ES2255286T3 - Inhibicion de los procesos patogenicos relacionados con las lesiones del tejido. - Google Patents

Abstract

Un método de fabricar un medicamento para el tratamiento de la fibrosis cardiaca compuesto por el paso de colocar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto dentro de un portador farmacéuticamente aceptable, donde el compuesto sea miembro de un grupo con la siguiente formula (Ver fórmula) donde: R1 es miembro del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, benzo, alquil inferior, fenilo y alcoxi inferior; R2 es miembro del grupo que consiste en hidroxi, acetoxi y alcoxi inferior; R3 es miembro del grupo que consiste en hidrógeno y alquenoxi-carbonil inferior; y n es 0, 1 o 2; y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Description

Inhibición de los procesos patogénicos relacionados con las lesiones del tejido.

Campo de la invención

El presente invento trata de la inhibición de los procesos patogénicos relacionados con las lesiones del tejido al regular, a nivel molecular, la economía matriz extracelular. De forma más específica, el presente invento está relacionado con las composiciones que contienen un derivado de quinazolinone, los cuales son útiles en este tipo de regulaciones, sobre todo del quinazolinone Halofuginone y otras moléculas que pueden ejercer sus efectos por medio de los mismos mecanismos, a nivel molecular.

De forma específica, se ha revelado que estas moléculas son inhibidores potentes de la trascripción del factor nuclear KB (NF-KB), y de este modo evitan la cascada dañina de procesos patogénicos iniciada por la lesión, y sin trastornar los mecanismos normales de reparación.

Antecedentes de la invención

La degradación y la reorganización de la MEC (matriz extracelular) son procesos esenciales en la reparación normal después de las lesiones del tejido. Sin embargo, estos mecanismos también ocurren en varios procesos patológicos, incluido la formación de adhesiones, la fibrosis hepática y la cirrosis, la formación de celoidos y cicatrices hipertróficas, y la fibrosis pulmonar. Todos los procesos mencionados son respuestas anormales a las lesiones del tejido. Sin embargo, cada proceso representa un tipo de fibrosis diferente, que trata de tipos de tejido diferente, y pudiendo contar con mecanismos esenciales diferentes.

La respuesta sicológica a la lesión del tejido es un proceso complejo que implica múltiples factores que incluyen la migración y replicación celular, renovación de los componentes de la MEC (matriz extracelular) y cambios en el micro-medio ambiente celular. En su esencia, tal respuesta implica la reparación o reemplazo de los tejidos dañados. La naturaleza precisa de esta reparación o reemplazo depende de los tejidos en cuestión, aunque todos los procesos implican ciertos principios básicos. La reparación normal y necesaria de cualquier tejido después de cualquier lesión requiere la coordinación de una amplia gama de factores por la expresión regulada genética.

La respuesta patofisiológica a la lesión del tejido puede ser diferente en estos tejidos también, aunque a menudo resulta en la formación de adhesiones u otros tipos de tejidos anormales que no duplican la funcionalidad del tejido del órgano original, entonces la reparación de la lesión del tejido no conduce a una restauración completa de la capacidad y función del órgano.

Un ejemplo de un proceso fibrótico que resulta de las respuestas patofisiológicas a las lesiones del tejido es la fibrosis cardiaca.

La fibrosis cardiaca tiene varias causas, que conducen a la deposición de tejido fibrótico. Al incrementarse la deposición de este tejido fibrótico, se disminuye la capacidad de funcionamiento del corazón, y conlleva a la minusvalía y consiguiente muerte del paciente. La formación de tejido fibrótico en el corazón se caracteriza en la deposición de cantidades anormalmente abundantes de componentes de la matriz extracelular, incluyendo el colágeno entre otras proteínas matrices. Por consiguiente, es necesario inhibir el proceso de fibrosis cardiaca para prevenir dañar el tejido cardiaco y, por lo tanto, la capacidad de funcionamiento del corazón.

Desgraciadamente, los tratamientos actualmente disponibles para inhibir varias respuestas anormales a las lesiones del tejido, como la formación y crecimiento de celoidos y cicatrices hipertróficas, fibrosis cardiaca y otros tipos de procesos de enfermedades fibróticas, no gozan de un éxito total. Por ejemplo, se puede emplear la cirugía para reducir el tamaño o extensión de la lesión, mientras se puede emplear la presión física para reducir el tamaño o extensión de celoidos o cicatrices hipertróficas, además de prevenir la formación inicial (D:D Datubo-Brown, Brit. J. Plas Surg., Vol 43, p. 70-77, 1990). Sin embargo, ninguno de los dos métodos de tratamiento puede prevenir que vuelve a ocurrir la lesión, y en especial la cirugía conlleva un alto riesgo de morbosidad.

Otras formas del tratamiento incluyen la administración de corticosteroides. Por ejemplo, el triamcinoione parece reducir el tamaño de los celoidos y cicatrices hipertróficas al incrementar la velocidad del proceso de degradación de colágeno (Rockwell, W.b. et al, Plastic and Recon. Surg., Vol. 84, p. 827-835, 1989). Sin embargo, los efectos secundarios de estos medicamentos pueden ser peligrosos y no siempre tienen éxito. Otros tratamientos, como la radiación, también han demostrado una eficacia variable, y están relacionados con otros efectos secundarios potenciales (Rockwell, W.b. et al, Plastic and Recon. Surg., Vol. 84, p. 827-835, 1989). Entonces, existe una necesidad de tratamientos claramente mejores para estas enfermedades, asociadas con los procesos fibróticos que resultan de respuestas patofisiológicas.

Tal y como se ha mencionado arriba, la síntesis y la deposición del colágeno tiene un papel importante en la formación de celoidos y cicatrices hipertróficas, en la formación de adhesiones, y además en la hiper-proliferación celular asociada con la soriasis, y en las muchas formas diversas de fibrosis patológica, por ejemplo la fibrosis cardiaca, la fibrosis pulmonar y la fibrosis hepática. La síntesis del colágeno aparece también en varias condiciones patológicas, en especial las condiciones relacionadas con la fibrosis primaria o secundaria. El papel crucial del colágeno en la fibrosis ha impulsado muchos intentos de desarrollar drogas para inhibir la acumulación del colágeno (K.I. Kivirikko, Annals of Medicine, Vol. 25, p. 113-126 1993).

Sin embargo, actualmente se cree que la deposición de los componentes MEC, como el colágeno, puede ser importante tanto para curar la herida, como para el mantenimiento general de la estructura de los tejidos. De hecho, los conocimientos actuales enseñan que la fuerza de la cura de la herida depende en último lugar de la deposición de colágeno (Haukipuro K., et al, Ann. Surg., Vol. 213 p. 75-80, 1991). De esta forma, y de acuerdo con los conocimientos actuales, la deposición de colágeno debe estar presente a un nivel suficiente para dar fuerza y soporte a la cura de la herida, pero no a un nivel tan elevado como para causar la formación de cicatrices.

Además, y de acuerdo con los conocimientos actuales, si suprimimos el proceso de la síntesis de colágeno se podría provocar unos efectos secundarios muy graves. Se examinaron ciertos medicamentos que suprimen el proceso de la síntesis de colágeno, tales como los inhibidores generales de la formación de colágeno, para conocer el papel que juegan en los procesos que dependen del colágeno, como el crecimiento de tumores, y descubrieron que estos medicamentos inhiben el crecimiento de tumores en los ratones, pero desgraciadamente, resultaron demasiado tóxicos para un uso prolongado. Entonces se examinaron los inhibidores de la síntesis y deposición del colágeno actualmente disponibles para conocer los efectos sobre las condiciones de enfermedades fibróticas y/o relacionadas con el colágeno, como las enfermedades fibróticas arriba-mencionadas.

En adición, existen muchos otros inhibidores de la síntesis y deposición del colágeno actualmente disponibles que son poco recomendables, aunque no hayan sido examinados por sus efectos sobre los varios procesos fibróticos, porque no aportan ninguna característica específica para la trayectoria metabólica del colágeno. Por estos, mucho medicamentos actualmente disponibles tienen efectos secundarios perjudiciales.

Por ejemplo, se ha usado drogas citotóxicas para intentar reducir la proliferación de fibroblastos que producen el colágeno (J.A. Casas, et al., Ann. Rhem. Dis., Vol. 46, p. 763, 1987), por ejemplo el colchicino que reduce la secreción de colágeno al matriz extracelular (D. Kershenobich, et al., N. Engl. J. Med., Vol. 318, p. 1709, 1988). Otras drogas actúan como inhibidores sobre las enzimas claves del metabolismo del colágeno (K. Karvonen, et al., J. Biol Chem. Vol. 265, p. 8414, (1990); C.J. Cunliffe, et al, J. Med. Chem., Vol. 35, p. 2652 (1992)). Sin embargo, ninguno de estos inhibidores demuestra efectos especiales para el metabolismo y deposición de tipos específicos de colágeno. Además, estas drogas pueden interferir con la biosíntesis de otras moléculas de colágeno vitales, como Clq en la trayectoria clásica de complementos, esterase acetilocolino del plato final de la junta neuro-muscular, conglutinín y apoproteína surfactante pulmonar. Tal interferencia y falta de especialización podría acarrear efectos secundarios adversos y potencialmente serios.

Existen otras drogas que pueden inhibir la síntesis del colágeno, por ejemplo la nifedipine y fenitoín, que también inhiben la síntesis de otras proteínas, y de esta manera bloquean de forma no específica la trayectoria del colágeno bio-sintético (T. Salo, et al., J. Oral Pathol. Med., Vol. 19, p. 404 (1990)). De nuevo, la falta de especialización reduce de forma significativa el uso clínico de estas drogas, dado que la inhibición no específica de la síntesis de proteínas puede resultar en efectos secundarios adversos al administrar la droga a un paciente.

De hecho, las drogas anti-fibróticas arriba-mencionadas, incluyendo los inhibidores de colágeno de unión trasversal como el beta-amino-propionitrilo arriba-mencionado, también son no específicas. Desgraciadamente, la falta de especialización de estos inhibidores de colágeno de unión trasversal resulta en última instancia en efectos secundarios adversos después de un uso prolongado. Estos efectos secundarios incluyen el síndrome latrítico, junto con el elastogénesis interrumpido. Este último efecto secundario resulta en la disrupción del elastín de unión trasversal, otra proteína del tejido fibroso y conectivo. En adición, el efecto de los inhibidores de colágeno de unión trasversal de estas drogas es secundario, entonces habría que producir demasiado colágeno, antes de que pueda ser degradado por la colagenaza. De esta forma se puede apreciar claramente la necesidad de un inhibidor tipo-específico de la síntesis del colágeno.

Se puede conocer un inhibidor tipo-específico de la síntesis del colágeno en la U.S. Patente No. 5.449.678 para el tratamiento de ciertas condiciones fibróticas, como la esclerodermia, y la enfermedad de Graft versus enfermedad anfitrión. Tanto una como la otra condición está relacionada con una deposición excesiva de colágeno, lo que puede ser inhibido por medio del Halofuginone. Este inhibidor específico está compuesto por una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto activo farmacéuticamente de una fórmula.

1

donde:

R_{1} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, benzo, alquil inferior, fenilo y alquoxi inferior;

R_{2} es miembro del grupo que consiste en hidroxi, acetoxi y alquoxi inferior; y

R_{3} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno y alquenoxi-carbonil inferior. De todos estos compuestos, se ha descubierto que el Halofuginon es especialmente preparada para tal tratamiento.

La Solicitud de Patente PCT No. WO96/06616 descubre además que estos compuestos son capaces de tratar de manera eficaz la restenosis, al prevenir la proliferación de células musculares vasculares y lisas. La restenosis se caracteriza en la proliferación de las células musculares lisas y la acumulación de matriz extracelular dentro del lumen de los vasos sanguíneos afectados en respuesta al daño vascular (Choi et al., Arch. Surg., Vol. 130, p. 257-261 (1995)). Un sello de esta proliferación de las células musculares lisas es la alteración fenotípica, desde el fenotipo normal de contracción hasta uno sintético. Se ha demostrado que el colágeno Tipo 1 soporta tales alteraciones fenotípicas, que pueden ser bloqueadas con el Haloluginone (Choi et al., Arch. Surg., Vol. 130, p. 257-261 (1995); Solicitud de Patente PCT No 96/06616). De esta forma, el Haloluginone puede prevenir este tipo de re-diferenciación anormal de las células musculares lisas después del daño vascular, al bloquear el colágeno de tipo 1 sintético. Otros estudios in vitro demuestran que el Haloluginone puede además inhibir la proliferación de células fibroblastos 3T3 (US Patent No 5.449.678).

Sin embargo, el proceso de la restenosis es diferente al proceso de fibrosis cardiaca. Además, el tejido cardiaco es diferente en general del tejido otros órganos. En especial, el tejido cardiaco debe mantener la capacidad de funcionar como un único músculo de acuerdo con una onda de actividad eléctrica, para bombear la sangre de manera eficaz. Por esto, el corazón debe mantener un nivel de funcionalidad superior, en comparación con otros órganos como por ejemplo el hígado, que puede encontrarse dañado en un grado significativo y que sigue proporcionando el nivel necesario de funcionamiento para mantener el cuerpo. Entonces, hasta una cantidad muy reducida de fibrosis cardiaca será perjudicial al funcionamiento del corazón, y por consiguiente los tratamientos que son válidos para otros órganos no serían considerados aptos para el tratamiento y/o prevención de la fibrosis cardiaca.

Además, la acción in vitro del Haloluginone no siempre previene sus efectos in vivo. Por ejemplo, el Haloluginone inhibe la síntesis del colágeno tipo 1 en los experimentos sobre crondrocitos óseos in vitro, tal y como se demuestra en el US Patent No 5.449.678. Sin embargo, los pollos tratados con el Haloluginone no mostraron ningún incremento en la rotura de los huesos, lo que indica que el efecto no aparece in vivo. De esta forma, no se puede predecir el comportamiento exacto del Haloluginone in vivo basándose en los resultados de los estudios in vitro.

De hecho, el descubrimiento inicial de la capacidad del Haloluginone de tratar varios estados de enfermedad con éxito fue una casualidad. Se ha demostrado la eficacia del Haloluginone en tratar estos estados de enfermedad por un método de tanteos, dado que se ignoraba el mecanismo exacto de acción fundamental del Haloluginone. Esta falta de conocimientos, junto con la incapacidad de predecir de forma segura el comportamiento in vivo del Haloluginone basado en sus efectos in vitro, ha limitado el desarrollo de nuevos agentes para estas condiciones
patológicas.

La elucidación del mecanismo de acción(es) fundamental del Haloluginone facilitaría el desarrollo de nuevos, y potencialmente más eficaces tratamientos. Además, se podría diseñar tales tratamientos para indicar con toda precisión los objetivos moleculares de Haloluginone y otros derivados de quinazolinone, para, de esta manera, potencialmente reducir los efectos secundarios no deseados del tratamiento. Tales tratamientos también podrían regular la suma de la economía de la matriz extracelular, y así llevar a una mejoría de muchas condiciones patológicas diferentes asociadas con trastornos en esta economía.

Existe entonces una necesidad médica, reconocida por muchos, para efectores específicos capaces de regular la economía de la matriz extracelular, donde el mecanismo de acción incluye la intervención apuntada hacia el nivel molecular transcripcional u otro, de manera que se determina un efecto específico en las respuestas patológicas a las lesiones del tejido por medio de una intervención precisa enfocada hacia un objetivo molecular particular. Entonces esto podría actuar de inhibidor del crecimiento, progresión y metástasis de un tumor, algo especialmente eficaz in vivo, de forma sustanciosa y sin afectar de manera adversa a otros procesos fisiológicos, y que fuese capaz de inhibir la angiogénesis y deposición del colágeno, capaz también de provocar de manera selectiva la apóptosis en las células del tumor, y con la capacidad de inhibir una variedad de procesos de enfermedad fibrótica, incluyendo la fibrosis cardiaca, de forma especial y enfocada, para que el tratamiento no resulte en efectos secundarios
desagradables.

Resumen de la invención

Ha sido revelado que la capacidad de las composiciones, de acuerdo con el presente invento, de prevenir los aspectos patogénicos de las lesiones del tejido y a la vez conservar los mecanismos normales de reparación del tejido, está basada en el hacho que estas moléculas abrogan la cascada de daños iniciada por la lesión del tejido, mientras mantiene la economía de la matriz extracelular correcta y sana.

De acuerdo con un aspecto del invento, se ha demostrado que el Halofuginone puede ser eficaz en la coordinación o co-regulación de genes múltiples que exhiben una actividad no regulada. Esta co-regulación es específica, en cuanto al hecho que existen ciertos genes, conocidos por su relación con los genes regulados de otros sistemas, que no son co-regulados por el Halofuginone. De hecho, una co-regulación tan específica indica un mecanismo fundamental y común a todos estos efectos de los derivados de quinazolinone, como el Halofuginone.

De acuerdo con otro aspecto del invento, el Halofuginone causa una amplia gama de efectos cuya relación estaba previamente desconocida, y que incluyen:

a) reducir la expresión del colágeno tipo I, en particular al inhibir la expresión del gen de colágeno \alpha1(I);

b)reducir la liberación de los citoquinas IL-1\beta y TNF \alpha, y en la inhibición de la trascripción de NF-\kappaB;

c) inhibir la producción del colágeno de tipo IV;

d) promocionar la actividad del factor de trascripción cKrox;

e) reducir la expresión del acompañante del colágeno, el gen de la proteína HSP47 resistente al calor, y en paralelo inhibir la expresión del gen de colágeno \alpha1(I); y

f) falta de efecto en la expresión de TGF \beta.

De acuerdo con el presente invento, ha sido revelado que el mecanismo de acción fundamental de Halofuginone y los quinolinones relacionados, presentes en la inhibición de las respuestas patogénicas a las lesiones del tejido, acarrea la regulación de la economía de la matriz extracelular al nivel molecular. Esta regulación incluye al menos los siguientes factores: la inhibición de la expresión del gen de colágeno \alpha1(I), la inhibición de la trascripción de NF-\kappaB y la inhibición de la producción de la colagenasa tipo IV. Otro factor importante en la eficacia de la regulación por medio del Halofuginone es la promoción de la actividad del factor de trascripción cKrox.

NF-\kappaB ha llegado a convertirse en el enfoque de un interés intenso, dado que se ha demostrado que se activa en las células gracias al estimulo de un gran número de factores, por ejemplo IL-1\beta (interleucina-1\beta) y el factor \alpha de la necrosis de tumores (TNF \alpha) (Mercurio and Manning, Curr. Op. In Cell Biol., 11.226-232, 1999). Muchos factores inflamatorios han sido demostrados como provocadores de NF-\kappaB, hasta el punto que se considera que una amplia gama de mecanismos de provocación se dirigen todos a este mismo objetivo. Por consiguiente, el efecto del Halofuginone en la inhibición de la expresión de NF-\kappaB podría indicar al menos una característica del mecanismo que provoca el efecto del Halofuginone en la inhibición de los procesos fibróticos, mientras regula y mantiene la economía de la matriz extracelular fisiológicamente normal y deseable.

El factor de la trascripción cKrox en la expresión del gen de colágeno \alpha1(I) es un factor de trascripción que contiene un dedo de cinc novedoso que se une a los promotores del gen de colágeno \alpha1(I) y \alpha2(I), y ha sido demostrado que reprime la trascripción del promotor del pro colágeno \alpha1(I) (Wisdom R.L.; Culic I; Lee J.Y.; Korn J.H.; GENE, (1997 Oct 1) 198:407-20). A continuación se detallará con la ayuda de ejemplos como se ha demostrado que el Halofuginone potencia el efecto de cKrox y, por consiguiente, potencia la inhibición de la síntesis del colágeno.

Tal y como se ha descrito anteriormente, los factores adicionales en la capacidad del Halofuginone de regular la economía de la matriz extracelular puede incluir una disminución en la liberación de los citoquinas IL-1\beta y TNF\alpha, y una disminución en la expresión del acompañante del colágeno HSP47. Concomitante con todos estos efectos reales ejercidos sobre la economía de la matriz extracelular existe la falta de cualquier efecto sobre la expresión de TGF\beta. Por consiguiente, es obvio que mientras la regulación de la economía de la matriz extracelular por parte del Halofuginone mantiene una matriz extra-celular sana, funciona de manera específica para un mecanismo fundamental en
particular.

Algunos de estos objetivos moleculares del Halofuginone y otras moléculas de su clase, como la inhibición de la expresión del gen marcador de tumores H19, y como la regulación total de la deposición y remodelación de la MEC (matriz extra-celular), son probablemente objetivos secundarios del mecanismo de acción del Halofuginone, o el Halofuginone actuará para inhibirlos solamente de manera indirecta. De hecho, estos efectos de inhibición pueden estar relacionados con la potenciación del factor de la trascripción cKrox, o a la regulación de los demás mecanismos arriba descritos.

De todos modos, todos estos mecanismos están relacionados con la regulación de la "economía matriz extra-celular". La regulación no es meramente una inhibición de todos los procesos relacionados con el movimiento de la matriz extra-celular y la deposición del colágeno, dado que se ha demostrado previamente por parte de los inventores que el Halofuginone inhibe la deposición excesiva de colágeno, sin interferir con los niveles de basal de la expulsión de colágeno necesarios para la reparación de heridas, tal y como se mostró en la US Patente 5.852.024.

El término "economía matriz extra-celular" propone indicar el conjunto de procesos relacionados con la síntesis, deposición y mantenimiento de la matriz extra-celular y las estructuras de tejidos relacionadas. La regulación correcta de la economía de la matriz extracelular conduce a la inhibición de la respuesta patológica a las lesiones del tejido, para que todos los objetivos potenciales de la acción del Halofuginone y los demás efectores puedan prevenir tales respuestas patológicas en gran medida, sin inhibir o alterar otras actividades fisiológicas deseadas.

Además, estos efectos especiales del Halofuginone, y de los demás compuestos que provocan la regulación de la economía de la matriz extracelular, son útiles en el tratamiento de varias enfermedades relacionadas con la deposición de la MEC y otros aspectos de la economía MEC, tal y como se pasa a detallar a continuación. Por ejemplo, y de manera inesperada, se ha descubierto, como pasamos a detallar a continuación, que el Halofuginone puede inhibir el proceso patofisiológico de la fibrosis cardiaca in vivo.

De acuerdo con un primer aspecto del presente invento, se proporciona un método de fabricación de un medicamento para el tratamiento de la fibrosis cardiaca, que incluye el paso de colocar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto en un portador farmacéuticamente aceptable, donde el compuesto sea miembro de un grupo con la siguiente fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

donde:

R_{1} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, benzo, alquil inferior, fenilo y alquoxi inferior;

R_{2} es miembro del grupo que consiste en hidroxi, acetoxi y alquoxi inferior;

R_{3} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno y alquenoxi-carbonil inferior; y

n es 0, 1 o 2.

Además están incluidos las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Otro aspecto del presente invento es el uso de un compuesto con la siguiente fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

donde:

R_{1} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, benzo, alquil inferior, fenilo y alquoxi inferior;

R_{2} es miembro del grupo que consiste en hidroxi, acetoxi y alquoxi inferior;

R_{3} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno y alquenoxi-carbonil inferior; y

n es 0, 1 o 2, o de una sal farmacéuticamente aceptable de tal compuesto;

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la fibrosis cardiaca.

\newpage

De acuerdo con un tercer aspecto del presente invento, se proporciona un método de fabricación de un medicamento para la prevención de la fibrosis cardiaca, que incluye el paso de colocar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto en un portador farmacéuticamente aceptable, donde el compuesto sea miembro de un grupo con la siguiente fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

donde:

R_{1} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, benzo, alquil inferior, fenilo y alquoxi inferior;

R_{2} es miembro del grupo que consiste en hidroxi, acetoxi y alquoxi inferior;

R_{3} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno y alquenoxi-carbonil inferior; y

n es 0, 1 o 2; y

además están incluidos las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

De acuerdo con un cuarto aspecto del presente invento, se proporciona el uso de un compuesto con la siguiente fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

donde:

R_{1} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, benzo, alquil inferior, fenilo y alquoxi inferior;

R_{2} es miembro del grupo que consiste en hidroxi, acetoxi y alquoxi inferior;

R_{3} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno y alquenoxi-carbonil inferior; y

n es 0, 1 o 2; o

de una sal farmacéuticamente aceptable de tal compuesto;

para la fabricación de un medicamento para la prevención en gran medida de la fibrosis cardiaca.

De acuerdo con las variantes preferidas del presente invento, el compuesto es el Halofuginone. De aquí en adelante se definirá el término "Halofuginone" como un compuesto con la siguiente fórmula:

6

y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo. La composición incluye preferiblemente un portador farmacéuticamente aceptable para el compuesto.

De forma preferible, y de aquí en adelante, todos los compuestos mencionados podrán ser bien el mismo compuesto tal y como está descrito en la fórmula, y/o las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Breve descripción de los dibujos

A continuación se describe el invento, a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, donde:

Figura 1 ilustra ciertos aspectos ejemplares de la economía de la matriz extracelular;

Figura 2 ilustra la inhibición, dependiente de la dosis, de la actividad de la colagenasa tipo IV en los cultivos de células de carcinoma de vejiga T50 en presencia del Halofuginone;

Figura 3 ilustra la inhibición de la expresión del gen H19 en las líneas de células de carcinoma de vejiga T50 por el Halofuginone;

Figura 4 muestra una mancha Northern Blot con el efecto del Halofuginone en la expresión en cadena del
Integrín \alpha_{v},

Figura 5 muestra el efecto del Halofuginone sobre la expresión de la sub-unidad \beta, determinado por RT-PCR;

Figura 6 ilustra el efecto del Halofuginone sobre la fracción de volumen de colágeno ventricular (CVF) en el corazón de una rata;

Figura 7 ilustra el efecto del Halofuginone sobre la expresión del gen de colágeno a1(I) en el corazón de una rata;

Figura 8 ilustra el efecto del Halofuginone sobre la expresión TGF-\beta en el corazón de una rata.

7

\vskip1.000000\baselineskip

donde:

R_{1} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, benzo, alquil inferior, fenilo y alquoxi inferior;

R_{2} es miembro del grupo que consiste en hidroxi, acetoxi y alquoxi inferior;

R_{3} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno y alquenoxi-carbonil inferior; y

n es 0, 1 o 2.

Además están incluidos las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la fibrosis cardiaca.

De acuerdo con otras variantes del presente invento, se proporciona una composición para la prevención en gran medida de la fibrosis cardiaca, que incluye una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable, donde el compuesto sea miembro de un grupo con la siguiente fórmula:

8

donde:

R_{1} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, benzo, alquil inferior, fenilo y alquoxi inferior;

R_{2} es miembro del grupo que consiste en hidroxi, acetoxi y alquoxi inferior;

R_{3} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno y alquenoxi-carbonil inferior; y

n es 0, 1 o 2; y

las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

De acuerdo con otras variantes preferidas del presente invento, el compuesto preferido es el Halofuginone. De aquí en adelante se definirá el término "Halofuginone" como un compuesto con la siguiente fórmula:

9

y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo. La composición incluye preferiblemente un portador farmacéuticamente aceptable para el compuesto.

De forma preferible, y de aquí en adelante, todos los compuestos mencionados podrán ser bien el mismo compuesto tal y como está descrito en la fórmula, y/o las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Descripción de los dibujos

A continuación se describe el invento, a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, donde:

Fig 1 ilustra ciertos aspectos ejemplares de la economía de la matriz extracelular;

Fig 2 ilustra la inhibición, dependiente de la dosis, de la actividad de la colagenasa tipo IV en los cultivos de células de carcinoma de vejiga T50 en presencia del Halofuginone;

Fig 3 ilustra la inhibición de la expresión del gen H19 en las líneas de células de carcinoma de vejiga T50 por el Halofuginone;

Fig 4 muestra una mancha Northern Blot con el efecto del Halofuginone en la expresión en cadena del Integrín \xi,

Fig 5 muestra el efecto del Halofuginone sobre la expresión de la sub-unidad \beta, determinado por RT-PCR;

Fig 6 ilustra el efecto del Halofuginone sobre la fracción de volumen de colágeno ventricular (CVF) en el corazón de una rata;

Fig 7 ilustra el efecto del Halofuginone sobre la expresión del gen de colágeno a1(I) en el corazón de una rata;

Fig 8 ilustra el efecto del Halofuginone sobre la expresión TGF-\beta en el corazón de una rata.

Breve descripción de la invención

De manera inesperada, se ha descubierto, como pasamos a detallar a continuación, que el mecanismo de acción fundamental del Halofuginone para la inhibición de todas estas respuestas patofisiológicas a las lesiones del tejido incluyen la regulación de la economía de la matriz extracelular al nivel molecular.

Tal y como se divulga a continuación, los resultados actuales de nuestros experimentos muestran que el Halofuginone inhibe de manera clara la expresión de NF-\kappaB (factor nuclear \kappaB), y además, paralelo a la inhibición de la expresión del colágeno. NF-\kappaB ha llegado a ser el objetivo de gran interés, dado que ha sido demostrado que se activa dentro de las células gracias a una amplia gama de factores estimulantes asociados con el estrés o las heridas. Se ha demostrado que NF-\kappaB puede ser provocado gracias a un gran número de factores, como IL-1\beta (interleucina-1\beta) y el factor \alpha de la necrosis de tumores (TNF\alpha) (Mercurio and Manning, Curr. Op. In Cell Biol., 11.226-232, 1999). De manera interesante, los resultados actuales de nuestros experimentos muestran que el Halofuginone también inhiba estos factores especiales. Se ha demostrado que muchos factores inflamatorios provocan NF-\kappaB, de forma que se considera que una amplia gama de mecanismos de provocación se dirigen todos a este mismo objetivo. De esta manera, el efecto del Halofuginone en la inhibición de la expresión de NF-\kappaB podría indicar al menos una característica del mecanismo que provoca el efecto del Halofuginone en la inhibición de los procesos fibróticos, mientras regula y mantiene la economía de la matriz extracelular fisiológicamente normal y deseada.

A la vez, se ha demostrado que NF-\kappaB tiene un papel importante en la regulación de la expresión del gen del colágeno tipo VII (COL7A1). NF-\kappaB media el efecto de TNF-\alpha en la expresión de COL7A1, al unirse a una parte específica del promotor de este gen, conocido como un "TNF-\alpha elemento de respuesta" (Kon et al., Oncogen, 18:1837-1844, 1999). Es de interés notar que COL7A1 está compuesto por dos elementos distintos en la región del promotor: el "TNF-\alpha elemento de respuesta" arriba-mencionado, y un elemento de respuesta separado para TGF-\beta. De esta manera, los efectos aparentes del Halofuginone sobre TNF-\alpha y NF-\kappaB, pero no sobre TGF-\beta, podrían permitir al Halofuginone contar eventualmente con los efectos de inhibición deseados para los procesos patológicos de la fibrosis, de forma importante y sin inhibir o de-regular de forma perjudicial la economía de la matriz extracelular fisiológicamente normal y deseable.

Otro objetivo molecular importante del Halofuginone es el factor de trascripción cKrox para la expresión del gen del colágeno \alpha1(I). cKrox es un factor de trascripción que contiene un dedo de cinc novedoso que se une a los promotores del gen de colágeno \alpha1(I) y \alpha2(I), y ha sido demostrado que reprime la trascripción del promotor del pro colágeno \alpha1(I) (Wisdom R.L.; Culic I; Lee J.Y.; Korn J.H.; GENE, (1997 Oct 1) 198:407-20). Tal y como se describe a continuación, el Halofuginone a la vez demuestra que puede potenciar el efecto de cKrox, y así potenciar la inhibición de la síntesis del colágeno.

cKrox también está presente en la piel en proporciones muchísimo más altas que en los huesos, lo que podría explicar porque el Halofuginone pudo disminuir la deposición de un exceso de colágeno en la piel, mientras no incrementó la fragilidad del hueso (Galera P; Musso M; Ducy P; Karsenly G; PNAS, (1994) 91:9372-6).

Otros efectos importantes que ocurren al administrar el Halofuginone incluyen la disminución de la expresión del acompañante específico del colágeno, el gen de la proteína HSP47 resistente al calor, y en paralelo la inhibición de la expresión del gen de colágeno \alpha1(I) y la reducción de la liberación de los citoquinas IL-1\beta y TNF \alpha, mientras inhibe la trascripción de NF-\kappaB; pero sin afectar la expresión de TGF\beta.

Se ha demostrado que HSP47 es un acompañante molecular específico para el colágeno y, en particular, para el procolágeno (Nagata y Hosokawa; Cell Structure and Function; 21:425-430, 1996). HSP47 es una proteína que se encuentra en el retículo endoplásmico (ER), y que se une al procolágeno nuevamente sintetizado hasta que la cadena de procolágeno entra dentro del cuerpo Golgi. Puede que HSP47 ayuda en la formación de las estructuras de proteína del mismo colágeno, como la estructura de hélice triple del colágeno. En apoyo de la relevancia funcional delHSP47 al colágeno, existen resultados anteriores que demuestran que la expresión de HSP47 en varias células está estrechamente relacionada con la expresión del colágeno (Nagata y Hosokawa; Cell Structure and Function; 21:425-430, 1996). En especial, se encontró un nivel elevado de expresión de HSP47 durante la progresión de la fibrosis hepática, provocada por medio de la administración de tetracloro carbónico a ratas, en paralelo al incremento en la expresión de colágeno tipo I.

Como punto de interés, los resultados actuales de los experimentos muestran que el Halofuginone inhibe de forma clara la expresión de HSP47 en paralelo a la expresión del colágeno. Estos resultados apoyan la hipótesis que sugiere que el Halofuginone actúa como mecanismo fundamental común para varios procesos diferentes relacionados con la síntesis y deposición patológico del colágeno y otros componentes MEC dentro del campo de enfermedades
fibróticas.

De todos modos, todos estos mecanismos están relacionados con la regulación de la economía de la matriz extracelular. Esta regulación no es una mera inhibición de todos los procesos relacionados con la matriz extra-celular y la deposición de colágeno, dado que, tal y como los inventores demostraron previamente, el Halofuginone inhibe la deposición excesiva de colágeno asociada con los celoidos y otras formaciones anormales de cicatrices, y sin embargo el Halofuginone no disminuye la fortaleza de la herida, tal y como se muestra en el U.S. Patent 5.852.024.

La regulación correcta de la economía de la matriz extracelular conduce a la inhibición de la respuesta patológica a las lesiones del tejido, hasta tal extremo que todos los objetivos potenciales del mecanismo de acción del Halofuginone y los demás efectores pueden prevenir gran parte de estas respuestas patológicas, sin inhibir ni alterar otras actividades fisiológicas deseadas. De hecho, empleamos el término "efector" al referirnos en gran medida a cualquier compuesto o combinación de la misma capaz de regular la economía de la matriz extracelular, y así inhibir de forma específica los procesos patológicos relacionados con las lesiones del tejido y los procesos relacionados de forma mecánica.

El término "procesos relacionados de forma mecánica" incluye aquellas condiciones patológicas que comparten al menos un mecanismo fundamental con respuestas anormales a las lesiones del tejido. Por ejemplo, la metástasis de las células malignas puede ser un ejemplo de un proceso relacionado de forma mecánica ya que esta metástasis depende de la neo-angiogénesis, que a la vez depende de la deposición de los componentes de la matriz extra-celular incluido el colágeno, tal y como se muestra en la Solicitud PCT No. WO 98/34613, presentada el 11 febrero de 1998.

Igualmente, las respuestas anormales a las lesiones del tejido como la formación de adhesión, también dependen de la deposición de colágeno. De esta forma, se podría decir que todos estos procesos patológicos están relacionados de forma mecánica.

Otros mecanismos de la "economía matriz extra-celular" incluyen, pero no se limitan a, la inhibición de la angiogénesis, la prevención de la deposición MEC, la inhibición de la producción de colagenasa tipo IV, la inhibición de la expresión de integrín, la provocación de apóptosis y la inhibición de la expresión del gen H19. Se puede apreciar la estructura íntegra de la economía de la matriz extracelular y el efecto del Halofuginone en relación con esta economía en la Figura 1. Se puede apreciar que los efectos específicos del Halofuginone en la economía de la matriz extracelular incluyen la inhibición o mejora de las condiciones asociadas con los tumores, la fibrosis, incluida la fibrosis renal, la escleroderma y GVHD, la restenosis y los daños sufridos por la piel. Al mediar ciertos efectos o factores asociados con la economía de la matriz extracelular, el Halofuginone y los demás efectores pueden inhibir la síntesis de colágeno tipo I, y de esta forma mejoran las condiciones patológicas asociadas con las lesiones del tejido, mientras permiten que continúen los procesos fisiológicos normales y deseados.

En cuanto a los aspectos específicos de estos mecanismos, se ha descrito con anterioridad la angiogénesis y la deposición MEC. La colagenasa tipo IV es una enzima metaloprotease central en el proceso de metástasis y la invasión celular. La apóptosis es la muerte programada de la célula, la cual, tal y como apuntamos anteriormente, es un bloque de células malignas, también descritas como "inmortales". El gen H19 es un gen marcador de tumores asociado con las primeras fases del carcinoma de la vejiga. De forma más específica, el desarrollo del gen H19 está regulado y su expresión tiene su momento más fuerte durante el desarrollo del feto cuando ocurre la diferenciación de los tejidos. Se asocian las anormalidades de los cromosomas en la región que contiene H19 a las primeras fases de los cuerpos malignos como el tumor Wilms, el carcinoma adrenocortical, hepatoblastoma, rabdomiosarcoma, tumores pulmonares, tumores trofoblásticos y carcinoma de la vejiga (B.Tycko, Am. J. Path., Vol. 144, p.431-439, 1994; de Groot, N. et al., Trophoblast Res., Vol. 8, p. 2285-2302, 1994: Rachemilewitz, J. et al., Oncogene, Vol., 11, p. 863-870, 1995).

La importancia de la economía de la matriz extracelular reside en que el mecanismo de acción del Halofuginone es capaz de promover muchas actividades deseadas, como la inhibición cito-estática de los cuerpos malignos, la reducción o prevención de la fibrosis y las adhesiones, y otras respuestas patológicas a las lesiones del tejido, o las actividades relacionadas de forma mecánica de las mismas, de manera importante y sin causar efectos secundarios no deseados como disminuir la fortaleza de las heridas cicatrizadas o alterar la remodelación de la estructura ósea.

Descripción de variantes preferidas

De forma inesperada, y tal y como pasamos a detallar, se ha descubierto que los mecanismos fundamentales de la acción del Halofuginone al inhibir todas las respuestas patogénicas a las lesiones del tejido incluyen la regulación de la economía de la matriz extracelular al nivel molecular. Esta regulación incluye los siguientes efectos: mejora las actividades del factor de trascripción cKrox, que a la vez reprime la trascripción del promotor de procolágeno \alpha1(I); disminuye la expresión del acompañante molecular del colágeno, HSP47, en paralelo a la inhibición de la expresión del gen de colágeno \alpha1(I); disminuye la liberación de citoquinas IL-1\beta y TNF \alpha, mientras inhibe la trascripción de NF-\kappaB; pero sin afectar la expresión de TGF \beta.

Además, el Halofuginone también está involucrado en otros aspectos de la economía de la matriz extracelular, incluido la inhibición de la producción de colagenasa tipo IV y la inhibición de la expresión del gen H19, y también la regulación general de la deposición y remodelación de la MEC (matriz extra-celular), la mejora y/o prevención de la enfermedad inflamatoria crónica, y la inhibición de neo-angiogénesis. Otros mecanismos de la "economía matriz extra-celular" incluyen, pero no se limitan a, la inhibición de angiogénesis, la prevención de la deposición MEC, la inhibición de la producción de colagenasa tipo IV, la inhibición de la expresión de integrín, la inhibición de apóptosis y la inhibición de la expresión del gen H19. Nunca antes, se ha demostrado una regulación tan específica de la economía de la matriz extracelular, particularmente in vivo.

A continuación pasamos a describir el invento en relación con ciertas variantes preferidas ilustradas en los dibujos y ejemplos adjuntos, para mejor comprender y apreciar ciertos aspectos de las mismas; sin embargo el invento no se limita a estas variantes en particular. En cambio, se incluyen todas las alternativas, modificaciones y equivalentes bajo el alcance del invento, tal y como se define en las Reivindicaciones adjuntas. De esta forma, los siguientes dibujos y ejemplos que incluyen variantes preferidas sirven para ilustrar la práctica de este invento, y se sobreentiende que aparecen de modo de ejemplo y para debatir las variantes preferidas del presente invento, y las presentamos para presentar una descripción útil y fácil de entender de los procedimientos de formulación, además de los principios y aspectos conceptuales del invento.

Se puede comprender el presente invento más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos y dibujos. Hacemos hincapié en que, aunque nos referimos exclusivamente al Halofuginone, creemos que los demás derivativos de quinazolinone cuentan con propiedades similares, tal y como describe y reivindica el US Patent 3.320.124.

Ejemplo 1 Promoción de la Actividad de cKrox y la Inhibición de Colágeno Tipo I Expresión de Genes por Halofuginone

Tal y como apuntamos anteriormente, uno de los objetivos más importantes de la acción del Halofuginone y los demás derivativos de quinazolinone y efectores es la promoción de la actividad cKrox y la inhibición concomitante de la expresión del gen de colágeno tipo I. Estas dos actividades fueron demostradas con el Halofuginone de la siguiente manera.

En primer lugar, se demostró la capacidad del Halofuginone de inhibir la expresión del gen de colágeno tipo I de la siguiente manera. Se cogieron unas células miometriales y leiomiosarcomas del mismo paciente, y las células fueron colocadas en platos de 10 cm en DMEM con un suplemento de 10% de FCS. Cuando las células llegaron a un 80% de confluencia, se cambió el medio por DMEM libre de suero más 0,1% BSA durante 48 horas, y fueron lavadas y expuestas al Halofuginone cada vez más concentrado en el mismo medio durante alrededor de 48 horas a aproximadamente 37ºC. Entonces recogimos las células y las sujetamos a una extracción de ARN y un análisis de mancha Northern Blot para la expresión del gen de colágeno tipo I. El Halofuginone inhibió la expresión del gen de colágeno tipo I (productos a 5.4 y 4.8 kb) de forma dependiente de la dosis.

Seguido, se extrajo unos fibroblastos de piel humana de un sujeto y fueron mantenidos en cultivo primario. Se trataron las células de control con el vehículo, mientras las células tratadas con Halofuginone fueron tratadas con Halofuginone de la forma arriba descrita. Entonces recogimos las células y las sujetamos a una extracción de ARN y un análisis de mancha Northern Blot para la expresión del gen de colágeno tipo I y para la expresión del gen cKrox. El Halofuginone promocionó la expresión del gen cKrox, mientras, y de forma simultánea, inhibió la expresión del gen de colágeno tipo I. Entonces, un objetivo molecular importante del mecanismo de acción de Halofuginone es obviamente realzar la expresión del gen cKrox y, por consiguiente, la actividad cKrox, que, a la vez, conduce a la inhibición de la expresión del gen de colágeno tipo I.

Enfocar la acción del Halofuginone es un objetivo novedoso, y no ha sido enseñado ni sugerido anteriormente en la técnica actual. Sin embargo, la importancia de aclarar este mecanismo está clara por el desarrollo y diseño de nuevos tratamientos para los procesos patológicos asociados con las lesiones del tejido. Además, los resultados proporcionan una explicación clara del mecanismo de la capacidad del Halofuginone de inhibir la síntesis patológica del colágeno, mientras permite que los procesos fisiológicos normales asociados con el colágeno se desarrollan sin efectos secundarios no deseados. En particular, son posibles las composiciones moleculares y químicas que a la vez son capaces de inhibir la síntesis patológica del colágeno, mientras permiten los procesos fisiológicos normales asociados con el colágeno desarrollarse sin efectos secundarios no deseados, al fijar como objetivo la potenciación de la expresión del gen y/o la actividad para una posible intervención terapéutica.

Ejemplo 2 Inhibición de la Producción de Colágeno Tipo IV por Halofuginone in vitro

Otra característica importante de la regulación de la economía de la matriz extracelular es la inhibición de la producción de colágeno tipo IV por el Halofuginone.

Las células de tumores secretan enzimas que digieran la MEC y así permiten a las células filtrarse por los tejidos vecinos e invadir otros tejidos. En numerosos estudios se han visto una conexión entre las matrices metaloproteasas (MMP), sobre todo de colagenasa tipo IV, y los procesos de invasión y metástasis de los tumores. La colagenasa tipo IV aparece como dos 72 y 92 kDa proteínas, codificadas por un único mARN.

Tal y como se demostró en la Figura 2, se ejercitó una profunda inhibición de la actividad de MMP2 (72 kDa colagenasa tipo IV) en los cultivos de células de carcinoma de vejiga T50 en presencia de 25 ng/ml Halofuginone, mientras se obtuvo una inhibición casi total en presencia de 100 ng/ml Halofuginone. Se incubaron a los cultivos de células sub-confluentes durante 6 a 24 horas en DMEM libre de suero. La actividad colagenolítica fue determinada sobre una gelatina impregnada (1 mg/ml. Difco, Detroit, MI) SDS-PAGE 8% gel. En breve, se separaron las muestras de medios de cultivo por los geles de substrato impregnado en condiciones no- reductoras, seguido de 30 minutos de incubación en 2.5% Triton X-100 (BDH; Inglaterra). Entonces se incubaron los geles durante 16 horas a 37ºC en 50 mM Tris, 0,2 M NaCl, 5 mM CaCl_{2}, 0,02% Brij 35 (peso / volumen) a pH7.5. Al final del período de incubación, se tiñeron a los geles con 0,5% Coomassie G250 (Bio-Rad Richmond CA) en metanol / ácido acético / H_{2}O (30:10:50). Se pudo determinar la intensidad de varias bandas por medio de un densímetro informatizado (Dinámica Molecular tipo 300ª.

Además se ha descubierto que el Halofuginone inhibe la invasión celular por medio de matrigel MEC, al emplear el ensayo Boyden de invasión de cámaras (datos no incluidos). Este tipo de inhibición apoya la inclusión de la inhibición de colagenasa tipo IV como parte del mecanismo de la economía de la matriz extracelular, donde el Halofuginone inhibe los procesos patológicos no deseados tales como el desarrollo, la progresión y la metástasis de tumores, de la forma descrita anteriormente.

Ejemplo 3 Inhibición de la Expresión del Gen Marcador de Tumores por el Halofuninone in vitro

Otro aspecto de la economía de la matriz extracelular la regulación de la expresión del gen marcador de tumores y, en particular, la inhibición de la expresión del gen H19.

El gen H19 es un gen de desarrollo regulado y su expresión tiene su momento más fuerte durante el desarrollo del feto cuando ocurre la diferenciación de los tejidos. El gen H19 está impreso por ambos padres y tiene expresión únicamente en el alelo maternal. El gen H19 es además un marcador de tumores y está relacionado con las primeras fases de los cuerpos malignos como el tumor Wilms, el carcinoma adrenocortical, hepatoblastoma, rabdomiosarcoma, tumores pulmonares, tumores trofoblásticos y carcinoma de la vejiga. El método experimental fue lo siguiente.

Se cultivó líneas de células RT112 y 5376 de carcinoma de la vejiga humana en ausencia y en presencia del Halofuginone (130 ng/ml, añadido 24 horas o 72 horas después de sembrar), y se evaluó la expresión del gen H19 por medio del análisis de mancha Northern Blot (Nagler, A. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., Vol. 17, p. 194-202, 1997). La exposición al Halofuginone resultó en una reducción importante de la expresión del gen H19 en las líneas de células RT112 y 5376 de carcinoma de la vejiga testadas, tal y como se puede apreciar en la Figura 3. Este grado de inhibición apoya la inclusión de la inhibición de la expresión del gen H19 como parte del mecanismo de la economía de la matriz extracelular, de la forma descrita anteriormente.

Ejemplo 4 Inhibición de la Expresión de Integrín

Otro aspecto importante del efecto del Halofuginone y los demás derivativos de quinazolinone en la economía de la matriz extracelular incluye la capacidad de estos compuestos de inhibir la expresión de integrín, tal y como ejemplifica el efecto del compuesto ilustrativo del Halofuginone.

Se ha visto como los integrines pueden funcionar in vivo en la vasculogénesis y angiogénesis. Una inyección de un anticuerpo neutralizador contra la sub-unidad \beta1 bloqueó la formación de un lumen aórtico en embriones de codornices. (Drak, C.J. et al., in vivo. Dev. Dyn. Vol. 193, p.83-91, 1992) Cheresh y sus socios aportan evidencias que \alpha_{v}\beta_{3} es necesario en el crecimiento de los vasos sanguíneos (Brooks, P.C. et al., Science Vol. 193, p.569-571, 1994). Un anticuerpo (LM609) contra el complejo integrín \alpha_{v}\beta_{3} inhibió el crecimiento normal de los vasos y también de la angiogénesis, estimulada por FGF-2 o provocada por tumores, en el ensayo CAM, pero no interrumpió los vasos ya existentes. El mecanismo por medio del cual el anti-\alpha_{v}\beta_{3} mAb interrumpe la angiogénesis parece incluir el apóptosis. Una única inyección intra-vascular de un péptido RGD antagonista de integrín \alpha_{v}\beta_{3}, o del anticuerpo monoclonal LM609 conduce a la regresión rápida de los tumores humanos transplantados al CAM. Las células de tumores que no expresan el gen \alpha_{v}, y por consiguiente el integrín \alpha_{v}\beta_{3}, pierden su capacidad de adhesión y exhiben una tumorigenicidad significadamente reducida al ser transplantadas a ratones atímicamente desnudos. Una transfección estable del \alpha_{v} cADN a estas células resultó en la restauración completa de su potencial tumorigénica (Felding-Habermann, B. et al, J. Clin. Invest., Vol. 89, p.2018-2022, 1992). Además, se ha descubierto que el Halofuginone inhibe la angiogénesis y el crecimiento de tumores.

Por consiguiente, se investigó el efecto del Halofuginone en la expresión de las sub-unidades de integrín \alpha_{v1}\beta_{3} y \beta_{5} en la línea de células altamente agresiva MDA 435 del carcinoma de mama humana. Se cultivaron las células en ausencia (ver Figura 4, columnas A & B) o en presencia del Halofuginone cada vez más concentrado (10-400 ng/ml) durante 24 horas (columna C: 400 ng/ml), 48 horas (columnas D-G: 10, 50, 200 y 400 ng/ml respectivamente) o 72 horas (Figura 4, columna H: 400 ng/ml). Se extrajo el total del ARN para someterlo a electroforesis con gel de 1.1% formaldehído-agaroso, transferirlo a un membrana de nailon e hibridar con una sonda PCR etiquetada ^{32}P, correspondiente a \alpha_{v}. Tal y como se puede apreciar en la Figura 4, la exposición de las células de carcinoma de mama durante 48 horas a 10 y 50 ng/ml del Halofuginone resultó en la regulación positiva del \alpha_{v} mARN (ver Figura 4, columnas D & E). Este efecto fue mínimo en concentraciones más altas (200-400 ng/ml) del Halofuginone (ver Figura 4, columnas F-H). Después se utilizó RT-PCR para analizar el efecto del Halofuginone en la expresión de las cadenas de integrín \beta_{3} y \beta_{5} por el MDA 435 de las células del carcinoma de mama. Tal y como se puede apreciar en la Figura 5, el Halofuginone inhibió la expresión del mARN de manera dependiente de la dosis, y alcanzando una inhibición casi total a 200 ng/ml (ver Figura 5, columna 1: control; columnas 2-5: 24 horas de exposición a 10, 50, 200 y 400 ng/ml del Halofuginone respectivamente). Por contraste, no produjo ningún efecto en la expresión del \beta_{5} mARN. Dado que el complejo integrín \alpha_{v}\beta_{3} tiene un papel importante en el angiogénesis, se puede mediar en parte el efecto anti-angiogénesis del Halofuginone por la inhibición de la expresión del gen \beta_{3}.

Por consiguiente, la inhibición de la expresión de los genes de integrín es claramente otro aspecto de la regulación de la economía de la matriz extracelular por el Halofuginone.

Ejemplo 5 La Inhibición de la Fibrosis Cardiaca

Tal y como se ha apuntado anteriormente, el efecto del compuesto ilustrativo del Halofuginone ejemplifica la capacidad de ciertas moléculas de regular la economía de la matriz extracelular al inhibir las respuestas anormales a las lesiones del tejido y a otros procesos patológicos relacionados de forma mecánica, mientras mantienen los procesos fisiológicos normales. Sin embargo, ninguno de estos resultados enseñó o sugirió la idoneidad de los compuestos que contienen quinazolinone, como por ejemplo el Halofuginone, para tratar la fibrosis cardiaca. Este resultado fue inesperado porque el tejido cardiaco está compuesto por células altamente diferenciadas que deben mantener un alto nivel de organización para poder funcionar de forma eficaz.

Además, el tejido miocardio debe contraerse como una única unidad de respuesta a una señal eléctrica, y esta característica no está asociada con otros tejidos estudiados anteriormente para el tratamiento con el Halofuginone de la fibrosis y otros tipos de lesiones del tejido. Esta característica es específica a los tejidos cardiacos e incrementa el efecto dañino de la fibrosis, dado que el tejido fibrótico no puede contraerse de esta forma. En segundo lugar, el tejido miocardio dañado se contrae de forma errónea, ya que en lugar de iniciar la contracción del corazón en un único punto, seguido por el paso veloz de la potencial a través del tejido del corazón, podrían desarrollarse arritmias en los tejidos dañados en donde surgen muchos de estos puntos, que causarán las contracciones erróneas y eventualmente, la muerte. En tercer lugar, el tejido del corazón debe funcionar como una única unidad. Otros tejidos, como el pulmón y el hígado, están compuestos por distintos tipos de tejidos y estructuras que pueden funcionar más o menos independientemente. Sin embargo, el corazón entero debe funcionar como una única unidad. De esta manera, no se puede enseñar o predecir la restauración de conservación de la función miocárdica por medio del Halofuginone como es debido, bien antes o bien después de comenzar el proceso fibrótico, basándose en los conocimientos anteriores.

Además, se ha demostrado que el Halofuginone es un solamente inhibidor de colágeno tipo I. Sin embargo, la formación del tejido fibrótico del corazón se caracteriza en la deposición de cantidades anormalmente grandes de componentes de la economía de la matriz extracelular. De esta forma, la capacidad del Halofuginone por inhibir la síntesis y deposición del colágeno tipo I, no puede predecir la capacidad del Halofuginone de ralentizar, reducir o mejorar la patogénesis de la fibrosis cardiaca.

Además, tal y como pasamos a detallar, el Halofuginone es capaz de prevenir la fibrosis cardiaca al inhibir la deposición de colágeno tipo I, sin de-regular ni alterar de otra forma la síntesis de TGF\beta (factor transformador de crecimiento), una citoquina que afecta generalmente a la síntesis y deposición de varios componentes MEC. Sin limitarse a un único mecanismo, puede ser que el Halofuginone esté ejercitando su efecto por su influencia sobre la trascripción del colágeno tipo I. De esta forma los efectos del Halofuginone son específicos y restringidos, peor a la vez, son capaces de prevenir la fibrosis cardiaca.

Aunque no se comprende del todo la patogénesis de la fibrosis cardiaca, se ha desarrollado con éxito unos modelos animales para la enfermedad. Se ha provocado la fibrosis cardiaca en ratas por medio de la administración crónica de angiotensín II (Ang II).

Es imprescindible testar los compuestos propuestos para la inhibición de la fibrosis cardiaca en un modelo in vivo, por ejemplo como el modelo Ang II arriba descrito, para comprobar la capacidad de ralentizar o parar el proceso patológico que conduce a la deposición de tejido fibrótico. A continuación pasamos a detallar los experimentos realizados sobre el inhibidor de la síntesis del colágeno tipo I, el Halofuginone.

Un examen histológico de muestras de corazones de ratas del grupo de control y los tratados con Ang II (angiotensín II) descubrió que el Ang II indujo cambios morfológicos específicos en el corazón de la rata, que incluían un incremento en el contenido de fibra de colágeno. El Halofuginone redujo de forma importante la ocurrencia de estos cambios morfológicos, y resultó en un corazón de rata de apariencia más normal.

El método de experimentación fue lo siguiente. Se dividió al grupo de ratas macho tipo Sprague-Dawley en cuatro grupos. Dos grupos recibieron una infusión crónica de Ang II de 0,150 ng/min por medio de una mini-bomba implantada. Este régimen de dosificación provocará la fibrosis cardiaca severa. Los otros dos grupos de ratas, los grupos de control, recibieron una inyección salina. Uno de los grupos de ratas tratadas con Ang II, y uno de los grupos de control recibieron una inyección intra-peritoneal diaria de 16 microgramos del Halofuginone. Al finalizar el período de experimentación se sacrificaron a las ratas y se quitaron el corazón para pesarlo.

Se tomaron muestras de corazones para un examen histológico. En breve, se recogieron a las muestras de tejido en una solución salina con fosfatos añadidos (PBS), y se les fijaron durante la noche en 4% de para-formaldehído en PBS a 4ºC. Se prepararon secciones de 5 \mum en serie después de deshidratar a las muestras en soluciones de etanol gradadas, aclaradas en cioroforma y empotradas en Paraplast. Se tiñeron a las proteínas colagenosas y no-colagenosas para diferenciarlas con 0,1% rojo Sirio y 0,1% verde inalterable como un contra-tinte en ácido pícrico. Este procedimiento tiñe de rojo el colágeno (Gascon-Barre, M., et al., J. Histochem. Cytochem., 37.377-381. 1989).

A continuación se hibridaron las muestras de corazón con una sonda para la expresión de colágeno de rata \alpha1(I), o con una sonda para la expresión de TGF\beta1. Para hibridar una de las sondas genéticas, se limpiaron de parafina a las secciones usando xilene, re-hidratado por medio de una serie gradada de soluciones de etanol, aclarado en agua destilada durante 5 minutos y luego incubado en 2X SSC a 70ºC durante 30 minutos. A continuación se aclararon las secciones en agua destilada y fueron tratadas con pronasa, 0,125 mg/ml en 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7,5, durante 10 minutos. Después de la digestión se aclararon las platinas con agua destilada, pos-fijada en 10% de formalina en PBS y bloqueada en 0,2% glicina. Después del bloqueo, se aclararon las platinas en agua destilada, rápidamente deshidratada por medio de soluciones de etanol gradadas y secadas al aire durante varias horas. Antes de hibridar la material adicional de colágeno \alpha1(I) de rata 1600 bp, fue recortada de la plasmida original, pUC18, e insertada dentro de la plasmida pSafyre. A continuación se hibridaron las secciones y esta sonda después del etiquetado con digoxigenin (M. Pines, et al., Matrix Biology. 14:765-71, 1996). De manera similar, se hibridaron las platinas con una sonda para TGF-\beta1.

La Figura 6 muestra el resultado de la cuantificación de volumen de colágeno de corazón de rata después de pasar una video-densitometría. Se tiñeron a secciones de tejido hepático de rata con rojo Sirio para demostrar el contenido de colágeno del tejido. Se pudo observar un bajo volumen de colágeno en las ratas de control (CON) y en ratas que únicamente recibieron el Halofuginone (HAL). Se pudo observar un alto volumen de colágeno en ratas que únicamente recibieron Ang II (AII), pero una reducción importante en ratas que recibieron tanto Ang II como el Halofuginone (A II + HAL), indicando la capacidad del Halofuginone de inhibir de forma importante el proceso patológico de fibrosis introducido por Ang II. De hecho, la fracción de volumen de colágeno ventricular (CVF) se incrementó por tres (p<0,05) en las ratas tratadas con Ang II, comparado con las ratas tratadas o bien únicamente con el Halofuginone, o bien con el Halofuginone más Ang II. De forma adicional, el CVF ventricular de las ratas de control fue idéntico a él de las ratas tratadas únicamente con el Halofuginone, y de hecho, durante un período de dos semanas, el Halofuginone no alteró el CVF ventricular al administrarlo a solas, sin Ang II. Entonces, el Halofuginone demuestra tener una alta capacidad de prevenir el incremento de CVF ventricular, provocado por Ang II, sin afectar solo al CVF ventricular.

La Figura 7 muestra los resultados de las mediciones de densitometría después de hibridar in situ una sección de tejido de corazón de rata con una sonda de colágeno de rata \alpha1(I). Se puede apreciar una baja expresión del gen de colágeno \alpha1(I) en el tejido del corazón de ratas que únicamente recibieron el Halofuginone (HALO). Se pudo apreciar un incremento marcado en la expresión del gen de colágeno \alpha1(I) en el hígado de las ratas que únicamente recibieron Ang II (AngII). Las ratas que recibieron tanto el Halofuginone como Ang II mostraron una reducción marcada en la expresión del gen de colágeno \alpha1(I) (Ang II + HALO), en comparación con las ratas que únicamente recibieron Ang II. Aunque la dosis de Halofuginone redujo de forma importante la expresión del gen de colágeno \alpha1(I) en las ratas, causada por Ang II, no inhibió la expresión por completo. Sin embargo, la expresión del gen de colágeno \alpha1(I) en las ratas tan reducida indica la eficacia del Halofuginone contra la provocación patológica de expresión por Ang II. De esta forma, el incremento por cinco en el nivel mARN de colágeno tipo I (p< 0,05), provocado por Ang II, fue atenuado por el Halofuginone.

La Figura 8 muestra que, aunque Ang II causó un incremento en la expresión de mARN para TGF P (p<0,05), la administración del Halofuginone no afectó esta mejora. En particular, el nivel de expresión de TGF \beta. fue más alto, de forma importante e igual, en las ratas que recibieron o bien Ang II (Ang II) o Ang II más el Halofuginone (Ang II + HALO), que en las ratas que únicamente recibieron el Halofuginone (HALO). De esta forma, el Halofuginone no parece inhibir los procesos de síntesis y deposición de la matriz extra-celular, controlados por TGF \beta.

Entonces, el Halofuginone es capaz de prevenir la fibrosis cardiaca al inhibir la deposición del colágeno tipo I, sin alterar la síntesis de TGF \beta, una citoquina que afecta a la síntesis y deposición de varios componentes MEC. Los efectos del Halofuginone parecen ser específicos a un aspecto en particular de la trayectoria de la síntesis de la matriz extra-celular; algo que ni se enseña ni se sugiere en los conocimientos actuales. Entonces, parece que lo específico del Halofuginone se dirige hacia un mecanismo particular de la síntesis y deposición del colágeno, un mecanismo que parece no estar controlado por TGF \beta.

Sobre todo, el Halofuginone pudo prevenir la aparición de los efectos de la fibrosis provocada por el Ang II en todos los niveles, incluido una reducción importante de los cambios morfológicos brutos y finos causados por la fibrosis provocada por el Ang II. Obviamente, los efectos del Halofuginone son tanto potentes como específicos en la prevención de los cambios morfológicos provocados durante el proceso patológico de la fibrosis cardiaca.

\newpage

Ejemplo 6 Co-Regulación de los Genes Múltiples con Halofuginone

Tal y como pasamos a detallar, el Halofuginone se ha mostrado, de forma inesperada, eficaz en la co-regulación de genes múltiples, cuya actividad no se consideró co-regulada previamente. Esta co-regulación es específica, en que ciertos genes, conocidos como potencialmente relacionados a los genes regulados en otros sistemas, no están co-regulados por el Halofuginone. Además, este tipo de co-regulación tan específica indica de manera clara que existe un mecanismo fundamental y común a todos estos efectos de los derivados de quinazolinone, como el Halofuginone.

En particular, los resultados de experimentos demuestran que el Halofuginone causa varios efectos considerados previamente como no-relacionados, que incluyen la disminución en la expresión del colágeno tipo I, en especial al inhibir la expresión del gen de colágeno \alpha1(I); inhibir la producción del colágeno tipo IV; inhibir la expresión del gen H19; disminuir la expresión del gen HSP47 en paralelo a la inhibición de la expresión del gen de colágeno \alpha1(I); disminuir la liberación de las citoquinas IL-1\beta y TNF\alpha, mientras inhibe la expresión de NF-\kappaB; pero sin afectar la expresión de TGF \beta.

Tal y como se ha descrito anteriormente de forma detallada, el Halofuginone parece causar un número de efectos inhibidores relacionados sobre la expresión de estos genes. Por ejemplo, se ha demostrado que el Halofuginone de-regula la expresión de HSP47, un acompañante molecular específico para el colágeno, en paralelo a la inhibición de la expresión de colágeno tipo I. Por otra parte, se descubrió un incremento en la expresión de HSP47 durante la progresión de la fibrosis hepática provocada por la administración de tetracloro de carbón a ratas, y, además en paralelo al incremento de expresión de colágeno tipo I, de forma que la inhibición paralela de la expresión de HSP47 y la expresión de colágeno tipo I por el Halofuginone podría indicar un aspecto del mecanismo de acuerdo con el cual el Halofuginone afecta un número de procesos relacionados con la síntesis y deposición patológica del colágeno y otros componentes de MEC dentro del estado de enfermedades fibróticas.

Además, se mostró de forma clara que el Halofuginone inhibe la expresión de NF-\kappaB (factor nuclear \kappaB), y en paralelo a la inhibición de la expresión de HSP47 y la expresión del colágeno. Se demostró que NF-\kappaB puede ser provocado por medio de un gran número de factores, como el IL-1\beta (interleuquin-1\beta) y el factor \alpha de la necrosis de tumores (TNF \alpha) (Mercurio and Manning, Curr. Op. In Cell Biol., 11.226-232, 1999), los cuales estaban entre los factores específicos también inhibidos por Halofuginone en los actuales experimentos.

De esta manera, los efectos aparentes del Halofuginone, en cuanto a TNF \alpha y NF-\kappaB, pero no a TGF \beta, podrían permitir eventualmente al Halofuginone tener los efectos deseados sobre los procesos patológicos de la fibrosis, sin, y de forma importante, inhibir de manera negativa o de-regular la economía de la matriz extracelular fisiológicamente normal y deseable.

Inhibición de Procesos Bioquímicos

Se puede apreciar detallada en la siguiente Tabla 1 la capacidad del Halofuginone de inhibir varios procesos bioquímicos de acuerdo con un conjunto de ensayos para determinar el porcentaje de inhibición de la aglomerante o actividad específica de algunas proteínas celulares en particular. Los ensayos fueron realizados por MDS Pathlabs Inc., (Bothell, Wisconsin, EEUU). Estos ensayos incluyeron: la inhibición de la liberación de las citoquinas IL-1\beta y TNF\alpha y la inhibición de la trascripción de NF-\kappaB. Los resultados fueron los siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

Ensayo Primaria	IC_{50}
liberación de citoquina IL-1\beta	31,7 nM
liberación de citoquina TNF\alpha	6,8 nM
trascripción de NF-\kappaB	25,0 nM

De esta forma los resultados demuestran claramente la constelación de efectos inhibidores del Halofuginone, tal y como se ha descrito anteriormente. Además, estos resultados demuestran un efecto potente y significativo del Halofuginone en estas funciones específicas, mientras que otras funciones ensayadas con el Halofuginone apenas demostraron efectos de interés (datos no mostrados).

Investigación sobre los Cambios en la Expresión de Genes con el Halofuginone

Tal y como pasamos a detallar, se investigó el efecto del Halofuginone en la expresión de genes múltiples, usando los Atlas cDNA Ensayo de Expresión (Clontech Ltd.), que permiten la investigación simultánea de un gran número de genes. Se puede apreciar los resultados de los ensayos funcionales de Atlas en la Tabla 2 (de-regulación de los genes después del tratamiento con el Halofuginone), y en las Tablas 3 (re-regulación de genes después del tratamiento con el Halofuginone) y 4 (de-regulación de los genes después del tratamiento con el Halofuginone) para los ensayos de Atlas de interacción humana. El método experimental fue lo siguiente:

Se usó el Atlas Ensayo de Expresión de cDNA Humano, número de catálogo 7740-1. El Atlas Ensayo de Expresión de cDNA Humano incluye 588 cADNs humanos colocados por duplicado sobre una membrana de nailon cargada positivamente, nueve cADNs de control para normalizar la abundancia de mARN, y ADNs plásmidos y bacteriófagos, incluidos como controles negativos para confirmar lo específico para hibridar. Se representan y organizan a los ADNs en varias clases funcionales distintas, que incluyen los factores de trascripción, citoquinas, oncogenes y genes que suprimen los tumores. Los ADNs inmovilizados en cada ensayo de Altas han sido preparados de manera que minimizan el problema de formar híbridos no específicos. Cada fragmento de cADN tiene de 200 a 600 bp y ha sido amplificado desde una región del trascripto que falta la cola poli-A, elementos repetitivos u otras secuencias altamente homólogas. Además se utilizó una Plantilla de Orientación transparente para permitir la identificación de los cDNAs que corresponden a las señales positivas para hibridar.

En primer lugar se trascribió al revés a 1 \mug de cada población de ADN, al utilizar los re-agentes provistos y [\alpha^{-32}P]dATP. Durante la noche se hibridó por separado cada sonda de cADN complejo, etiquetado por radioactividad, a los Ensayo de Atlas, usando una solución para hibridar ExpressHyb también proporcionada. Después de un lavado riguroso, se analizó el patrón de hibridar por medio de la auto-radiografía y/o se lo cuantificó por medio de la fósforo- imagen, tal y como pasamos a detallar a continuación. Se asesoraron a los niveles relativos de expresión de un dado cADN en dos fuentes de ARN diferentes, al comparar la señal obtenido con una sonda de una fuente de ARN a la señal obtenida con una sonda de otra fuente.

Se preparó el total de ARN a partir de los fibroblastos humanos primarios. Se cultivaron a células en platos de cultivos de 15 mm en presencia de 10% FCS en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) medio de cultivo. A una confluencia de más o menos 70-90%, se trataron a las células con 10^{-8} M Halofuginone durante 1 hora. Se sujetó tanto a las células tratadas como a las células sin tratar a una preparación total de ARN, usando SV Total ARN Isolation System (sistema de aislamiento SV de ARN total) (Promega, número de catálogo Z3100) o Tri Reagent (Molecular Research Center, Inc., número de catálogo TR-118).

De acuerdo con el protocolo de Promega, se añadió 2 ml de mantequilla de lisis a cada plato de 15 mm, donde se recogieron a las células lisis con la ayuda de la punta de un micro-liter de 200-1000 y fueron transferidas al plato siguiente hasta que las células de todos los platos hubieron sido liseados y recogidos. Entonces se trasfirió el lisato a las probetas micro-centrifugas, con 175 \mul de lisato por probeta, con un total de 10 probetas por cada uno de los 5 platos. Se añadió 350 \mul de SV ARN Amortiguador en Dilución (Dilution Buffer) a cada 175 \mul de lisate celular, y se mezcló la solución invirtiendo la probeta 3 o 4 veces. Después de un período de 3 minutos de incubación a 70ºC se centrifugaron los lisates a 11.000 g durante 10 minutos a R.T.

Para cada una de las muestras se preparó un Conjunto de Columnas de Centrifugar. Cada Conjunto de Columnas de Centrifugar está formado por una Cesta de Centrifugar y una Probeta de Colección. Se quitaron las tapas de las Cestas de Centrifugar y etiquetaron a las Probetas de Colección para luego colocarlas en un atril para probetas micro-centrifugas. Se transfirió el lisate aclarado a probetas micro-centrifugas limpias, sin remover las deyecciones. Se añadió 200 \mul de etanol de 95% a cada probeta de lisate y lo mezcló 3 o 4 veces por medio de una pipeta. Entonces se transfirió la mezcla al Conjunto de Columnas de Centrifugar y la centrifugó a 11,000 g durante 1 minuto a R.T.

Se sacó la Cesta de Centrifugar del Conjunto de Columnas de Centrifugar y se desechó el líquido de la Probeta de Colección. Entonces se devolvió la Cesta de Centrifugar a la Probeta de Colección y se añadió 600 \mul de SV ARN Solución de Limpieza (Wash Solution) al Conjunto de Columnas de Centrifugar, para luego centrifugar a las columnas a 11,00 g durante 1 minuto. Se vació la Probeta de Colección de la forma anteriormente descrita, y fue colocada en un atril. Para realizar cada aislamiento, se preparó una mezcla de incubación DNasc al combinar 40 \mul de Amortiguador de Núcleo Amarillo (Yellow Core Buffer), 5 \mul de 0,09 M MnCl_{2} y 5 \mul de la enzima DNase I por cada muestra en una probeta estéril (en este orden). Gradualmente se mezcló la mezcla de incubación por medio de una pipeta (y no una vórtice) y la guardó en hielo. Nada más terminarla, se aplicó 50 \mul de la mezcla de incubación DNase directamente sobre la membrana dentro de la Cesta de Centrifugar, asegurándose que la solución estuviese en contacto con, y cubriendo totalmente la membrana. Después del período de incubación de 15 minutos a R.T., se añadió 200 \mul de SV DNase Solución Parador (Stop Solution) a la Cesta de Centrifugar para centrifugarla a 11,000 g durante 1 minuto. Se añadió 600 \mul de SV ARN Solución de Limpieza (Wash Solution), para luego centrifugarla a 11,00 g durante 1 minuto. Se vació la Probeta de Colección, se añadió 250 \mul de SV ARN Solución de Limpieza (Wash Solution), para luego centrifugar fuertemente a 11,000 g durante 2 minutos.

Para cada una de las muestras se preparó una Probeta de Limpieza; se transfirió la Cesta de Centrifugar desde la Probeta de Colección hasta la Probeta de Limpieza y se añadió 100 \mul de Agua Libre de Nucleasa a la membrana, cubriendo completamente la superficie de la membrana con agua. Los Conjuntos de Cestas de Centrifugar fueron colocados para centrifugar con las tapas de las Probetas de Limpieza hacia fuera, y centrifugados a 11,000 g durante un minuto. Se quitó la Cesta de Centrifugar y se la desechó.

De acuerdo con el Procedimiento Tri Reagent, se trataron a las células con lisate directamente en las platinas de cultivo. Se añadió 1 ml de Tri Reagent a cada platina y se pasó el lisate celular varias veces por una pipeta. Se recogieron grupos de 5 platinas (tratadas y no tratadas). Se almacenaron a los homogenates a R.T. durante 5 minutos para permitir la disociación completa de los complejos núcleo-proteínas. Se suplementaron a los homogenates con 0,2 ml de cloroforma por cada 1 ml de Tri Reagent, y se agitaron vigorosamente las muestras durante 15 segundos. La mezcla resultante fue incubada a R.T. durante 15 minutos y centrifugada a 12,000 g durante 15 minutos a 40ºC. Después de la centrifugación, se separó a la mezcla en una fase fenocloroforma de rojo bajo, una entre-fase, y la fase incolora ácueo bajo que contiene el ARN. Se transfirió la fase ácuea a una probeta limpia, y se precipitó el ARN al introducir 0,5 ml de isopropanel por cada 1 ml de Tri Reagent usado en los pasos iniciales.

Se incubaron a las muestras a R.T. durante 10 minutos, y las centrifugaron a 12.000 g durante 8 minutos a 40ºC. Se desechó el sobrenadante y se lavó el grano de ARN con etanol de 75% (al menos 1 ml por Tri Reagent usado inicialmente) en un vórtice y luego en una centrifugación a 7,500 g durante 5 minutos a 40ºC. El ARN resultante fue secado al aire y suspendido de nuevo en agua.

Se determinó la cosecha total de ARN obtenido por medio de un espectrofotómetro a 260 nm, donde 1 unidad de absorción (A260) es igual a 40 \mug de ARN/ml de hebra única. La integridad del ARN purificado fue determinada también por medio de la electroforesis con agarosa gel, donde la ratio de 28S a 18S de ARNs eucariótico ribosoma debería ser aproximadamente 2:1 por mancha de etidio bromuro, que indica que no ha ocurrido una degradación importante del ARN.

La contaminación por ADN geonómico es especialmente molesta. Por esta razón se trataron a todos las muestras de ARN con DNase I ARNse-libre, antes de utilizarlas como sondas. Se combinaron los siguientes re-agentes para cada muestra:

500 \mul Total ARN (0,5 \mug)

100 \mul 10x DNase I Amortiguador (400 mM Tris-HCl pH7,5; 100 mM NaCl; 60 mM MgCl_{2})

50 \mul DNase I (RQ1 DNase ARNse-libre, Promega. Número de catálogo M6101; sin diluir; 1 unidad/\mul)

395 \mul H_{2}O Desionizado

Se mezcló bien la solución por medio de subir y bajarlo en pipetas varias veces. La mezclas reactivas fueron incubadas a 37ºC durante 1 hora en un baño de agua seguido de la adición de 100 \mul de 10X Mezcla de Terminación (Termination Mix)(0,1 M EDTA (pH 8,0); 1 ng/ml glicógeno (tipo IX de hígado bovino, Sigma, Número de Catálogo G0885)) y mezcladas al subir y bajarlas en pipetas varias veces.

Se dividió a cada reacción en dos probetas micro-centrifugas de 1,5-ml (550 \mul por probeta) y se añadió 550 \mul de fenol: cloroforma: isoamilalcohol (25:24:1) a cada probeta y se sometieron a las mezclas a un vórtice y un centrifugado en un micro-centrifugo a 14.000 rpm durante 10 minutos para separar las fases. Con cuidado se transfirió la capa superior acuosa a una probeta micro-centrifuga limpia de 1,5-ml, mientras se desecharon la interfaz y la fase inferior. Después de repetir esta extracción con la fase acuosa obtenida, se añadió 550 \mul de una mezcla de cloroforma: isoamilalcohol (24:1) a la capa acuosa final, seguido por un paso energético por el vórtice. Se centrifugaron a las probetas a 11,000 g durante 10 minutos para separar las fases, y se quitó la capa superior acuosa resultante para transferirla a una probeta micro-centrifuga de 2,0 ml. Se añadió 1/5 de volumen (100 \mul) de 7,5 M NH_{4}OAc y 2,5 volúmenes (1,5 \mul) de etanol de 96% y se sometieron a las mezclas a un vórtice y un centrifugado a 14.000 rpm durante 20 minutos. Se quitó el sobrenadante con cuidado y se cubrió al grano con 100 \mul de etanol de 80%, para luego centrifugarlo a 14.000 rpm durante 10 minutos. Después de quitar el sobrenadante, se secó al grano durante unos 10 minutos para hacer evaporar el etanol residuo. El grano fue disuelto en 250 \mul de H_{2}O desionizado, se combinaron las dos probetas idénticas y se sometió el ARN a un proceso de purificación oligo (dT) de poli A+ARN.

El ARN total fue sometido al aislamiento poli A+ARN al emplear los Sistemas de Aislamiento III PoliATract mARN de Promega (número de catálogo Z5300). Se incubó 500 \mul volumen del total ARN en un baño de agua a 65ºC durante 10 minutos. Se añadió 3 \mul de la Sonda Oligo (dT) Biotinilatada y 13 \mul de 20X SSC al ARN, entonces fueron mezclados suavemente e incubados a R.T. hasta enfriarse totalmente (aproximadamente 10 minutos). Se volvieron a suspender las Partículas de Streptavidin-Paramagnético (SA-PMPs) (una probeta por muestra de ARN) al tocar suavemente la parte inferior de la probeta hasta que quedaron completamente disueltas, para entonces capturarlas al colocar la probeta en el Atril Magnético hasta recoger todos los SA-PMPs en el lateral de la probeta (aproximadamente 30 segundos). Se quitó el sobrenadante y se lavaron a los SA-PMPs tres veces con 0,5x SSC (0,3 ml por lavado), y cada vez fueron capturados por medio del Atril Magnético, y luego se quitó el sobrenadante con cuidado. Se volvieron a suspender a los SA-PMPs lavados en 0,1 ml de 0,5x SSC.

El contenido total de la reacción de fusión fue añadido a la probeta que contenía los SA-PMPs lavados, y se incubó la mezcla a R.T. durante 10 minutos (se mezcló la mezcla de forma suave al invertir la probeta cada 1 o 2 minutos) y se capturaron a los SA-PMPs empleando el Atril Magnético y se quitó el sobrenadante cuidadosamente sin remover el grano de SA-PMP. Se lavaron a las partículas cuatro veces con 0,1x SSC (0,3 ml por lavado) al tocar suavemente la parte inferior de la probeta hasta que quedaron de nuevo en suspensión. Después del lavado final se hizo hincapié en quitar toda la fase acuosa posible sin remover las partículas de SA-PMP. Para limpiar el mARN, se volvió a suspender el último grano en 0,1 ml de Agua ARNse libre, y se volvieron a suspender las partículas al tocar suavemente la parte inferior de la probeta. Se capturaron a los SA-PMPs de forma magnética y la fase acuosa de mARN limpio fue transferida a una probeta limpia.

Se repitió al procedimiento de limpieza al volver a suspender el grano de SA-PMP en 0,15 de Agua ARNse libre, donde las partículas fueron capturadas y el mARN limpio fue incorporado en el mARN limpio del paso anterior. Para poder quitar cualquier partícula restante, se centrifugó al mARN limpio a 10.000 g durante 10 minutos, y el mARN fue transferido con cuidado a una probeta limpia.

Se determinaron la concentración y la pureza del mARN limpio por medio de un espectrofotómetro, tal y como se ha descrito anteriormente.

Para poder preparar las sondas cADN, el cADN fue sintetizado de poli A+ ARN, 1 \mu de Poli A+ ARN fue sujeto a una síntesis de cADN utilizando los ingredientes de Ensayo de Expresión (Ensayo de Expresión) de cADN Clontech Atlas. Se preparó una Mezcla Magistral para etiquetar a todas las reacciones:

5x Amortiguador de Reacción 2,0 \mul

10x dNTP Mezcla (para la etiqueta dATP) 1,0 \mul

(\mu-32P) dATP (3.000 Ci/mmol; 10 mCi/ml; Amersham(PB10204) 3,5 \mul

DTT (100 mM) 0,5 \mul

MMLV Transcriptase Inverso (50 unidades/\mul) 1,0 \mul

Para cada reacción se añadió 8,0 \mul de la Mezcla Magistral. Se precalentó el ciclador termal PCR (T3 Thermocycler, Biometra) hasta 70ºC. Se combinaron los siguientes ingredientes para cada poli A+ ARN experimental y el Poli A+ ARN de control en una probeta PCR de 0,2 ml (Tamar, número de catálogo 431M):

Poli A+ ARN muestra	1 \mug (2 \mul)
10x CDS Mezcla Imprimador	1 \mul

Se mezclaron las probetas en el vórtice, y les centrifugaron brevemente en el micro-centrifugador. Se incubaron a las probetas en el ciclador termal PCR precalentado a 70ºC durante 2 minutos, y después se las incubaron durante 2 minutos a 50ºC. 8 \mul de la Mezcla Magistral fue añadido a cada probeta de reacción (haciendo hincapié en no quitar las muestras de ARN del ciclador termal para más tiempo que lo necesario para añadir la Mezcla Magistral), se mezcló suavemente el contenido de las probetas por medio de pipetas, y fue devuelto al ciclador termal inmediatamente después. Se incubaron las probetas en el ciclador termal PCR a 50ºC durante 25 minutos, y la reacción fue terminada al añadir 1 \mul of 10x Mezcla de Terminación (0,1 M EDTA pH 8,0; 1,0 mg/ml Glicógeno [tipo IX del hígado bovino; Sigma]).

Para poder purificar el cADN etiquetado- ^{32}P de los nucleótidos etiquetados- ^{32}P no-incorporados y los fragmentos pequeños, se sujetó a cada probeta de reacción al siguiente procedimiento: para cada reacción se quitó a una columna CROMA SPIN-200 DEPC-H_{2}O para volver a suspender la matriz de gel completamente. (En caso de producirse burbujas de aire en la columna de la matriz, se invirtió de nuevo a la columna). Se quitó la tapa inferior de la columna y después se quitó lentamente la tapa superior. Se colocó la columna en un refrigerador de probetas micro-centrifugas de 1,5-ml, y se la dejó calentarse a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. Se invirtió la columna para permitir el drenaje del fluido de toda la columna hasta poder visionar la superficie de los glóbulos de gel en la columna de la matriz. La parte superior de la columna de la matriz debe de ser 1,0 ml. Se desechó al fluido recogido y se aplicó la muestra al centro de la superficie plana del lecho del gel de forma cuidadosa y lenta, antes de permitir que el lecho de resina absorbió completamente a la muestra, y proceder al siguiente paso.

Se aplicó 40 \mul de H_{2}O desionizado a la columna y se permitió el drenaje de este fluido de toda la columna antes de desecharlo. Se aplicó 250 \mul de H_{2}O desionizado a la columna y se permitió el drenaje de este fluido de toda la columna hasta no quedar nada de líquido encima del lecho del gel antes de desecharlo.

Se recogieron cuatro fracciones de la siguiente manera. Se transfirió a la columna a una probeta micro-centrifuga de 1,5-ml limpia; se añadió 100 \mul de H_{2}O desionizado a la columna y se permitió el drenaje total de este fluido de toda la columna. Se repitió el proceso cuatro veces. Se comprobó la incorporación a la sonda de ^{32}P empleando el método Cherenkov de contar por cintilación, al contar la muestra entera en el canal de tritio sin añadir el cóctel de cintilación a la probeta.

Se realizó el procedimiento de hibridar de la siguiente forma; primero se realizó una prueba para hibridar una membrana en blanco. Antes de hibridar las sondas preparadas de cADN etiquetado- ^{32}P con el Ensayo de Atlas, se comprobó la calidad de cada sonda cADN experimental al hibridar la membrana de nailon (en blanco) dispuesta como control. Esto permitió una estimación del nivel de fondo no-específico resultante de las impurezas en las muestras de ARN.

La membrana de nailon estaba almacenada a -20ºC, y se la mantuvo húmeda a lo largo del proceso. Se precalentó 15 ml de la solución ExpressHyb a 68ºC, y entonces se calentaron 1,5 mg de ADN de testes de salmón cortados (10 mg/ml; Sigma #D-7656) a 95-100ºC durante 5 minutos, para luego enfriarlo rápidamente sobre hielos. Se mezclaron al ADN desnaturalizado de testes de salmón cortados junto con el ExpressHyb precalentado, y la mezcla fue guardada a 68ºC hasta utilizarla.

Se humedeció al Ensayo de Atlas con H_{2}O desionizado y el exceso sacudido, antes de colocar al Ensayo de Atlas dentro de 10 ml de una solución previamente preparada de hibridar. Se realizó el proceso previo para hibridar durante 30 minutos a 68ºC con agitación continua.

Se mezcló la totalidad de sonda de cADN etiquetado (aproximadamente 200 \mul, 2 y 4-10 x 10^{6} cpm, para blancos y Ensayo de Atlas respectivamente) con 1/10ª del volumen total de reacción de 10x solución desnaturalizante (1 M NaOH, 10 mM EDTA) y se lo incubó a 68ºC durante 20 minutos. Entonces se añadió 5 \mul (1 \mug/\mul) de Cot-1 ADN y un volumen igual (aproximadamente 225 \mul) de 2x solución neutralizante (1 M NaH_{2}PO4 [pH 7,0]) y la incubación continuó a 68ºC durante 10 minutos.

Se añadió la mezcla radioactiva al 5 ml restante de la solución ExpressHyb; se vació la solución previamente preparada de hibridar y se introdujo la solución para hibridar. La formación de híbridos ocurrió durante la noche a 68ºC con agitación continua.

Se precalentaron las soluciones 1 (2x SSC; 1% SDS) Y 2 (0,1xSSC; 0,5%SDS) a 68ºC. Con cuidado se quitó la solución para hibridar, y se lavó el Ensayo de Atlas con 200 ml de solución 1 durante 30 minutos a 68ºC con agitación continua. Se repitió este paso cuatro veces. También se realizaron dos lavados adicionales de 30 minutos con la solución 2.

Se quitó el Ensayo de Atlas del contenedor y se sacudió el exceso de solución sin permitir que la membrana se secara. Inmediatamente se envolvió a la membrana en un envoltorio de plástico, y se expuso al Ensayo de Atlas a una película de rayos-x a -70ºC con una pantalla intensificadora durante 3 días.

Después de revelar la película, se quitaron las sondas de cADN del Ensayo de Atlas, y se volvió a utilizar la membrana. Se calentó una solución, hasta hacerla hervir, de 0,5% SDS, el Ensayo de Atlas fue desforrado del envoltorio de plástico y la membrana fue inmediatamente colocada dentro de la solución hirviendo durante 10 minutos. Se quitó la solución de la fuente de calor para permitirla enfriarse durante 10 minutos. Se comprobó la eficacia del desforro al exponerlo a una película de rayos-x, y se repitió el procedimiento de desforro hasta no detectar ningún rastro de radioactividad.

Se agruparon a los genes en el Ensayo de Atlas en varias clases funcionales:

A) Oncogenes; genes Supresores de Tumores; Proteínas de Control del Ciclo Celular.

B) Proteínas de Respuesta del Estrés; Proteínas para Canalizar y Transportar Iones; Moduladores y Efectores de Transducción de Señales Intercelulares.

C) Genes de Apóptosis; Síntesis de ADN. Genes de Reparación y Recombinación.

D) Factores de Trascripción, Proteínas Generales para Aglutinar el ADN.

E) Receptores: Factores de Crecimiento y Quemoquines, Interleucinas e Interferones. Hormonas, Neurotransmisores; Antígenes de Superficie Celular; Proteínas de Adhesión Celular.

F) Proteínas de Comunicación Célula a Célula: Factores de Crecimiento, Citoquinas y Quemoquines; Interleucinas e Interferones; Hormonas.

G) Genes de Mantenimiento

Controles Negativos: G2-4: 9-11:16-18

Puntos en Blanco: G1, 8, 15.

Tanto los controles negativos como los puntos en blanco se comportaron de la manera prevista al hibridar. Después de 3 días de exposición, se compararon los dos Ensayo de Atlas idénticos que habían hibridado las dos sondas diferentes, y se recogieron los genes que demostraron distintas intensidades de expresión entre los dos, para una investigación más exhaustiva.

TABLA 2

De-regulación de los genes después de tratamiento con Halofuginone
Gen	Efecto del Halofuginone
Proteína RAS-relacionado RAB-5ª	- -
Apópain (cistein proteasa CPP32 isoforma alfa)	-
Apópain (cistein proteasa Mch2 isoforma beta)	- -
MULT Proteína Homóloga	- -
UV Proteína de Reparación de Escisiones RAD23	- -
Factor Nuclear NF90	- - -
Proteína Homeobox HOX-D3	- -
Gliceraldehído 3-Fosfato Deshidrogenase (G3PDH)	- - - - -

\vskip1.000000\baselineskip

La regulación de genes de interacción de células humanas después de tratamiento con Halofuginone

Se empleó el mismo protocolo que anteriormente. Se trataron a fibroblastos humanos primarios durante 1 hora con 10^{-8} M Halofuginone. Previamente se testó el Halofuginone al nivel de ARN y se encontró una reducción del colágeno \alpha1(I)mARN después de tratamiento con el Halofuginone. Se prepararon sondas de cADN a raíz de mARN proveniente de células tratadas o no tratadas con el Halofuginone e hibridado contra el Atlas Ensayo de Expresión de cDNA Humano de Clontech: Ensayo de Atlas de Interacción de Células Humanas, número de catálogo 7746-1. Los ensayos incluyen 265 genes conocidos por su papel el varios tipos de interacción celular. Después de la hibridación se compararon las dos membranas y se recogieron los genes que demostraron distintas intensidades de expresión entre los dos, para una investigación más exhaustiva.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

Re-regulación de genes de interacción humana después de tratamiento con Halofuginone
Gen	Efecto del Halofuginone
Receptor de Laminin	+++
IGFBP6	+
Integrín alfa 3	+
TIMP-1	++
TIMP-2	++
CD59	++
Nucleoside Difosfato Quinase B	++
Proteína Transformadora RHOA	++

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4

De-regulación de genes de interacción humana después de tratamiento con Halofuginone
Gen	Efecto del Halofuginone
G3PDH	- - - - -
23 kDA proteína altamente básica	- -
CD9	- -
Wnt-13	- -
Caveolin - 1	- -
rhoG	- - -

\vskip1.000000\baselineskip

Se puede apreciar al estudiar estos resultados experimentales que el Halofuginone claramente altera la regulación de un número de genes diferentes, y por consiguiente afecta la economía de la matriz extracelular en cuanto a un gran número de productos genéticos diferentes. Sin embargo, muchos de estos efectos en genes diferentes son supuestamente secundarios al mecanismo de acción principal del Halofuginone y las moléculas relacionadas de este tipo, incluyendo la inhibición de la expresión del gen de colágeno \alpha1(I); inhibir la producción de colagenasa tipo IV; inhibir la expresión del gen H19; disminuir la liberación de las citoquinas IL-1\beta y TNF\alpha, mientras inhibe la trascripción de NF-\kappaB; y sin afectar la expresión de TGF \beta.

De esta forma, los efectos aparentes del Halofuginone en cuanto a TNF\alpha y NF-\kappaB, pero no a TGF \beta, podría permitir al Halofuginone ejercer los efectos inhibitorios deseados sobre los procesos patológicos de la fibrosis, de forma importante pero sin inhibir de manera negativa, ni de-regular la economía de la matriz extracelular fisiológicamente normal y deseada.

Ejemplo 7 Efectores para Regular la economía de la matriz extracelular

Tal y como se ha demostrado de forma clara anteriormente, se puede regular la economía de la matriz extracelular por medio del Halofuginone y otros efectores en varios puntos de intervención. Estos puntos de intervención permiten una inhibición selectiva de los procesos patológicos asociados con las lesiones del tejido, y otros procesos relacionados de forma mecánica, mientras se mantiene una actividad mayoritariamente normal en los procesos fisiológicamente deseables. Tal y como se apuntó anteriormente, el término "procesos relacionados de forma mecánica" se refiere a aquellas condiciones patológicas que comparten al menos un mecanismo fundamental con respuestas anormales a las lesiones del tejido. Por ejemplo, el crecimiento y la metástasis de las células malignas cancerígenas pueden ser un ejemplo de un proceso relacionado de forma mecánica.

El mecanismo de acción fundamental del Halofuginone en la inhibición de todos estos procesos patológicos incluye la inhibición de la síntesis del colágeno tipo I al nivel molecular, en especial al promocionar la actividad cKrox y, de esta manera, inhibir la expresión del gen de expresión de colágeno \alpha1(I), y también al disminuir la expresión del gen HSP47 en paralelo a la inhibición de la expresión del gen de colágeno \alpha1(I): disminuir la liberación de las citoquinas IL-1\beta y TNF\alpha, mientras inhibe la trascripción de NF-\kappaB; y sin afectar la expresión de TGF \beta. El término "promocionar la actividad cKrox" incluye, pero no de forma limitada, la re-regulación de la expresión del gen cKrox y una mejora en la actividad de la proteína o las proteínas cKrox.

Otros objetivos moleculares potenciales del Halofuginone incluyen la inhibición de la producción de la colagenasa tipo IV y la inhibición de la expresión del gen H19, junto con la regulación global de la deposición y remodelación del MEC (matriz extra-celular), y la inhibición de neo-angiogénesis. Otros mecanismos de la "economía matriz extra-celular" incluyen la inducción de apóptosis y la inhibición de la expresión del gen H19. Claramente, al ilustrar estos mecanismos y la regulación selectiva global de la economía de la matriz extracelular se puede demostrar algunos métodos novedosos y no-obvios para la intervención terapéutica hasta ahora desconocidos por la profesión.

Por consiguiente, el presente invento está pensado para incluir métodos y composiciones para la regulación de la economía de la matriz extracelular, y en especial para la promoción de la actividad cKrox y para la inhibición del gen HSP47 en paralelo a la inhibición de la expresión del gen de colágeno \alpha1(I): la disminución en la liberación de las citoquinas IL-1\beta y TNF\alpha, junto con la inhibición de la trascripción de NF-\kappaB; pero sin afectar en gran medida la expresión de TGF \beta.

Estos métodos y composiciones incluyen la administración de un efector a un sujeto. El término "efector" usado en este escrito se refiere en gran medida a cualquier compuesto químico o combinación del mismo capaz de regular la economía de la matriz extracelular de la forma anteriormente descrita. Preferiblemente, el efector será capaz de promocionar la actividad cKrox. De manera preferible esta promoción sería causada por mejorar la expresión del gen cKrox. De forma alternativa y preferible, el efector será capaz de inhibir el gen HSP47 en paralelo a la inhibición de la expresión del gen de colágeno \alpha1(I); disminuir la liberación de las citoquinas IL-1\beta y TNF\alpha, e inhibir la trascripción de NF-\kappaB; pero sin afectar la expresión de TGF \beta. Sería preferible que el efector pudiese promover esta constelación de efectos como un conjunto.

En las variantes preferidas de las composiciones del presente invento, estas composiciones incluyen un derivado del quinazolinone como efector. En otras variantes preferidas del presente invento, estas composiciones incluyen el Halofuginone como efector.

El efector del presente invento puede ser administrado al sujeto de varias maneras, bien conocidas por la profesión. De aquí en adelante, el término "sujeto" se refiere al humano o animal inferior a quien se administró el efector. Por ejemplo, se puede administrarlo por vía tópica (incluido oftálmicamente, por la vagina, por el recto, o por la nariz), oralmente o por medio de un agente, por ejemplo por un suero intravenoso o una inyección intra-peritoneal, subcutánea o intramuscular.

\newpage

Las formulaciones para la administración tópica pueden incluir, pero no de forma limitada, lociones, ungüentos, geles, cremas, supositorios, gotas, líquidos, esprays y polvos. Pueden resultar necesario o deseable el uso de los portadores farmacéuticos convencionales como las bases acuosas, aceitosas o en polvo, espesantes y similares.

Las composiciones aptas para la administración oral incluyen los polvos o gránulos, las suspensiones o soluciones en agua o medios no-acuosos, sobres, cápsulas o pastillas. Pueden resultar deseable el uso de los espesantes, diluyentes, condimentos, elementos que ayudan a la dispersión, emulsores o aglomerantes.

Las formulaciones para la administración por medio de un agente pueden incluir las soluciones acuosas estériles que pueden contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos indicados.

La dosis depende de la severidad de los síntomas y de la respuesta del sujeto al efector. Los profesionales versados podrán determinar fácilmente la dosis óptima, metodología de dosificación e índice de repetición.

El siguiente ejemplo es únicamente una ilustración de un método de regular la economía extra-celular por medio de un efector, como el Halofuginone, para tratar una condición patológica asociada con las lesiones del tejido o una condición relacionada de forma mecánica.

Ejemplo 8 Método de Tratamiento de la Fibrosis Cardiaca

Tal y como se ha descrito anteriormente, el Halofuginone se ha mostrado ser un inhibidor eficaz de la fibrosis cardiaca. El siguiente ejemplo es únicamente una ilustración de un método de tratar la fibrosis cardiaca con el Halofuginone.

El método incluye el paso de emplear el Halofuginone, en un portador farmacéuticamente aceptable, tal y como se ha descrito en el Ejemplo 7 anteriormente, para la administración del tratamiento a un sujeto. Se debe administrar el Halofuginone de acuerdo a una metodología eficaz de dosificación, preferiblemente hasta alcanzar un punto final predeterminado, como la ausencia de una progresión de la fibrosis cardiaca en el sujeto, la inhibición de la fibrosis cardiaca o la prevención de la formación de la fibrosis cardiaca.

Claims (4)

1. Un método de fabricar un medicamento para el tratamiento de la fibrosis cardiaca compuesto por el paso de colocar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto dentro de un portador farmacéuticamente aceptable, donde el compuesto sea miembro de un grupo con la siguiente formula:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

donde:

R_{1} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, benzo, alquil inferior, fenilo y alcoxi inferior;

R_{2} es miembro del grupo que consiste en hidroxi, acetoxi y alcoxi inferior;

R_{3} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno y alquenoxi-carbonil inferior; y

n es 0, 1 o 2;

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

2. El uso de un compuesto con la siguiente formula:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

donde:

R_{1} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, benzo, alquil inferior, fenilo y alcoxi inferior;

R_{2} es miembro del grupo que consiste en hidroxi, acetoxi y alcoxi inferior;

R_{3} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno y alquenoxi-carbonil inferior; y

n es 0, 1 o 2;

o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo compuesto;

para la fabricación de un medicamento para tratar la fibrosis cardiaca.

3. Un método de fabricar un medicamento para la prevención de la fibrosis cardiaca compuesto por el paso de colocar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto dentro de un portador farmacéuticamente aceptable, donde el compuesto sea miembro de un grupo con la siguiente formula:

12

donde:

R_{1} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, benzo, alquil inferior, fenilo y alcoxi inferior;

R_{2} es miembro del grupo que consiste en hidroxi, acetoxi y alcoxi inferior;

R_{3} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno y alquenoxi-carbonil inferior; y

n es 0, 1 o 2;

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

4. El uso de un compuesto con la siguiente formula:

13

donde:

R_{1} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, benzo, alquil inferior, fenilo y alcoxi inferior;

R_{2} es miembro del grupo que consiste en hidroxi, acetoxi y alcoxi inferior;

R_{3} es miembro del grupo que consiste en hidrógeno y alquenoxi-carbonil inferior; y

n es 0, 1 o 2;

o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo compuesto;

para la fabricación de un me amento para prevenir la fibrosis cardiaca.