ES2251307A1 - Solucion para el mantenimiento indefinido de los acidos nucleicos en su celula de origen. - Google Patents
Solucion para el mantenimiento indefinido de los acidos nucleicos en su celula de origen.Info
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Abstract
Solución para el mantenimiento indefinido de los ácidos nucleicos en su célula de origen. La invención se refiere a un producto cuyas características permiten mantener una muestra biológica obtenida de un individuo en condiciones tales que la calidad de los ácidos nucleicos extraídos con posterioridad no se vea afectada garantizando su integridad independientemente del tiempo que pase desde la obtención de la muestra hasta la extracción del ácido nucleico. Para ello, se mezcla una muestra biológica ya sea sólida (órgano) o líquida (sangre, semen, cultivo celular, etc) de un eucarionte o procarionte en una solución que consiste en la mezcla de EDTA (ácido ethylen-diamine-tetraacetico) en su forma trisódica, de Fluoruro sódico (NaF) y la saturación con Timol (extraído de . Thymus vulgaris L.) para evitar la contaminación y el crecimiento bacteriano y su ajuste a un pH equivalente a 8. Esta solución permite la recogida de muestras y su permanencia a temperatura ambiente en ella durante tiempoindefinido para su posterior extracción de ácidos nucleicos y PCR, clonado, secuenciación, hibridación o mutagénesis, con garantías suficientes de integridad y fiabilidad.
Description
Solución para el mantenimiento indefinido de los
ácidos nucleicos en su célula de origen.
La presente invención se encuadra dentro del
sector de la biología molecular, en concreto sobre técnicas
genéticas. De forma más específica, la presente invención tiene que
ver con los métodos, reactivos y sistemas que mantienen los ácidos
nucleicos (ADN, ARN, ADNc, ADNmit) en su célula de origen
procedente de tejidos tanto sólidos (órganos) como líquidos
(fluidos corporales) durante un tiempo indefinido y a temperatura
ambiente manteniendo una calidad óptima.
Los análisis o pruebas diagnósticas basados en
los ácidos nucleicos (ADN y ARN) son cada vez más frecuentes en
laboratorios clínicos, hospitales, clínicas veterinarias, etc, y
permiten identificar genéticamente cualquier individuo, establecer
sus relaciones genéticas con familiares (madre, padre, hijo) o con
individuos de otras poblaciones (dentro de razas, especie, género,
familia, clase), detectar si es portador de una mutación en un
determinado gen, analizar la presencia de un agente infeccioso,
conocer el tipo de tumor que padece, etc.
Muchas de éstas pruebas se han llevado a cabo de
forma indirecta analizando marcadores genéticos concretos, pero en
los últimos años la utilización de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa o PCR (Mullis y col, Patentes N° US4, 683,195,
US4,683,202, US4,800,159, y US4,965,188) ha permitido análisis más
específicos, sensibles y baratos desde una perspectiva
molecular.
Para llevar a cabo estos análisis, se requiere un
ácido nucleico de buena calidad, es decir un ácido nucleico de
doble cadena, íntegro, no degradado ni fragmentado.
Son muchos los factores que afectan la calidad de
las muestras de ADN (tipo de tejido almacenado, aditivo utilizado,
tiempo y forma de transporte hasta el laboratorio) y la estabilidad
de los marcadores analizados y por lo tanto es importante decidir
cuál será el método de conservación antes de iniciar un banco de
ADN.
Existen numerosas referencias bibliográficas de
la conservación del ADN sin aditivo a temperatura ambiente: en
muestras de líquido amniótico durante 8 días (Casareale y col.,
1992. PCR Methods Appl. Nov;2(2):149-53), en
sangre los resultados varían desde 24h (Polakova y col, 1989.
Bratisl Lek Listy. Nov; 90(11):844-7.) hasta
un máximo de 4 semanas (Joss y Do, 1997. J Med Microbiol. Jan;
46(1):92-6), sangre depositada y secada sobre
un porta de cristal (Aggarwal, 1992. Genet Anal Tech Appl.
Apr;9(2):54-7), en enjuagues bucales
mantenidos durante más de 60-90 días a temperatura
ambiente (Andrisin, 2002. Pharmacotherapy.
Aug;22(8):954-60) que arrojan todos unos
resultados negativos. Los experimentos realizados a temperaturas
superiores (a 23°C durante una semana (Madisen y col, 1987. Am J
Med Genet. Jun;27(2):379-90) o a 37°C (Cushwa
y Medrano, 1993. Biotechniques,14(2):204-7)
también resultan en un ácido nucleico degradado. En caso de añadir
un aditivo, el ADN se mantiene en buenas condiciones después de 72
semanas cuando la muestra se ha mezclada con fenol (Albarino y
Romanowski, 1994. Mol Cell Probes.
Oct;8(5):423-7), con otro aditivo denominado
LST (Low cost Storage and Transportantion buffer) que mantiene la
muestra por un máximo de cuatro semanas a temperatura ambiente
antes de proceder a congelarla si se quiere mantener mas tiempo
(Schultz, 1999. Am J Clin Pathol.
Jun;111(6):748-52). Fukatsu (1999. Mol Eco.
Nov;8(11):1935-45.) observa una buena calidad
de ADN después de seis meses de conservación de las muestras en
acetona, etanol, 2-propanol, diethyl ether y ethyl
acetate.
Hay también una manera de conservar el ADN en las
células manteniendo la sangre recogida en un soporte en forma de
tarjeta de papel. Existen en el mercado diferentes tipos de
tarjetas: las tarjetas FTA de las que hay muchas referencias con
resultados poco homogéneos. Así Natarajan y col, 2000
(Biotechniques. Dec;29(6):1328-33) sin
especificar tiempo de almacenamiento consiguen resultados
satisfactorios de calidad de ADN pero otros autores muestran que
pierde sensibilidad con el tiempo para detectar la presencia de ADN
de patógenos como la malaria (Zhong y col, 2001. J Clin Microbio.
Mar;39(3):1195-6); lo mismo ocurre en las
tarjetas IsoCode STIX también disponibles comercialmente. Un tercer
trabajo, refleja que la sangre recogida en tarjetas FTA mantiene la
muestra de sangre incluso para extraer ARN al cabo de un año cuando
la temperatura de conservación es de -20°C y dos a tres meses a
temperatura ambiente (Natarajan y col, 2000. Biotechniques.
Dec;29(6):1328-33). Las tarjetas Guthrie son
tarjetas de papel de filtro en las que se deposita la sangre de los
recién nacidos para realizar estudios metabólicos y según Makowski
(2003. Ann Clin Lab Sci.
Summer;33(3):243-50) pueden servir de fuente
de ADN ya que permiten almacenar sangre durante varios años pero el
tamaño de la muestra es muy pequeño y no se conoce la calidad del
ADN extraído después de mucho tiempo. Sierra Diagnostics utiliza un
método basado en una mezcla de un quelante de metales bivalente que
puede ser EDTA, EGTA o BAPTA a baja molaridad (de 0,001 M a 0,1 M)
acompañados de cloruro de litio o guanidina o sodio salicilato o
sodio perclorato o sodio tiocianato para la conservación de
muestras de orina durante unas horas. Con este método patentado
(US006458546B1) mantienen las muestras de orina desde su recogida
hasta la extracción de ADN durante un periodo máximo de diez
días.
A pesar de todas estas alternativas, el
procedimiento más empleado para mantener muestras durante largos
periodos sin perder calidad de ADN es el de la congelación a
diferentes temperaturas: a -18°C entre 7 dias y 3 meses, 6 meses a
-70°C después de descongelar en varias ocasiones (Naber, 1996.
Diagn Mol Pathol. Dec;5(4):253-9.), al menos
dos meses a -70°C (Madisen y col, 1987. Am J Med Genet.
Jun;27(2):379-90) y se recomienda el uso de
esta última temperatura para el mantenimiento de tejidos y sangre y
solo se extrae el ADN cuando surge la necesidad (Holland y col,
2002. Mutation Res. 7702:1-18).
La recogida de muestras de sangre en condiciones
de campo solo se puede realizar con un anticoagulante (generalmente
EDTAK3 - Nielsen, 1985. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand [C].
Apr;93(2):49-52) a temperatura ambiente y
recortando al máximo el tiempo de llegada al laboratorio y de
extracción de ADN. Este tiempo puede alargarse unas horas si la
muestra así tomada es refrigerada alcanzando una temperatura de
5°C. En esas condiciones, la extracción de ADN debe ser inmediata
para evitar su degradación o la muestra debe ser congelada para
permitir mantener la integridad de los ácidos nucleicos que
contiene. Por todo ello, en los laboratorios se tiende a extraer el
ácido nucleico de interés de la muestra a su llegada para impedir
su degradación y asegurar la fiabilidad de los análisis. Estas
necesidades de extracción casi inmediata implican una incertidumbre
en la asignación de tareas en el laboratorio al estar condicionadas
por la llegada de un número desconocido y variable de muestras.
La adición de un producto antiséptico en la
solución de recogida, permitiría alargar la vida media de los
ácidos nucleicos en su célula a temperatura ambiente, al impedir el
crecimiento bacteriano y la actividad de las enzimas nucleasas
responsables de su degradación. Sin embargo, no existe ninguna
referencia que aluda a esta posibilidad. El timol es un antiséptico
y un desinfectante que destruye la vitalidad de fermentos vivos,
anulando las enzimas presentes en el medio, previene la aparición
de la putrefacción y la frena cuando ésta ya se ha iniciado. Una
cantidad pequeña de timol añadida al albumen, leche, gelatina la
mantiene durante meses (Harvey Wickes Felter, M.D., and John Uri
Lloyd, Phr. M., Ph. D., 1898).
El timol se ha usado como desinfectante disuelto
en agua (Giraldes, M.), como base para llevar a cabo inhalaciones
en afecciones respiratorias (Bouillhon y Paquet), para tratar la
difteria y otras enfermedades producidaspor microorganismos, el
reuma articular, el tifus, la ftisis y la pielitis, también como
helmíntico y para tratar afecciones cutáneas, en el caso de excema,
psoriasis o quemaduras. En la actualidad se utiliza casi
exclusivamente en soluciones colutorias para el tratamiento de la
gingivitis, preparados para inhalar asociado a camphor, linimentos
de uso tópico, anestésico tópico (http://www.uhecom/thymol
htm) y en general como un componente antiséptico y antioxidante
en la práctica médica y en la industria como estabilizador de
diferentes agentes terapeúticos como el halotano para la anestesia
(Effect of thymol on kinetic properties of Ca and K currents in rat
skeletal muscle. Szentandrássy et al., BMC
Pharmacology 2003, 3:9), y finalmente en el
tratamiento de la varroasis en la abeja, siendo un producto que
daña menos los insectos que un acaricida sintético como es el ácido
oxálico (Imdorf, A. et al., 1995. Toxicity of thymol,
camphor, menthol and eucalyptol in Varroa jacobsoni and Apis
mellifera in laboratory tests. Apidologie 26,
p.27-31).
En muchos casos la toma de muestras se realiza en
lugares muy alejados de los laboratorios que se van a encargar de
su procesado, en condiciones difíciles (altas temperaturas,
dificultad para disponer de un aparato refrigerador) que dificultan
no ya la congelación de la muestra, sino también la inmediata
refrigeración de ésta.
Parece por lo tanto necesario disponer de un
aditivo que mezclado con cualquier tipo de tejido (ya sea un
fragmento de órgano, un frotis recogido con un hisopo, etc) o de
cualquier fluido (sangre, semen, líquido amniótico, etc) va a
mantener las muestras en unas condiciones en las que los ácidos
nucleicos incluidos en las células permanecerán íntegros durante un
tiempo indefinido, incluso a temperatura ambiente.
Solución para el mantenimiento indefinido de los
ácidos nucleicos en su célula de origen.
La presente invención se refiere a un producto
cuyas características permiten mantener una muestra obtenida de un
individuo en condiciones tales que la calidad de los ácidos
nucleicos extraídos con posterioridad no se vea afectada,
garantizando su integridad independientemente del tiempo que pase
desde la obtención de la muestra hasta la extracción del ácido
nucleico y de la temperatura a la que se ha mantenido la muestra. En
concreto se trata de una solución para el mantenimiento indefinido
de los ácidos nucleicos en su célula de origen que permite mantener
cualquier muestra biológica obtenida de un individuo ya sea este un
eucarionte o un procarionte, a temperatura ambiente o siempre igual
o superior a 5°C.
Esto se ha conseguido mezclando la muestra en una
solución que contiene EDTA, NaF y Timol y equilibrando la mezcla a
pH = 8. EDTA es un potente quelante divalente de metales que actúa
eliminando cationes que componen enzimas
metalo-dependientes como DNAsas susceptibles de
provocar la degradación de los ácidos nucleícos; su presencia por
lo tanto inactiva estas enzimas. NaF es el segundo componente
presente en la solución siendo otro quelante que ayuda a la
inactivación de enzimas como son ligasas, polimerasas,
exonucleasas, quinasas, nucleasas y su presencia mejora la
capacidad quelante del EDTA. El tercer componente que integra la
solución es Timol que es un aceite esencial que se extrae del
tomillo (Thymus vulgaris L.) y que tiene un alto poder
antiséptico, antifúngico y antihelmíntico. El timol (o camphor del
tomillo) también llamado isopropyl-metacresol,
6-isopropyl-m-cresol,
3-hydroxy-p-cymene,
isopropyl cresol,
2-isopropyl-5-methylphenol,
tiene una fórmula molecular C10H14O y es un fenol cristalino
obtenido de los aceites volátiles de Thymus vulgaris, Linn.
(N.O. Labiatae), Monarda punctata, Linn. (N.O. Labiatae), Carum
copticum, Benth. and Hook. f. (N.O. Umbelliferae), y de otras
plantas.
El timol se parece al fenol en su modo de acción
a pesar de que debido a su insolubilidad en los fluidos corporales,
se absorbe de manera mucho más lenta. Es menos irritante, y su
acción germicida es mayor que el fenol. El timol es un potente
bactericida muy superior a los demás fenoles ("Factors that
interact with the antibacterial action of thyme essential oil and
its active constituents". Juven et al., Appl Bacteriol.
1994 Jun;76(6):626-31). El timol actúa sobre
la membrana celular produciendo una pérdida de la permeabilidad
selectiva de la membrana por cambio en sus propiedades físicas.
Esta acción sobre las membranas es común a todos los fenoles y es
debida a la coexistencia de una parte hidrófila y otra lipófila. El
timol produce proteinatos insolubles debido a la inactivación
enzimática y la desnaturalización proteíca, y es el factor que
impide la degradación de los ácidos nucleicos por la presencia de
enzimas y por lo tanto permite su integridad a largo plazo. El
metilo y la cadena isopropilo aumenta la actividad antiséptica de
manera más eficiente que en el caso del fenol ya que su toxicidad
es menor en comparación con el fenol.
De esta forma el producto se obtiene mezclando en
una solución una cantidad de un quelante divalente de metales EDTA
(ácido
ethylen-diamine-tetraacetico) a una
molaridad que varía entre 0,39 M y 0,56 M en su forma trisódica, un
compuesto que mejora la capacidad quelante del EDTA que es el
Fluoruro sódico (NaF) a una molaridad que varía entre 0,33 M y 0,48
M y la saturación de esta solución con Timol (menos de 0,0001 M)
para impedir el crecimiento de microorganismos en la muestra
mientras ésta es mantenida a temperaturas igual o superiores a +5°C
y el equilibrado del pH a un valor de 8.
La solución actúa sobre la membrana celular
produciendo cambios en las propiedades físicas que le hacen perder
la permeabilidad, también inactiva las enzimas degradadotas
quelando sus cationes y contribuye a la desnaturalización proteica
dando proteinatos insolubles.
La solución añadida a cualquiera de los tejidos o
fluidos corporales: órganos, tejidos tumorales, piel, médula ósea,
pluma, pelo, sangre, suero sanguíneo, líquido amniótico, huevo,
semen, saliva, fluido vaginal, sudor, permite el almacenamiento de
la muestra y el mantenimiento de los ácidos nucleicos incluidos en
ella durante un tiempo indefinido y a cualquier temperatura
superior a 5°C. Esta solución impide la destrucción enzimática de
los ácidos nucleicos e impide que aparezca un crecimiento
bacteriano, fúngico o helmíntico cuyo origen es ajeno a la muestra
y que aparece acompañado de enzimas que degradan los ácidos
nucleicos de interés además de añadir su propio ADN cuya presencia
sesgaría los resultados que se lleven a cabo posteriormente sobre
esa muestra.
La invención revela que para mantener un ácido
nucleico en su tejido de origen (un fragmento de tejido de un
órgano, de piel, de pluma, sangre, semen, líquido amniótico, fluido
vaginal etc) es necesario sumergir la muestra en una solución que
contenga EDTA (ácido
ethylen-diamine-tetraacetico) en su
forma trisódica a una concentración no menor de 0,39 M, Fluoruro
sódico (NaF) a una concentración no menor de 0,33 M y con la
saturación de la mezcla con Timol y su equilibrado a pH = 8. Los
ácidos nucleícos a los que se refiere la invención son cualquier
ácido nucleico: ácido desoxiribonucleico (ADN), ácido ribonucleíco
(ARN), ácido desoxiribonucleíco codificante (ADNc) y ácido
desoxiribonucleíco mitocondrial (ADNmit) contenido en cualquier
célula tanto eucarionte como procarionte.
La mezcla de la solución con la muestra biológica
permite mantener ésta en condiciones tales que la calidad del ácido
nucleico extraído unas horas o varios años después no se vea
afectada, garantizando su integridad independientemente del tiempo
que pase desde la obtención de la muestra hasta la extracción del
ácido nucleico y garantizando que los procesos que se lleven a cabo
ya sean amplificación mediante PCR, secuenciación, clonado,
hibridación, mutagénesis o técnicas similares de forma óptima o
técnicas similares, tengan una calidad y fiabilidad elevada,
prácticamente del 100%. Esta mezcla puede prepararse en forma
líquida, sólida o micronizada y permite mantener indefinidamente el
ácido nucleico en muestras de tejido y fluidos biológicos tanto en
todos los eucariontes, especialmente en vertebrados superiores,
como en procariontes.
La capacidad del procedimiento descrito para
mantener en la célula, un ácido nucleico en condiciones de realizar
cualquier tipo de análisis independientemente del tiempo que haya
transcurrido desde la toma de la muestra, se observa al comparar
muestras que incorporan la mezcla objeto de la invención y muestras
que no la incorporan mantenidas todas ellas a +5°C, empleando la
absorbancia que arrojan los ácidos nucleicos después de extraídos
en diferentes momentos a partir de la toma de la muestra, como
parámetro de calidad. Se puede comprobar que independientemente del
tiempo transcurrido, las muestras conservadas en la solución objeto
de la invención tendrán cifras equivalentes de cantidad de ADN,
mientras que cuando no están mantenidas en esa solución, la
cantidad de ADN aumenta en un principio debido al crecimiento
bacteriano y se degrada y cae hasta cero en unas semanas (figura
1).
La invención se acompaña de las siguientes
figuras que con carácter ilustrativo representan lo siguiente:
Figura 1 muestra la absorbancia de los ADN
extraídos de muestras conservadas o no en la solución para el
mantenimiento indefinido de ácidos nucleicos, y mantenidas a +5°C
hasta 8 años.
Figura 2 muestra el ADN extraído a las 48 h y a
los 8 meses de muestras de sangre conservadas o bien en la solución
obtenida, que contiene EDTA, NaF y Timol, según se describe en el
contenido de esta memoria, o bien en EDTA K_{3} mantenidas a +5°C
o en EDTA K_{3} a -20°C.
- Calle 1: \lambda,
- Calle 2-7: sangre + invención
- Calle 8-22: sangre + EDTA K_{3} en refrigeración
- Calle 23-36: sangre + EDTA K_{3} en congelación.
Figura 3 muestra el resultado cuando las muestras
son extraídas (la sangre con lisis alcalina y el tejido con fenol
cloroformo) después de mantener la muestra durante 8 meses a +5°C
en la solución que describe el contenido de esta memoria y que
contiene EDTA, NaF y Timol y pH 8.
- Calle 1: \lambda
- Calle 2-6: sangre
- Calle 7-11: músculo
- Calle 12-15: pelo
- Calle 16-20: cartílago.
Figura 4 muestra el ADN extraído de las muestras
de diferentes tejidos conservadas sin aditivo a las 48h (calle
1-7) y sin aditivo y en congelación (calles
8-12), visualizadas en gel de agarosa 0,6%.
- Calle 1: \lambda
- Calle 2-3: sangre
- Calle 4-5: músculo
- Calle 6: pelo
- Calle 7: cartílago
- Calle 8-9: sangre
- Calle 10: músculo
- Calle 11: pelo
- Calle 12: cartílago
Figura 5 es el ADN extraído de diferentes
muestras (sangre, músculo, cartílago, pelo) mantenidas durante 8
meses en EDTA K_{3} a -20°C.
- Calle 1: \lambda
- Calle 2-8: sangre
- Calle 9-14: músculo
- Calle 15-21: cartílago
- Calle 22-24: pelo
Como resultado de la eficacia de la solución para
el mantenimiento indefinido de los ácidos nucleicos, se han llevado
a cabo unos experimentos en los que se han considerado como efectos
principales diferentes tejidos biológicos, diferentes tipos de
tratamiento, uno de los cuales era la solución objeto de la
invención, y diferentes tiempos desde el momento de obtención de la
muestra biológica.
El material biológico ha consistido en sangre,
cartílago de oreja, pelo, músculo.
Para cada tejido, se han analizado 50 individuos
diferentes, y para cada una de las muestras se han llevado a cabo 5
réplicas.
La conservación de las muestras se realizó a tres
temperaturas (Temperatura ambiente, Refrigeración entre 5°C y 7°C y
Congelación a -20°C) y con tres tratamientos diferentes (Sin
aditivo, con EDTA K3 y con el aditivo objeto de la
reivindicación).
Las muestras se mantuvieron durante un mínimo de
48 horas y un máximo de 8 meses en las diferentes condiciones de
conservación. La extracción de ADN en las condiciones que se
detallan a continuación se realizó tanto a las 48 horas desde la
toma de la muestra biológica, como al finalizar el período de 8
meses.
Se presenta un método de extracción de ADN
genómico realizado a partir de muestras de sangre mantenida a
temperatura ambiente y con el aditivo de la solución para el
mantenimiento indefinido de ácidos nucleícos, objeto de esta
invención.
La solución aquí descrita consistente en 1 gr de
EDTA trisódico, 100 mgrs de NaF y 0,1 mgr de Timol y pH 8, es
introducida en un tubo de 5 ml de capacidad al que se ha aplicado
vacío. Se recogen 5 ml de sangre por venopunción, a continuación se
agita suavemente el tubo por inversión para mezclar los reactivos y
la sangre. El tubo se mantiene a temperatura ambiente durante una
semana y se almacena durante tiempo indefinido a 5°C. Cuando se
decide extraer el ADN, se deja el tubo a temperatura ambiente
durante la noche anterior para conseguir una homogeneización de la
sangre y la solución.
Para extraer cantidades grandes de ADN (más de 5
\mug de ADN), se toman entre 1 ml y 3 ml de sangre + la solución.
Se añade el mismo volumen de Tris ClH 10 mM + EDTA 10 mM, se agita
y centrifuga durante 3 minutos y se retira el sobrenadante cuidando
de no apurar el fondo para no perder el sedimento que contiene las
células. Se repite la operación, se añade el mismo volumen de Tris
ClH 10 mM + EDTA 1 mM, a continuación se agita y centrifuga durante
3 minutos y se retira el sobrenadante. Se añade una solución de
lisis consistente en 250 \mul de una mezcla de NaCl 0,1 M y EDTA
25 mM, 12,5 pl de SDS al 10%, 0,1 mg de Proteinasa K y se incuba a
37°C durante dos o más horas, se añade fenol + cloroformo + alcohol
isoamílico en una proporción 25:24:1. Finalmente se centrifuga
durante 10 minutos y recoge el sobrenadante, se precipita el ADN
con etanol al 100% después de añadir 40 \mul de NaAc 3 M a
pH=5,2.(figura 2 y 3).
Para este ejemplo las cantidades de tejido de las
que se partieron fueron de 500 mgr de músculo, de 50 mgr de
cartílago. Los distintos tejidos se trataron con una solución que
contiene NaCl 0,14 M; MgAc 1,5 mM; ClK 5 mM; SDS 1% y un
tratamiento manual de homogeneización dejando además macerar el
tejido durante unos minutos. A esta mezcla se añade
fenol-cloroformo-alcohol isoamílico
en una proporción 25:24:1. Después de agitar durante 10 minutos, se
centrifuga 5 minutos, se recoge el sobrenadante (la fase acuosa) y
a éste se añade NaAc 3M (pH=5,2) y se precipita con etanol absoluto,
recogiendo el ovillo que forman los ácidos nucleicos al
precipi-
tar.
tar.
El resultado de esta extracción se puede ver en
la figura 4.
Se presenta un método de extracción de ADN
genómico a partir de una muestra de sangre contenida en la solución
objeto de la invención.
La solución aquí descrita consistente en 1 gr de
EDTA trisódico, 100 mgrs de NaF y 0,1 mgr de Timol es introducida
en un tubo de 5 ml de capacidad al que se ha aplicado vacío.
Se recogen 5 ml de sangre por venopunción, se
agita suavemente el tubo por inversión para mezclar los reactivos y
la sangre, el tubo se almacena a temperatura ambiente durante
tiempo indefinido. Al llegar al laboratorio, se recomienda su
almacenamiento a 5°C. Cuando se decida extraer el ADN, es necesario
dejar el tubo a temperatura ambiente durante la noche anterior para
conseguir una homogeneización de la sangre y la solución obtenida.
Se retira con una pipeta la cantidad que se necesita para realizar
el análisis (por ejemplo para una amplificación de uno o varios
genes: 50 \mul; para un test de hibridación, 100 \mul). Esa
cantidad de sangre + solución se pasa a un tubo limpio y se añade
100 \mul de H_{2}O destilada. Se agita y centrifuga durante 3
minutos, se retira el sobrenadante, se repite la operación dos
veces más y se añade al sedimento 100 \mul de NaOH 0,25 M y se
incuba durante 15 minutos, pasado ese tiempo se añade 100 \mul de
ClH 0,25 M, se mezcla y se añade 100 \mul de Tris ClH 0,1 M y pH
=8,5; a continuación se centrifuga y se cogen entre 2 a 5 \mul
del sobrenadante para una PCR. Ver Figuras 2 y 3.
Claims (8)
1. Solución para el mantenimiento indefinido de
los ácidos nucleicos en su célula de origen caracterizada
porque se compone de:
\bullet EDTA (ácido
ethylen-diamine-tetraacético) en una
cantidad que varía entre 0,39 M y 0,56 M en su forma trisódica
(Na_{3}).
\bullet Fluoruro sódico (NaF) a una molaridad
que varía entre 0,33 M y 0,48 M.
\bullet la saturación de esta solución con
Timol (extraído de Thymus vulgaris L aproximadamente 0,0001
M).
\bullet El equilibrado del pH con ClH hasta
alcanzar un valor de 8.
2. Solución para el mantenimiento indefinido de
los ácidos nucleicos en su célula de origen, según reivindicación
anterior, caracterizada porque la cantidad de EDTA en un
litro de solución varía entre 140 gr y 200 gr.
3. Solución para el mantenimiento indefinido de
los ácidos nucleicos en su célula de origen, según reivindicación
1, caracterizada porque la cantidad de NaF en un litro de
solución varía de 14 gr a 20 gr.
4. Solución para el mantenimiento indefinido de
los ácidos nucleicos en su célula de origen, según reivindicación
1, caracterizada porque la cantidad de Timol en un litro de
solución varía entre 5 y 10 mg.
5. Solución para el mantenimiento indefinido de
los ácidos nucleicos en su célula de origen, según reivindicación
1, caracterizada porque el pH es igual a 8.
6. Solución para el mantenimiento indefinido de
los ácidos nucleicos en su célula de origen, según reivindicaciones
anteriores, caracterizada porque al agregarse a una muestra
biológica obtenida de un individuo ya sea éste un eucarionte, un
procarionte, ésta se mantiene a temperaturas igual o superiores a
+5°C y en condiciones tales que la calidad de los ácidos nucleicos
extraídos con posterioridad no se vea afectada, garantizando su
integridad independientemente del tiempo que pase desde la obtención
de la muestra hasta la extracción del ácido nucleico.
7. Solución para el mantenimiento indefinido de
los ácidos nucleicos en su célula de origen, según reivindicación
anterior, donde la muestra biológica puede ser sangre, un órgano o
fragmento, un tejido sano o no (tumoral, inflamatorio), piel,
pluma, médula ósea, huevo, suero sanguíneo, líquido amniótico,
semen, saliva, fluido vaginal, sudor, heces, orina, pelo o un
cultivo celular.
8. Solución para el mantenimiento indefinido de
los ácidos nucleicos en su célula de origen , según
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque puede ser
una solución acuosa, sólida o micronizada.
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