ES2250221T3 - Procedimiento y dispositivo par ala preparacion de oligomeros y conjuntos de oligomeros asi como el uso del dispositivo. - Google Patents

Procedimiento y dispositivo par ala preparacion de oligomeros y conjuntos de oligomeros asi como el uso del dispositivo.

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ES2250221T3 ES00984987T ES00984987T ES2250221T3 ES 2250221 T3 ES2250221 T3 ES 2250221T3 ES 00984987 T ES00984987 T ES 00984987T ES 00984987 T ES00984987 T ES 00984987T ES 2250221 T3 ES2250221 T3 ES 2250221T3
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Abstract

Dispositivo microelectromecánico para la preparación de oligómeros, caracterizado porque al menos un elemento dosificador de líquidos (1, 4, 5, 7, 8) con al menos una microcámara de reacción (13) está integrado en un chip, en el que el elemento dosificador de líquidos presenta un microelemento calentador (8) y un canal (10) que desemboca en una boquilla (11) para expulsar el líquido y en el que la microcámara de reacción (13) se acopla directamente a la boquilla (11) por su cara opuesta al canal (10).

Description

Procedimiento y dispositivo para la preparación de oligómeros y conjuntos de oligómeros así como el uso del dispositivo.
La invención se refiere a la preparación de oligómeros que se sintetizan por acoplamiento gradual de unidades monoméricas a un material de soporte sólido. Para ello es necesaria una protección intermedia de los elementos monoméricos mediante uno o varios grupos protectores adecuados, que durante el acoplamiento del elemento monomérico se transfieren al extremo de la cadena en crecimiento y de los cuales uno se ha de disociar antes del paso de acoplamiento siguiente para generar un extremo de cadena reactivo (prolongable). La cadena en crecimiento se encuentra inmovilizada en el material de soporte.
Habitualmente, para su disociación, el reactivo usado en este proceso simplemente se elimina del soporte por lavado, por ejemplo con acetonitrilo, pero los autores observaron que un paso adicional de neutralización de este reactivo en algunos casos facilita, o en otros incluso posibilita, el uso del procedimiento de síntesis descrito.
Un ejemplo del principio de síntesis descrito es la generación de oligonucleótidos según el procedimiento de amidoéster del ácido fosforoso (procedimiento de amidita) o también el procedimiento de H-fosfonato en fase sólida. El procedimiento de amidita transcurre según el esquema representado en la Fig. 1; en el procedimiento de H-fosfonato falta el paso de oxidación, que se realiza conjuntamente para todas las unidades de H-fosfonato al final de la síntesis.
Cada ciclo de síntesis comienza con la disociación de un grupo protector dimetoxitritilo (en algunos monómeros monometoxitritilo) ("destritilación"), seguida del acoplamiento del monómero siguiente, un "paso de rematado" para la eliminación de las cadenas no alargadas y, finalmente, la oxidación del fósforo. Este ciclo de síntesis está bastante optimizado y se realiza de forma rutinaria en máquinas automáticas correspondientes con unos rendimientos del acoplamiento superiores a 99% por acoplamiento.
Aún así, mediante la incorporación de un sencillo paso adicional en el ciclo de síntesis, es posible explotar nuevos campos de aplicación, por ejemplo para la preparación de oligonucleótidos, en los cuales el ciclo convencional no se puede usar en absoluto o sólo con un considerable coste técnico:
La destritilación realizada para la disociación del grupo protector se lleva a cabo normalmente mediante un ácido orgánico en un disolvente orgánico, por ejemplo ácido tricloroacético al 2% en diclorometano. Después de un cierto tiempo, por ejemplo de 1 a 2 minutos, el ácido se elimina por lavado, para el cual a menudo se requieren unos tiempos de lavado relativamente largos para eliminar el ácido, también el ácido adsorbido al material de soporte, de forma segura y por completo. Esto resulta desventajoso, especialmente en cuanto a que este ácido puede producir despurinaciones en función del tiempo de actuación. Un paso de neutralización, en cambio, detiene la acción del ácido de forma segura y en un momento exactamente definido. Para ello son adecuadas bases orgánicas como, por ejemplo, la colidina.
También se conoce ya la preparación de conjuntos de oligómeros. Entre ellos se cuentan los conjuntos de oligonucleótidos, que con frecuencia también se denominan chips de oligonucleótidos o de ADN. Por una parte, se pueden preparar sintetizando primero los oligonucleótidos con la secuencia deseada y disponiéndolos después de forma definida en un soporte adecuado o, por otra, realizando la síntesis directamente sobre el material de soporte. Puesto que al final deben encontrarse en el soporte varios oligómeros de diferentes secuencias, la síntesis directa sobre el material de soporte ha de transcurrir de forma dirigida, dirigiéndose bien el ciclo de síntesis completo o bien sólo el paso de la desprotección. Precisamente este último procedimiento resulta especialmente atractivo ya que todos los demás pasos del ciclo se pueden realizar en paralelo para todos los oligómeros. Hasta ahora se conocen para ello dos estrategias que, sin embargo, presentan considerables inconvenientes:
- El uso de grupos protectores que se pueden disociar por luz (documento US 5424186).
El inconveniente reside en este caso en que hay que desviarse del ciclo de síntesis optimizado; los rendimientos de acoplamiento que se pueden alcanzar disminuyen sensiblemente, lo que limita este procedimiento.
- El uso de máscaras que cubren zonas definidas del área de síntesis (documento DE 19706570) o, estrechamente relacionada con ello, la aplicación del ácido mediante una cabeza de presión en posiciones definidas del área de síntesis (documento US 5847105).
El inconveniente de este último procedimiento reside en que existe el riesgo de que el ácido aplicado sea arrastrado, es decir, llegue, especialmente durante la eliminación del ácido por lavado, a zonas en las que no debe haber síntesis. Por el documento US 5847105 se conoce el intento de evitar este problema usando bromuro de cinc en lugar de un ácido. Sin embargo, la destritilación se vuelve tan lenta que también durante el lavado existe una cierta probabilidad de que las zonas que no deben ser destritiladas realmente permanezcan prácticamente inalteradas. La síntesis consume de este modo mucho tiempo, la destritilación con bromuro de cinc es al menos 10 veces más lenta que una destritilación con ácido (por ejemplo, ácido tricloroacético en diclorometano).
En el documento DE 19706570 se reduce el problema del arrastre mediante el uso de máscaras que se colocan sobre el sustrato de síntesis (el soporte) dejando al descubierto únicamente las zonas que se han de tratar. En la destritilación, el ácido (o cualquier otro agente) se puede eliminar por lavado sin el riesgo de ser arrastrado, ya que las zonas que no se han de desproteger todavía pueden permanecer protegidas por la máscara. Sin embargo, el procedimiento también se vuelve muy inflexible, precisamente por la técnica de la máscara. Si en un conjunto que se ha de generar de esta manera deben modificarse una o varias secuencias, es necesario preparar nuevas máscaras que reflejen estas modificaciones, por lo que tanto el esfuerzo técnico laboral como el consumo de tiempo en este procedimiento son inmensos.
El objetivo de la presente invención es, por lo tanto, proporcionar un dispositivo mejorado junto con un procedimiento para la preparación de oligómeros y conjuntos de oligómeros.
Para lograr este objetivo se propone un procedimiento en el que se evita el arrastre del reactivo de desprotección y en el que resulta posible de manera sencilla preparar oligómeros y conjuntos de oligómeros de forma más rápida con el dispositivo de acuerdo con la invención.
El paso de neutralización que se realiza en el procedimiento de acuerdo con la invención resuelve estos problemas de manera sencilla y elegante mediante la aplicación de una base para la neutralización en las posiciones que se han de tratar una vez que el ácido haya actuado el tiempo necesario. Los productos generados no conducen a una disociación no deseada de los grupos protectores ni afectan a los pasos posteriores del ciclo de reacción. Se pueden seguir usando los procedimientos de síntesis conocidos y optimizados y, en particular, no se han de desarrollar nuevos elementos monoméricos.
En el procedimiento mostrado en esta memoria resulta innecesario realizar una modificación del hardware cuando se modifican los conjuntos que se han de preparar. Así, la desprotección dirigida se lleva a cabo en un conjunto de cámaras de reacción independientes y cerradas. Esta disposición de las cámaras de reacción refleja la disposición de los oligómeros sobre el soporte, aplicándose los reactivos usados para la disociación de los grupos protectores y para la neutralización a través de un elemento dosificador de líquidos en posiciones definidas del material de soporte. Sin embargo, puesto que el abastecimiento de cada cámara con el agente de desprotección se puede regular individualmente, este conjunto de cámaras de reacción también puede crear sobre el soporte cualquier secuencia discrecional de oligómeros. La manera en que se lleva a cabo el abastecimiento de las cámaras individuales con los reactivos es tan poco crítica como el tipo o el estado de agregación del agente de desprotección. El conjunto de cámaras de reacción también se puede considerar una máscara activa.
No obstante, este procedimiento sólo tiene sentido si el agente de desprotección se neutraliza para evitar así el arrastre.
La preparación de los conjuntos de oligómeros se realiza con un novedoso dispositivo microelectromecánico con microrreactor y sistema dosificador de líquidos integrados, en el que tanto el elemento dosificador de líquidos como la microcámara de reacción están integrados en un chip. A través del elemento dosificador de líquidos se inyectan en la microcámara de reacción los reactivos usados para la disociación de los grupos protectores y para la neutralización. Estos elementos dosificadores de líquidos están basados en el principio de "chorro de tinta" ("Ink-Jet") y sirven para expulsar e inyectar diferentes líquidos en una microcámara de reacción integrada.
Según este principio, con la ayuda de un elemento calentador se lleva, en un plazo muy corto, una cantidad muy pequeña del líquido que se ha de expulsar (por ejemplo, tinta) y que se encuentra encima del calefactor a la temperatura necesaria para el sobrecalentamiento espontáneo. De este modo se forma una burbuja de gas cuya dilatación cúbica produce la eyección de la cantidad de líquido desplazada a través de una abertura de boquilla. Los sistemas de "chorro de burbujas" ("Bubble-Jet") usados en la actualidad están diseñados en general, en cuanto a la selección de materiales y la estructura, para la impresión con tinta. En consecuencia, se limitan esencialmente a líquidos no agresivos químicamente. Estos sistemas tampoco son adecuados para aplicaciones que implican materiales biocompatibles. Por lo tanto, en aplicaciones específicas en la técnica médica, la técnica biomédica, la química o también en el sector del automóvil surge el problema de que únicamente se puede usar una estrecha gama de líquidos. Para muchas aplicaciones, como, por ejemplo, la secuenciación de ADN o el mezclado de líquidos, tampoco existe un diseño adecuado de los elementos constructivos, es decir que faltan cámaras de reacción integradas, estructuras de mezclado microfluídico, etc.. Además, debido a la elevada rugosidad de la superficie del cuerpo de la boquilla, los conjuntos no se pueden disponer de forma estanca a líquidos sobre un sustrato, dado el caso, externo.
Los aparatos de microdosificación en combinación con cámaras de reacción o sustratos en los que se produce una reacción química se usan en la actualidad principalmente en la química, la medicina y la bioquímica para la síntesis o el análisis químico paralelo y, con ello, más rápido, así como para el mezclado, dosificación, eyección o inyección de los líquidos más diversos. El sistema completo consta en este caso normalmente de un sistema dosificador de líquidos que es desplazado y controlado por elementos mecánicos convencionales y de un sustrato o recipiente sobre o en el cual tiene lugar la reacción.
En los sistemas conocidos, ninguno de los dos componentes está integrado en un chip. Los problemas que caracterizan a la mayoría de estos sistemas en cuanto a su construcción son la imposibilidad de alimentar los líquidos de forma selectiva y dirigible, la limitación determinante de la densidad de integración, la imposibilidad de dosificar cantidades de líquido del orden de pl y el elevado consumo de líquidos de reacción resultante de ello.
El concepto presentado en la presente memoria resuelve todos los problemas antes mencionados mediante la integración de varios elementos dosificadores de líquidos y una cámara de reacción, también denominada la unidad de ambos elementos actuador, en un chip de microrreacción. La tecnología usada para la fabricación del chip proviene de la microelectrónica y permite los tipos de construcción más pequeños y elevadas densidades de integración.
El chip consta en detalle de los componentes elemento dosificador de líquidos, cámara de reacción y los sustratos usados.
Los actuadores pueden estar dispuestos en un conjunto uni- o bidimensional.
En el chip fabricado en este caso a modo de ejemplo están dispuestos en cada caso 2 actuadores sobre cada cámara de reacción, de manera que se pueden expulsar dos líquidos diferentes. No obstante, también se pueden usar más elementos dosificadores de líquidos por cámara de reacción.
El chip permite dosificar cantidades mínimas de líquido, y cada unidad de dosificación se puede dirigir selectivamente.
Los elementos dosificadores de líquidos se componen de una entrada de líquido a través de la cual el líquido penetra, mediante un sistema microfluídico, en la cámara de la boquilla en la que el líquido se sobrecalienta y se expulsa a la cámara de reacción a través de una boquilla durante la expansión siguiente de la burbuja de gas. Los componentes integrales de los elementos dosificadores de líquidos, los microelementos calentadores por medio de los cuales se lleva a cabo el sobrecalentamiento del líquido y el cuerpo de la boquilla están formados por capas de diamante CVD químicamente inertes. No obstante, el cuerpo de la boquilla también puede estar elaborado con otros materiales inertes, tales como poliimida, laca fotosensible, plástico, diamante, un semiconductor, un metal o un dieléctrico (SiN, SiO_{2}). Asimismo, la superficie del elemento calentador puede estar pasivado con diferentes materiales.
El contacto eléctrico de los elementos calentadores se lleva a cabo a modo de ejemplo mediante una metalización en múltiples capas estable a altas temperaturas, formada por Si/W:Si:N/Ti/Au. No obstante, es posible igualmente usar cualquier metal que forme un contacto por resistencia con el elemento calentador. Adicionalmente también es posible cubrir el metal con la ayuda de una capa protectora.
Cada cámara de reacción posee, además de la entrada de la boquilla, un canal adicional que sirve para la compensación de la presión o para la alimentación de diferentes líquidos o gases, por ejemplo gases protectores.
El sistema microfluídico se basa en un sistema de distribución compuesto por poliimida, con capilares y depósitos colectores, a través del cual los líquidos penetran en la cámara de la boquilla. Como materiales se consideran asimismo lacas fotosensibles (resto positivo, resto negativo), polímeros, metales, dieléctricos o semiconductores. El sistema microfluídico se puede encontrar tanto en la cara anterior como en la cara posterior del sustrato de soporte mecánico.
Entre los demás componentes integrales del chip se encuentran los diferentes sustratos. Entre ellos se cuentan el sustrato de soporte mecánico, en el que se graban al agua fuerte los tubos de alimentación para los líquidos y en cuya cara anterior o posterior se encuentra el sistema microfluídico, el sustrato de la cámara de reacción, que rodea la cámara de reacción, y el sustrato de productos de reacción, que cierra la cámara de reacción por debajo. Los sustratos se pueden estructurar mediante procedimientos de grabado químico húmedo o seco.
Como material para estos sustratos o como revestimiento superficial de estos sustratos se puede usar silicio, cuarzo, vidrio, plástico, diamante, SiC o cualquier otro material. Asimismo se puede usar un sistema de múltiples capas formado por estos materiales u otro material, en el que los sustratos no tienen que constar del mismo material. Otra posibilidad consiste en sustituir tanto el sustrato de la cámara de reacción como el sustrato de productos de reacción por el sistema microfluídico antes descrito.
La reacción química transcurre sobre el sustrato de productos de reacción, que en el chip fabricado en este caso no está unido mecánicamente de forma fija sino que es desmontable. Sobre el sustrato de productos de reacción tiene lugar, en la aplicación usada en este caso, la síntesis de las cadenas de oligonucleótidos. La superficie del sustrato de productos de reacción está funcionalizada químicamente. También el cuerpo de la boquilla y el sustrato de la cámara de reacción pueden estar funcionalizados. Las zonas funcionalizadas además están estructuradas. Después de la síntesis, el sustrato de productos de reacción se puede desmontar y usar posteriormente.
Otra configuración adicional de la invención prevé que el sustrato de productos de reacción también pueda ser transparente. Esto permite el uso de aparatos analíticos con el dispositivo de acuerdo con la invención, como, por ejemplo, microscopios, cámaras CCD, fotodiodos y fototransistores. Adicionalmente, también es posible la integración directa de elementos funcionales electrónicos, tales como transistores, diodos, CCDes, fotodiodos, fototransistores, resistencias o electrodos para la medición de la impedancia o para la voltametría cíclica.
A continuación se describe la invención con más detalle mediante las figuras y ejemplos de realización preferidos.
Muestran:
La Fig. 1: el ciclo de síntesis del procedimiento de amidita con amidoéster del ácido fosforoso;
la Fig. 2: la estructuración de un dispositivo microelectromecánico de acuerdo con la invención;
la Fig. 3: la representación de la reacción de equilibrio de la destritilación en medio ácido;
la Fig. 4: la estructuración del módulo de síntesis para el acoplamiento, el rematado y la oxidación y del módulo de síntesis para la desprotección dirigida.
En la Figura 1 se representa el esquema del ciclo de síntesis del procedimiento de amidita con amidoéster del ácido fosforoso para la preparación de oligonucleótidos.
El ciclo consiste, en el paso I, en la disociación de un grupo protector di- o monometoxitritilo. Este paso se denomina destritilación. En el paso II se lleva a cabo el acoplamiento del monómero a la posición desprotegida. El paso III, denominado rematado, produce la eliminación de las cadenas no alargadas. En el paso IV final se lleva a cabo finalmente la oxidación del fósforo.
En la Figura 2 se representa la estructuración del dispositivo microelectromecánico de acuerdo con la invención.
El chip presentado en este caso resuelve los problemas antes mencionados y constituye un sistema integrado que consta de varios elementos dosificadores de líquidos (1), (4), (8), (7), (5), un sistema microfluídico (4) y una cámara de reacción (13). Además de la construcción novedosa, también se usaron materiales novedosos, tales como capas de diamante CVD para los microelementos calentadores (8), el cuerpo (5) de la boquilla y el revestimiento del sustrato (6) de la cámara de reacción y del sustrato (9) de productos de reacción. La capa de diamante para los elementos calentadores (8) se dotó in situ con boro y se estructuró por grabado químico seco (plasma Ar/O_{2}). La concentración del impurificante ascendió a aproximadamente 10^{20} cm^{-3}. De este modo se alcanzó una resistencia específica del orden de m\Omegacm. Asimismo se usó una capa de diamante CVD no dotada sobre Si como cuerpo de boquilla (5) y como revestimiento (12). Las boquillas (11) se grabaron igualmente de forma química seca. El diamante posee excelentes propiedades mecánicas, químicas y térmicas. Es totalmente inerte químicamente y muy estable mecánicamente, por lo que se pueden usar todas las sustancias químicas húmedas. No se requieren capas de pasivación contra la oxidación, los daños por cavitación o contra un ataque químico del microcalentador o también del cuerpo de la boquilla. Gracias a la reducida rugosidad de la superficie se pueden usar para la estructuración procesos litográficos convencionales de la microelectrónica.
El sustrato de soporte (2) mecánico está compuesto de silicio en el que se grabaron de forma química húmeda las entradas (1) para dos líquidos diferentes. El sustrato de soporte (2) mecánico está revestido con una capa fina (2 \mum) de SiO_{2} (3) que sirve de aislante térmico para los microelementos calentadores (8). Con la ayuda de un sistema de distribución microfluídico compuesto por poliimida, con capilares y depósitos colectores (4), los líquidos se conducen desde la entrada posterior (1) a los elementos calentadores (8) de diamante correspondientes. Los microelementos calentadores (8) sirven para sobrecalentar el líquido usado que, como consecuencia de la dilatación cúbica de las burbujas de gas, es empujado a través del cuerpo de la boquilla (5) de diamante y la boquilla (11) a la microcámara de reacción (13). Los elementos calentadores se conectan eléctricamente mediante una metalización en múltiples capas estable a altas temperaturas, formada por Si/W:Si:N/Ti/Au (7). La reacción química tiene lugar sobre el sustrato (9) de productos de reacción, que en el chip fabricado en este caso no está unido mecánicamente de forma fija sino que es desmontable. Sobre el sustrato (9) de productos de reacción transcurre, en la aplicación usada en este caso, la síntesis de las cadenas de oligonucleótidos. La superficie del sustrato (9) de productos de reacción está funcionalizada químicamente. Las zonas funcionalizadas además están estructuradas. Después de la síntesis, el sustrato se puede desmontar y usar posteriormente. Cada cámara de reacción (13) contiene un canal (10) que sirve para la compensación de la presión o para la alimentación de diferentes líquidos o gases, por ejemplo gases protectores.
En la Figura 3 se representa el equilibrio de la reacción de destritilación de un oligonucleótido inmovilizado. La reacción directa, es decir, la destritilación para obtener el oligonucleótido desprotegido, se lleva a cabo añadiendo un ácido. Durante la neutralización, por ejemplo con colidina, se forman productos de reacción que no afectan a la síntesis. Por lo tanto, la reacción inversa prácticamente carece de importancia.
En la Figura 4 se representa la estructura de las cámaras de síntesis. La cámara de síntesis consta de una pieza inferior, sobre la cual se coloca una hoja como sustrato de productos de reacción que está tensada en un bastidor, y dos piezas superiores, una de las cuales permite la desprotección dirigida/neutralización y la otra la realización de todos los demás pasos del ciclo para toda la hoja.
La pieza superior para la desprotección/ neutralización es esencialmente una placa con varias cámaras de reacción en forma de ranura que está dotada de varios elementos dosificadores de líquidos. Para la desprotección dirigida se introduce en las posiciones que se han de desproteger primero el ácido, que provoca una destritilación localmente definida, y después la base. Ambos procesos se efectúan manualmente.
La segunda placa contiene una cámara de síntesis que cubre todas las posiciones posibles y las abastece conjuntamente con los reactivos. Para cada alargamiento de cadena se han de cambiar una vez las cámaras, proceso que también se efectúa manualmente.
Ejemplo 1
Se generó la secuencia .dA_{20} en un ensamblador de genes de Pharmacia eliminando del programa el paso de destritilación y añadiendo al cartucho de síntesis con el material de soporte, en el exterior del aparato, 0,2 ml de ácido tricloroacético al 2% en diclorometano. Al cabo de 1 minuto se neutralizó con 0,5 ml de colidina al 10% en acetonitrilo, el cartucho se retiró de la solución tras un mezclado intenso, se volvió a colocar, aún húmedo, en el aparato y se continuó con el ciclo de reacción. El análisis del oligonucleótido así generado muestra que los productos de reacción de la neutralización no afectan a la síntesis y que la posible reacción inversa (Fig. 3) tiene escasa importancia.
Ejemplo 2 Síntesis manual de un conjunto de oligonucleótidos bidimensional
La síntesis se realizó sobre una hoja de polipro-
pileno^{4} funcionalizada en una cámara de síntesis especial que se puede conectar a sintetizadores comerciales. La cámara de síntesis consta de una pieza inferior, sobre la cual se coloca la hoja que está tensada en un bastidor, y dos piezas superiores, una de las cuales permite la desprotección dirigida/neutralización y la otra la realización de todos los demás pasos del ciclo para toda la hoja. El dispositivo también es adecuado para el uso de otros materiales de soporte.
La pieza superior para la desprotección/neutra-
lización es esencialmente una placa perforada; en los orificios se introduce, en las posiciones que se han de desproteger, primero el ácido, que provoca una destritilación localmente definida, y después la base. Ambos procesos se efectúan manualmente. La segunda placa contiene una cámara de síntesis que cubre todas las posiciones posibles y las abastece conjuntamente con reactivos. Para cada alargamiento de cadena se han de cambiar una vez las cámaras, proceso que también se efectúa manualmente.
Antes del primer ciclo de síntesis dirigida se realizó sobre la hoja en la cámara II un acoplamiento con un enlace amino C_{6} de manera que las secuencias generadas se pudieran disociar a voluntad para un control de calidad.
Modo de proceder general en cada alargamiento de cadena:
1. Se coloca la pieza superior I.
2. Se introduce el ácido en los orificios correspondientes a las posiciones que se han de alargar.
3. Se espera hasta que se haya completado la destritilación (30 s).
4. Se introduce la base en los orificios cargados con ácido.
5. (opcional) Se elimina el líquido de los orificios correspondientes.
6. Se retira la cámara I.
7. Se coloca la cámara II y se conecta al sintetizador.
8. El sintetizador realiza los pasos "acoplamiento de un monómero", "rematado" y "oxidación" según las instrucciones del fabricante del aparato.
Ejemplo 3 Síntesis manual de un conjunto unidimensional de oligonucleótidos
El modo de proceder corresponde al del ejemplo 2. La síntesis se realizó sobre una tira de polipropileno funcionalizada en una cámara de síntesis especial que se puede conectar a sintetizadores comerciales. La cámara de síntesis consta de una pieza inferior, sobre la cual se coloca la tira, y dos piezas superiores, una de las cuales permite la desprotección dirigida/neutralización y la otra la realización de todos los demás pasos del ciclo para toda la tira. El dispositivo también es adecuado para el uso de otros materiales de soporte.
La pieza superior para la desprotección/neutra-
lización es esencialmente una placa provista de ranuras; en las ranuras se introduce, en las posiciones que se han de desproteger, primero el ácido, que provoca una destritilación localmente definida, y después la base. Ambos procesos se efectúan manualmente. La segunda placa contiene una cámara de síntesis en forma de meandro que cubre todas las posiciones posibles y las abastece conjuntamente con reactivos (Fig. 4). Para cada alargamiento de cadena se ha de cambiar una vez las cámaras, proceso que también se efectúa manualmente.
Antes del primer ciclo de síntesis dirigida se realizó sobre la hoja en la cámara II un acoplamiento con un enlace amino C_{6} de manera que las secuencias generadas se pudieran disociar a voluntad para un control de calidad.

Claims (36)

1. Dispositivo microelectromecánico para la preparación de oligómeros, caracterizado porque al menos un elemento dosificador de líquidos (1, 4, 5, 7, 8) con al menos una microcámara de reacción (13) está integrado en un chip, en el que el elemento dosificador de líquidos presenta un microelemento calentador (8) y un canal (10) que desemboca en una boquilla (11) para expulsar el líquido y en el que la microcámara de reacción (13) se acopla directamente a la boquilla (11) por su cara opuesta al canal (10).
2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque están dispuestas varias cámaras de reacción (13) en forma de conjunto uni- o multidimensional.
3. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque cada cámara de reacción (13) posee al menos dos elementos dosificadores de líquidos (1, 4, 5, 7, 8).
4. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque cada elemento dosificador de líquidos (1, 4, 5, 7, 8) se puede dirigir selectivamente.
5. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el líquido es expulsado a la cámara de reacción (13) a través de la boquilla (11) por sobrecalentamiento del líquido y explosión siguiente de las burbujas de gas.
6. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los microelementos calentadores (8) y el cuerpo (5) de la boquilla están formados por materiales químicamente inertes.
7. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el cuerpo (5) de la boquilla también está compuesto de poliimida, laca fotosensible, plástico, diamante, un semiconductor, un metal o un dieléctrico (SiN, SiO_{2}).
8. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el microelemento calentador (8) está pasivado en la superficie con diferentes materiales.
9. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque para la metalización (7) se usa un metal cualquiera que forme un contacto por resistencia con el microelemento calentador (8).
10. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la metalización (7) está cubierta por una capa protectora.
11. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque cada cámara de reacción (13) contiene un canal (10) para la ventilación o la alimentación de líquidos adicionales o gases protectores.
12. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el sistema microfluídico (4) también está compuesto de una laca fotosensible (resto positivo, resto negativo), un polímero, una poliimida, un metal, un dieléctrico o un semiconductor.
13. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque los sustratos (2, 6, 9) están estructurados con la ayuda de procedimientos de grabado químico húmedo o seco.
14. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el sistema microfluídico (4) para los líquidos de reacción se encuentra en la cara anterior o en la cara posterior del sustrato de soporte (2) mecánico.
15. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque los sustratos (2, 6, 9) están compuestos de silicio, cuarzo, vidrio, plástico, diamante, SiC o de cualquier otro material, o de un sistema de múltiples capas formado por los materiales mencionados u otro material.
16. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el sustrato (6) de la cámara de reacción se reviste por completo o sólo parcialmente con diamante, SiC, SiO_{2}, Si_{3}N_{4}, metales, plásticos o dieléctricos.
17. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el sustrato (9) de productos de reacción se reviste por completo o sólo parcialmente con diamante, SiC, SiO_{2}, Si_{3}N_{4}, metales, plásticos o dieléctricos.
18. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque los sustratos (6, 9) se sustituyen por un sistema microfluídico análogo a (4).
19. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque la pieza del dispositivo que contiene los elementos dosificadores de líquidos y la pieza del dispositivo que contiene la cámara de reacción están configuradas de forma separable.
20. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el sustrato (9) de productos de reacción se usa para el mezclado, la síntesis o para cualquier reacción química.
21. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el sustrato (9) de productos de reacción, el cuerpo (5) de la boquilla o el sustrato (6) de la cámara de reacción se trata químicamente en la superficie (por ejemplo, se funcionaliza o remata).
22. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque el sustrato (9) de productos de reacción es transparente para disponer debajo de él aparatos analíticos como, por ejemplo, microscopios, cámaras CCD, fotodiodos, fototransistores.
23. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque en el sustrato (9) de productos de reacción están integrados elementos funcionales electrónicos, tales como transistores, diodos, CCDes, fotodiodos, fototransistores, resistencias o electrodos para la medición de la impedancia o para la voltametría cíclica.
24. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque en la cámara de reacción (13) o en los sustratos (6, 9) están integrados elementos funcionales electrónicos, tales como transistores, diodos, CCDes, fotodiodos, fototransistores, resistencias o electrodos para la medición de la impedancia o para la voltametría cícli-
ca.
25. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque la cámara de reacción (13) está configurada en forma de cavidad en un sustrato (6, 9).
26. Procedimiento para la preparación de oligómeros o conjuntos de oligómeros usando el dispositivo microelectromecánico según una de las reivindicaciones 1 a 25 mediante el acoplamiento gradual de unidades monoméricas a un material de soporte sólido, en el que la protección intermedia se lleva a cabo mediante uno o varios grupos protectores que se transfieren al extremo de la cadena en crecimiento durante el acoplamiento de la unidad monomérica y se eliminan antes del paso de acoplamiento siguiente por disociación de los grupos protectores, y después de la disociación del grupo protector se realiza un paso de neutralización adicional, introduciéndose los reactivos usados para la disociación del grupo protector y para la neutralización en cámaras de reacción (13) cerradas aisladas entre sí.
27. Procedimiento según la reivindicación 26, caracterizado porque como oligómeros se usan oligonucleótidos.
28. Procedimiento según la reivindicación 26, caracterizado porque como oligómeros se usan oligorribonucleótidos.
29. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 26 a 28, caracterizado porque se usan unidades monoméricas abiológicas.
30. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 26 a 29, caracterizado porque la disociación del grupo protector se lleva a cabo mediante un ácido, por ejemplo ácido tricloroacético.
31. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 26 a 30, caracterizado porque la base usada para la neutralización es una base orgánica, por ejemplo colidina.
32. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 26 a 31, caracterizado porque la inyección de los reactivos para la disociación de los grupos protectores y para la neutralización se lleva a cabo por medio de un elemento dosificador de líquidos (1, 4, 5, 7, 8) en una microcámara de reacción (13), estando el elemento dosificador de líquidos y la microcámara de reacción integrados en un chip.
33. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 26 a 32, caracterizado porque los reactivos usados para la disociación del grupo protector y para la neutralización se aplican por medio de un elemento dosificador de líquidos (1, 4, 5, 7, 8) en una posición definida del material de soporte.
34. Uso del dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 25 para el análisis de cadenas de ADN o de oligómeros.
35. Uso del dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 25 para el mezclado y la reacción de diferentes líquidos, incluidos los agresivos.
36. Uso del dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 1 a 25 para la dosificación y/o el mezclado de diferentes líquidos sobre un sólido, por ejemplo para el análisis o la reacción del sólido.
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