ES2251084T3 - Policetidos y su sintesis y uso. - Google Patents
Policetidos y su sintesis y uso.Info
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Abstract
Procedimiento para producir un policétido que comprende modificar un grupo génico implicado en la biosíntesis de un policétido seleccionado entre rapamicina, FK506 e inmunomicina, incluyendo dicho grupo génico un gen ("el gen precursor") responsable de la producción de una enzima que es responsable de la producción de L-pipecolato, comprendiendo dicho procedimiento: (a) la etapa de eliminar o inactivar dicho gen precursor para producir un grupo génico modificado; y (b) expresar el grupo génico modificado en presencia de un compuesto precursor alternativo que se selecciona entre L-prolina, L-trans-4-hidroxiprolina, L-cis-4-hidroxiprolina, L-cis-3-hidroxiprolina y ácido trans-3-aza-biciclo[3,l,0]hexano-2-carboxílico, de manera que dicho compuesto precursor alternativo se incorpora en lugar de L-pipecolato, de modo que se produce un policétido alternativo.
Description
Policétidos y su síntesis y uso.
La presente invención se refiere a policétidos y
a su síntesis y uso. Se refiere particularmente, pero no
exclusivamente, a variantes de rapamicina.
La rapamicina (véase la figura 2) es un macrólido
lipófilo de peso molecular 914, con un resto
1,2,3-tricarbonilo unido a una lactona del ácido
pipecólico. La secuenciación de los posibles genes biosintéticos de
la rapamicina ha revelado la presencia de tres marcos de lectura
abiertos excepcionalmente grandes que codifican para la policétido
sintasa modular (Schwecke y cols., P.N.A.S. 92 (17)
7839-7843 (1995)). En ambos lados de estos genes
muy grandes, se disponen marcos de lectura abiertos que parecen
codificar para las enzimas que podrían requerirse en la biosíntesis
de rapamicina.
El grupo ("cluster") también contiene un gen
novedoso (rapL), cuyo producto se cree que cataliza la formación del
precursor de la rapamicina L-pipecolato (2) a
través de la ciclodesaminación de la L-lisina (1)
(Molnar y cols., Gene 169, 1-7 (1996)):
DENOYA CD Y COLS., en el documento J BACTERIOL,
JUNIO DE 1995, 177 (12) PÁGS. 3504-11 dan a conocer
un mutante alterado de Streptomyces que no puede fabricar
las avermectinas naturales en un medio que carece tanto de
S(+)-alfa-metilbutirato como de
isobutirato. La complementación con uno de estos compuestos
restablece la producción de las avermectinas naturales
correspondientes, mientras que la complementación del medio con
ácidos grasos alternativos da como resultado la formación de
avermectinas novedosas.
HAFNER EW Y COLS., en el documento J ANTIBIOT
(TOKIO), MARZO DE 1991, 44 (3) PÁGS. 349-56 dan a
conocer mutantes de Streptomyces incapaces de crecer con
isoleucina, valina y leucina como fuentes de carbono. En un medio
que carece tanto de ácido
S(+)-2-metilbutírico como ácido
isobutírico, el mutante tampoco puede fabricar avermectinas
naturales; la complementación con uno de estos compuestos
restablece la producción de las cuatro avermectinas naturales
correspondientes.
DUTTON CJ Y COLS., en el documento J ANTIBIOT
(TOKIO), MARZO DE 1991, 44 (3) PÁGS. 357-65 dan a
conocer mutantes de estreptomicina que carecen de la capacidad de
formar ácidos isobutírico y
S-2-metilbutírico a partir de sus
precursores de 2-oxoácidos y por tanto no pueden
producir avermectinas naturales a menos que se suministren estos
ácidos. Se proporciona una lista completa de precursores
alternativos.
LOMOVSKAYA, N. Y COLS., en el documento
MICROBIOLOGY, 143 1997, 875-883 dan a conocer
alteración y sustitución génicas en el Streptomyces
hygroscopicus, productor de rapamicina, con fagos.
El documento EP0589703 da a conocer derivados de
prolina de rapamicina y procedimientos para su producción mediante
Streptomyces hygroscopicus.
La biosíntesis de rapamicina requiere una
policétido sintasa modular, que utiliza una unidad iniciadora
("starter") derivada de shikimato y que lleva un total de
catorce ciclos sucesivos de alargamiento de cadena de policétidos
que se asemeja a las etapas en la biosíntesis de ácidos grasos.
Después se incorpora el ácido L-pipecólico a la
cadena, seguido por el cierre del anillo macrocíclico, y se cree que
ambas etapas están catalizadas por una enzima que incorpora
pipecolato (PIE), el producto del gen rapP. Después se requieren
oxidaciones específicas de lugar y etapas de
O-metilación adicionales para producir rapamicina.
O-metilación adicionales para producir rapamicina.
Ahora se ha encontrado que se puede crear
mediante ingeniería genética un microorganismo de S.
hygroscopicus en el que el gen (rapL) está inactivo. El
microorganismo no puede producir rapamicina en condiciones de
crecimiento normales, pero puede hacerlo si se suministra
pipecolato. Además, el hecho de suministrar al microorganismo
mutante diferentes sustratos conduce a la producción de variantes
de rapamicina. Puede aplicarse el mismo método general a otros
sistemas en los que participa un compuesto precursor que se produce
mediante un producto génico, por ejemplo, los sistemas FK506 y de
inmunomicina muy estrechamente relacionados en los que también
participa
pipecolato.
pipecolato.
Así, según la presente invención, en un primer
aspecto se proporciona un procedimiento para producir un policétido
que incluye modificar un grupo génico implicado en la biosíntesis
de un policétido, seleccionado entre rapamicina, FK506 e
inmunomicina, incluyendo dicho grupo génico un gen ("el gen
precursor") responsable de la producción de una enzima que es
responsable de la producción de L-pipecolato (que se
incorpora en dicho policétido), comprendiendo dicho procedimiento
la etapa de eliminar o inactivar dicho gen precursor. De manera
adecuada, dicho procedimiento de eliminar o inactivar dicho gen
precursor emplea sustitución génica mediada por fagos. En
realizaciones preferidas de la invención, el grupo génico es el
grupo génico para la producción de rapamicina en S.
hygroscopicus y el gen precursor es el gen rapL cuyo
producto es responsable de la producción de
L-pipecolato.
El procedimiento para producir un policétido
incluye además una etapa de expresar el grupo génico modificado en
presencia de un compuesto precursor alternativo seleccionado entre
L-prolina,
L-trans-4-hidroxiprolina,
L-cis-4-hidroxiprolina,
L-cis-3-hidroxiprolina
y ácido
trans-3-azabiciclo[3,l,0]hexano-2-carboxílico
que se incorpora en lugar de L-pipecolato, de modo
que se produce un policétido alternativo.
En aspectos adicionales, la invención proporciona
policétidos que pueden producirse mediante el método anterior,
productos farmacéuticos que comprenden dichos policétidos y el uso
de tales policétidos para preparar composiciones farmacéuticas, por
ejemplo, inmunosupresores que contienen variantes de rapamicina.
Algunas realizaciones de la invención se
describirán ahora más detalladamente con referencia a los dibujos
adjuntos en los que:
la figura 1 muestra una parte del grupo génico de
la rapamicina, tipo natural y mutado, y el vector fágico utilizado
para llevar a cabo la mutación;
la figura 2 muestra estructuras de rapamicina y
algunas variantes; y
las figuras 3 y 4 ilustran los efectos de
rapamicina y las variantes en las líneas celulares linfoblastoides
humanas.
Con el fin de facilitar la producción de
rapamicinas alternativas, se creó un mutante cromosómico de S.
hygroscopicus mediante sustitución génica mediada por el fago
\PhiC31 usando el método de Lomovskaya y cols. [Microbiology (UK)
1997, 143, 815-883]. Se encontró un único
sitio BamH I de 42 pb en el gen rapL (1032 pb de longitud). Este
sitio BamH I se eliminó mediante relleno de extremos con la ADN
polimerasa I de E. coli, creando así una mutación del marco
de lectura en el gen rapL. Se clonó un fragmento de EcoR I de 3 kb
que englobaba todo el gen rapL flanqueado por rapK y parte de los
genes rapM respectivamente, en el vector fágico, KC515. Se utilizó
el fago recombinante para transfectar S. hygroscopicus. Un
acontecimiento de recombinación doble resultó en la creación de un
mutante cromosómico de S. hygroscopicus con una mutación del
marco de lectura en rapL. Esto se resume en la
figura 1.
figura 1.
Nota: también se remite al lector a L.E. Khaw y
cols., J. Bacteriol., 180 (4) 809-814 (1998)
tanto para los detalles y discusión experimentales del trabajo como
para los antecedentes de ello.
Materiales. Todas las enzimas de biología
molecular y los reactivos procedían de fuentes comerciales. La
viomicina fue un regalo de Pfizer, el ácido
L-pipecólico, L-prolina,
3,4-deshidroprolina, ácido picolínico, ácido
pirrol-2-carboxílico,
trans-4-hidroxiprolina,
cis-4-hidroxiprolina,
cis-3-hidroxiprolina y ácido
(\pm)-trans-3-aza-biciclo-[3,1,0]hexano-2-carboxílico
se obtuvieron de Aldrich Chemical Company.
Se hizo crecer Escherichia coli DH1OB
(GibcoBRL) en medio 2x(extracto de triptona - levadura) tal
como describen Sambrook y cols, ("Molecular Cloning", Cold
Spring Harbor (1989)). Se obtuvo el vector pUC18 de New England
Biolabs. o de Sigma Chemical Co. Se seleccionaron los
transformantes de E. coli con 100 mg/mL de ampicilina. El
productor de rapamicina Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491
(de ATCC) y sus derivados se mantuvieron en agar SY (1,5% de
almidón soluble; 0,1% de extracto de levadura; 0,1% de
K_{2}HPO_{4}; 0,1% de MgSO_{4} x 7 H_{2}O; 0,3% de NaCl;
tampón de ácido
N-tri[hidroximetil]metil-2aminoetanosulfónico
(Tes) 30 mM, pH 7,4; 1,5% de agar), y se cultivaron en caldo de
cultivo de soja tríptica con el 1,0% de glucosa, MES 100mM pH 6,0,
complementado con
10 ug/mL de viomicina en caso necesario. Se cultivó S. lividans J11326 (D A Hopwood y cols: "Genetic Manipulation of Streptomyces: a laboratory manual", The John Innes Foundation, Norwich, Inglaterra (1985)) en YEME (Hopwood y cols., 1985) o medio con agua del grifo (0,5% de glucosa; 1% de sacarosa; 0,5% de triptona; 0,25% de extracto de levadura; 36 mg de EDTA; pH 7,1).
10 ug/mL de viomicina en caso necesario. Se cultivó S. lividans J11326 (D A Hopwood y cols: "Genetic Manipulation of Streptomyces: a laboratory manual", The John Innes Foundation, Norwich, Inglaterra (1985)) en YEME (Hopwood y cols., 1985) o medio con agua del grifo (0,5% de glucosa; 1% de sacarosa; 0,5% de triptona; 0,25% de extracto de levadura; 36 mg de EDTA; pH 7,1).
Se hicieron crecer cultivos líquidos a 30ºC en
matraces Erlenmeyer con agitación a 200-250 rpm. La
infección con el actinofago KC515 de atr (Hopwood (1985) op.
cit. y K. F. Chater en: "The Bacteria" IX
(119-158), Nueva York 1986) y su derivado
\Phi\DeltarapL (presente trabajo) se llevó a cabo sobre medio de
ADN sólido complementado con MgSO_{4} 10 mM, Ca(NO_{3})
8 mM y 0,5% de glucosa (Hopwood y cols., 1985).
Las manipulaciones de ADN, los procedimiento de
PCR y electroporación se llevaron a cabo tal como se describe en
Sambrook y cols (1989). Se aisló el ADN total de S.
hyqroscopicus usando el conjunto de aislamiento de ADN genómico
de Gibco. Se realizaron hibridaciones de tipo Southern con sondas
marcadas con digoxigenina usando el conjunto de marcación de ADN
DIG (Boehringer Mannheim). Se aislaron los fragmentos de ADN para
marcar y subclonar con el conjunto de extracción en gel Qiaex
(Qiagen).
Se construyó pUC3EcoRI mediante clonación de un
fragmento de Eco RI de 3034 pb (nucleótidos 93956 a 96990 del grupo
rap) (T. Schwecke y cols., P.N.A.S. 92,
7839-7843 (1995)) que englobaba todo el gen
rapL flanqueado por rapK y parte de los genes
rapM, respectivamente, en un vector modificado con pUC18,
cortado con Eco RI en el que se ha eliminado el sitio de
Bam HI en la región del policonector. Se encontró un único
sitio Bam HI (empezando en el nucleótido 95036 del grupo rap)
de 42 pb en el gen rapL (nucleótido 95078 a 94047 del grupo
rap; 1032 pb de longitud). Se digirió el plásmido pUC3Eco RI
con Bam HI y los extremos cohesivos se rellenaron mediante
tratamiento con ADN polimerasa I de E. coli (fragmento
Klenow). El ADN plasmídico ligado se digirió nuevamente con
Bam HI y se utilizó para transformar E. coli. Se
seleccionaron transformantes resistentes a ampicilina y se comprobó
su ADN plasmídico para determinar la eliminación del sitio
Bam HI mediante análisis enzimático de restricción. Esto se
confirmó mediante secuenciación de ADN. El inserto de 3 kb se
escindió del plásmido con Eco RI y los extremos cohesivos se
volvieron extremos romos mediante tratamiento con ADN polimerasa I
de E. coli (fragmento Klenow). El inserto con extremos romos
se clonó en el vector KC515 fágico cortado con Pvu II, dando
como resultado \Phi\DeltarapL.
Se transfectaron protoplastos de S.
lividans J11326 con el constructo fágico tal como describen
Hopwood y cols. (1985). Se identificó el fago recombinante usando
análisis con PCR. Se realizó la infección de S. hygroscopicus
NRRL 5491 con \Phi\DeltarapL según Lomovskaya y cols
(Microbiology, 143, 875-883 (1997)) en placas
de ADN complementadas con glucosa, MgSO_{4} y Ca(NO_{3}).
Se seleccionaron lisógenos recubriendo las placas con 50
\mug.mL^{-1} (concentración final) de viomicina a las 24 h
después de la infección. Las cepas que habían experimentado un
segundo acontecimiento de recombinación eliminando el fago
integrado, se identificaron mediante selección de aislados
sensibles a viomicina tras tres rondas de crecimiento no selectivo y
esporulación en placas de SY. La inserción y la subsiguiente
pérdida del fago se confirmaron mediante hibridaciones genómicas de
tipo Southern.
El suministro de precursores de \DeltarapL de
S. hygroscopicus se realizó de manera habitual en matraces
de 500 mL que contenían 100 mL de caldo de cultivo de soja tríptica
con el 1,0% de glucosa, MES 100 mM pH 6,0, complementado con el
análogo apropiado de ácido pipecólico, a una concentración final de
1 mg/mL. También se cultivó \DeltarapL de S. hygroscopicus
en matraces de 2 L que contenían 400 mL de medios químicamente
definidos tal como describen Cheng y cols (Appl. Microbiol.
Biotechnol. 43 1096-1098 (1995)). Para
la fermentación a gran escala, se utilizaron 10 \muL de esporas
de \DeltarapL de S. hygroscopicus para inocular un matraz
de 100 mL que contenía 30 mL de medio de caldo de cultivo de soja
tríptica. El matraz se incubó en un agitador rotatorio (300 rpm) a
28ºC durante 4 días. Se transfirieron 4 mL del primer cultivo de
siembra a un matraz de 2 L (segundo cultivo de siembra) que
contenía
400 mL del medio y se incubó sobre un agitador rotatorio (300 rpm) a 28ºC durante 4 días. El segundo cultivo de siembra se transfirió a un fermentador de 20 L que contenía 15 L del medio. Se añadió trans-4-hidroxiprolina al medio de manera aséptica hasta una concentración final de 1 mg/mL. La fermentación se llevó a cabo a 28ºC durante 4 días, con una velocidad de agitación de 500 rpm. Se recogieron y se extrajeron las células durante la noche con dos veces su volumen de metanol.
400 mL del medio y se incubó sobre un agitador rotatorio (300 rpm) a 28ºC durante 4 días. El segundo cultivo de siembra se transfirió a un fermentador de 20 L que contenía 15 L del medio. Se añadió trans-4-hidroxiprolina al medio de manera aséptica hasta una concentración final de 1 mg/mL. La fermentación se llevó a cabo a 28ºC durante 4 días, con una velocidad de agitación de 500 rpm. Se recogieron y se extrajeron las células durante la noche con dos veces su volumen de metanol.
Después de 3-4 días de
fermentación, se recogieron micelios mediante filtración y se
extrajeron con dos volúmenes de metanol a temperatura ambiente
durante 1 h. Se analizaron los extractos brutos mediante
cl-em usando un LCQ de Finnigan MAT (San José, CA)
con una HPLC de Hewlett-Packard 1100. La
fermentación a gran escala se llevó a cabo de manera similar. El
extracto bruto se evaporó hasta sequedad y después se purificó
mediante cromatografía ultrarrápida (gel de sílice de Merck 60, nº
9385) con acetona/hexano 1/1. Las fracciones que contenían
rapamicinas se purificaron adicionalmente mediante HPLC preparativa
en una columna RP18 de 250 x 20 mm (HPLC Technology, Macclesfield,
RU) usando condiciones habituales. La fermentación de 15 L dio como
resultado aproximadamente
15 mg de prolilrapamicina pura y 3 mg de 4-hidroxi-prolil-26-desmetoxi-rapamicina. Los espectros de RMN se determinaron en un espectrofotómetro Bruker DRX.
15 mg de prolilrapamicina pura y 3 mg de 4-hidroxi-prolil-26-desmetoxi-rapamicina. Los espectros de RMN se determinaron en un espectrofotómetro Bruker DRX.
La rapamicina induce una detención específica del
ciclo celular en G1 en la línea celular 536, que es una línea de
linfocitos B humanos inmortalizada mediante infección con virus de
Epstein-Barr. Se comparó la potencia de cada análogo
con la de la rapamicina usando células 536 como bioensayo. Las
células 536 (obtenidas del depósito de células genéticas humanas
mutantes, Camden, Nueva Jersey, EEUU) se cultivaron en medio de
Iscove complementado con un 10% de suero bovino fetal. Para el
bioensayo, se sembraron las células 536 en placas de
microtitulación de 96 pocillos a 10.000 por pocillo en 100 \muL
de medio de crecimiento. Se prepararon reservas de fármaco de 1 mM
en DMSO y se realizaron diluciones adicionales para dar una
concentración final constante de DMSO al 0,1% en medio de
crecimiento. Se trataron los cultivos de control con DMSO al 0,1%
en medio de crecimiento; los cultivos experimentales recibieron una
concentración final de rapamicina o análogo de rapamicina 10^{-7}
M, 10^{-8} M, 10^{-9} M o
10^{-10} M. Cada cultivo se realizó por triplicado y las placas replicadas se marcaron con 1 \muCi de timidina tritiada (Amersham International, actividad específica de 70 Ci/mM) por pocillo durante 3h a 0h; 24h; o 48h de la incubación con fármacos. En los puntos de tiempo respectivos, se recogieron los cultivos sobre papel de fibra de vidrio para atrapar el ADN tras la lisis del agua; se eliminaron mediante lavado los nucleótidos libres. Se determinó la radiactividad incorporada en los discos de filtro / ADN atrapado en un contador de centelleo usando líquido de centelleo biodegradable.
10^{-10} M. Cada cultivo se realizó por triplicado y las placas replicadas se marcaron con 1 \muCi de timidina tritiada (Amersham International, actividad específica de 70 Ci/mM) por pocillo durante 3h a 0h; 24h; o 48h de la incubación con fármacos. En los puntos de tiempo respectivos, se recogieron los cultivos sobre papel de fibra de vidrio para atrapar el ADN tras la lisis del agua; se eliminaron mediante lavado los nucleótidos libres. Se determinó la radiactividad incorporada en los discos de filtro / ADN atrapado en un contador de centelleo usando líquido de centelleo biodegradable.
Para confirmar que el producto génico rapL está
realmente implicado en la biosíntesis de rapamicina como un
suministrador de precursores, se aisló el mutante cromosómico con
mutación del marco de lectura \DeltarapL de S.
hygroscopicus tal como se describe en Materiales y métodos. Esta
mutación se investigó mediante hibridación por inmunotransferencia
de tipo Southern usando el fragmento de EcoRI de 3 kb
(93956-96990) para detectar mediante sonda el ADN
cromosómico digerido por Bgl II/Bam HI. El análisis del tipo
natural de S. hygroscopicus muestra los fragmentos de Bam
HI/Bgl II esperados de 5,9 kb (que representa los nucleótidos
89118-95036) y de 2,7 kb (que representa los
nucleótidos 95036-97710) tras hibridación. Cuando el
ADN cromosómico de \DeltarapL de S. hygroscopicus se trató
de manera similar, sólo se detectó un fragmento de Bam HI/Bgl II de
8,6 kb (que representa los nucleótidos 89118-97710),
lo que indica que se ha eliminado el sitio de Bam HI en la posición
95036. Esto se confirmó mediante análisis con PCR. Se sometió el
ADN cromosómico a PCR usando cebadores de oligonucleótidos idénticos
a, respectivamente, las secuencias de desde el nucleótido 93950
hasta 93968; y desde 96990 hasta 97010. Se amplificó a partir del
ADN de tipo natural el fragmento de ADN de 3 kb esperado y, tras la
digestión con Bam III, se detectaron dos bandas de aproximadamente
2 kb y 1 kb de tamaño. En las muestras que contenían ADN
cromosómico de \DeltarapL de S. hygroscopicus se encontró
que el producto de PCR de 3 kb amplificado era resistente a la
digestión por BamHI.
A los cultivos de crecimiento del mutante
\DeltarapL de S. hygroscopicus se suministraron diferentes
precursores de aminoácidos (tabla 1). Se encontró que sólo se
incorporaban los tres derivados de prolina como se observó mediante
CL-EM. El principal derivado de rapamicina en las
fermentaciones además de prolilrapamicina es un compuesto con m/z
de 908 que podría corresponder a una
hidroxi-rapamicina que carece de un grupo metoxilo.
También se detectaron cantidades menores de un compuesto con m/z de
938 que podría corresponder a
hidroxi-prolil-rapamicina. Los
experimentos de fragmentación con EM, así como los espectros UV
característicos indicaron claramente que estos compuestos son
derivados de rapamicina con una hidroxiprolina incorporada. Con el
fin de conseguir suficiente material para la caracterización
mediante RMN, se añadió hidroxiprolina en gran escala al mutante
(15 L de caldo) y se aislaron 3 mg del compuesto con m/z de 908
como se describe en Materiales y métodos. Los datos de RMN
(tabla 2) mostraron los desplazamientos y acoplamientos químicos esperados para el sistema de espín de hidroxiprolina. Los desplazamientos químicos que cambiaron para las posiciones 26 y 27 y los desplazamientos que no cambiaron para las posiciones 38-40 en comparación con la rapamicina demostraron que en la posición 26 faltaba el grupo metoxilo. Los datos de la fragmentación con EM (tabla 3) confirmaron estos hallazgos. Esto puede deducirse a partir de la pérdida del fragmento C15-C26 que conduce a un fragmento con m/z de 644 para ambos derivados de rapamicina nuevos. Además, la pérdida del fragmento C28-C42 (322 uma) puede observarse en ambos compuestos, así como en la rapamicina, lo que indica que no hay modificación en esta parte de las moléculas. Los iones a m/z de 807 y 777, respectivamente, que son equivalentes a la pérdida del aminoácido (131 uma) confirman la presencia de OH-prolina. Esto significa que el compuesto con m/z de 938 es 4-hidroxiprolil-rapamicina.
(tabla 2) mostraron los desplazamientos y acoplamientos químicos esperados para el sistema de espín de hidroxiprolina. Los desplazamientos químicos que cambiaron para las posiciones 26 y 27 y los desplazamientos que no cambiaron para las posiciones 38-40 en comparación con la rapamicina demostraron que en la posición 26 faltaba el grupo metoxilo. Los datos de la fragmentación con EM (tabla 3) confirmaron estos hallazgos. Esto puede deducirse a partir de la pérdida del fragmento C15-C26 que conduce a un fragmento con m/z de 644 para ambos derivados de rapamicina nuevos. Además, la pérdida del fragmento C28-C42 (322 uma) puede observarse en ambos compuestos, así como en la rapamicina, lo que indica que no hay modificación en esta parte de las moléculas. Los iones a m/z de 807 y 777, respectivamente, que son equivalentes a la pérdida del aminoácido (131 uma) confirman la presencia de OH-prolina. Esto significa que el compuesto con m/z de 938 es 4-hidroxiprolil-rapamicina.
| Compuesto suministrado | Incorporación | Masa | Tiempo de retención | Producto principal |
| (m/z. M+Na^{-}) | CL-EM (min.) | |||
| Ácido L-pipecólico | Sí | 936 | 8,84 | Rapamicina |
| L-prolina | Sí | 922 | 7,99 | Prolil-rapamicina |
| L-trans-4-hidroxi-prolina | Sí | 938/908 | 5,35/6,29 | 4-hidroxi-prolil-rapami- |
| cina y 4-hidroxi-prolil- | ||||
| 26-desmetoxi-rapamicina | ||||
| L-cis-4-hidroxi-prolina | Sí | 938/908 | 5,35/6,29 | como arriba |
| Compuesto suministrado | Incorporación | Masa | Tiempo de retención | Producto principal |
| (m/z. M+Na^{-}) | CL-EM (min.) | |||
| L-cis-3-hidroxi-prolina | Sí | 938/908 | 5,35/6,29 | 3-hidroxi-prolil-rapami- |
| cina y 3-hidroxi-prolil- | ||||
| 26-desmetoxi-rapamicina | ||||
| Ácido picolínico | No | |||
| Ácido pirrol-2-carboxílico | No |
| Posición | ^{1}H8 (ppm) | ^{13}C8 (ppm) |
| 1 | 171,30 | |
| 2 | 5,24 | 58,17 |
| 3 | 2, 65, 1,69 | 38,48 |
| 4 | 4,38 | 70,63 |
| 5 | 3, 37, 2,94 | 56,53 |
| 26 | 3,58 | no determinado |
| 27 | 3,89 | 70,63 |
| 38 | 2,93 | 83,90 |
| 39 | 3,37 | 73,95 |
| 40 | 1, 99, 1,33 | 31,22 |
| 49 | 3,12 | 55,68 |
| 51 | 3,39 | 56,50 |
| m/z de rapamicina | m/z de 4-hidroxi-prolil-rapamicina | m/z de 4-hidroxi-prolil-26-desme- |
| toxi-rapamicina | ||
| 936 | 938 | 908 |
| 904 | 906 | 876 |
| 807 (pérdida de pipecolato, | 807 (pérdida de hidroxiprolina, | 777 (pérdida de hidroxiprolina, |
| 129 uma) | 131 uma) | 131 uma) |
| 642 | 644 | 644 |
| 614 | 616 | 586 |
| 596 | 598 | 568 |
| 582 | 584 | 554 |
| 564 | 566 | 536 |
Se llevó a cabo una fermentación de 2 L de
\DeltarapL de S. hygroscopicus a la que se suministró
ácido
(+/-)-trans-3-aza-biciclo[3.l.0]hexano-2-carboxílico
(0,5 mg.mL^{-1}) durante 5 días en medio TSBGM (Khaw y cols.,
(1998) J. Bacteriol. 180, 809-814.). Se
recogieron las células mediante filtración y se extrajeron con 1 L
de metanol a 4ºC durante la noche. En esta etapa se realizó el
análisis de espectrometría de masas por electrospray y
cromatografía de líquidos a alta presión
(HPLC-ESIEM) del extracto de metanol bruto usando
un CL de Hewlett-Packard 1100 unido a un
espectrómetro de masas LCQ de Finnigan-Mat. Se
detectó ácido
trans-3-aza-biciclo[3.1.0]hexano-2-carboxílico-rapamicina
en el caldo de fermentación.
Se combinaron y concentraron los extractos de
metanol a presión reducida. Se diluyó el residuo acuoso con
500 mL de agua destilada y se extrajo tres veces con 500 ml de acetato de etilo destilado. Los extractos de acetato de etilo combinados se secaron con sulfato de sodio anhidro y se evaporaron hasta sequedad. El residuo amarillo resultante se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida en una columna de gel de sílice de 150 mm x 30 mm (diámetro) [Merck 60] que se eluyó de manera isocrática con una mezcla 1:1 (v/v) de acetona/hexano.
500 mL de agua destilada y se extrajo tres veces con 500 ml de acetato de etilo destilado. Los extractos de acetato de etilo combinados se secaron con sulfato de sodio anhidro y se evaporaron hasta sequedad. El residuo amarillo resultante se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida en una columna de gel de sílice de 150 mm x 30 mm (diámetro) [Merck 60] que se eluyó de manera isocrática con una mezcla 1:1 (v/v) de acetona/hexano.
Se analizaron las fracciones mediante
espectrometría de masas por electrospray. Se utilizaron
EM-EM y EM^{n} para determinar la estructura de la
nueva rapamicina en las fracciones a partir de la columna de sílice
ultrarrápida.
Las fracciones que contenían ácido
trans-3-aza-biciclo[3.l.0]hexano-2-carboxílico
se purificaron adicionalmente mediante HPLC preparativa de fase
inversa en una columna Prodigy ODS3 (Phenomenex) de 250 x 20 mm
(diámetro) usando elución con gradientes empezando a 70/30 (v/v) de
acetonitrilo/agua, aclarando linealmente hasta el 100% de
acetonitrilo durante 25 minutos. La fermentación de 2 L dio como
resultado aproximadamente 4 mg ácido
trans-3-aza-biciclo[3.l.0]hexano-2-carboxílico-rapamicina
puro.
La EM de alta resolución del ácido
trans-3-aza-biciclo[3.l.0]hexano-2-carboxílico-rapamicina
en un espectrómetro de masas Bruker BioApex FTICR usando ionización
por electrospray, dio un ion molecular con sodio a m/z de 934,52776,
lo que confirmó que la fórmula molecular era
C_{5l}H_{77}NO_{l3}.
Se midió la respuesta a la dosis de las líneas
celulares linfoblastoides humanas 536. En el experimento mostrado
en la figura 3, la cpm media de la timidina radiomarcada
incorporada en los controles no tratados muestra que la exposición
al fármaco durante 0-3h no tenía un efecto
apreciable sobre la síntesis de ADN hasta 100 nM de rapamicina,
prolilrapamicina o
4-hidroxi-prolil-26-desmetoxi-rapamicina.
Esto implica que ninguno de los compuestos era tóxico para la línea
celular 536. Tras 24 y 48 horas (figura 4), las células 536
mostraron una inhibición de la síntesis de ADN dependiente de la
concentración con una DI del 50% de 1 nM para rapamicina; y 3 nM
para prolilrapamicina.
4-hidroxi-prolil-26-desmetoxi-rapamicina también era inhibitoria pero no alcanzó el 50% a 100 nM. Los experimentos previos han mostrado que la rapamicina es un potente inhibidor de la progresión a G1 en la línea celular 536 (Metcalfe y cols., Oncogene 15, 1635-1642 (1997)). Esto también se sugiere en estos experimentos para los análogos de rapamicina, ya que no se encontró ningún efecto significativo a las 3 h pero se observó inhibición una vez que la población celular tuvo tiempo de continuar a través de un ciclo celular completo (24 h) y había alcanzado el punto de detención farmacológica.
4-hidroxi-prolil-26-desmetoxi-rapamicina también era inhibitoria pero no alcanzó el 50% a 100 nM. Los experimentos previos han mostrado que la rapamicina es un potente inhibidor de la progresión a G1 en la línea celular 536 (Metcalfe y cols., Oncogene 15, 1635-1642 (1997)). Esto también se sugiere en estos experimentos para los análogos de rapamicina, ya que no se encontró ningún efecto significativo a las 3 h pero se observó inhibición una vez que la población celular tuvo tiempo de continuar a través de un ciclo celular completo (24 h) y había alcanzado el punto de detención farmacológica.
Claims (6)
1. Procedimiento para producir un policétido que
comprende modificar un grupo génico implicado en la biosíntesis de
un policétido seleccionado entre rapamicina, FK506 e inmunomicina,
incluyendo dicho grupo génico un gen ("el gen precursor")
responsable de la producción de una enzima que es responsable de la
producción de L-pipecolato, comprendiendo dicho
procedimiento: (a) la etapa de eliminar o inactivar dicho gen
precursor para producir un grupo génico modificado; y (b) expresar
el grupo génico modificado en presencia de un compuesto precursor
alternativo que se selecciona entre L-prolina,
L-trans-4-hidroxiprolina,
L-cis-4-hidroxiprolina,
L-cis-3-hidroxiprolina
y ácido
trans-3-aza-biciclo[3,l,0]hexano-2-carboxílico,
de manera que dicho compuesto precursor alternativo se incorpora en
lugar de L-pipecolato, de modo que se produce un
policétido alternativo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que dicho procedimiento de eliminar o inactivar dicho gen precursor
emplea una sustitución génica mediada por fago.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el grupo génico es el grupo génico para
la producción de rapamicina en S. hygroscopicus y el gen
precursor es rapL.
4. Compuesto seleccionado entre
4-hidroxi-prolil-rapamicina,
4-hidroxiprolil-26-desmetoxi-rapamicina,
3-hidroxi-prolil-rapamicina,
3-hidroxiprolil-26-desmetoxi-rapamicina
y ácido
trans-3-aza-biciclo[3,1,0]hexano-2-carboxílico-rapamicina,
en el que la prolilrapamicina se describe en la figura 2.
5. Composición farmacéutica que comprende un
compuesto según la reivindicación 4.
6. Uso de un compuesto según la reivindicación 4
en la fabricación de una composición inmunosupresora.
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