ES2253000T3 - Celulas somaticas con gen prp alterado y sus metodos de utilizacion. - Google Patents

Abstract

Un cultivo celular que comprende células huésped que tienen su genoma manipulado para que: - expresen una molécula química o biológica útil en una composición terapéutica; y - no expresen una proteína PrP debido a la alteración de cualquier secuencia de PrP endógena.

Description

Células somáticas con gen PrP alterado y sus métodos de utilización.

Campo de la invención

La invención se refiere de manera general al campo de células somáticas y líneas celulares alteradas con respecto a la expresión de un gen nocivo para el desarrollo temprano y, en particular, se refiere a células con un gen PrP alterado.

Antecedentes de la invención

Los priones son patógenos infecciosos que producen encefalopatías espongiformes en el sistema nervioso central de animales. Los priones son distintos de las bacterias, virus y viroides. Actualmente la hipótesis predominante es que no es necesario un componente ácido nucleico para la infectividad de la proteína priónica. Además, un prión que infecta a una especie de animales (por ejemplo, a un humano) no infectará a otra especie (por ejemplo, a un ratón).

Una etapa fundamental en el estudio de los priones y de las enfermedades que causan fue el descubrimiento y la purificación de una proteína denominada proteína priónica ("PrP") [Bolton y col., Science 218:1309-11 (1982); Prusiner y col., Biochemistry 21:6942-50 (1982); McKinley y col., Cell 35:57-62 (1983)]. Desde entonces se han clonado, secuenciado y expresado los genes que codifican la proteína priónica completa en animales transgénicos. La PrP^{C} está codificada por un gen del huésped de una sola copia [Basler y col., Cell 46:417-28 (1986)] y se encuentra normalmente en la superficie externa de la neuronas. Una hipótesis destacada es que las enfermedades causadas por priones resultan de la conversión de PrP^{C} en una forma modificada denominada PrP^{Sc}.

Actualmente, parece que la isoforma de la tembladera de la proteína priónica (PrP^{Sc}) es necesaria para la transmisión y la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas transmisibles de animales y humanos. Ver Prusiner, S.B., "Molecular biology of prion disease", Science 252:1515-1522 (1991). Las enfermedades causadas por priones más comunes de los animales son la tembladera de las ovejas y las cabras y la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) del ganado [Wilesmith, J. y Wells, Microbiol. Immunol. 172:21-38 (1991)]. Se han identificado cuatro enfermedades causadas por priones en humanos: (1) kuru, (2) Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), (3) Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker (GSS) y (4) insomnio familiar fatal (FFI) [Gajdusek, D.C., Science 197:943-960 (1977); Medori y col., N. Engl. J. Med. 326:444-449 (1992)]. La presentación de las enfermedades priónicas humanas como enfermedades esporádicas, genéticas e infecciosas planteaba inicialmente un enigma que ha sido explicado por el origen genético celular de la PrP.

Algunos casos de enfermedad priónica humana han sido transmitidos a roedores pero aparentemente con menos regularidad que la transmisión entre animales de la misma especie [Gibbs, Jr. y col., Slow Transmissible Diseases of the Nervous System, Vol. 2, S.B. Prusiner y W.J. Hadlow, eds. (New York: Academic Press), pp. 87-110 (1979); Tateishi y col., Prion Diseases of Humans and Animals, Prusiner y col., eds. (London: Ellis Horwood), pp. 129-134 (1992)]. La transmisión infrecuente de una enfermedad priónica humana a roedores ha sido citada como un ejemplo de la "barrera entre especies" descrita por vez primera por Pattison en sus estudios de transmisión del agente de la tembladera entre ovejas y roedores [Pattison, I.H., NINDB Monograph 2, D.C. Gajdusek, C.J. Gibbs Jr. y M.P. Alpers, eds. (Washington, D.C.: U.S. Government Printing), pp. 249-257 (1965)]. En esas investigaciones, la transmisión inicial de priones de una especie a otra fue asociada con un tiempo de incubación prolongado, desarrollando la enfermedad solamente unos pocos animales. La transmisión posterior en la misma especie se caracterizó porque todos los animales resultaban enfermos después de tiempos de incubación enormemente acortados.

Se demostró que la base molecular de la barrera de especies entre el hámster sirio (SHa) y el ratón residía en la secuencia del gen PrP utilizando ratones transgénicos (Tg) [Scott y col., Cell 59:847-857 (1989)]. La SHaPrP difiere de la MoPrP en 16 posiciones de los 254 residuos de aminoácido [Basler y col., Cell 46:417-428 (1986); Locht y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6372-6376 (1986)]. Ratones Tg(SHaPrP) que expresaban SHaPrP tenían tiempos de incubación abreviados cuando eran inoculados con priones de SHa. Cuando se realizaron estudios similares con ratones que expresaban los transgenes de PrP humanos u ovinos, no se suprimía la barrera entre especies, esto es, el porcentaje de animales que resultaba infectado era inaceptablemente bajo y los tiempos de incubación eran inaceptablemente largos. Por tanto, no ha sido posible, por ejemplo en el caso de priones humanos, utilizar animales transgénicos (tales como ratones conteniendo un gen PrP de otra especie) para analizar de manera fiable una muestra con el fin de determinar si esa muestra está infectada con priones. Tal análisis fue descrito por vez primera en la solicitud Nº de Serie 08/242.188 registrada el 13 de Mayo de 1994, que es ahora la Patente de EE.UU. 5.565.186 publicada el 15 de Octubre de 1996.

La mayoría de los casos de CJD humana son esporádicos, pero alrededor del 10-15% son heredados como enfermedades autosómicas dominantes que están causadas por mutaciones en el gen PrP humano [Hsiao y col., Neurology 40:1820-1827 (1990); Goldfarb y col., Science 258:806-808 (1992); Kitamoto y col., Proc. R. Soc. Lond. 343:391-398 (1994)]. La CJD yatrogénica ha sido causada por la hormona de crecimiento humana derivada de pituitarias de cadáveres así como de injertos de duramadre [Brown y col., Lancet 340:24-27 (1992)]. A pesar de los numerosos intentos para relacionar la CJD con una fuente infecciosa tal como el consumo de carne de oveja infectada con tembladera, no se ha identificado ninguna hasta la fecha [Harries-Jones y col., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 51:1113-1119 (1988)] excepto en los casos de enfermedad inducida yatrogénicamente. Por otra parte, se cree que el kuru, que devastó durante muchas décadas a los Fore y a tribus vecinas de las tierras altas de Nueva Guinea, ha sido propagado por infección durante el canibalismo ritual [Alpers, M.P., Slow Transmissible Diseases of the Nervous System, Vol. 1, S.B. Prusiner y W.J. Hadlow, eds. (New York: Academic Press), pp. 66-90 (1979)].

Más de 45 adultos jóvenes tratados previamente con HGH derivada de pituitarias humanas han desarrollado CJD [Koch y col., N. Engl. J. Med. 313:731-733 (1985); Brown y col., Lancet 340:24-27 (1992); Fradkin y col., JAMA 265:880-884 (1991); Buchanan y col., Br. Med. J. 302:824-828 (1991)]. Afortunadamente, hoy día se utiliza HGH recombinante, aunque se ha planteado la aparentemente remota posibilidad de que una expresión incrementada de wt PrP^{C} estimulada por niveles elevados de HGH podría inducir la enfermedad priónica [Lasmezas y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1163-1169 (1993)]. El hecho de que la HGH preparada a partir de pituitarias estuviera contaminada con priones, está apoyado por la transmisión de la enfermedad priónica a un mono 66 meses después de la inoculación con un lote sospechoso de HGH [Gibbs, Jr. y col., N. Engl. J. Med. 328:358-359 (1993)]. Los largos tiempos de incubación asociados con las enfermedades priónicas no revelará el alcance completo de CJD yatrogénica en miles de personas tratadas con HGH en todo el mundo. La CJD yatrogénica parece haberse desarrollado en cuatro mujeres infértiles tratadas con hormona gonadotrofina derivada de pituitaria humana contaminada [Healy y col., Br. J. Med. 307:517-518 (1993); Cochius y col., Aust. N.Z. J. Med. 20:592-593 (1990); Cochius y col., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 55:1094-1095 (1992)], así como en al menos 11 pacientes que recibieron injertos de duramadre [Nisbet y col., J. Am. Med. Assoc. 261:1118 (1989); Thadani y col., J. Neurosurg. 69:766-769 (1988); Willison y col., J. Neurosurg. Psychiatric 54:940 (1991); Brown y col., Lancet 340:24-27 (1992)]. Estos casos de CJD yatrogénica subrayan la necesidad de someter a selección productos farmacéuticos que pudieran estar posiblemente contaminados con priones.

Dos doctores de Francia fueron acusados de homicidio involuntario de un niño que había sido tratado con hormonas de crecimiento extraídas de cadáveres. El niño desarrolló la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. (Ver New Scientist, 31 de Julio de 1993, página 4). Según el Instituto Pasteur, desde 1989 ha habido 24 casos informados de CJD en jóvenes que fueron tratados con hormona de crecimiento humana entre 1983 y la mitad de 1985. Quince de estos niños murieron. Parece ahora como si cientos de niños hubieran sido tratados en Francia con hormona de crecimiento extraída de cadáveres con el riesgo de desarrollar CJD (ver New Scientist, 20 de Noviembre de 1993, página 10). A la vista de todo esto, existe claramente la necesidad de un método cómodo, rentable, para producir productos humanos tales como hormona de crecimiento que estén libres de cualquier contaminación con priones potencialmente contagiosos.

El riesgo de transmisión de enfermedades relacionadas con priones a través de productos terapéuticos humanos es un serio problema sanitario. Un método para prevenir la transmisión de enfermedades relacionadas con priones es producir productos humanos recombinantes en organismos tales como Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae, ya que estos organismos no tienen un gen PrP endógeno y por tanto no son susceptibles a la infección por PrP^{Sc}. Aunque la producción en Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae es ideal para la síntesis a gran escala de muchas proteínas humanas, factores tales como la estabilidad plasmídica y la insolubilidad del producto proteico deseado pueden limitar la utilidad de estos sistemas en algunas circunstancias. Además, ciertas proteínas producidas recombinantemente requieren modificaciones post-traduccionales para obtener la función de la proteína endógena, y por tanto pueden requerir la síntesis en células de mamífero o incluso en líneas celulares específicas de la especie para el funcionamiento correcto de la proteína producida. Por ejemplo, una tirotropina humana recombinante (rhTSH) producida en células de ovario de hámster chino está mucho más sialilada que una hTSH no recombinante de pituitaria derivada de cadáveres. La rhTSH tiene también una velocidad de eliminación metabólica 2 veces menor que la TSH de pituitaria, lo cual tiene como resultado una concentración sérica de rhTSH más de 10 veces mayor en comparación con la hTSH de pituitaria. (Thotakura y col., Endocrinology 128:341-348 (1991)). Como es deseable utilizar agentes terapéuticos con las modificaciones post-traduccionales apropiadas, son preferibles los sistemas de mamífero para la producción de tales proteínas.

Además, otros agentes terapéuticos, tales como anticuerpos, son producidos exclusivamente por sistemas celulares de mamífero. Las técnicas clásicas de fusión celular permiten la producción eficaz de anticuerpos monoclonales fusionando la célula B productora del anticuerpo con una línea celular de mamífero inmortalizada. La línea celular resultante es denominada línea celular de hibridomas. Las aplicaciones de anticuerpos humanos producidos por estos sistemas de hibridomas tienen un potencial prometedor en el área del cáncer, de las inmunodeficiencias y de otras enfermedades que implican una respuesta inmune. Por ejemplo, se ha demostrado que el anticuerpo monoclonal humano SC-1 inductor de apoptosis produce una inducción significativa de actividad apoptótica en ocho pacientes con adenocarcinoma de estómago pobremente diferenciado (Vollmers y col., Oncol. Rep. 5:549-552 (1998)). En otro ejemplo, se ha demostrado que el anticuerpo hacia HER2/neu es una terapia prometedora para el cáncer de mama humano (Valero, (1998) Semin. Oncol. 5:549-552). Los anticuerpos monoclonales producidos en sistemas de hibridomas murinos requieren una etapa adicional de "humanización" de los anticuerpos con el fin de impedir que los anticuerpos sean reconocidos como epítopos foráneos (ver, por ejemplo, Sato y col. (1994) Mol. Immunol. 31:371-381). Estos sistemas son susceptibles a la infección por priones y los anticuerpos producidos en las células infectadas presentan un riesgo de transmisión a cualquier individuo que reciba anticuerpos procedentes de las fuentes infectadas.

Prusiner y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10608-10612, 1993) describen ratones que son homozigotos para la ablación del gen de la proteína priónica (PrP). La inmunización de estos ratones con priones infecciosos purificados produjo antisueros que se unían a PrP en Transferencias Western.

Como muchos agentes terapéuticos son producidos en sistemas de mamífero, existe la necesidad de asegurar la seguridad de los productos aislados de tales sistemas. Dado el potencial de transmisión de la enfermedad cuando estos agentes terapéuticos son extraídos de tejidos, existe la necesidad de un método para producir agentes terapéuticos que estén libres del riesgo de contaminantes causantes de enfermedades en humanos tales como priones.

Resumen de la invención

Se describe un método para producir agentes terapéuticos de mamífero libres de contaminación con priones, células para ser utilizadas en tales métodos y formulaciones terapéuticas libres de priones producidas a través de las células. La invención comprende la producción de tales agentes terapéuticos en células somáticas que tienen un genoma con un gen PrP alterado artificialmente. El gen PrP de estas células puede ser eliminado o sustituido por una forma exógena inducible del gen PrP. Preferiblemente, las células de la invención proceden de ratón, rata, hámster, vaca, oveja, caballo, cerdo, perro, gato, pollo, más preferiblemente de primates y muy preferiblemente de humano. Estas células pueden derivar de animales transgénicos con un gen PrP alterado, o la PrP puede haber sido alterada en la célula. Tales células no son ya susceptibles a la infección por PrP (PrP^{Sc}), ya que la infección requiere una interacción entre el agente priónico infeccioso y la forma endógena de la proteína (PrP^{C}). Los agentes terapéuticos producidos mediante tal método incluyen, pero no se limitan a, péptidos, proteínas, anticuerpos, moléculas de ARN antisentido, ribozimas, vectores víricos y similares. Cualquiera de los agentes terapéuticos puede ser combinado con un vehículo con el fin de proporcionar una formulación farmacéutica apropiada que esté libre de priones.

La invención presenta células y un método para producir agentes terapéuticos utilizando células somáticas de mamífero en las que el gen PrP endógeno ha sido alterado y se ha introducido en el genoma un gen PrP exógeno. El gen PrP endógeno puede ser alterado y el gen PrP exógeno introducido posteriormente en las células, o el gen PrP endógeno puede ser alterado mediante la sustitución del gen PrP endógeno por la forma exógena del gen PrP, por ejemplo mediante recombinación homóloga específica de sitio. Además, el gen PrP introducido puede estar o no integrado en el genoma de la célula.

En una realización, la invención presenta la producción de agentes terapéuticos en células huésped que expresan secuencias de PrP exógenas procedentes de una especie genéticamente distinta de las células huésped. Estas células expresan PrP^{C}, pero están protegidas de la infección por priones procedente de la PrP^{Sc} específica de especie de la célula huésped.

En otra realización, la invención presenta la producción de agentes terapéuticos en células huésped que expresan secuencias de PrP exógenas de la misma especie que la célula huésped, estando eliminada la forma endógena de PrP.

Otro aspecto de la invención es un método para producir anticuerpos en una célula hibridoma con un gen PrP endógeno alterado. La alteración del gen PrP puede seguir a la fusión de la célula B productora de anticuerpos con la línea celular inmortalizada, y puede tener lugar antes del establecimiento del hibridoma como una línea celular o después del establecimiento. Alternativamente, la línea celular de hibridomas libre de priones puede ser producida mediante la transfección de células B procedentes de animales con un gen PrP alterado, eliminando de este modo el gen PrP endógeno de la célula B. Estas células B transfectadas pueden ser fusionadas con una línea celular inmortalizada que tenga también un gen PrP eliminado, teniendo como resultado un hibridoma sin expresión de PrP endógena que es resistente a la infección por priones.

Otro aspecto de la invención es la adaptación de anticuerpos monoclonales para ser utilizados como agentes terapéuticos mediante la alteración y la producción posterior en células de mamífero, células que tienen un PrP endógeno alterado. Una vez más, el gen PrP endógeno puede ser eliminado o sustituido por una forma inducible del gen PrP. Preferiblemente, el agente terapéutico producido es un anticuerpo humano, y el anticuerpo es "humanizado" en una línea celular de primate en la que se ha eliminado el PrP.

Un objeto de la invención es proporcionar un método para producir productos biológicos que estén libres del riesgo de infección por priones, y por tanto no transmitirán enfermedades relacionadas con priones a los sujetos que reciban tales productos.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método para asegurar la bioactividad y la seguridad de los agentes terapéuticos de mamífero.

Una característica de la invención es que las células utilizadas en la invención no son susceptibles a la infección por priones.

Una ventaja de la invención es que el método asegura que los productos biológicos creados mediante este método están libres de priones.

Un objeto es proporcionar un rango de agentes terapéuticos y de formulaciones de los mismos que estén libres de priones.

Estos y otros objetos, ventajas y características de la invención serán obvios para las personas expertas en la técnica después de la lectura de los detalles de la invención descritos más a fondo a continuación.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Antes de describir las presentes líneas celulares, métodos y productos libres de priones, debe comprenderse que esta invención no está limitada a las líneas celulares, métodos o productos particulares descritos y, por supuesto, puede variar. Debe comprenderse también que la terminología utilizada en la presente tiene la finalidad de describir solamente realizaciones particulares y no está destinada a ser limitante, ya que el ámbito de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

A no ser que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el comprendido comúnmente por las personas con experiencia habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o en los ensayos de la presente invención, se describen a continuación los métodos y materiales preferidos.

Debe señalarse que cuando se utilizan en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las fórmulas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen los referentes en plural a no ser que el contexto lo indique claramente de otro modo. Así, por ejemplo, la referencia a "una construcción" incluye una pluralidad de tales construcciones y la referencia a "una célula de mamífero" incluye la referencia a una o más células de mamífero, líneas celulares de mamífero y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

Definiciones

El término "aislado" indicará separado de su entorno natural. Una proteína aislada no está necesariamente separada de todos los materiales con los que está normalmente presente y puede permanecer glicosilada.

Los términos "producto terapéutico" o "agente terapéutico", según son utilizados en la presente, indican generalmente cualquier molécula química o biológica utilizada para obtener un efecto farmacológico, biológico, fisiológico y/o psicológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención completa o parcial de una enfermedad o de un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de la enfermedad y/o de un efecto adverso atribuible a la enfermedad. El término agentes terapéuticos, según se utiliza en la presente, incluye cualquier compuesto utilizado en el tratamiento de una enfermedad de un mamífero, particularmente un humano, e incluye composiciones para:

(a) prevenir la aparición de una enfermedad o un síntoma en un sujeto que pueda estar predispuesto a la enfermedad o síntoma, pero que no ha sido diagnosticado todavía de padecerla;

(b) inhibir un síntoma de la enfermedad, esto es, detener su desarrollo; o

(c) aliviar un síntoma de la enfermedad, esto es, producir la regresión de la enfermedad.

El término "tratamiento" es utilizado en la presente para indicar la administración de un "agente terapéutico" para obtener todos o alguno de los resultados deseados de un "agente terapéutico".

La "eliminación" o "supresión" de un gen, términos que son utilizados indistintamente en la presente, significa una alteración en la secuencia del gen o en una secuencia asociada con el gen que tiene como resultado una disminución de la función del gen diana, preferiblemente de tal modo que la expresión del gen diana sea indetectable o insignificante. La eliminación de un gen PrP endógeno significa que la función de cualquier gen PrP endógeno ha sido disminuida sustancialmente, de tal manera que la expresión no es detectable o está presente únicamente a niveles insignificantes. Transgénicos con un gen eliminado ("knock-out") pueden ser animales transgénicos que tengan una eliminación ("knock-out") heterozigótica del gen PrP (PrP^{+/0}) o una eliminación homozigótica del gen PrP (PrP^{0/0}). Los "knock-outs" incluyen también "knock-outs" condicionales, en los que la alteración del gen diana puede tener lugar después de, por ejemplo, la exposición del animal a una sustancia que estimule la alteración del gen diana, la introducción de un enzima que estimule la recombinación en el lugar del gen diana (por ejemplo, Cre en el sistema Cre-lox), o de otro método para dirigir la alteración del gen diana post-natalmente.

El término "Prnp-^{0/0}" o "Prnp-Abl" se refiere a un animal transgénico en el que ha sido eliminado su gen PrP, indicando el "^{0/0}" que ambos alelos han sido eliminados, mientras que "^{0/+}" indica que sólo se ha eliminado uno. Específicamente, el animal que está siendo referido es generalmente un ratón transgénico en el que se ha eliminado su gen PrP, esto es un ratón "knock-out" para PrP. Como el gen PrP está alterado, no se expresa proteína PrP de ratón.

El término "prión" indicará una partícula infecciosa que se sabe que causa enfermedades (encefalopatías espongiformes) en humanos y animales. El término "prión" es una contracción de las palabras "proteína" e "infección", y las partículas están compuestas en su mayoría, si no exclusivamente, por moléculas de PrP^{Sc} codificadas por un gen PrP que expresa PrP^{C} que cambia su conformación para convertirse en PrP^{Sc}. Los priones son distintos de las bacterias, virus y viroides. Los priones conocidos incluyen aquéllos que infectan a animales para producir la tembladera, una enfermedad transmisible, degenerativa del sistema nervioso central de las ovejas y las cabras, así como encefalopatías espongiformes bovinas (BSE) o enfermedad de las vacas locas y encefalopatías espongiformes felinas de los gatos. Cuatro enfermedades priónicas que se sabe que afectan a los humanos son (1) kuru, (2) Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), (3) Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker (GSS) y (4) insomnio familiar fatal (FFI). Según se utiliza en la presente, el término prión incluye todas las formas de priones que causan todas o cualquiera de estas enfermedades u otras en cualquier animal utilizado - y en particular en humanos y en animales de granja domesticados. Los priones incluyen todas las variantes infecciosas de la proteína PrP^{Sc}.

Los términos "gen PrP" y "gen de la proteína priónica" son utilizados indistintamente en la presente para describir el material genético que expresa las proteínas PrP. El término "gen PrP" se refiere generalmente a cualquier gen de cualquier especie que codifique cualquier forma de una secuencia de aminoácidos de PrP incluyendo cualquier proteína priónica. Algunas secuencias de PrP comúnmente conocidas están descritas en Gabriel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097-9101 (1992).

Los términos "preparación de priones estandarizada", "preparación de priones", "preparación" y similares son utilizados en la presente indistintamente para describir una composición que contiene priones, composición que es obtenida del tejido cerebral de mamíferos que contienen sustancialmente el mismo material genético en relación con las proteínas PrP, por ejemplo tejido cerebral de un conjunto de mamíferos que presentan signos de enfermedad priónica, mamíferos que pueden contener cualquiera de (1) un transgén quimérico de PrP; (2) un gen PrP endógeno eliminado; (3) un número elevado de copias de genes PrP procedentes de una especie genéticamente diferente o (4) híbridos con un gen PrP endógeno eliminado y un gen PrP procedente de una especie genéticamente diferente. Los mamíferos a partir de los cuales se obtienen las preparaciones de priones estandarizadas presentan signos clínicos de disfunción del SNC como resultado de la inoculación con priones y/o debido a su composición genéticamente modificada, por ejemplo, un número elevado de copias de genes PrP.

Los términos "gen de la proteína PrP eliminado", "gen PrP alterado", "gen PrP eliminado", "PrP^{0/0}" y similares son utilizados indistintamente en la presente para indicar un gen PrP endógeno que ha sido alterado (por ejemplo, se han añadido y/o eliminado nucleótidos) de tal manera que el gen se ha convertido en inoperante. Ejemplos de genes PrP no funcionales y de métodos para producir los mismos están descritos en Büeler, H. y col., "Normal development of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein", Nature 356:577-582 (1992), que se incorpora a la presente por referencia. Están alterados ambos alelos de los genes.

Los términos "resistente a la infección", "resistente a la infección con priones" y similares significan que las células incluyen un gen PrP alterado que hace que las mismas sean resistentes a la enfermedad priónica cuando son inoculadas con una cantidad y un tipo de prión que se esperaría que causaran la enfermedad priónica si las células expuestas o un producto de las células expuestas fueran introducidos en un animal de la misma especie.

El término "libre de priones" significa que la composición contiene una cantidad insuficiente de priones (PrP^{Sc}) para producir una infección y contiene preferiblemente cantidades no detectables de priones utilizando la tecnología actual de detección y, muy preferiblemente, no contiene priones en absoluto.

Los términos "susceptible a la infección" y "susceptible a la infección por priones" y similares son utilizados indistintamente en la presente para describir células que pueden ser infectadas por priones, siendo capaces tales células infectadas de causar en un animal objeto el desarrollo de una enfermedad si es inoculado con estas células infectadas o con productos producidos en tales células.

El término "tiempo de incubación" indicará el tiempo desde la inoculación de un animal con un prión hasta el momento en el que el animal desarrolla por vez primera síntomas detectables de la enfermedad resultante de la infección. Un tiempo de incubación reducido es de seis meses o inferior, preferiblemente alrededor de 75 días \pm 25 días o inferior, más preferiblemente alrededor de 30 días \pm 10 días o inferior.

Los términos "animal genéticamente diferente" y "mamífero genéticamente diferente" son utilizados para describir un animal que incluye una secuencia de codones del PrP nativo que difiere de la del animal de ensayo genéticamente diferente en 17 o más codones, preferiblemente en 20 o más codones y muy preferiblemente en 28-40 codones. De este modo, un gen PrP de ratón es genéticamente diferente con respecto al gen PrP de un humano, una vaca o una oveja, pero no es genéticamente diferente con respecto al gen PrP de un hámster.

El término "anticuerpo" significa una proteína inmunoglobulina que es capaz de unirse a un antígeno. El término anticuerpo, según se utiliza en la presente, tiene la intención de incluir el anticuerpo completo así como cualquier fragmento del anticuerpo (por ejemplo, F(ab'), Fab, Fv) capaz de unirse al epítopo, antígeno o fragmento antigénico de interés. Los anticuerpos preferidos para los ensayos de la invención son inmunorreactivos o inmunoespecíficos para, y por tanto se unen específicamente y selectivamente a, una proteína PrP. Se prefieren los anticuerpos que son inmunorreactivos e inmunoespecíficos para la PrP^{C} nativa y para la PrP^{Sc} tratada, pero no para la PrP^{Sc} nativa. Los anticuerpos hacia la PrP son preferiblemente inmunoespecíficos, por ejemplo no son sustancialmente reactivos de manera cruzada con materiales relacionados. El término "anticuerpo" incluye todos los tipos de anticuerpos, por ejemplo policlonales, monoclonales y los producidos mediante la metodología de presentación en fagos. Anticuerpos particularmente preferidos de la invención son anticuerpos que tienen un grado de afinidad por el antígeno diana relativamente elevado.

"Anticuerpo purificado" se refiere a aquél que está suficientemente libre de otras proteínas, carbohidratos y lípidos con los que está asociado en la naturaleza. Tal anticuerpo "se une preferencialmente" a una proteína PrP^{Sc} tratada o desnaturalizada (o a un fragmento antigénico de la misma) y no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas no relacionadas antigénicamente. Un anticuerpo purificado de la invención es preferiblemente inmunorreactivo con, e inmunoespecífico para, una especie específica.

Un "fragmento antigénico" de una proteína (por ejemplo, HER2/neu) indica una porción de tal proteína que es capaz de unirse a un anticuerpo.

Por el término "unirse específicamente" se indica una avidez elevada y/o una afinidad de unión elevada de un anticuerpo por un polipéptido específico, por ejemplo un epítopo de una proteína tal como una proteína HER2/neu. La unión del anticuerpo al epítopo en este polipéptido específico es preferiblemente más potente que la unión del mismo anticuerpo a cualquier otro epítopo, particularmente a aquéllos que pueden estar presentes en las moléculas en asociación con, o en la misma muestra que, el polipéptido específico de interés, por ejemplo se une más potentemente a fragmentos epitópicos de una proteína tal como HER2/neu de tal manera que, ajustando las condiciones de unión, el anticuerpo se une casi exclusivamente a un lugar epitópico o a fragmentos de una proteína deseada tal como un fragmento epitópico expuesto por tratamiento de HER2/neu y no expuesto en receptores relacionados de la misma subfamilia.

Células con un gen PrP alterado

Preferiblemente, el producto del gen PrP en las células utilizadas en el método de la invención es indetectable, insignificante y, muy preferiblemente, inexistente. La eliminación d2e un gen PrP endógeno significa que la función de la proteína PrP ha sido sustancialmente disminuida, de tal manera que la expresión de la proteína PrP no es detectable o está presente únicamente a niveles insignificantes. Esto puede conseguirse mediante una variedad de mecanismos, incluyendo la introducción de una alteración de la secuencia codificadora, por ejemplo la inserción de uno o más codones de parada, la inserción de un fragmento de ADN, la eliminación de la secuencia codificadora, la sustitución de la secuencia codificadora por codones de parada, etc. En algunos casos las secuencias de transgenes exógenos son finalmente eliminadas del genoma, dejando un cambio neto en la secuencia nativa. Pueden utilizarse diferentes procedimientos para conseguir el "knock-out". Ver las Patentes de EE.UU. 5.464.764, 5.627.059 y patentes y publicaciones relacionadas de Capecchi y col. Puede inducirse una deleción cromosómica de todo o parte del gen nativo, incluyendo deleciones de las regiones no codificadoras, particularmente de la región promotora, de secuencias reguladoras 3', de intensificadores, o deleciones del gen que activa la expresión de los genes PrP. Puede conseguirse también un "knock-out" funcional mediante la introducción de una construcción antisentido que bloquee la expresión de los genes nativos (por ejemplo, ver Li y Cohen (1986) Cell 85:319-329). Los "knock-outs" incluyen también "knock-out" condicionales, por ejemplo en los que la alteración del gen diana tiene lugar después de la exposición del animal a una sustancia que estimule la alteración del gen diana, la introducción de un enzima que estimule la recombinación en el sitio del gen diana (por ejemplo, Cre en el sistema Cre-lox), o de otros métodos para dirigir la alteración del gen diana.

En general, las secuencias que facilitan la recombinación específica de sitio útiles en la presente invención, incluyen cualquier secuencia de nucleótidos que facilite la recombinación específica de sitio por interacción de un enzima específico con dos de tales secuencias que facilitan la recombinación específica de sitio. Ejemplos de secuencias que facilitan la recombinación específica de sitio incluyen, pero no se limitan necesariamente a: vectores PNS según se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.627.059; secuencias lox (recombinación mediada por el enzima Cre); secuencias frt (Golic y col. (1989) Cell 59:499-509 y O'Gorman y col. (1991) Science 251:1351-5), recombinación mediada por la recombinasa de FLP; las secuencias de reconocimiento de la recombinasa pSR1 de Zygosaccharomyces rouxii (Matsuzaki y col. (1990) J. Bacteriol. 172:610-8) y similares. Cada una de éstas puede ser utilizada para alterar la expresión de la PrP endógena mediante alteración del gen endógeno, esto es creando un "knock-out" de PrP y/o sustituyendo el gen endógeno por una forma inducible de PrP, esto es, creando un "knock-out" de PrP condicional.

El gen PrP exógeno introducido puede ser un gen PrP de mamífero que esté unido operativamente a un promotor inducible. Por el término "unido operativamente" se indica que una secuencia de ADN y una(s) secuencia(s) regula-
dora(s) están conectadas de tal manera que se permite la expresión del gen cuando las moléculas apropiadas, por ejemplo proteínas activadoras de la transcripción, están unidas a la(s) secuencia(s) reguladora(s). Tal gen PrP inducible funciona con un "knock-out" condicional, ya que la inducción de PrP puede ser controlada de forma reversible.

Construcciones específicas de interés incluyen, pero no se limitan a, PrP antisentido que bloqueará la expresión del PrP nativo, la expresión de mutaciones de PrP negativas dominantes y la sobreexpresión de un gen PrP. Puede introducirse en el locus un marcador detectable, tal como lac Z, en el que la regulación por incremento de la expresión tendrá como resultado un cambio en el fenotipo fácilmente detectable. Son también de interés construcciones que utilizan la región promotora del PrP, en combinación con un gen informador o con la región codificadora.

Las construcciones de ADN para recombinación homóloga comprenderán al menos una porción del gen PrP con la modificación genética deseada, e incluirán regiones de homología con el locus diana. Las construcciones de ADN para integración aleatoria no necesitan incluir regiones de homología para mediar la recombinación. Oportunamente, se incluyen marcadores para selección positiva y negativa. Métodos para generar células que tengan modificaciones en un gen diana mediante recombinación homóloga son conocidos en la técnica. Para diferentes técnicas de transfección de células de mamífero, ver Keown y col. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537.

Composiciones de ácidos nucleicos de PrP

El término "PrP" es utilizado genéricamente para designar genes PrP, por ejemplo homólogos de rata, humano, ratón, cobaya, etc., y sus formas alternativas. Utilizado genéricamente, este término incluye diferentes isoformas, polimorfismos, secuencias variantes y también formas mutadas de PrP. El término tiene también la intención de significar el marco de lectura abierto que codifica polipéptidos específicos, intrones y secuencias de nucleótidos no codificadoras 5' y 3' adyacentes implicadas en la regulación de la expresión, hasta 1 kb aproximadamente más allá de la región codificadora, pero posiblemente además en ambas direcciones. Las secuencias de ADN que codifican PrP pueden ser ADNc o ADN genómico, o un fragmento de los mismos. El gen puede ser introducido en un vector apropiado para el mantenimiento extracromosómico o para integración en el huésped. Se conocen las secuencias de aminoácidos y las secuencias de ADN de varios animales, ver las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.565.186; 5.763.740; 5.789.655; 5.792.901 y las publicaciones citadas en estas patentes referentes a secuencias, isoformas, polimorfismos, variantes y mutaciones.

Una secuencia genómica de interés comprende el ácido nucleico presente entre el codón de inicio y el codón de parada, según se define en las secuencias enumeradas en la presente y en las patentes y publicaciones citadas, incluyendo todos los intrones que están presentes normalmente en un cromosoma nativo. Puede incluir además las regiones 3' y 5' no traducidas encontradas en el ARNm maduro. Puede incluir además secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción específicas, tales como promotores, intensificadores, etc., incluyendo alrededor de 1 kb, pero posiblemente más, de ADN genómico flanqueante en el extremo 5' o 3' de la región transcrita. El ADN genómico puede ser aislado como un fragmento de 100 kpb o más pequeño y sustancialmente libre de secuencias cromosómicas flanqueantes.

La secuencia de esta región 5' y las secuencias 5' corriente arriba y 3' corriente abajo adicionales, pueden ser utilizadas para elementos promotores, incluyendo sitios de unión de intensificadores, que proporcionan la expresión en tejidos en los que se expresa PrP. La expresión específica de tejidos es útil para determinar el patrón de expresión y para proporcionar promotores que remeden los patrones de expresión nativos. Los polimorfismos que existen de forma natural en la región promotora son útiles para determinar variaciones naturales de la expresión, particularmente aquellas que pueden estar asociadas con la enfermedad. Alternativamente, pueden introducirse mutaciones en la región del promotor con el fin de determinar el efecto de la alteración de la expresión en sistemas definidos experimentalmente. En la técnica se conocen métodos para la identificación de motivos de ADN específicos implicados en la unión de factores transcripcionales, por ejemplo la similitud de secuencias con motivos de unión conocidos, estudios de retardo en gel, etc. Para ejemplos ver Blackwell y col. (1995) Mol. Med. 1:194-205; Mortlock y col. (1996) Genome Res. 6:327-33; y Joulin y Richard-Foy (1995) Eur. J. Biochem. 232:620-626.

Las secuencias reguladoras pueden ser utilizadas para identificar secuencias que actúan en cis requeridas para la regulación transcripcional o traduccional de la expresión de PrP, especialmente en diferentes tejidos o etapas de desarrollo, y para identificar secuencias que actúan en cis y factores que actúan en trans que regulan o median la expresión. Tales regiones de control transcripcional o traduccional pueden ser unidas operativamente a un gen PrP con el fin de estimular o impedir la expresión de la PrP de tipo salvaje o alterada o de otras proteínas de interés en células cultivadas.

Las composiciones de ácido nucleico utilizadas en la presente invención pueden codificar todos o una parte de los polipéptidos de PrP, según sea apropiado. Pueden obtenerse fragmentos de la secuencia de ADN mediante la síntesis química de oligonucleótidos de acuerdo con métodos convencionales, mediante digestión con enzimas de restricción, mediante amplificación por PCR, etc. Por lo general, los fragmentos de ADN tendrán al menos 15 nt, normalmente al menos 18 nt, más habitualmente al menos 50 nt aproximadamente. Tales fragmentos pequeños de ADN son útiles como cebadores de PCR, para la selección mediante hibridación, etc. Fragmentos de ADN más grandes, esto es mayores de 100 nt, son útiles para la producción del polipéptido codificado. Para utilización en reacciones de amplificación, tales como PCR, se empleará un par de cebadores.

Las técnicas de mutagénesis in vitro de genes clonados son conocidas. Ejemplos de protocolos para examinar mutaciones pueden encontrarse en Gustin y col., 1993, Biotechniques 14:22; Barany, 1985, Gene 37:111-23; Colicelli y col., 1985, Mol. Gen. Genet. 199:537-9; y Prentki y col., 1984, Gene 29:303-13. Pueden encontrarse métodos para la realización de mutagénesis específica de sitio en Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CHS Press, pp. 15.3-15.108; Weiner y col., 1993, Gene 126:35-41; Sayers y col., 1992, Biotechniques 13:592-6; Jones y Winistorfer, 1992, Biotechniques 12:528-30; Barton y col., 1990, Nucleic Acids Res. 18:7349-55; Marotti y Tomich, 1989, Gene Anal. Tech. 6:67-70 y Zhu, 1989, Anal. Biochem. 177:120-4. Por ejemplo, genes PrP de pollo, bovinos, de oveja, de rata y ratón están descritos y publicados en Gabriel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097-9101 (1992). La secuencia del hámster sirio está publicada en Basler y col., Cell 46:417-428 (1986). El gen PrP de oveja está publicado por Goldmann y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2476-2480 (1990). La secuencia del gen PrP bovino está publicada en Goldmann y col., J. Gen. Virol. 72:201-204 (1991). La secuencia del gen PrP de pollo está publicada en Harris y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7664-7668 (1991). La secuencia del gen PrP del visón está publicada en Kretzschmar y col., J. Gen. Virol. 73:2757-2761 (1992). La secuencia del gen PrP humano está publicada en Kretzschmar y col., DNA 5:315-324 (1986). La secuencia del gen PrP de ratón está publicada en Locht y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6372-6376 (1986). La secuencia del gen PrP de oveja está publicada en Westaway y col., Genes Dev. 8:959-969 (1994). Estas publicaciones se incorporan todas a la presente por referencia para revelar y describir el gen PrP y las secuencias de aminoácidos de PrP.

Sistema inducible por tetraciclina

Los sistemas de transactivación regulada por tetraciclina (tet) para la expresión de genes inducibles permite el control temporal y cuantitativo de genes exógenos en células de mamífero, ratones transgénicos y plantas. Para una revisión, ver Shockett, PNAS 43:5173-5176 (1996), que se incorpora a la presente por referencia. El sistema pionero de expresión génica regulada por tet implicaba la expresión constitutiva de la proteína transactivadora de tet (tTA) con el promotor/intensificador temprano inmediato (IE) de citomegalovirus (CMV). La tTA es una proteína de fusión compuesta por el represor de tet de Escherichia coli y el dominio de activación transcripcional de la proteína VP16 del virus del herpes simple. En ausencia de tetraciclina, la porción del represor de tet de tTA media la unión de alta afinidad a secuencias del operador de resistencia a tet de Tn10 (tetO). En presencia de tetraciclina, un cambio conformacional en el represor de tet impide la unión de tTA a su operador.

Se ha desarrollado también un sistema modificado que utiliza un transactivador inverso (rtTA) que se une eficazmente a tetO solamente en presencia de los derivados de tet doxiciclina o anhidrotetraciclina. Se hipotetiza que este sistema es especialmente útil en situaciones en las que células o individuos han de ser mantenidos en el estado reprimido durante largos periodos de tiempo y en los que la exposición de larga duración a tet o a uno de sus derivados es indeseable, o en situaciones que requieran una inducción rápida.

Aunque la realización preferida de la presente invención presenta un sistema inducible por tetraciclina dirigido por el promotor de CMV, pueden utilizarse otros métodos de administración de los genes regulados por tet y de otros factores resistentes. Por ejemplo, pueden utilizarse vectores víricos dirigidos por el promotor de SV40, por promotores específicos de células gliales o por el parvovirus autónomo LuIII, para expresar tTA. Estos y otros sistemas similares pueden ser utilizados en la presente invención sin alejarse del espíritu de la descripción, como será obvio para los expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden utilizarse sistemas tales como sistemas inducibles por ecdisoma en lugar del sistema inducible por tetraciclina.

Producción de anticuerpos

Los anticuerpos son preparados de acuerdo con métodos convencionales, en los que el polipéptido o proteína expresados es utilizado como inmunógeno, por sí mismo o conjugado a transportadores inmunogénicos conocidos, por ejemplo KLH, pre-S HBsAg, otras proteínas víricas o eucariotas o similares. Pueden emplearse diferentes adyuvantes, con una serie de inyecciones, según sea apropiado. Para los anticuerpos monoclonales, después de una o más inyecciones de refuerzo se aísla el bazo, se inmortalizan los linfocitos mediante fusión celular y posteriormente se someten a selección por la unión de anticuerpos de alta afinidad. Las células inmortalizadas, esto es hibridomas, que producen los anticuerpos deseados pueden ser posteriormente expandidas. Para una descripción adicional, ver Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane eds., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, 1988.

Una vez que se ha identificado un anticuerpo monoclonal adecuado como agente terapéutico potencial, el anticuerpo debe ser adaptado para ser utilizado en el organismo en cuestión. La alteración del anticuerpo para adaptarlo al sistema inmune de la especie en cuestión cumple dos funciones básicas: disminuye la posibilidad de una reacción adversa significativa de la respuesta inmune del huésped hacia el anticuerpo terapéutico, e incrementa la actividad terapéutica del anticuerpo, ya que es menos probable que la actividad sea neutralizada por el sistema inmune del huésped. Por ejemplo, los anticuerpos utilizados como agentes terapéuticos para humanos son rutinariamente "humanizados" antes de ser utilizados para tratar enfermedades humanas.

Existen muchos procedimientos para humanizar anticuerpos monoclonales, cada uno de los cuales diseña y construye un anticuerpo humano remodelado que remeda al anticuerpo de ratón. Por ejemplo, un procedimiento basa el diseño del anticuerpo humano en la secuencia consenso más homóloga. Otro procedimiento basa el diseño en el anticuerpo humano más homólogo. Estos procedimientos utilizan ambos cultivos de células de primate y, por tanto, tienen el riesgo de contaminación con PrP^{Sc} y la infección potencial de las personas tratadas con tales agentes terapéuticos. La eliminación del gen PrP endógeno en las líneas celulares utilizadas para humanizar estos anticuerpos puede prevenir este hecho.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se presentan con el fin de proporcionar a las personas con experiencia habitual en la técnica una revelación y una descripción completas de cómo realizar y utilizar la presente invención, y no tienen la intención de limitar el ámbito de lo que se considera como la invención, ni tienen la intención de representar o insinuar que los experimentos mostrados son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etc.), pero debe tenerse en cuenta que puede haber algunos errores y desviaciones experimentales. A no ser que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio, la temperatura es en grados centígrados y la presión es o está próxima a la presión atmosférica.

Ejemplo 1 Producción de tirotropina humana

Se ha demostrado que la presencia y la estructura específica de restos tales como oligosacáridos en ciertas proteínas, es importante para la producción y para la bioactividad de estas proteínas. Como la estructura de carbohidratos de una proteína está determinada en parte por el aparato de glicosilación de las células en las que se produce la proteína, el tipo de célula huésped que produzca esta proteína influye directamente sobre la actividad in vivo de la proteína. Es por tanto deseable que las proteínas que requieran cierta composición de carbohidratos sean producidas en células que contengan el aparato necesario para proporcionar la modificación post-traduccional apropiada.

Como el aparato celular que controla la modificación post-traduccional varía incluso entre células de diferentes especies de mamífero, algunas proteínas humanas son producidas preferiblemente en células de primate. Un grupo de proteínas que son sensibles a tales modificaciones son las hormonas glicoproteicas de la pituitaria y coriónicas. Con el fin de asegurar la seguridad de estas proteínas con respecto a la infectividad priónica, estas proteínas pueden ser producidas en células que no tengan una proteína priónica humana en funcionamiento. La producción de estas proteínas utilizando el método de la invención es por tanto realizada preferiblemente en células libres de priones adecuadas.

Preparación de una línea celular humana desprovista de PrP derivada de neuronas

La línea celular de neuroblastoma N2a es un tipo celular que puede ser utilizado en el método de la presente invención para producir proteínas humanas modificadas apropiadamente. La actividad del gen PrP endógeno en la línea celular N2a es eliminada utilizando la tecnología de recombinación homóloga según está descrita en la Patente de EE.UU. Nº 5.627.059. La Patente '059 utiliza un vector PNS compuesto por una construcción de cuatro componentes: una primera y una segunda secuencia homólogas a secuencias del gen PrP; una secuencia de ADN para selección positiva insertada entre la primera y la segunda secuencia homólogas; y una secuencia para selección negativa conectada a cada lado de las secuencias homólogas, pero no situada entre las dos. Cuando la primera y la segunda secuencia homólogas experimentan recombinación homóloga con las secuencias diana homólogas del gen PrP, se inserta la secuencia para selección positiva mientras que la secuencia negativa no se inserta. Las células sin la secuencia para selección positiva no experimentan recombinación en el locus de PrP, y las células con las secuencias para selección negativa tienen una secuencia insertada en el genoma, pero no experimentan recombinación homóloga en el gen PrP. Las células N2a con un PrP alterado son de este modo seleccionadas mediante recombinación homóloga por la presencia de las secuencias para selección positiva y la ausencia de las secuencias para selección negativa.

Las células N2a con el gen PrP alterado son seleccionadas con el fin de ser utilizadas para la producción de tirotropina humana. Como estas células no contienen el gen PrP endógeno, no tienen ya el riesgo de infección por la forma PrP^{Sc} de la proteína. Estas células N2a pueden ser por tanto clasificadas como una línea celular "libre de priones" y los productos producidos en esta línea celular pueden ser también caracterizados como "libres de priones", significando que los productos producidos a partir de tales líneas celulares libres de priones no presentan un riesgo para los individuos que reciban una terapia in vivo utilizando productos producidos a partir de estas líneas celulares.

Producción de tirotropina humana en la línea celular desprovista de PrP

La TSH humana es un miembro de las hormonas glicoproteicas de la pituitaria y coriónicas, y contiene dos subunidades unidas no covalentemente, \alpha y \beta. Para producir hTSH, un ADN complementario para la coriogonadotropina \alpha humana y un minigén de hTSH \beta, descrito en Wondisford y col. (1988) Mol. Endocrin. 2:32-39, son cotransfectados en las células N2a libres de priones. Se seleccionan los transfectantes estables con tasas elevadas de producción de TSH. La TSH expresada es purificada a partir de los sobrenadantes del cultivo mediante cromatografía en Blue-Trisacryl M (IBF Biotechnics, Savage, MD), Q-Sepharose Fast Flow y S-Sepharose Fast Flow (ambas de Pharmacia, Piscataway, NJ). La pureza final de la TSH aislada es generalmente mayor del 97%.

Ejemplo 2 Producción de proteína en una línea celular humana con PrP inducible

Ciertas líneas celulares pueden ser sensibles a la presencia de PrP, y por tanto puede ser deseable tener expresión de PrP a ciertos tiempos en el cultivo de la línea celular, por ejemplo durante el establecimiento de la línea celular "knock-out" para PrP o para fines de selección. Con este fin, una línea celular sin PrP endógeno pero con un gen PrP inducible permitirá la expresión de PrP^{C} durante los periodos necesarios del cultivo de la línea celular, pero posteriormente permitirá que las células están libres de priones para la producción de agentes terapéuticos. Estas líneas celulares pueden ser producidas mediante la inserción de un transgén priónico inducible en la línea celular parental, y la alteración posterior de la forma endógena del gen PrP.

Sustitución del gen PrP endógeno por un gen PrP inducible

Con el fin de producir células HeLa que tengan el gen PrP endógeno sustituido por un transgén inducible, se utilizan secuencias que codifican sitios lox para estimular la recombinación específica de sitio. Un sitio lox es una secuencia de nucleótidos en la que el producto génico del gen cre, referido en la presente como "Cre", cataliza la recombinación específica de sitio. Un sitio lox particularmente preferido es un sitio loxP. La secuencia de loxP, que tiene 34 pb de longitud, es conocida y puede ser producida sintéticamente o puede ser aislada del bacteriófago P1 por métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Hoess y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3398). El sitio loxP está compuesto por dos repeticiones invertidas de 13 pb separadas por una región separadora de 8 pb. Las secuencias de nucleótidos de las repeticiones del inserto y de la región separadora de loxP son según sigue:

ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT

Otros sitios lox adecuados incluyen loxB, loxL y loxR, que pueden ser aislados de E. Coli (Hoess y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 22:3398). Preferiblemente, el sitio lox utilizado es loxP o loxC2. Las secuencias de nucleótidos de las repeticiones del inserto y de la región separadora de loxC2 son según sigue:

ACAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT

Las secuencias que facilitan la recombinación específica de sitio útiles en la presente invención pueden ser una secuencia que exista de forma natural o una secuencia modificada. Por ejemplo, la solicitud publicada PCT nº WO 93/19172 describe vectores fagos en los que los genes VH10 están flanqueados por dos sitios loxP, uno de los cuales es un sitio loxP mutante (loxP511), en el que la G en séptima posición dentro de la región separadora de loxP está sustituida por una A, impidiendo que la recombinación en el vector escinda simplemente los genes V_{H}. Sin embargo, dos sitios loxP511 pueden recombinarse a través de recombinación mediada por Cre y, por tanto, pueden ser recombinados selectivamente en presencia de uno o más sitios lox de tipo salvaje. Las secuencias de nucleótidos de las repeticiones del inserto y de la región separadora de loxP511 son según sigue:

ATAACTTCGTATA ATGTATAC TATACGAAGTTAT

Pueden producirse también sitios lox mediante una variedad de técnicas sintéticas que son conocidas en el oficio. Por ejemplo, técnicas sintéticas para producir sitios lox están descritas por Ogilvie y col. (1981) Science 21A:270.

El lox diana es colocado en el genoma de células HeLa cultivadas utilizando métodos conocidos en la técnica. El lox-neo diana es colocado en las células HeLa mediante electroporación de 10^{7} células en 0,8 ml con 1 \mug de un vector de integración específico de sitio, pSF1, que contiene secuencias de loxP y una secuencia del neogén no modificada (Fukushige (1992) PNAS 89:7905-7909). La electroporación utiliza un único pulso de 450 V a 500 \muF procedente de un Gene Pulser de BioRad. Un día después, las células son seleccionadas por crecimiento en un medio \propto^{-} que carece de desoxirribonucleósidos y ribonucleósidos suplementado con un 15% de suero bovino fetal dializado.

La integración mediada por Cre de los vectores dirigidos de lox utilizaba las mismas condiciones de electroporación con 10 \mug de vector dirigido y 20 \mug de las construcciones diana. Las construcciones diana que contienen el marco de lectura abierto de HuPrP son obtenidas mediante el clonaje de un fragmento genómico sin promotor corriente abajo del operador de la tetraciclina heptamerizado en el vector pUHD 10-3 para obtener tetO-HuPrP. El fragmento tetO-HuPrP es posteriormente clonado en el vector pBS226 detrás del promotor de hCMV. Cada muestra electroporada es sembrada en una placa de cultivo de 10 cm. Dos días después las células son seleccionadas por su crecimiento en medio con G418 (400 \mug/ml). La formación de colonias fue valorada 12 días más tarde y se seleccionaron clones individuales para su expansión. Los antibióticos doxiciclina o minociclina son ambos potentes represores de la actividad de LacZ dependiente de tTA, y añadidos cualquiera de ellos a una concentración de 1 \mug/ml en el momento de la transfección reprimen los niveles de PrP^{C}. Las líneas celulares con formación estable de HuPrP son seleccionadas utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en el oficio.

Con el fin de producir proteínas libres de priones en las líneas celulares con PrP inducible, las células deben ser cultivadas durante un número determinado de pases sin tetraciclina para asegurarse de que no haya una expresión de PrP detectable en estas células. ADN complementario para una proteína humana puede ser luego transfectado a las células HeLa y seleccionarse los transfectantes estables. La proteína de interés puede ser aislada de estas células mediante cualquiera de varios métodos comúnmente utilizados por los expertos en la técnica.

Ejemplo 3 Producción de anticuerpos hacia HER-2/NEU en hibridomas resistentes a priones

Para producir anticuerpos en células resistentes a la infección por priones, el gen PrP endógeno de ratón puede ser alterado en la línea de hibridomas. El gen PrP endógeno es alterado preferiblemente después de la fusión, pero la alteración puede tener lugar antes o después del establecimiento de las líneas celulares de hibridomas. El gen PrP endógeno es alterado utilizando un vector basado en un virus adenoasociado (AAV) que puede modificar eficazmente secuencias cromosómicas diana humanas homólogas. El protocolo utilizado está elucidado en Russel e Hirata (1998) Nat. Genet. 18:325-330, que se incorpora a la presente por referencia. El vector contiene secuencias homólogas al gen PrP de ratón suficientes para una recombinación homóloga correcta, pero las secuencias no codifican un gen PrP funcional.

Inmunización de ratones con el antígeno HER-2/NEU

Seis ratones BALB/c hembra son inmunizados intraperitonealmente para la producción inicial de anticuerpos. Para cada ratón, la solución de inyección contiene 250 \mul de Adyuvante Completo de Freund mezclados con 250 \mul de una solución preparada del antígeno HER-2/NEU. La inyección puede contener entre 1 y 200 \mug del antígeno, y el antígeno puede estar o no unido covalentemente a un pequeño hapteno inmunogénico o a una proteína inmunogénica grande tal como hemocianina. Después de dos semanas, cada animal recibe una dosis de refuerzo de una cantidad similar, pero utilizando 250 \mul de Adyuvante Incompleto de Freund como adyuvante.

El día 24, se recoge sangre de la cola de los ratones para analizar la respuesta inmunogénica hacia el antígeno. Las muestras de sangre son diluidas 1:5 en PBS y muestras de cada ratón son comparadas con diluciones similares de un ratón control no inmunizado en un ensayo para determinar la respuesta inmune, tal como un ensayo de transferencia de manchas. El día 35, se inyectan a cada animal 250 \mul de Adyuvante Incompleto de Freund y el día 45 se toman de nuevo muestras de sangre de la cola y muestras de suero se someten a selección por inmunoprecipitación frente a una preparación del antígeno HER-2/NEU radiomarcado in vivo. Los animales cuyo suero respondía potentemente al antígeno son inyectados el día 56 con 100 \mul de solución del antígeno intravenosamente y 100 \mul de solución del antígeno intraperitonealmente. El día 59, los esplenocitos de los respondedores potentes son fusionados con una línea celular de mieloma de BALB/c.

Fusión del mieloma y los esplenocitos para crear hibridomas

Las líneas de hibridomas resistentes a priones que producen los anticuerpos hacia HER-2/NEU son creadas después de la fusión de los esplenocitos que producen los anticuerpos hacia HER-2/NEU con la línea celular de mieloma. La fusión puede ser realizada mediante cualquier fusógeno conocido por los expertos en la técnica, y preferiblemente con polietilén glicol. Las células de mieloma utilizadas en el proceso de fusión son portadoras de una mutación en el gen de la fosforribosil transferasa de hipoxantina-guanina (HPRT), y por tanto las células inmortalizadas que han experimentado la fusión con los esplenocitos son seleccionadas por la adición de cualquier compuesto que bloquee la ruta de síntesis de nucleótidos de novo, tal como metotrexato o aminopterina. Las células fusionadas que sobreviven a tal selección son expandidas.

Eliminación del gen PrP en las líneas de hibridomas HER-2/NEU

El gen o genes endógenos de la línea celular de hibridomas puede ser alterado utilizando una construcción que codifique una proteína de unión fluorescente verde (GFP) bajo el control de un promotor o intensificador de mamífero, preferiblemente CMV-IE. GFP es un gen informador que no requiere ningún sustrato para la detección y que puede ser utilizado como marcador de las células transgénicas. La construcción portadora del transgén GFP puede ser como la ilustrada en Takada y col., "Selective Production of Transgenic Mice Using Green Fluorescent Protein as a Marker", Nature Biotechnology (1997) 15:458-461, que se incorpora a la presente por referencia. La alteración del gen PrP endógeno utilizando tal método puede permitir una fácil identificación de las poblaciones celulares candidatas en las que ha tenido lugar el acontecimiento de recombinación homóloga, y la selección puede ser confirmada utilizando métodos más tradicionales tales como el análisis de Transferencia Southern.

La actividad del gen PrP endógeno en los hibridomas seleccionados que expresan los anticuerpos monoclonales hacia HER-2/NEU puede ser suprimida utilizando la tecnología de recombinación homóloga según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.627.059 y anteriormente en el Ejemplo 1. Las células hibridoma con el gen PrP alterado son seleccionadas utilizando un microscopio de fluorescencia. Las células hibridoma que expresan la GFP pueden ser expandidas clonalmente y posteriormente la población clonal puede ser sometida a selección por la presencia de PrP^{C} endógena. Las células hibridoma sin secuencias de PrP remanentes expresadas pueden ser clasificadas como "libres de priones" y los anticuerpos producidos por las mismas no presentarán riesgo de infección.

Ejemplo 4 Humanización de los anticuerpos monoclonales hacia HER-2/NEU

El ADNc que codifica el anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce HER-2/NEU (de aquí en adelante "ANTI-NEU") es modificado mediante PCR para que tenga secuencias de EcoRI y Kozak en el extremo 5' y sitios de HindIII y secuencias donadoras de ayuste en el extremo 3' (ver, por ejemplo, Maeda y col. (1991) Hum. Antibod. Hybridomas 2:124-134; Kettleborough y col. (1991) Protein Engng. 4:773-783). Las regiones V son posteriormente unidas a los genes que codifican las regiones constantes humanas bajo el control de la región del promotor-intensificador del factor de elongación humano 1-\alpha (HEF), con V_{L} unida a la región constante kappa humana y V_{H} unida a la región constante gamma-1.

El gen que codifica la región V_{L} del ANTI-NEU remodelado es construida mediante un método de injerto de CDR basado en PCR según está ilustrado en Sato y col., "Humanization of a Mouse Anti-Human Interleukin-6 Receptor Antibody Comparing Two Methods for Selecting Human Framework Regions", Mol. Immunol. (1994) 31:371-381. Se diseñaron ocho cebadores de PCR. Los cebadores externos A y H hibridan con secuencias de ADN del vector pUC19 en el que se ha clonado el ADNc que codifica el anticuerpo ANTI-NEU humanizado, y cada uno codifica un sitio de restricción de endonucleasas diferente para el clonaje. Los cebadores para el injerto de CDR B, C, D tienen las secuencias de ADN que codifican CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de las regiones variables del ANTI-NEU de ratón. Los cebadores complementarios E, F y G constan de 15-20 bases que son las secuencias de ADN complementarias en el lado 5' de los cebadores B, C y D, respectivamente. En la primera etapa de PCR, se llevan a cabo cuatro reacciones, las reacciones A-E, B-F, C-G y D-H, utilizando como molde secuencias de la cadena ligera humana clonadas en pUC19. En una segunda etapa, los cuatro productos de PCR procedentes de la primera etapa de la PCR son ensamblados por su propia complementariedad. Se añaden posteriormente a la reacción los cebadores externos y se amplifica el producto de ADN de longitud completa. El producto final de la PCR es digerido con las endonucleasas de restricción apropiadas y clonado en un vector pUC19. Una vez que el producto de la PCR es secuenciado para su verificación, el mismo es clonado en el vector de expresión HEF.

Se construye también el gen que codifica la región V_{H} del ANTI-NEU remodelado utilizando el método de injerto de CDR anteriormente descrito, empleando una secuencia de aminoácidos consenso para regiones V_{H} humanas pertenecientes al subgrupo I (HSG-I). Esta secuencia es también clonada en el vector de expresión HER.

La actividad del gen PrP^{C} endógeno en la línea celular COS es eliminada utilizando la tecnología de recombinación homóloga según se describió en el Ejemplo 1. Células COS con un gen PrP alterado son de este modo seleccionadas por la alteración del gen PrP mediante recombinación homóloga por la presencia de las secuencias de selección positivas y la ausencia de la secuencia de selección negativa. Las células COS con el gen PrP alterado son utilizadas posteriormente para producir los anticuerpos humanizados. Como estas células no contienen el gen PrP endógeno, no tienen ya el riesgo de infección por la forma PrP^{Sc} de la proteína. Estas células COS son por tanto clasificadas como una línea celular "libre de priones" y los productos producidos en esta línea celular pueden ser también caracterizados como "libres de priones", significando que los productos producidos a partir de tales líneas celulares libres de priones no presentan un riesgo para los individuos que reciban una terapia in vivo utilizando productos producidos a partir de estas líneas celulares.

Los vectores de expresión de la cadena ligera y la cadena pesada son cotransfectados en la línea COS carente de PrP mediante electroporación. Cantidades iguales de cada ADN plasmídico (10 \mug) son añadidas a 0,8 ml de células suspendidas en PBS a 1 x 10^{7} ml^{-1}. Se aplica un pulso de 1,9 kV, 25 \muF de capacitancia utilizando un aparato Gene Pulsar (BioRad). Después de un periodo de recuperación de 10 minutos a temperatura ambiente, las células electroporadas son añadidas a 20 ml de DMEM conteniendo un 10% de suero de ternera fetal libre de gammaglobulina (GIBCO). Después de una incubación de 2 horas, se recoge el medio, se centrifuga para eliminar los desechos celulares y se aplica a una columna de Proteína A agarosa (Affi-Gel Protein A MAPSII kit, BioRad) equilibrada con tampón de unión. El eluato es concentrado y el tampón cambiado a PBS utilizando un microconcentrador.

Ejemplo 5 Producción de anticuerpos monoclonales hacia SC-1

Puede encontrarse que las líneas celulares de hibridomas crezcan más eficazmente con una expresión limitada de PrP, y para este fin puede ser deseable el tener una expresión modulada de PrP en las células hibridoma. Esto puede conseguirse sustituyendo el gen PrP endógeno encontrado en las células hibridoma por un transgén que contenga una proteína PrP^{C} inducible que pueda ser suprimida para la producción de los anticuerpos. Las secuencias que codifican la PrP endógena de los hibridomas son sustituidas utilizando la inserción específica de sitio de un transgén que codifica una proteína PrP^{C} inducible. El procedimiento implica la vectorización de genes para introducir un sitio de FRT en la región genómica que contiene las secuencias del PrP endógeno con el fin de crear un "sitio aceptor del transgén", seguido por la inserción de una única copia del transgén en el sitio de FRT diana utilizando FRT-recombinasa (ver, por ejemplo, Wigley y col., Reprod. Fertil. Dev.).

Se produce un casete para insertar el gen PrP inducible en el genoma de los hibridomas y es insertado en el locus de PrP de las células hibridoma. Este casete contiene un gen de resistencia a neomicina totalmente funcional flanqueado por repeticiones directas del sitio de FRT. El neogén actuará como un marcador para selección positiva, y los acontecimientos de vectorización pueden ser monitorizados mediante análisis de Transferencia Southern para asegurarse de que no quedan secuencias del PrP endógeno. Una vez que se ha realizado todo esto, las células hibridoma serán transfectadas con una fuente de FLP-recombinasa para escindir el neogén. Esto generará un único sitio de FRT en un único locus de PrP, y la pérdida de neosecuencias puede ser monitorizada mediante análisis Southern. Se utiliza FLP-recombinasa para insertar una única copia del gen PrP inducible en el sitio de FRT recién creado. Esto implica la cotransfección de un plásmido que contiene una fuente de FLP y un plásmido que contiene las secuencias de PrP inducibles unidas a un único FRT.

Ejemplo 6 Humanización de los anticuerpos monoclonales hacia SC-1

El gen que codifica la región V_{L} del SC-1 remodelado es construido utilizando el protocolo de injerto de CDR del Ejemplo 4, y es introducido en un vector de expresión HER.

La región de la cadena pesada es diseñada sobre la base de la secuencia de aminoácidos de la región V_{H} del HAX humano, según está descrito en Dersimoninan y col. (1987) J. Immun. 139:2496-2501. Primeramente, la secuencia de V_{H} del SC-1 de ratón es comparada con la secuencia de V_{H} del HAX humano, y se diseña una V_{H} del SC-1 humano para remedar la estructura del anticuerpo de ratón. La secuencia de ADN de la V_{H} humana diseñada está dividida en 6 secuencias oligonucleotídicas solapantes de 90-94 pares de bases de longitud aproximadamente, con un solapamiento aproximado de 20 pares de bases. Tres de los oligonucleótidos tienen una secuencia de ADN sentido y los otros tres tienen una secuencia de ADN antisentido. Se diseñan también dos cebadores externos. Los seis oligonucleótidos son ensamblados y se amplifica el ADN de longitud completa con los cebadores externos. El producto de la PCR es digerido con EcoRI y HindIII y subclonado en un vector pUC19. Cada oligonucleótido es analizado por ordenador para determinar las posibles estructuras secundarias que podrían interferir con el ensamblaje.

Los vectores de expresión de la cadena ligera y de la cadena pesada son posteriormente cotransfectados en la línea COS carente de PrP inducible por tet mediante electroporación. Cantidades iguales de cada ADN plasmídico (10 \mug) son añadidas a 0,8 ml de células suspendidas en PBS a 1 x 10^{7} ml^{-1}. Se aplica un pulso de 1,9 kV, 25 \muF de capacitancia utilizando un aparato Gene Pulsar (BioRad). Después de un periodo de recuperación de 10 minutos a temperatura ambiente, las células electroporadas son añadidas a 20 ml de DMEM conteniendo un 10% de suero de ternera fetal libre de gammaglobulina (GIBCO). Después de una incubación de 2 horas, se recoge el medio, se centrifuga para eliminar los desechos celulares y se purifica.

Claims (15)

1. Un cultivo celular que comprende células huésped que tienen su genoma manipulado para que:

- expresen una molécula química o biológica útil en una composición terapéutica; y

- no expresen una proteína PrP debido a la alteración de cualquier secuencia de PrP endógena.

2. El cultivo celular de la reivindicación 1, en el que las células huésped son células de caballo, vaca, oveja, perro o primate.

3. El cultivo celular de la reivindicación 1, en el que las células huésped son células hibridoma.

4. Un método para producir una composición terapéutica libre de contaminación con priones infecciosos que comprende:

(i) la producción de una molécula terapéutica en células huésped, conteniendo dichas células huésped un gen PrP alterado o desorganizado artificialmente de tal manera que dichas células huésped no expresan PrP endógena;

(ii) el aislamiento de dicha composición terapéutica a partir de dichas células huésped; y

(iii) en el que la composición terapéutica aislada se caracteriza por la incapacidad para transmitir una patología mediada por priones a un sujeto de la misma especie que las células huésped.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la composición terapéutica es para uso terapéutico bovino, equino, ovino, canino, felino o humano.

6. El método de la reivindicación 4 ó 5, en el que la composición terapéutica es seleccionada del grupo que consta de: un péptido, una proteína, una molécula antisentido, un ribozima, un vector vírico, un vector de expresión y un plásmido.

7. El método de la reivindicación 4, en el que dicha producción de (i) comprende:

- la eliminación de un gen PrP endógeno en una célula huésped; y

- la manipulación del genoma de la célula con el fin de producir una composición terapéutica a partir de dicha célula huésped.

8. El método de la reivindicación 4, en el que dicha producción de (i) comprende:

- la supresión de la expresión de secuencias de PrP exógenas; y

- la manipulación del genoma de la célula con el fin de producir una composición terapéutica a partir de dicha célula huésped.

9. Un método para producir anticuerpos libres de contaminación con priones infecciosos que comprende:

- la inoculación de un mamífero con un antígeno con el fin de producir anticuerpos específicos para dicho antígeno;

- la fusión de linfocitos B aislados que expresen dichos anticuerpos con células huésped de mamífero que contienen un gen PrP alterado o desorganizado artificialmente de tal manera que dichas células huésped no expresan PrP endógena, con el fin de establecer una línea de hibridomas que exprese dichos anticuerpos;

- la producción de dichos anticuerpos; y

- el aislamiento de dichos anticuerpos.

10. El método de la reivindicación 9, en el que los anticuerpos son humanizados.

11. El cultivo celular de la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que se ha eliminado un alelo del gen PrP del genoma.

12. El cultivo celular de la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que se han eliminado ambos alelos del gen PrP del genoma.

13. El método de la reivindicación 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, en el que se ha eliminado un alelo de un gen PrP de las células huésped.

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14. El método de la reivindicación 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, en el que se han eliminado ambos alelos de un gen PrP de las células huésped.

15. Un método para producir una composición terapéutica libre de priones infecciosos, que comprende:

(i) la producción de un cultivo celular según se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 y la producción de una molécula terapéutica en el cultivo celular; y

(ii) el aislamiento de una composición terapéutica a partir del cultivo celular.