ES2255811B1 - Metodo para el diagnostico de cancer y/o pronostico de tratamientos oncologicos. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para diagnosticar y/o pronosticar los tratamientos en oncología mediante la determinación de las proteínas de la familia VRK. Los niveles y tipo de proteína presente en la muestra tumoral indicarían el nivel de sensibilidad de ese tumor frente a un agente terapéutico, siendo así marcador de diagnóstico de cáncer y de pronóstico de un tumor así como indicador de la evolución futura de un tumor.
Description
Método para el diagnóstico de cáncer y/o
pronóstico de tratamientos oncológicos.
La invención se relaciona en general con el
diagnóstico de cáncer y el pronóstico de los tratamientos en
oncología. En particular se refiere a un método para determinar la
respuesta de un cáncer frente a agentes terapéuticos.
La mayoría de los tratamientos utilizados en
oncología, basan su mecanismo de acción en: el daño que causan en
el ADN, como la quimioterapia que en gran parte utiliza fármacos:
que dañan el ADN y la radioterapia por si misma daña el ADN
[1-3].
La célula responde de dos maneras al daño, bien
por parada del ciclo celular que permitiría que se reparara el ADN
antes de la replicación, o bien por inducción de apoptosis o
muerte: celular programada [4, 5]. Esta apoptosis elimina la célula
que contiene daño génico y al no poder perpetuarse se elimina el
riesgo. Tanto la parada del ciclo celular, como la apoptosis se
encuentran reguladas por p53. p53 actúa en los llamados puntos de
control G1/S o G2/M [6-8].
La proteína p53 está mutada muy frecuentemente
en casi todos los tipos de cáncer, aunque su frecuencia varía
entre el 20 y el 70 por ciento. Estas mutaciones ocurren en el
dominio de unión al ADN impidiendo que p53 funcione como un
activador transcripcional. Se han descrito más de 10.000 mutaciones
diferentes de esta proteína [9].
La respuesta celular de p53 frente a diversos
fármacos (doxorubicina, actinomicina D, nocodazol, taxol entre
otros) o radiación (luz ultravioleta o radiación ionizante) es
ilustrada en la Figura 1. Células A549 procedentes de un cáncer de
pulmón humano que es normal para p53 fue tratada en cultivo con
actinomicina D, nocodazol, taxol o bien tratada por irradiación
con luz ultravioleta-C. En todos los casos la
consecuencia del estímulo fue la acumulación de la proteína p53.
Esta acumulación representa la respuesta normal de una célula
frente a daño genotóxico o estrés [10]. La proteína inactiva al ser
no funcional no puede activar su mecanismo de autorregulación y se
detecta frecuentemente como una acumulación de p53 [11, 12]. Sin
embargo, la acumulación de p53 es un parámetro erróneo, ya que no
se puede discriminar con técnica de Inmunohistoquímica, si la
acumulación es consecuencia de una respuesta a estrés o de una
proteína no funcional.
Las protein quinasas forman una gran familia de
genes que se dividen en dos grandes grupos dependiendo del residuo
que fosforile (Ser, Thr o Tyr). Si fosforilan un residuo Tirosina,
pertenecen al grupo de las Protein Tirosina quinasas (PTK), y si
fosforilan un residuo Ser o Thr, pertenecen al grupo de
Ser-Thr quinasas (STK). Dentro de este segundo
grupo, se encuentran las proteínas VRK (Vaccinia Related Kinase)
Las proteínas VRK constituyen una familia de
tres proteínas denominadas VRK1, VRK2 y VRK3 que tiene en su
estructura primaria o secuencia de aminoácidos una región
conservada con las características de proteínas con actividad
Serina-Treonina quinasa, aunque su longitud total
puede ser variable debido a otras regiones de la proteína. Esta
región, que define a la familia, tiene una localización variable
dentro de la estructura completa de las proteínas. En VRK1 y VRK2
se encuentra próxima al extremo amino-terminal, y
en VRK3 está más centrada y localizada hacia el extremo
carboxi-terminal. Este dominio tiene una longitud
de 300 aminoácidos y contiene un sitio conservado de unión a ATP y
otro sitio activo de actividad quinasa. Para que una proteína se
considere miembro de esta familia de proteínas hay que tener en
cuenta su grado de identidad y homología.
Quinasas | Residuos dominio ser-thr quinasa | Identidad |
VRK1 vs. VRK2 | 24-326/17-315 | 54.6 |
VRK1 vs. VRK3 | 24-326/153-456 | 35.9 |
VRK2 vs. VRK3 | 17-315/153-456 | 31.3 |
La secuencia de las tres proteínas comparadas
entre sí se muestra en la Figura 2. En esta figura se indica la
localización relativa del dominio Ser-Thr que
define a la familia.
Los ARN que codifican por las diferentes
quinasas de la familia VRK se encuentran presentes en numerosos
tipos de células, independiente de cual sea su origen.
Inicialmente estos ARN se detectan en líneas
celulares tumorales [13], pero también durante el desarrollo
hematopoyético [14]. Aunque la función biológica es realizada por
la proteína. Estas proteínas pueden tener una expresión diferencial
como ya se ha demostrado en el desarrollo hematopoyético
embrionario [14].
La actividad kinasa de las proteínas VRK utiliza
como una de sus dianas la proteína p53. Esta proteína es diana de
numerosas quinasas humanas entre las que se encuentran ATM [15,
16], ATR [17, 18], CHK1 [19], CHK2 [20, 21], JNK [22], y caseína
quinasa I [23].
La fosforilación de la proteína p53 por VRK1 y
VRK2 es específica y ocurre en el residuo
Treonina-18 de p53, en su región transactivadora
amino-terminal. La fosforilación de treonina 18 en
p53 se realiza tanto por la VRK1 como por la VRK2. Esta
fosforilación es específica para este residuo. Ninguna otra serina
o treonina en el extremo amino-terminal de p53 es
fosforilada por la VRK [24].
Uno de los problemas que existen en la terapia
oncológica es que la mayoría de los fármacos basan su mecanismo de
acción en el daño que producen en el ADN sin discriminar células
sanas de células cancerígenas. Por lo que existe una necesidad de
pronosticar la evolución de un tumor frente a un tratamiento
oncológico.
Los investigadores han identificado un nuevo
marcador de diagnóstico y/o pronóstico de tumores que permite a los
profesionales médicos seleccionar o evaluar los tratamientos en
oncología, así como una nueva diana para la modificación de la
respuesta frente a los distintos agentes terapéuticos.
La presente invención proporciona un método para
el diagnóstico de cáncer y/o pronóstico de tratamientos en
oncología mediante la determinación de las proteínas de la familia
VRK en general y más particularmente mediante la determinación de
lo niveles de la proteína VRK1 y/o VRK2 y/o VRK3.
Un objeto de la invención lo constituye un
método para determinar la respuesta de un cáncer frente a agentes
terapéuticos, en general mediante la determinación de los niveles
de las proteínas de la familia VRK y más particularmente mediante la
determinación de los niveles de la proteína VRK1 y/o VRK2 y/o
VRK3.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye un método para determinar la respuesta de un cáncer
frente a agentes terapéuticos mediante la determinación de las
proteínas de la familia VRK, donde los niveles de las proteínas de
la familia VRK indican la sensibilidad o no al agente terapéutico,
en concreto los niveles de la proteína VRK1 y/o VRK2 y/o VRK3.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye un método para determinar la respuesta de un cáncer
frente a agentes terapéuticos mediante la determinación de las
proteínas de la familia VRK, donde los niveles de las proteínas de
la familia VRK identifican diferencias entre tumores, en concreto
los niveles de la proteína VRK1 y/o VRK2 y/o VRK3.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye un método para determinar la respuesta de un cáncer
frente a agentes terapéuticos mediante la determinación de las
proteínas de la familia VRK en una muestra biológica y/o la
comparación con una muestra normal y/o una muestra de otro
tumor.
Un aspecto más particular de la invención se
refiere a que la determinación específica de las proteínas de la
familia VRK se lleva a cabo mediante la utilización de anticuerpos
específicos, más concretamente anticuerpos
anti-VRK1, y/o anti-VRK2, y/o
anti-VRK3.
Un aspecto más particular de la invención se
refiere a que la determinación específica de las proteínas de la
familia VRK se lleva a cabo mediante ensayo de
RT-PCR para un precursor genético de las proteínas
de la familia VRK.
Cuando en la invención nos referimos a las
proteínas de la familia VRK, en general nos referimos a cualquier
proteína que por su homología y/o función pueda se considerada
dentro de esta familia, más particularmente a las proteínas VRK1 y/o
VRK2 y/o VRK3. Cualquier proteína que se encuentre tenga una
identidad en su región ser-thr quinasa de un
mínimo del 31 por ciento con respecto a cualquiera de uno de los
tres miembros conocidos hasta ahora habrá que considerarla como un
nuevo miembro de la familia aunque su origen puede ser diferente
bien por proceder de un procesamiento alternativo de su ARN
mensajero generando una isoforma, pero codificada por uno de los
tres genes ya identificados, o bien ser derivada de un gen aun no
descubierto.
Otro aspecto de la presente invención lo
constituye un kit para el diagnóstico del cáncer y/o pronóstico de
tratamientos en oncología que comprende al menos los anticuerpo
específicos frente a las proteínas de la familia VRK. En particular,
el kit comprende al menos el anticuerpo anti-VRK1,
y/o al menos el anticuerpo anti-VRK2 y/o al menos el
anticuerpo anti-VRK3.
Otro aspecto de la presente invención lo
constituye un kit para el diagnóstico del cáncer y/o pronóstico de
tratamientos en oncología que comprende al menos los reactivos
necesario para llevar a cabo la detección de las proteínas VRK
mediante RT-PCR.
"Determinación de los niveles de proteínas de
la familia VRK" en la presente solicitud, s refiere tanto a la
determinación cuantitativa como a la determinación cualitativa de
los nivele de dichas proteínas por técnicas conocidas por el estado
de la técnica.
Respuesta de una línea celular a estrés inducido
por diferentes agentes como actinomicina D (Act D), luz
ultravioleta C (UV-C), nocodazole (Noc) y taxol. En
todos los casos, la célula tratada presenta una estabilización de
p53. Las células fueron lisadas en buffer y 20 microgramos de
proteínas fueron cargados en un gel de
poliacrilamida-SDS y sometidos a electroforesis.
Tras el fraccionamiento las proteínas fueron transferidas a una
membrana de Inmobilon-P. La membrana fue bloqueada
con una solución de PBS con 5% leche en polvo desnatada y
posteriormente incubada con un anticuerpo específico
anti-p53. Tras 1 hora se lavó la membrana y se
incubó con un anticuerpo secundario anti-IgG de
ratón marcado con peroxidas. El gel se reveló con un kit de
luminiscencia que es detectada por una película de rayos X, o bien
directamente en un lector digital de la señal luminosa.
Estructura primaria y alineamiento de las
proteínas humanas de VRK conocidas hasta ahora. Los asteriscos
indican identidad del aminoácido, y los puntos similitud de los
mismos. La región de homología entre ambas es claramente detectada
por la concentración de estos residuos. La línea vertical indica la
región correspondiente al dominio quinasa incluyendo tanto el sitio
de unión a ATP como el sitio catalítico de la enzima.
Acumulación y estabilización de p53 inducida por
VRK1 y colocalización de las mismas en el núcleo.
- A.
- Células de cáncer de pulmón A549 transfectadas con pHA-VRK1(derecha superior) y pCB+6-p53 (izquierda superior). A nivel de célula individual se ve que aquellas que han tomado los dos plásmidos la señal es solapante (derecha inferior) y se localiza en el núcleo.
- A.1: \alphap53
- A.2: \alphaVrk1
- A.3: DAPI
- A.4: Merged
- B.
- Detección de la acumulación de p53 en células A549. Cuando se contrasfecta con VRK1 (derecha), la señal de p53 es mucho más intensa debido a su estabilización. La proteína fue determinada en un extracto total por medio de un inmunoblot. Frente a p53 se utilizó el anticuerpo DO1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
Detección de las isoformas de VRK2 humana por
diversas técnicas.
- A.
- Detección por RT-PCR de VRK2A y VRK2B.
- B.
- Detección por inmunoblot de las dos isoformas, VRK2A y VRK2B, en extractos celulares totales:
- 293T: célula epitelial de riñón embrionario humano,
- H1299: carcinoma de colon
- HeLa: carcinoma de cuello uterino
- HepG2: línea celular de hepatocarcinoma primario humano
- MCF7: carcinoma de mama
- C.
- Detección por inmunofluorescencia de las proteínas VRK2 en células individuales MCF7.
Detección de VRK1 humano por técnicas de
Inmunohistoquímica convencional en dos biopsias de carcinoma
escamoso de cabeza y cuello. La muestra A es negativa (baja
expresión de los niveles de la proteína VRK1) y la muestra B
positiva (alta expresión de los niveles de la proteína VRK1). Ambas
fotografías se tomaron a 400 aumentos.
Mediante la realización de un experimento de
introducción de VRK1 exógena en la célula, se comprobó que los
niveles de la kinasa VRK1 modulaban los niveles de la proteína p53.
En la figura 3A, se muestra como la introducción de VRK1 exógena
(dio lugar a una estabilización de p53. Este resultado se repitió
utilizando distintos tipos de célula. Los investigadores llegaron
al mismo resultado, analizando los extractos totales de células y
determinando la proteína p53 por medio de un inmunoblot, para ello,
usaron un anticuerpo monoclonal (D0-1 de Santa Cruz
Biotechnology) (Figura 3B).
La detección de las isoformas de VRK2 humana, se
llevó a cabo mediante RT-PCR para ambas isoformas
en un grupo de linfocitos normales (PBL), linfomas de Burkitt y
carcinomas de colon (Figura 4A). Alternativamente, se detectaron las
dos isoformas mediante un inmunoblot con anticuerpo policlonal
(Figura 4B) y a nivel de célula individual por microscopía de
inmunofluorescencia (Figura 4C).
La proteína se detectó también en aquellos casos
donde al ARN estaba presente, esto se demostró mediante inmunoblot
y mediante microscopia.
Para demostrar que la proteína VRK1 podía
distinguir diferencias entre tumores, se realizó un estudio en
carcinomas escamosos de cabeza y cuello. Los resultados indicaron
que este antígeno es capaz de distinguir tumores con alta y baja
expresión (Figura 5).
Cuando nos referimos a una alta o baja
expresión, nos referimos a una diferente expresión de los niveles
de la proteína VRK cuando se comparan los niveles de expresión de
dicha proteína en una célula normal no patológica de un tejido con
los niveles de expresión de la proteína VRK en una muestra
patológica o tumoral del mismo tejido. Es decir, para determinar
si una muestra tiene una alta o baja expresión, se toma como
referencia los niveles de proteína VRK en una célula normal o no
patológica del mismo tejido. Como ejemplo puede ser la comparación
de una biopsia de tejido normal y tumoral, o la de un linfocito B y
un linfoma.
El ARN total procedente de microdisección de
órganos y células en suspensión se obtuvo por extracción basada en
métodos que usan soluciones de fenol-guanidina
(Trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA), seguido de precipitación en
etanol. La calidad de este ARN total es suficiente para
RT-PCR 0.2 \mug del ARN fueron usados para la
síntesis por RT de un cDNA para el cual se usó Superscript®
transcriptasa en reverso (Invitrogen) según las instrucciones del
fabricante.
En las células humanas HeLa procedente de un
carcinoma de cervix el ARN total se extrajo utilizando un kit de
extracción de ARN (Invitrogen). La síntesis de cDNA se realizó
también con Superscript® transcriptasa en reverso (Invitrogen)
según las instrucciones del fabricante.
La presencia de ARN especifico de VRK1, VRK2 y
VRK3 se determinó por una RT-PCR semi cuantitativa.
La reacción de RT utilizando ARN total se realizó como se ha
descrito previamente. Una décima parte del producto de la reacción
RT se usó para la PCR específica. Para la amplificación de la VRK1
murina (GenBank AA815837) se usaron los amplímeros mVRK1A (SEQ ID
NO 1) y mVRK1B (SEQ ID NO 2), que amplifican una banda de 332
nucleótidos. La amplificación de la VRK2 murina (GenBank AA914007)
se realizó con los amplímeros mVRK2A (SEQ ID NO 3), y mVRK2B (SEQ
ID NO 4) que amplifican una banda de 382 nt. Esta amplificación se
realizó con un ciclo inicial de 95ºC durante 5 minutos, seguida de
veinticinco ciclos compuesto de tres pasos (95ºC por 40 segundos;
56ºC por 40 segundos; y 72ºC por 50 segundos), y un ciclo final de
extensión a 72ºC por 5 minutos. Para la VRK3 (GenBank BC010473) los
amplímeros utilizados fueron mVRK3A (SEQ ID NO 5) y mVRK3B (SEQ ID
NO 6) que amplifican una banda de 559 nucleótidos. Las condiciones
fueron un ciclo inicial a 92ºC por 5 min, 30 ciclos (92ºC por 40
segundos, 58ºC por 40 segundos y 72ºC por 40 segundos) y un ciclo
final a 72ºC por 10 minutes. La amplificación de
8-actinogse utiliza como control de la reacción y
para cuantificación relativa en caso de necesidad. Todas las
reacciones se realizaron con Taq DNA polimerasa (Promega, Madison,
WI, de Perkin-Elmer) con MgCl_{2} 2.5 mM. Los
productos de la PCR fueron analizados en geles de agarosa al 2% y
fotografiadas con luz ultravioleta (GelDoc, BioRad) o
alternativamente transferidos a una membrana
Zeta-Probe (BioRad, San Diego, CA) o
Hybond-C (Amersham Biosciences, UK) que fueron
hibridadas con la sonda correspondiente. La imagen del gel fue
analizada con el programa Quantity One en un BioRad FX Imager
(BioRad, San Diego, CA) [14].
Para detectar el cDNA de longitud casi total (nt
130-1657) o bien del la parte carboxy terminal de
VRK2 humano se usaron diferentes amplímeros basados en la secuencia
humana VRK2 (GenBank AB000449) [13]. Para VRK2A: SEQ ID NO 7 (nt
130-165), este amplímero tiene el colón de
iniciación y un sitio de restricción BamHl. VRK2X: SEQ ID NO
8 (nt 1652-1675 cadena antisentido), con un sitio
de restricción Xbal y el codón de terminación. VRK2S: SEQ
ID NO 9 (nt 1652-1675 antisentido), con el sitio
Sall y codón de terminación. VRK2C: SEQ ID NO 10 (nt
899-920) con BamHl como sitio de restricción
para clonación. La reacción de PCR contenía 1 \mul de producto de
la reacción del cDNA, 2 unidades de Thermus aquaticus
polimerasa, y MgCl_{2} 1.5 mM en el tampón suministrado por el
fabricante (Sigma, St. Louis, MO). La amplificación se realizó en un
ciclo a 95ºC por 5 min, treinta ciclos (95ºC 30 segundos, 56ºC 30
segundos, 72ºC 30 segundos), y una elongación final a 72ºC durante
5 minutos.
Para identificar la presencia o ausencia de un
exón adicional en el mensajero de VRK2 se diseñaron amplímeros que
flanqueen el exón extra. Amplímero en sentido: SEQ ID NO y 11
amplímero antisentido: SEQ ID NO 12 que amplifican fragmentos de 135
y 179 nucleótidos específicos para las isoformas VRK2A y VRK2B
respectivamente. Los productos de la reacción de amplificación se
analizaron en un gel de agarosa al 1 por ciento [25].
(Figura
4A).
4A).
Las líneas celulares, 293T (célula epitelial de
riñón embrionario humano), H1299 (carcinoma de colon), A549 (línea
celular de cáncer de pulmón humano), HeLa (carcinoma de cuello
uterino), HepG2 (línea celular de hepatocarcinoma primario humano),
Cost, MCF7 y H1299, fueron crecidas en medio DMEM complementado con
10 por ciento de suero fetal bovino conteniendo penicilina,
estreptomicina y glutamina. El ADN libre de endotoxinas para las
transfecciones fue preparado con un maxi-kit JetStar
(Genomed, Bad Oeynhausen, Germany). Para las células Cos1 las
transfecciones se realizaron con fosfato cálcico, 0.35 x 10^{6}
células fuero sembradas en placas P60. A estas células se le añadió
10 \mug del plásmido phVRK2A-HA o
phVRK2B-HA, plásmidos de expresión en células de
mamífero que contiene el cDNA completo de la VRK2A o VRK2B humana
unido en fase con el epítopo HA (epítopo estándar derivado de la
hemaglutinina del virus de la gripe, y que es un marcador estándar
de detección de proteínas transfectadas disponible en múltiples
catálogos de empresas de biotecnología). Para células H1299, se
sembraron 0.5 x 10^{6} células por placa, y tras 24 horas las
células se transfectaron con 5 \mug de phVRK2A-HA
o phVRK2B-HA y 25ng de pCB6-p53,
plásmido de expresión en mamífero que expresa el cDNA de p53 humano
(obsequio del Dr. Karen Vousden, Beatson Institute, Glasgow,
Escocia) con 10 \mul de reactivo JetPEI (PolyTransfection,
Illkirch, France) y vector GEX4T1 (plásmido de expresión
procariota comercial de Amersham Biosciences-GE
Healthcare que se utiliza como ADN de relleno para que en todos los
experimentos la cantidad total de ADN sea la misma) vacío hasta
completar la cantidad de ADN. Las transfecciones con el reactivo
JetPl se realizaron siguiendo las instrucciones del proveedor
(PolyTransfection, Illkirch, France).
Como líneas celulares se utilizaron 293T (célula
epitelial de riñón embrionario humano), H1299 (carcinoma de colon),
HeLa (carcinoma de cuello uterino), HepG2 (hepatocarcinoma) y MCF7
(carcinoma de mama).
El anticuerpo policlonal específico para las
isoformas VRK2 se preparó por inmunización de un conejo con
proteína de fusión GST-VRK2A. El anticuerpo
monoclonal específico para el epitopo HA fue de Covence (San
Francisco, CA). El anticuerpo policlonal específico para
calreticulina fue de Calbiochem (La Jolla, CA). Para p53 se utilizó
el anticuerpo DO1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Como
anticuerpos secundarios en inmunofluorescencia se utilizaron
anti-IgG de ratón marcado con Cy2 (Fluorolink Cy2)
o un anti-IgG de conejo marcado con Cy3 (Fluorolink
Cy3), de Amersham. Luminiscence in westerns blot se desarrolló con
un kit ECL (Amersham). (Figura
4B).
4B).
La línea celular usada fue MCF7 (cáncer de mama
celular humano). Para inmunofluorescencia las células adherentes
crecidas sobre un porta fueron fijadas con un 3% de
paraformaldehído seguido de incubación con los anticuerpos
correspondientes durante 30 minutos cada uno. Como anticuerpo
primario se utilizó un policlonal frente a la de VRK2A. Para p53 se
utilizó el anticuerpo DO1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,
CA). Como anticuerpos secundarios se utilizaron un
anti-IgG de ratón marcado con Cy2 (Fluorolink Cy2)
o un anti-IgG de conejo marcado con Cy3 (Fluorolink
Cy2), ambos obtenidos de Amersham Biosciences (Little Chalfont,
UK). El análisis de miscroscopía confocal se realizó en un equipo
Zeiss LSM510. (Figura 4C).
Los métodos y condiciones usados en la
transfección, en loa microscopia de fluorescencia y en el
inmunoblot son sustancialmente similares a los del ejemplo anterior
aunque la transfección de las células se hizo con el plásmido
ph-VRK1-HA (ver figura 3).
Cortes de bloques de parafina fueron procesados
por técnicas rutinarias para detección por anticuerpos específicos
(anti-VRK1) y revelados con anticuerpos secundarios
acoplados a peroxidasa. La positividad alta o baja se determina por
la intensidad de la coloración marrón (Figura 5).
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<210> 1
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<211> 22
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<212> DNA
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\hfill22
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<400> 3
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\hfill24
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\hfill44
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<210> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipcaagagtctc aagaaccttt g
\hfill21
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Claims (24)
1. Método in vitro para el diagnóstico de
cáncer que comprende la determinación de los niveles de las
proteínas de la familia VRK.
2. Método según la reivindicación 1 donde la
proteína de la familia VRK determinada es la VRK1.
3. Método según la reivindicación 1 donde la
proteína de la familia VRK es la VRK2.
4. Método según la reivindicación 1 donde la
proteína de la familia VRK es la VRK3.
5. Método in vitro para el pronóstico de
tratamientos en oncología que comprende la determinación de los
niveles de las proteínas de la familia VRK.
6. Método según la reivindicación 5 donde la
proteína de la familia VRK determinada es la VRK1.
7. Método según la reivindicación 5 donde la
proteína de la familia VRK determinada es la VRK2.
8. Método según la reivindicación 5 donde la
proteína de la familia VRK determinada es la VRK3.
9. Método in vitro para determinar la
respuesta de un cáncer frente a agentes terapéuticos que comprende
la determinación de los niveles de las proteínas de la familia VRK
donde la alteración de dichos niveles indican la sensibilidad o no
al agente terapéutico.
10. Método in vitro para identificar
diferencias entre tumores que comprende la determinación de las
proteínas de la familia VRK.
11. Método in vitro según cualquiera de
las reivindicaciones 9-10 que comprende:
- -
- determinación de proteínas de la familia VRK en una muestra biológica.
- -
- comparación con muestra normal y/o muestra de otro tumor.
12. Método in vitro según cualquiera de
las reivindicaciones 9-11 donde la determinación de
los niveles de las proteínas de la familia VRK se realiza mediante
anticuerpos específicos.
13. Método in vitro según la
reivindicación 12 donde el anticuerpo específico es el
anti-VRK1.
14. Método in vitro según la
reivindicación 12 donde el anticuerpo específico es el
anti-VRK2.
15. Método in vitro según la
reivindicación 12 donde el anticuerpo específico es el
anti-VRK3.
16. Método in vitro según la
reivindicación 9-11, donde la determinación
específica de los niveles de las proteínas VRK se realiza mediante
ensayo de RT-PCR.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 9-12 y 16, donde la proteína de la
familia VRK determinada es la VRK1.
18. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 9-12 y 16, donde la proteína de la
familia VRK determinada es la VRK2.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 9-12 y 16, donde la proteína de la
familia VRK determinada es la VRK3.
20. Kit para el diagnóstico del cáncer y/o
pronóstico de tratamientos en oncología que comprende al menos los
anticuerpos específicos frente a las proteínas de la familia
VRK.
21. Kit según la reivindicación 20, que
comprende al menos el anticuerpo anti-VRK1.
22. Kit según la reivindicación 20, que
comprende al menos el anticuerpo anti-VRK2.
23. Kit según la reivindicación 20, que
comprende al menos el anticuerpo anti-VRK3.
24. Kit para el diagnóstico del cáncer y/o
pronóstico de tratamientos en oncología caracterizado
porque comprende al menos los reactivos necesarios para llevar a
cabo la detección de las proteínas VRK mediante
RT-PCR.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200401142A ES2255811B1 (es) | 2004-05-12 | 2004-05-12 | Metodo para el diagnostico de cancer y/o pronostico de tratamientos oncologicos. |
PCT/ES2005/000261 WO2006005778A1 (es) | 2004-05-12 | 2005-05-12 | Método para el diagnóstico de cáncer y/o pronóstico de tratamientos oncológicos |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200401142A ES2255811B1 (es) | 2004-05-12 | 2004-05-12 | Metodo para el diagnostico de cancer y/o pronostico de tratamientos oncologicos. |
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ES2255811A1 ES2255811A1 (es) | 2006-07-01 |
ES2255811B1 true ES2255811B1 (es) | 2007-07-16 |
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ID=35783540
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES200401142A Expired - Fee Related ES2255811B1 (es) | 2004-05-12 | 2004-05-12 | Metodo para el diagnostico de cancer y/o pronostico de tratamientos oncologicos. |
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WO (1) | WO2006005778A1 (es) |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO1998029552A1 (fr) * | 1996-12-27 | 1998-07-09 | Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. | Nouveau gene de serine-threonine kinase |
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2004
- 2004-05-12 ES ES200401142A patent/ES2255811B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-05-12 WO PCT/ES2005/000261 patent/WO2006005778A1/es active Application Filing
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2006005778A1 (es) | 2006-01-19 |
ES2255811A1 (es) | 2006-07-01 |
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