ES2250363T3 - Guanilhidrazonas aromaticas farmaceuticamente activas. - Google Patents
Guanilhidrazonas aromaticas farmaceuticamente activas.Info
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Abstract
Uso del compuesto de fórmula (N, N¿-bis(3, 5-diacetilfenil)decano diamida tetrakis (amidinohidrazona)), o una sal de él para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las infecciones causadas por cadenas de VIH-1 resistentes a los fármacos o por el virus de la hepatitis B resistente a la lamivudina.
Description
Guanilhidrazonas aromáticas farmacéuticamente
activas.
La presente invención proporciona compuestos
guanilhidrazona aromáticos y su uso como agentes farmacéuticamente
activos, especialmente para la profilaxis y el tratamiento de
enfermedades e infecciones causadas por virus, incluyendo
infecciones oportunistas. Los compuestos guanilhidrazona también son
útiles como inhibidores de la desoxihipusina sintasa y como
inhibidores para la exportación nuclear en enfermedades infecciosas.
Además, se dan a conocer los métodos para el tratamiento de
infecciones y enfermedades inducidas por virus junto con las
composiciones farmacéuticas útiles dentro de dichos métodos.
Las muertes de lo que se ha reconocido como
infección VIH con fallo inmune se han visto clínicamente, sin
haberse entendido, durante al menos 35 años, y probablemente más
tiempo. Un marino británico infectado de VIH, que había viajado
extensamente, se cree que murió con deficiencia inmune severa e
infección de VIH en 1959, el primer caso probado del SIDA
moderno.
El material genético de la cadena de
VIH-1 más común es muy similar a la de un virus
conocido por infectar naturalmente a chimpancés, y puede ser que los
antepasados del VIH hayan estado presentes en África, quizás incluso
en humanos, durante mucho tiempo, quizás centenares de años. En
África Occidental, un primo cercano del VIH-1,
llamado VIH-2, es casi idéntico para varios virus de
monos africanos indígenas y casi con certeza ha derivado de ellos
bastante recientemente en el tiempo evolutivo de los virus (menos de
varios siglos).
En primer lugar, el término "SIDA" significa
Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida, pero siempre se ha
entendido que la cantidad de inmunodeficiencia en la que estamos
interesados no es una cantidad trivial. SIDA es el nombre escogido
históricamente para un nuevo síndrome médico que es esencialmente
fatal al 100%, y así al definir "SIDA" estamos buscando
personas con una inmunodeficiencia en el rango amenazador para la
vida, y que continuará empeorando sin cesar hasta que la vida sea
imposible. Una forma de definir la inmunodeficiencia es definirla
mediante las llamadas "infecciones oportunistas", enfermedades
raramente vistas en personas cuyo sistema inmunitario es
completamente funcional. En los primeros días del SIDA, antes de que
se descubriera el VIH, el síndrome se definió de hecho usando tales
enfermedades oportunistas.
En la historia del SIDA pronto se encontró que el
defecto inmunitario en esta enfermedad es peculiar y que involucra
de forma muy visible a un tipo particular de células en los tejidos
sanguíneos y linfáticos (nódulos linfáticos), llamadas "linfocitos
T". En el síndrome del SIDA, ciertos linfocitos T desaparecen
gradualmente de los tejidos sanguíneos y linfáticos y un simple
recuento de linfocitos T en la sangre puede indicar la seriedad de
la reducción en ambos sitios (ya que los linfocitos sanguíneos
provienen de los órganos linfáticos). El brazo del sistema
inmunitario que es controlado más directamente por los linfocitos T
(la defensa del cuerpo contra virus y hongos) es más defectuoso en
el SIDA, y las infecciones víricas y fúngicas son la mayoría
infecciones oportunistas que aparecen y causan la muerte en el
SIDA.
Después de que se identificara el VIH, los
estudios estadísticos lo escogieron rápidamente como la respuesta
más probable propuesta para la causa del SIDA. El VIH tiene la
típica estructura de lentivirus, idéntica a las del VIF y VIS. Se
encontró que las personas infectadas con VIH desarrollaron en la
sangre anticuerpos frente a él normalmente un mes o dos después de
la infección y los mantuvieron de por vida. Sin embargo, la
presencia de anticuerpos en la sangre durante años no parecía
preservar a las personas con VIH de ponerse finalmente muy enfermas.
Hoy se sabe que los lentivirus son capaces de mutar para escapar de
los anticuerpos del huésped, de manera que los anticuerpos
encontrados en la misma sangre que estos virus a menudo no los
neutralizan, especialmente en el curso tardío de la enfermedad [J.
Acquir. Immune. Defic. Syndr. 7:211-219, 1994]. El
VIH infecta preferiblemente células CD4+, que se pierden en los
pacientes de SIDA.
Sin embargo, muchas personas aparentemente se
recuperaron totalmente después de una infección inicial de VIH y se
sintieron bien. Como con otros lentivirus, fue sorprendente el largo
periodo de latencia del VIH antes de la enfermedad secundaria. En
una persona con SIDA, hasta el 13% de los linfocitos y monocitos en
la sangre se encontraban infectados [N Engl J Med
326:1385-1391,1992]. Del 93% al 100% del tiempo, se
pudieron recuperar virus infecciosos y ADN viral de la sangre de
personas asintomáticas que eran VIH positivas, y el 100% del tiempo
de personas con SIDA [N Engl J Med. 321:1621-5,1989;
AIDS 6:373-377, 192; AIDS 8:895-900,
1994]. Se pudieron cultivar niveles más elevados de virus a partir
de tejidos linfáticos de personas en las que se estaba multiplicando
activamente, incluso en personas que parecían sanas [Clin Res
40:333, 1992; Proc Natl Acad Sci USA 88:9838-9842,
1991; J Infect Dis. 164:1051-1057, 1991; J Acquir
Immune Defic Syndr 6:655-662, 1993]. Como los monos
infectados de VIS y los gatos infectados de VIF destinados a un
futuro fallo inmunitario, las personas VIH positivas aún estaban
infectadas, y la mayoría aún estaban perdiendo lentamente células
inmunitarias en los tejidos linfáticos.
A menudo también aparecieron infecciones
oportunistas, como la infección de levaduras candida en la
garganta (a menudo la primera infección), o la inusual neumonía
fúngica causada por Pneumocystis carinii (este organismo es
reprimido particularmente por los linfocitos CD4+, y por eso es una
de las primeras infecciones en llegar cuando baja su número). Con la
aparición de estos marcadores de enfermedad secundaria, ahora la
persona infectada se decía que tenía "SIDA maduro" o
simplemente SIDA.
La propagación de los lentivirus en la naturaleza
involucra un complejo sistema bio-ecológico en el
cuál interactúan el huésped, el parásito y una gama de problemas
sociales y ambientales. Los virus se diseminan exclusivamente por
intercambio de fluidos corporales. Todos los factores que facilitan
tal intercambio a gran escala pueden potenciar epidemias y
epizootias.
Criterios similares de organización genómica
viral, morfología, y propiedades biológicas conducen a la inclusión
del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en la familia de los
lentivirus. Llamado originalmente virus asociado a la linfadenopatía
(VAL), virus linfotrópico III de las células T humanas
(VLTH-3) o retrovirus asociado al SIDA (RVA) por los
respectivos pioneros en el campo, fue sustituido por el nombre VIH
por el Comité de Nomenclatura de Virus. Nuevas inclusiones
posteriores dentro de la familia de los lentivirus, basadas en
criterios similares, fueron los virus simios, felinos y bovinos.
Todos estos agentes se llamaron virus de inmunodeficiencia
(siguiendo el precedente del VIH) independientemente de si causaron
inmunodeficiencia o, por este hecho, cualquier enfermedad. La tabla
1 siguiente da un resumen de los miembros ya conocidos de la familia
lentivirus.
| Virus | Huésped | Enfermedades |
| VAIE | Caballo | Anemia, emaciación |
| VMV | Oveja | Neumonía, emaciación, artritis, mastitis, encefalitis |
| VEAC | Cabra | artritis, mastitis, encefalitis |
| VIB | Ganado | ninguna |
| VIF | Gato | Inmunodeficiencia, encefalitis, emaciación |
| VISs | Varias especies de monos africanos | ninguna |
| VIH-1, VIH-2 | Humanos | \begin{minipage}[t]{73mm}Inmunodeficiencia, neumonía, encefalopatía, emaciación, gastroenteropatía, nefropatía\end{minipage} |
Los VIS y VIF se descubrieron varios años después
del VIH y la lección que permanece de los estudios del VIS y VIF es
que los lentivirus solos en algunas circunstancias son bastante
capaces de causar lentamente la muerte por inmunosupresión.
El VIF es llamado el "SIDA de los gatos". El
virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) es un lentivirus
descubierto en Petaluma, California, en 1986, donde se obtuvo por
primera vez de la sangre de dos gatos domésticos que vivían en un
hogar en el cual hubo un cierto número de muertes de gatos de un
extraño desorden de deficiencia inmunitaria.
Con respecto al número de individuos infectados
de VIH, cada día se infectan con el virus aproximadamente 16000
personas en todo el mundo, sucediendo el 95% de nuevos casos en
países en desarrollo (sobre todo África). Más de 2,6 millones de
personas murieron de SIDA solamente en 1999, el número más alto
registrado desde que se empezaron a reunir datos sobre la enfermedad
a principios de los 80. Según la American Medical Association,
alrededor de 45 millones de personas en todo el mundo están
infectadas con VIH. De los más de 2,6 millones de personas
fallecidos por enfermedades asociadas con el SIDA en 1999, unos
550000 fueron niños menores de 15 años. Aunque la esperanza de vida
aumentó muy significativamente por la introducción de nuevos
tratamientos, en el momento actual no existe cura para el SIDA.
La hepatitis es una inflamación del hígado que
muy a menudo está causada por la infección de uno de los cinco virus
de la hepatitis A, B, C, D ó E. En algunos casos, particularmente en
aquellos relacionados con la hepatitis B y C, puede resultar una
"hepatitis crónica". La hepatitis crónica se produce cuando el
cuerpo no es capaz de eliminar completamente el virus incluso aunque
no persistan los síntomas. La presencia continua del virus a lo
largo de cierto número de años puede conducir a cirrosis (hígado
cicatrizado) o a carcinoma hepatocelular (cáncer de hígado). Se
estima que aproximadamente 350 millones de personas en todo el mudo
están infectadas con hepatitis B crónica. El VHB se transmite a
través del contacto sexual, transmisión vertical (madre a hijo en el
nacimiento) o por entrar en contacto con sangre contaminada. Se
estima que más de 2 billones de personas en todo el mundo se han
infectado con el virus de la hepatitis B. De estos 2 billones,
aproximadamente 350 millones de personas han desarrollado la
infección crónica del VHB, poniéndoles en elevado riesgo de
desarrollar cirrosis y cáncer de hígado (World Health Organization
Fact Sheet on Hepatitis B, Nov. 1998).
| INCIDENCIA: | 140000 - 320000 infecciones/año en los Estados Unidos |
| PREVALENCIA: | Estimados 1 - 1,25 millones de infectados crónicos americanos |
| COSTES: | Estimados \textdollar700 millones (1991 dólares)/año (pérdidas médicas y de trabajo). |
Los soportes crónicos del VHB se han definido
como aquellos que son positivos en el antígeno de superficie del VHB
durante más de 6 meses. Aproximadamente el 5-10% de
estas personas que están infectadas con el virus se volverán
soportes, un 5-10% estimado de estas personas
infectadas cada año progresarán hacia la enfermedad crónica del
hígado, cirrosis y posiblemente cáncer de hígado. Aproximadamente
5000 personas mueren en Estados Unidos cada año en relación con el
VHB, 1000 mueren de cáncer de hígado relacionado con el VHB. El
periodo de incubación del VHB normalmente dura de 2 a 4 meses,
aunque puede ser muy corto (10 días) o extremadamente largo (9
meses). Antes de la aparición de la enfermedad aguda son detectables
los antígenos HBs y HBe en el suero de los pacientes. El comienzo de
la hepatitis aguda se caracteriza por la aparición de anticuerpos
anti-HBc, que al principio pertenecen exclusivamente
a la clase IgM. Desde este momento los anticuerpos
anti-HBc serán detectables en el suero del paciente
durante el resto de su vida, no importa si hay una hepatitis B
aguda, una forma de infección persistente de virus o alguna
inmunidad al VHB adquirida naturalmente.
El suceso más significativo que indica el curso
crónico de la hepatitis B es la ausencia de la seroconversión
HBsAg/anti-HBs. Si este fenómeno no ha sucedido
durante los 6 meses después del inicio de la enfermedad, se tienen
que considerar la persistencia de la infección de VHB y los cuadros
clínicos relacionados (soporte HBsAg asintomático, hepatitis
crónica, cirrosis o hepatoma).
Aunque el tratamiento monoterapia con
Epivir-VHB (lamivudina, 3TC) o Intron A
(interferon-alfa) muestra algunos beneficios para la
hepatitis crónica B, hay la necesidad de terapias adicionales.
Actualmente, los fármacos que están en desarrollo incluyen
Coviracil/FTC, DAPD, L-FMAU (Triagle
Pharmaceuticals), adefovir dipivoxil, tenofovir (Gilead Sciences),
epavudine, epcitabine (Novicio Pharmaceuticals), así como lobucavir,
Famvir/penciclovir, entecavir/BMS-200475, racivir,
DXG, pro-fármaco L-ddA,
HDP-P-aciclovir,
LM-019c, CS-1091,
PS-019, PS-018,
pro-fármacos ara-AMP, limosina,
(-)-Carbovir, ribozimas martillo e inhibidores de la
glicosidasa. Por consiguiente, son muy necesarios los nuevos
fármacos antivirales.
Block T y col.: Glucosidasa/inhibidores
del plegamiento de la proteína como posibles agentes virales
anti-hepatitis B y C a prueba de mutación. Resumen y
presentación oral 16 en la 3ª International Conference on Therapies
for Viral Hepatitis, Diciembre 12-16, 1999;
Maui, USA y Antiviral Therapy 1999; 4 (Suplemento 4),
8.
Cretton-Scott E. y col.:
Farmacocinética de la
beta-L-timidina y
beta-L-2'-desoxicitidina
en marmotas de Norteamérica y monos. Resumen y presentación en
póster 124 en la 3ª International Conference on Therapies for Viral
Hepatitis, Diciembre 12-16, 1999; Maui, USA y
Antiviral Therapy 1999; 4 (Suplemento 4), 50.
Hernández B. y col.: Quinasas celulares
involucradas en la fosforilación de la
beta-L-timidina y
beta-L-2'-desoxicitidina,
dos agentes virales específicos anti-hepatitis B.
Resumen y presentación en póster 123 en la 3ª International
Conference on Therapies for Viral Hepatitis, Diciembre
12-16, 1999; Maui, USA y Antiviral
Therapy 1999; 4 (Suplemento 4), 49.
Hostetler KY. y col.: Actividad oral de
1-0-hexadecil-propanodiol-3-P-aciclovir
en marmotas de Norteamérica con hepatitis crónica de las marmotas de
Norteamérica y sinergia con lamivudina in vitro. Resumen y
presentación en póster 80 en la 3ª International Conference on
Therapies for Viral Hepatitis, Diciembre 12-16,
1999; Maui, USA y Antiviral Therapy 1999; 4
(Suplemento 4), 29.
Juodawlkis A. y col.: Actividad antiviral
de la beta-L-timidina y
beta-L-2'-desoxicitidina
en el modelo marmota de Norteamérica de la infección de hepatitis
crónica B. Resumen y presentación en póster 97 en la 3ª
International Conference on Therapies for Viral Hepatitis, Diciembre
12-16, 1999; Maui, USA y Antiviral
Therapy 1999; 4 (Suplemento 4), 37.
Ono-Nita SK. y col.:
Investigación de nuevos antivirales para el virus tipo salvaje de la
hepatitis B y tres mutantes resistentes a la lamivudina. Resumen y
presentación en póster 89 en la 3ª International Conference on
Therapies for Viral Hepatitis, Diciembre 12-16,
1999; Maui, USA y Antiviral Therapy 1999; 4
(Suplemento 4), 33.
Placidi L. y col.: Farmacología celular de
la beta-L-timidina y
beta-L-2'-desoxicitidina
en células HepG2 y hepatocitos primarios de rata, mono y humano.
Resumen y presentación en póster 122 en la 3ª International
Conference on Therapies for Viral Hepatitis, Diciembre
12-16, 1999; Maui, USA y Antiviral
Therapy 1999; 4 (Suplemento 4), 48.
Sommadossi J-P y col.:
L-nucleósidos específicos del virus de la
anti-hepatitis B. Resumen y presentación oral 19 en
la 3ª International Conference on Therapies for Viral Hepatitis,
Diciembre 12-16, 1999; Maui, USA y
Antiviral Therapy 1999; 4 (Suplemento 4), 8.
Ying C. y col.: Inhibición de la
replicación de la variante ADN polimerasa M550V del virus de la
hepatitis B por adefovir, tenofovir, L-FMAU, DAPD,
peniciclovir y lobucavir. Resumen y presentación en póster 76 en la
3ª International Conference on Therapies for Viral Hepatitis,
Diciembre 12-16, 1999; Maui, USA y
Antiviral Therapy 1999; 4 (Suplemento 4), 27.
El virus del Herpes simplex es un patógeno humano
altamente adaptado con un ciclo lítico de replicación extremadamente
rápido, e incluso con la habilidad de invadir neuronas sensoriales
donde se produce la expresión génica altamente restringida con
ausencia de citopatología.
Tales infecciones latentes están sujetas a
reactivación, por medio de la cuál el virus infeccioso se puede
recuperar en el tejido periférico enervado por las neuronas
infectadas de forma latente siguiendo un estrés fisiológico
específico. Un factor principal en estos "conmutadores" desde
la infección lítica a la latente y hacia atrás involucra la
interacción entre los promotores virales, el genoma viral y la
maquinaria transcripcional celular. Los virus del Herpes simplex
tipo 1 y 2 se asocian generalmente con la infección facial
mucocutánea (herpes labialis), la infección genital (herpes
genitalis), la infección oftálmica (herpes keratitis) y la infección
neonatal. Las lesiones generalmente se curan solas, pero la
infección permanece, con el virus estableciendo una infección
latente en las neuronas. En huéspedes inmunocomprometidos, la
recurrencia del VHS-1 puede causar lesiones
fulminantes progresivas que son resistentes a la terapia antiviral
actual. La infección neonatal normalmente se extiende
sistemáticamente y puede conducir a encefalitis. La terapia
antiviral actual como Acyclovir no elimina la infección viral. Se
necesitan nuevas terapias para eliminar el virus latente o bien para
reprimir el desarrollo de las lesiones a largo plazo.
El virus de Epstein-Barr,
referido frecuentemente como VEB, es un miembro de la familia de los
herpesvirus y uno de los virus humanos más comunes. El virus se
encuentra en todo el mundo y la mayoría de personas se infectan con
VEB alguna vez durante sus vidas. En los Estados Unidos, hasta el
95% de los adultos entre 30 y 40 años se han infectado. Los bebés se
vuelven susceptibles al VEB tan pronto como desaparece la protección
de los anticuerpos maternos (presente en el nacimiento). Muchos
niños se infectan con VEB y estas infecciones normalmente no causan
síntomas o son indistinguibles de otras enfermedades breves y suaves
de la infancia. En los Estados Unidos y en otros países
desarrollados muchas personas no se infectan con el VEB en su
infancia. Cuando la infección con VEB ocurre durante la adolescencia
o la joven edad adulta, causa mononucleosis infecciosa del 35% al
50% de las veces.
Los síntomas de la mononucleosis infecciosa son
fiebre, dolor de garganta y glándulas linfáticas hinchadas. A veces
puede desarrollar un bazo hinchado o participación del hígado. Sólo
raramente ocurren problemas cardíacos o participación del sistema
nervioso central, y la mononucleosis infecciosa casi nunca es fatal.
No hay asociaciones conocidas entre la infección de VEB activa y
problemas durante el embarazo, tales como abortos espontáneos o
defectos de nacimiento. Aunque los síntomas de la mononucleosis
infecciosa normalmente se resuelven en 1 ó 2 meses, el VEB permanece
dormido o latente en unas pocas células en la garganta y la sangre
durante el resto de la vida de la persona. Periódicamente, el virus
se puede reactivar y se encuentra comúnmente en la saliva de
personas infectadas. Esta reactivación sucede normalmente sin
síntomas de enfermedad.
El VEB también establece una infección durmiente
de por vida en algunas células del sistema inmunitario del cuerpo.
Un último suceso en muy pocos soportes de este virus es la
emergencia del linfoma de Burkitt y el carcinoma nasofaríngeo, dos
cánceres raros que no se encuentran normalmente en los Estados
Unidos. El VEB parece jugar un papel importante en estas
malignidades, pero probablemente no es la única causa de la
enfermedad.
La mayoría de individuos expuestos a personas con
mononucleosis infecciosa han sido infectados previamente con VEB y
no están en riesgo de mononucleosis infecciosa. Además, la
transmisión de VEB requiere un contacto íntimo con la saliva
(encontrada en la boca) de una persona infectada. La transmisión de
este virus a través del aire o la sangre no sucede normalmente. El
periodo de incubación o el tiempo desde la infección hasta la
aparición de los síntomas va de 4 a 6 semanas. Las personas con
mononucleosis infecciosa pueden ser capaces de extender la infección
a otros durante un periodo de semanas. Sin embargo, no se
recomiendan precauciones especiales o procedimientos de aislamiento,
ya que el virus también se encuentra frecuentemente en la saliva de
personas sanas. De hecho, muchas personas sanas pueden transportar y
extender el virus intermitentemente de por vida. Estas personas son
normalmente el depósito primario para la transmisión persona a
persona. Por esta razón la transmisión del virus es casi imposible
de prevenir.
El diagnóstico clínico de la mononucleosis
infecciosa se sugiere en base a los síntomas de fiebre, dolor de
garganta, glándulas linfáticas hinchadas, y la edad del paciente.
Usualmente, son necesarios análisis de laboratorio para la
confirmación. Los resultados serológicos para personas con
mononucleosis infecciosa incluyen un recuento elevado de glóbulos
blancos, un porcentaje elevado de ciertos glóbulos blancos atípicos,
y una reacción positiva a un análisis "mono spot". No hay un
tratamiento específico para la mononucleosis infecciosa, más que
tratar los síntomas. No hay disponibles fármacos antivirales o
vacunas, excepto Ganciclovir.
El VHSK es un virus perteneciente a la familia de
los herpesvirus. El VHSK fue descubierto en 1994. El virus tiene dos
nombres que se usan normalmente: VHSK que es su nombre descriptivo y
VHH8 que es su nombre formal. Ambos nombres son esencialmente
intercambiables. El VHSK causa un cáncer de los vasos sanguíneos
llamado sarcoma de Kaposi (SK), un linfoma (un cáncer de los
linfocitos) llamado linfoma basado en la cavidad corporal y algunas
formas de crecimiento severo del nódulo linfático, llamado
enfermedad de Castleman. La proporción de la infección de VHSK en la
población general de los países mediterráneos (Italia, Grecia,
Israel, Arabia Saudita) es mayor que en Norte América y el Norte de
Europa. Poblaciones adultas en algunas partes de África tienen
proporciones muy elevadas de la infección (>50%). En muchos
aspectos las pautas globales de la infección de VHSK parecen ser
similares a las del virus de la hepatitis B, aunque aún estamos en
un estado temprano de entendimiento de la epidemiología del VHSK. El
virus se puede transmitir a través del contacto sexual. El VHSK
también se transmite probablemente en alguna extensión a través de
rutas no sexuales, por ejemplo por contacto oral (besos),
particularmente en los países mediterráneos y africanos. La
transmisión directa de una madre embarazada a su feto parece ser
rara, aunque niños muy pequeños pueden infectarse después del
nacimiento, particularmente en África. Esta es una característica
común para algunos herpesvirus en que la infección con estos virus
es general y ocurre a una edad temprana en países empobrecidos. El
VHSK se puede transmitir durante el transplante de órganos aunque
esto no parece ser común. Una vez expuesto al VHSK, la infección
probablemente dura toda la vida y el sistema inmune de los adultos
sanos mantiene el virus controlado a niveles extremadamente bajos.
El problema real con el VHSK ocurre cuando una persona infectada se
vuelve inmunosuprimida. Esto ocurre entre pacientes de transplantes
y pacientes que reciben quimioterapia. Hay buenas evidencias de que
si alguien está infectado con el VHSK y está inmunosuprimido,
entonces sus posibilidades de desarrollar la enfermedad clínicamente
detectable debido al VHSK son mayores que para otras infecciones
virales comunes. La infección con VHSK se diagnostica mediante un
análisis de sangre. Ahora parece probable que al inicio de la
epidemia de SIDA había de hecho dos epidemias víricas simultáneas:
la epidemia de VIH bien reconocida y una segunda epidemia
"silenciosa" de VHSK. Solo esas personas que se volvían
inmunosuprimidas por el VIH desarrollaban SK. El VHSK es
probablemente menos transmisible que el VIH, por supuesto esto es
cierto a partir de productos sanguíneos y compartir agujas, y así
solamente la fracción de personas que desarrollaron SIDA se
infectaron con VHSK y desarrollaron SK. La enfermedad relacionada
con el VHSK también puede suceder en personas sin inmunodeficiencia
obvia, pero esto es raro y ocurre principalmente entre hombres
mayores. Ha habido una importante epidemia de SK en algunas partes
de África, especialmente el este y el sur de África, coincidiendo
con la pandemia africana de VIH. El SK es ahora el tumor más común
del que se informa en varios registros de cáncer africanos. Mientras
la mayoría de los pacientes africanos de SK también están infectados
por el VIH, esas áreas también tienen las proporciones más grandes
del mundo de esta enfermedad para personas no infectadas por VIH. No
hay vacuna para el VHSK. La terapia existente es el Ganciclovir.
La varicela es una infección causada por el virus
de la varicela-zoster (VVZ). El VVZ se extiende en
las descargas nasales y en el fluido del interior de las ronchas de
la varicela. La varicela es muy contagiosa, y el 90% de las personas
que no son inmunes la cogen cuando están expuestos. Las epidemias
son más comunes a finales de invierno y principios de primavera, y
los niños de edades entre 5 y 9 años cuentan con la mitad de los
casos.
Normalmente, la varicela es una enfermedad suave,
pero puede causar complicaciones serias, incluyendo neumonía,
encefalitis, e infecciones bacterianas serias de las ronchas de la
varicela. Después de causar un ataque de varicela, el VVZ permanece
en el cuerpo. Permanece durmiente en las células nerviosas y puede
ser reactivado más tarde durante la vida causando herpes. Los niños
(y otros) que desarrollan varicela y tienen sistemas inmunitarios
debilitados pueden tratarse con Acyclovir.
Los adenovirus son una causa frecuente de
infecciones agudas del tracto respiratorio superior. Además, también
causan cierto número de otro tipo de infecciones. Fueron aislados
por primera vez en 1953 por investigadores que intentaban establecer
líneas celulares a partir de tejido adenoidal de niños extraído
durante amigdalectomías y de reclutas militares con enfermedades
febriles. Ciertos tipos de adenovirus se asocian comúnmente con
síndromes clínicos particulares: enfermedad respiratoria aguda,
faringitis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis. La mayoría de
adenovirus involucran los tractos respiratorios o gastrointestinales
o el ojo. Las infecciones de adenovirus son muy comunes, la mayoría
son asintomáticas. La mayoría de personas han sido infectadas con al
menos 1 tipo a los 15 años. Los virus se pueden aislar de la mayoría
de amígdalas/adenoides extirpadas quirúrgicamente, que indican
infecciones latentes. No se sabe cuánto tiempo puede persistir el
virus en el cuerpo, o si es capaz de reactivarse después de largos
periodos, causando enfermedades (es difícil aislar este virus oculto
porque sólo está presente en pocas células). Se sabe que el virus se
reactiva durante la inmunosupresión, por ejemplo en pacientes de
SIDA.
No hay terapia para los adenovirus. Se han
desarrollado vacunas inactivadas y se usan rutinariamente para
reclutas militares en algunos países (por ejemplo, EEUU). Esto es
porque los adolescentes y otros, en el contacto cercano diario están
en riesgo de expansión de la epidemia de infecciones respiratorias.
En los últimos años ha habido un interés considerable en el
desarrollo de adenovirus como vectores defectuosos para transportar
y expresar genes extraños con propósitos terapéuticos. Una razón
para esto es que el genoma del adenovirus se manipula in
vitro con relativa facilidad y los genes acoplados al MLP se
expresan eficientemente en grandes cantidades.
El virus respiratorio sincitial (VRS) es una
causa importante de enfermedades respiratorias en niños pequeños. La
infección de VRS produce una variedad de signos y síntomas que
involucran diferentes áreas del tracto respiratorio, desde la nariz
a los pulmones.
En niños menores de 3 años, el VRS puede causar
enfermedades del tracto respiratorio inferior como bronquiolitis o
neumonía y puede conducir a fallo respiratorio. En este caso, los
síntomas pueden incluir fiebre elevada, tos severa, respiración
sibilante, respiración anormalmente rápida, respiración dificultosa
y un color azulado de los labios o las uñas de los dedos causado por
bajos niveles de oxígeno en la sangre. En bebés con infección de VRS
severa puede haber retracciones anormales de los músculos entre las
costillas, ya que el niño lucha por conducir la respiración en los
pasajes respiratorios infectados. La infección de VRS sucede en todo
el mundo, más a menudo en epidemias que pueden durar hasta cinco
meses, desde finales de otoño hasta principios de primavera. Desde
1990 las epidemias se han iniciado típicamente en algún momento
entre finales de octubre y mediados de diciembre, y han alcanzado el
máximo durante enero y febrero. Cada año durante estos periodos de
epidemia se hospitalizan aproximadamente 90000 bebés y niños
pequeños con infecciones de VRS y aproximadamente 4500 mueren.
Las proporciones más elevadas de enfermedad de
VRS ocurren en bebés de dos a seis meses, con un máximo a la edad de
dos a tres meses. La infección de VRS a menudo es llevada a casa por
un niño en edad escolar y pasa a uno menor, especialmente un bebé.
Cuando el VRS infecta un centro de cuidado diario, no es inusual ver
que el 100% de los niños enferman de infección de VRS. El VRS se
extiende comúnmente a través de hospitales, infectando también tanto
a lospacientes como al personal.
Prevención y tratamiento: RespiGam es una vacuna
usada para proteger bebés que se consideran con elevado riesgo de
enfermedad severa si se infectan con VRS, tales como aquellos con
enfermedades pulmonares crónicas. Este tratamiento intravenoso
preventivo lleva varias horas para ser administrado y se tiene que
repetir mensualmente durante la estación del VRS. Más recientemente
se ha hecho disponible una vacuna similar, Synagis. Esta ha
remplazado a RespiGam como tratamiento de elección para la mayoría
de niños de elevado riesgo porque se administra como inyecciones
intramusculares mensuales, haciéndola más conveniente y consumiendo
menos tiempo para administrarla. Ribavirin es el único fármaco
disponible, con una eficacia sólo moderada.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar nuevos agentes farmacéuticamente activos que se puedan
usar como sustancias para la profilaxis y/o el tratamiento de
infecciones inducidas por virus y enfermedades que incluyen
infecciones oportunistas. Este objetivo se alcanza mediante la
revelación de la reivindicación independiente. Otras características
ventajosas, aspectos y detalles de la invención son evidentes a
partir de las reivindicaciones dependientes. La descripción, los
ejemplos y las figuras de la presente solicitud son útiles para
entender la invención.
Es objeto de la presente invención proporcionar
nuevos agentes farmacéuticamente activos junto con métodos para el
tratamiento de infecciones y enfermedades causadas por virus,
incluyendo infecciones oportunistas.
Este objetivo se alcanza mediante la revelación
de la reivindicación independiente. Otras características
ventajosas, aspectos y detalles de la invención son evidentes a
partir de las reivindicaciones dependientes. La descripción, los
ejemplos y las figuras de la presente solicitud son útiles para
entender la invención.
Se dan a conocer compuestos de fórmula general
(I):
en la
que:
X_{1} y X_{1}' son -CHGhy o
-C(CH_{3})Ghy independientemente entre sí;
X_{2} y X_{2}' son -H, -OCH_{3}, -CHGhy o
-C(CH_{3})Ghy independientemente entre sí;
Ghy representa un grupo guanidino:
=N-NH-C(NH)NH_{2};
Z es
-A-(CH_{2})_{n}-CH=CH-(CH_{2})_{p}-A'-B,
-A-(CH_{2})_{n}-C_{6}H_{4}-(CH_{2})_{p}-A'-B,
-A-(CH_{2})_{n}-C_{5}H_{3}N-(CH_{2})_{p}-A'-B,
-A-(CH_{2})_{n}-CR'R''-(CH_{2})_{p}-A'-B,
-A-(CH_{2})_{n}-CH=CH-(CH_{2})_{p}-B,
-A-(CH_{2})_{n}-C_{6}H_{4}-(CH_{2})_{p}-B,
-A-(CH_{2})_{n}-C_{5}H_{3}N-(CH_{2})_{p}-B,
-(CH_{2})_{n}-B,
-A-(CH_{2})_{n}-CR'R''-(CH_{2})_{p}-B,
-A-(CH_{2})_{n}-B o
-A-(CH_{2})_{n}-A'-B;
R', R'' son -OH, -SH, -NH_{2}, metilo, etilo o
propilo independientemente entre sí;
A y A' son -NH(CO)-, -NH-,
-(CO)NH-, -NH(CO)NH- o -O- independientemente
entre sí;
B representa
n y p son enteros de 0 a 10
independientemente entre sí; y sales farmacéuticamente aceptables de
ellos bajo la condición de que A\neq
A'.
Los compuestos que tienen la fórmula general (I)
en la que A = A' son conocidos por las patentes U.S 5,599,984;
5,750,573; 5,753,684 como inhibidores de la absorción de arginina
por macrófagos y/o su conversión a urea. Por consiguiente, estos
compuestos se pueden usar para el tratamiento de tumores e
infecciones dependientes de arginina. Además, se da a conocer la
adecuación de estos compuestos en la prevención de la generación de
óxido nítrico (NO) por las células y para prevenir la inflamación
mediada por NO y otras respuestas. El documento WO98/20868 da a
conocer un método para el tratamiento de enfermedades y desórdenes
que involucran la activación de células T y la infección de VIH
usando la protein quinasa p38 mitogen activada (MAPK) que señala el
camino como diana para la intervención. Se sugiere que los
compuestos guanilhidrazona según la fórmula (I) actúan como
inhibidores MAPK. El documento U.S. 5,849,794 da a conocer el uso de
algunos compuestos de fórmula general (I) en la que A = A' para
prevenir y mejorar la caquexia, el síndrome clínico de estado
nutricional pobre y desgaste fisiológico asociado con el cáncer y
otras enfermedades crónicas, mientras el documento U.S. 5,854,289
describe el uso de dichos compuestos para el tratamiento de la
esclerosis múltiple (encefalomielitis autoinmune) y el documento
U.S. 6,143,728 da a conocer su uso para el tratamiento de un
desorden o enfermedad caracterizado por la activación de las
células T.
células T.
Sorprendentemente, los compuestos de
guanilhidrazona de la presente invención muestran una actividad
excelente frente a variedad de virus diferentes.
Es más preferible el uso del compuesto inventivo
N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)decano
diamida tetrakis (amidinohidrazona).
Se dan a conocer compuestos de fórmula general
(II):
en la
que:
X_{1}, X_{2} y X_{3} son -CHGhy o
-C(CH_{3})Ghy independientemente entre sí;
X_{1}', X_{2}' y X_{3}' son -H, -CHGhy o
-C(CH_{3})Ghy independientemente entre sí;
Ghy representa un grupo guanidino:
=N-NH-C(NH)NH_{2};
A, A' y A'' son -NH(CO)-, -(CO)NH-,
-NH(CO)NH-, -NH- o -O-;
Y es (C_{6}H_{3}), cuando m_{1}, m_{2},
m_{3} = 0;
Y es N, cuando m_{1}, m_{2}, m_{3} son
enteros de 1 a 6 independientemente entre sí;
y sales de ellos farmacéuticamente aceptables
como agentes farmacéuticamente activos para la profilaxis y/o
tratamiento de infecciones y enfermedades inducidas por virus,
incluyendo las infecciones oportunistas.
Los compuestos de fórmula general (II) son
conocidos por el documento U.S. 5,859,062 y 5,849,794 en los que se
da a conocer el uso de tales compuestos para el tratamiento de
enfermedades inflamatorias mediadas por TNF y un método para el
tratamiento de enfermedades neoplásicas. Además, se describen
compuestos de las fórmulas generales (I) y (II) en los documentos
U.S. 6,002,900 y 6,008,255 junto con su uso para el tratamiento de
la pérdida completa de nitrógeno corporal asociada con la enfermedad
catabólica o para el tratamiento del choque endotóxico en un
sujeto.
sujeto.
Es preferible el uso de un compuesto de fórmula
general (II) en la que X_{1} está en posición meta o para de A' en
el caso de que X_{1}' representa hidrógeno; y/o en la queX_{2}
está en posición meta o para de A'' en el caso de que X_{2}'
representa hidrógeno; y/o X_{3} está en posición meta o para de A
en el caso de que X_{3}' representa hidrógeno. Si el residuo
X_{1} y/o X_{2} y/o X_{3} no es hidrógeno, es/son preferibles
la posición meta de cada X_{1} y X_{1}' en relación con A', y/o
la posición meta de X_{2} y X_{2}' en relación con A'', y/o la
posición meta de X_{3} y X_{3}'en relación
con A.
con A.
Los compuestos de fórmula general (II) muestran
tres de los elementos estructurales característicos mostrados en la
fórmula general (I), comprendiendo un núcleo benceno sustituido con
uno o dos residuos caracterizados como X y una conexión
(caracterizada como Z) representada por una cadena alquilo
consistente en 1 a 6 unidades metileno conectadas al mencionado
núcleo de benceno vía el elemento estructural A como se muestra en
la
fórmula (II).
fórmula (II).
Se da a conocer el uso de compuestos
guanilhidrazona aromáticos de fórmula general (I) y/o (II) y/o sales
de ellos farmacéuticamente aceptables como un inhibidor de la
desoxihipusina sintasa.
Se da a conocer el uso de un compuesto de fórmula
general (I) y/o (II) y/o sales de él farmacéuticamente aceptables
como un inhibidor del transporte o exportación nuclear en
enfermedades infecciosas.
Sorprendentemente se encontró que los compuestos
guanilhidrazona de fórmula general (I) y (II) muestran excelente
actividad frente a varios virus y por consiguiente se pueden usar en
la profilaxis y el tratamiento de infecciones inducidas por virus,
incluyendo infecciones oportunistas, y también enfermedades
asociadas con tales infeccio-
nes.
nes.
El compuesto de la presente invención y/o las
sales farmacéuticamente activas de él se pueden usar para la
producción de un agente para la profilaxis y/o el tratamiento de
enfermedades e infecciones, incluyendo infecciones oportunistas,
causadas por virus. Son ejemplos de tales virus los retrovirus
(lentivirus y oncoretrovirus), adenovirus, hepadnavirus,
herpesvirus, virus de la gripe y paramixovirus. Los virus que se
integran en el genoma de una célula son los retrovirus,
hepadnavirus, adenovirus, herpesvirus y virus de la gripe, mientras
que los paramixovirus no se integran en el genoma de una célula.
Los retrovirus se pueden seleccionar del grupo
que comprende lentivirus y oncoretrovirus. Son ejemplos de
lentivirus el VIF, VIS, VIB, VIH-1,
VIH-2, visna virus, virus de la
artritis-encefalitis caprina (VAEC) y el virus de la
anemia infecciosa equina (VAIE). Más preferentemente, el retrovirus
representa el lentivirus VIH-1 o
VIH-2. Los VLTH-I,
VLTH-II y VLB pertenecen a los oncoretrovirus.
Además, la excelente actividad antiviral de los compuestos
guanilhidrazona inventivos se puede usar preferentemente para tratar
retrovirus en que el retrovirus es una cadena de VIH trópica a
célula T o en que el retrovirus es una cadena de VIH trópica a
macrófago.
Los paramixovirus comprenden el virus
respiratorio sincitial, virus de la parainfluenza, virus de las
paperas y virus del sarampión. La familia de los herpesvirus
comprende los herpesvirus humanos 1 a 8 y diferentes herpes virus
para varias especies animales como se muestra abajo en la tabla
2:
| Subfamilia | Género | Humano | Animal |
| \alpha-herpesvirus | Virus simplex | Herpesvirus humano 1 | Herpesvirus bovino 2 |
| (virus herpes simplex 1) | |||
| Herpesvirus humano 2 | Virus Herpes | ||
| (virus herpes simplex 2) | cercopitecina 1 | ||
| (virus herpes B) | |||
| Virus varicela | Herpesvirus humano 3 | Virus pseudorabia | |
| (virus varicela zoster) | Herpesvirus bovino 1 | ||
| Virus del aborto equino | |||
| \beta-herpesvirus | Citomegalovirus | Herpesvirus humano 5 | |
| (VMCH) | |||
| Muromegalovirus | Herpesvirus murina 1 | ||
| Roseolovirus | Herpesvirus humano 6 | Herpesvirus aotina 1,3 | |
| Herpesvirus humano 7 | |||
| \gamma-herpesvirus | Limfocritovirus | Herpesvirus humano 4 | Herpesvirus cercopitecina 2 |
| (virus Epstein-Barr) | |||
| Herpesvirus pongina 1 | |||
| Rhadinovirus | Herpesvirus humano 8 | Herpesvirus adelina 2 | |
| Herpesvirus saimirina 1 |
Más preferiblemente, el herpesvirus se selecciona
entre el virus herpes simplex I, virus herpes simplex II, virus
varicela zoster, virus Epstein-Barr, VMCH, o VHH8.
Los hepadnavirus se seleccionan entre VBH, virus de la hepatitis de
Ground-Squirrel (VHGS), o el virus de la hepatitis
de la marmota de Norteamérica (VHW).
Según Gallo y Barre-Sinoussi el
VIH es el agente causante del síndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA) (Barre-Sinoussi y col., 1983;
Gallo y col. 1984). En humanos, la infección por VIH conduce al
desarrollo de incompetencia inmune, infecciones oportunistas,
desórdenes neurológicos como deterioro cognitivo y motor,
crecimiento neoplásico, y muerte. La infección de VIH es una
pandemia y las enfermedades asociadas al VIH representan un
importante problema de salud en aumento. Se está haciendo un
esfuerzo considerable en el diseño de terapias efectivas, pero no
existen fármacos anti-retrovirales curativos contra
el SIDA. Por consiguiente, es necesario el diseño y el ensayo de
nuevos fármacos anti-retrovirales, no tóxicos y
efectivos, con nuevos modos de acción.
La excelente actividad antiviral de las
guanilhidrazonas aromáticas de fórmula (I) permite su uso para el
tratamiento de virus resistentes frente a los fármacos antivirales
comunes. Especialmente los compuestos guanilhidrazona representan
una nueva clase de fármacos anti-retrovirales.
El VIH es un retrovirus complejo que además de
las proteínas estructurales gag, pol y env codifica varios genes
reguladores (Cullen 1991). Específicamente, el regulador de acción
trans de la expresión génica viral, llamado Rev, es crucialmente
importante para la replicación del VIH (Feinberg y col., 1986). La
proteína Rev del VIH es una fosfoproteína nuclear que en estado
estable se acumula en los nucleolos y tiene la capacidad de conectar
los compartimientos nucleares y citoplasmáticos (Meyer & Malim,
1994). Dentro de los distintos dominios biológicos de la proteína
Rev existen los que son esenciales para su actividad biológica. La
diana de acción cis para el Rev es un elemento de secuencia
altamente estructurado terminado el Elemento de Respuesta de Rev
(ERR) localizado en el ARN del VIH (Malim y col., 1989). Hasta
unirse al ARN del VIH como un monómero, el Rev tiene que
multimerizar y por consiguiente interactuar con
co-factores codificados celularmente (Malim y col.,
1989) en su camino para exportar el ARN del VIH desde el núcleo al
citoplasma donde ocurre la translación de la proteína. Hasta ahora,
el Rev es el factor específico de exportación del ARN más estudiado,
que contiene una señal de exportación nuclear rica en leucina (SEN)
(Pollard & Malim, 1998). Se mostró que el factor de iniciación
eucariótico 5A (eIF-5A) enlaza directa y
específicamente el SEN Rev VIH (Ruhl y col., 1993). Distintos
mutantes de eIF-5A han mostrado inhibir la
exportación nuclear de las proteínas Rev, y de esta manera la
replicación del VIH (Bevec y col., 1996; Junker y col. 1996).
Además, los anticuerpos anti eIF-5A bloquean
específicamente la translocación nucleocitoplasmática de Rev (Schatz
y col., 1998), indicando que eIF-5A es parte del
camino específico de exportación nucleocitoplasmática utilizado por
el VIH (Elfgang y col., 1999). En general, la translocación de mARNs
de un lado a otro de los poros nucleares requiere un soporte de
proteínas, que es parte de un sistema complejo localizado en la
envoltura nuclear. De este modo, el eIF-5A sería una
parte de un sistema de transporte que está involucrado en la
translocación del ARN nuclear hacia el citoplasma. Después del
tránsito a través de los poros nucleares y el montaje de los
ribosomas competentes para la translación, los mARNs preferentemente
translocados se utilizarían en el proceso de la síntesis de
proteínas. Por consiguiente, las sustancias químicas con bajo peso
molecular que interfieren con la función biológica de la proteína
eIF-5A a nivel del transporte nuclear son
potenciales compuestos antivirales al interferir con la
translocación nucleocitoplasmática del mARNs viral, especialmente en
el campo de las enfermedades asociadas al VIH. Sorprendentemente, se
encontró que los com-
puestos guanilhidrazona aromáticos de la presente invención actúan como un inhibidor de la activación del eIF-5A.
puestos guanilhidrazona aromáticos de la presente invención actúan como un inhibidor de la activación del eIF-5A.
La proteína eIF-5A tiene una
característica bioquímica única, es la única proteína eucariótica
celular conocida que contiene el aminoácido inusual hipusina. La
formación de la hipusina es una modificación del residuo lisina en
la posición del aminoácido 50 dentro de los 154 aminoácidos que
contiene la molécula precursora eIF-5A, mediante una
reacción enzimática post-translacional de dos pasos
(Park y col., 1993). En el primer paso, el enzima celular
desoxihipusina sintasa (DHS) cataliza la transferencia de una
fracción aminobutilo desde la espermidina hasta la lisina 50 dentro
de eIF-5A vía una formación intermedia de sustrato
enzimático en la lisina 329 del DHS para generar la forma
eIF-5A desoxihipusina (Wolf y col., 1997). El
intermedio eIF-5A desoxihipusina es hidroxilado
posteriormente mediante el enzima desoxihipusina hidroxilasa,
resultando el eIF-5A biológicamente activo que
contiene hipusina. La formación de hipusina es esencial para la
actividad biológica de la proteína eIF-5A (Park y
col., 1993). Además, la proteína eIF-5A
biológicamente activa es esencial para la exportación nuclear de las
proteínas Rev, y de este modo, la replicación del VIH (Bevec y col.,
1996; Junker y col. 1996), así como para la función de la proteína
Rex del virus tipo I de la leucemia de las células T humanas
(VLTH-I), que es crucial ella misma para la
replicación del VLTH-I (Katahira y col., 1995).
Por consiguiente, se estableció un ensayo in
vitro de análisis del DHS (Bevec y col., 1996) para identificar
sustancias químicas de bajo peso molecular como inhibidores de la
formación de hipusina en la proteína eIF-5A con el
objetivo de interferir en última instancia con la replicación del
VIH y VLTH-I. Además, tales inhibidores pueden
interferir con la replicación de los virus de la gripe (apuntando a
las actividades biológicas de las proteínas NS1, NS2 o M1), con la
replicación de los virus del herpes (apuntando a las actividades
biológicas de la proteína SM del virus Epstein-Barr
y la proteína ICP27 del virus Herpes simplex), o con la replicación
de adenovirus (apuntando a las actividades biológicas de las
proteínas E1B y E4orf6).
Sorprendentemente se encontró que las
guanilhidrazonas aromáticas y las sales farmacéuticamente aceptables
de ellas son inhibidores potentes de la activación de
eIF-5A, que muestran su efecto a concentraciones
farmacéuticamente aceptables. Además, las guanilhidrazonas
aromáticas son capaces de inhibir el transporte nuclear de las
moléculas de ARN. Sin el deseo de estar sujeto a una teoría, el
solicitante cree que se puede inhibir particularmente la exportación
tipo ARN polimerasa III de moléculas de mARN (normalmente se cree
que las moléculas de mARN se exportan desde al núcleo al citoplasma
por los caminos de exportación dependientes de la ARN polimerasa II)
desde el núcleo al citoplasma de una célula. La inhibición del
transporte nuclear representa un nuevo objetivo para la prevención
del tratamiento de enfermedades virales, particularmente el VIH e
infecciones oportunistas asociadas con él.
Empleando el ensayo in vitro del análisis
de DHS (Bevec y col., 1996) se descubrieron compuestos de bajo peso
molecular del tipo de las guanilhidrazonas aromáticas inventivas,
como
N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)-decano
diamida tetrakis (amidinohidrazona) (compuesto 4: también conocido
como N,
N'-bis[3,5-bis[1-(aminoiminometil)
hidrazono]etil]fenil decano diamida), compuesto 1,
compuesto 5, como potentes inhibidores de la formación de hipusina
en la proteína eIF-5A en rangos de concentración
submicromolar y micromolar bajo, respectivamente. El ensayo de los
compuestos de fórmula general (I) en sistemas celulares VIH
pertinentes reveló que estos compuestos son inhibidores potentes de
la replicación del VIH en el rango submicromolar y micromolar bajo.
Así, otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de
compuestos como los reivindicados, como inhibidores de la activación
de eIF-5A y la replicación del VIH.
Sorprendentemente, en los sistemas celulares VIH
pertinentes, el compuesto nº 4 se descubrió como potente inhibidor
de la replicación del VIH en el rango submicromolar en una cadena
agresiva de VIH trópica a célula T, en una cadena agresiva de VIH
trópico a macrófago, en VIH primarios aislados de pacientes, así
como en una cadena agresiva de VIH
multifármaco-resistente sin toxicidades celulares
aparentes a dosis antivirales efectivas. Por eso, el compuesto nº 4
es un potente inhibidor de la exportación nuclear que interfiere con
la replicación del VIH. Por eso, la presente invención proporciona
un género de compuestos guanilhidrazona sustituidos que son útiles
como inhibidores del VIH-1, VIH-2,
VLTH-1, así como para el tratamiento de enfermedades
asociadas con estos virus.
Los compuestos de la presente invención actúan
como inhibidores de la desoxihipusina sintasa y también como
inhibidores de la activación de la eIF-5A y la
replicación del VIH. Así, otro aspecto de la presente invención
proporciona un método para la inhibición de la actividad
desoxihipusina sintasa para la prevención o tratamiento de
enfermedades infecciosas, particularmente infecciones virales, que
comprenden administrar a un sujeto que los necesita una cantidad
efectiva farmacéuticamente de al menos un compuesto de fórmula
general (I) y/o (II) y/o sales farmacéuticamente activas de
ellos.
Como el eIF-5A está relacionado
en el transporte nuclear, los compuestos de la presente invención
actúan como moduladores del transporte nuclear, particularmente el
transporte nuclear de moléculas de ARN. Más particularmente, los
compuestos de la invención se pueden usar para la producción de un
agente capaz de inhibir la exportación de las moléculas de ARN desde
el núcleo al citoplasma de una célula, que puede ser una célula de
mamífero infectada, por ejemplo, una célula humana, bovina, equina,
felina, caprina u ovina. Preferentemente los compuestos de fórmula
(I) son inhibidores de la exportación de moléculas de ARN viral
desde el núcleo al citoplasma.
Más preferiblemente, los compuestos inhiben la
exportación de moléculas de ARN que derivan de material genético
viral integrado en el genoma de una célula huésped. Además, es
preferible que los compuestos (I) y/o (II) se usen como moduladores
de la exportación de moléculas de ARN dependiente de la ARN
polimerasa III. Así, se da a conocer el uso de al menos un compuesto
guanilhidrazona aromático de fórmula general (I) y/o sales de él
farmacéuticamente activas para la producción de un agente capaz de
modular la exportación tipo ARN polimerasa III de moléculas de ARN
desde el núcleo al citoplasma de una célula. La célula mencionada es
preferiblemente una célula humana.
Mediante la identificación de las dianas
celulares de los compuestos de fórmula (I) y/o (II), se proporciona
un agente para la prevención o tratamiento de enfermedades
infecciosas que involucran la exportación nuclear, particularmente
la exportación de ARN heterólogos desde el núcleo al citoplasma vía
eIF-5A. Particularmente, la presente invención
proporciona un agente y un método para la prevención o el
tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por virus que se
integran y que no se integran en el genoma de una célula. Los virus
se pueden seleccionar entre los retrovirus, particularmente
lentivirus y oncoretrovirus (grupo VLTH-VLB),
adenovirus, hepadnavirus, herpesvirus y virus de la gripe. Más
particularmente, el virus es un retrovirus que se puede seleccionar
entre lentivirus tales como VIH-1,
VIH-2, VIF, virus de la inmunodeficiencia bovina
(VIB), virus de la inmunodeficiencia simia (VISs), virus visna Maedi
(VVM), virus de la artritis-encefalitis caprina
(VAEC), virus de la anemia infecciosa equina (VAIE), o
oncoretrovirus tales como el virus I de la leucemia de células T
humanas (VLTH-I), el virus II de la leucemia de
células T humanas (VLTH-II) y el virus de la
leucemia bovina (VLB). Más preferiblemente, el retrovirus es
VIH-1 o VIH-2 y el herpesvirus es el
virus I del Herpes simplex, virus II del Herpes simplex, virus de la
varicela Zóster, virus Epstein-Barr, VMCH o
VHH8.
Los compuestos de la presente invención se pueden
usar también para la producción de un agente para la profilaxis y/o
tratamiento de enfermedades e infecciones causadas por virus que se
integran o que no se integran en el genoma de una célula. Los
paramixovirus son ejemplos de virus que no se integran en el genoma
de una célula. Los paramixovirus comprenden, por ejemplo, los virus
de la parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión y el
virus respiratorio sincitial.
La presente invención da a conocer también un
método en el que los compuestos inventivos de guanilhidrazona se
usan para tratar virus que son resistentes contra los fármacos
anti-virales más comunes. Por esto, las
guanilhidrazonas aromáticas y/o las sales farmacéuticamente
aceptables de ellas se administran en una dosis correspondiente a
una concentración efectiva en el rango de 0,01-10
\muM. Más preferiblemente, los compuestos inventivos de la
presente invención se administran en una dosis correspondiente a una
concentración efectiva en el rango de 0,1-5
\muM.
Sorprendentemente se encontró que los compuestos
de fórmula (I) y (II) son inhibidores potentes de la replicación del
VIH en un rango submilimolar, especialmente submicromolar, en
cadenas agresivas de VIH trópico a células T, cadenas agresivas de
VIH trópicas a macrófagos, en VIH primario aislado de pacientes, así
como en cadenas agresivas de VIH multi-fármaco
resistentes, sin toxicidad celular aparente a la dosis antiviral
efectiva.
Estos descubrimientos sugieren que la clase de
compuestos mencionada de las guanilhidrazonas aromáticas tiene
ventajas sobre los fármacos usados actualmente en el tratamiento de
las enfermedades del VIH, por ejemplo, la Terapia
Anti-retroviral altamente Activa (TARAA),
consistente en Inhibidores de Transcriptasa Reversa Análogos a
Nucleósidos (ITRNs), Inhibidores de Transcriptasa Reversa no
Nucleosídicos (ITRNNs) e Inhibidores de Proteasa (IPs). Esta terapia
es acompañada por la rápida emergencia de cadenas virales
resistentes. En algunos pacientes, la replicación de
VIH-1 resistente conduce a la emergencia de
variantes más virulentas del VIH-1, que se asocian
con una pérdida acelerada de células CD4+ y confiere un riesgo
significativamente elevado de progresión de la enfermedad y muerte
(D'Aquila y col., 1995). La resistencia emerge como una consecuencia
de la presión selectiva de terapias supresitas de forma incompleta y
es determinado por mutaciones en la transcriptasa reversa del VIH y
los genes de la proteasa. Las mutaciones primarias alteran la unión
del fármaco a su diana resultando en un incremento en la cantidad de
fármaco necesaria para inhibir el enzima. Las mutaciones secundarias
aumentan la resistencia mejorando la buena forma de los virus que
transportan infecciones primarias. En el caso de ITRNs, la mutación
M148V es un ejemplo de una mutación clave que conduce a un nivel de
resistencia elevado. Las posiciones adicionales de las mutaciones
incluyen M41L, K70R, T215Y (Zidovudina), L74V (Didanosina), T69D
(Zalcitabina), Y115F (Abacavir). La resistencia
multi-fármaco que confiere resistencia cruzada a la
clase ITRNs entera se reconoce bien (Q151M e inserción mutación
T69SSS). La resistencia cruzada también es extensa entre los tres
ITRNs usados normalmente Efavirenz, Nevirapine y Delavirdine, que
los hace inactivos contra el virus que expresa la mutación K130N en
el gen transcriptasa reversa. La mutación K103N actúa inhibiendo la
formación de la cavidad que se enlaza al fármaco. Para este tipo de
fármaco el "primer disparo" es frecuentemente el "único
disparo". Además, la resistencia cruzada entre los IPs es más una
regla que una excepción (Indinavir y Ritonavir tienen patrones de
resistencia casi idénticos - K20M, V32I, M36I, M46I, I54V, L63P,
A71V, V82A/T/F, I84V, L90M - y las cadenas
Saquinavir-resistentes también tienen resistencia
cruzada con otros IPs- L101, K20M, I84V, L90M) (Roberts y col.,
1998). Incluso para el nuevo tipo de fármacos anti VIH como T20, un
péptido de 36 aminoácidos derivado de la proteína VIHgp41 que inhibe
la fusión del virus a la célula huésped, ya se ha demostrado
resistencia in vitro (Kilby y col., 1998). Además, los
pacientes en TARAA se enfrentan a efectos secundarios a largo plazo,
incluyendo pancreatitis, neuropatías periféricas, hepatotoxicidad,
diabetes (Visnegarwala y col. 1997), o anormalidades metabólicas en
la redistribución de la grasa corporal (Gervasoni y col., 1999), así
como en el metabolismo de la glucosa y el campo cardiovascular
(Henry y col., 1998). Para muchos pacientes que experimentan las
toxicidades del fármaco arriba mencionadas, una interrupción
estructurada del tratamiento es una necesidad inevitable
("Vacaciones de fármacos"). Sin embargo, durante este tiempo el
virus suprimido puede rebrotar.
Debido al modo de acción propuesto como
inhibidores de la función biológica de la proteína celular
eIF-5A que es per se un cofactor crucial para
la función de la proteína viral esencial Rev para la translocación
del núcleo al citoplasma de los mARNs esenciales del VIH, las
guanilhidrazonas aromáticas y las guanilhidrazonas aromáticas
sustituidas es muy probable que disminuyan la formación de
resistencia en los virus por dos razones principales: 1) La diana
primaria es una proteína celular. 2) La interacción
Rev-REE está altamente conservada. Las mutaciones en
el dominio de activación Rev (el sitio de interacción de REV con la
proteína eIF-5A) son estrategias de intervención
médica probadas para inhibir la replicación del VIH (Bevec y col.,
1992; Malim y col., 1992; Liu y col., 1994; Escaich y col., 1995,
Woffendin y col., 1996; Bonyhadi y col., 1997; Una intervención
genética molecular para los efectos en el SIDA de una forma negativa
transdominante de REV - General Clinical Research Center, University
of Michigan, Ann Arbor, Center Watch; Clinical Trials Listing
Service on Medscape, 7 de Enero, 2000).
Debido a la indicada capacidad para cruzar la
barrera sanguínea cerebral en el modelo animal de rata de la
isquemia cortical focal permanente (Meistrell y col., 1997), los
compuestos de fórmula (I) pertenecen a las pocas sustancias
anti-VIH (como Abacavir, Lamivudina, Zidovudina o
GW42867X de Glaxo Wellcome, Stavudina de
Bristol-Myers Squibb o Nevirapina de Roxana
Laboratories), que también pueden inhibir la replicación del VIH en
el sistema nervioso central (SNC) para la prevención del tratamiento
de desórdenes del SNC inducidos por VIH. Normalmente, los
inhibidores IP han mostrado que no cruzan la barrera sanguínea
cerebral. Debido al modo de acción, se puede esperar razonablemente
que los compuestos de fórmula general (I) y (II) también inhibirán
la replicación de otros virus como los mencionados arriba.
En un aspecto relacionado con los estudios dados
a conocer aquí, la presente invención revela un método para el
tratamiento de enfermedades e infecciones inducidas por virus,
incluyendo infecciones oportunistas, en un mamífero, incluido un
humano, que comprende administrar al mamífero una cantidad de al
menos un compuesto de fórmula (I) y/o (II) y/o sales
farmacéuticamente aceptables de él, efectiva para tratar infecciones
y/o enfermedades inducidas por virus. Preferiblemente el método
mencionado se usa para tratar infecciones de VIH-1.
Las enfermedades e infecciones inducidas por virus pueden ser
causadas por los virus que comprenden retrovirus, adenovirus,
hepadnavirus, herpesvirus, virus de la gripe, y paramixovirus.
Los hepadnavirus se pueden seleccionar del grupo
que comprende ortohepadnavirus y avihepadnavirus. Son ejemplos de
ortohepadnavirus el VHB, virus de la hepatitis
Ground-Squirrel (VHGS), virus de la hepatitis de la
marmota de Norteamérica (VHW). Más preferiblemente, el hepadnavirus
representa el virus de la hepatitis B humana
(VHB).
(VHB).
Los herpesvirus se pueden seleccionar del grupo
que comprende \alpha-herpesvirus (Simplexvirus,
Varicelavirus), \beta-herpesvirus
(Citomegalovirus conocido también como herpesvirus humano 5,
Muromegalovirus, Roseolovirus), o
\gamma-herpesvirus (Linfocriptovirus,
Rhadinovirus). Son ejemplos de \alpha-herpesvirus
el virus Herpes simplex tipo I (herpesvirus humano 1), el virus
Herpes simplex tipo II (herpesvirus humano 2), el virus de la
Varicela Zoster (herpesvirus humano 3). Son ejemplos de
\gamma-herpesvirus el virus de
Epstein-Barr (herpesvirus humano 4) o el herpesvirus
humano tipo 8 (VHH8). Más preferiblemente, el herpesvirus es el
virus Herpes simplex tipo 1 o el virus de la Varicela Zoster, o el
virus de Epstein-Barr (VEB), o el citomegalovirus
humano (VCMH), o el herpesvirus humano 6, el herpesvirus humano 7, o
el herpesvirus humano tipo 8 (VHH8). Más preferiblemente, el
herpesvirus representa el \alpha-herpesvirus virus
Herpes simplex tipo 1, o el virus de la Varicela Zoster, o el
\gamma-herpesvirus virus de
Epstein-Barr, o el virus del Herpes humano tipo
8.
Los paramixovirus se pueden seleccionar del grupo
que comprende paramixovirinas o pneumovirinas. Más preferiblemente,
el paramixovirus representa el virus respiratorio sincitial
(VRS).
Además de esto, un método para inhibir la
exportación nuclear para la prevención o el tratamiento de
enfermedades infecciosas, particularmente infecciones víricas que
comprenden la administración a un sujeto que lo necesita de una
cantidad farmacéuticamente efectiva de al menos un compuesto de
fórmula general (I) y/o sales farmacéuticamente activas de él. Las
enfermedades infecciosas mencionadas, tales como infecciones de
VIH-1, o infecciones del virus de la hepatitis B, o
infecciones del virus 1 del Herpes simplex, infecciones del virus de
Epstein-Barr, o infecciones del herpesvirus humano
8, o infecciones del virus de la Varicela Zoster, o infecciones de
adenovirus, o infecciones del virus respiratorio sincitial, son por
ejemplo enfermedades causadas por virus, especialmente lentivirus u
oncoretrovirus, hepadnavirus, paramixovirus, adenovirus, herpesvirus
y virus de la gripe. Más preferiblemente, las enfermedades
mencionadas son causadas por los lentivirus VIH-1 o
VIH-2, o por el hepadnavirus de la hepatitis B. El
retrovirus también puede ser una cadena de VIH trópica a célula T,
una cadena de VIH trópica a monocito y más preferiblemente una
cadena de virus resistente a fármacos. La cadena de
VIH-1 o VIH-2, o la cadena de VHB
también pueden ser resistentes frente a los inhibidores de la
proteasa y/o inhibidores de la transcriptasa reversa. Así, se da a
conocer el uso de los compuestos guanilhidrazona de fórmula general
(I) y/o (II) y un método para el tratamiento de infecciones y
enfermedades inducidas por virus, incluidas las infecciones
oportunistas, en el que el retrovirus es una cadena
VIH-1 o VIH-2 la cuál es resistente
contra los inhibidores de la proteasa y/o inhibidores de la
transcriptasa
reversa.
reversa.
Para tratar las mencionadas infecciones y
enfermedades inducidas por virus asociadas al menos a un compuesto
de fórmula general (I) y/o (II) y/o sales farmacéuticamente activas
de ellos, se administran a un individuo que las necesita de acuerdo
con el método dado a conocer en una dosis correspondiente a una
concentración efectiva en el rango 0,01 - 10 \muM, más
preferiblemente en el rango de 0,1 - 5 \muM. Además, los
compuestos guanilhidrazona aromáticos se pueden administrar
directamente o en combinación con otros compuestos terapéuticos,
especialmente con otros agentes antivirales. En la tabla 3 se
muestra una lista de agentes antivirales apropiados. En relación con
las declaraciones de arriba, se da a conocer el uso del compuesto
guanilhidrazona aromático de la presente invención y un método para
el uso de los compuestos inventivos y/o sales farmacéuticamente
activas de dichos compuestos, en el que al menos un compuesto de
fórmula general (I) y/o (II) y/o sales farmacéuticamente activas de
él, se administran en combinación con otros compuestos terapéuticos,
especialmente con otros agentes antivirales. Estos otros agentes
antivirales mencionados se pueden seleccionar entre los fármacos
listados abajo en la tabla 3.
Así, los compuestos descritos en la presente
invención se pueden usar en una monoterapia directamente o en forma
de composiciones farmacéuticamente aceptables para tratar
infecciones y/o enfermedades inducidas por virus. Dichas
enfermedades son causadas preferiblemente por o asociadas con
VIH-1, VIH-2,
VLTH-1, VHB. Además, los compuestos guanilhidrazona
inventivos se pueden usar como inhibidores de cadenas VIH con
tropismo para monocitos y para cadenas con tropismo para células T.
Además, los compuestos descritos en la presente invención se pueden
usar en combinación con otros agentes o fármacos antivirales para
combatir el VIH-1, VIH-2,
VLTH-1, VHB, así como para el tratamiento de
enfermedades asociadas con estos virus.
Los compuestos inventivos descritos en la
presente invención se pueden combinar específicamente con ITRNs y
ITRNNs de VIH-1 y VIH-2 como: AZT
(Zidovudina), 3TC (Lamivudina), ddI (Didanosina), ddC (Zalcitabina),
ABC (Abacavir), d4T (Stavudina), FTC
(2'-desoxi-5-fluoro-3'-tiacidina),
Emivirina, EFV (Efavirenz), DLV (Delavirdina), NVP (Nevirapina),
Adefovir dipivoxil, PMPA; con Pis Indinavir, Ritonavir, Saquinavir,
Nelfinavir, Amprenavir, ABT378, BMS 232632, Tipranavir,
L-756,423, DMP-450,
AG-1776; con hidroxicarbamida,
micofenolato-mofetil; con inhibidores de fusión
T-20, T-1249; con antagonistas CXCR4
como AMD 3100, T22, ALX40-4C, NSC 651016; con
antagonistas SSR5 como RANTES, APO-RANTES, nsc
651016; con hidroxiurea; con inhibidores integrasa como
antraquinonas, quinalizarina, ácido L-chicórico,
ácido dicafeoilquínico, con inhibidores dedo de cinc como compuestos
ditiano; con inmunomoduladores como interleuquina-2,
interferón-alfa, interferón-beta,
GM-CSF, G-CSF; con estrategias
terapéuticas de vacunas que incluyen virus vivos, atenuados y de
replicación incompetente; virus inactivados muertos; proteína de la
subunidad de la envoltura; proteína de la subunidad del núcleo;
péptidos; ácidos nucleicos de los respectivos retrovirus,
específicamente de VIH-1 o VIH-2;
con aproximaciones de terapia génica anti-retroviral
como mutantes de Rev antisentido o
dominantes-negativos. Esta invención también se
refiere a la combinación de compuestos inventivos descrita en la
presente invención con al menos uno de los fármacos mencionados
arriba. Los compuestos inventivos de fórmula general (I) y (II) se
pueden usar como inhibidores de VIH-1,
VIH-2, VLTH-I, VHB, así como para el
tratamiento de enfermedades asociadas con esos virus, donde los
agentes y fármacos antivirales mencionados arriba, especialmente
ITRNs, ITRNNs o IPs, causaron respectivamente resistencias virales
frente los mencionados agentes o fármacos antivirales. Los
compuestos guanilhidrazona aromáticos de la presente invención o
sales farmacéuticamente efectivas de ellos se administran
preferiblemente en una dosis correspondiente a una concentración
efectiva en el rango 0,01 - 10 \muM, más preferiblemente en el
rango de 0,1 - 10 \muM, y sumamente preferible en el rango de 0,1
- 5 \muM.
Como se menciona arriba, una realización
preferible de la presente invención se refiere al uso de los
compuestos guanilhidrazona aromáticos reivindicados en combinación
con otros agentes antivirales. La tabla 3 representa una colección
de agentes antivirales del VIH apropiados que se pueden usar en
combinación con al menos un compuesto de la fórmula general (I)
y(o (II) y/o sales farmacéuticamente activas de él.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se expone arriba, los compuestos
guanilhidrazona inventivos de la presente invención y/o las sales
farmacéuticamente activas de ellos o composiciones farmacéuticas que
contienen al menos un compuesto guanilhidrazona inventivo como un
ingrediente activo son útiles para la profilaxis y/o tratamiento de
infecciones, incluyendo infecciones oportunistas, y enfermedades
asociadas con estas infecciones.
Amablemente le recordamos la sección previa
titulada "VIH y SIDA":
El SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida)
es una condición causada por el VIH. Este virus ataca el sistema
inmune, las "fuerzas de seguridad" del cuerpo que combaten las
infecciones. Cuando el sistema inmune se destruye, las
"infecciones oportunistas" (IOs) se aprovechan de las defensas
debilitadas del cuerpo. Por consiguiente, decir que alguien "murió
de SIDA" no es totalmente correcto, ya que a menudo son las
enfermedades oportunistas las que causan la muerte.
Un parámetro de diagnóstico para detectar el SIDA
es mirar el número de células CD4+ del paciente. Otra forma de
detectar el SIDA es buscar las IOs: si a un individuo VIH+ se le
diagnostica una infección oportunista, se tomará como una indicación
de SIDA.
Así, es realmente importante desarrollar nuevos
métodos y proporcionar nuevos compuestos farmacéuticamente activos
para prevenir y tratar las mencionadas infecciones oportunistas.
Abajo se listan ejemplos de cada una de las
principales IOs y cánceres que pueden ocurrir durante la última
etapa de la enfermedad del VIH:
- \bullet
- Complejo Mycobacterium Avium (MAC, MAI)
- \bullet
- Salmonelosis
- \bullet
- Sífilis y neurosífilis
- \bullet
- Tuberculosis (TB)
- \bullet
- Displasia/cáncer anal
- \bullet
- Displasia/cáncer cervical
- \bullet
- Sarcoma de Kaposi (SK)
- \bullet
- Linfomas
- \bullet
- Citomegalovirus (CMV)
- \bullet
- Hepatitis
- \bullet
- Virus del Herpes simplex (herpes oral y genital)
- \bullet
- Virus del Herpes Zoster (herpes zoster)
- \bullet
- Virus del papiloma humano (VPH, verrugas genitales, displasia/cáncer anal/cervical)
- \bullet
- Molluscum Contagiosum
- \bullet
- Leucoplaquia vellosa oral (LVO)
- \bullet
- Leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP)
- \bullet
- Aspergilosis
- \bullet
- Candidiasis (tordo, infección de levaduras)
- \bullet
- Coccidioidomicosis
- \bullet
- Meningitis criptocócica
- \bullet
- Histoplasmosis
- \bullet
- Cryptosporidiosis
- \bullet
- Microsporidiosis
- \bullet
- Neumonía Pneumocistis Carinii (NPC)
- \bullet
- Toxoplasmosis
- \bullet
- SIDA Dementia Complex
- \bullet
- Neuropatía periférica
- \bullet
- Úlceras aftosas
- \bullet
- Depresión y ansiedad
- \bullet
- Fatiga y anemia
- \bullet
- Náuseas y diarrea
- \bullet
- Trombocitopenia
- \bullet
- Síndrome de cansancio y lipodistrofia
Los 10 últimos años de estudio han producido una
evidencia clara de que los individuos con la infección de
VIH-1 tienen riesgo elevado de desórdenes
neurológicos y del neurocomportamiento, tanto primarios como
secundarios. Los desórdenes primarios suceden como resultado de la
influencia del VIH-1 en el sistema nervioso central
(SNC); mientras, los desórdenes secundarios ocurren normalmente como
resultado de deficiencias del sistema inmune o efectos del
tratamiento. Los desórdenes del neurocomportamiento asociados con la
infección de VIH-1 se pueden complicar por la
preexistencia o nueva aparición de desórdenes psicológicos y
emocionales. La investigación clínica de los desórdenes neurológicos
y particularmente del neurocomportamiento asociados con la infección
de VIH-1 se ha complicado por asuntos metodológicos
y controversias, así como la nosología definida del enfermo.
En la siguiente información de la investigación
actual del VIH-1 se presentan los desórdenes
neurológicos relacionados, el diagnóstico y el tratamiento enfocado
a los desórdenes del neurocomportamiento relacionados con SIDA y un
breve repaso de los desórdenes neurológicos secundarios relacionados
con el VIH. Los compuestos guanilhidrazona inventivos de la presente
invención también son útiles para la profilaxis y/o tratamiento de
las enfermedades oportunistas descritas abajo.
El VIH-1 puede invadir
directamente el sistema nervioso central (SNC). La infección viral
en el SNC se ve más a menudo en las células microgliales
mono-nucleares y las células gigantes
multi-nucleadas. La pérdida neuronal normalmente es
secundaria a la presencia del VIH-1 en las células
de alrededor y no en las mismas neuronas. El proceso por el cuál
ocurre la muerte neuronal es especulativo, aunque los mecanismos
prepuestos incluyen la producción de citoquinas que interfieren con
la función neuronal, la producción de metabolitos neurotransmisores
anormales que son neurotóxicos, y la presencia de ciertos fragmentos
víricos que interfieren con la transmisión del neurotransmisor.
Los desórdenes de SNC asociados con
VIH-1 incluyen los desórdenes del
neurocomportamiento, desórdenes cognitivos menores asociados al VIH
y demencia asociada al VIH, y el desorden neurológico de la
mielopatía asociada al VIH.
El desorden cognitivo menor asociado a VIH puede
ocurrir en pacientes que de otro modo son asintomáticos o
ligeramente sintomáticos. El desorden se caracteriza por déficit
subcortical de atención, de velocidad de procesado de la
información, aprendizaje y memoria, y de las habilidades
psicomotoras. El desorden cognitivo menor asociado a VIH se puede
complicar por la presencia de depresión o ansiedad, pero no es
causado por problemas psiquiátricos.
Estudios recientes han mostrado que la presencia
de desorden cognitivo menor asociado a VIH aumenta al empeorar la
función inmune. El recuento de linfocitos CD4 y CD8, las relaciones
CD4/CD8 y la presencia de
beta-2-microglobulina (B2M) tanto en
suero como en fluido cerebroespinal han mostrado correlacionarse con
la severidad del desorden cognitivo asociado al VIH. Sin embargo, no
hay patognomónica del desorden.
La demencia asociada al VIH (DAV) es un desorden
progresivo que se presenta inicialmente como apatía, inercia,
lentitud cognitiva, pérdida de memoria y retirada social. Al
progresar, múltiples funciones cognitivas se dañan de forma
creciente. Las fases terminales se caracterizan por daño cognitivo
global, mutismo y retardo psicomotor severo. A diferencia del
desorden cognitivo menor asociado al VIH, el DAV raramente se
desarrolla antes de problemas constitucionales y normalmente no se
desarrolla antes de otras enfermedades que definen el SIDA. Como con
el desorden cognitivo menor asociado al VIH, a través de la
evaluación neuropsicológica se recomienda ayudarse del diagnóstico
diferencial e identificar la presencia de cualquier perturbación
psiquiátrica co-existente.
La mielopatía asociada al VIH se caracteriza por
síntomas de debilidad, descoordinación y/o incontinencia urinaria y
signos de paresis, espasticidad e hiperreflexia. Esta condición
afecta aproximadamente al 20% de los pacientes adultos con SIDA,
aunque se encuentra evidencia de la mielopatía en las autopsias del
50% de pacientes. Esta condición se asocia a menudo con disfunción
cognitiva co-existente.
El VIH-1 se ha encontrado en la
médula espinal y CSF de los pacientes con mielopatía asociada al
VIH; sin embargo, es incierto si el VIH-1 es un
patógeno directo. Otras condiciones tales como deficiencias de
vitamina B12 causan desórdenes similares, particularmente en
pacientes inmuno-comprometidos.
El paciente de VIH
inmuno-comprometido está en peligro de numerosos
desórdenes del sistema nervioso central y periférico que no son
causados directamente por el virus del VIH. Los desórdenes nerviosos
periféricos, incluyendo neuropatía sensorial, polineuropatías
desmielinantes inflamatorias, mononeuropatías, y neuropatías
craneales se encuentran en pacientes infectados de VIH. La
incidencia de neuropatías aumenta al empeorar el funcionamiento del
sistema inmune y normalmente ocurre en presencia de otros desórdenes
relacionados con el VIH; Sin embargo, en ejemplos raros, las
neuropatías periféricas pueden preceder otros síntomas del VIH. La
miopatía asociada al VIH-1 es poco común, pero se
puede presentar a lo largo de todos los estadios de la
enfermedad.
Los pacientes
inmuno-comprometidos están en peligro de infecciones
oportunistas neurológicas. Meningitis cryptococcal, toxoplasmosis,
citomegalovirus (CMV), y leucoencefalopatía multifocal progresiva
(LMP) se han visto en variadas incidencias entre pacientes de SIDA.
El CMV retinitis causa una retinitis hemorrágica en hasta el 20% de
pacientes de SIDA. El tratamiento de elección es ganciclovir, el
cuál ha demostrado una respuesta clínica positiva en aproximadamente
el 80% de pacientes.
Además de las infecciones oportunistas, los
pacientes de SIDA están en peligro de neoplasmas oportunistas del
SNC, encefalopatías metabólicas, enfermedades cerebrovasculares y
neurosífilis.
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\newpage
Se dan a conocer composiciones farmacéuticas que
comprenden al menos un compuesto de fórmula general (I) y/o (II) y/o
sales farmacéuticamente aceptables de él como un ingrediente activo
y un soporte, excipiente, coadyuvante y/o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
El compuesto de las fórmulas generales (I) y/o
(II) se puede administrar también en forma de sus sales
farmacéuticamente activas usando opcionalmente soportees,
excipientes, coadyuvantes y/o diluyentes farmacéuticamente
aceptables sustancialmente no tóxicos. Las medicaciones de la
presente invención se preparan en un soporte o diluyente sólido o
líquido convencional y un coadyuvante convencional hecho de una
forma conocida farmacéuticamente al nivel de dosis apropiado. Las
preparaciones preferibles están en forma administrable, que es
apropiada para la aplicación oral. Estas formas administrables, por
ejemplo, incluyen píldoras, comprimidos, comprimidos película,
comprimidos recubiertos, cápsulas, polvos y depósitos. También son
posibles otras formas aparte de las administrables oralmente. Los
compuestos inventivos guanilhidrazona de fórmula general (I) y/o
(II) o las preparaciones farmacéuticas que contienen los mencionados
compuestos se pueden administrar de cualquier manera apropiada,
incluyendo pero no limitándose a la inyección (intravenosa,
intraperitoneal, intramuscular, subcutánea), por absorción a través
de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (revestimientos
epiteliales de la mucosa oral, rectal y vaginal, mucosa
nasofaríngea, mucosa intestinal); oralmente, rectalmente,
transdermalmente, tópicamente, intradermalmente, intragástricamente,
intracutáneamente, intravaginalmente, intravasalmente,
intranasalmente, intrabucalmente, percutáneamente, sublingualmente,
o cualquier otra manera disponible en la técnica farmacéutica.
Dentro de los métodos dados a conocer, las
composiciones farmacéuticas de la presente invención que contienen
al menos un compuesto guanilhidrazona aromática de fórmula general
(I) o sales farmacéuticamente aceptables de él como un ingrediente
activo, se administran típicamente en mezclas con materiales de
soporte apropiados, seleccionados apropiadamente respecto a la forma
de administración intencionada, por ejemplo, comprimidos orales,
cápsulas (tanto rellenas de sólido, como rellenas de
semi-sólido o rellenas de líquido), polvos para la
constitución, geles orales, elixires, gránulos dispersables,
jarabes, suspensiones, y similares y consistentes con las prácticas
farmacéuticas convencionales. Por ejemplo, para la administración
oral en forma de comprimidos o cápsulas, el componente activo del
fármaco se puede combinar con cualquier soporte oral inerte no
tóxico farmacéuticamente aceptable, tal como lactosa, almidón,
sucrosa, celulosa, estearato magnésico, fosfato dicálcico, sulfato
cálcico, talco, manitol, alcohol etílico (formas líquidas) y
similares. Además, si se desea o necesita, se pueden incorporar a la
mezcla aglutinantes apropiados, lubricantes, agentes desintegrantes
y agentes colorantes. Los polvos y los comprimidos pueden comprender
de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 95 por ciento de
composición inventiva.
Los aglutinantes apropiados incluyen almidón,
gelatina, azúcares naturales, edulcorantes de maíz, gomas naturales
y sintéticas tales como acacia, alginato sódico,
carboximetil-celulosa, polietilenglicol y ceras.
Entre los lubricantes se pueden mencionar para el uso en estas
formas de dosificación, ácido bórico, benzoato sódico, acetato
sódico, cloruro sódico y similares. Los desintegrantes incluyen
almidón, metilcelulosa, goma guar y similares. Los agentes y
conservantes de edulcoración y aromatización se pueden incluir
también si es apropiado. Algunos de los términos indicados arriba,
es decir, desintegrantes, diluyentes, lubricantes, aglutinantes y
similares, se discuten abajo más en detalle.
Adicionalmente, las composiciones pueden estar
formuladas en forma de liberación sostenida para proporcionar la
velocidad de liberación controlada de alguno o varios de los
componentes o ingredientes activos para optimizar los efectos
terapéuticos, por ejemplo, la actividad antihistamínica y similares.
Las formas de dosificación apropiadas para la liberación sostenida
incluyen comprimidos recubiertos que contienen recubrimientos de
variadas velocidades de desintegración o matrices poliméricas de
liberación controlada impregnadas con los componentes activos y
modeladas en forma de comprimidos o cápsulas que contienen tales
matrices poliméricas porosas impregnadas o encapsuladas.
Las preparaciones en forma líquida incluyen
disoluciones, suspensiones y emulsiones. Como ejemplo se pueden
mencionar el agua o las disoluciones
agua-propilenglicol para inyecciones parenterales o
la adición de edulcorantes y opacificantes para disoluciones,
suspensiones y emulsiones orales. Las preparaciones en forma líquida
también pueden incluir disoluciones para la administración
intranasal.
Las preparaciones de aerosol apropiadas para la
inhalación pueden incluir disoluciones y sólidos en forma de polvo,
que pueden estar en combinación con un soporte farmacéuticamente
aceptable tal como gas inerte comprimido, por ejemplo,
nitrógeno.
Para la preparación de supositorios, una cera de
bajo punto de fusión tal como una mezcla de glicéridos de ácido
graso tales como mantequilla de coco se funde en primer lugar, y el
ingrediente activo se dispersa homogéneamente en ella por agitación
o mezcla similar. La mezcla homogénea molida se vierte entonces
dentro de moldes de tamaño conveniente, se deja enfriar y
solidifica.
También están incluidas las preparaciones en
forma sólida que tienen la intención de ser convertidas, poco antes
del uso, en preparaciones en forma líquida tanto para la
administración oral como parenteral. Tales formas líquidas incluyen
disoluciones, suspensiones y emulsiones.
Los compuestos guanilhidrazona aromáticos de la
presente invención también se pueden aplicar de forma transdérmica.
Las composiciones transdérmicas pueden tomar la forma de cremas,
lociones, aerosoles y/o emulsiones y se pueden incluir en un parche
transdérmico del tipo matriz o reservorio como los convencionales en
la técnica para este propósito.
El término cápsula se refiere a un contenedor o
inclusión especial hecho de metilcelulosa, alcoholes polivinílicos,
o gelatinas desnaturalizadas o almidón para sostener o contener las
composiciones que comprenden los ingredientes activos. Las cápsulas
de carcasa dura están hechas típicamente de mezclas de hueso de
fuerza de gel relativamente elevada y gelatinas de piel de cerdo. La
cápsula propiamente puede contener pequeñas cantidades de
colorantes, agentes opacantes, plastificantes y conservantes.
Comprimido quiere decir forma de dosificación
sólida comprimida o molida que contiene los ingredientes activos con
diluyentes apropiados. El comprimido se puede preparar por
compresión de mezclas o granulaciones obtenidas por granulación
húmeda, granulación seca o por compactación, bien conocidas por una
persona experta en la técnica.
Los geles orales se refieren a ingredientes
activos dispersos o solubilizados en una matriz hidrofílica
semi-sólida.
Los polvos para constitución se refieren a
mezclas de polvo que contienen los ingredientes activos y diluyentes
apropiados que se pueden suspender en agua o zumos.
Los diluyentes apropiados son sustancias que
usualmente suponen la parte principal de la composición o forma de
dosificación. Los diluyentes apropiados incluyen azúcares tales como
lactosa, sucrosa, manitol y sorbitol, almidones derivados de trigo,
maíz, arroz y patata, y celulosas tales como celulosa
microcristalina. La cantidad de diluyente en la composición puede ir
de aproximadamente 5 a aproximadamente 95% en peso de la composición
total, preferiblemente de aproximadamente 25 a aproximadamente 75%,
más preferiblemente de aproximadamente 30 a aproximadamente 60% en
peso.
El término desintegrante se refiere a materiales
añadidos a la composición para ayudarla a romperse (desintegrarse) y
liberar los medicamentos. Los desintegrantes apropiados incluyen
almidones, almidones modificados "solubles en agua fría" tales
como almidón carboximetil sódico, gomas naturales y sintéticas tales
como haba de langosta, karaya, guar, tragacanto y agar, derivados de
celulosa tales como metilcelulosa y carboximetilcelulosa sódica,
celulosas microcristalinas y celulosas microcristalinas
entrecruzadas, tales como croscarmelosa sódica, alginatos tales como
ácido algínico y alginato sódico, arcillas tales como bentonitas, y
mezclas efervescentes. La cantidad de desintegrante en la
composición puede ir desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente
20% en peso de la composición, más preferiblemente desde
aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10% en peso.
Los aglutinantes caracterizan sustancias que unen
o "pegan" polvos entre sí y los hacen cohesivos por formación
de gránulos, sirviendo así como "adhesivo" en la formulación.
Los aglutinantes añaden la fuerza cohesiva ya disponible en el
diluyente o el agente a granel. Los aglutinantes apropiados incluyen
azúcares tales como sucrosa, almidones derivados de trigo, maíz,
arroz y patata; gomas naturales tales como acacia, gelatina y
tragacanto; derivados de algas tales como ácido algínico, alginato
sódico y alginato cálcico de amonio; materiales celulósicos tales
como metilcelulosa y carboximetilcelulosa sódica e
hidroxipropil-metilcelulosa; polivinilpirrolidonas;
e inorgánicos tales como silicato de aluminio magnesio. La cantidad
de aglutinante en la composición puede ir desde aproximadamente 2
hasta aproximadamente 20% en peso de la composición, más
preferiblemente desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10% en
peso, incluso más preferiblemente desde aproximadamente 3 hasta
aproximadamente 6% en peso.
Los lubricantes se refieren a sustancias añadidas
a la forma de dosificación para permitir al comprimido, gránulos,
etc. después de ser comprimido, liberarse del molde o troquel
reduciendo la fricción de desgaste. Los lubricantes apropiados
incluyen estearatos metálicos tales como estearato magnésico,
estearato cálcico o estearato potásico; ácido esteárico; ceras de
elevado punto de fusión; y lubricantes solubles en agua tales como
cloruro sódico, benzoato sódico, acetato sódico, oleato sódico,
polietilenglicoles y d'l-leucina. Los lubricantes se
añaden normalmente en el último paso antes de la compresión, ya que
tienen que estar presentes en la superficie de los gránulos y entre
ellos y las partes de la prensa de comprimidos. La cantidad de
lubricante en la composición puede ir desde aproximadamente 0,2
hasta aproximadamente 5% en peso de la composición, preferiblemente
desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 2% en peso, más
preferiblemente desde aproximadamente 0,3 hasta aproximadamente 1,5%
en peso.
Los deslizantes son materiales que evitan el
endurecimiento y mejoran las características de flujo de las
granulaciones, de manera que el flujo es suave y uniforme. Los
deslizantes apropiados incluyen dióxido de silicio y talco. La
cantidad de deslizante en la composición puede ir desde
aproximadamente 0,2 hasta aproximadamente 5% en peso de la
composición, preferiblemente desde aproximadamente 0,1% hasta
aproximadamente 5% en peso, preferiblemente desde aproximadamente
0,5 hasta aproximadamente 2% en peso.
Los agentes colorantes son excipientes que
proporcionan coloración a la composición o la forma de dosificación.
Tales excipientes pueden incluir tintes de grado alimentario y
tintes de grado alimentario adsorbidos sobre un adsorbente apropiado
tal como arcilla u óxido de aluminio. La cantidad de agente
colorante puede variar desde aproximadamente 0,1 hasta
aproximadamente 5% en peso de la composición, preferiblemente desde
aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 1%.
Las técnicas para la formulación y la
administración de los compuestos guanilhidrazona aromáticos de la
presente invención se pueden encontrar en "remington's
Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton PA. Una
composición apropiada que contiene al menos un compuesto de la
invención puede ser una disolución del compuesto en un soporte
farmacéutico líquido apropiado o cualquier otra formulación tal como
comprimidos, píldoras, comprimidos película, comprimidos
recubiertos, grageas, cápsulas, polvos y depósitos, geles, jarabes,
mezclas, suspensiones, emulsiones y similares.
Una dosificación terapéuticamente efectiva de un
compuesto de fórmula general (I) se refiere a la cantidad del
compuesto que tiene como resultado al menos una inhibición parcial
del crecimiento celular bacteriano. La toxicidad y la eficacia
terapéutica de tales compuestos se pueden determinar mediante
procedimientos estándar farmacéuticos, farmacológicos y
toxicológicos en cultivos celulares o animales de experimentación
para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población)
y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la
población). La relación de dosis entre el efecto tóxico y el
terapéutico es el índice terapéutico y se puede expresar como la
relación entre LD50 y ED50. La dosis del compuesto se encuentra
preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circular que
incluye el ED50 con poca o sin toxicidad. Más preferiblemente, la
dosis del compuesto corresponde a una concentración efectiva en el
rango de 0,01-10 \muM. La cantidad actual de
composición administrada será dependiente del sujeto que es tratado,
del peso del sujeto, la severidad de la aflicción, la manera de
administración y el juicio del médico que lo prescribe.
La Fig. 1 muestra las estructuras de varios
compuestos guanilhidrazona aromáticos de fórmula general (I):
- Compuesto 1:
- N-(4-acetilfenil)-N'-(3,5-diacetilfenil)urea tris (amidinohidrazona)
- Compuesto 2:
- N,N'-bis(3-acetilfenil) pentano diamida bis (amidinohidrazona)
- Compuesto 3:
- N,N'-bis(3,5-diacetilfenil) pentano diamida tetrakis (amidinohidrazona)
- Compuesto 4:
- N,N'-bis(3,5-diacetilfenil) decano diamida tetrakis (amidinohidrazona)
- Compuesto 5:
- N,N'-bis(3,5-diacetilfenil) butano diamida tetrakis (amidinohidrazona)
- Compuesto 6:
- N,N'-bis(3,5-diacetilfenil) hexano diamida tetrakis (amidinohidrazona)
- Compuesto 7:
- N,N'-bis(3,5-diacetilfenil) heptano diamida tetrakis (amidinohidrazona)
- Compuesto 8:
- N,N'-bis(3,5-diacetilfenil) ácido isoftálico diamida tetrakis (amidinohidrazona)
La clonación de la eIF-5A
humana y DHS cADN se consiguió usando una librería de cADN de
hígado prefabricado (Clontech) con primers de reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) específicos para eIF-5A
(Smit-McBride y col. 1989) y DHS (Bevec y col.,
1996) cADNs anclando sitios de restricción adicionales BamHI y EcoRI
para la clonación posicional dentro de los vectores pGex de
expresión de proteína (Amersham Pharmacia Biotech). Después de la
determinación de la secuencia, los plásmidos se transformaron dentro
de la cadena BL21 (DE3) de E. coli. Un cultivo bacteriano de
toda la noche se diluyó 1:10 con medio LB fresco (suplementado con
100 \mug/ml de ampicilina) y creció durante 1 h a 37ºC.
Posteriormente se añadió IPTG (0,5 mM) y el cultivo avanzó otras 4h.
Las células se pasaron a pellet y se resuspendieron en 2 ml de PBS
conteniendo DTT 1 mM. Después de la sonicación (dos veces durante 30
s a un ajuste de 10W) el lisado se centrifugó durante 2 min a 14000
rpm en una centrífuga Eppendorf y el pellet se disolvió en 1 ml de
urea 8 M y se dializó durante la noche frente
glicina-NaOH 0,3 M (pH 9,0)/Tween 20 0,1%. La
consistencia de las proteínas de fusión se ensayó en un gel
SDS-PAGE. Después de esto, la fusión
GST-eIF-5A se rompió con Factor Xa
(Roche) debido a la recomendación del fabricante, mientras la
proteína de fusión GST-eIF-5A se
analizó para la actividad desoxihipusina sintasa. La mezcla de
reacción enzimática estándar (volumen total 200 \mul) contuvo 5
\mug eIF-5A, 0,5 \muCi
[^{3}H]espermidina (15 Ci/mmol), 1 mM NAD^{+}, 1 mM DTT y
varias cantidades de GST-DHS en tampón
glicina-NaOH 0,3 M, pH 9,0, suplementado con 50
\mug/ml de BSA. La mezcla se incubó a 37ºC durante 3 h y se paró
añadiendo 100 \mul de espermidina 20 mM en PBS. La mezcla de
reacción se pasó a través de columnas de filtración por gel Sephadex
G-25 (columnas PD-10, Amersham
Pharmacia Biotech) para separar la eIF-5A marcada
del exceso de espermidina. La radioactividad incorporada se midió en
un contador de escintilación líquida. La [^{3}H]espermidina
se obtuvo de DuPont-NEN; la espermidina no marcada
de Calbiochen, y NAD^{+} de Roche.
La replicación del VIH se midió mediante el Kit
de análisis de captura del antígeno p24 VIH (ELISA;
HIVAG-1 Monoclonal kit B1a011; Abbott) siguiendo la
recomendación del fabricante, o mediante el uso del sistema de
análisis Quantiplex VIH-1 ARN 3.0 (ADNr) (Chiron
Diagnostics). El último ensayo es un ensayo de muestra de la
amplificación de señal de ácido nucleico (empleando un procedimiento
sándwich de hibridación del ácido nucleico) para la cuantificación
directa del ARN del VIH en el plasma humano. Allí, brevemente, el
VIH-1 se concentra primero por centrifugación a
partir del plasma. Después de liberar el ARN genómico del
VIH-1 de los viriones, el ARN es capturado en un
microondas mediante un conjunto de muestras específicas de captura
de oligonucleótidos sintético. Un conjunto de muestras diana se
hibrida al ARN viral y a las muestras de
pre-amplificador. Las muestras de captura, que
comprenden 17 extensores de captura individuales, y las muestras
diana, que comprenden 81 extensores diana individuales, se unen a
diferentes regiones del gen pol del ARN viral. La muestra de
amplificador se hibrida al pre-amplificador formando
un complejo de ADN ramificado (ADNr). Entonces, a este complejo de
ADNr inmobilizado se le hibridan múltiples copias de una muestra
marcada con fosfatasa alcalina. La detección se consigue por
incubación del complejo entero con un sustrato quimioluminiscente.
La emisión de luz es directamente proporcional a la cantidad de ARN
de VIH-1 presente en cada muestra, y los resultados
son guardados por un analizador apropiado como unidades relativas de
luz.
Las células de Jurkat (especie: leucemia de
célula T humana, características especiales: las células son
permisivas al crecimiento de cadenas de VIH de células T trópicas;
fuente: ATTC nº Cat. TIB 152) o las células PM1 (especie: derivado
clónico de células HUT 78 humanas; características especiales: las
células son permisivas al crecimiento de cadenas de VIH de
macrófagos trópicos y células T trópicas; fuente: Dr. Marvin Reitz,
cortesía del NIH AIDS Research and Reference Reagent Program nº Cat.
3038) se estimularon durante 3 días con fitohemaglutinina
(PHA-P, nº de producto L9132 de Sigma) en una
concentración de 2 \mug/ml (1,5x10^{6} células/ml) y bromuro de
hexadimetrina (Polybrene, nº de producto H9268 de Sigma) en una
concentración de 2 \mug/ml (1,5x10^{6} células/ml) en medio RPMI
1640 que contiene 10% de suero fetal de ternero (FCS, Pansystems
GmbH) y antibiótico.
Para infección de VIH-1, se
resuspendieron 5x10^{7} células en 500 \mul de medio de cultivo
fin fármacos de ensayo y se incubó en un tubo de tapón azul de 50 ml
a 37ºC durante 5 horas con reservas virales de título alto de
VIH-1. Las células Jurkat se infectaron con la
cadena VIH-1 NL4-3 células T, las
células PM1 con la cadena VIH-1 Ba-L
trópica a macrófagos (ambas del NIH AIDS Research and Reference
Reagent Program). Después de la infección las células se lavaron dos
veces con PBS sin Ca^{2+} y Mg^{2+} para evitar la determinación
de falsos positivos de antígeno p24. Las células se resuspendieron y
se cultivaron adicionalmente alícuotas idénticas (1x10^{6}/ml) de
células infectadas en 10 ml de medio con fármacos de ensayo a varias
concentraciones, o en medio con DMSO como control para el cálculo de
la inhibición de la replicación del virus [en %].
Se cambió el medio de cultivo y las células se
escindieron los días 3 y 7 de los experimentos. La viabilidad de las
células (tinción Trypan-azul), el recuento de
células y los niveles del antígeno p24 se determinaron los días 3, 7
y 10 del experimento. No se observaron diferencias significativas en
la viabilidad de las células (\sim85-90% de
células vivas).
Las células PM1 infectadas de nuevo con cadena
VIH-1_{Ba-L} trópica a
macrófago
| DMSO | Compuesto nº 4 | Compuesto nº 4 |
| (disolvente control) | 0,5 \muM | 1,0 \muM |
| d10: 0% | d10: 82% | d10: 73% |
\vskip1.000000\baselineskip
| DMSO | Compuesto nº 5 | Compuesto nº 5 |
| (disolvente control) | 1,0 \muM | 5,0 \muM |
| d7: 0% | d7: 48% | d7: 97% |
| d10: 0% | d10: 35% | d10: 86% |
\vskip1.000000\baselineskip
| DMSO | Compuesto nº 1 | Compuesto nº 1 |
| (disolvente control) | 1,0 \muM | 5,0 \muM |
| d7: 0% | d7: 23% | d7: 72% |
| d10: 0% | d10: 0% | d10: 51% |
Las células Jurkat infectadas de nuevo con cadena
VIH-1_{NL4/3} trópica a célula T
| DMSO | Compuesto nº 4 | Compuesto nº 4 |
| (disolvente control) | 0,5 \muM | 1,0 \muM |
| d10: 0% | d10: 31% | d10: 85% |
\vskip1.000000\baselineskip
| DMSO | Compuesto nº 5 | Compuesto nº 5 |
| (disolvente control) | 1,0 \muM | 5,0 \muM |
| d7: 0% | d7: 26% | d7: 70% |
| d10: 0% | d10: 0% | d10: 16% |
\vskip1.000000\baselineskip
| DMSO | Compuesto nº 1 | Compuesto nº 1 |
| (disolvente control) | 1,0 \muM | 5,0 \muM |
| d7: 0% | d7: 15% | d7: 52% |
| d10: 0% | d10: 5% | d10: 31% |
El día 10 de la infección, las cadenas de VIH se
replicaron vigorosamente en cultivos no tratados. Los números
describen el porcentaje de inhibición de la replicación del VIH
comparado con experimentos control.
Las células mononucleares de sangre periférica
(CMSPs) de pacientes infectados de VIH-1 se aislaron
- (después de dar el consentimiento informal) - mediante
centrifugación en gradiente Biocoll (Biochrom). 1x10^{6}/ml CMSPs
se cultivaron (5 ml en una placa de de 32 mm seis pocillos) en
presencia de fármacos de ensayo o en DMSO (disolvente control) en
medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero antólogo y 2 mM de
L-glutamina a 37ºC y 5% de CO_{2}.
El medio de cultivo se cambió cada 3 días durante
los experimentos. Una vez a la semana, cada cultivo se escindió 1:1
y se añadió 2x10^{6} de alimentador CMSPs (por pocillo) e
interleuquina 2 recombinante (IL-2)[10U/ml](Roche).
Antes de la adición a los cultivos celulares, los alimentadores
CMSPs preparados a partir de 4 donantes sanos, se trataron durante 4
días con PHA-P y PB (2 \mug/ml por cada 2x10^{6}
células). El día 14 se determinó la viabilidad de CMSPs (tinción
Trypan-azul), el recuento celular y la carga viral
(antígeno p24: Innotest HIV Antigen mAb, Innogenetics N.V., Gent,
Belgium, o ADNr: Ensayo 3.0 VIH-1 ARNA, Bayer AG,
Tarrytown, NY, EEUU). No se observaron diferencias significativas en
la viabilidad de las células (\sim75-80% células
vitales).
| CMSPs infectadas de VIH del paciente 1 | ||
| DMSO | Compuesto nº 4 | Compuesto nº 4 |
| (disolvente control) | 0,5 \muM | 1,0 \muM |
| d14: 0% | d14: 91,6% | d14: 90,7% |
\vskip1.000000\baselineskip
| CMSPs infectadas de VIH del paciente 2 | ||
| DMSO | Compuesto nº 4 | Compuesto nº 4 |
| (disolvente control) | 0,5 \muM | 1,0 \muM |
| d14: 0% | d14: 85,8% | d14: 97,6% |
| CMSPs infectadas de VIH del paciente 3 | ||
| DMSO | Compuesto nº 4 | Compuesto nº 4 |
| (disolvente control) | 0,5 \muM | 1,0 \muM |
| d14: 0% | d14: 91% | d14: 90% |
El día 14 del cultivo, el virus se replicó
vigorosamente en todos los cultivos no tratados. Los números
describen el porcentaje de inhibición de la replicación del
VIH-1 comparado con experimentos control.
Las células PM1 se infectaron con
VIH-1 Ba-L (como se describió
arriba) y se cultivaron durante 12 días en presencia del compuesto
nº 4 a una concentración de 500 nM. Posteriormente las células se
escindieron 1:1. Uno de estos cultivos se siguió incubando en 500 nM
del fármaco de ensayo durante otros 12 días. El otro cultivo se lavó
con Medio y se incubó durante 12 días en DMSO (control).
El medio de cultivo se cambió el día 2, 5, 7, 10
y 12 antes de eliminar el fármaco y el día 2, 5, 7 y 9 después de la
escisión celular. La viabilidad de las células, el recuento celular
y los niveles de antígeno p24 se determinaron a los días
indicados.
Los resultados de los experimentos de lavado con
el compuesto nº 4 se muestran en la figura 2.
Las células PM1 se infectaron con un
"VIH-1 omni-fármaco resistente"
(VIH-1 NL4-3 recombinante en que el
gen proteasa y la parte 5' del gen de la transcriptasa reversa se
reemplazó por las secuencias correspondientes de un aislado clínico
omni-fármaco resistente, resistente a todos los
fármacos anti-VIH disponibles actualmente. Las
células infectadas se incubaron con el compuesto nº 4 a una
concentración de 250, 500 y 1000 nM o DMSO (control). El medio de
cultivo se cambió cada 3 días. La viabilidad de las células (tinción
Trypan-azul), el recuento celular y los niveles de
p24 se determinaron el día 6 y 12.
| DMSO | Compuesto nº 4 | Compuesto nº 4 | Compuesto nº 4 |
| (disolvente control) | 0,25 \muM | 0,5 \muM | 1,0 \muM |
| d6: 0% | d6: 15% | d6: 30% | d6: 58% |
| d12: 0% | d12: 64% | d12: 95% | d12: 97% |
El día 12 de la infección, el virus se replicó
vigorosamente en los cultivos no tratados. Los números describen el
porcentaje de inhibición de la replicación del VIH-1
comparado con experimentos control.
Además, también se ensayaron varios "tipos"
diferentes de cadenas de VIH-1 resistentes a
múltiples fármacos anti-retrovirales:
| "Tipo" de virus | Compuesto nº 4 | [%] de inhibición de la |
| [\muM] | replicación del virus | |
| VIH-1 resistente a IP | 1,0 | 95% |
| 0,5 | 50% | |
| VIH-1 resistente a ITRNN | 1,0 | 82% |
| 0,5 | 71% | |
| VIH-1 resistente a ITRN + IP | 1,0 | 73% |
| 0,5 | 68% | |
| IP: inhibidores de proteasa | ||
| ITRNN: inhibidores de transcriptasa reversa no nucleosídicos | ||
| ITRN: inhibidores de transcriptasa reversa nucleosídicos |
CMSPs de un paciente infectado de
VIH-1 se cultivaron en varias concentraciones de
compuesto nº 4 (125, 250, 500 y 750 nM) o DMSO (control). El medio
de cultivo se cambió cada 3 días durante los experimentos. Una vez a
la semana, cada cultivo se escindió 1:1 y se añadieron
CMSPs-alimentadoras (las células alimentadoras se
prepararon y estimularon con PHA-P y PB como se
resume en la figura 3) y IL-2 recombinante [10U/ml]
(Roche). Cada semana se determinaron la viabilidad celular (tinción
Trypan-azul), el recuento celular y los niveles de
p24. Los resultados de la inhibición a largo plazo de un aislado
clínico de VIH-1 se muestran en la figura 3.
Se infectaron con VIH-1
Ba-L 10^{8} células PM1. Las células infectadas se
lavaron dos veces en PBS, se escindieron 1:1 y se cultivaron en
presencia del compuesto nº 4 (800 nM) o DMSO (50 ml de cada
cultivo). Los ARNs se aislaron el día 7 después de la infección. Los
ARNs citoplasmáticos (C) se prepararon por lisis de las células en
tampón NP-40 (0,05% de NP-40,
MgCl_{2} 5 mM, KCl 50 mM, Hepes-NaOH 10 mM pH 7,6)
como se describe previamente (Greenberg y Ziff 1984 Nature
311:433-438). Los lisados se aclararon por
centrifugación (centrífuga Eppendorf de sobre mesa; 14000 rpm, 5
min., 4ºC) y se ajustaron a una concentración final de isotiocianato
de guanidina 4 M. Esta disolución se cargó sobre un cojín de CsCl
5,7 M. Posteriormente las muestras se centrifugaron usando una
ultracentrífuga Beckman TLX (rotor TLA 100) durante 2,5 h a 100000
rpm y 24ºC. El pellet de ARN se redisolvió en agua, se trató con
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y se precipitó en
etanol. Después de la centrifugación (centrífuga Eppendorf de sobre
mesa; 14000 rpm, 15 min., 4ºC), los pellets de ARN se liofilizaron y
posteriormente se disolvieron en agua para el análisis posterior.
Los ARNs totales (T) se aislaron por lisis directa de las células en
isotiocianato de guanidina 4 M y se purificaron por centrifugación a
través de un cojín de CsCl 5,7 M como se resume arriba.
Se fraccionaron por electroforesis muestras de
ARN citoplasmático y total, de 25 ml cada una, a través de geles de
azarosa al 1,2% en formaldehído, se transfirieron sobre membranas
Hybond N (Amersham) y se sometieron a análisis Northern usando
muestras de oligonucleótidos sintéticos
radio-marcados VIH-1
U3-LTR-(5'-GGTGTGTAGTTCTGCCAATCAGGGAAGTAGCC-3')
y U6 snARN-específico
(5'-GATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGG-3')
como se describe previamente (Valent y col. 1991 Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88:3339-3342).
La detección del U6 snARN exclusivamente nuclear
sirvió como control para la pureza de las muestras de ARN
citoplasmático. La muestra VIH-1 específica detecta
tres clases de mARN viral: unspliced \sim clase 9kb,
single-spliced \sim clase 4kb y
multiply-spliced \sim clase 2kb. De forma
importante, la acumulación citoplasmática de la \sim clase 9kb y
la \sim clase 4kb de especies de ARN viral está sujeto a la
regulación de la proteína VIH-Rev.
Las intensidades de las bandas específicas se
evaluaron por fosfo-imagen. Para comparar
cuantitativamente la
\sim clase 9kb y la \sim clase 4kb de mARN de VIH-1 citoplasmático, se corrigieron los valores de intensidad debido a cargas de ARN ligeramente diferentes. Por esto, se igualaron las intensidades de la \sim clase 2kb del mARN del VIH-1 (que se acumula en el citoplasma de un modo dependiente de Rev-VIH y parece no afectarse por el compuesto 4), y se ajustaron los valores para las especies de ARN unspliced y single-spliced (la \sim clase 9kb y la \sim clase 4kb respectivamente). Los resultados de la inhibición de la acumulación citoplasmática de mARNs virales spliced de forma incompleta causados por el compuesto nº 4 se muestran en la figura 4. La figura 4ª muestra células PM1 infectadas por VIH-1 Ba-L. La figura 4B describe la cuantificación de las manchas mostradas en la figura 4A.
\sim clase 9kb y la \sim clase 4kb de mARN de VIH-1 citoplasmático, se corrigieron los valores de intensidad debido a cargas de ARN ligeramente diferentes. Por esto, se igualaron las intensidades de la \sim clase 2kb del mARN del VIH-1 (que se acumula en el citoplasma de un modo dependiente de Rev-VIH y parece no afectarse por el compuesto 4), y se ajustaron los valores para las especies de ARN unspliced y single-spliced (la \sim clase 9kb y la \sim clase 4kb respectivamente). Los resultados de la inhibición de la acumulación citoplasmática de mARNs virales spliced de forma incompleta causados por el compuesto nº 4 se muestran en la figura 4. La figura 4ª muestra células PM1 infectadas por VIH-1 Ba-L. La figura 4B describe la cuantificación de las manchas mostradas en la figura 4A.
10^{7} células Jurkat se marcaron
metabólicamente durante 12 horas usando 50 \muCi
[1,4-14 C] de dihidrocloruro de putrescina (108
mCi/mmol; Amersham) en presencia de 0,5 \muM o 1,0 \muM del
compuesto nº 4 o DMSO (control). Las células se pelletearon, se
lavaron dos veces en PBS y se lisaron en tampón RIPA (SDS 0,1%,
Triton X-100 1%, desoxicolato sódico 1%, NaCl 150
mM, PMSF 0,24 mM, EDTA 1 mM, Tris 10 mM pH 7,4). Las concentraciones
de proteína se determinaron (análisis de proteína
Bio-Rad) y cantidades iguales de proteína de los
variados extractos celulares radio-marcados se
sometieron a análisis de inmunoprecipitación específica de
eIF-5A usando anticuerpos policlonales
anti-eIF-5A de ratón (Schatz y col.
1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1607-1612) y se
analizaron por 14% SDS-PAGE y
auto-radiografía. En la figura nº 5 se muestran los
resultados de inhibición de la formación de hipusina en células
vivas eIF-5A mediante el compuesto nº 4.
CMSPs de un donante sano se cultivaron durante 7
días en presencia de 500 nM del compuesto nº 4 o DMSO (control).
Posteriormente, las células se lavaron en PBS y se analizaron por
FACS (FACSCalibur, Becton Dickinson) usando un kit de apoptosis de
anexina V acoplado a FITC disponible comercialmente según el
protocolo del fabricante (Bender Medsystems # BMS306FI). En la
figura 6A se muestran los resultados de los efectos del compuesto nº
4 en la apoptosis.
Células T Jurkat se cultivaron durante 7 días en
presencia de 500 nM del compuesto nº 4 o DMSO (control). El análisis
del ciclo celular se registró en un aparato FACSCalibur (Becton
Dickinson) usando un kit de tinción de ADN basado en yoduro de
propidio (CycleTestTM Plus: Becton Dickinson) disponible
comercialmente, según las especificaciones del fabricante. En la
figura 6B se muestran los resultados de los efectos del compuesto nº
4 en la progresión del ciclo celular.
Las células HepG2-2.215 humanas
(ATCC nº cat. CRL-11997) infectadas de forma crónica
con VHB, se situan en placas de microtitración de 96 pocillos en
medio DMEM suplementado con suero fetal bovino. Después de la
incubación a 37ºC en una ambiente humidificado al 5% en CO_{2}
durante 16-24 horas, la monocapa de células
HepG2-2.215 se lava y el medio se reemplaza con
medio completo que contiene varias concentraciones del compuesto de
ensayo. Cada tres días durante los experimentos se cambia el medio
de cultivo por medio fresco que contiene el compuesto de ensayo
diluido apropiadamente.
Seis días después de la administración inicial
del compuesto de ensayo, el cultivo celular sobrenadante se recoge y
se clarifica por centrifugación. La viabilidad celular se evalúa
mediante un procedimiento de absorción de tinte (Promega's Cell
Titer Aqueous One Solution). El ADN del VHB asociado a los viriones
presente en el cultivo de tejido sobrenadante se amplifica empleando
tecnología PCR usando pares de primers derivados de la cadena ayw
del VHB. Posteriormente, el ADN del VHB amplificado por PCR se
detecta a tiempo real mediante el seguimiento del incremento en las
señales de fluorescencia que resultan de la degradación
exonucleótica de una molécula de la muestra fluorescente inhibida,
siguiendo la hibridación de la muestra al ADN del VHB amplificado
(TaqMan; Perkin-Elmer).
El mismo tipo de experimentos se realizó
adicionalmente con una cadena mutante de VHB resistente a la
lamivudina, que se transfeccionó dentro de células HepG2.
| Compuesto | IC_{50} (\muM) | IC_{50} (\muM) | TC_{50} (\muM) | TI_{50} (\muM) | TI_{50} (\muM) | Comentarios |
| ADN virión | ADN viral | ADN virión | ADN viral | |||
| intracelular | intracelular | |||||
| Nº 4 | 3,19 | 4,96 | >20 | >6,27 | >4,03 | Activo |
El efecto del compuesto nº 4 en la producción de
VHB mutante transfeccionado, resistente a la lamivudina, en células
HepG2:
| Compuesto | IC_{50} (\muM) | TC_{50} (\muM) | TI_{50} (\muM) | Comentarios |
| ADN virión | ADN virión | |||
| Nº 4 | 2,78 | 24,7 | 8,7 | Activo |
La mínima concentración de fármaco inhibidora que
reduce la replicación viral al 50% (IC_{50}) y la mínima
concentración de fármaco que inhibe el crecimiento celular al 50%
(TC_{50}) se calculan usando un programa de análisis de regresión
para ajustar curvas semilogarítmicas. Dividiendo TC_{50} por
IC_{50} se determina un índice terapéutico (TI)(selectividad) para
el compuesto nº 4.
Se emplea un procedimiento de ensayo de la
inhibición CPE de los efectos citopáticos inducidos por virus que
usa Promega's Cell Titer Aqueous One Solution (MTS, tinción
metabólica) para evaluar los compuestos para la actividad antiviral
frente al virus del herpes simplex tipo 1 (cadena HF) en células
Vero (células de mono verde africano, ATCC nº cat.
CCL-81). Se pre-cultivan las células
Vero en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos usando Dulbecco's
Modified Eagle's Medium (DMEM) suplementado con suero fetal bovino
10% inactivado por calor (SFB), L-glutamina,
penicilina y estreptomicina. A cada uno de los replicados de
cultivos celulares se le añaden 50 \mul de la disolución del
fármaco de ensayo y 50 \mul de la suspensión del virus. Los
controles celulares que contienen medio solo, los controles
infectados de virus que contienen medio y virus, los controles de
citotoxicidad del fármaco que contienen medio y cada concentración
del fármaco, los controles del reactivo que contienen solo medio de
cultivo (células no), y los controles colorimétricos del fármaco que
contienen fármaco y medio (células no) transcurren simultáneamente
con las muestras de ensayo. Las placas se incuban a 37ºC en una
atmósfera humidificada que contiene 5% de CO_{2} hasta que se
observa CPE máximo en los cultivos control del virus no tratado (día
5). La inhibición CPE se determina por un procedimiento de absorción
de tinte (MTS). Este método mide la viabilidad celular y se basa en
la reducción del tetrazolio MTS por enzimas mitocondriales de
células huésped viables dando MTS formazan. El MTS (10 \mul) se
añade a cada uno de los pocillos de la placa. Las placas se incuban
a 37ºC durante 4 horas. El color púrpura del MTS formazan se mide
entonces espectrofotométricamente a 490/650 nm. El valor de la
densidad óptica (DO) de cada cultivo es una función de la cantidad
de formazan producida, la cuál es proporcional al número de células
viables. Se utiliza un programa de ordenador para calcular el
porcentaje de reducción de CPE de los pocillos infectados de virus y
el % de viabilidad celular de los pocillos control de fármaco no
infectados.
| Compuesto | IC_{50} (\muM) | TC_{50} (\muM) | TI_{50} | Comentarios |
| Nº 4 | 1,56 | 20,58 | 13,19 | Activo |
La mínima concentración de fármaco inhibidora que
reduce la CPE al 50% (IC_{50}) y la mínima concentración de
fármaco que inhibe el crecimiento celular al 50% (TC_{50}) se
calculan usando un programa de análisis de regresión para ajustar
curvas semilogarítmicas. Dividiendo TC_{50} por IC_{50} se
determina un índice terapéutico (TI)(selectividad) para el compuesto
nº 4.
Células P3HR-1 humanas se
infectan de forma latente con VEB. El cultivo de estas células en
presencia de éster forbol induce un ciclo lítico de infección,
resultando una estimulación de la replicación viral dentro de las
células. La eficacia del compuesto en este ensayo se determinó
usando tecnología PCR TaqMan y la toxicidad del compuesto se midió
por adición de Promega's Cell Titer Aqueous One Solution (tinte
metabólico).
- 1.
- Las células P3HR-1 se cuentan por el método de exclusión de la tinción trypan azul y se determina el recuento de células/ml. Las células son pelleteadas por centrifugación y se lavan una vez con PBS para minimizar el nivel basal de virus liberado por las células no tratadas que entran espontáneamente en el ciclo lítico y liberan virus.
- 2.
- Las células se resuspenden en medio fresco y se ajustan a la densidad celular apropiada. Las células se sitúan entonces en el interior de los pocillos de placas de microtitración de 96 pocillos de fondo redondo, en un volumen de 50 \mul por pocillo.
- 3.
- El éster forbol TPA se añade a los pocillos apropiados en un volumen de 50 \mul por pocillo para rendir una concentración final de 15 ng/ml. Se añade medio en lugar de TPA en tres pocillos para guardarlos como control negativo.
- 4.
- Los compuestos de ensayo se diluyen en DMSO hasta una concentración de reserva que es 400X la concentración más alta deseada del ensayo. Estos compuestos se siguen diluyendo en medio completo en tubos de titración de 1,2 ml para rendir una disolución que es 2x la concentración más alta deseada del ensayo. Se realizan diluciones en serie semi-log de esta disolución en medio completo para rendir un total de 6 concentraciones de ensayo para cada compuesto de ensayo. Las diluciones del compuesto se añaden a los pocillos apropiados de la placa de microtitración en un volumen de 100 \mul por pocillo. Se añade medio que no contiene compuesto de ensayo a los pocillos de control del virus y control de las células. Además, 200 \mul que no contienen compuestos de ensayo se añaden a los pocillos exteriores de la placa.
- 5.
- Las placas se incuban a 37ºC en un incubador de CO_{2} humidificado hasta el día 4 después de la adición del fármaco.
- 6.
- Se realizan placas por duplicado poniendo medio en lugar de TPA para evaluar la toxicidad del compuesto.
- 1.
- Las placas de eficacia se sacan del incubador, se congelan descongelan dos veces y las muestras de lisados celulares (100 \mul) se sacan de cada pocillo y se transfieren a placas de almacenamiento de 96 pocillos.
- 2.
- Se añade pronasa a las muestras sobrenadantes hasta una concentración final de 0,75 mg/ml. Las muestras se incuban a 37ºC durante 30 minutos. Entonces se tratan las muestras con 1 unidad de DNasa por pocillo y se incuban a 37ºC durante 60 minutos. El ADN encapsidado de los viriones intactos no se afecta por este tratamiento. La DNasa se inactiva calentando las muestras hasta 95ºC durante 15 minutos.
- 3.
- Las mezclas de reacción del PCR se preparan a partir de reactivos proporcionados por el PE Applied Biosystems TaqMan PCR Reagent Kit según las indicaciones del fabricante. Los volúmenes de reacción total son de 50 \mul cada uno. La mezcla de reacción patrón se dispensa dentro de tubos ópticos de PCR en un volumen de 47 \mul. Las muestras (3 ml) se añaden a la mezcla de reacción y se mezclan a fondo.
- 4.
- Las placas de reacción se cargan dentro de un PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detector, y se inicia un ciclo de funcionamiento usando las condiciones de PCR recomendadas por el fabricante.
- 5.
- Una curva patrón preparada a partir de números conocidos de copia de ADN aislado de células P3HR-1 y amplificado va con cada placa para cuantificar el número de copias de ADN en cada muestra original. La eficacia del compuesto se determina por comparación del número de copias de ADN de los pocillos de ensayo con las de los pocillos control.
- 6.
- A cada pocillo de las placas de toxicidad se le añaden veinte microlitros de Cell Titer Aqueous One Solution (Promega). Las placas se incuban a 37ºC durante 4 horas en un incubador de CO_{2} humidificado o hasta que se produce un desarrollo suficiente del color. Las placas se leen en un lector de placas de microtitración VMax a una longitud de onda de 490/650 nm. La toxicidad del compuesto de ensayo se determina por comparación de la densidad óptica de los pocillos de ensayo con la de los pocillos control.
| Compuesto | IC_{50} (\muM) | TC_{50} (\muM) | TI | Comentarios |
| Nº 4 | 2,3 \muM | 21,8 \muM | 9,48 | Actividad significativa |
La mínima concentración de fármaco inhibidora que
reduce la replicación viral al 50% (IC_{50}) y la mínima
concentración de fármaco que inhibe el crecimiento celular al 50%
(TC_{50}) se calculan usando un programa de análisis de regresión
para ajustar curvas semilogarítmicas. Dividiendo TC_{50} por
IC_{50} se determina un índice terapéutico (TI)(selectividad) para
el compuesto nº 4.
La línea celular humana BCBL-1
está disponible a través del AIDS Referente and Reagent Program (nº
cat. 3233). Esta línea celular derivó de un linfoma basado en las
cavidades corporales infectado de forma latente con
VHH-8. El cultivo de estas células en presencia de
éster forbol induce un ciclo lítico de infección, teniendo como
resultado la liberación de partículas virales dentro medio. La
eficacia del compuesto en este ensayo propuesto se determinó usando
tecnología PCR TaqMan y la toxicidad del compuesto se midió por
adición de Promega's Cell Titer Aqueous One Solution (tinte
metabólico).
- 7.
- Las células BCBL-1 se cuentan por el método de exclusión de la tinción trypan azul y se determina el recuento de células/ml. Las células son pelleteadas por centrifugación y se lavan una vez con PBS para minimizar el nivel basal de virus liberado por las células no tratadas que entran espontáneamente en el ciclo lítico y liberan virus.
- 8.
- Las células se resuspenden en medio fresco y se ajustan a la densidad celular apropiada. Las células se sitúan entonces en el interior de los pocillos de placas de microtitración de 96 pocillos de fondo redondo, en un volumen de 50 \mul por pocillo.
- 9.
- El éster forbol TPA se añade a los pocillos apropiados en un volumen de 50 \mul por pocillo para rendir una concentración final de 15 ng/ml. Se añade medio en lugar de TPA en tres pocillos para usarlos como control negativo.
- 10.
- Los compuestos de ensayo se diluyen en DMSO hasta una concentración de reserva que es 400X la concentración más alta deseada del ensayo. Estos compuestos se siguen diluyendo en medio completo en tubos de titración de 1,2 ml para rendir una disolución que es 2x la concentración más alta deseada del ensayo. Se realizan diluciones en serie semi-log de esta disolución en medio completo para rendir un total de 6 concentraciones de ensayo para cada compuesto de ensayo. Las diluciones del compuesto se añaden a los pocillos apropiados de la placa de microtitración en un volumen de 100 \mul por pocillo. Se añade medio que no contiene compuesto de ensayo a los pocillos de control del virus y control de las células. Además, 200 \mul que no contienen compuestos de ensayo se añaden a los pocillos exteriores de la placa.
- 11.
- Las placas se incuban a 37ºC en un incubador de CO_{2} humidificado hasta el día 4 después de la adición del fármaco.
- 12.
- Se realizan placas por duplicado poniendo medio en lugar de TPA para evaluar la toxicidad del compuesto.
- 7.
- Las placas de eficacia se sacan del incubador y las muestras sobrenadantes (100 \mul) se sacan de cada pocillo y se transfieren a placas de almacenamiento de 96 pocillos.
- 8.
- Se añade pronasa a las muestras sobrenadantes hasta una concentración final de 0,75 mg/ml. Las muestras se incuban a 37ºC durante 30 minutos. Entonces se tratan las muestras con 1 unidad de DNasa por pocillo y se incuban a 37ºC durante 60 minutos para degradar el ADN que ha sido liberado por las células muertas. El ADN encapsidado de los viriones intactos no se afecta por este tratamiento. La DNasa se inactiva calentando las muestras hasta 95ºC durante 15 minutos.
- 9.
- Las mezclas de reacción del PCR se preparan a partir de reactivos proporcionados por el PE Applied Biosystems TaqMan PCR Reagent Kit según las indicaciones del fabricante. Los volúmenes de reacción total serán de 50 \mul. La mezcla de reacción patrón se dispensa dentro de tubos ópticos de PCR en un volumen de 47 \mul. Las muestras (3 \mul) se añaden a la mezcla de reacción y se mezclan a fondo.
- 10.
- Las placas de reacción se cargan dentro de un PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detector, y se inicia un ciclo de funcionamiento usando las condiciones de PCR recomendadas por el fabricante.
- 11.
- Una curva patrón preparada a partir de números conocidos de copia de ADN aislado de células BCBL-1 y amplificado va con cada placa para cuantificar el número de copias de ADN en cada muestra original. La eficacia del compuesto se determinará por comparación del número de copias de ADN de los pocillos de ensayo con las de los pocillos control.
- 12.
- A cada pocillo de las placas de toxicidad se le añadirán veinte microlitros de Cell Titer Aqueous One Solution (Promega). Las placas se incubarán a 37ºC durante 4 horas en un incubador de CO_{2} humidificado o hasta que se produce un desarrollo suficiente del color. Las placas se leerán en un lector de placas de microtitración VMax a una longitud de onda de 490/650 nm. La toxicidad del compuesto de ensayo se determinará por comparación de la densidad óptica de los pocillos de ensayo con la de los pocillos control.
| Compuesto | IC_{50} (\muM) | TC_{50} (\muM) | TI | Comentarios |
| Nº 4 | 2,3 | 78,9 | 34 | Activo |
La mínima concentración de fármaco inhibidora que
reduce la replicación viral al 50% (IC_{50}) y la mínima
concentración de fármaco que inhibe el crecimiento celular al 50%
(TC_{50}) se calculan usando un programa de análisis de regresión
para ajustar curvas semilogarítmicas. Dividiendo TC_{50} por
IC_{50} se determina un índice terapéutico (TI)(selectividad) para
el compuesto nº 4.
Las células MRC-5 (fibroblasto
pulmonar embriónico humano) (ATCC nº cat. CCL-171)
se siembran en placas de 24 pocillos usando Eagle's Minimum
Essential Medium (EMEM) suplementado con suero fetal bovino 10%
inactivado por calor (SFB), L-glutamina, piruvato
sódico, aminoácidos no esenciales, penicilina y estreptomicina.
Entonces, las placas se incuban durante la noche a 37ºC y 5% de
CO_{2}. Al día siguiente, el medio se aspira y se añaden a los
pocillos de cada placa aproximadamente 50-100 ufp
(unidades formadoras de placa) de cadena VZV ELLEN en un volumen de
200 \mul de medio de ensayo (EMEM suplementado con SBF 5%
inactivado por calor (SFB), L-glutamina, piruvato
sódico, aminoácidos no esenciales, penicilina y estreptomicina): Los
pocillos restantes de cada placa sirven como pocillos de control
celular y reciben 200 \mul de medio de ensayo sin virus. Se
permite que el virus se adsorba sobre las células durante 1 h a 37ºC
y 5% de CO_{2}. Dos diluciones de cada fármaco de ensayo se
preparan diluyéndolos en el medio de ensayo que contiene
metilcelulosa 0,5%. Después del periodo de incubación se añade 1 ml
de dilución de cada fármaco a pocillos triplicados de una placa. El
medio de ensayo (sin fármaco) que contiene metilcelulosa 0,5% se
añade a los tres pocillos de control de células y a los tres
pocillos de control de virus de cada placa. Las placas se incuban
durante 9-12 días para permitir la formación de la
placa. Entonces se aspira el medio de los pocillos y las células se
fijan y se tiñen usando metanol 20% que contiene cristal violeta.
Las placas se enumeran por inspección microscópica y los datos se
representan como porcentaje de virus control.
La toxicidad del fármaco se determina en paralelo
por sembrado de células MRC-5 en placas de 96
pocillos y añadiendo fármacos a pocillos triplicados a dos
diluciones. Después de un periodo de icubación de seis días, se
determina la viabilidad de las células usando CellTiter 96 Aqueous
One Solution (Promega).
| Compuesto | IC_{50} (\muM) | TC_{50} (\muM) | TI_{50} | Comentarios |
| Nº 4 | 4,69 | 13,61 | 2,9 | Actividad significativa |
La mínima concentración de fármaco inhibidora que
reduce la CPE al 50% (IC_{50}) y la mínima concentración de
fármaco que inhibe el crecimiento celular al 50% (TC_{50}) se
calculan usando un programa de análisis de regresión para ajustar
curvas semilogarítmicas. Dividiendo TC_{50} por IC_{50} se
determina un índice terapéutico (TI)(selectividad) para el compuesto
nº 4.
Se emplea un procedimiento de ensayo de
citoprotección usando MTS para evaluar la actividad antiviral de
compuestos frente al virus respiratorio sincitial (largo) en células
Vero (mono verde africano, ATCC nº cat. CCL-81). Las
células se pre-cultivan durante la noche a 37ºC
(2x10^{4}/pocillo en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos)
con suero fetal bovino 10% que contiene Minimum Essential Medium. El
control positivo para el ensayo es
interferona-gama/ribavirina. El medio de infección
continen niveles reducidos de suero (FBS 2%).
Usando diluciones semi-log
empezando el ensayo elevado a 100 \mug/ml, las diluciones del
fármaco se hacen y se añaden a cultivos triplicados en 0,1 ml de
volumen y también se añade suspensión de virus
pre-titrada en 0,1 ml de volumen. El control de
células que contiene medio solo, los controles de virus que
contienen medio y virus, los controles de toxicidad del fármaco que
contienen medio y concentraciones de cada fármaco van
simultáneamente con las muestras de ensayo. Las placas se incuban a
37ºC con 5% de CO_{2} hasta que se observa CPE máximo (efecto
citopatogénico) en los controles de virus sin tratar. La inhibición
del CPE se determina por el procedimiento de absorción de tinte
(Celltiter-MTS). El reactivo Celltiter contiene un
compuesto tetrazolio nuevo (MTS) un reactivo de acoplamiento
electrónico etosulfato de fenacina (PES). El
MTS-tetrazolio es bioreducido por las células a un
producto formazan coloreado que es soluble en el medio de cultivo
del tejido. Esta conversión es cumplida por el NADPH o NADH
producido por los enzimas deshidrogenasa en células activas
metabólicamente. La cantidad de formazan soluble producido por
reducción celular del MTS se mide mediante la absorbancia a 490 nm.
La cantidad de producto formazan medida por la cantidad de
absorbancia a 490 nm es directamente proporcional al número de
células vivas en el cultivo, permitiendo así el análisis
cuantitativo rápido de la inhibición de la muerte celular inducida
por virus de las sustancias de ensayo.
| Compuesto | IC_{50} (\muM) | TC_{50} (\muM) | TI | Comentarios |
| Nº 4 | 1,460 | 8,68 | 5,95 | Actividad significativa |
| Compuesto | IC_{95} (\muM) | TC_{95} (\muM) | TI | Comentarios |
| Nº 4 | 2,96 | 30,20 | 10,20 | Activo |
La mínima concentración de fármaco inhibidora que
reduce la replicación viral al 50% (IC_{50}) y la mínima
concentración de fármaco que inhibe el crecimiento celular al 50%
(TC_{50}) se calculan usando un programa de análisis de regresión
para ajustar curvas semilogarítmicas. Dividiendo TC_{50} por
IC_{50} se determina un índice terapéutico (TI)(selectividad) para
el compuesto nº 4.
La mínima concentración de fármaco inhibidora que
reduce la replicación viral al 95% (IC_{95}) y la mínima
concentración de fármaco que inhibe el crecimiento celular al 95%
(TC_{95}) se calculan usando un programa de análisis de regresión
para ajustar curvas semilogarítmicas. Dividiendo TC_{95} por
IC_{95} se determina un índice terapéutico (TI)(selectividad) para
el compuesto nº 4.
Claims (10)
1. Uso del compuesto de fórmula
(N,N'-bis(3,5-diacetilfenil)decano
diamida tetrakis
(amidinohidrazona)),
o una sal de él para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de las infecciones causadas por
cadenas de VIH-1 resistentes a los fármacos o por el
virus de la hepatitis B resistente a la lamivudina.
2. Uso según la reivindicación 1, donde la
cadena de VIH-1 es resistente a todos los fármacos
anti-VIH disponibles actualmente.
3. Uso según la reivindicación 1, donde la
cadena de VIH-1 es resistente a inhibidores de la
proteasa.
4. Uso según la reivindicación 1, donde la
cadena de VIH-1 es resistente a inhibidores de la
transcriptasa reversa no nucleosídica.
5. Uso según la reivindicación 1, donde la
cadena de VIH-1 es resistente a inhibidores de la
transcriptasa reversa nucleosídica e inhibidores de la proteasa.
6. Uso según la reivindicación 1, donde la
cadena de VIH-1 es una cadena trópica a
macrófago.
7. Uso según la reivindicación 1, donde la
cadena de VIH-1 causa Síndrome de Inmunodeficiencia
Adquirida.
8. Uso según la reivindicación 1, donde la
cadena de VHB causa inflamación crónica del hígado, cirrosis del
hígado, o cáncer de hígado.
9. Uso según la reivindicación 1, en el que el
compuesto de la fórmula dada a conocer o sales farmacéuticamente
aceptables de él se tiene que administrar a un paciente que lo
necesite preferiblemente en una dosis correspondiente a una
concentración efectiva en el rango de 0,01-10
\muM.
10. Uso según la reivindicación 1, en el que el
compuesto de la fórmula dada a conocer o sales farmacéuticamente
aceptables de él se tiene que administrar a un paciente que lo
necesite más preferiblemente en una dosis correspondiente a una
concentración efectiva en el rango de 0,1-5
\muM.
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