ES2249873T3

ES2249873T3 - Uso de aminoacidos o peptidos marcados con 13c o 14c como agentes de diagnostico de la funcion exocrina pancreatica.

Info

Publication number: ES2249873T3
Application number: ES99304388T
Authority: ES
Inventors: Tadashi Kohno; Isaburo Hosoi; Junko Ohshima; Kunihiko Shibata; Asuka Ito
Original assignee: Tokyo Gas Co Ltd
Current assignee: Tokyo Gas Co Ltd
Priority date: 1998-06-05
Filing date: 1999-06-04
Publication date: 2006-04-01
Anticipated expiration: 2019-06-04
Also published as: EP0966975B1; NO992727D0; JP2000053697A; NO323757B1; JP3340699B2; NO992727L; DK0966975T3; DE69927089T2; AU729896B2; CA2273549A1; AU3316899A; EP0966975A2; EP0966975A3; DE69927089D1; NZ336116A; PT966975E; CA2273549C

Abstract

SE PRESENTA UN AGENTE DE DIAGNOSTICO PARA LA FUNCION EXOCRINA PANCREATICA QUE COMPRENDE UN AMINOACIDO O UN PEPTIDO QUE CONTIENE AL MENOS UN ATOMO 13 C O 14 C, O UNA SAL FARMACOLOGICAMENTE ACEPTABLE DEL MISMO DIFERENTE DE BZ - TYR SUP,13 C-PABA. UN COMPUESTO ETIQUETADO CON 13 C O 14 C REPRESENTADO POR LA SIGUIENTE FORMULA (II): X 2 -R 2 -Y 2 -Z 1 O UNA SAL DEL MISMO, EN DONDE X 2 ES UN ATOMO DE HIDROGENO O UN GRUPO PROTECTOR, R 2 ES UN PEPTIDO DE ENTRE 2 Y 5 AMINOACIDOS, UN AMINOACIDO O UN ENLACE SIMPLE, Y 2 ES UN AMINOACIDO, Z 1 ES UN AMINOACIDO QUE OPCIONALMENTE TIENE UN GRUPO PROTECTOR, Y AL MENOS UNO DE LOS AMINOACIDOS EN R 2 , Y 2 Y Z 1 , O AL MENOS UNO DE LOS GRUPOS PROTECTORES EN X 2 Y Z 1 CUANDO LOS GRUPOS PROTECTORES CONTIENEN UN ATOMO DE CARBONO, ESTA ETIQUETADO CON SUP,13 C O 14 C.

Description

Uso de aminoácidos o péptidos marcados con ^{13}C ó ^{14}C como agentes de diagnóstico de la función exocrina pancreática.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a agentes de diagnóstico de la función exocrina pancreática, y a nuevos compuestos.

Antecedentes de la invención

Los "ensayos de la función exocrina pancreática" son útiles para el diagnóstico de enfermedades pancreáticas tales como pancreatitis crónica y aguda, y cáncer pancreático. También es útil para determinar el estado y el pronóstico de pacientes, y para controlar la medicación de preparaciones de proteasa: las descripciones generales se encuentran en Arvanitakis y Cooke, Gastroenterology, 74:932 (1978); Niederau y Grendell, Gastroenterology, 88:1973 (1985); Goldberg, Bull. Mol. Biol. Med., 15:1 (1990); Lankisch, Int. J. Pancreatology, 14:9 (1993); Bank y Chow, Gastroenterologist, 2:224 (1994); y Steer et al., Eng. J. Med., 332:1482 (1995).

Los ensayos de la función exocrina pancreática se clasifican más o menos en ensayos de intubación y ensayos sin intubación. Los ensayos de intubación implican intubar una sonda a través de la boca hasta el duodeno para recoger el jugo duodenal. Habitualmente se usa el ensayo de la secretina, en el que se administra intravenosamente secretina para estimular la secreción del jugo pancreático antes de la recogida. Este método es muy exacto puesto que las cantidades y componentes del jugo pancreático se analizan directamente y es el "patrón de oro" del ensayo de la función exocrina pancreática. Sin embargo, este método no se puede usar repetidamente, ni se puede usar para una identificación sistemática, debido a la tremenda agresión provocada en los pacientes. Sólo está disponible en un número relativamente pequeño de centros médicos, puesto que el médico debe estar muy cualificado. Además, puesto que este método requiere la colocación de la sonda fluoroscópica durante la recogida del jugo duodenal, existe el problema de la exposición a rayos X.

Por otro lado, los ensayos sin sondas son fáciles de realizar para estimar la función exocrina pancreática que no requiera intubación, en los que la cantidad segregada de compuestos producidos por enzimas exocrinas pancreáticas, o la cantidad segregada de las enzimas exocrinas pancreáticas, se miden per se. Hoy en día, se usan principalmente los cuatro métodos siguientes:

1.: El ensayo de PFD, en el que se administra un sustrato sintético, BT-PABA (ácido N-benzoil-L-tirosil-p-aminobenzoico), para quimiotripsina segregada por el páncreas, y se mide la cantidad de PABA (ácido p-aminobenzoico), un producto degradado por la quimiotripsina, excretado en la orina;

: Yamato C. et al., "Hydrolysis and Metabolism of N-benzoyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoic acid in normal and pancreatic duct-ligated animals" Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, (1978) 206/2 (468-474), da a conocer un estudio sobre la hidrólisis y metabolismo de ácido N-benzoil-L-tirosil-p-aminobenzoico (Bz-ty-PABA).

2.: Ensayo PLT, en el que se administra oralmente un sustrato sintético, FDL (dilaurato de fluoresceína), para la colesterol éster hidrolasa, una esterasa segregada por el páncreas, y se mide la cantidad del producto de degradación, fluoresceína, segregado en la orina, o su concentración en la sangre;

3.: El ensayo de quimiotripsina fecal, en el que se determina cuantitativamente la quimiotripsina en las heces; y

4.: Ensayo de elastasa fecal, en el que se determina cuantitativamente la elastasa en las heces.

Sin embargo, la sensibilidad de cualquiera de estos ensayos es demasiado baja para detectar ligeras disminuciones de la función exocrina pancreática. Por lo tanto, no se han usado tan a menudo en años recientes.

Para resolver este problema, se han buscado muchos ensayos más fáciles de la función exocrina pancreática; también se han aplicado los ensayos de respiración de ^{13}C, en los que se administra un compuesto marcado con ^{13}C y se mide el incremento de la concentración de ^{13}CO_{2} en la exhalación. Los ejemplos de tales ensayos de respiración de ^{13}C se ilustran a continuación:

1.: Ensayo de respiración de ^{13}C, en el que se administra un lípido marcado con ^{13}C, o un triglicérido mixto, que es un sustrato para lipasa: Chen et al., J. Nuclear Med., 15:1125 (1974); Watkins et al., J. Lab. Clin. Med., 90:422 (1977); Ghoos et al., Digestion, 22:239 (1981); John, SG., Gastroenterology, 83:44 (1982); Watkins et al., Gastroenterology, 82:911 (1982); Benini et al., Digestion, 29:91 (1984); Jones et al., J. Lab. Clin. Med., 105:647 (1985); Knoblach et al., Monatsschr Kinderheilkd, 136:26 (1988); Vantrappen et al., Arch. Disease in Childhood, 65:574 (1990); Kato et al., Am. J. Gastroenterol., 88:64 (1993); McClean et al., Arch. Disease in Childhood, 69:366 (1993); Jakobs et al., Eur. J. Pediatr., 156:S78 (1997); y Kalivianakis et al., Eur. J. Clin. Invest., 27:434 (1997);

2.: Ensayo de respiración de ^{13}C en el que se administra un éster de colesterol marcado con ^{13}C, que es un sustrato para la colesterol esterasa, una lipasa: Mundlos, et al., Pediatric Res., 22:257 (1987); Cole et al., Gastroenterology, 93:1372 (1987); y Mundlos et al., Gut., 31:1324 (1990);

: el documento US 4.676.974 (Hofmann et al.) enseña la determinación de la función exocrina pancreática mediante un método de ensayo de respiración en el que se ingiere en el cuerpo un éster marcado radioactivamente, tal como octanoato de colesterol, y éste es hidrolizado por las enzimas pancreáticas y oxidado a CO_{2} marcado, que se expele en la respiración.

3.: Ensayo de respiración de ^{13}C en el que se administra un almidón marcado con ^{13}C, que es un sustrato para una amilasa: Hiele et al., Gastroenterology, 96:503 (1989); Dewit et al., Pediatric Res., 32:45 (1992); y Z. Gastroenterol., 35:187 (1997); y

4.: Ensayo de respiración de ^{13}C en el que se administra una proteína de huevo enriquecida con ^{13}C, que es una proteína que tiene una concentración de ^{13}C aumentada hasta 1,4% atm, con respecto a la abundancia natural de 1,1% atm, alimentando un pollo con ^{13}C-leucina, y que es un sustrato para una proteasa: Y. Ghoos, ^{13}CO_{2}-Breath Tests átomo the laboratory "Digestion-Absorption", University Hospital Gasthuisberg, Leuven, Bélgica (1996).

Sin embargo, todos estos métodos son menos sensibles que los convencionales, y consumen tiempo. Por lo tanto, estos métodos no se han consolidado en los campos clínicos.

De este modo, es deseable desarrollar un ensayo muy sensible de la función exocrina pancreática que sea poco agresivo para el paciente y proporcione resultados exactos pronto.

Sumario de la invención

En consecuencia, un objeto de la presente invención es proporcionar un agente de diagnóstico de la función exocrina pancreática que conduzca a un ensayo muy sensible de la función exocrina pancreática, que sea poco agresivo para el paciente, y que proporcione resultados exactos pronto.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un nuevo compuesto para el ensayo de la función exocrina pancreática.

Se ha encontrado que la función exocrina pancreática se puede estimar con una gran sensibilidad administrando oralmente un compuesto peptídico marcado con ^{13}C a una rata normal y a una rata con pancreatitis crónica, y midiendo la concentración de ^{13}CO_{2} en el CO_{2} exhalado después de la administración. De este modo, se ha completado la presente invención.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un aminoácido o de un péptido que contiene al menos un átomo de ^{13}C o ^{14}C, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, distinto de Bz-Tyr-^{13}C-PABA, en la fabricación de un agente de diagnóstico de la función exocrina pancreática, en el que el agente de diagnóstico se usa en un ensayo de respiración.

En un aspecto preferido, la molécula de aminoácido contiene un átomo de ^{13}C o ^{14}C.

En un aspecto preferido, el aminoácido o péptido tiene un grupo modificador o protector, y el grupo modificador o protector contiene un átomo de ^{13}C o ^{14}C.

En un aspecto preferido, el aminoácido o péptido está representado por la siguiente fórmula (I):

(I)X_{1}-R_{1}-Y_{1}

en la que

X_{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo protector,

R_{1} es un péptido de 2 a 50 aminoácidos, un aminoácido o un enlace sencillo,

Y_{1} es un aminoácido que tiene opcionalmente un grupo protector. Preferiblemente, al menos uno de los aminoácidos en R_{1} e Y_{1}, o al menos un grupo éster en Y_{1} cuando el aminoácido en Y_{1} está protegido con el grupo éster, está marcado con ^{13}C o ^{14}C.

En un aspecto preferido, el aminoácido o péptido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es capaz de ser un sustrato de una proteasa o proteasas, de forma que es capaz de ser descarboxilado subsiguientemente para generar ^{13}CO_{2} o ^{14}CO_{2}. Preferiblemente, la proteasa o proteasas son proteasas exocrinas pancreáticas. Preferiblemente, la proteasa o proteasas exocrinas pancreáticas se seleccionan del grupo que consiste en quimiotripsina, tripsina, elastasa, y carboxipeptidasas.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, o una sal del mismo, para uso en diagnóstico en el que el compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C está representado por la siguiente fórmula (II):

(II)X_{2}-R_{2}-Y_{2}-Z_{1}

en la que

X_{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo protector,

R_{2} es un péptido de 2 a 5 aminoácidos, un aminoácido o un enlace sencillo,

Y_{2} es un aminoácido,

Z_{1} es un aminoácido que tiene opcionalmente un grupo protector, y al menos uno de los aminoácidos en R_{2}, Y_{2} y Z_{1}, o al menos uno de los grupos protectores en X_{2} y Z_{1}, cuando los grupos protectores contienen un átomo de carbono, está marcado con ^{13}C o ^{14}C,

y en el que

1) en el caso en el que X_{2} sea un grupo protector y R_{2} es un enlace sencillo,

: 1-i) cuando Z_{1} es D-Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de D-Ala,

: 1-ii) cuando Z_{1} es Ala-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 1-iii) cuando Z_{1} es Pro-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

2) en el caso en el que X_{2} sea un grupo protector y R_{2} sea un aminoácido,

: 2-i) cuando Z_{1} es D-Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de Val,

: 2-ii) cuando Z_{1} es Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 2-iii) cuando Z_{1} es Gly-OEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

3) en el caso en el que X_{2} sea un grupo protector, R_{2} sea un péptido de 2 aminoácidos, y Z_{1} sea Gln que tiene opcionalmente SEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Ala,

4) en el caso en el que X_{2} es un átomo de hidrógeno y R_{2} sea un enlace sencillo,

: 4-i) cuando Z_{1} es Pro, Y_{2} es un aminoácido distinto de Ala,

: 4-ii) cuando Z_{1} es Leu, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly, Val, Leu y Tyr,

: 4-iii) cuando Z_{1} es Phe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 4-iv) cuando Z_{1} es Gly-OEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 4-v) cuando Z_{1} es Ala-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

5) en el caso en el que X_{2} sea un átomo de hidrógeno y R_{2} sea un aminoácido,

: 5-i) cuando Z_{1} es Leu, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

: 5-ii) cuando Z_{1} es Phe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

: 5-iii) cuando Z_{1} es Gly, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 5-iv) cuando Z_{1} es Pro, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 5-v) cuando Z_{1} es Met, Y_{2} es un aminoácido distinto de Asp,

: 5-vi) cuando Z_{1} es Asn-Bzl, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

6) en el caso en el que X_{2} sea un átomo de hidrógeno y R_{2} sea un péptido de 2 aminoácidos,

: 6-i) cuando Z_{1} es Leu, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 6-ii) cuando Z_{1} es Ser, Y_{2} es un aminoácido distinto de Asp, y

7) en el caso en el que X_{2} sea un átomo de hidrógeno y R_{2} sea un péptido de 3 aminoácidos,

: 7-i) cuando Z_{1} es Leu, Y_{2} es un aminoácido distinto de Phe,

: 7-ii) cuando Z_{1} es Met, Y_{2} es un aminoácido distinto de Phe;

con la condición de que se excluyan los siguientes compuestos:

Ala-Pro, Gly-Leu, Gly-Phe, Val-Leu, Leu-Leu, Tyr-Leu, Ac-D-Ala-D-Ala, Gly-Gly-OEt, Leu-Ala-OMe, Ac-Gly-Pro-OMe, Boc-Leu-Ala-OMe, Gly-Pro-Leu, Gly-Pro-Phe, Ala-Gly-Gly, Gly-Leu-Pro, Phe-Asp-Met, Gly-Leu-Pro, Dansil-Tyr-Val-D-Ala, Cbz-Gly-Leu-Ala, Thr-Leu-Asn-Bzl, Z-Pro-Pro-Gly-OEt, Leu-Leu-Leu-Leu, Lys-Arg-Asp-Ser, Ac-Leu-Ala-Ala-Gln(NMe_{2}), Ac-Leu-Ala-Ala-Gln(NMe_{2})-SEt, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu y Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, en los que Ac es acetilo, Et es etilo, Me es metilo, Boc es t-butiloxicarbonilo, Dansil es dansilo, Cbz es carbobenciloxi, Bzl es benzoilo, Z es benciloxicarbonilo, SEt es etanotiol, y NMe_{2} es dimetilamino.

En un aspecto preferido del compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, o una sal del mismo, para uso en el segundo aspecto de la presente invención

1) en el caso en el que el X_{2} sea un grupo protector seleccionado del grupo que consiste en Dansil, Cbz, Ac y Z, y R_{2} sea un aminoácido o un péptido de 2 aminoácidos,

: 1-i) cuando Z_{1} es D-Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de Val,

: 1-ii) cuando Z_{1} es Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 1-iii) cuando Z_{1} es Gly-OEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

: 1-iv) cuando Z_{1} es Gln(NMe_{2}) o Gln(NMe_{2})-SEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Ala,

2) en el caso en el que X_{2} sea Ac o Boc, y R_{2} sea un enlace sencillo,

: 2-i) cuando Z_{1} es D-Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de D-Ala,

: 2-ii) cuando Z_{1} es Pro-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 2-iii) cuando Z_{1} es Ala-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

3) en el caso en el que X_{2} sea un átomo de hidrógeno y R_{2} sea un aminoácido o un péptido de 2 ó 3 aminoácidos,

: 3-i) cuando Z_{1} es Leu, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro, Leu y Phe,

: 3-ii) cuando Z_{1} es Phe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

: 3-iii) cuando Z_{1} es Gly, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 3-iv) cuando Z_{1} es Pro, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 3-v) cuando Z_{1} es Met, Y_{2} es un aminoácido distinto de Asp y Phe,

: 3-vi) cuando Z_{1} es Asn-Bzl, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 3-vii) cuando Z_{1} es Ser, Y_{2} es un aminoácido distinto de Asp, y

4) en el caso en el que X_{2} sea un átomo de hidrógeno y R_{2} sea un enlace sencillo

: 4-i) cuando Z_{1} es Pro, Y_{2} es un aminoácido distinto de Ala,

: 4-iii) cuando Z_{1} es Phe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 4-iv) cuando Z_{1} es Gly-OEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 4-v) cuando Z_{1} es Ala-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu.

En un aspecto preferido del compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, o una sal del mismo, para uso en el segundo aspecto de la presente invención, X_{2} se selecciona del grupo que consiste en Ac, Bz (benzoilo), Boc, Z y un átomo de hidrógeno.

En un aspecto preferido, el compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, o una sal del mismo, para uso en el segundo aspecto de la presente invención es capaz de ser un sustrato de una proteasa o proteasas de forma que sea capaz subsiguientemente de ser descarboxilada para generar ^{13}CO_{2} o ^{14}CO_{2}. Preferiblemente, la proteasa o proteasas son proteasas exocrinas pancreáticas. Preferiblemente, la proteasa o proteasas exocrinas pancreáticas se seleccionan del grupo que consiste en quimiotripsina, tripsina, elastasa, y carboxipeptidasas.

En un aspecto preferido del compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, o una sal del mismo, para uso en el segundo aspecto de la presente invención, X_{2} es un grupo protector y R_{2} es un enlace sencillo.

En un aspecto preferido, el compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, o una sal del mismo, para uso en el segundo aspecto de la presente invención

(1): al menos uno de los aminoácidos en Y_{2} y Z_{1} es Arg o Lys,

(2): al menos uno de los aminoácidos en Y_{2} y Z_{1} es un aminoácido aromático, Leu, His o Met,

(3): al menos uno de los aminoácidos en Y_{2} y Z_{1} es un aminoácido neutro y no aromático,

(4): el aminoácido en Z_{1} es un aminoácido distinto de Arg, Lys y Pro, o

(5): el aminoácido en Z_{1} es Arg o Lys.

En un aspecto preferido del compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, o una sal del mismo, para uso en el segundo aspecto de la presente invención, X_{2} se selecciona del grupo que consiste en un átomo de hidrógeno, Bz, Ac y Boc, Y_{2} se selecciona del grupo que consiste en Phe, Ala, Gly, Tyr y Arg, Z_{1} se selecciona del grupo que consiste en Leu que tiene opcionalmente un grupo protector, Ala que tiene opcionalmente un grupo protector, y Gly que tiene opcionalmente un grupo protector. Preferiblemente, Z_{1} se selecciona del grupo que consiste en Leu, Ala, Gly, Leu-OMe, Leu-OEt, Ala-OMe, Ala-OEt, Gly-OMe y Gly-OEt.

En un aspecto preferido del compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, o una sal del mismo, para uso en el segundo aspecto de la presente invención, Z_{1} es un aminoácido marcado con ^{13}C o ^{14}C que tiene opcionalmente un grupo protector.

En un aspecto preferido, el compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, o una sal del mismo, para uso en el segundo aspecto de la presente invención, se selecciona del grupo que consiste en los siguientes compuestos:

(a): Phe-^{13}C-Leu,

(b): Arg-^{13}C-Leu,

(c): Bz-Ala-^{13}C-Ala,

(d): Bz-Gly-^{13}C-Leu,

(e): Bz-Phe-^{13}C-Gly,

(f): Bz-Tyr-^{13}C-Leu,

(g): Bz-Phe-^{13}C-Leu,

(h): Bz-(DL)Phe-^{13}C-Leu,

(j): Bz-Arg-^{13}C-Leu,

(k): Ac-Phe-^{13}C-Leu,

(l): Ac-Tyr-^{13}C-Leu,

(m): Bz-Ala-^{13}C-Ala-OMe,

(n): Bz-Gly-^{13}C-Leu-OMe,

(o): Bz-Phe-^{13}C-Gly-OMe,

(p): Bz-Phe-^{13}C-Leu-OMe,

(q): Bz-(DL)Phe-^{13}C-Leu-OMe,

(r): Ac-Phe-^{13}C-Leu-OMe,

(s): Ac-Tyr-^{13}C-Leu-OMe,

(t): Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-^{13}C-Leu,

(u): Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-^{13}C-Leu, y

(v): Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-^{13}C-Gly-Phe-Leu.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, como se define en el segundo aspecto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un agente de diagnóstico de la función exocrina pancreática, en el que el agente de diagnóstico se usa en un ensayo de respiración.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, como se define en el segundo aspecto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un agente de diagnóstico de la pancreatitis crónica o de la pancreatitis aguda.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra los contenidos de quimiotripsinógeno y amilasa en el páncreas de un grupo inyectado con ácido oleico y de un grupo de control. Para el grupo inyectado con ácido oleico (\bullet), se inyectaron 50 \mul de ácido oleico en el conducto pancreático de 17 ratas Wistar macho de 5 semanas (n = 17). Para el grupo de control (\medcirc), sólo se llevó a cabo una laparotomía (n = 11). Después del tratamiento, las ratas de ambos grupos se mantuvieron durante 3 semanas. Después, se retiró el páncreas, y se determinaron los contenidos de quimiotripsinógeno y de amilasa.

La Fig. 2 muestra el transcurso de tiempo del grado de aumento de la concentración de ^{13}C en el ^{13}CO_{2} exhalado (\Delta^{13}C (\textperthousand)) después de la administración de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu)-Na. En el minuto 0, se administró oralmente Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu)-Na (250 mg/kg) a las ratas con pancreatitis crónica (líneas punteadas, n = 8) y a las ratas del control (línea continua, n = 4).

La Fig. 3 muestra la distribución de valores para las ratas con pancreatitis crónica (\bullet, n = 8) y para las ratas normales (\medcirc, n = 4) en los ensayos PFD y de respiración de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu) (^{13}C-BPL). Cada rata se sometió al ensayo de PFD antes del ensayo de respiración de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu). La sensibilidad (la relación de positivos verdaderos del ensayo a positivos verdaderos totales) se muestra debajo para cada dibujo de distribución cuando se fija un valor de corte (barra), de forma que la especificidad (la relación de negativo verdadero del ensayo a negativos verdaderos totales) es 100%.

La Fig. 4 muestra la distribución de valores para las ratas con pancreatitis crónica (\bullet, n = 8) y para las ratas normales (\medcirc, n = 7) en los ensayos PFD y de respiración de Bz-Ala-(^{13}C-Ala) (^{13}C-BAA). Cada rata se sometió al ensayo de PFD antes del ensayo de respiración de Bz-Ala(^{13}C-Ala). La sensibilidad (la relación de positivos verdaderos del ensayo a positivos verdaderos totales) se muestra debajo para cada dibujo de distribución cuando se fija un valor de corte (barra), de forma que la especificidad (la relación de negativo verdadero del ensayo a negativos verdaderos totales) es 100%.

La Fig. 5 muestra la distribución de valores para las ratas con pancreatitis crónica (\bullet, n = 10) y para las ratas normales (\medcirc, n = 10) en los ensayos PFD y de respiración de Bz-Gly-(^{13}C-Leu) (^{13}C-BGL). Cada rata se sometió al ensayo de PFD antes del ensayo de respiración de Bz-Gly-(^{13}C-Leu). La sensibilidad (la relación de positivos verdaderos del ensayo a positivos verdaderos totales) se muestra debajo para cada dibujo de distribución cuando se fija un valor de corte (barra), de forma que la especificidad (la relación de negativo verdadero del ensayo a negativos verdaderos totales) es 100%.

Descripción de la invención

En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle.

Los péptidos se indican aquí de tal manera que los términos N están a la izquierda, y los términos C están a la derecha.

Los restos de aminoácidos se muestran en abreviaturas de tres letras. Excepto que se indique de otro modo, los aminoácidos son isómeros L.

El "aminoácido" se refiere aquí a cualquier compuesto que tenga grupos carboxilo y amino en la molécula, e incluye iminoácidos tales como prolina e hidroxiprolina, y compuestos que tengan una estructura de lactama en la molécula.

El "péptido" se refiere aquí a cualquier compuesto que esté formado por la unión de al menos dos aminoácidos vía un enlace peptídico, e incluye péptidos homoméricos que consisten en aminoácidos, péptidos heteroméricos que comprenden un componente o componentes no aminoácidos, y sus derivados. El péptido tiene 100 o menos restos de aminoácidos.

El "aminoácido o péptido que contiene al menos un átomo ^{13}C o ^{14}C" se refiere aquí a cualquier aminoácido o péptido en el que al menos un átomo de carbono presente en el aminoácido, en los restos de aminoácidos del péptido, en un grupo modificador o en un grupo protector del mismo, está sustituido con un átomo ^{13}C o ^{14}C, dando como resultado en las moléculas del aminoácido o del péptido átomos enriquecidos en ^{13}C o ^{14}C con respecto a los encontrados en la naturaleza.

El agente de diagnóstico de la función exocrina pancreática según la presente invención comprende un aminoácido o un péptido que contiene al menos un átomo ^{13}C o ^{14}C, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo distinta de Bz-Tyr-^{13}C-PABA. La molécula de aminoácido puede contener un átomo ^{13}C o ^{14}C. Como alternativa, cuando el aminoácido o el péptido tiene un grupo modificador o protector, el grupo modificador o protector puede contener un átomo ^{13}C o ^{14}C.

Por ejemplo, el aminoácido o péptido se puede representar mediante la siguiente fórmula (I):

(I)X_{1}-R_{1}-Y_{1}

en la que

X_{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo protector,

Y_{1} es un aminoácido que tiene opcionalmente un grupo protector.

En la fórmula (I), X_{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo protector. El grupo protector incluye cualquier grupo protector que se use generalmente en el campo de la química orgánica, por ejemplo, los descritos en "Textbook for Biochemical Experiments 1 - Protein Chemistry IV", editado por Japan Biochemical Society, publicado por Tokyo Kagaku Dojin (1977); "Textbook for Experimental Chemistry 22 - Organic Synthesis IV", editado por Japan Chemical Society, publicado por Maruzen (1992); "Bases and Experiments of Peptide Synthesis", Nobuo Izumiya, Tetsuo Kato, Tohiko Aoyagi y Michinori Waki, publicado por Maruzen (1985); "Modification of Proteins", ed por Robert E. Feeney, John R. Whitaker, the American Chemical Society (1982); M. Bodanszky, "Principles of Peptides Synthesis", Springer-Verlag, Berlín (1984); y E. Schroder, K. Lubke, "The Peptides", Academic Press, N.Y. Vol. 1 (1965), Vol. 2 (1966). Concretamente, los ejemplos de los mismos incluyen los grupos benzoilo, acetilo, benciloxicarbonilo, benciloxicarbonilo sustituido (tal como p-nitrobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, etc.), t-butiloxicarbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo, p-toluenosulfonilo, ftalilo, formilo, trifluoroacetilo, trifenilmetilo, ciclohexiloxicarbonilo, o-nitrofenilsulfenilo, t-aciloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, difenilfosfinilo, difenilfosfinotioilo, bencilo, alquilo, aliltiocarbonilo, o-nitrofenoxiacetilo, cloroacetilo, bencenosulfonilo, dibencilfosforilo, trialquilsililo, alilideno, y acetoacetilo.

R_{1} es un péptido de 2 a 50 aminoácidos, un aminoácido o un enlace sencillo. El aminoácido incluye glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, arginina, lisina, histidina, prolina, y ornitina.

Y_{1} es un aminoácido que tiene opcionalmente un grupo protector. El grupo protector incluye cualquiera de los grupos protectores que se usan generalmente en el campo de la química orgánica, por ejemplo, los descritos en "Textbook for Biochemical Experiments 1 - Protein Chemistry IV", editado por Japan Biochemical Society, publicado por Tokyo Kagaku Dojin (1977); "Textbook for Experimental Chemistry 22 - Organic Synthesis IV", editado por Japan Chemical Society, publicado por Maruzen (1992); "Bases and Experiments of Peptide Synthesis", Nobuo Izumiya, Tetsuo Kato, Tohio Aoyagi y Michinori Waki, publicado por Maruzen (1985); "Modification of Proteins", ed por Robert E. Feeney, John R. Whitaker, the American Chemical Society (1982); M. Bodanszky, "Principles of Peptides Synthesis", Springer-Verlag, Berlín (1984); y E. Schroder, K. Lubke, "The Peptides", Academic Press, N.Y. Vol. 1 (1965), Vol. 2 (1966). Concretamente, los ejemplos de los mismos incluyen los grupos éster metílico, éster etílico, éster bencílico, éster t-butílico y éster p-nitrobencílico, y grupos hidrazida N'-sustituidos, para proteger grupos carboxílicos; grupos benciloxicarbonilo, p-toluenosulfonilo y 2-clorobenciloxicarbonilo para proteger el grupo \omega-amino en los restos de lisina y de ornitina; grupos nitro, metoxibenciloxicarbonilo y p-toluenosulfonilo para proteger el grupo guanidino en el resto de arginina; grupos bencilo y t-butilo para proteger el grupo hidroxilo en los restos de aminoácidos que contienen un grupo hidroxilo, tal como los restos de serina y de tirosina; grupos benciloxicarbonilo y benciloximetilo para proteger el grupo imidazol en el resto de histidina; grupos bencilo y tritilo para proteger el grupo mercapto en el resto de cisteína; grupo sulfóxido para proteger el grupo tioéter en el resto de metionina; y grupo formilo para proteger el grupo indol en el resto de triptófano. El aminoácido incluye glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, arginina, lisina, histidina, prolina, y ornitina.

Los aminoácidos representados por R_{1} e Y_{1}, y los péptidos representados por R_{1}, se pueden modificar de diversas maneras. Tal modificación incluye la guanidilación, succinilación y acetilación de grupos amino; la modificación del grupo guanidino en la arginina con un compuesto dicarbonílico; la esterificación de grupos carboxílicos; la sulfenilsulfonación y la alquilación del grupo tiol en cisteína; la etoxicarbonilación del grupo imidazol en histidina; la formación de sales de sulfonio de la metionina; la acetilación de serina y de treonina; la nitración y la yodación de tirosina; y la nitrofenilsulfonilación de triptófano.

Al menos uno de los aminoácidos en R_{1}, o al menos un grupo éster en Y cuando el aminoácido en Y está protegido con el grupo éster, puede estar marcado con ^{13}C o ^{14}C. Preferiblemente, los restos de aminoácido sobre los que reaccionan las proteasas exocrinas pancreáticas están marcados con ^{13}C o ^{14}C. La expresión "marcado con ^{13}C o ^{14}C", usada aquí, significa que una molécula está marcada introduciendo en ella ^{13}C o ^{14}C, e incluye la sustitución de un carbono constitutivo de una molécula por ^{13}C o ^{14}C, o la unión covalente de una molécula a un grupo atómico o molécula que contenga ^{13}C o ^{14}C.

La presente invención también engloba un compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C representado mediante la siguiente fórmula (II):

(II)X_{2}-R_{2}-Y_{2}-Z_{1}

o una sal del mismo, para uso en diagnóstico

en la que

X_{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo protector,

Y_{2} es un aminoácido,

Z_{1} es un aminoácido que tiene opcionalmente un grupo protector, y

al menos uno de los aminoácidos en R_{2}, Y_{2} y Z_{1}, o al menos uno de los grupos protectores en X_{2} y Z_{1}, cuando los grupos protectores contienen un átomo de carbono, está marcado con ^{13}C o ^{14}C,

con la condición de que se excluyan los siguientes compuestos:

Ala-Pro, Gly-Leu, Gly-Phe, Val-Leu, Leu-Leu, Tyr-Leu, Ac-D-Ala-D-Ala, Gly-Gly-OEt, Leu-Ala-OMe, Ac-Gly-Pro-OMe, Boc-Leu-Ala-OMe, Gly-Pro-Leu, Gly-Pro-Phe, Ala-Gly-Gly, Gly-Leu-Pro, Phe-Asp-Met, Gly-Leu-Pro, Dansil-Tyr-Val-D-Ala, Cbz-Gly-Leu-Ala, Thr-Leu-Asn-Bzl, Z-Pro-Pro-Gly-OEt, Leu-Leu-Leu-Leu, Lys-Arg-Asp-Ser, Ac-Leu-Ala-Ala-Gln(NMe_{2}), Ac-Leu-Ala-Ala-Gln(NMe_{2})-SEt, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu y Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, en los que Ac es acetilo, Et es etilo, Me es metilo, Boc es t-butiloxicarbonilo, Cbz es carbobenciloxi, Bzl es benzoilo, Z es benciloxicarbonilo, SEt es etanotiol, y NMe_{2} es dimetilamino.

En la fórmula (I), X_{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo protector. El grupo protector incluye cualquier grupo protector que se use generalmente en el campo de la química orgánica, por ejemplo, los descritos en "Textbook for Biochemical Experiments 1 - Protein Chemistry IV", editado por Japan Biochemical Society, publicado por Tokyo Kagaku Dojin (1977); "Textbook for Experimental Chemistry 22 - Organic Synthesis IV", editado por Japan Chemical Society, publicado por Maruzen (1992); "Bases and Experiments of Peptide Synthesis", Nobuo Izumiya, Tetsuo Kato, Tohiko Aoyagi y Michinori Waki, publicado por Maruzen (1985); "Modification of Proteins", ed por Robert E. Feeney, John R. Whitaker, the American Chemical Society (1982); M. Bodanszky, "Principles of Peptides Synthesis", Springer-Verlag, Berlín (1984); y E. Schroder, K. Lubke, "The Peptides", Academic Press, N.Y. Vol. 1 (1965), Vol. 2 (1966). Concretamente, los ejemplos de los mismos incluyen los grupos benzoilo, acetilo, benciloxicarbonilo, benciloxicarbonilo sustituido (tal como p-nitrobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, etc.), t-butiloxicarbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo, p-toluenosulfonilo, ftalilo, formilo, trifluoroacetilo, trifenilmetilo, ciclohexiloxicarbonilo, o-nitrofenilsulfenilo, t-aciloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, difenilfosfinilo, difenilfosfinotioilo, bencilo, alquilo, aliltiocarbonilo, o-nitrofenoxiacetilo, cloroacetilo, bencenosulfonilo, dibencilfosforilo, trialquilsililo, alilideno, y acetoacetilo.

R_{2} es un péptido de 2 a 5 aminoácidos, un aminoácido o un enlace sencillo. El aminoácido incluye glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, arginina, lisina, histidina, prolina, y ornitina.

Y_{2} es un aminoácido, y el aminoácido incluye glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, arginina, lisina, histidina, prolina, y ornitina.

Z_{1} es un aminoácido que tiene opcionalmente un grupo protector. El grupo protector incluye cualquiera de los grupos protectores que se usan generalmente en el campo de la química orgánica, por ejemplo, los descritos en "Textbook for Biochemical Experiments 1 - Protein Chemistry IV", editado por Japan Biochemical Society, publicado por Tokyo Kagaku Dojin (1977); "Textbook for Experimental Chemistry 22 - Organic Synthesis IV", editado por Japan Chemical Society, publicado por Maruzen (1992); "Bases and Experiments of Peptide Synthesis", Nobuo Izumiya, Tetsuo Kato, Tohiko Aoyagi y Michinori Waki, publicado por Maruzen (1985); "Modification of Proteins", ed por Robert E. Feeney, John R. Whitaker, the American Chemical Society (1982); M. Bodanszky, "Principles of Peptides Synthesis", Springer-Verlag, Berlín (1984); y E. Schroder, K. Lubke, "The Peptides", Academic Press, N.Y. Vol. 1 (1965), Vol. 2 (1966). Concretamente, los ejemplos de los mismos incluyen los grupos éster metílico, éster etílico, éster bencílico, éster t-butílico y éster p-nitrobencílico, y grupos hidrazida N'-sustituidos, para proteger grupos carboxílicos; grupos benciloxicarbonilo, p-toluenosulfonilo y 2-clorobenciloxicarbonilo para proteger el grupo \omega-amino en los restos de lisina y de ornitina; grupos nitro, metoxibenciloxicarbonilo y p-toluenosulfonilo para proteger el grupo guanidino en el resto de arginina; grupos bencilo y t-butilo para proteger el grupo hidroxilo en los restos de aminoácidos que contienen un grupo hidroxilo, tal como los restos de serina y de tirosina; grupos benciloxicarbonilo y benciloximetilo para proteger el grupo imidazol en el resto de histidina; grupos bencilo y tritilo para proteger el grupo mercapto en el resto de cisteína; grupo sulfóxido para proteger el grupo tioéter en el resto de metionina; y grupo formilo para proteger el grupo indol en el resto de triptófano. El aminoácido incluye glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, arginina, lisina, histidina, prolina, y ornitina.

Los aminoácidos representados por R_{2}, Y_{2} y Z_{1}, y los péptidos representados por R_{2}, se pueden modificar de diversas maneras. Tal modificación incluye la guanidilación, succinilación y acetilación de grupos amino; la modificación del grupo guanidino en la arginina con un compuesto dicarbonílico; la esterificación de grupos carboxílicos; la sulfenilsulfonación y la alquilación del grupo tiol en cisteína; la etoxicarbonilación del grupo imidazol en histidina; la formación de sales de sulfonio de la metionina; la acetilación de serina y de treonina; la nitración y la yodación de tirosina; y la nitrofenilsulfonilación de triptófano.

Al menos uno de los aminoácidos en R_{2}, Y_{2} y Z_{1}, o al menos uno de los grupos protectores en X_{2} y Z_{1} cuando los grupos protectores contienen un átomo de carbono, está marcado con ^{13}C o ^{14}C.

Preferiblemente, Z_{1} es un aminoácido marcado con ^{13}C o ^{14}C que tiene opcionalmente un grupo protector.

En una realización de la presente invención, el compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, o una sal del mismo, puede ser según lo siguiente:

: 1-i) cuando Z_{1} es D-Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de D-Ala,

: 1-ii) cuando Z_{1} es Ala-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 1-iii) cuando Z_{1} es Pro-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 2-i) cuando Z_{1} es D-Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de Val,

: 2-ii) cuando Z_{1} es Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 2-iii) cuando Z_{1} es Gly-OEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

: 4-i) cuando Z_{1} es Pro, Y_{2} es un aminoácido distinto de Ala,

: 4-iii) cuando Z_{1} es Phe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 4-iv) cuando Z_{1} es Gly-OEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 4-v) cuando Z_{1} es Ala-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 5-i) cuando Z_{1} es Leu, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

: 5-ii) cuando Z_{1} es Phe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

: 5-iii) cuando Z_{1} es Gly, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 5-iv) cuando Z_{1} es Pro, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 5-v) cuando Z_{1} es Met, Y_{2} es un aminoácido distinto de Asp,

: 5-vi) cuando Z_{1} es Asn-Bzl, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 6-i) cuando Z_{1} es Leu, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 6-ii) cuando Z_{1} es Ser, Y_{2} es un aminoácido distinto de Asp, y

: 7-i) cuando Z_{1} es Leu, Y_{2} es un aminoácido distinto de Phe,

: 7-ii) cuando Z_{1} es Met, Y_{2} es un aminoácido distinto de Phe;

En otra realización de la presente invención, el compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, o una sal del mismo, puede ser según lo siguiente:

1) en el caso en el que el X_{2} sea un grupo protector seleccionado del grupo que consiste en Dansilo, Cbz, Ac y Z, y R_{2} sea un aminoácido o un péptido de 2 aminoácidos,

: 1-i) cuando Z_{1} es D-Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de Val,

: 1-ii) cuando Z_{1} es Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 1-iii) cuando Z_{1} es Gly-OEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

2) en el caso en el que X_{2} sea Ac o Boc, y R_{2} sea un enlace sencillo,

: 2-i) cuando Z_{1} es D-Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de D-Ala,

: 2-ii) cuando Z_{1} es Pro-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 2-iii) cuando Z_{1} es Ala-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 3-ii) cuando Z_{1} es Phe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

: 3-iii) cuando Z_{1} es Gly, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 3-iv) cuando Z_{1} es Pro, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 3-v) cuando Z_{1} es Met, Y_{2} es un aminoácido distinto de Asp y Phe,

: 3-vi) cuando Z_{1} es Asn-Bzl, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 3-vii) cuando Z_{1} es Ser, Y_{2} es un aminoácido distinto de Asp, y

: 4-i) cuando Z_{1} es Pro, Y_{2} es un aminoácido distinto de Ala,

: 4-iii) cuando Z_{1} es Phe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 4-iv) cuando Z_{1} es Gly-OEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 4-v) cuando Z_{1} es Ala-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu.

En la fórmula (II), se prefiere que X_{2} se seleccione del grupo que consiste en Ac, Bz (benzoilo), Boc, Z y un átomo de hidrógeno.

También, en la fórmula (II), se prefiere que X_{2} sea un grupo protector y R_{2} sea un enlace sencillo.

En una realización preferida de la presente invención,

(1): al menos uno de los aminoácidos en Y_{2} y Z_{1} es Arg o Lys (este es un sustrato adecuado para tripsina),

(2): al menos uno de los aminoácidos en Y_{2} y Z_{1} es un aminoácido aromático, Leu, His o Met (este es un sustrato adecuado para quimiotripsina),

(3): al menos uno de los aminoácidos en Y_{2} y Z_{1} es un aminoácido neutro y no aromático (este es un sustrato adecuado para elastasa),

(4): el aminoácido en Z_{1} es un aminoácido distinto de Arg, Lys y Pro (este es un sustrato adecuado para carboxipeptidasa A), o

(5): el aminoácido en Z_{1} es Arg o Lys (este es un sustrato adecuado para carboxipeptidasa B).

En una realización más preferida de la presente invención, X_{2} se selecciona del grupo que consiste en un átomo de hidrógeno, Bz, Ac y Boc, Y_{2} se selecciona del grupo que consiste en Phe, Ala, Gly, Tyr y Arg, Z_{1} se selecciona del grupo que consiste en Leu que tiene opcionalmente un grupo protector, Ala que tiene opcionalmente un grupo protector, y Gly que tiene opcionalmente un grupo protector, por ejemplo, el grupo que consiste en Leu, Ala, Gly, Leu-OMe, Leu-OEt, Ala-OMe, Ala-OEt, Gly-OMe y Gly-OEt, y más específicamente el grupo que consiste en ^{13}C o ^{14}C-Leu, ^{13}C o ^{14}C-Ala, ^{13}C o ^{14}C-Gly, ^{13}C o ^{14}C-Leu-OMe, ^{13}C o ^{14}C-Leu-OEt, ^{13}C o ^{14}C-Ala-OMe, ^{13}C o ^{14}C-Ala-OEt, ^{13}C o ^{14}C-Gly-OMe y ^{13}C o ^{14}C-Gly-OEt.

En una realización aún más preferida de la presente invención, el compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C representado por la fórmula (II), o una sal del mismo, se selecciona del grupo que consiste en los siguientes compuestos:

(a): Phe-^{13}C-Leu,

(b): Arg-^{13}C-Leu,

(c): Bz-Ala-^{13}C-Ala,

(d): Bz-Gly-^{13}C-Leu,

(e): Bz-Phe-^{13}C-Gly,

(f): Bz-Tyr-^{13}C-Leu,

(g): Bz-Phe-^{13}C-Leu,

(h): Bz-(DL)Phe-^{13}C-Leu,

(j): Bz-Arg-^{13}C-Leu,

(k): Ac-Phe-^{13}C-Leu,

(l): Ac-Tyr-^{13}C-Leu,

(m): Bz-Ala-^{13}C-Ala-OMe,

(n): Bz-Gly-^{13}C-Leu-OMe,

(o): Bz-Phe-^{13}C-Gly-OMe,

(p): Bz-Phe-^{13}C-Leu-OMe,

(q): Bz-(DL)Phe-^{13}C-Leu-OMe,

(r): Ac-Phe-^{13}C-Leu-OMe,

(s): Ac-Tyr-^{13}C-Leu-OMe,

(t): Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-^{13}C-Leu,

(u): Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-^{13}C-Leu, y

(v): Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-^{13}C-Gly-Phe-Leu.

Los compuestos marcados con ^{13}C o ^{14}C, representados por la fórmula (I) anterior, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y los compuestos marcados con ^{13}C o ^{14}C representados por la fórmula (II) anterior, y sus sales, se pueden absorber a través del tubo digestivo después de la reacción de una proteasa o proteasas, y se pueden descarboxilar mediante acción metabólica para generar ^{13}CO_{2} o ^{14}CO_{2}. La proteasa o proteasas pueden ser proteasas exocrinas pancreáticas que incluyen quimiotripsina, tripsina, elastasa, y carboxipeptidasas representadas por carboxipeptidasa A y B.

La quimiotripsina rompe específicamente el enlace peptídico terminal carboxílico de un resto de tirosina, triptófano, fenilalanina, leucina, histidina o metionina, y también actúa sobre ésteres y amidas que contienen estos restos.

La tripsina cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos en el término carboxílico de un resto de arginina, un resto de lisina, y un resto de S-aminoetilcisteína producido por reacciones artificiales. Además, los productos químicos sintéticos que contienen un enlace (alil)amida o éster en lugar del enlace peptídico pueden ser sustratos para la tripsina en tanto que deriven de los tres aminoácidos.

La elastasa hidroliza el enlace peptídico en el término carboxílico de los restos de alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina y metionina, que son aminoácidos no aromáticos no cargados. Se sabe que la succinil-(alanil)3-p-nitroanilida puede ser un sustrato artificial para ella.

La carboxipeptidasa B tiene una acción para romper secuencialmente, a partir del término carboxílico, aminoácidos básicos tales como arginina y lisina.

La carboxipeptidasa A tiene una acción para romper secuencialmente, a partir del término carboxílico, aminoácidos hidrófobos aromáticos tales como tirosina, fenilalanina, triptófano, leucina, isoleucina, treonina, glutamina, histidina, alanina, valina, asparagina, serina, lisina, glicina, ácido aspártico y ácido glutámico.

Teniendo en cuenta tales especificidades de las proteasas por los sustratos según lo descrito anteriormente, se pueden diseñar compuestos marcados con ^{13}C o ^{14}C, o sales de los mismos, adecuados para uso en agentes de diagnóstico de la función exocrina pancreática.

Los compuestos marcados con ^{13}C o ^{14}C se pueden sintetizar de manera conocida usando aminoácidos comercialmente disponibles. Por ejemplo, se pueden usar los métodos descritos en "Textbook for Experimental Chemistry 22 - Organic Synthesis IV", editado por Japan Chemical Society, publicado por Maruzen (1992). Más abajo se describirá un ejemplo ilustrativo de los mismos.

Un aminoácido marcado con ^{13}C se disuelve en cloruro de hidrógeno/metanol y se pone a reflujo. El éster metílico resultante se suspende en diclorometano, y entonces se añade gota a gota trietilamina mientras se enfría con hielo y se agita. Además, se añaden un N-benzoil-aminoácido, 1-hidroxi-1H-benzotriazol\cdotH_{2}O (HOBt), y diclorometano. Después, se añade una disolución de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida-HCl (WSC), disuelta en diclorometano, y la mezcla se agita. Tras la concentración, la mezcla de reacción se extrae con acetato de etilo, se lava con HCl 1 N, con NaHCO_{3} al 5%, y con agua, se seca sobre sulfato de magnesio, y se evapora hasta sequedad, o se saponifica posteriormente, para producir el compuesto deseado marcado con ^{13}C representado por la fór-
mula (I).

Los compuestos marcados con ^{13}C o ^{14}C se pueden obtener en forma de una sal. Las sales pueden incluir aquellas con ácidos inorgánicos tales como ácidos clorhídrico, sulfúrico, nítrico y fosfórico; con ácidos orgánicos tales como ácidos fórmico, acético, propiónico, glicólico, succínico, málico, tartárico, cítrico y trifloroacético; con metales alcalinos tales como sodio y potasio; con metales alcalino-térreos tales como calcio; y con aminas orgánicas tales como amonio, etanolamina, trietilamina y diciclohexilamina.

El ensayo que usa los agentes para la función exocrina pancreática según la presente invención se puede llevar a cabo administrando a un paciente el compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, representado mediante la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Es posible un ensayo en el que se mida la concentración del compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C en el suero, la orina o las heces, después de la administración; sin embargo, es deseable un ensayo de respiración en el que se mida un aumento de la concentración de ^{13}C o ^{14}C en el CO_{2} exhalado, después de la administración. Cuando se administra a un paciente el compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C representado mediante la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se puede hacer ingerir al paciente una comida de ensayo, o similar, para inducir la secreción de enzimas pancreáticas. También, se pueden combinar para uso dos o más compuestos marcados con ^{13}C o ^{14}C representados mediante la fórmula (I), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En concreto, en los casos de ^{13}C, la concentración de ^{13}C se determina en el CO_{2} exhalado después de la administración, a continuación se diagnostica la función exocrina pancreática a partir de los datos del grado de incremento (\Delta^{13}C (\textperthousand)) de la concentración de ^{13}C en el ^{13}CO_{2} exhalado, a tiempos predeterminados (por ejemplo, 5, 10 y 15 minutos) después de la administración, o a partir de los datos asociados con el transcurso del tiempo (pendiente de comienzo, cambio en la pendiente, tiempo pico, etc.), en el grado de incremento (\Delta^{13}C (\textperthousand)) de la concentración de ^{13}C en el ^{13}CO_{2} exhalado durante un período de tiempo predeterminado después de la administración. En los casos de ^{14}C, la concentración de ^{14}C, es decir, la radioactividad, se determina en el CO_{2} exhalado después de la administración; y la función exocrina pancreática se diagnostica a partir de los datos de la cantidad de radioactividad en el ^{13}CO_{2} exhalado, a tiempos predeterminados (por ejemplo, 5, 10 y 15 minutos) después de la administración, o a partir de los datos asociados con el transcurso del tiempo (pendiente de comienzo, cambio en la pendiente, tiempo pico, etc.) en el incremento de la tasa de radioactividad en el ^{13}CO_{2} exhalado durante un período predeterminado después de la administración. Estos métodos de ensayo utilizan el fenómeno de que, cuando se administra a un paciente el compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C representado mediante la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el compuesto es absorbido a través del tubo digestivo después de la reacción de una proteasa o proteasas, y se descarboxila mediante acción metabólica en el organismo para generar ^{13}CO_{2} o
^{14}CO_{2}.

La concentración de ^{13}C en el ^{13}CO_{2} exhalado se puede determinar mediante espectrometría de masas-cromatografía de gases (GC-MS), espectroscopía infrarroja, espectrometría de masas, espectroscopía acústica fotoeléctrica, RMN (resonancia magnética nuclear), y otros métodos.

La concentración de ^{14}C, o la radioactividad en el CO_{2} exhalado, se puede medir a partir de la respiración de un paciente, directamente o después de atrapar el CO_{2} en un disolvente, con un contador GM, un contador de centelleo de líquidos, un contador de centelleo de sólidos, autorradiografía, una cámara de ionización, o similar.

El agente de diagnóstico de la función exocrina pancreática según la presente invención se puede formular a partir del compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C representado mediante la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o en combinación con un excipiente o vehículo en una preparación oral tal como un comprimido, una cápsula, un polvo, un gránulo, un líquido, etc. El excipiente o vehículo puede ser cualquiera farmacéuticamente aceptable usado normalmente en este campo, y su naturaleza y composición se pueden escoger apropiadamente. Por ejemplo, se puede usar el agua como vehículo líquido. Los vehículos sólidos incluyen derivados de celulosa tales como hidroxipropilcelulosa, y sales de ácidos orgánicos tales como estearato de magnesio. También, se pueden usar preparaciones liofilizadas.

El compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C representado mediante la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está contenido en el agente en cantidades variables dependiendo de la naturaleza del agente, pero generalmente está en una cantidad de 1 a 100% en peso, preferiblemente 50 a 100% en peso. En una cápsula, comprimido, gránulo o preparación en polvo, el compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C representado mediante la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está contenido en la preparación en una cantidad de alrededor de 10 a 100% en peso, preferiblemente 50 a 100% en peso, siendo el resto un vehículo.

La dosis del agente de diagnóstico de la función exocrina pancreática según la presente invención debe ser suficiente para determinar o confirmar un incremento de ^{13}CO_{2} o ^{14}CO_{2} en la respiración después de la administración. Variará dependiendo de la edad y del peso corporal del paciente, y del fin del ensayo. Por ejemplo, la dosis unitaria puede ser alrededor de 1 a 1000 mg/kg de peso corporal para un adulto.

Ejemplos

A continuación, la presente invención se ilustra con más detalle mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Preparación de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu)-OMe

Después de que se disolvió 1 g de 1-^{13}C-L-leucina (Masstrace) en cloruro de hidrógeno/metanol y de que se puso a reflujo, el éster metílico de ^{13}C-L-leucina resultante se suspendió en 50 ml de diclorometano, y se añadieron gota a gota 1,08 ml de trietilamina con enfriamiento en hielo y con agitación. Después, se añadieron 2,0 g de N-benzoil-DL-fenilalanina, 2,34 g de HOBt (1-hidroxi-1H-benzotriazol\cdotH_{2}O), y 50 ml de diclorometano. Después, se añadió una disolución de 1,49 g de WSC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida-HCl) disuelta en 100 ml de diclorometano, y se agitó durante 1 hora mientras se enfría con hielo, y después se deja toda la noche a temperatura ambiente. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). La mezcla de reacción se concentró, se extrajo con acetato de etilo, se lavó con HCl 1 N, con NaHCO_{3} al 5%, y con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 2,32 g de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu)-OMe.

Ejemplo 2 Preparación de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu) y su sal sódica (Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu)-Na)

Después de que se disolvieron 2,32 g de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu)-OMe en 100 ml de metanol, se añadieron gota a gota 6,4 ml de NaOH 1 N con enfriamiento en hielo y con agitación, seguido de calentamiento y agitación a 70ºC durante 2,5 horas. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). Después de que la reacción estuvo terminada, la mezcla de reacción se neutralizó con HCl 1 N, se concentró y se disolvió en NaHCO_{3} al 5%. Después de lavar con acetato de etilo, y con NaHCO_{3} al 5%, se acidificó con HCl 1 N. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 1,93 g de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu), que entonces se recristalizó con acetato de etilo.

La estructura y la posición marcada con ^{13}C se confirmaron mediante RMN ^{13}C y espectrometría de masas.

RMN^{13}C (metanol-d4, 300 MHz): 175,8 ppm (^{13}COOH)

Espectrometría de masas (m/z): 383 (M^{+}), 365, 224, 131, 105, 77

LC-MS (m/z): 384 (M^{+}+H), 252, 224, 105

La sal sódica de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu) se obtuvo neutralizando Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu) con un equivalente de carbonato sódico 1 M, seguido de la liofilización.

Ejemplo 3 Degradación de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu) por quimiotripsina

Se hizo reaccionar Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu) con quimiotripsina, y el producto de la degradación, leucina, generado con la acción de la quimiotripsina, se determinó cuantitativamente mediante la reacción de la ninhidrina. La reacción se llevó a cabo en 20 mM de HEPPS-Na (pH 8,0), 23 mM de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu), 0,16 mg/ml de quimiotripsina (procedente de páncreas bovino, Worthington Biochemical Corporation, \alm{1}1432, Lote 37A906), a 37ºC durante 15 minutos. Después de la reacción, se añadieron a 100 \mul de la mezcla de reacción 50 \mul de tampón de citrato (ácido cítrico monohidratado), 20 \mul de disolución de ninhidina (disolución de 50 mg/ml en metilcellosolve) y 100 \mul de disolución de KCN (disolución 0,01 M acuosa de KCN diluida 50 veces con metilcellosolve), y se calentó a 100ºC durante 15 minutos. Después de enfriar la mezcla de la reacción de la ninhidrina hasta la temperatura ambiente, se añadieron 150 \mul de etanol al 60% (v/v) a 100 \mul de la mezcla de la reacción de la ninhidrina, y se agitó, seguido de la determinación de una absorbancia a una longitud de onda de 570 nm. Como "blanco" se tomó un experimento en el que todas las reacciones se llevaron a cabo sin añadir Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu), y como patrón se usó la leucina.

El compuesto Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu) se degradó con la reacción con quimiotripsina para producir leucina. La tasa de degradación fue 1,72 nmoles/mg de quimiotripsina/minuto. A partir de estos resultados, se confirmó que Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu) podría ser un sustrato para quimiotripsina.

Ejemplo 4 Preparación de Bz-Ala-(^{13}C-Ala)-OMe

Después de que se disolvieron 2 g de 1-^{13}C-L-alamina (Masstrace) en cloruro de hidrógeno/metanol y de que se puso a reflujo, el éster metílico de ^{13}C-L-alamina resultante se suspendió en 100 ml de diclorometano, y se añadieron gota a gota 4,0 ml de trietilamina con enfriamiento en hielo y con agitación. Después, se añadieron 5,6 g de N-benzoil-L-alanina, 8,9 g de HOBt, y 100 ml de diclorometano. Después, se añadió una disolución de 5,6 g de WSC disuelta en 100 ml de diclorometano, y se agitó durante 1 hora mientras se enfría con hielo, y después se deja toda la noche a temperatura ambiente. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). La mezcla de reacción se concentró, se extrajo con acetato de etilo, se lavó con HCl 1 N, con NaHCO_{3} al 5%, y con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 4,38 g de Bz-Ala-(^{13}C-Ala)-OMe.

Ejemplo 5 Preparación de Bz-Ala-(^{13}C-Ala) y su sal sódica

Después de que se disolvieron 4,38 g de Bz-Ala-(^{13}C-Ala)-OMe en 100 ml de metanol, se añadieron gota a gota 16 ml de NaOH 1 N con enfriamiento en hielo y con agitación, seguido de calentamiento y agitación a 70ºC durante 2 horas. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). Después de que la reacción estuvo terminada, la mezcla de reacción se neutralizó con HCl 1 N, se concentró y se disolvió en NaHCO_{3} al 5%. Después de lavar con acetato de etilo, y con NaHCO_{3} al 5%, se acidificó con HCl 1 N. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 2,85 g de Bz-Ala-(^{13}C-Ala), que entonces se recristalizó con acetato de etilo.

RMN^{13}C (metanol-d4, 300 MHz): 175,9 ppm (^{13}COOH)

LC-MS (m/z): 266 (M^{+}+H), 176,148, 105

La sal sódica de Bz-Ala-(^{13}C-Ala) se obtuvo neutralizando Bz-Ala-(^{13}C-Ala) con un equivalente de carbonato sódico 1 M, seguido de la liofilización.

Ejemplo 6 Preparación de Bz-Gly-(^{13}C-Leu)-OMe

Después de que se disolvieron 2 g de 1-^{13}C-L-leucina (Masstrace) en cloruro de hidrógeno/metanol y de que se puso a reflujo, el éster metílico de ^{13}C-L-leucina resultante se suspendió en 100 ml de diclorometano, y se añadieron gota a gota 2,4 ml de trietilamina con enfriamiento en hielo y con agitación. Después, se añadieron 3,0 g de N-benzoilglicina, 5,1 g de HOBt, y 100 ml de diclorometano. Después, se añadió una disolución de 3,3 g de WSC disuelta en 200 ml de diclorometano, y se agitó durante 1 hora mientras se enfría con hielo, y después se deja toda la noche a temperatura ambiente. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). La mezcla de reacción se concentró, se extrajo con acetato de etilo, se lavó con HCl 1 N, con NaHCO_{3} al 5%, y con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 4,38 g de Bz-Gly-(^{13}C-Leu)-OMe.

Ejemplo 7 Preparación de Bz-Gly-(^{13}C-Leu) y su sal sódica

Después de que se disolvieron 4,38 g de Bz-Gly-(^{13}C-Leu)-OMe en 100 ml de metanol, se añadieron gota a gota 15 ml de NaOH 1 N con enfriamiento en hielo y con agitación, seguido de calentamiento y agitación a 70ºC durante 2,5 horas. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). Después de que la reacción estuvo terminada, la mezcla de reacción se neutralizó con HCl 1 N, se concentró y se disolvió en NaHCO_{3} al 5%. Después de lavar con acetato de etilo, y con NaHCO_{3} al 5%, se acidificó con HCl 1 N. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 3,83 g de Bz-Gly-(^{13}C-Leu), que entonces se recristalizó con acetato de etilo.

RMN^{13}C (CDCl_{3}, 300 MHz): 175,5 ppm (^{13}COOH)

Espectrometría de masas (m/z): 293 (M^{+}), 275, 134, 105

LC-MS (m/z): 294 (M^{-}+H), 162, 134, 105

La sal sódica de Bz-Gly-(^{13}C-Leu) se obtuvo neutralizando Bz-Gly-(^{13}C-Leu) con un equivalente de carbonato sódico 1 M, seguido de la liofilización.

Ejemplo 8 Preparación de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Gly)-OMe

Después de que se disolvieron 570 mg de 1-^{13}C-glicina (Masstrace) en cloruro de hidrógeno/metanol y de que se puso a reflujo, el éster metílico de ^{13}C-glicina resultante se suspendió en 50 ml de diclorometano, y se añadió gota a gota 1 ml de trietilamina con enfriamiento en hielo y con agitación. Después, se añadieron 2,0 g de N-benzoil-DL-fenilalanina, 2,3 g de HOBt, y 50 ml de diclorometano. Después, se añadió una disolución de 1,41 g de WSC disuelta en 100 ml de diclorometano, y se agitó durante 1 hora mientras se enfría con hielo, y después se deja toda la noche a temperatura ambiente. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). La mezcla de reacción se concentró, se extrajo con acetato de etilo, se lavó con HCl 1 N, con NaHCO_{3} al 5%, y con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 2,11 g de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Gly)-OMe.

Ejemplo 9 Preparación de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Gly) y su sal sódica

Después de que se disolvieron 2,11 g de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Gly)-OMe en 100 ml de metanol, se añadieron gota a gota 6,9 ml de NaOH 1 N con enfriamiento en hielo y con agitación, seguido de calentamiento y agitación a 70ºC durante 2,5 horas. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). Después de que la reacción estuvo terminada, la mezcla de reacción se neutralizó con HCl 1 N, se concentró y se disolvió en NaHCO_{3} al 5%. Después de lavar con acetato de etilo, y con NaHCO_{3} al 5%, se acidificó con HCl 1 N. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 1,3 g de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Gly).

RMN^{13}C (CDCl_{3}, 300 MHz): 179,2 ppm (^{13}COOH)

Espectrometría de masas (m/z): 327 (M^{+}), 309, 224, 161, 105, 77.

LC-MS (m/z): 328 (M^{+}+H), 252, 224, 105

La sal sódica de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Gly) se obtuvo neutralizando Bz-DL-Phe-(^{13}C-Gly) con un equivalente de carbonato sódico 1 M, seguido de la liofilización.

Ejemplo 10 Preparación de Ac-Phe-(^{13}C-Leu)-OMe

Después de que se disolvieron 1,16 g de 1-^{13}C-L-leucina (Masstrace) en cloruro de hidrógeno/metanol y de que se puso a reflujo, el éster metílico de ^{13}C-L-leucina resultante se suspendió en 50 ml de diclorometano, y se añadieron gota a gota 1,2 ml de trietilamina con enfriamiento en hielo y con agitación. Después, se añadieron 1,8 g de N-acetil-L-fenilalanina, 2,7 g de HOBt, y 50 ml de diclorometano. Después, se añadió una disolución de 1,7 g de WSC disuelta en 100 ml de diclorometano, y se agitó durante 1 hora mientras se enfría con hielo, y después se deja toda la noche a temperatura ambiente. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). La mezcla de reacción se concentró, se extrajo con acetato de etilo, se lavó con HCl 1 N, con NaHCO_{3} al 5%, y con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 2,62 g de Ac-Phe-(^{13}C-Leu)-OMe.

Ejemplo 11 Preparación de Ac-Phe-(^{13}C-Leu) y su sal sódica

Después de que se disolvieron 2,62 g de Ac-Phe-(^{13}C-Leu)-OMe en 100 ml de metanol, se añadieron gota a gota 9,3 ml de NaOH 1 N con enfriamiento en hielo y con agitación, seguido de calentamiento y agitación a 70ºC durante 2,5 horas. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). Después de que la reacción estuvo terminada, la mezcla de reacción se neutralizó con HCl 1 N, se concentró y se disolvió en NaHCO_{3} al 5%. Después de lavar con acetato de etilo, y con NaHCO_{3} al 5%, se acidificó con HCl 1 N. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 2,44 g de Ac-Phe-(^{13}C-Leu), que entonces se recristalizó con acetato de etilo.

RMN^{13}C (CDCl_{3}, 300 MHz): 175,9 ppm (^{13}COOH)

LC-MS (m/z): 322 (M^{+}+H), 190, 162, 120

La sal sódica de Ac-Phe-(^{13}C-Leu) se obtuvo neutralizando Ac-Phe-(^{13}C-Leu) con un equivalente de carbonato sódico 1 M, seguido de la liofilización.

Ejemplo 12 Preparación de Ac-Tyr-(^{13}C-Leu)-OMe

Después de que se disolvieron 0,98 g de 1-^{13}C-L-leucina (Masstrace) en cloruro de hidrógeno/metanol y de que se puso a reflujo, el éster metílico de ^{13}C-L-leucina resultante se suspendió en 50 ml de diclorometano, y se añadió gota a gota 1,0 ml de trietilamina con enfriamiento en hielo y con agitación. Después, se añadieron 65 g de N-acetil-L-tirosina, 2,26 g de HOBt, y 50 ml de diclorometano. Después, se añadió una disolución de 42 g de WSC disuelta en 100 ml de diclorometano, y se agitó durante 1 hora mientras se enfría con hielo, y después se deja toda la noche a temperatura ambiente. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). La mezcla de reacción se concentró, se extrajo con acetato de etilo, se lavó con HCl 1 N, con NaHCO_{3} al 5%, y con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 2,14 g de Ac-Tyr-(^{13}C-Leu)-OMe.

Ejemplo 13 Preparación de Ac-Tyr-(^{13}C-Leu) y su sal sódica

Después de que se disolvieron 2,14 g de Ac-Tyr-(^{13}C-Leu)-OMe en 100 ml de metanol, se añadieron gota a gota 7,3 ml de NaOH 1 N con enfriamiento en hielo y con agitación, seguido de calentamiento y agitación a 70ºC durante 2,5 horas. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). Después de que la reacción estuvo terminada, la mezcla de reacción se neutralizó con HCl 1 N, se concentró y se disolvió en NaHCO_{3} al 5%. Después de lavar con acetato de etilo, y con NaHCO_{3} al 5%, se acidificó con HCl 1 N. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 1,36 g de Ac-Tyr-(^{13}C-Leu), que entonces se recristalizó con acetato de etilo.

RMN^{13}C (metanol-d4, 300 MHz): 175,8 ppm (^{13}COOH)

LC-MS (m/z): 338 (M^{+}+H), 206, 178, 136

La sal sódica de Ac-Tyr-(^{13}C-Leu) se obtuvo neutralizando Ac-Tyr-(^{13}C-Leu) con un equivalente de carbonato sódico 1 M, seguido de la liofilización.

Ejemplo 14 Preparación de un modelo de pancreatitis crónica en ratas 14-1 Método para la preparación

Se preparó un modelo de pancreatitis crónica en ratas inyectando ácido oleico en el tubo pancreático (Mundlos et al., Pancreas 1:29 (1986)). Después de un ayuno toda la noche, se anestesió una rata macho Wistar de 5 semanas mediante administración intraperitoneal de Nembutal (50 mg/kg). La pared abdominal se depiló, y la rata se mantuvo en posición de decúbito supino en una mesa de operación. Se aplicó una disolución de Isodine para esterilizar, y se realizó en el abdomen una incisión de 3 a 4 cm en la línea central. Se sacaron el duodeno y el páncreas, y la pared duodenal se perforó con una aguja de 25 G. Se insertó una cánula de polietileno (PE-10) a través del orificio perforado en el duodeno, y se insertó además en el conducto colédoco alrededor de 5 mm de la papila. La cánula insertada se fijó mediante una micropinza. Posteriormente, el conducto biliar se cerró mediante una micropinza a fin de evitar que el ácido oleico vaya al hígado. Se inyectó ácido oleico (50 \mul) a un caudal de 20 \mul/min mediante una bomba de microjeringuilla. Después de que la inyección estuvo terminada, se dejó reposar a la rata durante 2 minutos de forma que el ácido oleico se distribuyera por todo el páncreas. Se retiraron las micropinzas y la cánula, y se recolocó el duodeno. El endotelio se suturó con hilo de seda (hilo de sutura de seda Nescosuture 3-0, Nihon Shoji KK), y la piel externa se suturó con una grapadora para la piel (Appose ULC, No. 8034-12, 5,7 x 3,8 mm). Como control, sólo se llevó a cabo una laparotomía. Estas ratas sometidas a la operación se mantuvieron con una ingesta sin restricciones de comida estándar y agua a 23ºC, humedad relativa de 55%, hasta su uso.

14-2 Evaluación

Después de inyectar ácido oleico en el conducto pancreático y de mantenerlas durante 3 semanas, estas ratas (ratas inyectadas con ácido oleico) se sometieron a una medida de amilasa en sangre, y a la determinación cuantitativa de los contenidos de quimiotripsinógeno y de amilasa en el páncreas (Fig. 1). Se añadió un tampón de extracción (20 mM de HEPPS+Na, pH 8,0, 100 mM de KCl, 0,5% (p/v) de Tritón X-100) al páncreas retirado, hasta el volumen total de 10 ml. El material se sometió a disgregación ultrasónica (Bionic 7250, Seiko, Sonics & Materials) y se centrifugó a 10.000 x g durante 20 minutos para producir un extracto pancreático como un sobrenadante. A 200 \mul del extracto pancreático, se añadieron 200 \mul de 1 mg/ml de tripsina (procedente de páncreas porcino, Biozyme, código TRY1, lote 0196), que contenía 5 mg/ml de tripsina, 1 mM de tampón de acetato, pH 3,2, diluido cinco veces con 20 mM de Hepes-Na, pH 8,0, y se dejó reposar a 4ºC durante 2 horas para activar el quimiotripsinógeno a quimiotripsina (Lampel y Kern, Virchows Archiv A 373:97 (1977)). Después de añadir 30 \mul del extracto pancreático activado y 20 \mul de 123,8 mM de BT-PABA a 150 \mul de 20 mM de HEPPS-Na, pH 8,0, la reacción de la quimiotripsina se realizó a 37ºC durante 15 minutos. Después de la reacción, se añadieron 10 \mul de una disolución al 100% (p/v) de TCA, y se centrifugó a 15.000 x g durante 5 minutos, y el PABA en el sobrenadante se determinó cuantitativamente usando un kit de medida de PABA (Eisai). La actividad de la amilasa en el extracto pancreático se midió usando Fiji Dri-Chem. Ambas unidades de actividad (U) muestran los \mumoles liberados/min.

El contenido de quimiotripsinógeno fue 62,4 U \pm 26,2, n = 11 en las ratas del control, y 8,1 U \pm 10,7, n = 17 en las ratas inyectadas con ácido oleico. El contenido de amilasa fue 8681 U \pm 5622, n = 11 en las ratas del control y 789 U \pm 1842, n = 17 en las ratas inyectadas con ácido oleico. De este modo, ambos contenidos de enzima se redujeron significativamente en las ratas inyectadas con ácido oleico (Fig. 1). En particular, el contenido de quimiotripsinógeno estaba notablemente reducido. Por lo tanto, se puede evaluar que se ha producido pancreatitis en 12 ratas entre 17 ratas inyectadas con ácido oleico (70%), si el límite inferior normal es la media - 2 SD del contenido de quimiotripsinógeno para el control. Por otro lado, las concentraciones de amilasa en sangre de ambas ratas tuvieron el mismo nivel, que aumenta en el período agudo de la pancreatitis, 1930 U \pm 823, n = 11 en las ratas del control y 2137 U \pm 668, n = 17 en las ratas inyectadas con ácido oleico; por lo tanto, las ratas inyectadas con ácido oleico están caracterizadas como un modelo de pancreatitis crónica.

Ejemplo 15 Ensayo de respiración de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu) 15-1 Método

Las ratas del modelo de pancreatitis crónica y las ratas del control, que se mantuvieron durante 3 a 4 semanas tras la operación, ayunaron desde las 9:00 am hasta las 4:00 pm. Se administraron oralmente 3 mg/ml de BT-PABA (disolución de PFD para uso interno, Eisai) en una cantidad de 15 mg/kg. La orina se recogió durante 16 horas hasta las 9:00 am del siguiente día. La cantidad de la orina recogida y la concentración de PABA en la orina se determinaron usando un kit de medición de PABA, para determinar la tasa de excreción en orina (ensayo de PFD).

Después del ensayo de PFD, se administró oralmente a las ratas, las cuales ayunaron durante 24 horas, Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu)-Na disuelto en agua destilada (250 mg/kg, 6 ml/kg), para llevar a cabo un ensayo de respiración de ^{13}C. La rata de 9 semanas se inmovilizó sin anestesia en un soporte para ratas, para un aparato de irradiación de microondas. La respiración se recogió a un caudal de alrededor de 100 a 300 ml/min usando una bomba de régimen variable (bomba de régimen variable VS-500, Shibata Kagaku Kogyo), y se introdujo directamente a una celda de flujo de un analizador de ^{13}CO_{2} EX130S (Nihon Bunko). Se colocó un secador Perma Pure (MD-050-12P, Perma Pure INC.) entre el soporte de la rata y la bomba de régimen variable, para eliminar el vapor de agua en la respiración. La concentración de CO_{2} se estabilizó, la rata se retiró del soporte de ratas, y se administró Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu)-Na disuelto en agua destilada en el estómago, usando una sonda oral.

Los datos de salida procedentes del analizador de ^{13}CO_{2} se convirtieron en AD y se introdujeron en un ordenador personal (Apple Power Macintosh 8500). Usando un programa de ordenador Lab VIEW (National Instruments) de procesamiento de datos, se integraron y se promediaron 10 puntos de datos a cada 100 ms, en un intervalo de 5 segundos, y se convirtieron en % átomos de ^{13}C, \Delta^{13}C (\textperthousand), y concentración de CO_{2} (%). De esta manera, el ensayo de respiración de ^{13}C se llevó a cabo de forma continua. Los datos convertidos se presentaron en tiempo real y se almacenaron en un disco duro. La concentración de CO_{2} en la respiración recogida se mantuvo a 3 \pm 0,5%.

El \Delta^{13}C (\textperthousand) se calculó a partir de la concentración de ^{13}C en el CO_{2} exhalado en cada punto de tiempo (^{13}C tmin) y a partir de la concentración de ^{13}C en el CO_{2} estándar (^{13}C std), según la siguiente ecuación:

\Delta^{13}C \ (\textperthousand) = [(^{13}C \ tmin - ^{13}C \ 0 \ min)/^{13}C \ std] \ x \ 1000

Después del ensayo de respiración, el abdomen de la rata se abrió bajo anestesia mediante administración intraperitoneal de Nembutal (50 mg/kg), y todo el páncreas se sacó y se pesó. Después, se determinó el contenido de quimiotripsinógeno.

15-2 Resultados

Se llevó a cabo el ensayo de respiración de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu) (Fig. 2), en el que se administraron oralmente 250 mg/kg de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu)-Na a las ratas con pancreatitis crónica y a las ratas del control, y se midió el transcurso del tiempo de la concentración de ^{13}CO_{2} en el CO_{2} exhalado después de la administración. En las ratas del control, el valor de \Delta^{13}C (\textperthousand) comenzó a aumentar a los 2 a 3 minutos después de la administración, aunque hubo cierta diferencia en el grado de aumento entre los individuos. El valor alcanzó un pico de 100 a 200\textperthousand a 15 hasta 20 minutos, y después disminuyó gradualmente. En 7 casos de las ratas con pancreatitis crónica, por el contrario, el grado de aumento fue pequeño y continuó aumentando lentamente durante 30 minutos. La rata que queda mostró el mismo comportamiento que las ratas del control, pero el pico de tiempo fue más tarde. A los 10 minutos después de la administración, los valores de \Delta^{13}C (\textperthousand) de las ratas con pancreatitis crónica fueron menores que el valor más pequeño de \Delta^{13}C (\textperthousand) para las ratas del control. En consecuencia, la sensibilidad es del 100% incluso cuando el valor de corte se ajusta de forma que la especificidad es del 100% usando el valor de \Delta^{13}C (\textperthousand) a los 10 minutos como un valor de comprobación (Fig. 3). Por otro lado, la sensibilidad en el ensayo de PFD del mismo grupo de ratas, llevado a cabo inmediatamente antes del ensayo de la respiración, fue del 50%, indicando que el ensayo de respiración de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu) fue muy superior a aquél (Fig. 3). Puesto que se ha informado que la sensibilidad de los ensayos simples de la función exocrina pancreática distintos del ensayo de PFD es idéntica a la del ensayo de PFD, se puede afirmar que el ensayo de respiración de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu) es el ensayo simple más altamente sensible de la función exocrina pancreática. Adicionalmente, además de la tensión provocada al paciente debido a las 6 horas de recogida de la orina y a que se ve forzado a beber una gran cantidad de agua, este ensayo de PFD es desventajoso por cuanto son necesarios análisis subsiguientes, de forma que los resultados a menudo no se obtienen en el mismo día. Por el contrario, el ensayo de la respiración de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu) tiene la ventaja de que el período de restricción es sólo 10 minutos, y los resultados se pueden conocer pronto en el sitio y al momento.

Ejemplo 16 Ensayo de respiración de Bz-Ala-(^{13}C-Ala)

De manera similar a 15-1, se llevó a cabo el ensayo de respiración de Bz-Ala-(^{13}C-Ala) en el que se administraron oralmente 50 mg/kg de Bz-Ala-(^{13}C-Ala)-Na, y se midió el transcurso de tiempo de la concentración de ^{13}CO_{2} en el CO_{2} exhalado después de la administración. La sensibilidad fue 88% cuando se usó el valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a 10 minutos como un valor de comprobación, y se estableció un valor de corte de forma que la especificidad fue 100% (Fig. 4). Por otro lado, la sensibilidad en el ensayo de PFD del mismo grupo de ratas llevado a cabo inmediatamente antes del ensayo de la respiración fue 63%; de este modo, el ensayo de respiración de Bz-Ala-(^{13}C-Ala) tuvo una mayor sensibilidad (Fig. 4). Adicionalmente, además de la tensión creada al paciente debido a 6 horas de recogida de la orina y debido a que se ve forzado a beber una gran cantidad de agua, este ensayo de PFD es desventajoso por cuanto son necesarios análisis subsiguientes de forma que los resultados a menudo no se obtienen en el mismo día. Por el contrario, se podría afirmar que el ensayo de respiración de Bz-Ala-(^{13}C-Ala) es más excelente por cuanto el período de limitación es sólo de 10 minutos, y por cuanto los resultados se pueden conocer pronto en el sitio y en el tiempo.

Ejemplo 17 Ensayo de respiración de Bz-Gly-(^{13}C-Leu)

De manera similar a 15-1, se llevó a cabo el ensayo de respiración de Bz-Gly-(^{13}C-Leu) en el que se administraron oralmente 50 mg/kg de Bz-Gly-(^{13}C-Leu)-Na, y se midió el transcurso de tiempo de la concentración de ^{13}CO_{2} en el CO_{2} exhalado después de la administración. La sensibilidad fue 80% cuando se usó el valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a 18 minutos como un valor de comprobación, y se estableció un valor de corte de forma que la especificidad fue 100% (Fig. 5). Por otro lado, la sensibilidad en el ensayo de PFD del mismo grupo de ratas llevado a cabo inmediatamente antes del ensayo de la respiración fue 50%; de este modo, el ensayo de respiración de Bz-Gly-(^{13}C-Leu) tuvo una mayor sensibilidad (Fig. 5). Adicionalmente, además de la tensión creada al paciente debido a 6 horas de recogida de la orina y debido a que se ve forzado a beber una gran cantidad de agua, este ensayo de PFD es desventajoso por cuanto son necesarios análisis subsiguientes de forma que los resultados a menudo no se obtienen en el mismo día. Por el contrario, el ensayo de respiración de Bz-Gly-(^{13}C-Leu) tiene una ventaja por cuanto el período de limitación es sólo de 18 minutos, y por cuanto los resultados se pueden conocer pronto en el sitio y en el tiempo.

Ejemplo 18 Preparación de Bz-L-Phe-(^{13}C-Leu)-OMe

Después de que se disolvieron 3,02 g de 1-^{13}C-L-leucina (Masstrace) en cloruro de hidrógeno/metanol y de que se puso a reflujo, el éster metílico de ^{13}C-L-leucina resultante se suspendió en 150 ml de diclorometano, y se añadieron gota a gota 3,22 ml de trietilamina con enfriamiento en hielo y con agitación. Después, se añadieron 6,16 g de N-benzoil-L-fenilalanina, 7,02 g de HOBt, y 100 ml de diclorometano. Después, se añadió una disolución de 4,4 g de WSC disuelta en 200 ml de diclorometano, y se agitó durante 1 hora mientras se enfría con hielo, y después se deja toda la noche a temperatura ambiente. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). La mezcla de reacción se concentró, se extrajo con acetato de etilo, se lavó con HCl 1 N, con NaHCO_{3} al 5%, y con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 8,36 g de Bz-L-Phe-(^{13}C-Leu)-OMe.

Ejemplo 19 Preparación de Bz-L-Phe-(^{13}C-Leu) y su sal sódica

Después de que se disolvieron 8,36 g de Bz-L-Phe-(^{13}C-Leu)-OMe en 150 ml de metanol, se añadieron gota a gota 23,2 ml de NaOH 1 N con enfriamiento en hielo y con agitación, seguido de calentamiento y agitación a 70ºC durante 3,5 horas. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). Después de que la reacción estuvo terminada, la mezcla de reacción se neutralizó con HCl 1 N, se concentró y se disolvió en NaHCO_{3} al 5%. Después de lavar con acetato de etilo, y con NaHCO_{3} al 5%, se acidificó con HCl 1 N. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 7,92 g de Bz-L-Phe-(^{13}C-Leu), que entonces se recristalizó con acetato de etilo.

RMN^{13}C (metanol-d4, 300 MHz): 175,9 ppm (^{13}COOH)

Espectrometría de masas (m/z): 383 (M^{+}), 365, 224, 131, 105, 77

LC-MS (m/z): 384 (M^{+}+H), 252, 224, 105

La sal sódica de Bz-L-Phe-(^{13}C-Leu) se obtuvo neutralizando Bz-L-Phe-(^{13}C-Leu) con un equivalente de carbonato sódico 1 M, seguido de la liofilización.

Ejemplo 20 Preparación de Bz-Tyr-(^{13}C-Leu)-OMe

Después de que se disolvieron 1,73 g de 1-^{13}C-L-leucina (Masstrace) en cloruro de hidrógeno/metanol y de que se puso a reflujo, el éster metílico de ^{13}C-L-leucina resultante se suspendió en 100 ml de diclorometano, y se añadieron gota a gota 2,00 ml de trietilamina con enfriamiento en hielo y con agitación. Después, se añadieron 4,05 g de N-benzoil-L-tirosina, 4,35 g de HOBt, y 100 ml de diclorometano. Después, se añadió una disolución de 2,73 g de WSC disuelta en 150 ml de diclorometano, y se agitó durante 1 hora mientras se enfría con hielo, y después se deja toda la noche a temperatura ambiente. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). La mezcla de reacción se concentró, se extrajo con acetato de etilo, se lavó con HCl 1 N, con NaHCO_{3} al 5%, y con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 5,5 g de Bz-Tyr-(^{13}C-Leu)-OMe.

Ejemplo 21 Preparación de Bz-Tyr-(^{13}C-Leu) y su sal sódica

Después de que se disolvieron 5,5 g de Bz-Tyr-(^{13}C-Leu)-OMe en 150 ml de metanol, se añadieron gota a gota 14,6 ml de NaOH 1 N con enfriamiento en hielo y con agitación, seguido de calentamiento y agitación a 70ºC durante 3,5 horas. La terminación de la reacción se confirmó mediante cromatografía de capa fina sobre gel de sílice, usando como disolvente desarrollador cloroformo:metanol (95:5). Después de que la reacción estuvo terminada, la mezcla de reacción se neutralizó con HCl 1 N, se concentró y se disolvió en NaHCO_{3} al 5%. Después de lavar con acetato de etilo, y con NaHCO_{3} al 5%, se acidificó con HCl 1 N. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró hasta sequedad para producir 4,39 g de Bz-Tyr-(^{13}C-Leu), que entonces se recristalizó con acetato de etilo.

RMN^{13}C (metanol-d4, 300 MHz): 175,9 ppm (^{13}COOH)

Espectrometría de masas (m/z): 399 (M^{+}), 381, 240, 147, 107, 105, 77

LC-MS (m/z): 400 (M^{+}+H), 268, 240

La sal sódica de Bz-Tyr-(^{13}C-Leu) se obtuvo neutralizando Bz-Tyr-(^{13}C-Leu) con un equivalente de carbonato sódico 1 M, seguido de la liofilización.

Ejemplo 22 Preparación de Arg-(^{13}C-Leu)

Se disolvieron un (1) g de 1-^{13}C-L-leucina (Masstrace), 1,7 g de ácido p-toluenosulfónico monohidratado
(TosOH\cdotH_{2}O) y 3,7 ml de alcohol bencílico (BzlOH) en 10 ml de benceno seco, y se calentó y se puso a reflujo en un baño de aceite (110ºC) usando un aparato Dean-Stark equipado con un condensador de reflujo, en un matraz de evaporación. La reacción se llevó a cabo durante 5 horas mientras se separaba el agua producida a medida que transcurría la reacción. Después de que la reacción terminó, se añadieron 15 ml de éter y 15 ml de éter de petróleo, para cristalizar el agente reaccionante, y éste se recristalizó con etanol-éter para producir ^{13}C-Leu-OBzl.

Se disolvieron N \alpha-carbobenzoxi Ng-tosilarginina (Z-Arg(Tos)) y una cantidad equimolar de ^{13}C-Leu-OBzl en tetrahidrofurano seco (THF), y se añadieron una cantidad equimolar de HOBt, dos cantidades molares de dimetilaminopiridina y 1,5 cantidades molares de WSC, para hacerlos reaccionar durante 3 horas. Después de que la reacción terminó y de que el disolvente se separó mediante destilación a presión reducida, el material se disolvió en cloroformo, y la capa de cloroformo se lavó secuencialmente con ácido cítrico al 10%, agua, NaHCO_{3} al 4%, y agua. La capa de cloroformo se secó sobre Na_{2}SO_{4}, y después el disolvente se separó mediante destilación. El residuo se recristalizó en etanol/éter para producir Z-Arg(Tos)-^{13}C-Leu-OBzl. Después, se disolvió 1 g de Z-Arg(Tos)-^{13}C-Leu-OBzl en 3,6 ml de tioanisol, 1,5 ml de ácido trifluoroacético (TFA) y 0,6 ml de ácido trifluorometilsulfónico (TFMSA), y se hizo reaccionar a la temperatura ambiente durante 2 horas. Después de separar el disolvente mediante destilación, el residuo se disolvió en agua y se trató con una resina de intercambio aniónico (AG-X8, tipo ácido acético). La disolución resultante se concentró y se purificó en una columna LH20 (2,5 x 60 cm) equilibrada con metanol:agua (1:1) para producir 200 mg de Arg-(^{13}C-Leu).

La estructura y la posición marcada con ^{13}C se confirmaron mediante RMN ^{1}H y RMN ^{13}C.

RMN ^{1}H (DMSO-d6, 400 MHz):

: 1,073-1,015 ppm 6H: CH-(CH_{3})_{2} Leu

: 1,868-1,690 ppm 7H: CH-(CH_{3})_{2} Leu, CH-CH_{2}-CH

: Leu CH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2} Arg

: 3,26 ppm 2H: CH_{2}-NH-C=NH_{2} Arg

: 3,477 ppm: H_{2}O

: 3,649 ppm ^{1}H: NH-CH-COOH Leu

: 4,2 ppm ^{1}H: NH_{2}-CH-CONH Arg

: 7,3-6,8 ppm: grupo guanidínico Arg

RMN ^{13}C (DMSO-d6, 400 MHz):

: 173,3 ppm: NH-CH-(^{13}C-COOH) Leu

Ejemplo 23 Preparación de Phe-(^{13}C-Leu)

Después de que se disolvieron 9,96 g de 1-^{13}C-L-leucina (Masstrace) en 75 ml de NaOH 1 N, se añadió una disolución de dicarbonato de di-t-butilo (Boc_{2}O) (18,0 g) en acetona (50 ml). Después, se añadieron a la misma, gota a gota, 5,21 ml de trietilamina, y se agitó a temperatura ambiente. Después de una hora, se añadió una disolución de Boc_{2}O (9,8 g) en acetona (40 ml), y se agitó toda la noche a temperatura ambiente. Después de que la acetona se separó por destilación a presión reducida, se añadieron 500 ml de acetato de etilo, se precipitó con HCl 6 N, se lavó con agua y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Después de separar el agente secante mediante filtración, se añadieron 10 ml de ciclohexilamina (CHA). Después de lavar con HCl 1 N, se extrajo Boc-(^{13}C-Leu) con disolución saturada de hidrogenocarbonato de sodio, y la capa acuosa se acidificó con HCl 6 N, se extrajo con acetato de etilo, se lavó con agua y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Después de concentrar a presión reducida, el producto oleoso residual se disolvió en hexano, y se añadieron 1,2 ml de agua para cristalizar y producir Boc-(^{13}C-Leu)-OH-H_{2}O. Se disolvieron diez (10) g de Boc-(^{13}C-Leu)-OH-H_{2}O en etanol (50 ml)-agua (20 ml), y se añadieron 6,52 g de carbonato de cesio disuelto en 20 ml de agua destilada. Después de concentrar a presión reducida, se añadieron etanol y tolueno, y el agua restante se eliminó azeotrópicamente para producir un producto en forma de gel, que se suspendió en 300 ml de dimetilformamida (DMF). A la suspensión se añadieron gota a gota 5,2 ml de bromuro de bencilo a temperatura ambiente con agitación. Después de agitar a temperatura ambiente durante 45 minutos, el disolvente se separó por destilación a presión reducida. Se añadió acetato de etilo, y se lavó con agua. Después de secar sobre sulfato de sodio anhidro, el acetato de etilo se separó por destilación a presión reducida para producir un producto oleoso. Al producto se añadieron 59 ml de TFA, y se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos. Después de añadir 8,37 g de ácido p-toluenosulfónico monohidratado, el TFA se separó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter diisopropílico para cristalizar y producir TosOH\cdotH-(^{13}C-Leu)-OBzl. Después de disolver 7,89 g de TosOH\cdotH-(^{13}C-Leu)-OBzl, 5,57 g de t-Boc-L-fenilalanina (Boc-Phe) y 2,97 g de HOBt en 80 ml de DMF, se añadieron 4,03 ml de carbodiimida soluble en agua (WSCD:1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) gota a gota mientras se enfriaba con hielo y se agitaba a temperatura ambiente durante 3 horas. Se añadieron acetato de etilo y agua con hielo, y se separó en dos capas. La capa orgánica se lavó con hidrogenocarbonato sódico saturado, con agua, con HCl 0,1 N y con agua, y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Después de separar el acetato de etilo por destilación a presión reducida, se añadió hexano para cristalizar y producir Boc-Phe-(^{13}C-Leu)-OBzl. El Boc-Phe-(^{13}C-Leu)-OBzl (5,2 g) se disolvió en 10 ml de ácido acético, y se añadieron 500 mg de paladio al 5% sobre carbón (Pd-C). Mientras se agitaba a temperatura ambiente, se hizo pasar gas hidrógeno durante 1 hora. Después de eliminar el catalizador mediante filtración, el líquido madre se concentró a presión reducida hasta alrededor de 10 ml. Mientras se enfriaba con hielo, se añadieron 7,23 ml de HCl 4,6 N/dioxano, y se agitó durante 10 minutos, seguido de una agitación adicional a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de concentrar a presión reducida, se añadió éter para solidificar. El sólido resultante se separó por filtración, se lavó con éter y se disolvió en 100 ml de agua destilada. Los materiales insolubles se separaron por filtración con un filtro de membrana, y se liofilizaron. Este producto se purificó en rp-hplc (YMC-ODS (10 \mum), 30 mm x 250 mm, 20 ml/min, CH_{3}CN ac. (HCl al 0,05%)) (5%-5%-20%, 0-15-75 minutos), y la fracción principal se liofilizó para producir 2,84 g de Phe-(^{13}C-Leu).

La estructura y la posición marcada con ^{13}C se confirmaron mediante RMN ^{13}C, espectrometría de masas y análisis de aminoácidos.

RMN ^{13}C (DMSO-d6, 270 MHz): 174,3 ppm (^{13}COOH)

MALD-MS (m/z): 280,20 (M^{+}+H)

Análisis de aminoácidos: fenilalanina 1,00; leucina 1,01 (condiciones hidrolíticas: HCl 6 N, 110ºC, 22 horas).

Ejemplo 24 Preparación de Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu) y su sal sódica

A 33,8 g de N-t-Boc-fenacil-L-alanina (Boc-Ala-OPac), se añadieron 9,6 ml de disolución de HCl 4,6 N/dioxano, y se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos. Se añadió éter dietílico para solidificar, y el sólido se separó por filtración y se secó a presión reducida. Este material se suspendió en 100 ml de diclorometano, y se añadieron 18,9 g de N-t-Boc-L-alanina (Boc-Ala), y se enfrió hasta 0ºC. Después de añadir 19,2 ml de WSCD, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Después de concentrar a presión reducida, el residuo se disolvió en acetato de etilo/agua, y la capa orgánica se lavó con agua, con HCl 1 N y con agua, y se secó sobre sulfato sódico anhidro. El acetato de etilo se separó por destilación a presión reducida, y se añadió éter diisopropílico para solidificar. El sólido resultante se separó por filtración y se recristalizó con acetona-éter-éter diisopropílico para dar Boc-Ala-
Ala-OPac.

A 15,1 g de Boc-Ala-Ala-OPac, se añadieron 88,8 ml de TFA, y se agitó a temperatura ambiente durante 50 minutos. Después de concentrar a presión reducida, se añadieron 11,3 ml de disolución de HCl 4,6 N/dioxano. Se añadió éter dietílico/éter diisopropílico para solidificar, y el sólido resultante se separó por filtración y se secó a presión reducida. Este material se disolvió en 100 ml de DMF, y se añadieron 7,95 g de Boc-Ala y 5,95 g de HOBt. Después de enfriar hasta 0ºC y añadir 8,1 ml de WSCD, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se enfrió, y se añadió agua para precipitar. El sólido precipitado se separó por filtración y se disolvió en cloroformo/metanol (3:1). La capa orgánica se lavó con agua y se concentró directamente a presión reducida. Se añadió éter para cristalizar y producir Boc-Ala-Ala-Ala-OPac.

Se disolvió Boc-Ala-Ala-Ala-OPac (8,99 g) en 50 ml de diclorometano/trifluoroetanol (TFE) (3:1), y se le añadieron 100 ml de ácido acético. Después, se añadieron 26,2 g de polvo de cinc, y se agitó vigorosamente a 35ºC durante 1 hora. Los materiales insolubles se separaron por filtración, y lo que queda se concentró a presión reducida. Se añadió ácido acético, se lavó con agua y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El acetato de etilo se separó por destilación a presión reducida, y se añadió éter al residuo para cristalizar y producir Boc-Ala-Ala-Ala-OH.

Después de que se disolvieron 9,96 g de 1-^{13}C-L-leucina (Masstrace) en 75 ml de NaOH 1 N, se añadió una disolución de dicarbonato de Boc_{2}O (18 g) en acetona (50 ml). Después, se añadieron a la misma, gota a gota, 5,21 ml de trietilamina, y se agitó a temperatura ambiente. Después de una hora, se añadió una disolución de Boc_{2}O (9,8 g) en acetona (40 ml), y se agitó toda la noche a temperatura ambiente. Después de que la acetona se separó por destilación a presión reducida, se añadieron 500 ml de acetato de etilo, se precipitó con HCl 6 N, se lavó con agua y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Después de separar el agente secante mediante filtración, se añadieron 10 ml de CHA. Después de lavar con HCl 1 N, se extrajo Boc-(^{13}C-Leu) con disolución saturada de hidrogenocarbonato de sodio, y la capa acuosa se acidificó con HCl 6 N, se extrajo con acetato de etilo, se lavó con agua y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Después de concentrar a presión reducida, el producto oleoso residual se disolvió en hexano, y se añadieron 1,2 ml de agua para cristalizar y producir Boc-(^{13}C-Leu)-OH\cdotH_{2}O.

Se disolvieron diez (10) g de Boc-(^{13}C-Leu)-OH\cdotH_{2}O en etanol (50 ml)-agua (20 ml), y se añadieron 6,52 g de carbonato de cesio disuelto en 20 ml de agua destilada. Después de concentrar a presión reducida, se añadieron etanol y tolueno, y el agua restante se eliminó azeotrópicamente para producir un producto en forma de gel, que se suspendió en 300 ml de DMF. A la suspensión se añadieron gota a gota 5,2 ml de bromuro de bencilo a temperatura ambiente con agitación. Después de agitar a temperatura ambiente durante 45 minutos, el disolvente se separó por destilación a presión reducida. Se añadió acetato de etilo, y se lavó con agua. Después de secar sobre sulfato de sodio anhidro, el acetato de etilo se separó por destilación a presión reducida para producir un producto oleoso. Al producto se añadieron 59 ml de TFA, y se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos. Después de añadir 8,37 g de ácido p-toluenosulfónico monohidratado, el TFA se separó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter diisopropílico para cristalizar y producir TosOH\cdotH-(^{13}C-Leu)-OBzl.

Después de disolver 7,89 g de TosOH\cdotH-(^{13}C-Leu)-OBzl, 5,57 g de Boc-Phe y 2,97 g de HOBt en 80 ml de DMF, se añadieron 4,03 ml de WSCD gota a gota mientras se enfriaba con hielo, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Se añadieron acetato de etilo y agua con hielo, lo que dio como resultado dos capas separadas. La capa orgánica se lavó con hidrogenocarbonato sódico saturado, con agua, con HCl 0,1 N y con agua, y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Después de separar el acetato de etilo por destilación a presión reducida, se añadió hexano para cristalizar y producir Boc-Phe-(^{13}C-Leu)-OBzl.

A 3,71 g de Boc-Phe-(^{13}C-Leu)-OBzl se añadieron 17,5 ml de TFA, se agitaron a temperatura ambiente durante 40 minutos, y se concentraron a presión reducida. Después de añadir 2,2 ml de HCl 4,6 N/dioxano, se añadió éter diisopropílico para cristalizar. Los cristales se separaron por filtración, se secaron a presión reducida y se disolvieron en 50 ml de DMF, y se añadieron 2,13 g de Boc-Ala-Gly-OH\cdotH_{2}O y 1,15 g de HOBt. Mientras se enfriaba con hielo, se añadieron gota a gota 1,56 ml de WSCD, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de enfriar la mezcla de reacción, el sólido precipitado se separó por filtración y se lavó con agua. Este material se disolvió en acetato de etilo y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Después de la concentración a presión reducida, el material se cristalizó con éter diisopropílico para producir Boc-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu)-OBzl.

A 3,59 g de Boc-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu)-OBzl, se añadieron 22,2 ml de TFA, y se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos. Después de concentrar a presión reducida, se añadieron 1,7 ml de disolución de HCl 4,6 N/dioxano, y se solidificó con éter diisopropílico. El sólido se separó por filtración y se disolvió en 50 ml de DMF, y se añadieron 2,03 g de Boc-Ala-Ala-Ala-OH y 1,06 g de 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzotriazina (HOObt). Mientras se enfriaba con hielo, se añadieron gota a gota 19 ml de WSCD, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Después de enfriar la mezcla de reacción, se añadió agua y el sólido precipitado se separó por filtración y se lavó con agua. El sólido se suspendió en metanol, se separo por filtración y se seco a presión reducida. El material se disolvió en 100 ml de cloroformo/trifluoroetanol, y las impurezas se separaron por filtración. El disolvente se eliminó a presión reducida, y se añadió éter al residuo, seguido de la filtración, para producir Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu)-OBzl.

A 2,68 g de Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu)-OBzl se añadieron 19 ml de TFA, y se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos. Después de concentrar a presión reducida, se añadió éter para solidificar. El sólido se separó por filtración y se disolvió en 20 ml de DMF, y se añadieron 0,80 g de benzoil-1-hidroxisuccinimida (Bz-ONSu). Después de añadir gota a gota 0,5 ml de trietilamina, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una hora. Después, se añadieron adicionalmente 20 ml de DMF, y se añadió trietilamina para ajustar el pH a 6. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas adicionales. Después de enfriar la mezcla de reacción, se añadió agua, y el sólido precipitado se separó por filtración y se lavó con agua. El sólido se suspendió en metanol y se separó por filtración para producir Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu)-OBzl.

Después de disolver 1,63 g de Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu)-OBzl en 80 ml de diclorometano/alcohol hexafluoroisopropílico (3:1), se añadieron 0,32 g de paladio al 5% sobre carbón suspendido en agua/metanol. La mezcla de reacción se agitó a 20ºC durante 4 horas mientras se introduce en ella gas hidrógeno. Se usó un papel de filtro en forma de polvo para separar por filtración el catalizador, y el filtrado se concentró a presión reducida. Se añadió agua para solidificar, y el sólido se separó por filtración y se lavó con agua. El sólido se suspendió en metanol, se separó por filtración y se secó a presión reducida. Este material se disolvió en 50 ml de alcohol hexafluoroisopropílico y se concentró a presión reducida, y al residuo se añadió acetato de etilo para cristalizar y producir 1,19 g de Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu).

RMN ^{13}C (DMSO-d6, 270 MHz): 173,8 ppm (^{13}COOH)

PD-MS (m/z): 725,3 (M^{+}+H), 748,2 (M^{+}+Na), 764,4 (M^{+}+K)

Análisis de aminoácidos: fenilalanina 1,00; glicina 1,08; alanina 4,09; leucina 1,04 (condiciones hidrolíticas: HCl 6 N, 110ºC, 22 horas).

La sal sódica de Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu) se obtuvo neutralizando Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu) con un equivalente de carbonato sódico 1 M, seguido de la liofilización.

Ejemplo 25 Preparación de Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu) y su sal sódica

Al igual que en el Ejemplo 24, se obtuvo Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu)-OBzl. Después de disolver 1,62 g de Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu)-OBzl en 40 ml de diclorometano/alcoholhexafluoroisopropílico (3:1), se añadieron 0,16 g de paladio al 5% sobre carbón suspendido en agua/metanol. Se introdujo hidrógeno gaseoso en la mezcla de reacción durante 1,5 horas mientras se agitaba a 27ºC. Se usó un papel de filtro polvoriento para filtrar el catalizador, y el filtrado se concentró a presión reducida. Se añadió acetonitrilo para solidifcar, y el sólido se separó por filtración. El sólido se secó a presión reducida, y se disolvió a 30 ml de alcohol hexafluoroisopropílico. Los materiales insolubles se separaron por filtración, y lo que queda se concentró a presión reducida. Se añadió acetato de etilo al residuo, y el material en gel precipitado se filtró para producir 1,56 g de Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu).

RMN ^{13}C (DMSO-d6, 270 MHz): 173,7 ppm (^{13}COOH)

PD-MS (m/z): 721,7 (M^{+}+H), 743,9 (M^{+}+Na), 759,9 (M^{+}+K)

Análisis de aminoácidos: fenilalanina 1,00; glicina 1,09; alanina 4,07; leucina 1,04 (condiciones hidrolíticas: HCl 6 N, 110ºC, 22 horas).

La sal sódica de Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu) se obtuvo neutralizando Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-(^{13}C-Leu) con un equivalente de carbonato sódico 1 M, seguido de la liofilización.

Ejemplo 26 Preparación de Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu y su sal sódica

Después de disolver 5 g de 1-^{13}C-glicina (Masstrace) en disolución acuosa (17,5 ml) de hidróxido sódico (2,56 g), y de añadir 3,65 ml de trietilamina, se añadió una disolución de Boc_{2}O (15,1 ml) en acetona (8 ml), y se agitó a temperatura ambiente durante 17 h. Después de concentrar a presión reducida, se añadió ácido cítrico a la capa acuosa para ajustar el pH hasta 4, y se añadió cloruro sódico para desalinizar, seguido de la extracción con acetato de etilo. El extracto se secó directamente sobre sulfato de magnesio, y el agente secante se separó por filtración. Después de añadir 6,76 ml de CHA, el filtrado se dejó reposar toda la noche en un refrigerador. El cristal precipitado se separó por filtración para producir Boc-(^{13}C-Gly)-OH\cdotCHA.

Se suspendieron ocho (8) g de Boc-(^{13}C-Gly)-OH-CHA en 50 ml de THF, y se añadieron 6,32 ml de HCl 4,6 N/dioxano. La mezcla se disgregó completamente en un lavador ultrasónico, y se añadió éter. El sólido precipitado se separó por filtración, y el filtrado se concentró a presión reducida. Se añadió éter al residuo, y los materiales insolubles se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se lavó con hexano y se separó por filtración para producir Boc-(^{13}C-Gly)-OH.

Después de disolver 5,31 g de Boc-Phe, 7,87 g de TosOH\cdotH-Leu-OBzl y 2,84 g de HOBt en 40 ml de DMF, se añadieron 3,72 ml de WSCD con enfriamiento con hielo, y se agitó durante 30 minutos y a temperatura ambiente durante otras 2,5 horas. Después de concentrar a presión reducida, se añadió acetato de etilo, se lavó secuencialmente con disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico, con disolución acuosa saturada de cloruro sódico, con disolución acuosa al 10% de ácido cítrico y con disolución acuosa saturada de cloruro sódico, y se secó sobre sulfato de magnesio. Después de concentrar a presión reducida, se añadieron 43 ml de HCl 4,6 N/dioxano, y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de concentrar a presión reducida, se añadió éter y el sólido precipitado se separó por filtración para producir HCl\cdotH-Phe-Leu-OBzl.

Después de disolver 3,52 g de Boc-(^{13}Gly)-OH, 8,88 g de HCl\cdotH-Phe-Leu-OBzl y 2,70 g de HOBt en 40 ml de DMF, se añadieron 3,54 ml de WSCD con enfriamiento con hielo, y se agitó durante 30 minutos y a temperatura ambiente durante otras 14 horas. Después de concentrar a presión reducida, el material se disolvió en acetato de etilo, se lavó secuencialmente con disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico, con disolución acuosa saturada de cloruro sódico, con disolución acuosa al 10% de ácido cítrico y con disolución acuosa saturada de cloruro sódico, y se secó sobre sulfato de magnesio. Después de concentrar a presión reducida, se obtuvo Boc-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu-OBzl.

A 10,4 g de Boc-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu-OBzl, se añadieron 42,8 ml de HCl 4,6 N/dioxano, y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Después de concentrar a presión reducida, se obtuvo un producto oleoso. El producto oleoso se disolvió en 40 ml de DMF, y se añadieron 3,7 g de Boc-Ala y 2,66 g de HOBt, seguido de la adición de 3,49 ml de WSCD mientras se enfriaba con hielo, y esto se agitó durante 30 minutos y durante 16 horas adicionales a temperatura ambiente. Después de concentrar a presión reducida, el material se disolvió en acetato de etilo, y se lavó con disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico, con disolución acuosa saturada de cloruro sódico, con disolución acuosa al 10% de ácido cítrico y con disolución acuosa saturada de cloruro sódico. La capa orgánica se concentró a presión reducida, y el residuo se lavó con éter diisopropílico y se separó por filtración para producir Boc-Ala-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu-OBzl.

Al igual que en el Ejemplo 24, se obtuvo Boc-Ala-Ala-Ala-OH.

A 3,59 g de Boc-Ala-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu-OBzl, se añadieron 22,2 ml de TFA y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Después de concentrar a presión reducida, se añadieron 1,7 ml de HCl 4,6 N/dioxano, y se añadió éter diisopropílico para solidificar. El sólido se separó por filtración y se secó. Este material se disolvió en 50 ml de DMF, y se añadieron 2,03 g de Boc-Ala-Ala-Ala-OH y 1,06 g de HOObt. Mientras se enfriaba con hielo, se añadieron 1,19 ml de WSCD, y esto se agitó durante 30 minutos y durante otras 14 horas a temperatura ambiente. Después de enfriar la mezcla de reacción, se añadió agua y el gel precipitado se separó por filtración para producir Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu-OBzl.

A una suspensión de 2,00 g de Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu-OBzl y 1,34 ml de anisol, se introdujeron 12 ml de fluoruro de hidrógeno anhidro mientras se agitaba y se enfriaba en un baño de hielo seco y metanol. El material se agitó durante 1 hora con enfriamiento a -5ºC, y a esta temperatura se separó por destilación el fluoruro de hidrógeno. Se añadió éter al residuo, y el sólido precipitado se separó por filtración. El sólido se suspendió en 40 ml de DMF-agua (9:1), y se añadieron 704 mg de Bz-ONSu y 1,03 ml de trietilamina, y se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. Después, se añadieron 40 ml de DMF-agua (9:1), y se agitó toda la noche a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadieron 541 mg de Bz-ONSu, y se agitó toda la noche a temperatura ambiente. Después de concentrar a presión reducida, se añadió acetato de etilo al residuo, se disgregó completamente en un lavador ultrasónico, y se separó por filtración para producir 1,53 g de Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu.

La estructura y la posición marcada con ^{13}C se confirmaron mediante RMN ^{13}C, mediante espectrometría de masas y mediante análisis de aminoácidos.

RMN ^{13}C (DMSO-d6, 270 MHz): 168,2 ppm (^{13}COOH)

PD-MS (m/z): 725,5 (M^{+}+H), 747,8 (M^{+}+Na), 764,3 (M^{+}+K)

Análisis de aminoácidos: fenilalanina 1,00; glicina 1,14; alanina 4,25; leucina 1,07 (condiciones hidrolíticas: HCl 6N, 110ºC, 22 horas).

La sal sódica de Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu se obtuvo neutralizando Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu con un equivalente de carbonato sódico 1 M, seguido de la liofilización.

Ejemplo 27 Preparación de Bz-Tyr-O-(^{13}C-Et)

Después de que se disolvieran 5,31 g de N-t-Boc-O-bencilo-L-tirosina y 3,5 g de 1,2-^{13}C-etanol (Masstrace) en 30 ml de DMF, se añadieron 2,32 g de HOBt, y se añadieron gota a gota 3,14 ml de WSCD con enfriamiento con hielo, seguido de agitación a temperatura ambiente durante 4 horas. Se añadió acetato de etilo, y el material se lavó secuencialmente con agua, con disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico, con disolución acuosa saturada de cloruro sódico, con HCl 1N y con disolución acuosa saturada de cloruro sódico, y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El disolvente se separó por destilación a presión reducida. Mientras se enfriaba a -10ºC, se añadieron 20 ml de TFA al producto oleoso incoloro resultante, seguido de la agitación durante 10 minutos y durante otros 50 minutos a temperatura ambiente. Tras concentrar a presión reducida, se añadieron 3,73 ml de HCl 4,6 N/dioxano, y se añadió éter diisopropílico para solidificar. El residuo se separó por filtración y se lavó adicionalmente con éter diisopropílico. Este residuo se disolvió en 50 ml de DMF, y se añadieron 1,99 ml de cloruro de benzoilo y 4,00 ml de trietilamina mientras se enfriaba a -10ºC. Tras agitar durante 30 minutos y a temperatura ambiente durante otras 3 horas, se añadió acetato de etilo y se lavó secuencialmente con disolución acuosa saturada de cloruro sódico, con disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio, con disolución acuosa saturada de cloruro de sodio, con HCl 1N y con disolución acuosa saturada de cloruro de sodio, y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El disolvente se separó por destilación a presión reducida, y el residuo se lavó con éter y se secó a presión reducida. Este material se recristalizó en metanol para producir Bz-Tyr(Bzl)-O-(^{13}C-Et). Después, se disolvieron 800 mg de Bz-Tyr(Bzl)-O-(^{13}C-Et) en 30 ml de ácido acético, y se añadieron 1600 mg de negro de paladio. Se introdujo gas hidrógeno durante 6 horas mientras se agitó vigorosamente a temperatura ambiente. Se detuvo el gas hidrógeno, y la mezcla de reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente. Se usó un papel de filtro polvoriento para separar por filtración el catalizador, y después el ácido acético se separó por destilación a presión reducida. Se añadió hexano, y la concentración a presión reducida dio un sólido incoloro. Se añadió agua, y el sobrenadante se eliminó repetidamente por decantación. El material se disolvió en disolución acuosa al 20% de acetonitrilo, seguido de liofilización. Este material se sometió a RP-HPLC (YMC A-323 ODS, 30 x 250 mm, CH_{3}CN ac. al 20-50% que contiene 0,1% de TFA (60 minutos), caudal 20 ml/min) para recoger una fracción principal que entonces se liofilizó para producir 350 mg de Bz-Tyr-O-(^{13}C-Et).

La estructura y la posición marcada con ^{13}C se confirmaron mediante RMN ^{13}C y mediante espectrometría de masas.

RMN ^{13}C (CDCl_{3}, 270 MHz): 14,2 ppm (^{13}CH_{3}), 61,6 ppm (^{13}CH_{2})

PD-MS (m/z): 316,2 (M^{+}+H)

Ejemplo 28 Preparación de Bz-Arg-(^{13}C-Leu)\cdotHCl

Al igual que en el Ejemplo 24, se obtuvo TosOH-H-(^{13}C-Leu)-OBzl. Después de que se disolvieran 18,1 g de TosOH-H-(^{13}C-Leu)-OBzl, 14,5 g de hidrocloruro de N-t-Boc-arginina monohidratado (Boc-Arg-HCl\cdotH_{2}O) y 5,95 g de HOBt en 130 ml de DMF, se añadieron 8,4 ml de WSCD mientras se enfriaba a -20ºC, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3,5 horas. Después de que se separó la DMF por destilación, el material se disolvió en acetato de etilo y se lavó con disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio, con disolución acuosa saturada de cloruro sódico, con HCl 0,1 N y con disolución acuosa saturada de cloruro sódico. El material se secó sobre sulfato sódico anhidro. Después de que se separó el acetato de etilo mediante destilación a presión reducida, se añadió hexano para producir un cristal. El cristal se separó por filtración, se lavó con hexano y se secó a presión reducida. El cristal bruto resultante se disolvió en 50 ml de acetonitrilo. A esta disolución se añadió éter diisopropílico para producir un cristal de Boc-Arg-(^{13}C-Leu)-OBzl-TosOH.

A 24,8 g de Boc-Arg-(^{13}C-Leu)-OBzl-TosOH, se añadieron 50 ml de TFA, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, y se concentró a presión reducida. Después de que se añadieron 20 ml de HCl 4,6 N/dioxano, se añadió éter para producir un cristal de un hidrocloruro. El hidrocloruro se separó por filtración y se secó a presión reducida. Al hidrocloruro resultante, se añadieron 5,12 g de ácido benzoico y 5,67 g de HOBt, y la mezcla se disolvió en 110 ml de DMF. A esta disolución se añadieron 7,7 ml de WSCD mientras se enfriaba a -20ºC, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. La disolución de la reacción se concentró, se disolvió en acetato de etilo y se lavó con HCl 0,1 N, con disolución acuosa saturada de cloruro de sodio, y con disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio, para producir un cristal. El cristal se separó por filtración, se lavó con acetato de etilo y con agua, y se disolvió en ácido acético. A esta disolución se añadió éter para producir un producto oleoso incoloro. El producto se disolvió en 250 ml de ácido acético. A esta disolución se añadieron 3 g de paladio sobre carbón. LA mezcla se agitó a temperatura ambiente mientras se introduce hidrógeno gaseoso en ella durante 2 horas. El catalizador se separó por filtración, y el ácido acético se separó por destilación. El residuo se disolvió en 9 ml de HCl 4,6 N/dioxano. Se añadió éter diisopropílico para producir un cristal de 16,4 g de
Bz-Arg-(^{13}C-Leu)\cdotHCl.

RMN ^{13}C (D_{2}O, 270 MHz): 177,5 ppm (^{13}COOH)

ESI-MS (m/z): 393,2 (M^{+}+H)

Análisis de aminoácidos: arginina: 1,00; leucina 1,02 (condiciones hidrolíticas: HCl 6 N, 110ºC, 22 horas)

Ejemplo 29 Ensayo de respiración de Bz-L-Phe-(^{13}C-Leu)

Al igual que en el Ejemplo 15-1, se llevó a cabo un ensayo de respiración de Bz-L-Phe-(^{13}C-Leu) en el que se administró oralmente 250 mg/kg de Bz-L-Phe-(^{13}C-Leu)\cdotNa a las ratas con pancreatitis crónica (n = 4) y a las ratas normales (n = 4), y se midió el grado de aumento (\Delta^{13}C (\textperthousand)) de la concentración de ^{13}CO_{2} en el CO_{2} en la respiración tras la administración. El valor de \Delta^{13}C (\textperthousand) a 10 minutos tras la administración fue 6,97 \pm 6,09\textperthousand en ratas con pancreatitis crónica, y 115,02 \pm 71,26\textperthousand en ratas normales; de este modo, el valor de las ratas con pancreatitis crónica fue significativamente menor que el de las ratas normales (p < 0,05 (ANOVA con LSD de Fischer))
(Tabla 1).

TABLA 1

Ensayo de respiración de Bz-L-Phe-(^{13}C-Leu)
	\Delta^{13}C (\textperthousand) a 10 min
Pancreatitis crónica nº 1	1,61
Pancreatitis crónica nº 2	3,28
Pancreatitis crónica nº 3	17,21
Pancreatitis crónica nº 4	5,77
Normal nº 1	31,29
Normal nº 2	60,25
Normal nº 3	165,37
Normal nº 4	203,16

Se administró oralmente Bz-L-Phe-(^{13}C-Leu)-Na en una cantidad de 250 mg/kg a las ratas con pancreatitis crónica (n = 4) y a las ratas normales (n = 4).

Ejemplo 30 Ensayo de respiración de Bz-Tyr-(^{13}C-Leu)

Al igual que en el Ejemplo 15-1, se llevó a cabo un ensayo de respiración de Bz-Tyr-(^{13}C-Leu) en el que se administraron oralmente 250 mg/kg de Bz-Tyr-(^{13}C-Leu)\cdotNa a las ratas con pancreatitis crónica (n = 4) y a las ratas normales (n = 4), y se midió el grado de aumento (\Delta^{13}C (\textperthousand)) de la concentración de ^{13}CO_{2} en el CO_{2} exhalado, tras la administración. El valor de \Delta^{13}C (\textperthousand) a 20 minutos tras la administración fue 3,66 \pm 3,24\textperthousand en las ratas con pancreatitis crónica, y 69,53 \pm 32,50\textperthousand en ratas normales; de este modo, el valor de las ratas con pancreatitis crónica fue significativamente menor que el de las ratas normales (p < 0,05 (ANOVA con LSD de Fischer)) (Tabla 2).

TABLA 2

Ensayo de respiración de Bz-Tyr-(^{13}C-Leu)
	\Delta^{13}C (\textperthousand) a 20 min
Pancreatitis crónica nº 1	8,76
Pancreatitis crónica nº 2	3,58
Pancreatitis crónica nº 3	2,44
Pancreatitis crónica nº 4	-0,15
Normal nº 1	111,32
Normal nº 2	65,76
Normal nº 3	21,02
Normal nº 4	80,02

Se administró oralmente Bz-Tyr-(^{13}C-Leu)\cdotNa en una cantidad de 250 mg/kg a las ratas con pancreatitis crónica
(n = 4) y a las ratas normales (n = 4).

Ejemplo 31 Ensayo de respiración de Arg-(^{13}C-Leu)

Al igual que en el Ejemplo 15-1, se llevó a cabo un ensayo de respiración de Arg-(^{13}C-Leu) en el que se administraron oralmente 30 mg/kg de Arg-(^{13}C-Leu) a las ratas con pancreatitis crónica (n = 4) y a las ratas normales (n = 4), y se midió el grado de aumento (\Delta^{13}C (\textperthousand)) de la concentración de ^{13}CO_{2} en el CO_{2} exhalado, tras la administración. El valor de \Delta^{13}C(\textperthousand) a 30 minutos tras la administración fue 4,37 \pm 1,83\textperthousand en las ratas con pancreatitis crónica, y 12,37 \pm 2,26\textperthousand en ratas normales; de este modo, el valor de las ratas con pancreatitis crónica fue significativamente menor que el de las ratas normales (p < 0,01 (ANOVA con LSD de Fischer)) (Tabla 3).

TABLA 3

Ensayo de respiración de Arg-(^{13}C-Leu)
	\Delta^{13}C (\textperthousand) a 30 min
Pancreatitis crónica nº 1	3,74
Pancreatitis crónica nº 2	6,97
Pancreatitis crónica nº 3	4,87
Pancreatitis crónica nº 4	1,92
Normal nº 1	10,30
Normal nº 2	13,74
Normal nº 3	15,37
Normal nº 4	10,08

Se administró oralmente Arg-(^{13}C-Leu) en una cantidad de 30 mg/kg a las ratas con pancreatitis crónica (n = 4) y a las ratas normales (n = 4).

Ejemplo 32 Ensayo de respiración de Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu

Al igual que en el Ejemplo 15-1, se llevó a cabo un ensayo de respiración de Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu en el que se administraron oralmente 420 mg/kg de Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu\cdotNa a las ratas con pancreatitis crónica (n = 2) y a las ratas normales (n = 2), y se midió el grado de aumento (\Delta^{13}C (\textperthousand)) de la concentración de ^{13}CO_{2} en el CO_{2} exhalado, tras la administración. El valor de \Delta^{13}C(\textperthousand) a 15 minutos tras la administración fue 0,61\textperthousand en las ratas con pancreatitis crónica, y 33,32\textperthousand en ratas normales; de este modo, el valor de las ratas con pancreatitis crónica fue significativamente menor que el de las ratas normales (Tabla 4).

TABLA 4

Ensayo de respiración de Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu
	\Delta^{13}C (\textperthousand) a 15 min
Pancreatitis crónica nº 1	-1,90
Pancreatitis crónica nº 2	3,12
Normal nº 1	23,47
Normal nº 2	43,16

Se administró oralmente Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-(^{13}C-Gly)-Phe-Leu-Na en una cantidad de 420 mg/kg a las ratas con pancreatitis crónica (n = 2) y a las ratas normales (n = 2).

Ejemplo 33 Ensayo de respiración de Bz-Arg-(^{13}C-Leu)

Al igual que en el Ejemplo 15-1, se llevó a cabo un ensayo de respiración de Bz-Arg-(^{13}C-Leu) en el que se administraron oralmente 100 mg/kg de Bz-Arg-(^{13}C-Leu)\cdotHCl a las ratas con pancreatitis crónica (n = 3) y a las ratas normales (n = 3), y se midió el grado de aumento (\Delta^{13}C (\textperthousand)) de la concentración de ^{13}CO_{2} en el CO_{2} exhalado, tras la administración. El valor de \Delta^{13}C (\textperthousand) a 20 minutos tras la administración fue 3.05 \pm 6,97\textperthousand en las ratas con pancreatitis crónica, y 68,77 \pm 12,01\textperthousand en ratas normales; de este modo, el valor de las ratas con pancreatitis crónica fue significativamente menor que el de las ratas normales (p < 0,01 (ANOVA con LSD de Fischer)) (Tabla 5).

TABLA 5

Ensayo de respiración de Bz-Arg-(^{13}C-Leu)
	\Delta^{13}C (\textperthousand) a 20 min
Pancreatitis crónica nº 1	3,69
Pancreatitis crónica nº 2	11,25
Pancreatitis crónica nº 3	-5,79
Normal nº 1	51,94
Normal nº 2	74,46
Normal nº 3	79,91

Ejemplo 1 de formulación

Líquido para uso interno

Se añadió agua pura a 5 partes en peso de Bz-DL-Phe-(^{13}C-Leu)\cdotNa para producir un total de 100 partes en peso, y esta cantidad total se disolvió y se esterilizó a través de un filtro Millipore. El filtrado se recogió en una botella de vial, y se cerró herméticamente para producir un líquido para uso interno.

Ventajas de la invención

La presente invención proporciona un método de ensayo de la función exocrina pancreática altamente sensible que proporciona poco estrés a un sujeto, y da resultados exactos pronto.

Los ensayos simples convencionales para la función exocrina pancreática son menos sensibles y por lo tanto se han usado menos como ensayos de diagnóstico para la pancreatitis, y actualmente se han utilizado generalmente para el seguimiento del pronóstico de la pancreatitis, lo cual siempre necesita ensayos repetidos. Sin embargo, un ensayo simple muy sensible para la función exocrina pancreática se utilizaría a menudo en el diagnóstico de la pancreatitis en un examen físico. Además, se aplicaría para evaluar la seriedad de la pancreatitis crónica, el preconocimiento del inicio de la pancreatitis fulminante seria con una mortalidad todavía elevada (30%), el diagnóstico de las causas de la pancreatitis, y el diagnóstico prematuro del cáncer pancreático. También sería útil como un método de diagnóstico para descartar la pancreatitis en un examen médico de pacientes ambulatorios generales.

Claims

1. Uso de un aminoácido o un péptido que contiene al menos un átomo de ^{13}C o ^{14}C, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo distinto de Bz-Tyr-^{13}C-PABA en la fabricación de un agente de diagnóstico para la función exocrina pancreática, en el que el agente de diagnóstico se usa en un ensayo de respiración.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la molécula de aminoácido contiene un átomo de ^{13}C o ^{14}C.

3. Uso según la reivindicación 1, en el que el aminoácido o péptido tiene un grupo modificador o protector, y el grupo modificador o protector contiene un átomo de ^{13}C o ^{14}C.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el aminoácido o péptido está representado por la siguiente fórmula (I):

(I)X_{1}-R_{1}-Y_{1}

en la que

X_{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo protector,

Y_{1} es un aminoácido que tiene opcionalmente un grupo protector.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que al menos uno de los aminoácidos en R_{1} e Y_{1}, o al menos un grupo éster en Y_{1} cuando el aminoácido en Y_{1} está protegido con el grupo éster, está marcado con ^{13}C o ^{14}C.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el aminoácido o péptido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es capaz de ser un sustrato de una proteasa o proteasas, de forma que sea capaz subsiguientemente de ser descarboxilada para generar ^{13}C o ^{14}C.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que la proteasa o proteasas son proteasas exocrinas pancreáticas.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que la proteasa o proteasas exocrinas pancreáticas se seleccionan del grupo que consiste en quimiotripsina, tripsina, elastasa, y carboxipeptidasas.

9. Compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, o una sal del mismo, para uso en diagnóstico

en el que el compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C está representado por la siguiente fórmula (II):

(II)X_{2}-R_{2}-Y_{2}-Z_{1}

en la que

X_{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo protector,

Y_{2} es un aminoácido,

y en el que

: 1-i) cuando Z_{1} es D-Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de D-Ala,

: 1-ii) cuando Z_{1} es Ala-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 1-iii) cuando Z_{1} es Pro-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

\newpage

: 2-i) cuando Z_{1} es D-Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de Val,

: 2-ii) cuando Z_{1} es Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 2-iii) cuando Z_{1} es Gly-OEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

: 4-i) cuando Z_{1} es Pro, Y_{2} es un aminoácido distinto de Ala,

: 4-iii) cuando Z_{1} es Phe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 4-iv) cuando Z_{1} es Gly-OEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 4-v) cuando Z_{1} es Ala-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 5-i) cuando Z_{1} es Leu, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

: 5-ii) cuando Z_{1} es Phe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

: 5-iii) cuando Z_{1} es Gly, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 5-iv) cuando Z_{1} es Pro, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 5-v) cuando Z_{1} es Met, Y_{2} es un aminoácido distinto de Asp,

: 5-vi) cuando Z_{1} es Asn-Bzl, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 6-i) cuando Z_{1} es Leu, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 6-ii) cuando Z_{1} es Ser, Y_{2} es un aminoácido distinto de Asp, y

: 7-i) cuando Z_{1} es Leu, Y_{2} es un aminoácido distinto de Phe,

: 7-ii) cuando Z_{1} es Met, Y_{2} es un aminoácido distinto de Phe;

con la condición de que se excluyan los siguientes compuestos:

10. Compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C, o una sal del mismo, para uso en el diagnóstico según la reivindicación 9, en el que

: 1-i) cuando Z_{1} es D-Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de Val,

: 1-ii) cuando Z_{1} es Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 1-iii) cuando Z_{1} es Gly-OEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

2) en el caso en el que X_{2} sea Ac o Boc, y R_{2} sea un enlace sencillo,

: 2-i) cuando Z_{1} es D-Ala, Y_{2} es un aminoácido distinto de D-Ala,

: 2-ii) cuando Z_{1} es Pro-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 2-iii) cuando Z_{1} es Ala-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 3-ii) cuando Z_{1} es Phe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Pro,

: 3-iii) cuando Z_{1} es Gly, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 3-iv) cuando Z_{1} es Pro, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 3-v) cuando Z_{1} es Met, Y_{2} es un aminoácido distinto de Asp y Phe,

: 3-vi) cuando Z_{1} es Asn-Bzl, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu,

: 3-vii) cuando Z_{1} es Ser, Y_{2} es un aminoácido distinto de Asp, y

: 4-i) cuando Z_{1} es Pro, Y_{2} es un aminoácido distinto de Ala,

: 4-iii) cuando Z_{1} es Phe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 4-iv) cuando Z_{1} es Gly-OEt, Y_{2} es un aminoácido distinto de Gly,

: 4-v) cuando Z_{1} es Ala-OMe, Y_{2} es un aminoácido distinto de Leu.

11. Compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C o una sal del mismo para uso en el diagnóstico según la reivindicación 9 o 10, en el que X_{2} se selecciona del grupo que consiste en Ac, Bz (benzoilo), Boc, Z y un átomo de hidrógeno.

12. Compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C o una sal del mismo para uso en el diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el compuesto o una sal del mismo es capaz de ser un sustrato de una proteasa o proteasas, de forma que sea capaz subsiguientemente de ser descarboxilada para generar ^{13}C o ^{14}C.

13. Compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C o una sal del mismo para uso en el diagnóstico según la reivindicación 12, en el que la proteasa o proteasas son proteasas exocrinas pancreáticas.

14. Compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C o una sal del mismo para uso en el diagnóstico según la reivindicación 13, en el que la proteasa o proteasas exocrinas pancreáticas se seleccionan del grupo que consiste en quimiotripsina, tripsina, elastasa, y carboxipeptidasas.

15. Compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C o una sal del mismo para uso en el diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que X_{2} es un un grupo protector y R_{2} es un enlace sencillo.

16. Compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C o una sal del mismo para uso en el diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en el que

(1) al menos uno de los aminoácidos en Y_{2} y Z_{1} es Arg o Lys,

(2) al menos uno de los aminoácidos en Y_{2} y Z_{1} es un aminoácido aromático, Leu, His o Met,

(3) al menos uno de los aminoácidos en Y_{2} y Z_{1} es un aminoácido neutro y no aromático,

(4) el aminoácido en Z_{1} es un aminoácido distinto de Arg, Lys y Pro, o

(5) el aminoácido en Z_{1} es Arg o Lys.

17. Compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C o una sal del mismo para uso en el diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, en el que X_{2} se selecciona del grupo que consiste en un átomo de hidrógeno, Bz, Ac y Boc, Y_{2} se selecciona del grupo que consiste en Phe, Ala, Gly, Tyr y Arg, Z_{1} se selecciona del grupo que consiste en Leu que tiene opcionalmente un grupo protector, Ala que tiene opcionalmente un grupo protector, y Gly que tiene opcionalmente un grupo protector.

18. Compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C o una sal del mismo para uso en el diagnóstico según la reivindicación 17, en el que Z_{1} se selecciona del grupo que consiste en Leu, Ala, Gly, Leu-OMe, Leu-OEt, Ala-OMe, Ala-OEt, Gly-OMe y Gly-OEt.

19. Compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C o una sal del mismo para uso en el diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, en el que Z_{1} es un aminoácido marcado con ^{13}C o ^{14}C que tiene opcionalmente un grupo protector.

20. Compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C o una sal del mismo para uso en el diagnóstico según la reivindicación 9, se selecciona del grupo que consiste en los siguientes compuestos:

(a): Phe-^{13}C-Leu,

(b): Arg-^{13}C-Leu,

(c): Bz-Ala-^{13}C-Ala,

(d): Bz-Gly-^{13}C-Leu,

(e): Bz-Phe-^{13}C-Gly,

(f): Bz-Tyr-^{13}C-Leu,

(g): Bz-Phe-^{13}C-Leu,

(h): Bz-(DL)Phe-^{13}C-Leu,

(j): Bz-Arg-^{13}C-Leu,

(k): Ac-Phe-^{13}C-Leu,

(l): Ac-Tyr-^{13}C-Leu,

(m): Bz-Ala-^{13}C-Ala-OMe,

(n): Bz-Gly-^{13}C-Leu-OMe,

(o): Bz-Phe-^{13}C-Gly-OMe,

(p): Bz-Phe-^{13}C-Leu-OMe,

(q): Bz-(DL)Phe-^{13}C-Leu-OMe,

(r): Ac-Phe-^{13}C-Leu-OMe,

(s): Ac-Tyr-^{13}C-Leu-OMe,

(t): Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-^{13}C-Leu,

(u): Boc-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Phe-^{13}C-Leu, y

(v): Bz-Ala-Ala-Ala-Ala-^{13}C-Gly-Phe-Leu.

21. Uso de un compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un agente de diagnóstico de la función exocrina pancreática, en el que el agente de diagnóstico se usa en un ensayo de respiración.

22. Uso de un compuesto marcado con ^{13}C o ^{14}C según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un agente de diagnóstico de pancreatitis crónica o pancreatitis aguda.