señalización
de la insulina.
Sin embargo, todavía no se han identificado las
funciones exactas de dicho dominio SH2 que contiene inositol
polifosfato 5-fosfatasa SHIP2.
La solicitud de patente internacional WO
97/12039 describe la purificación y el aislamiento de moléculas de
ácido nucleico que comprenden una secuencia que codifica para el SH2
que contiene inositol fosfatasa, un vector que comprende dicha
secuencia, una célula transformada por dicho vector y una molécula
de SH2 que contiene inositol fosfatasa aislada y purificada
expresada por parte de dicha célula. Este documento también describe
anticuerpos dirigidos frente a dicha proteína y un método para
identificar una sustancia que puede unirse a dicha proteína.
Inesperadamente los inventores han descubierto
que un mamífero deficiente, preferiblemente un ratón deficiente,
que comprende una deleción parcial o total (heterocigótica u
homocigóticamente) de dicho dominio SH2 que contiene una secuencia
polifosfato inositol 5 fosfatasa SHIP2, es hipersensible a la
insulina (hipoglucemia postnatal grave y desregulación de la
expresión de genes implicados en la gluconeogénesis).
Este aumento de sensibilidad es tan importante
que a los dos o tres días siguientes al nacimiento los ratones
homocigotos (SHIP2 -/-) mueren de hipoglucemia grave, y que se
observa una tolerancia a la glucosa alterada en los ratones
heterocigotos (SHIP2 +/-).
In vitro, la ausencia de uno o ambos
alelos normales del gen SHIP2 se asocia con una mayor activación de
PKB, un efector de la cascada de PdtIns 3-cinasa, y
de MAP cinasa en respuesta a la insulina. Estos resultados
proporcionan las primeras evidencias directas de que SHIP2 es un
potente regulador negativo de la señalización de insulina in
vivo, y una diana terapéutica potencial para el tratamiento de
la diabetes tipo II.
La presente invención describe un inhibidor de
dicha molécula inositol polifosfato 5 fosfatasa SHIP2,
preferiblemente una molécula humana, estando dirigido dicho
inhibidor frente a dicha molécula y siendo capaz de reducir o
bloquear su actividad o expresión.
Un primer ejemplo preferido de dicho inhibidor
es un ARN antisentido (de 8 a 50 bases, preferiblemente desde 10
hasta 30 bases en longitud) construido a partir de la secuencia
complementaria del ARN mensajero que puede deducirse de la
secuencia del ADN complementario de la molécula SHIP2 que codifica
para la secuencia (identificada en lo sucesivo como SEQ ID No. 1 y
por Erneux et al. (1998)) o su hebra complementaria y que
hibrida de manera específica e inhibe su expresión. Dichos
inhibidores también puede ser una molécula que reduzca directa o
indirectamente la expresión o estabilidad de ARNm de SHIP2 (factores
de transcripción).
Un segundo ejemplo de dicho inhibidor es una
molécula SHIP2 mutada o una parte de la misma de más de
aproximadamente 30, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o
aproximadamente 150 aminoácidos (dominante negativo) que impediría
la actividad natural de SHIP2 mediante la competencia de la molécula
mutada con respecto a las proteínas que interaccionan o los
receptores implicados en la cascada de producción de insulina.
Preferiblemente, dicha molécula de SHIP2 mutada o parte de la misma
comprende una mutación en la siguiente secuencia de aminoácidos:
RTNVPSWCDR, especialmente una o más mutaciones, preferiblemente de
los siguientes aminoácidos: S, C, N, D ó R de dicha parte de
secuencia de SHIP2. Dicha(s) mutación(es)
afecta(n) al sitio catalítico de la molécula SHIP2
(actividad fosfatasa), tal como se describe en Erneux et al.
(1998). Normalmente, esas mutaciones crearían efectos negativos
dominantes.
Otros ejemplos de dichos inhibidores son
sustratos de dicha molécula SHIP2 (siendo una enzima) y análogos de
sus sustratos tales como el fosfatidilinositol
3,4,5-trifosfato, el inositol
1,3,4,5-tetrakisfosfato, el
inositol-1,4,5-trifosfato
adenofostina o cualquier análogo disponible de la estructura
inositol fosfato que incluyen ésteres que atraviesan la membrana o
fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato que se han
utilizado para administrar el fosfatidilinositol
3,4,5-trifosfato a través de las membranas
celulares.
Dicho inhibidor también puede ser un inhibidor
competitivo, tal como el 2,3-bifosfoglicerato,
agentes bloqueadores de tiol o cualquier inhibidor de proteína
fosfatasa tal como ácido ocadaico o el ortovanadato. El inhibidor
también puede ser una parte específica de más de aproximadamente 30,
aproximadamente 50, aproximadamente 100 o aproximadamente 150
aminoácidos de la estructura proteica de dicha enzima,
preferiblemente un parte que comprende el dominio SH2 (los primeros
110 aminoácidos de la secuencia SEQ ID No. 1), el dominio rico en
prolina (los últimos 351 aminoácidos de la secuencia SEQ ID No. 1)
o partes más preferidas de dicha secuencia que puedan competir con
el reclutamiento de la molécula SHIP2 a las membranas plasmáticas,
inhibiendo así su actividad.
El inhibidor también podría reducir o bloquear
la actividad de la molécula SHIP2, o reduce la expresión del ARNm
de SHIP2.
El inhibidor o una composición farmacéutica que
comprenda un vehículo o diluyente aceptable o el inhibidor tal como
se describe en la presente solicitud, pudiendo reducir o bloquear la
actividad de la molécula SHIP2, aumenta la sensibilidad de un
paciente (incluyendo un humano) a la insulina y podría utilizarse de
manera ventajosa en el tratamiento o prevención de la diabetes de
tipo II y enfermedades asociadas.
La presente solicitud también describe un
método, kit o aparato para la detección de compuestos conocidos o
desconocidos que podrían utilizarse como inhibidores de dicha
molécula de inositol polifosfato 5 fosfatasa SHIP2. Dicho método
comprende las etapas de someter dichos compuestos desconocidos a un
ensayo basado en el análisis de la actividad de la molécula SHIP2.
Dicho ensayo, se lleva a cabo de manera ventajosa sobre un
constructo molecular que contiene el dominio catalítico de la enzima
SHIP2 (para la molécula SHIP2 humana correspondiente identificada
en la secuencia adjunta SEQ ID No. 1, éste oscila desde el
aminoácido 427 hasta el aminoácido 729 o uno o más partes
específicas de dicho dominio catalítico), expresándose dicho
constructo en un microorganismo, preferiblemente E. coli, o
en una línea celular y comprendiendo el ensayo medios para
cuantificar la hidrólisis de inositol
1,3,4,5-tetrakisfosfato y la producción de inositol
1,3,4-trifosfato. En Pesesse et al., 1998 se
ha descrito la expresión de SHIP2 en la bacteria E. coli.
El kit, aparato y método descritos en la
presente solicitud comprenden sustratos comercialmente disponibles.
El ensayo según la solicitud también podría basarse en la
cuantificación de la hidrólisis de fosfatidilinositol
3,4,5-trifosfato seguida de análisis en
cromatografía de capa fina.
Otro análisis de posibles inhibidores de la
actividad de la molécula SHIP2 se basa en la inhibición de la
fosforilación de SHIP2 en tirosina, porque este índice de activación
ha demostrado ser crucial en el proceso de activación y en las
rutas sensibles a insulina. La molécula SHIP2 se purifica y se
examina su fosforilación mediante análisis de inmunotransferencia
de tipo Western (Western blot) con anticuerpos
anti-fosfotirosina que también podrían utilizarse
como un inhibidor según la invención.
Otro análisis de posibles inhibidores de las
moléculas SHIP2 se basa en la reducción o inhibición de la expresión
de ARNm de SHIP2, porque la reducción de la expresión de ARNm de
SHIP2 in vivo se asocia con un aumento de la sensibilidad a
la insulina. La región promotora de SHIP2 o las regiones sin
traducir (5' ó 3') del ADNc de SHIP2 están relacionados con un gen
indicador (luciferasa, CAT, ...) en un vector de plásmido y
transfectado en células en cultivo. Los compuestos que han de
ensayarse se añaden o no a las células y se registra la actividad
del gen indicador para encontrar los compuestos que reducen la
actividad del gen indicador, es decir los compuestos que actúan a
través del promotor, las regiones 5' ó 3' sin traducir de las
secuencias de SHIP2 para reducir la producción de la proteína.
La presente invención se refiere al uso de un
mamífero deficiente no humano que comprende homocigótica o
heterocigóticamente una deleción parcial o total en su genoma de la
secuencia de nucleótidos de la inositol polifosfato
5-fosfatasa SHIP2 como modelo para el estudio de
enfermedades en las que dicha enfermedad se produce por la
hipersensibilidad a la insulina en un paciente, así como modelo
para el estudio del tratamiento de dichas enfermedades en dicho
paciente.
Dicha enfermedad puede seleccionarse del grupo
que consiste en hipoglucemia grave en un recién nacido y una
tolerancia a la glucosa alterada en un adulto.
Según la presente invención, dicho paciente
puede ser humano. Además, dicho mamífero deficiente puede ser un
ratón.
La presente invención se refiere al uso un
mamífero deficiente no humano que comprende (homocigótica o
heterocigóticamente) una deleción parcial o total (en su genoma) de
la secuencia genética que codifica para la enzima inositol
polifosfato 5-fosfatasa SHIP2, siendo dicho mamífero
deficiente hipersensible a la insulina y que podría utilizarse como
modelo para el estudio de enfermedades tales como hipoglucemia grave
en un recién nacido humano, y una tolerancia a la glucosa alterada
en humanos adultos así como el estudio de su tratamiento. Dicha
secuencia genética codifica para la molécula
inositol-polifosfato 5-fosfatasa
SHIPS2 (enzima) identificada en lo sucesivo como SEQ ID No. 1, y
descrita por parte de Pesesse et al. (1997).
Preferiblemente, dicho mamífero deficiente no
humano es un ratón deficiente, obtenido mediante técnicas bien
conocidas por el experto en la técnica. Preferiblemente, dicho
mamífero se obtiene mediante modificación genética, una deleción
parcial o total en la secuencia de tipo salvaje a través de la
integración de una secuencia foránea de ácido nucleico. Se
incorpora dicha secuencia modificada genéticamente en un vector o se
somete a electroporación y reintroducción en una célula madre
embrionaria (ES) para lo que se seleccionan clones celulares antes
de la integración preferiblemente en una
mórula-embrión de Swiss
pseudo-grávida según la técnica descrita por
Carmeliet et al. (1996), permitiendo en lo sucesivo la
selección de ratones que comprenden la modificación heterocigótica
de dicha secuencia de tipo salvaje y tras cruzar genéticamente de
manera homocigótica ratones modificados.
La figura 1 representa la disrupción diana del
gen SHIP2. (a, se representan el alelo de tipo salvaje (arriba) y
el vector dirigido (abajo) (exones, los cuadros rellenos), así como
las 2 sondas utilizadas en el análisis de tipo Southern y los
fragmentos de ADN generados tras la digestión con EcoRI y BamHI. R:
EcoRI; B: BamHI. b, Análisis de inmunotransferencia de tipo
Southern (Southern blot) de células ES de tipo salvaje (+/+) y
recombinante (+/-), así como la progenie de un cruce heterocigoto.
Se digirió ADN genómico bien con EcoRI o bien BamHI y se hibridó
con la sonda 1. c, análisis de inmunotransferencia de tipo Northern
(Northern blot) de ARNm (2 \mug/banda) aislado de MEF
(fibroblasto embrionario de ratón) de SHIP2^{+/+}, SHIP2^{+/-},
y SHIP2^{-/-}, hibridado con un fragmento de ADNc de SHIP2 o de
actina como sondas. d, Análisis de inmunotransferencia de tipo
Western de proteínas (100 \mug/banda) aisladas de MEF de
SHIP2^{+/+}, SHIP2^{+/-}, y SHIP2^{-/-} utilizando como sonda
un anticuerpo anti-SHIP2 de conejo. Se observa una
única señal a 160 KDa).
La figura 2 representa la homeostasis de glucosa
alterada en recién nacidos SHIP2^{-/-}. (a, concentraciones de
glucosa en sangre (arriba) e insulina en plasma (abajo) en recién
nacidos SHIP2^{+/+}, SHIP2^{+/-}, y SHIP2^{-/-} de 10 a 15
horas de vida a los que se inyectó o no en el plazo de una hora
postnatal con un anticuerpo Ac anti-insulina
(1/800 en NaCl al 0,9%, 100 \mul por recién nacido). Los valores
se expresan como la media \pm EEM (error estándar de la media)
obtenida a partir del análisis de 9 SHIP2^{+/+}, 8 SHIP2^{+/-},
y 8 SHIP2^{-/-}, y 6 ratones y SHIP2^{-/-} tratados con
anticuerpo Ac anti-insulina. b, mortalidad de los
recién nacidos SHIP2^{-/-} (n= 22/grupo) a los que se inyectó o no
o bien con D-glucosa (7%, 100 \mul por inyección
a lo largo del primer día postnatal) o bien con anticuerpo Ac
anti-insulina de cobaya neutralizante (1/800 en
NaCl al 0,9%, 100 \mul en el plazo de una hora postnatal). Las
pruebas de Mann-Whitney indicaron que la mortalidad
de ratones SHIP2^{-/-} tratados o no tratados fue
significativamente diferente (P<0,001). La mortalidad de recién
nacidos SHIP2^{-/-} tratados bien con suero normal de cobaya
(1/800 en NaCl al 0,9%, 100 \mul por recién nacido) o bien con
NaCl al 0,9%, no fue significativamente diferente de los ratones
SHIP2^{-/-} no tratados (datos no mostrados). c, Análisis de
inmunotransferencia de tipo Northern de la expresión de PEPCK,
TAT-5' Y G-6-Pasa en
el hígado de recién nacidos SHIP2^{+/+}, SHIP2^{-/-} de 2 a 3,5
horas de vida tratados o no con una única inyección de anticuerpo Ac
anti-insulina de la cobaya en un plazo de la
primera hora tras el nacimiento. La inmunotransferencia se hibridó
con una sonda de oligonucleótidos antisentido de ARN 18S para
controlar la igualdad de carga de ARN total).
La figura 3 muestra el aumento en la
sensibilidad a la insulina en ratones SHIP2^{+/-} adultos. (a,
concentraciones de glucosa en sangre (arriba) e insulina en plasma
(abajo) en un ensayo de tolerancia a la glucosa. Los valores se
expresan como la media \pm EEM obtenidas de 6 ratones
SHIP2^{+/+} (círculos rellenos) y SHIP2^{+/-} (cuadrados
rellenos) que tienen un peso corporal indistinguible). *P<0,05;
**P<0,01 (prueba de la t de Student). b, Concentraciones de
glucosa en sangre en un ensayo de tolerancia a la insulina. Los
valores se expresan como la media \pm EEM obtenidas de 10 ratones
SHIP2^{+/+} (círculos rellenos) y SHIP2^{+/-} (cuadrados
rellenos). **P<0,01; ***P<0,001 (prueba de la t de Student).
c, análisis de inmunotransferencia de tipo Northern y Western de
ARN total y proteínas aisladas de músculos esqueléticos de ratones
SHIP2^{+/+}, y SHIP2^{+/-} de 6-8 semanas de
vida. La inmunotransferencia de tipo Northern se hibridó con un
fragmento de ADN_{c} SHIP2 o un oligonucleótido antisentido de
ARN 18S como sondas; se utilizó un anticuerpo Ac
anti-SHIP2 para detectar la proteína SHIP2. d,
expresión de GLUT4 en músculos esqueléticos de ratones
SHIP2^{+/+}, y SHIP2^{+/-} adultos. Los ratones ayunaron
durante la noche y se les inyectó (insulina) o no (basal) con
insulina. Se aisló la fracción rica en membrana plasmática a partir
de miocitos, y se determinaron los niveles de GLUT4 en esta
fracción mediante inmunotransferencia de tipo Western. Los
resultados son representativos de 3 experimentos separados. La
cantidad de GLUT4 fue similar en el lisado total preparado a partir
de miocitos de SHIP2^{+/+} y SHIP2^{+/-} (datos no mostrados).
e, Síntesis de glucógeno en músculos sóleos aislados de ratones
SHIP2^{+/+} y SHIP2^{+/-} adultos. Se aislaron los músculos
sóleos de ratones SHIP2^{+/+} y SHIP2^{+/-} machos sometidos a
ayuno durante una noche, y se incubaron durante 60 min con o sin
insulina (0,1 - 50 nM) y
[^{3}H]-3-glucosa (5 mM, 1
\muCi/ml). Al final de la incubación, se disolvieron los músculos
y se hizo precipitar el glucógeno y se contó. Panel izquierdo: los
valores se expresan como nmoles de glucosa incorporada en glucógeno
por mg de proteína muscular y se presentan como medias \pm EEM de
7-8 músculos (excepto a 0,1 nM con la que se
utilizaron 4 músculos). *P<0,02, **P<0,03 (prueba de la t de
Student). Panel derecho: los resultados se expresando como tanto
por ciento del efecto máximo de insulina (determinado dividiendo el
incremento debido a la insulina a cada concentración de la hormona
por el incremento máximo en el efecto de insulina a 50 nM)).
Con el fin de caracterizar las funciones de la
molécula SHIP2 in vivo, los inventores han generado y
analizado una cepa de ratón deficiente en el gen SHIP2 según el
siguiente método preferido.
Se construyó el vector dirigido reemplazando un
fragmento genómico de 7,3 kb que contiene exones
19-29 y la señal de poliadenilación del gen SHIP2
de ratón por un casete de resistencia a la neomicina (Schurmans
et al. (1999)). El casete estaba flanqueado por fragmentos de
ADN genómico de ratón de 4,0 kb y 5,5 kb en las regiones 5' y 3',
respectivamente. Se sometieron a electroporación las células ES R1
con el plásmido de selección de diana linearizado por SalI. Se
confirmó la recombinación homóloga en el locus SHIP2 mediante
inmunotransferencia de tipo Southern, y se agregaron las células ES
SHIP2^{+/-} con mórulas derivadas de ratones CDI. Los ratones
quiméricos resultantes transmitieron el alelo mutante a la progenie.
Para el genotipado, se llevó a cabo un análisis de tipo Southern
con sondas específicas (descritas en la Figura 1a) o mediante
reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores
específicos para amplificar el neogén y un exón específico sometido
a deleción en el alelo mutante.
Se extrajo ARN de los fibroblastos embrionarios
de ratón (MEF) utilizando un kit Fast Track (Invitrogen) y se
purificó ARN total a partir de hígado de recién nacido y de músculos
esquelético y cardiaco utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen). Se
cargaron 2 \mug/banda de ARNm y 20 \mug/banda de ARN total sobre
un gel de agarosa al 1% y se transfirió a una membrana de nylon. Se
hibridaron las membranas con fragmentos de ADNc de ratón que
codifican para SHIP2, TAT-5', C/EBP\alpha,
C/EBP\beta, aldolasa B, actina o
G-6-Pasa como sondas. Se utilizaron
oligonucleótidos antisentido para la detección de ARNm de PEPCK
(5'-CAGACCATTATGCAGCTGAGGAGGCATT-3')
y ARN 18S
(5'-GTGCGTACTTAGACATGCATG-3')(Lee
et al. (1997)). Se analizaron mediante inmunotransferencia de
tipo Western los sobrenadantes de homogeneizados de MEF asilados a
partir de embriones SHIP2^{+/+}, SHIP2^{+/-} y SHIP2^{-/-} de
13,5 días. Se separaron las proteínas (100 \mug/banda) mediante
SDS/PAGE y se transfirieron a láminas de nitrocelulosa. Se llevaron
a cabo saturación, incubación con antisuero
anti-SHIP2 de conejo y la detección por ECL tal
como se ha descrito (Bruyns et al. (1999)). Para la expresión
in vivo de GLUT4, se sometió a ayuno durante una noche a
ratones SHIP2^{+/+} y SHIP2^{+/-} (de 6-10
semanas de vida), se anestesiaron y se inyectaron o no por vía
intravenosa con 1 mU/g (peso corporal) de insulina. Tras 5 minutos,
se extrajeron los músculos esqueléticos de las patas posteriores.
Se prepararon una fracción rica en membrana plasmática y un lisado
total a partir de miocitos tal como se ha descrito (Simpson et
al. (1983), Higaki et al. (1999)). Se separaron
alícuotas de proteínas (100 \mug) mediante
SDS-PAGE y se analizaron por inmunotransferencia
con anticuerpo anti-GLUT4. Se detectaron
inmunocomplejos utilizando ^{125}I-proteína A.
Se sometieron a ayuno ratones SHIP2^{+/+} y
SHIP2^{+/-} (de 6-10 semanas de vida) durante más
de 12 h y se inyectaron por vía intraperitoneal bien con 1,5 mg/g
(peso corporal) de D-glucosa o bien 1 mU/g (peso
corporal) de insulina (Actrapid™, Novo Nordisc, Dinamarca). Se
extrajeron muestras de sangre del seno retroorbitario en diferentes
puntos de tiempo. Se determinó enzimáticamente la concentración de
glucosa en sangre. Se determinaron los niveles de insulina en
plasma utilizando un kit™ ELISA para rata (Mercodia AB, Uppsala,
Suecia).
Recién nacidos recibieron bien inyecciones
repetidas por vía intraperitoneal de D-glucosa (al
7%, 100 \mul por inyección) durante las primeras 24 horas tras el
nacimiento, o bien una única inyección por vía intraperitoneal de
un anticuerpo policlonal anti-insulina porcina de
cobaya (1/800 en NaCl al 0,9%, 100 \mul; ref AB1295™, Chemicon
Int Inc, Ternecula, CA) en el plazo de la primera hora postnatal. Se
demostró el efecto neutralizante de este anticuerpo
anti-insulina tras la inyección en un ratón adulto
cargado con glucosa: se observó un aumento significativo de los
niveles de glucosa en sangre a los 30 y 60 minutos, en comparación
con ratones no tratados o tratados con suero normal de cobaya.
Se incubaron islotes pancreáticos (Malaisse
et al. (1984)), preparados mediante el procedimiento con
colagenasa del páncreas de 3-4 ratones, en grupos
de 8 islotes cada uno durante 90 minutos a 37ºC en 1,0 ml de un
medio tamponado con Hepes -y bicarbonato- que contiene 5 mg/ml de
albúmina sérica bovina y, tal como se requería,
D-glucosa 11,1 mM. Se midió la insulina liberada en
el medio mediante radioinmunoensayo.
Se aislaron rápidamente los 2 músculos sóleos de
ratones SHIP2^{+/+} o SHIP2^{+/-} en ayunas, y se ataron por
los tendones a las pinzas de acero inoxidable (Stenbit et al.
(1996)). Se llevaron a cabo todas las incubaciones a 37ºC en una
atmósfera de 95% de O_{2}: 5% de CO_{2} en 1 ml de tampón
Krebs-Ringer bicarbonato (pH 7,35) complementado
con albúmina sérica bovina al 1% (fracción V, pH 7, Intergen) y
piruvato 2 mM. Tras una incubación previa de 15 min sin insulina,
se incubaron los músculos durante 60 minutos sin o con las
concentraciones indicadas de insulina en el mismo medio sin
piruvato pero con 3-[^{3}H]-glucosa (5 mM, 1
\muCi/ml). Tras la compleción, se disolvieron los músculos en
NaOH 1 N, y se situaron alícuotas de la disolución alcalina sobre
papeles Whatmann. Se colocaron los papeles en etanol al 60% helado,
y se lavaron exhaustivamente (tres lavados de 20 min cada uno) en
etanol al 60% antes del conteo. Se expresaron todos los resultados
por mg de proteína muscular (determinado por el bien conocido
ensayo de Pierce).
Tras someter a electroporación las células
madres (ES) con el vector dirigido, los inventores han utilizado
una inmunotransferencia de tipo Southern y dos sondas y enzimas de
restricción diferentes con el fin de identificar los clones
recombinantes con una deleción de ADN genómico de 7,3 kb sobre un
alelo del gen SHIP2 (figura 1a, b). El cruce de machos quiméricos
con hembras C57BL/6 dio como resultado una F1 de ratones
heterocigóticos (SHIP2^{+/-}) que no presentó anomalías obvias.
El peso corporal a las 8 semanas, la esperanza de vida y la
incidencia de tumores espontáneos no fue significativamente
diferente de los ratones de tipo salvaje SHIP2^{+/+}. Entonces se
entrecruzaron ratones SHIP2^{+/-} de la F1 y se sometió a
genotipado en el nacimiento a 182 de la descendencia viable; de
éstos, 47 (26%) fueron SHIP2^{+/+}, 94 (51%) SHIP2^{+/-} y 41
(22%) SHIP2^{-/-}. Estas frecuencias estaban dentro de las
expectativas de Mendel para la transmisión de un gen autosómico, y
sugiere que la disrupción de ambos alelos de SHIP2 no produce
letalidad embrionaria. Se analizaron fibroblastos embrionarios de
ratón (MEF) derivados de embrión de 13,5 días para confirmar la
reducción de los niveles y la completa ausencia de ARNm de SHIP2
(figura 1c) o proteína (figura 1d) en ratones SHIP2^{+/-} y
SHIP2^{-/-}, respectivamente.
Al nacimiento, los ratones SHIP2^{-/-} eran
fenotípicamente indistinguibles de sus compañeros de camada; la
mayoría de ellos podía alimentarse, aunque progresivamente de manera
menos eficiente que los ratones SHIP2^{+/+} y SHIP2^{+/-}. Una
estrecha supervisión reveló que los ratones SHIP2^{-/-} se volvían
progresivamente cianóticos o pálidos y letárgicos en el plazo de
las primeras 24 horas de vida. Algunas crías SHIP2^{-/-} recién
nacidas presentaron signos de dificultad respiratoria y todos
fracasaron en la ganancia de peso (SHIP2^{+/+}: 1,60 \pm 0,02
g, SHIP2^{+/-}: 1,63 \pm 0,04 g y SHIP2^{-/-}: 1,20 \pm 0,01
g para una camada típica de 10 recién nacidos, 18 horas tras el
nacimiento; prueba de la t de Student, P<0,005), murieron en un
plazo de 3 días tras el nacimiento. La causa de la dificultad
respiratoria observada en algunos de los ratones SHIP2^{-/-} no
fue una falta de agente tensioactivo o una diferenciación anormal de
las células productoras de agente tensioactivo, ya que la expresión
de las proteínas asociadas al agente tensioactivo (SPA,
SP-B y SP-C) y de los factores de
transcripción TTF-1 o C/EBP era normal en los
pulmones de los ratones SHIP2^{-/-}. Además, la tinción con
hematoxilina y eosina del pulmón de SHIP2^{-/-}, así como del
cerebro, timo, hígado, estómago, páncreas, riñón, piel, músculo,
bazo, vejiga, e intestinos delgado y grueso no reveló anomalías
particulares.
Con frecuencia, en recién nacidos, la
hipoglucemia grave se asocia con episodios cianóticos, apnea,
dificultades respiratorias, rechazo a la alimentación y
somnolencia. No se observaron diferencias en las concentraciones de
glucosa en sangre entre los distintos genotipos a las 2 y 8 horas
tras el parto. Sin embargo, cuando se analizaron de las 10 a las 15
horas postparto, la concentración de glucosa en sangre en ratones
SHIP2^{-/-} fue significativamente inferior que en ratones
SHIP2^{+/-} y SHIP2^{+/+} (Figura 2a; prueba de la t de
Student, P<10^{-6}). La hipoglucemia no se debía a glucosuria,
ni a un exceso de secreción de insulina por parte de las células
beta pancreáticas: los niveles de insulina en plasma fueron
significativamente inferiores en ratones SHIP2^{-/-} que en
ratones SHIP2^{+/-} y SHIP2^{+/+} (figura 2a; prueba de la t de
Student, P<0,05). La histología e inmunohistoquímica de los
islotes pancreáticos utilizando anticuerpos
anti-insulina, -glucagón y -somatostatina no
revelaron anomalías en la expresión y distribución antigénica en
ratones SHIP2^{-/-}. Para probar si la hipoglucemia era la causa
de muerte postnatal, se inyectó D-glucosa a los
ratones SHIP2^{-/-}. Los ratones SHIP2^{-/-} hipoglucémicos se
rescataron de manera transitoria hasta 96 horas mediante inyecciones
repetidas de D-glucosa durante las primeras 24
horas postparto (figura 2b). Aproximadamente diez minutos después
de cada inyección, los recién nacidos SHIP2^{-/-} recuperaron un
color normal de la piel y estaban menos letárgicos que los ratones
no inyectados. También se observó una supervivencia prolongada
cuando a los ratones SHIP2^{-/-} se les inyectó con un anticuerpo
neutralizante frente a la insulina en el plazo de la primera hora
tras el nacimiento (Figura 2b). Además, la inyección de anticuerpo
anti-insulina a ratones SHIP2^{-/-} aumentó de
manera significativa las concentraciones de glucosa a las
10-15 horas postparto en comparación con ratones no
inyectados (Figura 2a; prueba de la t de Student, P<0,0002).
Estos datos indican que la hipoglucemia en ratones SHIP2^{-/-} no
se produce por una mayor producción de insulina o unos niveles
reducidos de glucagón, sino que más bien resulta de una mayor
sensibilidad a la insulina.
El hígado juega un papel fundamental en la
homeostasis de la glucosa al nacimiento: proporciona glucosa a la
sangre a través de la gluconeogénesis. Durante ese periodo crítico,
se activa la transcripción de diversas enzimas hepáticas implicadas
en la gluconeogénesis en respuesta a las condiciones hormonales y
dietéticas. La interferencia en las cascadas de señalización del
glucagón o la insulina al o justo antes del nacimiento da como
resultado una aparición retrasada o prematura de estas enzimas, e
hipoglucemia neonatal o diabetes. La expresión de fosfoenolpiruvato
carboxicinasa (PEPCK), una enzima clave de la gluconeogénesis, fue
muy baja o ausente en el hígado de ratones SHIP2^{-/-}, en
comparación con ratones SHIP2^{+/+} (Figura 2c). La inyección de
ratones SHIP2^{-/-} con un anticuerpo Ac
anti-insulina neutralizante restableció una
expresión normal de ARNm de PEPCK (Figura 2c). También se redujo la
expresión de tirosina aminotransferasa (TAT-5') y
glucosa-6-fosfatasa
(G-6-Pasa) hepáticas, otras dos
enzimas gluconeogénicas también inducidas tras el nacimiento,
aunque en menor grado que la PEPCK (Figura 2c). No se afectaron por
la mutación los niveles de ARN m de C/EBP, C/EBP y aldolasa B. Por
tanto, la ausencia de SHIP2 conduce a una reducción de la expresión
de diversas enzimas gluconeogénicas clave, contribuyendo a la
hipoglucemia en los ratones SHIP2^{-/-} recién nacidos. A pesar
de los bajos niveles de insulina encontrados en los ratones
mutantes, se indujo de manera importante la expresión de PEPCK
cuando se neutralizó la insulina de manera precoz tras el
nacimiento. En conjunto, estos datos indican que las células
hepáticas de SHIP2^{-/-} presentan una mayor sensibilidad a la
insulina in vivo.
Puesto que SHIP2 es un regulador negativo
crítico de la sensibilidad a la insulina in vivo, y puesto
que la pérdida de SHIP2 conduce a una hipoglucemia letal en ratones
recién nacidos, se investigó si menores cantidades de expresión de
SHIP2 en ratones SHIP2^{+/-} (Figura 1c, 1d, 3c) alteraría la
sensibilidad a la insulina. No hubo diferencias significativas en
los niveles de insulina en plasma o de glucosa en sangre basales
entre ratones SHIP2^{+/+} y SHIP2^{+/-} adultos, ni tras un
ayuno durante una noche (Figura 3a) ni cuando se alimentaron
libremente (niveles de glucosa en ratones alimentados libremente:
9,8 \pm 0,5 mM frente a 8,8 \pm 0,2 mM en ratones SHIP2^{+/+}
y SHIP2^{+/-}, respectivamente; niveles de insulina en ratones
alimentados libremente: 1,17 \pm 0,29 \mug/l frente a 0,96
\pm 0,16 \mug/l en ratones SHIP2^{+/+} y SHIP2^{+/-},
respectivamente). Sin embargo, la inyección de
D-glucosa dio como resultado un aclaramiento de
glucosa más rápido en ratones SHIP2^{+/-} que SHIP2^{+/+}: la
glucemia fue significativamente inferior en todos los puntos de
tiempo en ratones SHIP2^{+/-} (Figura 3a). El aumento de
aclaramiento de glucosa en ratones SHIP2^{+/-} no fue
consecuencia de una mayor liberación de insulina: treinta minutos
tras la administración de glucosa, los niveles de insulina también
fueron significativamente inferiores en los ratones SHIP2^{+/-}
que en los de tipo salvaje (Figura 3a). Además, la salida de
insulina desde los islotes pancreáticos aislados en respuesta a la
glucosa no fue significativamente diferente en ratones SHIP2^{+/+}
y SHIP2^{+/-}. Se demostró la hipersensibilidad a insulina cuando
a los ratones se les inyectó insulina, es decir, se observó una
hipoglucemia significativamente más profunda a los 30 y 60 minutos
tras la inyección en ratones SHIP2^{+/-} que en
ratonesSHIP2^{+/+} (Figura 3b).
La insulina estimula el transporte y
almacenamiento de glucosa como glucógeno en los músculos
esqueléticos a través de la translocación del transportador de
glucosa GLUT4 desde las reservas intracelulares a la superficie
celular (Czech et al. (1999)), y la activación de la
glucógeno sintasa. La pérdida de un alelo de SHIP2 dio como
resultado una reducción en la expresión de ARNm y proteína de SHIP2
en las células del músculo esquelético (Figura 3c). Tras un ayuno
durante la noche, la cantidad de transportador GLUT4 en la fracción
de la membrana plasmática del miocito fue baja pero similar en los
ratones SHIP2^{+/+} y SHIP2^{+/-} (Figura 3d). Sin embargo,
cuando los ratones SHIP2^{+/+} y SHIP2^{+/-} están cargados con
insulina, los niveles de GLUT4 en la membrana plasmática fueron
superiores en los músculos esqueléticos de SHIP2^{+/-}, lo que
concuerda con el mayor aclaramiento de glucosa hallado en estos
ratones. Se analizó la síntesis de glucógeno en respuesta a la
estimulación de insulina, que refleja tanto la captación de glucosa
como la activación de la glucógeno sintasa, en músculos sóleos
aislados de ratones SHIP2^{+/-} y SHIP2^{+/+} (Figura 3e). En
condiciones basales o en la presencia de concentraciones de
insulina de máxima estimulación (2 y 50 nM), se observó una
síntesis de glucógeno similar en los músculos de SHIP2^{+/+} y
SHIP2^{+/-}. Sin embargo, la estimulación con concentraciones de
insulina fisiológicas, inferiores (0,1 ó 0,3 nM) dio como resultado
una síntesis de glucógeno significativamente más elevada en
músculos de SHIP2^{+/-} que en músculos de SHIP2^{+/+} (Figura
3e). Cuando se expresa en tanto por ciento del efecto máximo de
insulina, la curva dosis respuesta de insulina se movió hacia las
concentraciones de insulina inferiores en los ratones SHIP2^{+/-},
en comparación con los ratones SHIP2^{+/+} (Figura 3e). En
conjunto, los datos indican que la sensibilidad a la insulina se
aumenta de manera significativa en músculos esqueléticos de ratones
heterocigóticos que expresan solamente una cantidad reducida de
proteína SHIP2.
La incidencia de la aparición adulta de diabetes
mellitus se ha incrementado dramáticamente y la enfermedad es un
problema de salud importante. La resistencia al efecto estimulador
de la insulina sobre la utilización de la glucosa es un rasgo
patogénico clave de la mayoría de las formas de diabetes de
aparición adulta (tipo II, o no dependiente de insulina), y
contribuye a la morbilidad asociada con la diabetes autoinmune (tipo
I, o dependiente de insulina). Es crucial comprender mejor los
mecanismos moleculares que regulan la señalización de insulina. Los
datos en ratones modificados genéticamente identifican SHIP2 como un
regulador negativo esencial y crítico de la señalización de
insulina y la sensibilidad a la insulina in vivo. Por tanto,
SHIP2 es una diana terapéutica novedosa para el tratamiento de la
diabetes de tipo II y un gen candidato a la predisposición a la
misma enfermedad.
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Claims (4)
1. Uso de un mamífero deficiente no humano que
comprende una deleción parcial o total homocigótica o
heterocigóticamente en su genoma en la secuencia de nucleótidos de
la inositol polifosfato 5-fosfatasa SHIP2 como un
modelo para el estudio de enfermedades en las que dicha enfermedad
se produce por la presencia de hipersensibilidad a la insulina en
un paciente, así como un modelo para el estudio del tratamiento de
dichas enfermedades en dicho paciente.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste en
hipoglucemia grave en un recién nacido y trastorno en la tolerancia
a la glucosa en un adulto.
3. Uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, en el que dicho paciente es humano.
4. Uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho mamífero deficiente es un
ratón.
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