ES2257524T3 - Analisis multidimensional de la formula leucocitaria. - Google Patents

Analisis multidimensional de la formula leucocitaria.

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ES2257524T3 ES02380098T ES02380098T ES2257524T3 ES 2257524 T3 ES2257524 T3 ES 2257524T3 ES 02380098 T ES02380098 T ES 02380098T ES 02380098 T ES02380098 T ES 02380098T ES 2257524 T3 ES2257524 T3 ES 2257524T3
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Abstract

Método para la identificación multiparamétrica y/o recuento y/o caracterización de células en fluidos corporales que incluye los siguientes pasos: (a) mezcla de una muestra de dicho fluido corporal con una cantidad previamente medida de esferas fluorescentes u otro tipo de esferas para recuento, para su uso en la cuantificación del número de células por volumen en la muestra, en un recipiente; (b) adición a dicha muestra de un combinado de anticuerpos monoclonales con marcado fluorescente que incluyan anti-HLA-Dr, anti-CD33, anti-CD45 y anti-CD14, en donde los marcadores fluorescentes de dichos anticuerpos tienen un espectro de emisión con picos diferentes entre sí; (c) análisis de dichas células en un aparato capaz de detectar y registrar al menos cuatro canales de fluorescencia y al menos dos canales de dispersión de luz para cada una de las células de dicha muestra, en donde se miden e identifican leucocitos totales, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, linfocitos, células dendríticas totales, células dendríticas/monocitos positivos para CD16, células dendríticas derivadas de células mieloides, células dendríticas linfoplasmacitoides y cualquier población o agrupamiento de células que sea diferente de cualquiera de las subpoblaciones regulares de leucocitos, empleando un programa informático con un algoritmo de ventanas electrónicas de selección que utiliza combinaciones lógicas de ventanas electrónicas de selección para caracterizarlas en función de su posición y dispersión en el diagrama de dispersión y se valora cuantitativamente el número de cada una de estas poblaciones de células por microlitro de muestra.

Description

Análisis multidimensional de la fórmula leucocitaria.
Ámbito de la invención
Esta invención está relacionada con el campo de la citometría de flujo y, más concretamente, con el análisis de leucocitos de la sangre, de la médula ósea o de cualquier fluido corporal que contenga leucocitos. La invención hace posible el cálculo de frecuencia diferencial de subpoblaciones de leucocitos de la sangre y la médula ósea en cuanto a sus frecuencias absolutas y relativas mediante el uso de mediciones de citometría de flujo multiparamétricas de las muestras celulares en combinación con una suspensión de esferas de referencia.
Antecedentes de la invención
En la patente nº 5.047.321 de EE.UU., Loken y Terstappen describieron el análisis multiparamétrico de componentes celulares en un fluido corporal. Los fluidos corporales descritos incluían sangre y médula ósea. Utilizando una combinación de dos colorantes de ácidos nucleicos, un anticuerpo monoclonal con marcado fluorescente y dos parámetros de dispersión de luz, Loken y Terstappen fueron capaces de distinguir entre dos o más de los diversos componentes de la sangre y la médula ósea, contar el número de células de cada componente y proporcionar un análisis diferencial de cada uno de ellos. Utilizando una combinación de LDS-751 (Exciton) como colorante de ADN, naranja de tiazol ("TO", Molecular Probes, Inc.) como colorante de ARN, un anticuerpo monoclonal anti-CD45 con marcado fluorescente y la dispersión de luz frontal y ortogonal en sangre completa o en aspirados de médula ósea, Loken y Terstappen pudieron detectar y distinguir entre sí eritrocitos, reticulocitos, eritrocitos nucleados, plaquetas, linfocitos, monocitos, granulocitos neutrófilos, granulocitos basófilos, granulocitos eosinófilos y precursores de todas las células nucleadas, pero no otros leucocitos normales (como células dendríticas) o patológicos (blastos leucémicos).
En la patente nº 6.287.791, Terstappen y Chen describieron un posterior perfeccionamiento de la patente nº 5.047.321 de EE.UU., pero que no mostraba ninguna mejora en la caracterización de las diferentes subpoblaciones de leucocitos.
En la patente nº 5.137.809 de EE.UU., Loken y Sha describieron el análisis multiparamétrico de componentes celulares de la médula ósea. Los autores utilizaron una combinación de anticuerpos monoclonales marcados con distintos fluorocromos para teñir todos los leucocitos en un primer paso y luego teñir subpoblaciones seleccionadas en un segundo paso.
Todos los métodos arriba mencionados eran capaces de identificar la mayoría de los leucocitos y lo hacían identificando sólo subpoblaciones seleccionadas identificadas por los anticuerpos monoclonales utilizados. Por otra parte, si se da el recuento de las subpoblaciones de leucocitos en porcentaje con respecto a los leucocitos totales, es imposible relacionar el perfil obtenido con los resultados obtenidos en los recuentos tradicionales de células hematológicas. En estas condiciones, las diferentes rutas identificadas se quedan aisladas de las principales pruebas diagnósticas que se utilizan normalmente en todos los laboratorios clínicos.
En la patente nº 5.627.037, de EE.UU., Ward et al. describen un método de un solo paso para la detección y recuento absoluto de una o más poblaciones de células de una muestra de sangre. El método emplea un reactivo que consta de una mezcla de uno o más marcadores celulares, una micropartícula fluorescente y un fijador. El método hace referencia al recuento absoluto de leucocitos, tal como linfocitos CD4+, pero no ofrece ninguna indicación de cómo hacer el cómputo de las subpoblaciones individuales de leucocitos presentes dentro de esta mezcla de muestra/reactivo. En Cytometry 2000; 40(1):50-9, Upham J.W. et al. describen el uso de la combinación CD33/CD14/HLADR, que sólo puede identificar una parte de todas las poblaciones celulares presentes en sangre periférica, pero no otras. Además, para poder hacer eso, tenían que lisar los eritrocitos y lavar la muestra. En Blood 2001; 98 nº 11, part 2: 104b-105b, Frey Beat M. et al. describen la cuantificación de glóbulos rojos residuales en concentrados de plaquetas y plasma recién congelado por citometría de flujo.
Resumen de la invención
La presente invención comprende un método para el análisis multiparamétrico simultáneo de células en un fluido corporal, como sangre y médula ósea entre otros. Dichos fluidos corporales pueden proceder de muestras normales o patológicas. Para cada célula que esté presente en una muestra de células tomadas de sangre, médula ósea u otros fluidos corporales, se realizan al menos dos mediciones de dispersión de luz y al menos cuatro mediciones de fluorescencia. Los cuatro componentes de fluorescencia constan de cuatro fluorocromos diferentes, cada uno relacionado con un anticuerpo monoclonal distinto. Cada anticuerpo es capaz de reconocer un antígeno diferente expresado en cantidades distintas en las diferentes subpoblaciones de leucocitos de la muestra. La emisión de cada fluorocromo puede distinguirse de las demás.
Las células de la muestra se mezclan con una o más poblaciones de micropartículas fluorescentes y una mezcla de reactivos de anticuerpos monoclonales a los que se puede añadir una solución de lisado de eritrocitos. Posteriormente, la muestra se analiza por medio de un citómetro de flujo en donde las células se hacen pasar de una en una a través de una o más zonas de detección. En cada una de las zonas de detección, las células y las esferas se exponen individualmente a una fuente de luz que emite a una única longitud de onda y se registran las mediciones realizadas sobre células individuales para al menos dos parámetros de dispersión de luz y al menos cuatro parámetros de fluorescencia para cada célula y cada esfera. Los datos registrados sobre cada célula y cada esfera se analizan en tiempo real o se almacenan en un dispositivo de almacenamiento y análisis de datos, como un ordenador. La patente nº 4.284.412 de EE.UU. describe la configuración y el uso de un citómetro de flujo típico provisto de una única fuente de luz y la paten-
te nº 4.727.020 de EE.UU. describe la configuración y el uso de un citómetro de flujo provisto de dos fuentes de luz.
El conjunto de anticuerpos monoclonales elegidos consta de una mezcla de anti-HLA-Dr, anti-CD33, anti-CD45 y anti-CD14 a la que se podría añadir un reactivo anti-CD38 como quinto marcador conjugado con un quinto fluorocromo. El número CD de los anticuerpos monoclonales es un número de designación de grupo asignado por el International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens (Taller y conferencia internacional sobre antígenos de diferenciación de leucocitos humanos) y se han elaborado muchas versiones de cada anticuerpo tanto a nivel comercial como individualmente y se han sometido al Workshop para su agrupamiento.
Los anticuerpos se pueden conjugar directamente con un marcador fluorescente o se pueden marcar indirectamente con, por ejemplo, un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado directamente con el marcador fluorescente; no obstante, es preferible la conjugación directa. Los marcadores fluorescentes que se pueden utilizar en la práctica con esta invención incluyen el isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), proteína de peridinin clorofila (PerCP), aloficocianina (APC), cianina-5.5 (Cy5.5) y conjugados de los mismos unidos a PE o a PerCP (por ejemplo, PE-Cy5, PerCP-Cy5.5, PE-cianina 7). La combinación preferente de marcadores es FITC, PE, PerCP-Cy5.5 y APC. La patente nº 4.520.110 de EE.UU. describe la composición y el uso de conjugados de PE con un anticuerpo monoclonal y la patente nº 4.542.104 de EE.UU. describe la composición y el uso de PE en forma de conjugado por pares. La patente nº 4.876.190 de EE.UU. describe la composición y el uso de PerCP.
En un método preferente, se toma una muestra de fluido corporal, como sangre o médula ósea, y se mezcla con un tampón que contiene una micropartícula fluorescente en cantidades conocidas y un anticuerpo monoclonal anti-HLA-Dr con marcado fluorescente, un anticuerpo monoclonal anti-CD33 con marcado fluorescente, un anticuerpo monoclonal anti-CD45 con marcado fluorescente y un anticuerpo monoclonal anti-CD14 con marcado fluorescente (o sólo los anticuerpos con marcado fluorescente antes mencionados sin micropartículas). También se podría añadir un quinto reactivo de anticuerpo monoclonal anti-CD38 conjugado con un quinto fluorocromo. Después de mezclar suavemente y de incubar, se puede añadir una solución de lisado de eritrocitos o, en su lugar, la mezcla se procesa directamente en un citómetro de flujo, tal como el citómetro de flujo de doble láser marca FACS Calibur^{TM} (BD Biosciences) o un citometro de flujo de cinco colores si se utilizó un quinto reactivo anti-CD38 conjugado con fluorocromo. Las células se analizan materialmente de una en una y se miden y registran por separado para cada célula, la dispersión de luz frontal, la dispersión de luz ortogonal y las cuatro emisiones de fluorescencia. Los seis (o siete) parámetros medidos directamente para cada célula se registran luego en una o más combinaciones para identificar y caracterizar cada célula. Normalmente los eventos clasificados como pertenecientes a una población dada de células se definirán como aquellos eventos que se agrupan en regiones específicas del espacio de 6 dimensiones (o 7 dimensiones) creado como se define más adelante. El método de esta invención se puede utilizar tanto para identificar todas las subpoblaciones de leucocitos individuales como para cuantificar cada una de estas subpoblaciones en términos de su concentración en la muestra (número de células por microlitro de muestra). Para ese fin se necesita la identificación específica de las esferas de referencia para obtener el número absoluto de células presentes en un volumen de muestra dado.
Más adelante, junto con las ilustraciones que se adjuntan, se explica con más detalle el procedimiento para el análisis de los resultados obtenidos de la medición de citometría de flujo de muestras teñidas y preparadas como se ha descrito anteriormente.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 comprende una serie de trece gráficos de puntos de células de un lisado de sangre periférica total que han sido marcadas con anti-HLA-Dr-FITC, anti-CD33-PE, anti-CD-45-PerCP-Cy5.5 y anti-CD14-APC en donde (A) es un gráfico biparamétrico de dispersión frontal de luz (FSC) frente a dispersión de luz ortogonal (SSC), (B) es un diagrama de biparamétrico de SSC frente a fluorescencia de anti-CD45-PerCP-Cy5.5, (C) es un gráfico biparamétrico de dispersión de luz ortogonal frente a fluorescencia de anti-HLA-Dr-FITC, (D) es una representación biparamétricos seleccionados para un grupo de eventos de dispersión de luz ortogonal frente a fluorescencia de anti-CD45-PerCP-Cy5.5, (E) es una representación biparamétricos seleccionados para un grupo de eventos de fluorescencia de anti-CD14-APC frente a fluorescencia de anti-HLA-Dr-FITC, (F) es una representación biparamétricos seleccionados para un grupo de eventos de FSC frente a fluorescencia de anti-CD33-PE, (G) es un diagrama biparamétrico de fluorescencia de anti-HLA-Dr-FITC frente a fluorescencia de anti-CD33-PE, (H) es una representación biparamétricos de fluorescencia de anti-CD14-APC frente a fluorescencia de anti-CD33-PE, (I) es una representación biparamétricos seleccionados para un grupo de eventos de la fluorescencia de anti-CD33-PE frente a fluorescencia de anti-HLA-Dr-FITC, (J) es una representación biparamétricos seleccionados para un grupo de eventos de dispersión de luz ortogonal frente a fluorescencia de anti-CD45-PerCP-Cy5.5, (K) es una representación biparamétricos seleccionados para un grupo de eventos de dispersión de luz ortogonal frente a fluorescencia de anti-HLA-Dr-FITC, (L) es una representación biparamétricos seleccionados para un grupo de eventos de dispersión de luz ortogonal frente a dispersión de luz frontal y (M) es una representación biparamétricos seleccionados para un grupo de eventos de fluorescencia de anti-CD33-PE frente a fluorescencia de anti-CD45-PerCP-Cy5.5.
La Figura 2 representa una serie de ventanas electrónicas de selección de células siguiendo una secuencia lógica. La utilización de estas ventanas electrónicas de selección de células en esta secuencia da lugar a una definición sistemática de una serie de subpoblaciones de leucocitos y de esferas tal como se describe. El número de subpoblaciones de leucocitos que se pueden identificar selectivamente en muestras de sangre periférica de voluntarios sanos con la ayuda de la secuencia de ventanas electrónicas de selección de células, es de ocho subpoblaciones. Además, se selecciona una ventana electrónica de selección para el recuento de las esferas para ayudar a calcular la concentración de células para cada subpoblación.
Leyendas de las figuras
Figura 1.- Gráficos de puntos representativos y regiones utilizados para la identificación de los diferentes subpoblaciones de células y esferas medidas por citometría de flujo después de teñir una muestra de sangre periférica de un voluntario sano con una combinación de HLADR-FTIC/CD33-PE/CD45-PerCPCy5.5/CD14-APC en un tubo TruCOUNT.
Figura 2.- Filtros lógicos descritos en el texto y su relación tanto con las regiones descritas en la Figura 1 como con la subpoblación específica de leucocitos identificados en una muestra normal de sangre periférica.
Descripción detallada de la invención
A continuación se ilustra el procedimiento descrito en esta invención mediante el siguiente ejemplo que no limita el campo de aplicación ni el alcance de la invención.
Ejemplo 1 Material y métodos
Se obtuvo sangre total normal de voluntarios sanos después de obtener su consentimiento informado. En cada prueba se añadieron 100 \mul de sangre total de un tubo Vacutainer con EDTA (BD) a un tubo TruCOUNT (BD Biosciences) o a cualquier otro elemento de recuento absoluto, como esferas FlowCOUNT (Beckmann/Coulter Hialeth, FL) o PerfectCOUNT (Cytognos, Salamanca, España). A este tubo de muestra se añadieron 5 \mul de reactivo anti-HLA-Dr-FITC, 5 \mul de reactivo anti-CD33-PE, 5 \mul de reactivo anti-CD45-PerCy5.5 y 5 \mul de reactivo anti-CD14-APC (BD Biosciences) y se mezcló suavemente durante 5 segundos. Esta mezcla de reactivos/muestra se incubó durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. A continuación se añadieron 2 ml de solución de lisado FACS (BD Biosciences), diluida 1:10 con agua destilada. Esta nueva mezcla de reactivos/muestra se mezcló suavemente durante 5 segundos y se incubó otros 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La mezcla de reactivos/muestra se mantuvo en la oscuridad hasta el momento de ser procesada en un citómetro de flujo marca FACS Calibur dotado de dos láseres. Las células teñidas deben analizarse en las dos horas siguientes a la adición de la solución de lisado FACS. Los datos de la muestra se registraron y analizaron en un ordenador Macintosh G4 equipado con el programa informático CellQuest Pro para un total de 60.000 eventos por muestra. Durante la adquisición, la información fue registrada después de fijar un umbral para aquellos eventos que resultaran positivos para CD45 y/o HLADR y/o que tuvieran valores altos de dispersión de luz frontal (FSC), con el fin de limitar la adquisición de datos a los leucocitos y las células nucleadas y eliminar la mayoría de los eventos correspondientes a glóbulos rojos no nucleados, plaquetas y restos celulares.
En la Figura 1 la secuencia utilizada para el análisis de datos se ilustra mediante trece gráficos de puntos biparamétricos (o diagramas de dispersión) diferentes representativos para una muestra de lisado de sangre periférica total normal. En los gráficos de puntos (A), (B) y (C) se muestran todos los eventos adquiridos. Con el fin de seleccionar específicamente las células nucleadas y las esferas presentes de entre todos los eventos, se fijaron las regiones de manera que incluyeran aquellos eventos con FSC intermedio/alto (región 1 del gráfico A) y/o resultado positivo para CD45 (región 2 del gráfico B) y/o resultado positivo para HLADr (región 3 del gráfico C), independientemente de sus valores de dispersión lateral de luz. R4 en el gráfico B identifica las esferas de referencia (ventana electrónica de selección 1, véase más adelante):
- El gráfico (A) es un diagrama de dispersión de FSC frente a dispersión de luz ortogonal (SSC). Se muestran todos los eventos adquiridos y se selecciona una región denominada región 1 o R1 para identificar las células más grandes.
- El gráfico (B) es un histograma biparamétrico de SSC frente a fluorescencia de anti-CD45-PerCP-Cy5.5. Se muestran todos los eventos adquiridos y se seleccionó una ventana electrónica, denominada región 2 o R2, para separar los glóbulos rojos no nucleados, plaquetas y residuos celulares en el extremo inferior derecho de la representación, de las poblaciones de leucocitos en el lado derecho de la ventana electrónica de selección. La zona R4 de este gráfico de puntos identifica la población de esferas.
- El gráfico (C) es un diagrama de dispersión de la dispersión de luz ortogonal (SSC) frente a la fluorescencia de anti-HLA-Dr-FTIC. Se muestran todos los eventos y se selecciona una tercera ventana electrónica de selección, denominada región 3 o R3 para separar el numeroso grupo de células del lado izquierdo de la representación junto con las que de SSC algo más bajo, menor expresión de fluorescencia, de las poblaciones celulares del lado inferior derecho de la representación.
Para seguir con la selección y recuento de células, se definirá una ventana electrónica (Gx) que puede contener combinaciones lógicas de las regiones identificadas en las funciones lógicas "Y", "O" y "Y NO". Si una ventana electrónica de selección define una función "Y" entre regiones, todos los eventos sumados en una ventana electrónica de selección (Gx) serán eventos que pertenecen a la región Rx Y la región Ry. Si una ventana electrónica de selección define una función "O" entre regiones, todos los eventos sumados en una ventana electrónica de selección (Gx) serán eventos que pertenecen la región Rx O a la región Ry. Si una ventana electrónica de selección define una función "Y NO" entre regiones, todos los eventos sumados en una ventana electrónica de selección (Gx) serán eventos que pertenecen a la región Rx Y NO a la región Ry.
La ventana electrónica de selección 1 o G1 incluye aquellos eventos de la región 4 o R4 y corresponde a las esferas de recuento.
Se genera un cuarto diagrama de dispersión (D), idéntico a (B), con dispersión de luz ortogonal frente a fluorescencia de anti-CD45-PerCP-Cy5.5, excepto en el hecho de que en este gráfico de puntos biparamétrico sólo se muestran aquellos eventos correspondientes a las células nucleadas [sucesos incluidos en la ventana electrónica de selección 2 o G2 = (no R4 Y R1 Y/O R2 Y/O R3)]. Empleando estas definiciones, en sangre periférica normal, las células nucleadas representarán la concentración total de leucocitos que en la muestra se puede encontrar por lo tanto bajo la ventana electrónica de selección 2 (G2).
En este cuarto gráfico de puntos biparamétrico se identifican tres grupos distintos de eventos importantes denominados como región 5 (o R5), región 6 (o R6) y región 7 (o R7). R5 define la numerosa población intermedia de sucesos y R6 define la población del extremo superior del diagrama de dispersión que contiene los eventos con valores muy altos de dispersión ortogonal de luz. R7 agrupa los eventos de la parte inferior derecha del diagrama de dispersión e incluye varios grupos de eventos que requerirán una posterior separación en los pasos siguientes. Utilizando de nuevo la herramienta "ventana electrónica de selección" como se definió antes, podemos definir subgrupos específicos de leucocitos que se incluyen dentro de estas tres regiones: R5 a R7, ambas incluidas.
El gráfico E muestra un diagrama de dispersión de puntos, biparamétrico, de fluorescencia anti-CD14-APC frente a fluorescencia de anti-HLA-Dr-FITC para aquellos eventos incluidos en R5. Dentro de este diagrama de dispersión de puntos (gráfico E) se definen dos regiones (R8 y R9): una (R8) a la izquierda de la parte central del diagrama de dispersión de puntos y la otra justo a la derecha de R8 (R9) como se muestra en la figura 1.
El gráfico F muestra un diagrama de dispersión de puntos biparamétricos de FSC frente a CD33-PE y el gráfico G un histograma de puntos de HLADr-FITC frente a CD33-PE; en estos gráficos (F y G) se definen dos regiones (R10 y R11) como se muestra en la figura 1: una (R10 del gráfico F) incluye aquellos eventos positivos para CD33-PE con intensidad débil/intermedia con valores de FSC de medios a altos, mientras que la otra región (R11 del gráfico G) incluye eventos autofluorescentes que se agrupan como células negativas para HLADr-FITC y débilmente positivas para CD33. Utilizando la herramienta "ventana electrónica de selección" como se definió antes, podemos definir subgrupos específicos de leucocitos que se incluyen dentro de los siguientes grupos de tres regiones: neutrófilos G3 = G2 Y R5 Y R8 Y R10) y eosinófilos (G4 = G2 Y R6 Y R9 Y R11).
El gráfico (H) muestra un diagrama de dispersión de fluorescencia de anti-CD14-APC frente a fluorescencia de anti-CD33-PE. Se puede definir una región 12 (R12) que encierra a la agrupación de células en la parte superior derecha próxima al centro del diagrama de dispersión. Se define la ventana electrónica de selección 5 (G5) como la combinación lógica de la ventana electrónica de selección 2 Y región 7 Y región 12 (G5 = G2 Y R7 Y R12). La ventana electrónica de selección 5 (G5) define la concentración de los monocitos.
El gráfico (I) muestra un diagrama de dispersión de fluorescencia de anti-CD33-PE frente a fluorescencia de anti-HLA-Dr-FITC. Se dibuja la región 13 que encierra el grupo de células de la parte central izquierda del diagrama de dispersión (células positivas para CD33-PE, negativas para HLADr-FITC).
El gráfico (J) muestra un diagrama de dispersión de puntos de la dispersión de luz ortogonal frente a fluorescencia de anti-CD45-PerCP-Cy5.5. Se puede dibujar la región 14 (R14) aquí para englobar el grupo de eventos de la parte inferior central de la representación (bajo SSC y positivo débil para CD45). Se define la ventana electrónica de selección 6 (G6) como la combinación lógica de la ventana electrónica de selección 2 Y la región 7 Y la región 13 Y la región 14 Y NO la región 12 Y NO la ventana electrónica de selección 3 Y NO la ventana electrónica de selección 4 Y NO la ventana electrónica de selección 5 (G6 = G1 Y R7 Y R13 Y R14 Y NO R12 Y NO G3 Y NO G4). G6 define la concentración de basófilos.
El gráfico (K) muestra un diagrama de dispersión de puntos donde se representa la dispersión de luz ortogonal frente a fluorescencia de anti-HLA- Dr-FITC. Se dibuja la región 15 (R15) que encierra la población de eventos situados a lo largo de la parte superior de la población que se extiende horizontalmente con bajo SSC.
El gráfico (L) muestra un diagrama de dispersión de puntos donde se representa la dispersión de luz ortogonal (SSC) frente a la dispersión frontal de luz (FSC). Se define la región 16 (R16) que encierra el grupo de eventos situados a lo largo del eje de las abscisas con valores bajos de dispersión de luz ortogonal (SSC). Se define la ventana electrónica de selección 7 (G7) como la combinación lógica de la ventana electrónica de selección 2 Y la región 7 Y la región 16 Y NO la ventana electrónica de selección 3 Y NO la ventana electrónica de selección 4 Y NO la ventana electrónica de selección 5 Y NO la ventana electrónica de selección 6 (G7 = G2 Y R7 Y R16 Y NO G3 Y NO G4 Y NO G5 Y NO G6). La ventana electrónica de selección 7 (G7) define la concentración de linfocitos.
Se define la ventana electrónica de selección 8 (G8) como la combinación lógica de la ventana electrónica de selección 2 Y la región 7 Y la región 15 Y NO la ventana electrónica de selección 3 Y NO la ventana electrónica de selección 4 Y NO la ventana electrónica de selección 5 Y NO la ventana electrónica de selección 6 Y NO la ventana electrónica de selección 7 (G8 = G2 Y R7 Y R15 Y NO G3 Y NO G4 Y NO G5 Y NO G6 Y NO G7).
El gráfico (M) muestra un diagrama de dispersión de puntos donde se representa la frecuencia de anti-CD33-PE frente a fluorescencia de anti- CD45-PerCy5.5 sólo para aquellos eventos incluidos en la ventana electrónica de selección 8 (G8). Se dibuja la región 17 (R17), región 18 (R18) y región 19 (R19). Se define la ventana electrónica de selección 9 (G9) como la combinación lógica de la ventana electrónica de selección 8 Y la región 17 (G9 = G8 Y R17). Esta ventana electrónica de selección 9 (G9) define la concentración de las células dendríticas linfoplasmacitoides. Se define la ventana electrónica de selección 10 (G10) como la combinación lógica de la ventana electrónica de selección 8 (G8) Y la región 18. La ventana electrónica de selección 10 (G10) define la concentración de las células dendríticas/monocitos CD16+. Se define la ventana electrónica de selección 11 (G11) como la combinación lógica de la ventana electrónica de selección 8 (G8) Y la región 19 (R19). La ventana electrónica de selección 11 (G11) define la concentración de células dendríticas mieloides CD33+elevado.
Se define la ventana electrónica de selección 12 (G12) como aquellos eventos que quedan dentro de la ventana electrónica de selección 9 (G9) O la ventana electrónica de selección 10 (G10) O la ventana electrónica de selección 11 (G11). La ventana electrónica de selección 12 (G12) define la concentración total de las células dendríticas.
Como resultado de la secuencia de las diferentes etapas analíticas, se pueden definir y computar hasta diez subpoblaciones de leucocitos (incluida la subsegmentación de la población de células dendríticas) en una muestra de sangre periférica normal. Utilizando el recuento de esferas en la mezcla definida de reactivos/muestra, se puede calcular el parámetro "concentración en células por microlitro". Esta expresión de los resultados permitirá establecer una correlación directa con los contadores de hematología instalados rutinariamente en los laboratorios clínicos.
Las subpoblaciones computadas y definidas tienen unas características de ubicación muy bien definidas en los diferentes diagramas de dispersión de puntos. Esto es debido a su marcado con una intensidad de fluorescencia específica con la ayuda de los anticuerpos monoclonales empleados. El análisis de una serie de muestras de voluntarios sanos muestra que cada una de las subpoblaciones de leucocitos identificadas puede ser caracterizada con respecto a las coordenadas de posición de su centro de gravedad a lo largo del eje de abscisas y de ordenadas para cada representación de gráfico de puntos biparamáticos. Por otra parte, cada una de las subpoblaciones identificadas tiene unos límites característicos de diseminación de la distribución de la población (CV). Estos dos parámetros (posición del centro de gravedad y dispersión) se incluyen en la identificación de las subpoblaciones.
El espaciamiento específico encontrado entre cada una de las subpoblaciones de sangre periférica normal arriba mencionadas en el espacio de 6 dimensiones creado con la medición, crea el espacio necesario para que cualquier población de células anormales se muestre como un agrupamiento de leucocitos independiente de las subpoblaciones normales y no regular. Enfermedades específicas dan lugar a una huella específica en los diagramas de dispersión de puntos con la localización de grupos de células en los espacios de células no regulares. Considerando estos agrupamientos de células no regulares se puede diagnosticar y controlar el estado de la enfermedad.
Esto se puede conseguir tanto en muestras obtenidas ex vivo como en muestras de células manipuladas in vitro obtenidas con fines de investigación, diagnóstico y/o evaluación pronóstica.

Claims (15)

1. Método para la identificación multiparamétrica y/o recuento y/o caracterización de células en fluidos corporales que incluye los siguientes pasos:
(a) mezcla de una muestra de dicho fluido corporal con una cantidad previamente medida de esferas fluorescentes u otro tipo de esferas para recuento, para su uso en la cuantificación del número de células por volumen en la muestra, en un recipiente;
(b) adición a dicha muestra de un combinado de anticuerpos monoclonales con marcado fluorescente que incluyan anti-HLA-Dr, anti-CD33, anti-CD45 y anti-CD14, en donde los marcadores fluorescentes de dichos anticuerpos tienen un espectro de emisión con picos diferentes entre sí;
(c) análisis de dichas células en un aparato capaz de detectar y registrar al menos cuatro canales de fluorescencia y al menos dos canales de dispersión de luz para cada una de las células de dicha muestra, en donde se miden e identifican leucocitos totales, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, linfocitos, células dendríticas totales, células dendríticas/monocitos positivos para CD16, células dendríticas derivadas de células mieloides, células dendríticas linfoplasmacitoides y cualquier población o agrupamiento de células que sea diferente de cualquiera de las subpoblaciones regulares de leucocitos, empleando un programa informático con un algoritmo de ventanas electrónicas de selección que utiliza combinaciones lógicas de ventanas electrónicas de selección para caracterizarlas en función de su posición y dispersión en el diagrama de dispersión y se valora cuantitativamente el número de cada una de estas poblaciones de células por microlitro de muestra.
2. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque el fluido corporal comprende sangre periférica.
3. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque el fluido corporal comprende médula ósea.
4. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque el fluido corporal comprende líquido cerebroespinal.
5. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque el fluido corporal comprende orina.
6. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque a dicha muestra se añade una solución de lisis para provocar el lisado de los eritrocitos presentes en dicha muestra.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque se añade un quinto reactivo de anticuerpo monoclonal dirigido frente a CD38 para clasificar además en subgrupos las poblaciones de células antes definidas.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque el recipiente del paso (a) ya contiene la cantidad previamente medida de esferas fluorescentes u otro tipo de esferas para recuento.
9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque al recipiente que contiene la muestra se añade una cantidad previamente medida de esferas fluorescentes u otro tipo de esferas para recuento.
10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque dichos marcadores se seleccionan del grupo que consta de ficoeritrina (PE), isotiocianato de fluoresceína (FITC), aloficocianina (APC), Rojo Texas, proteína de peridinin clorofila (PerCP), cianina-5 (Cy5), cianina-5.5 (Cy5.5), cianina-7 (Cy7) y conjugados de éstos asociados a PE (por ejemplo, PE-Cy5), a APC (por ejemplo, APC-Cy7) o a PerCP (por ejemplo PerCP-Cy5.5).
11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 caracterizado porque los anticuerpos monoclonales se conjugan directamente con dichos marcadores.
12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 caracterizado porque el primer fluorocromo es FITC, el segundo fluorocromo es PE, el tercer fluorocromo es PerCP-Cy5.5 y el cuarto fluorocromo es APC.
13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 caracterizado porque el primer anticuerpo marcado es anti-HLA-Dr-FITC, el segundo es anti-CD33-PE, el tercero es anti-CD45-PerCP-Cy5.5 y el cuarto es anti-CD14-APC.
14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 caracterizado porque el algoritmo de ventanas electrónicas de selección del programa informático que utiliza ventanas electrónicas de selección lógicas selecciona en primer lugar los leucocitos totales, en segundo los neutrófilos, en tercero los eosinófilos, en cuarto los monocitos, en quinto los basófilos, en sexto los linfocitos, en séptimo las células dendríticas linfoplasmacitoides, en octavo las células dendríticas/monocitos CD16+, en noveno las células dendríticas mieloides, en décimo las células dendríticas totales y en undécimo cualquier población de células agrupadas además de las subpoblaciones de leucocitos antes mencionadas.
15. Un kit para la identificación multiparamétrica, análisis y/o recuento de células en un fluido corporal que incluye los siguientes pasos:
(a) un recipiente que contiene una cantidad previamente medida de esferas fluorescentes u otro tipo de esferas para recuento, para usar en el cómputo del número de células por volumen presentes en la muestra;
(b) un combinado de anticuerpos monoclonales con marcado fluorescente consistentes en anti-HLA-Dr, anti-CD33, anti-CD45 y anti-CD14, en donde los marcadores fluorescentes de dichos anticuerpos tienen espectros de emisión con picos diferentes entre sí;
(c) un programa informático con un algoritmo de ventanas electrónicas de selección basado en la utilización de combinaciones lógicas de ventanas electrónicas de selección para la caracterización de leucocitos totales, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, linfocitos, células dendríticas totales, células dendríticas/monocitos positivos para CD16, células dendríticas derivadas de células mieloides, células dendríticas linfoplasmacitoides y cualquier población de células agrupadas que sean diferentes de cualquiera de las subpoblaciones de leucocitos regulares en cuanto a su posición y dispersión en el diagrama de dispersión de puntos y el cálculo del número de cada uno de estos tipos de células por microlitro de muestra.
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