ES2255811B1 - Metodo para el diagnostico de cancer y/o pronostico de tratamientos oncologicos. - Google Patents

Metodo para el diagnostico de cancer y/o pronostico de tratamientos oncologicos. Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a un método para diagnosticar y/o pronosticar los tratamientos en oncología mediante la determinación de las proteínas de la familia VRK. Los niveles y tipo de proteína presente en la muestra tumoral indicarían el nivel de sensibilidad de ese tumor frente a un agente terapéutico, siendo así marcador de diagnóstico de cáncer y de pronóstico de un tumor así como indicador de la evolución futura de un tumor.

Description

Método para el diagnóstico de cáncer y/o pronóstico de tratamientos oncológicos.
Campo de la invención
La invención se relaciona en general con el diagnóstico de cáncer y el pronóstico de los tratamientos en oncología. En particular se refiere a un método para determinar la respuesta de un cáncer frente a agentes terapéuticos.
Antecedentes de la invención
La mayoría de los tratamientos utilizados en oncología, basan su mecanismo de acción en: el daño que causan en el ADN, como la quimioterapia que en gran parte utiliza fármacos: que dañan el ADN y la radioterapia por si misma daña el ADN [1-3].
La célula responde de dos maneras al daño, bien por parada del ciclo celular que permitiría que se reparara el ADN antes de la replicación, o bien por inducción de apoptosis o muerte: celular programada [4, 5]. Esta apoptosis elimina la célula que contiene daño génico y al no poder perpetuarse se elimina el riesgo. Tanto la parada del ciclo celular, como la apoptosis se encuentran reguladas por p53. p53 actúa en los llamados puntos de control G1/S o G2/M [6-8].
La proteína p53 está mutada muy frecuentemente en casi todos los tipos de cáncer, aunque su frecuencia varía entre el 20 y el 70 por ciento. Estas mutaciones ocurren en el dominio de unión al ADN impidiendo que p53 funcione como un activador transcripcional. Se han descrito más de 10.000 mutaciones diferentes de esta proteína [9].
La respuesta celular de p53 frente a diversos fármacos (doxorubicina, actinomicina D, nocodazol, taxol entre otros) o radiación (luz ultravioleta o radiación ionizante) es ilustrada en la Figura 1. Células A549 procedentes de un cáncer de pulmón humano que es normal para p53 fue tratada en cultivo con actinomicina D, nocodazol, taxol o bien tratada por irradiación con luz ultravioleta-C. En todos los casos la consecuencia del estímulo fue la acumulación de la proteína p53. Esta acumulación representa la respuesta normal de una célula frente a daño genotóxico o estrés [10]. La proteína inactiva al ser no funcional no puede activar su mecanismo de autorregulación y se detecta frecuentemente como una acumulación de p53 [11, 12]. Sin embargo, la acumulación de p53 es un parámetro erróneo, ya que no se puede discriminar con técnica de Inmunohistoquímica, si la acumulación es consecuencia de una respuesta a estrés o de una proteína no funcional.
Las protein quinasas forman una gran familia de genes que se dividen en dos grandes grupos dependiendo del residuo que fosforile (Ser, Thr o Tyr). Si fosforilan un residuo Tirosina, pertenecen al grupo de las Protein Tirosina quinasas (PTK), y si fosforilan un residuo Ser o Thr, pertenecen al grupo de Ser-Thr quinasas (STK). Dentro de este segundo grupo, se encuentran las proteínas VRK (Vaccinia Related Kinase)
Las proteínas VRK constituyen una familia de tres proteínas denominadas VRK1, VRK2 y VRK3 que tiene en su estructura primaria o secuencia de aminoácidos una región conservada con las características de proteínas con actividad Serina-Treonina quinasa, aunque su longitud total puede ser variable debido a otras regiones de la proteína. Esta región, que define a la familia, tiene una localización variable dentro de la estructura completa de las proteínas. En VRK1 y VRK2 se encuentra próxima al extremo amino-terminal, y en VRK3 está más centrada y localizada hacia el extremo carboxi-terminal. Este dominio tiene una longitud de 300 aminoácidos y contiene un sitio conservado de unión a ATP y otro sitio activo de actividad quinasa. Para que una proteína se considere miembro de esta familia de proteínas hay que tener en cuenta su grado de identidad y homología.
Quinasas Residuos dominio ser-thr quinasa Identidad
VRK1 vs. VRK2 24-326/17-315 54.6
VRK1 vs. VRK3 24-326/153-456 35.9
VRK2 vs. VRK3 17-315/153-456 31.3
La secuencia de las tres proteínas comparadas entre sí se muestra en la Figura 2. En esta figura se indica la localización relativa del dominio Ser-Thr que define a la familia.
Los ARN que codifican por las diferentes quinasas de la familia VRK se encuentran presentes en numerosos tipos de células, independiente de cual sea su origen.
Inicialmente estos ARN se detectan en líneas celulares tumorales [13], pero también durante el desarrollo hematopoyético [14]. Aunque la función biológica es realizada por la proteína. Estas proteínas pueden tener una expresión diferencial como ya se ha demostrado en el desarrollo hematopoyético embrionario [14].
La actividad kinasa de las proteínas VRK utiliza como una de sus dianas la proteína p53. Esta proteína es diana de numerosas quinasas humanas entre las que se encuentran ATM [15, 16], ATR [17, 18], CHK1 [19], CHK2 [20, 21], JNK [22], y caseína quinasa I [23].
La fosforilación de la proteína p53 por VRK1 y VRK2 es específica y ocurre en el residuo Treonina-18 de p53, en su región transactivadora amino-terminal. La fosforilación de treonina 18 en p53 se realiza tanto por la VRK1 como por la VRK2. Esta fosforilación es específica para este residuo. Ninguna otra serina o treonina en el extremo amino-terminal de p53 es fosforilada por la VRK [24].
Uno de los problemas que existen en la terapia oncológica es que la mayoría de los fármacos basan su mecanismo de acción en el daño que producen en el ADN sin discriminar células sanas de células cancerígenas. Por lo que existe una necesidad de pronosticar la evolución de un tumor frente a un tratamiento oncológico.
Los investigadores han identificado un nuevo marcador de diagnóstico y/o pronóstico de tumores que permite a los profesionales médicos seleccionar o evaluar los tratamientos en oncología, así como una nueva diana para la modificación de la respuesta frente a los distintos agentes terapéuticos.
Objeto de la invención
La presente invención proporciona un método para el diagnóstico de cáncer y/o pronóstico de tratamientos en oncología mediante la determinación de las proteínas de la familia VRK en general y más particularmente mediante la determinación de lo niveles de la proteína VRK1 y/o VRK2 y/o VRK3.
Un objeto de la invención lo constituye un método para determinar la respuesta de un cáncer frente a agentes terapéuticos, en general mediante la determinación de los niveles de las proteínas de la familia VRK y más particularmente mediante la determinación de los niveles de la proteína VRK1 y/o VRK2 y/o VRK3.
Otro aspecto particular de la invención lo constituye un método para determinar la respuesta de un cáncer frente a agentes terapéuticos mediante la determinación de las proteínas de la familia VRK, donde los niveles de las proteínas de la familia VRK indican la sensibilidad o no al agente terapéutico, en concreto los niveles de la proteína VRK1 y/o VRK2 y/o VRK3.
Otro aspecto particular de la invención lo constituye un método para determinar la respuesta de un cáncer frente a agentes terapéuticos mediante la determinación de las proteínas de la familia VRK, donde los niveles de las proteínas de la familia VRK identifican diferencias entre tumores, en concreto los niveles de la proteína VRK1 y/o VRK2 y/o VRK3.
Otro aspecto particular de la invención lo constituye un método para determinar la respuesta de un cáncer frente a agentes terapéuticos mediante la determinación de las proteínas de la familia VRK en una muestra biológica y/o la comparación con una muestra normal y/o una muestra de otro tumor.
Un aspecto más particular de la invención se refiere a que la determinación específica de las proteínas de la familia VRK se lleva a cabo mediante la utilización de anticuerpos específicos, más concretamente anticuerpos anti-VRK1, y/o anti-VRK2, y/o anti-VRK3.
Un aspecto más particular de la invención se refiere a que la determinación específica de las proteínas de la familia VRK se lleva a cabo mediante ensayo de RT-PCR para un precursor genético de las proteínas de la familia VRK.
Cuando en la invención nos referimos a las proteínas de la familia VRK, en general nos referimos a cualquier proteína que por su homología y/o función pueda se considerada dentro de esta familia, más particularmente a las proteínas VRK1 y/o VRK2 y/o VRK3. Cualquier proteína que se encuentre tenga una identidad en su región ser-thr quinasa de un mínimo del 31 por ciento con respecto a cualquiera de uno de los tres miembros conocidos hasta ahora habrá que considerarla como un nuevo miembro de la familia aunque su origen puede ser diferente bien por proceder de un procesamiento alternativo de su ARN mensajero generando una isoforma, pero codificada por uno de los tres genes ya identificados, o bien ser derivada de un gen aun no descubierto.
Otro aspecto de la presente invención lo constituye un kit para el diagnóstico del cáncer y/o pronóstico de tratamientos en oncología que comprende al menos los anticuerpo específicos frente a las proteínas de la familia VRK. En particular, el kit comprende al menos el anticuerpo anti-VRK1, y/o al menos el anticuerpo anti-VRK2 y/o al menos el anticuerpo anti-VRK3.
Otro aspecto de la presente invención lo constituye un kit para el diagnóstico del cáncer y/o pronóstico de tratamientos en oncología que comprende al menos los reactivos necesario para llevar a cabo la detección de las proteínas VRK mediante RT-PCR.
"Determinación de los niveles de proteínas de la familia VRK" en la presente solicitud, s refiere tanto a la determinación cuantitativa como a la determinación cualitativa de los nivele de dichas proteínas por técnicas conocidas por el estado de la técnica.
Descripción de las figuras Figura 1
Respuesta de una línea celular a estrés inducido por diferentes agentes como actinomicina D (Act D), luz ultravioleta C (UV-C), nocodazole (Noc) y taxol. En todos los casos, la célula tratada presenta una estabilización de p53. Las células fueron lisadas en buffer y 20 microgramos de proteínas fueron cargados en un gel de poliacrilamida-SDS y sometidos a electroforesis. Tras el fraccionamiento las proteínas fueron transferidas a una membrana de Inmobilon-P. La membrana fue bloqueada con una solución de PBS con 5% leche en polvo desnatada y posteriormente incubada con un anticuerpo específico anti-p53. Tras 1 hora se lavó la membrana y se incubó con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con peroxidas. El gel se reveló con un kit de luminiscencia que es detectada por una película de rayos X, o bien directamente en un lector digital de la señal luminosa.
Figura 2
Estructura primaria y alineamiento de las proteínas humanas de VRK conocidas hasta ahora. Los asteriscos indican identidad del aminoácido, y los puntos similitud de los mismos. La región de homología entre ambas es claramente detectada por la concentración de estos residuos. La línea vertical indica la región correspondiente al dominio quinasa incluyendo tanto el sitio de unión a ATP como el sitio catalítico de la enzima.
Figura 3
Acumulación y estabilización de p53 inducida por VRK1 y colocalización de las mismas en el núcleo.
A.
Células de cáncer de pulmón A549 transfectadas con pHA-VRK1(derecha superior) y pCB+6-p53 (izquierda superior). A nivel de célula individual se ve que aquellas que han tomado los dos plásmidos la señal es solapante (derecha inferior) y se localiza en el núcleo.
A.1: \alphap53
A.2: \alphaVrk1
A.3: DAPI
A.4: Merged
B.
Detección de la acumulación de p53 en células A549. Cuando se contrasfecta con VRK1 (derecha), la señal de p53 es mucho más intensa debido a su estabilización. La proteína fue determinada en un extracto total por medio de un inmunoblot. Frente a p53 se utilizó el anticuerpo DO1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
Figura 4
Detección de las isoformas de VRK2 humana por diversas técnicas.
A.
Detección por RT-PCR de VRK2A y VRK2B.
B.
Detección por inmunoblot de las dos isoformas, VRK2A y VRK2B, en extractos celulares totales:
293T: célula epitelial de riñón embrionario humano,
H1299: carcinoma de colon
HeLa: carcinoma de cuello uterino
HepG2: línea celular de hepatocarcinoma primario humano
MCF7: carcinoma de mama
C.
Detección por inmunofluorescencia de las proteínas VRK2 en células individuales MCF7.
Figura 5
Detección de VRK1 humano por técnicas de Inmunohistoquímica convencional en dos biopsias de carcinoma escamoso de cabeza y cuello. La muestra A es negativa (baja expresión de los niveles de la proteína VRK1) y la muestra B positiva (alta expresión de los niveles de la proteína VRK1). Ambas fotografías se tomaron a 400 aumentos.
Descripción detallada de la invención
Mediante la realización de un experimento de introducción de VRK1 exógena en la célula, se comprobó que los niveles de la kinasa VRK1 modulaban los niveles de la proteína p53. En la figura 3A, se muestra como la introducción de VRK1 exógena (dio lugar a una estabilización de p53. Este resultado se repitió utilizando distintos tipos de célula. Los investigadores llegaron al mismo resultado, analizando los extractos totales de células y determinando la proteína p53 por medio de un inmunoblot, para ello, usaron un anticuerpo monoclonal (D0-1 de Santa Cruz Biotechnology) (Figura 3B).
La detección de las isoformas de VRK2 humana, se llevó a cabo mediante RT-PCR para ambas isoformas en un grupo de linfocitos normales (PBL), linfomas de Burkitt y carcinomas de colon (Figura 4A). Alternativamente, se detectaron las dos isoformas mediante un inmunoblot con anticuerpo policlonal (Figura 4B) y a nivel de célula individual por microscopía de inmunofluorescencia (Figura 4C).
La proteína se detectó también en aquellos casos donde al ARN estaba presente, esto se demostró mediante inmunoblot y mediante microscopia.
Para demostrar que la proteína VRK1 podía distinguir diferencias entre tumores, se realizó un estudio en carcinomas escamosos de cabeza y cuello. Los resultados indicaron que este antígeno es capaz de distinguir tumores con alta y baja expresión (Figura 5).
Cuando nos referimos a una alta o baja expresión, nos referimos a una diferente expresión de los niveles de la proteína VRK cuando se comparan los niveles de expresión de dicha proteína en una célula normal no patológica de un tejido con los niveles de expresión de la proteína VRK en una muestra patológica o tumoral del mismo tejido. Es decir, para determinar si una muestra tiene una alta o baja expresión, se toma como referencia los niveles de proteína VRK en una célula normal o no patológica del mismo tejido. Como ejemplo puede ser la comparación de una biopsia de tejido normal y tumoral, o la de un linfocito B y un linfoma.
Ejemplos Ejemplo 1 Detección de expresión de VRK murina y humana por RT-PCR, Extracción de RNA procedentes de órganos murinos embrionarios o líneas celulares humanas
El ARN total procedente de microdisección de órganos y células en suspensión se obtuvo por extracción basada en métodos que usan soluciones de fenol-guanidina (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA), seguido de precipitación en etanol. La calidad de este ARN total es suficiente para RT-PCR 0.2 \mug del ARN fueron usados para la síntesis por RT de un cDNA para el cual se usó Superscript® transcriptasa en reverso (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
En las células humanas HeLa procedente de un carcinoma de cervix el ARN total se extrajo utilizando un kit de extracción de ARN (Invitrogen). La síntesis de cDNA se realizó también con Superscript® transcriptasa en reverso (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 2 Amplificación por PCR de las VRK1, VRK2 y VRK3 murinas
La presencia de ARN especifico de VRK1, VRK2 y VRK3 se determinó por una RT-PCR semi cuantitativa. La reacción de RT utilizando ARN total se realizó como se ha descrito previamente. Una décima parte del producto de la reacción RT se usó para la PCR específica. Para la amplificación de la VRK1 murina (GenBank AA815837) se usaron los amplímeros mVRK1A (SEQ ID NO 1) y mVRK1B (SEQ ID NO 2), que amplifican una banda de 332 nucleótidos. La amplificación de la VRK2 murina (GenBank AA914007) se realizó con los amplímeros mVRK2A (SEQ ID NO 3), y mVRK2B (SEQ ID NO 4) que amplifican una banda de 382 nt. Esta amplificación se realizó con un ciclo inicial de 95ºC durante 5 minutos, seguida de veinticinco ciclos compuesto de tres pasos (95ºC por 40 segundos; 56ºC por 40 segundos; y 72ºC por 50 segundos), y un ciclo final de extensión a 72ºC por 5 minutos. Para la VRK3 (GenBank BC010473) los amplímeros utilizados fueron mVRK3A (SEQ ID NO 5) y mVRK3B (SEQ ID NO 6) que amplifican una banda de 559 nucleótidos. Las condiciones fueron un ciclo inicial a 92ºC por 5 min, 30 ciclos (92ºC por 40 segundos, 58ºC por 40 segundos y 72ºC por 40 segundos) y un ciclo final a 72ºC por 10 minutes. La amplificación de 8-actinogse utiliza como control de la reacción y para cuantificación relativa en caso de necesidad. Todas las reacciones se realizaron con Taq DNA polimerasa (Promega, Madison, WI, de Perkin-Elmer) con MgCl_{2} 2.5 mM. Los productos de la PCR fueron analizados en geles de agarosa al 2% y fotografiadas con luz ultravioleta (GelDoc, BioRad) o alternativamente transferidos a una membrana Zeta-Probe (BioRad, San Diego, CA) o Hybond-C (Amersham Biosciences, UK) que fueron hibridadas con la sonda correspondiente. La imagen del gel fue analizada con el programa Quantity One en un BioRad FX Imager (BioRad, San Diego, CA) [14].
Ejemplo 3 VRK2 Humana VRK2 humana: amplímeros para PCR y clonación
Para detectar el cDNA de longitud casi total (nt 130-1657) o bien del la parte carboxy terminal de VRK2 humano se usaron diferentes amplímeros basados en la secuencia humana VRK2 (GenBank AB000449) [13]. Para VRK2A: SEQ ID NO 7 (nt 130-165), este amplímero tiene el colón de iniciación y un sitio de restricción BamHl. VRK2X: SEQ ID NO 8 (nt 1652-1675 cadena antisentido), con un sitio de restricción Xbal y el codón de terminación. VRK2S: SEQ ID NO 9 (nt 1652-1675 antisentido), con el sitio Sall y codón de terminación. VRK2C: SEQ ID NO 10 (nt 899-920) con BamHl como sitio de restricción para clonación. La reacción de PCR contenía 1 \mul de producto de la reacción del cDNA, 2 unidades de Thermus aquaticus polimerasa, y MgCl_{2} 1.5 mM en el tampón suministrado por el fabricante (Sigma, St. Louis, MO). La amplificación se realizó en un ciclo a 95ºC por 5 min, treinta ciclos (95ºC 30 segundos, 56ºC 30 segundos, 72ºC 30 segundos), y una elongación final a 72ºC durante 5 minutos.
Para identificar la presencia o ausencia de un exón adicional en el mensajero de VRK2 se diseñaron amplímeros que flanqueen el exón extra. Amplímero en sentido: SEQ ID NO y 11 amplímero antisentido: SEQ ID NO 12 que amplifican fragmentos de 135 y 179 nucleótidos específicos para las isoformas VRK2A y VRK2B respectivamente. Los productos de la reacción de amplificación se analizaron en un gel de agarosa al 1 por ciento [25]. (Figura
4A).
Transfección de líneas celulares humanas con ph-VRK2A-HA y ph-VRK2B-HA
Las líneas celulares, 293T (célula epitelial de riñón embrionario humano), H1299 (carcinoma de colon), A549 (línea celular de cáncer de pulmón humano), HeLa (carcinoma de cuello uterino), HepG2 (línea celular de hepatocarcinoma primario humano), Cost, MCF7 y H1299, fueron crecidas en medio DMEM complementado con 10 por ciento de suero fetal bovino conteniendo penicilina, estreptomicina y glutamina. El ADN libre de endotoxinas para las transfecciones fue preparado con un maxi-kit JetStar (Genomed, Bad Oeynhausen, Germany). Para las células Cos1 las transfecciones se realizaron con fosfato cálcico, 0.35 x 10^{6} células fuero sembradas en placas P60. A estas células se le añadió 10 \mug del plásmido phVRK2A-HA o phVRK2B-HA, plásmidos de expresión en células de mamífero que contiene el cDNA completo de la VRK2A o VRK2B humana unido en fase con el epítopo HA (epítopo estándar derivado de la hemaglutinina del virus de la gripe, y que es un marcador estándar de detección de proteínas transfectadas disponible en múltiples catálogos de empresas de biotecnología). Para células H1299, se sembraron 0.5 x 10^{6} células por placa, y tras 24 horas las células se transfectaron con 5 \mug de phVRK2A-HA o phVRK2B-HA y 25ng de pCB6-p53, plásmido de expresión en mamífero que expresa el cDNA de p53 humano (obsequio del Dr. Karen Vousden, Beatson Institute, Glasgow, Escocia) con 10 \mul de reactivo JetPEI (PolyTransfection, Illkirch, France) y vector GEX4T1 (plásmido de expresión procariota comercial de Amersham Biosciences-GE Healthcare que se utiliza como ADN de relleno para que en todos los experimentos la cantidad total de ADN sea la misma) vacío hasta completar la cantidad de ADN. Las transfecciones con el reactivo JetPl se realizaron siguiendo las instrucciones del proveedor (PolyTransfection, Illkirch, France).
Detección de VRK2 en inmunoblot por anticuerpos monoclonales
Como líneas celulares se utilizaron 293T (célula epitelial de riñón embrionario humano), H1299 (carcinoma de colon), HeLa (carcinoma de cuello uterino), HepG2 (hepatocarcinoma) y MCF7 (carcinoma de mama).
El anticuerpo policlonal específico para las isoformas VRK2 se preparó por inmunización de un conejo con proteína de fusión GST-VRK2A. El anticuerpo monoclonal específico para el epitopo HA fue de Covence (San Francisco, CA). El anticuerpo policlonal específico para calreticulina fue de Calbiochem (La Jolla, CA). Para p53 se utilizó el anticuerpo DO1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Como anticuerpos secundarios en inmunofluorescencia se utilizaron anti-IgG de ratón marcado con Cy2 (Fluorolink Cy2) o un anti-IgG de conejo marcado con Cy3 (Fluorolink Cy3), de Amersham. Luminiscence in westerns blot se desarrolló con un kit ECL (Amersham). (Figura
4B).
Detección de VRK2 por microscopia de fluorescencia
La línea celular usada fue MCF7 (cáncer de mama celular humano). Para inmunofluorescencia las células adherentes crecidas sobre un porta fueron fijadas con un 3% de paraformaldehído seguido de incubación con los anticuerpos correspondientes durante 30 minutos cada uno. Como anticuerpo primario se utilizó un policlonal frente a la de VRK2A. Para p53 se utilizó el anticuerpo DO1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Como anticuerpos secundarios se utilizaron un anti-IgG de ratón marcado con Cy2 (Fluorolink Cy2) o un anti-IgG de conejo marcado con Cy3 (Fluorolink Cy2), ambos obtenidos de Amersham Biosciences (Little Chalfont, UK). El análisis de miscroscopía confocal se realizó en un equipo Zeiss LSM510. (Figura 4C).
Ejemplo 4 VRK1 Humana Transfección de líneas celulares humanas con ph-VRK1-HA y acumulación de p53 por microscopia de fluorescencia e inmunoblot (figura 3)
Los métodos y condiciones usados en la transfección, en loa microscopia de fluorescencia y en el inmunoblot son sustancialmente similares a los del ejemplo anterior aunque la transfección de las células se hizo con el plásmido ph-VRK1-HA (ver figura 3).
Detección de VRK1 por técnicas de Inmunohistoquímica (Figura 5)
Cortes de bloques de parafina fueron procesados por técnicas rutinarias para detección por anticuerpos específicos (anti-VRK1) y revelados con anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa. La positividad alta o baja se determina por la intensidad de la coloración marrón (Figura 5).
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caagagtctc aagaaccttt g
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Claims (24)

1. Método in vitro para el diagnóstico de cáncer que comprende la determinación de los niveles de las proteínas de la familia VRK.
2. Método según la reivindicación 1 donde la proteína de la familia VRK determinada es la VRK1.
3. Método según la reivindicación 1 donde la proteína de la familia VRK es la VRK2.
4. Método según la reivindicación 1 donde la proteína de la familia VRK es la VRK3.
5. Método in vitro para el pronóstico de tratamientos en oncología que comprende la determinación de los niveles de las proteínas de la familia VRK.
6. Método según la reivindicación 5 donde la proteína de la familia VRK determinada es la VRK1.
7. Método según la reivindicación 5 donde la proteína de la familia VRK determinada es la VRK2.
8. Método según la reivindicación 5 donde la proteína de la familia VRK determinada es la VRK3.
9. Método in vitro para determinar la respuesta de un cáncer frente a agentes terapéuticos que comprende la determinación de los niveles de las proteínas de la familia VRK donde la alteración de dichos niveles indican la sensibilidad o no al agente terapéutico.
10. Método in vitro para identificar diferencias entre tumores que comprende la determinación de las proteínas de la familia VRK.
11. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 9-10 que comprende:
-
determinación de proteínas de la familia VRK en una muestra biológica.
-
comparación con muestra normal y/o muestra de otro tumor.
12. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 donde la determinación de los niveles de las proteínas de la familia VRK se realiza mediante anticuerpos específicos.
13. Método in vitro según la reivindicación 12 donde el anticuerpo específico es el anti-VRK1.
14. Método in vitro según la reivindicación 12 donde el anticuerpo específico es el anti-VRK2.
15. Método in vitro según la reivindicación 12 donde el anticuerpo específico es el anti-VRK3.
16. Método in vitro según la reivindicación 9-11, donde la determinación específica de los niveles de las proteínas VRK se realiza mediante ensayo de RT-PCR.
17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-12 y 16, donde la proteína de la familia VRK determinada es la VRK1.
18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-12 y 16, donde la proteína de la familia VRK determinada es la VRK2.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-12 y 16, donde la proteína de la familia VRK determinada es la VRK3.
20. Kit para el diagnóstico del cáncer y/o pronóstico de tratamientos en oncología que comprende al menos los anticuerpos específicos frente a las proteínas de la familia VRK.
21. Kit según la reivindicación 20, que comprende al menos el anticuerpo anti-VRK1.
22. Kit según la reivindicación 20, que comprende al menos el anticuerpo anti-VRK2.
23. Kit según la reivindicación 20, que comprende al menos el anticuerpo anti-VRK3.
24. Kit para el diagnóstico del cáncer y/o pronóstico de tratamientos en oncología caracterizado porque comprende al menos los reactivos necesarios para llevar a cabo la detección de las proteínas VRK mediante RT-PCR.
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