ES2248808T3

ES2248808T3 - Anticuerpos monoclonales reactivos con la cetp humana y metodo de cuantificacion.

Info

Publication number: ES2248808T3
Application number: ES96912292T
Authority: ES
Inventors: Masafumi Japan Tobacco Inc. KAMADA; Hiroshi Japan Tobacco Inc. OKAMOTO; Takuya Japan Tobacco Inc. TAMATANI
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1995-05-02
Filing date: 1996-05-01
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2016-05-01
Also published as: IL118069A0; AU5515696A; IN188167B; EP0825259A1; US6410020B1; IL118069A; EP0825259B1; EP0825259A4; WO1996034948A1; CA2219947C; KR100244573B1; KR19990008283A; DE69635017T2; US6140474A; DE69635017D1; CA2219947A1

Abstract

SE DESCRIBE UN ANTICUERPO MONOCLONAL QUE POSEE UNA AVIDEZ MUY ESPECIFICA POR CETP DE ORIGEN HUMANO (ACTIVIDAD INHIBIDORA DE CETP) Y QUE RESULTA UTIL COMO REACTIVO PARA CUANTIFICAR Y PURIFICAR CETP DEORIGEN HUMANO Y COMO PROFILACTICO O REMEDIO PARA LA HIPERLIPEMIA Y LA ARTERIOESCLEROSIS; Y PROCEDIMIENTOS PARA CUANTIFICAR Y PURIFICAR CETP DE ORIGEN HUMANO. EL ANTICUERPO PERMITE QUE SE CUANTIFIQUE CON FACILIDAD EL CETP DE ORIGEN HUMANO CONTENIDO EN UNA MUESTRA CON UNA ELEVADA SENSIBILIDAD SIN LA NECESIDAD DE TRATAR LA MUESTRA CON CALOR O TENSIOACTIVOS. COMO EL ANTICUERPO POSEE UNA ACTIVIDAD INHIBIDORA DE CETP TAN ELEVADA, RESULTA UTIL COMO MEDICINA PARA TRATAR O PREVENIR DIVERSAS ENFERMEDADES, TALES COMO LA HIPERLIPEMIA, LA LIPOPROTEINEMIA DE DENSIDAD HIPER RTERIOESCLEROSIS.

Description

Anticuerpos monoclonales reactivos con la CETP humana y método de cuantificación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal reactivo a la proteína humana de transferencia de éster colesterol (CETP, por las siglas de la expresión inglesa, Cholesterol Ester Transfer Protein), un anticuerpo monoclonal y su fragmento reactivo a CETP humana, un anticuerpo monoclonal inmovilizado, un fragmento de anticuerpo monoclonal inmovilizado y un anticuerpo monoclonal marcado, un conjunto de detección, ensayo, separación o purificación de CETP humana, un método para la detección, ensayo, separación y purificación de CETP humana y una composición farmacéutica que contiene dicho anticuerpo monoclonal o dicho fragmento de anticuerpo.

Antecedentes de la invención

Existen tres tipos de colesterol, el tipo libre, el tipo de ácido graso de cadena larga en todos los tejidos y el plasma sanguíneo. Los dos últimos juegan un papel importante en la formación de las membranas celulares. El último es fisiológicamente inactivo y existe principalmente en forma de almacenamiento. Los colesteroles en un cuerpo son derivados de la ingestión en el intestino delgado o de la biosíntesis en varios tejidos, especialmente en el hígado. La mayoría de los colesteroles son derivados desde la biosíntesis en el hígado.

El colesterol libre biosintetizado y secretado por el hígado se incorpora como lipoproteína de muy baja densidad (VLDL). Luego, por las acciones de la lipasa lipoproteína (LPL) y la lipasa triglicérido hepática (HTGL), se metaboliza a lipoproteína de baja densidad (VLDL) lipoproteína de densidad intermedia (IDL). Por la incorporación dentro de células periféricas, receptores de LDL, se proporciona colesterol libre a las células.

Existe una vía desde las células periféricas al hígado llamado sistema de transferencia reverso de colesterol, que entra en reverso desde el hígado a las células periféricas, como se menciono anteriormente. El colesterol libre sobrante que se proporciona a las células periféricas desde el hígado es arrastrado por la lipoproteína de alta densidad (HDL) en sangre. Luego, por la acción de la aciltransferasa de lecitina-colesterol (LCAT), se convierte a éster de colesterol y se almacena en lipoproteína de alta densidad (HDL) en la sangre. Por la acción de la proteína de transferencia de éster colesterol (CETP), el éster colesterol se almacena en HDL y es transferido a VLDL, IDL ó LDL en sangre. Por la incorporación de VLDL, IDL ó LDL recibe el éster colesterol a través de receptores de LDL en el hígado, el colesterol se transfiere indirectamente al hígado.

Recientemente, el sistema de transferencia de colesterol reverso ha atraído mucha atención como un mecanismo para prevenir que las células periféricas acumulen colesterol y prevenir así la aterosclerosis. De hecho, como el HDL que tiene un papel importante en el sistema de transferencia de colesterol reverso, muchas encuestas epidemiológicas muestran que el decrecimiento del éster de colesterol HDL en sangre es uno de los factores de riesgo de los trastornos de arteria coronarios. Es ahora bien reconocido que el HDL es una lipoproteína que tiene una acción antiarteriosclerosis.

Además de la importancia de HDL en sangre, se reconoce que CETP es también importante porque media la transferencia del éster de colesterol en HDL en LDL de sangre. Por lo tanto, se vuelve un tema urgente el aclarar la relación entre CETP y varias enfermedades tales como la deficiencia en CETP, hiperlipemia, hiperalfalipoproteínemia, hipercolesterolemia, hipolipemia, arteriosclerosis, diabetes y síndrome nefrótico.

Por ejemplo, esta experimentalmente demostrado que es secretado unas varias veces CETP superior en sangre de los pacientes con hiperlipemia comparado con algunos voluntarios sanos. En relación con la arteriosclerosis ha sido demostrado lo siguiente. Cuando la actividad CETP es baja, la arteriosclerosis no es producida fácilmente y el estándar de colesterol de HDL es alto. Por el contrario, cuando la actividad de CETP es alta, la arteriosclerosis es producida fácilmente y el estándar de colesterol de HDL es bajo. Tales relaciones son demostradas experimentalmente (Current Therapy, vol. 7, 9: 36-45 (1989)).

Para aclarar la relación entre varias enfermedades y CETP, métodos de ensayos para CETP en fluidos corporales tales como plasma sanguíneo de personas sanas o de pacientes que tienen varias enfermedades descritas arriba, especialmente los métodos de inmunoensayos tales como radioinmunoensayo (RIA) usando un anticuerpo monoclonal para CETP (anticuerpo monoclonal anti-CETP), o ensayo inmunoenzimático (EIA, ELISA) están siendo desarrollados con un anticuerpo monoclonal anti-CETP usado en los métodos de ensayos.

Respecto al ensayo EIA (ELISA), con el anticuerpo monoclonal anti-CETP por ejemplo, Imai et al. (Japanese Unexamined Patent Publicación No. HEI6-169793), Nakano, et al.,(Arteriosclerosis, vol. 19, 11:951, No. 22, (1991)), Takahama, et al. (Arteriosclerosis, vol. 20, 10:837, No. 135, (1992)), Sato, et al. (Arteriosclerosis, vol. 20, 10:836, No. 134, (1992)), H. Mezdur, et al.(Clinical Chemistry, vol. 40, 4:593-597(1994)) Clark et al. (Journal of Lipid Research, vol. 36,:876-889 (1995)) han informado sobre el método de ELISA "sándwich" usando dos clases de anticuerpos monoclonales anti-CETP o su Fab'.

Sin embargo, estos métodos de ensayos requieren de una manipulación complicada. Antes del ensayo, la muestra de plasma tiene que ser tratada con calor a 95-100ºC y/ó pretratadas con agentes tensioactivos de superficie (detergentes surfactantes) tales como TWEEN 20^{TM} y Triton X-100^{TM}. Desde que el tratamiento por calor de una muestra de plasma causa la desnaturalización de la CETP en la muestra, el ensayo solamente da como resultado la cantidad de CETP desnaturalizada. Por lo tanto, es imposible analizar con exactitud la CETP intacta en una muestra de plasma.

También, R Clark et al. (FASEB Journal, vol. 8, 7: A1343 No. 495(1994)), Takahashi et al. (Arteriosclerosis, vol. 20, 10:837 No. 136 (1992) y Ibíd. vol. 21, 3: 209 No. 97 (1993)), Kanamitu et al. (Ibíd. vol. 21, 3:209 No. 98 (1993)), Waki et al. (Ibíd. vol. 22, 5:441 No. 194 (1994)) informan sobre los resultados de ensayo sobre CETP en plasma sanguíneo por ELISA que, sin embargo, no se describen en detalle los métodos de preparación y las propiedades de anticuerpos anti-CETP y los procedimientos específicos de los ensayos.

Respecto a los métodos de ensayo RIA con un anticuerpo monoclonal anti-CETP, Fukazawa et al. (Study on lipid biochemistry, vol. 34:163-166(1992)), Y. Marcel et al. (J. Clin. Invest., vol. 85:10-17 (1990) y Adv. Exp. Med. Biol., vol. 243: 225-230 (1988)), Fukazawa et al. (J. Biochem., vol. 111:696-698(1992)), J. Koizumi et al. (Atherosclerosis, 90:189-196(1991), M. Brown et al. (Nature, vol. 342: 448-451(1989)) y V. Dangremont et al. (Clinica Chimica Acta, vol. 231: 147-160 (1994)) existen reportes publicados al respecto.

Sin embargo, estos métodos RIA también tienen defectos como los que tiene el método de EIA (ELISA). Los defectos están en la complejidad de su manipulación (los métodos requieren pretratamiento de la muestra de plasma con un detergente) y/o la sensibilidad insuficiente para la detección.

Como se describe arriba, muchos investigadores han tratado de establecer un método de ensayo para CETP. Sin embargo, no hay existen reportes de un sistema conveniente y sensible que no necesite de ningún pretratamiento de la muestra y que determine la cantidad de CETP intacta convenientemente con una alta sensibilidad.

Para dilucidar la relación entre las enfermedades (como la arteriosclerosis, hiperlipemia hiperalfalipoproteínemia e hipercolesterolemia) y CETP que tiene un papel importante en el sistema de transferencia reversa de colesterol, el que puede estar muy relacionado con el inicio de las enfermedades, existe una razón fuerte para desarrollar un método de ensayo simple y sensible que pueda ser ampliamente aplicable para propósitos clínicos para examinar CETP intacta en los fluidos corporales incluyendo el plasma sanguíneo de personas sanas o cualquier paciente, y para desarrollar un anticuerpo monoclonal útil para expresar en el método de ensayo: Sin embargo, todavía no han sido establecidos. La presente invención proporciona un método de ensayo extensamente aplicable para los propósitos clínicos y un anticuerpo monoclonal anti-CETP humana, el que es muy útil no solamente como se dice como método del ensayo sino también como un reactivo para la separación y la purificación de CETP como un producto farmacéutico.

Sumario de la invención

Los inventores de la presente invención investigaron los métodos de ensayos para CETP en el fluido corporal humano que puede ser extensamente aplicable para los propósitos clínicos en los anticuerpos monoclonales en contra de las CETP humanas usados para dichos métodos de ensayo; y, usando CETP humana purificada biológicamente activa como un inmunógeno, los inventores consiguieron preparar tres anticuerpos monoclonales anti-CETP humana que tienen diferente especificidad ligante (alta actividad inhibidora CETP) respectivamente a CETP humana, especialmente a CETP intacta en el fluido corporal humano.

Más aún, cuando los tres anticuerpos monoclonales anti-CETP humana tienen alta especificidad ligante (actividad inhibidora de CETP) a CETP humana, especialmente en CETP intacta en el fluido corporal humano, los inventores han encontrado que, para el ensayo de CETP intacta en el fluido corporal humano (plasma sanguíneo, etc.), el inmunoensayo usando anticuerpos monoclonales anti-humanos CETP de la presente invención pueden proporcionar un simple y sensible método de ensayo que no se había establecido anteriormente.

Particularmente, como los tres anticuerpos monoclonales CETP anti-humano tienen alta especificidad ligante, pero diferente (actividad inhibidora de CETP) a CETP humana (-especialmente al CETP intacta en el fluido corporal humano), usando una combinación de cualquiera de los dos de dichos tres anticuerpos monoclonales para ELISA "sándwich", los inventores han logrado desarrollar un método más simple y más sensible de ensayo extensamente aplicable a los propósitos clínicos.

Cuando los anticuerpos monoclonales CETP anti-humano tienen alta especificidad ligante (actividad inhibidora de CETP) a CETP humana (especialmente a CETP intacta en el fluido corporal humano), usando los anticuerpos monoclonales de la invención, es posible el ensayo de CETP humana, simple y sensiblemente, sin cualquier pretratamiento como el calor o tratamiento con detergente a una muestra de plasma.

Además, como los anticuerpos monoclonales anti-CETP humana de la invención tienen alta actividad inhibidora CETP, son útiles para los fármacos para el tratamiento o la prevención de diversas enfermedades causadas por una dinámica anormal de CETP como la arteriosclerosis, alta hiperlipemia HDL en sangre y alta hipercolesterolemia en sangre.

La presente solicitud se refiere a los siguientes aspectos:

El primer aspecto es un anticuerpo monoclonal que tiene por lo menos las siguientes características:

(a): reactivo CETP de plasma de un humano sano, pacientes de hiperlipemia, pacientes deficientes en LCAT (por las siglas de la expresión inglesa, Lecithin Cholesterol Acil Transferase) o pacientes de hiper HDL (lipoproteína de alta densidad).

(b): No es reactiva al CETP de conejo en una concentración de 3 \mug/ml o inferior.

(c): No es específicamente reactiva a CETP humana desnaturalizada.

El segundo aspecto son los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales reactivos al CETP humana, y más específicamente, los hibridomas \alm{1} 72-1 y \alm{1} 86-2 identificados por los Número de acceso FERM BP-4944 y FERM BP-4945 respectivamente.

El tercer aspecto son los anticuerpos monoclonales reactivos a la CETP humana, y más específicamente los anticuerpos monoclonales \alm{1} 72-1 y \alm{1} 86-2, que son derivados respectivamente de los hibridomas \alm{1} 72-1 y \alm{1} 86-2 identificados por los números de acceso FERM BP-4944 y FERM BP–4945 respectivamente.

El cuarto aspecto es un anticuerpo monoclonal quimérico recombinante reactivo a CETP humana, que comprende una región variable suya derivada del anticuerpo monoclonal anteriormente mencionado y una región constante derivada de inmunoglobulina humana.

El quinto aspecto es un anticuerpo monoclonal reactivo recombinante humanizado para CETP humana, en el cual una parte de todas las regiones determinantes complementarias de una región hipervariable es derivada del anticuerpo monoclonal antes mencionado, las regiones de la estructura de la región hipervariable son derivadas de inmunoglobulina humana, y la región constante es derivada de inmunoglobulina humana.

El sexto aspecto es un fragmento anticuerpo llamado F(ab')_{2} ó Fab' derivada de un anticuerpo monoclonal mencionado más arriba. El anticuerpo monoclonal quimérico recombinante antes mencionado es el anticuerpo monoclonal humanizado recombinante.

El séptimo aspecto es un anticuerpo monoclonal inmovilizado y un fragmento de anticuerpo inmovilizado. El anticuerpo monoclonal inmovilizado es preparado por inmovilización del anticuerpo monoclonal, el anticuerpo monoclonal quimérico recombinante o el anticuerpo monoclonal recombinante humanizado o un portador insoluble.

Más específicamente, el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el anticuerpo inmovilizado sobre el que el fragmento ha sido inmovilizado en una placa, tubo de ensayo, probeta, tubo, cuentas, pelotas, filtros, membrana o portador insoluble usando columna de cromatografía de afinidad.

El octavo aspecto es un anticuerpo monoclonal marcado con un fragmento anticuerpo. El anticuerpo monoclonal marcado es preparado marcando el anticuerpo monoclonal, el anticuerpo monoclonal quimérico recombinante o anticuerpo monoclonal recombinante humanizado con una sustancia capaz de proporcionar señales detectables por separado o por reacción con otra sustancia. El fragmento de anticuerpo marcado es preparado marcando el fragmento de anticuerpo F(ab')_{2} ó Fab' con una sustancia capaz de proporcionar señales detectables independientes ó por reacción con otra sustancia.

Más específicamente, son un anticuerpo monoclonal marcado o un fragmento de anticuerpo marcado con una enzima, o un material fluorescente, un material quimiluminiscente, biotina, avidina o radioisótopos.

El noveno aspecto es un conjunto de ensayo o la detección de CETP humana que comprende al menos el anticuerpo monoclonal, anticuerpo monoclonal quimérico recombinante o el anticuerpo monoclonal recombinante humanizado, el fragmento de anticuerpo monoclonal arriba mencionado o F(ab')_{2} ó Fab', el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado, o el anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de anticuerpo marcado.

Específicamente, un conjunto para ensayo o detección de CETP humana que comprende un anticuerpo monoclonal inmovilizado o un fragmento del anticuerpo inmovilizado y el anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de anticuerpo marcado.

El décimo aspecto es un método de ensayo y detección de CETP humana por un inmunoensayo caracterizado por el uso al menos de un anticuerpo monoclonal, el anticuerpo monoclonal quimérico recombinante, el anticuerpo monoclonal quimérico recombinante humanizado, el fragmento de anticuerpo F(ab')_{2} ó Fab', el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el anticuerpo inmovilizado, o el anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de anticuerpo marcado.

El primer aspecto específico es un método para ensayo o detección de CETP humana por inmunoensayo que comprende al menos los siguientes pasos:

(A) Reacción de una muestra con el anticuerpo monoclonal inmovilizado antes mencionado ó fragmento de anticuerpo inmovilizado; y

(B) Reacción del anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de anticuerpo marcado con un complejo antígeno-anticuerpo que es formado por la unión de CETP humana en la muestra con el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado.

El segundo aspecto específico es un método de ensayo ó detección de CETP humana por inmunoensayo que comprende al menos los siguientes pasos:

(a) Hacer reaccionar una muestra con el anticuerpo monoclonal marcado antes mencionado o el fragmento de anticuerpo marcado; y

(b) Reacción del anticuerpo monoclonal inmovilizado antes mencionado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado con un complejo de antígeno-anticuerpo que es formado por CETP humana unida a la muestra con el anticuerpo monoclonal marcado o un fragmento del anticuerpo monoclonal marcado.

El tercer aspecto específico es un método de ensayo o detección de CETP humana por inmunoensayo que comprende al menos los siguientes pasos:

(a) hacer reaccionar una mezcla que comprende el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado, el anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de anticuerpo marcado y una muestra.

El cuarto aspecto específico es un método por ensayo o detección de CETP humana por inmunoensayo que comprende al menos los siguientes pasos:

(a) hacer reaccionar una muestra y el estándar de CETP humana marcada con una sustancia de marcado capaz de suministrar señales detectables por separado o por reacción con el anticuerpo monoclonal inmovilizado de más arriba o el fragmento inmovilizado.

El quinto aspecto específico es un método ensayo o detección de CETP humana por inmunoensayo que comprende al menos los siguientes paso (a) o pasos siguientes (b) y (c):

(a) Hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal antes mencionado o fragmento de anticuerpo con una mezcla de la muestra con el estándar de CETP humana, el que está preparado por marcado con una sustancia capaz de proporcionar señales detectables independientes o reaccionando con otras sustancias;

(b) Hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal antes mencionado o el fragmento de anticuerpo con una muestra:

(c) seguido por el paso (b), hacer reaccionar el estándar de CETP humana marcado con la mezcla de reacción del paso (b), en que la CETP humana marcada es preparada marcando una sustancia capaz de proporcionar señales detectables por separado con otras sustancias.

Más específicamente, un método de ensayo o detección de CETP humana por inmunoensayo que comprende al menos los siguientes pasos (a) y (d), o pasos (b) para (d):

(a) Reacción del anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo de la presente invención con una mezcla de una muestra y el estándar de CETP humana el que es preparado marcando una sustancia capaz de proporcionar señales detectables independientes o por reacción con otras sustancias.

(b) Reacción del anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo de la presente invención con la muestra.

(c) Seguido por el paso (b), reaccionando el estándar de CETP humana con la mezcla de reacción del paso (b); en el que el estándar de CETP humana marcada es preparado marcando una sustancia capaz de proporcionar señales detectables independientes o por reacción con otras sustancias:

(d) Reacción de un anti-suero derivado desde reactivo desde mamífero por anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo con un complejo de antígeno-anticuerpo, el que es formado por la unión del estándar de CETP humana con el anticuerpo monoclonal ó el fragmento de anticuerpo.

El decimoprimero aspecto es un conjunto para la separación o la purificación de CETP humana que comprende el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento inmovilizado.

El decimosegundo aspecto es un método para la separación o la purificación de CETP humana por cromatografía de afinidad usando el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado. Más específicamente, es un método de purificación para CETP humana usando cromatografía de afinidad en columna.

El decimotercero aspecto es un compuesto farmacéutico que comprende cualquiera de uno de los anticuerpos monoclonales, el anticuerpo monoclonal quimérico recombinante, el anticuerpo monoclonal recombinante humanizado o el fragmento de anticuerpo F(ab')_{2} ó Fab', un portador aceptable farmacéutico. Más específicamente, es una composición de farmacéutica para tratar y/o prevenir perlipemia o arteriosclerosis.

Descripción breve de los dibujos

La Fig. 1 muestra un cromatograma de CETP humana por cromatografía de columna de PHENYL SEPHAROSE.

La Fig. 2 muestra un cromatograma de CETP humana por cromatografía de columna de RESOURCE Q^{TM}.

La Fig. 3 muestra un cromatograma de CETP humana por cromatografía de afinidad en columna usando el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1,

La Fig. 4 muestra una electroforesis de CETP humana purificada por cromatografía de afinidad en columna con el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1 mostrando el peso molecular.

La Fig. 5 muestra la reactividad de los anticuerpos monoclonales, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, y \alm{1} 176-1 para CETP humana purificada.

La Fig. 6 muestra un cromatograma de CETP de conejo por cromatografía en columna de PHENYL SEPHA- ROSE^{TM}.

La Fig. 7 muestra un cromatograma de CETP conejo por cromatografía de columna de BLUE SEPHAROSE^{TM}.

La Fig. 8 muestra un cromatograma de CETP conejo por cromatografía de columna de Sepharosa LDL succinilada.

La Fig. 9 muestra la reactividad de los anticuerpos monoclonales, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, y \alm{1} 176-1 a CETP de conejo purificado.

La Fig. 10 muestra la sensibilidad de la cuantificación del anticuerpo monoclonal marcado \alm{1} 86-2 y algunos anticuerpos inmovilizados que son combinados.

La Fig. 11 muestra la sensibilidad de cuantificación cuando son combinados el anticuerpo monoclonal marcado
\alm{1} 176-1 y varios anticuerpos inmovilizados.

La Fig. 12 muestra la sensibilidad de cuantificación cuando son combinados el anticuerpo monoclonal marcado
\alm{1} 72-1 y varios anticuerpos inmovilizados.

La Fig. 13 muestra la sensibilidad de cuantificación cuando son combinados el anticuerpo monoclonal marcado
\alm{1} 86-2 y el anticuerpo inmovilizado \alm{1} 72-1 a varias concentraciones.

La Fig. 14 muestra la sensibilidad de cuantificación cuando son combinados el anticuerpo monoclonal marcado
\alm{1} 72-1 y el anticuerpo inmovilizado \alm{1} 86-2 a varias concentraciones.

La Fig. 15 muestra la sensibilidad de cuantificación cuando son combinados el anticuerpo monoclonal marcado
\alm{1} 176-1 y el anticuerpo inmovilizado \alm{1} 72-1 a varias concentraciones.

La Fig. 16 muestra la sensibilidad de cuantificación cuando son combinados el anticuerpo monoclonal marcado
\alm{1} 72-1 y el anticuerpo inmovilizado \alm{1} 176-1 a varias concentraciones.

La Fig. 17 muestra la sensibilidad de cuantificación cuando se combinan el anticuerpo monoclonal marcado \alm{1} 72-1
(1 \mug/ml) y el anticuerpo inmovilizado \alm{1} 86-2 (1 ng/pocillo ó 3 ng/pocillo).

La Fig. 18 muestra una curva de calibración de preparaciones del estándar CETP humana purificado derivadas por el método de cuantificación de la presente invención.

La Fig. 19 muestra la cuantificación de CETP de plasma humano con diferente pureza por el método de cuantificación de la presente invención.

La Fig. 20 muestra una correlación entre la actividad de CETP y la cantidad CETP en las muestras determinadas usando el método de cuantificación de la presente invención.

La Fig. 21 muestra la actividad y la cantidad de CETP de plasma de sujetos normales o determinado en varios pacientes usando el método de cuantificación de la presente invención.

La Fig. 22 muestra que la reactividad del anticuerpos monoclonal, \alm{1} 72-1 o \alm{1} 86-2 para desnaturalizar CETP humana, y la diferencia entre los métodos de cuantificación de la presente invención y los otros convencionales.

La Fig. 23 muestra el efecto inhibidor de la actividad CETP por un anticuerpo monoclonal anti-CETP en una prueba en vivo usando conejo.

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La Fig. 24 muestra el efecto inhibitorio de la actividad CETP por un anticuerpo monoclonal CETP anti-humano en una prueba en vivo usando ratones transgénicos los que expresan altamente CETP humana.

La Fig. 25 muestra el efecto sobre el nivel de colesterol de HDL en sangre por un anticuerpo CETP anti-humano en una prueba en vivo.

Aclarando el significado de los términos usados aquí, en las presentes invenciones se explican en detalle.

Un "Anticuerpo monoclonal" de la presente invención significa un reactivo anticuerpo monoclonal para CETP humana y más específicamente, un anticuerpo monoclonal que tiene por lo menos las siguientes características (a), (b) y (c).

(a) Reactivo para CETP de plasma (por las siglas de la expresión inglesa, Cholesterol éster Transfer Protein) de humanos sanos, pacientes con hiperlipemia, pacientes con deficiencia de LCAT (por las siglas de la expresión inglesa, Lecithin Cholesterol Acil Transferase) o pacientes con HDL (lipoproteína de alta densidad).

(b) No reactivo para CETP de conejo en una concentración de 3 \mug/ml ó inferior.

(c) No específicamente reactivo para desnaturalizar al CETP humana.

Además, el anticuerpo monoclonal de la presente invención tiene una característica que es reactivo a CETP intacta en el fluido corporal humano.

"CETP Desnaturalizada humana" mencionada aquí significa CETP humana en la que la estructura alta de la proteína (conformación) ha sido destruida por tratamiento tales como el tratamiento por calor o el tratamiento con detergente (Tween-20, Triton X-100, etc.), o es que es biológicamente inactivo.

Más específicamente, "Anticuerpo monoclonal" de la presente invención representan los anticuerpos monoclonales \alm{1} 72-1 y \alm{1} 86-2 derivados desde los hibridomas \alm{1} 72-1 y el \alm{1} 86-2 identificados por el Número de Acceso FERM BP-4944 y FERM BP-4945 respectivamente, y el anticuerpo monoclonal \alm{1} 176-1 que se produce desde el hibridoma \alm{1} 176-1 preparado en el ejemplo descrito abajo.

Además, se incluye un anticuerpo monoclonal quimérico recombinante, un anticuerpo monoclonal recombinante humanizado derivado desde el anticuerpo monoclonal en el que puede ser preparado por recombinación genética, y también incluye un anticuerpo monoclonal humano.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención (por ejemplo, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 y \alm{1} 176-1) pueden ser preparados por métodos de preparación convencionales establecidos para anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, pueden ser producidos por hibridomas preparados por fusión celular. Es decir, mamíferos inmunizados con antígenos, pueden ser obtenidos de células produciendo anticuerpos. Las células de hibridoma son preparadas desde células que producen anticuerpos con células de mielomas que no tienen una capacidad de producir anticuerpos. Después de clonar el hibridoma, se seleccionan los clones que producen anticuerpos monoclonales que muestran afinidad específica del antígeno usado para la inmunización de los mamíferos y luego, los anticuerpos monoclonales de la presente invención se producen a partir de los hibridomas.

Específicamente son usadas CETP humana, no desnaturalizada, intacta, y purificada, biológicamente activa como un antígeno. Mamíferos (incluidos animales transgénicos como ratones genéticos creados por ingeniería que producen un anticuerpo humano), más específicamente, ratón, rata, hámster o cobaya, son inmunizados con dicho antígeno inyectando varias veces el antígeno por vía muscular, intravenosa, almohadilla de alimentación o intraperitoneal, subcutáneamente.

En general, la inmunización es llevada a cabo de una a cuatro veces desde cada uno a los catorce días de la inmunización inicial. Las células productoras del anticuerpo es derivada del mamífero inmunizado aproximadamente de uno a cinco días después de la inmunización final.

El hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal puede ser preparado de acuerdo con el método según Kohler, y Milstein et al..(Nature, vol. 256:495-497 (1975)) o de acuerdo con un método modificado similar al método original. Los hibridomas son preparados por fusión celular de célula productora de un anticuerpo y célula de mieloma. Las células productoras de un anticuerpo son derivadas del bazo, del nódulo linfático, la médula de hueso o la amígdala, preferentemente del bazo, de mamíferos inmunizados de acuerdo con los procedimientos antes mencionados. Las células de mieloma incapaces de producir auto-anticuerpo son derivadas de mamíferos preferentemente de un ratón, rata, cobaya, hámster, conejo o humano, más preferentemente de un ratón, rata o humano.

Como las células de mieloma pueden ser usadas para la fusión de células, por ejemplo, derivadas de mieloma de ratón,. P3/X63-AG8.653 (653), P3/NS1/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.U1(P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/O, Sp2), PAI, FO o BW5147, derivadas de mieloma de ratas 210RCY3-Ag.2,3, U-266AR1, derivadas de mieloma humano, GM1500-6TG-Ai-2, UC729-6, CEM-AGR, D1 R11 o CEM-T15, etcétera.

El tamizado de hibridomas puede ser llevado a cabo cultivando los hibridomas sobre una placa de micro valoración como ejemplo, y luego, al medir la reactividad del sobrenadante de los cultivo de pocillos se muestra la proliferación de células de CETP humana purificada usada para la inmunización de mamíferos y puede ser llevado a cabo por RIA o por el ensayo de inmunización por enzima como ELISA.

Las preparaciones de un anticuerpo monoclonal a partir del hibridoma son llevadas a cabo cultivando el hibridoma in vitro o poniendo el hibridoma in vivo en ascitis de un ratón, rata, cobaya, hámster o conejo, preferentemente en ascitis de ratón o rata, pero más preferentemente en ascitis de ratón, y luego, aislando el anticuerpo monoclonal del sobrenadante de cultivo o de los ascitis de mamíferos.

En el caso de cultivos de un hibridoma en vitro, dependiendo de las características de células, los propósito del estudio, método de cultivo, etcétera, pueden ser usada de cualquier medio nutriente conocido o cualquier tipo de medios nutrientes modificado a partir de medios básicos conocidos, mientras que los medios son útiles para proliferar; mantener actualizados y almacenar el hibridoma y para producir anticuerpo monoclonal en el sobrenadante de cultivo.

Como medio básico, por ejemplo, pueden ser usado medios bajos en calcio tales como medio HamF12, medio MCDB153 y medio MEM con bajo calcio, y medio con alto calcio como los medios MCDB104, medios MEM, medio D-MEM, medio RPMI1640, medio de ASF104 o medio de RD. Dependiendo del propósito del cultivo, dicho medio básico podría contener, por ejemplo, suero, hormonas, citoquinas y/o diversas sustancias inorgánicas ó orgánicas.

El aislamiento y la purificación del anticuerpo monoclonal del sobrenadante de los cultivos antes mencionados o ascitis puede ser llevado a cabo aplicando la precipitación de sulfato de amonio saturado, la precipitación de euglobulina, los método de ácido caproico, método de ácido caprílico, cromatografía de intercambio de ión (DEAE, DE52 o análogos), o la cromatografía de afinidad en columna como la cromatografía en antiinmunoglobulina y cromatografía en columna de proteína A, etcétera.

Por "Anticuerpo recombinante quimérico monoclonal" de la presente invención se entiende un anticuerpo monoclonal manipulado genéticamente, específicamente un anticuerpo monoclonal quimérico como un anticuerpo monoclonal recombinante quimérico de ratón/humano que comprende una región variable obtenida de un anticuerpo monoclonal antes mencionado, como el \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 o \alm{1} 176-1 y una región constante derivada de la inmunoglobulina humana. Las regiones constantes derivadas de inmunoglobulinas humanas tienen secuencias de aminoácido únicas diferentes sobre la base de su isotipo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. La región constante de inmunoglobulina humana de cualquier isotipo puede ser proporcionada a la región constante del anticuerpo monoclonal quimérico recombinante de la presente invención. La región constante de IgG humano es preferible.

Un anticuerpo monoclonal quimérico de ratón/humano recombinante derivado del anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 o \alm{1} 176-1 incluido en el anticuerpo monoclonal de la presente invención puede ser preparado como sigue, sin embargo, no está limitado a los siguientes método de preparación.

El anticuerpo monoclonal quimérico recombinante puede ser preparado, por ejemplo, haciendo referencia a Experimental Medicine (Edición especial) Vol. 1-6, No. 10, 1988 y Japanese patent publication No. HEI 3-73280. En la descendente el gen VH activo (reconfigura el gen VDJ que codifica la región variable de la cadena H), el gen CH (gen C que codifica la región constante de la cadena H) es operable unido a ello y en la descendente el gen VL activo (reconfigura el gen VJ que codifica la región variable de la cadena L), el gen CL (gen C que codifica la región constante de la cadena L) es operable unido a ello. Estos genes son insertados en el mismo o en un vector de expresión diferente. El gen VH usado aquí es obtenido de ADN que codifica el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 ó \alm{1} 176-1 aislado del hibridoma, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 ó \alm{1} 176-1 de la presente invención. El gen CH y el gen CL son obtenidos desde ADN que codifica la inmunoglobulina humana. El gen VL es obtenido de ADN que codifica el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 ó \alm{1} 176-1 aislado del hibridoma \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 ó \alm{1} 176-1 de la presente invención. Las células del hospedero son transformadas con el(os) vector(es). El anticuerpo monoclonal quimérico de ratón/humano recombinante de la presente invención puede ser preparado cultivando dichas células transformadas. Como células hospederas, pueden ser usadas células procarióticas (por ejemplo E. coli) o células eucarióticas (por ejemplo células CHO).

Brevemente, después de que el ADN sea extraído del hibridoma \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 ó \alm{1} 176-1 por un método convencional, los ADN son digeridos con enzimas de restricción apropiadas como EcoRI e HindIII. Entonces, es efectuado el Southern Blot por electroforesis (por ejemplo, con gel de agarosa 0,7%). Después de la electroforesis, el gel es teñido (por ejemplo, con bromuro de etidio). Después de tomar una fotografía del gel, la ubicación del marcador es visible y el gel es lavado dos veces; luego, el gel es sumergido en solución de HCl 0,25 M durante 15 minutos. Entonces el gel es sumergido en 0,4 N NaOH durante 10 minutos con suave agitación. Por un método convencional, el gel se transfiere a un filtro y después de 4 horas de reposo, el filtro es recuperado y es lavado dos veces con 2 x SSC. Después de secar el filtro completamente, se obtiene la masa o el filtro que se mantiene a 75ºC durante 3 horas. Después de obtener la masa, el filtro se pone en la solución de SDS al 0,1% de SSC/0,1 de x y es tratado por 30 minutos a 65ºC. El filtro es sumergido en 3 x SSC/solución de SDS 0,1%. Entonces, el filtro es colocado en una bolsa de vinilo con la solución de pre-hibridización y dejado reposar por 3 a 4 horas a 65ºC.

Entonces, se adiciona a la muestra de solución de ADN marcado con ^{32}P, y la mezcla se hace reaccionar durante aproximadamente 12 horas a 65ºC. Después de la hibridización, el filtro es lavado a una concentración de sal, la temperatura de reacción y el período de tiempo apropiados (como ejemplo, con una solución de SDS de 2 x SSC-0,1%,
a temperatura ambiente durante 10 minutos). El filtro es colocado en una bolsa de vinilo luego y es adicionada una pequeña cantidad de 2 x SSC, y la bolsa es cerrada fuerte y es llevada a cabo la auto radiografía.

Por el mencionado Southern Blot, arriba son identificados el gen VDJ reconfigurado y el gen VJ, los que respectivamente codifican, la cadena H y la cadena L del anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 ó \alm{1} 176-1. La región que incluye el fragmento de ADN identificado es fraccionada por centrifugación con gradiente de densidades con sacarosa e incorporada en un vector fago (como Charon 4A, Charon 28, \lambda EMBL3 y \lambda EMBL4). Transformando la E. coli (como LE392 y NM539) con el vector fago, se establece una biblioteca de genomas. Junto a la hibridización de placas con un sensor adecuado (tales como el gen J de cadena H y el gen J de cadena (x) de L) de acuerdo con el método de Benton-Davis (Science, Vol. 196, p.180-182, 1977), los clones positivos contienen los genes VDJ ó VJ reconfigurados respectivamente y son obtenidos de la biblioteca de genomas, respectivamente. Sobre los clones obtenidos, se hace un mapa de enzima de restricción, se determina la secuencia de nucleótido y se confirma la existencia del gen VH (VDJ) o el gen VL reconfigurados.

Por otro lado, el gen CH humano y el gen CL humano usados para la quimerización son aislados separadamente. Por ejemplo, para preparar un anticuerpo quimérico con IgG1 humano, son aislados un gen C\gamma1 (gen CH) y un gen C_{K} (gen C). Estos genes pueden ser aislados de la biblioteca de genomas humanos usando un gen C\gamma1 de ratón (corresponde al gen C\gamma_{1} humano) y un gen C_{K} de ratón (corresponde al gen C_{K} humano) como sondas porque las secuencias de nucleótidos del gen de inmunoglobulina de ratón y el gen de inmunoglobulina humana son muy homólogos.

Brevemente, como un ejemplo, un fragmento de ADN que contiene el gen C_{K} humano y la región de aumento pueden ser aislados de la biblioteca de genomas de HaeIII-A1uI humano \lambda Charon 4A (Cell, Vol. 15:1157-1174 (1978)) usando un fragmento HindIII-BamHI (3 kb) derivado del clon Ig146 de (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 75: 4709-4713 (1978) y un fragmento de EcoRI (6,8 kb) obtenido como sondas del clon MEP10 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 78:474-478 (1981)). El gen C\gamma_{1} humano puede ser aislado, por ejemplo, digiriendo ADN de la célula de hígado fetal humana con HindIII, fraccionando por electroforesis de gel de agarosa, insertando la banda 5,9 kb dentro \lambda 788 y luego aislando las sondas antes mencionadas.

Usando el gen VH aislado de ratón, el gen VL de ratón, el gen CH humano y gen CL humano, y considerando la región promotora y la región cercana al gen, el gen CH humano es dispuesto descendentemente respecto al gen VH de ratón, y el gen CL humano es dispuesto descendentemente respecto al gen VL de ratón en un vector de expresión como pSV2gpt y pSV2neo usando una enzima de restricción apropiada y una ligasa de ADN. En este caso, el gen VH de ratón/gen CH humano y el gen VL de ratón/gen CL humano puede ser colocado en un vector de expresión o en vectores de expresión diferentes.

El gen quimérico insertado en el(os) vector(es) expresado(s) es introducido en células de mieloma que no producen anticuerpos como las célula de P3X63-Ag8-653 y la célula de SP210 por el método de fusión de protoplasto, el método de DEAE-dextrana, método de fosfato de calcio o método del perforación eléctrico. Las células transformadas son escogidas cultivándolas en medios de cultivo conteniendo una droga que corresponda al gen resistente a la droga insertada en el vector de expresión (s), y por lo tanto pueden ser obtenidas células productoras de anticuerpo monoclonal quimérico.

A partir del sobrenadante de cultivo de las células que producen el anticuerpo seleccionado, puede ser obtenido del anticuerpo monoclonal quimérico.

Por el término "anticuerpo monoclonal recombinante humanizado" de la presente invención se representa un anticuerpo monoclonal obtenido por ingeniería genética. Específicamente, quiere significar que una parte o el todo de las regiones determinantes complementarias de la región hipervariable son obtenidas de ese anticuerpo monoclonal antes mencionado (como por ejemplos, los anticuerpos monoclonales \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 o \alm{1} 176-1), las regiones del esqueleto de la región hipervariable son obtenidas de las inmunoglobulina humana, y la región constante es obtenida de la inmunoglobulina humana.

La(s) región(es) que condicionan la complementariedad en la región hipervariable representa(n) tres regiones (CDR1, CDR2, CDR3) que existen en la región hipervariable de la región variable del anticuerpo y se unen con el antígeno directamente complementariamente. La(s) región(es) del esqueleto en la región hipervariable representa(n)
las cuatro regiones (FR1, FR2, FR3, FR4) que están ubicada(s) entre (antes y después) de las tres regiones que determinan la complementariedad, y son relativamente bien conservadas.

En otras palabras, el término "anticuerpo monoclonal recombinante humanizado" representa el anticuerpo monoclonal en el que todas las partes excepto para una parte o el todo de la(s) región(es) que condicionan la complementariedad de la región hipervariable de los anticuerpos monoclonales de la presente invención son reemplazadas con la(s) correspondiente(s) de la inmunoglobulina humana.

La región constante derivada de la inmunoglobulina humana tiene una única discordancia de secuencia de aminoácidos con el isotipo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. La región constante del anticuerpo monoclonal recombinante deshumanizado de la presente invención podría ser la región constante de cualquier isotipo de inmunoglobulina humana, pero preferentemente, es la región constante de IgG humano. La región del esqueleto(s) en la región hipervariable derivada de inmunoglobulina humana no está limitada a esos isotipos.

El anticuerpo monoclonal recombinante humanizado derivado del anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 o \alm{1} 176-1 incluido en los anticuerpos monoclonales de la presente invención puede ser preparado, por ejemplo, por los siguientes pasos pero no se limita a los siguientes.

Por ejemplo, el anterior puede ser preparado por la técnica de ingeniería genética de acuerdo con la publicación de Patente Japonesa sin examinar de número HEI4-506458 y Patente Japonesa sin examinar de número SYOU62-296890. Desde el hibridoma \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 o \alm{1} 176-1, por lo menos, son aislados unos genes CDR de cadena H de ratón y al menos unos genes CDR de cadena L de ratón que se corresponden con los genes CDR de cadena H de ratón. Del gen de la inmunoglobulina humana, son aislados el gen de cadena H humano que codifica toda la región excepto la cadena CDR de H humano (corresponde a la cadena CDR de H de ratón), y el gen de cadena de L humano que codifica toda excepto CDR humano de cadena L de la región (corresponde a la cadena CDR de L de ratón). Los genes de cadena CDR de H de ratón son aislados y el gen de cadena de H humano son unidos operablemente y son introducidos en un vector de expresión apropiado, y, de forma semejante, los genes de cadena CDR de L de ratón y el gen de cadena de L humano son unidos operablemente y son introducidos en otro vector de expresión apropiado. O, de otra forma, es posible introducir los genes de cadena CDR de H de ratón/el gen de cadena de H humano y los genes de cadena CDR de L de ratón/el gen de cadena de L humano en el mismo vector de expresión. Transformando las células del hospedero con el(os) vector(es) de expresión obtenido(s), pueden ser obtenidas las células transformadas que producen el anticuerpo monoclonal humanizado. Cultivando dicha células transformadas, puede ser obtenido el anticuerpo monoclonal humanizado del sobrenadante de cultivo.

Como ambas células hospederas pueden ser usadas las células procarióticas como E. coli y las células eucarióticas como las células CHO/(ovarios del hámster chino).

El término "Anticuerpo humano" en la presente invención pretende denotar que la inmunoglobulina, de la que regiones enteras incluyen tanto las regiones constantes y las variables de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras son derivadas de genes que codifican la inmunoglobulina humana.

El anticuerpo humano es producido de acuerdo con un método común de la siguiente manera. Por ejemplo, los genes de inmunoglobulina humana están integrados en una localización de genes de animales, como ratones excepto humanos para obtener los animales transgénicos productores de anticuerpos humanos. Entonces, los animales transgénicos son inmunizados usando cualquier antígeno. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales y/o policlonales son obtenidos de la misma manera descrita arriba. Por ejemplo, tales ratones transgénicos que producen los anticuerpos humanos son producidos usando el método revelado en las diversas referencias: Nature Genetics:, 7: 13-21 (1994), patente Japonesa aún por examinar No. HEI4-504365, Internacional Patent Publication No. WO94/25585 NIKKEI Science-June: 40-50 (1995), Nature, 368: 856-859 (1994); y la Publicación Nacional versión traducida No. 1995-500233.

"F(ab')" ó "Fab" de la presente invención representan fragmentos de anticuerpos producidos por tratamiento de inmunoglobulina (anticuerpo monoclonal) tratando con una proteasa como pepsina o papaína. Estos términos se refieren al(os) fragmento(s) de anticuerpo digeridos en posiciones antes y después de los enlaces de disulfuro entre las dos cadenas de H en la región bisagra. Por ejemplo, cuando IgG1 es tratado con papaína, es escindido aguas arriba del enlace de disulfuro entre las dos cadenas de H en la región de bisagra para producir dos fragmentos idénticos, que comprenden una cadena de L comprendiendo a VL (región variable de cadena L) y CL (la cadena de L constante respecto a la región), y una cadena de fragmento H que comprende VH (región de cadena variable H) y CH\gamma_{1} (región constante \gamma_{1} de la respecto a la cadena H) que es enlazados en el región C terminal por un enlace de disulfuro. Cada uno de los dos fragmentos idénticos es llamado Fab'. Cuando se trata con pepsina, IgG es escindido aguas abajo del enlace de disulfuro entre las dos cadenas H en la región de bisagra para hacer un fragmento de anticuerpo que es un poco más grande que un fragmento que consta de dos Fab conectando éstos en la región de bisagra. Este fragmento de anticuerpo es llamado F(ab')_{2}.

"El anti-suero derivado de un mamífero" de la presente invención representa un suero conteniendo un anticuerpo reactivo al anticuerpo monoclonal o a su fragmento de anticuerpo de la presente invención. El suero es preparado inmunizando a un ratón, rata, cobaya, conejo, cabra, cerdo o bovino, pero preferentemente una rata, cobaya, conejo o cabra, con el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo de la presente invención de acuerdo con los procedimientos descritos arriba para preparar el anticuerpo monoclonal humano mencionado más arriba. Mayor cantidad, específicamente, es un anti-suero obtenido de los mamíferos inmunizados con el anticuerpo monoclonal antes mencionado (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 o \alm{1} 176-1) o los fragmentos de anticuerpo de F(ab')_{2} ó Fab de estos anticuerpos.

"Portador insoluble" de la presente invención representa a un portador que lleva CETP humana en una muestra (por ejemplo, muestra de fluido corporal como plasma sanguíneo, sobrenadante de cultivo o sobrenadante de centrífuga) o en el anticuerpo monoclonal antes mencionado o en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, por la adsorción física o el enlace químico. Por ejemplo, los siguientes materiales pueden ser usados; (1) composiciones de plásticos de resinas de poliestireno, resina policarbonato, resina de silicona o resina de nylon; placa compuesta de sustancias insolubles de agua como vidrio; probeta o tubo que tiene capacidad interior; cuentas; pelotas; filtro o membrana etc., y (2) portadores insolubles usando cromatografía como portador del tipo de celulosa, portador del tipo de agarosa, portador del tipo de poliacrilamida, portador del tipo dextrana para afinidad; portador del tipo de poliestireno, portador del tipo alcohol de polivinilo; portador del tipo poliaminoácidos y portador del tipo de silicona porosa.

"Anticuerpo monoclonal inmovilizado" o "Fragmento de anticuerpo inmovilizado" de la presente invención representa un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo que es atado a dicho portador insoluble por adsorción física o enlace químico. El anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado puede ser usado para la detección, ensayo, la separación y purificación de CETP humana en una muestra (por ejemplo, muestra de un fluido corporal como plasma sanguíneo, sobrenadante de cultivo y sobrenadante de centrifugación). Para el propósito de la detección o ensayo, el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado puede ser usado en el portador insoluble mencionado arriba (1). Especialmente para el ensayo considerando un manejo simple y simultáneo de muchas muestras, usando preferiblemente una placa plástica que tiene muchos pocillos tales una placa de micro titulación con 96 pocillos. Para la separación y purificación, el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizados pueden ser usado sobre un filtro o membrana mencionado arriba (1) o el portador insoluble mencionado arriba (2).

"Sustancia marcada capaz de proporcionar señales detectable por separado o por la reacción con la otra sustancia" de la presente invención representa una sustancia que se usa para detectar el anticuerpo monoclonal antes mencionado, el fragmento de anticuerpo y otro estándar de CETP humana. Son detectables uniendo la sustancia con el anticuerpo, el fragmento o el estándar (unión fisicoquímica etc.). Específicamente, la sustancia es una enzima, material fluorescente, material quimiluminiscente, biotina, avidina o radioisótopo, etcétera. Más específicamente, la sustancia es una enzima como peroxidasa, fosfatasa alcalina, \beta-D galactosidasa, glucosa oxidasa, 6-fosfato-glucosa-alcohol deshidrogenasa, malato deshidrogenasa, penicilasa, catalasa, apo glucosa oxidasa, ureasa, luciferasa y acetilcolina esterasa; el material fluorescente como isotiocianato de fluorescencia, proteína ficobilina, quelato de metales de las tierras raras, dansilcloro e isotiocianato de tetrametilrodamina; radioisótopo como ^{3}H, ^{14}C y ^{131}I biotina; avidina o materiales quimiluminiscentes.

Radioisótopos y materiales fluorescentes pueden proporcionar señales detectables por separado. Por otro lado, enzimas, materiales quimiluminiscentes, biotina y avidina no pueden proporcionar señales detectables por separado, pero con una u otras sustancias más, pueden suministrar señales detectables. Por ejemplo, en el caso de una enzima, requiere por lo menos su sustrato. Varios sustratos son usados dependiendo del método para la medición de la actividad de enzima (método calorimétrico, método de fluorescencia método de bioluminiscencia o método de luminiscencia química, etc.). En el caso de biotina, generalmente, es reaccionado al menos, avidina o avidina modificada enzimáticamente, pero no está limitado a este método. Si son necesarias varias sustancias desarrolladas y coloreadas, pueden ser usadas en dependencia de dichos sustratos.

"Anticuerpo monoclonal marcado", "Fragmento anti-cuerpo marcado" y "Estándar CETP humana marcado" del medio de la presente invención denotan el anticuerpo monoclonal, el fragmento de anticuerpo y el estándar de CETP humana marcada con una sustancia de marcado, respectivamente. Estos anticuerpos monoclonales marcados, fragmentos de anticuerpos marcados y el estándar de CETP humana marcado pueden usarse para la detección y ensayo de CETP humana en una muestra como una muestra de fluido corporal (plasma sanguíneo etc., sobrenadante de cultivo y sobrenadante de centrifugación). En la presente invención, cualquier sustancia marcada mencionada arriba puede ser usada, sin embargo, considerando el límite de detección (la sensibilidad), el límite de ensayo y la manipulación (la conveniencia), es preferible la biotina marcada.

El "Estándar CETP humana" de la presente invención quiere decir la CETP humana usada como estándar para la detección o ensayo de CETP humana en una muestra como es mencionado arriba.

"Inmunoensayo" de la presente invención representa un método para la detección o ensayo (por ejemplo, una muestra de fluido corporal como plasma sanguíneo, sobrenadante de cultivo y sobrenadante de centrifugación) basado sobre el principio de reacción antígeno-anticuerpo. En la presente invención, cualquiera de los métodos de inmunoensayo conocidos pueden ser aplicado para la presente invención mientras que el anticuerpo usado sea el anticuerpo monoclonal antes mencionado o su fragmento de anticuerpo, el anticuerpo monoclonal inmovilizado antes mencionado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado para el antígeno-anticuerpo del que la reacción sea uno o más entre el anticuerpo monoclonal a quien el fragmento de anticuerpo seleccionado antes mencionados o el fragmento anticuerpo marcado, y siempre que el antígeno sea CETP humana.

Específicamente, los métodos ejemplificados son descritos en "Enzyme Immuno Assay" (3rd edition, Eiji Ishikawa et al. ed., Igakusyoin, 1987) tales como método de fase sólido anticuerpo simple, método de fase líquida doble anticuerpo, método de fase sólida doble anticuerpo, método de sándwich, técnica de inmunoensayo de enzima multiplicada (EMEIT), inmunoensayo de enzima canalizada, inmunoensayo de enzima moduladora mediada por enzima (EMMIA), inmunoensayo de enzima inhibidora, ensayos inmunoenzimométricos, inmunoensayo de enzima mejorada e inmunoensayo de conexión proximal, o un método de pote como se describe en la Publicación de Patente Japonesa No. HE12-39747.

En la presente invención, dependiendo del propósito del ensayo, puede ser seleccionado el inmunoensayo apropiado. Teniendo en cuenta la fácil manipulación del y/o la eficiencia económica, especialmente su consideración en amplio uso clínico, son preferidos el método de sándwich, el método de pote, el método de fase sólida con anticuerpo simple o el método de fase fluido con anticuerpo doble. Es más preferible usar el método de sándwich o el método de pote. Es más preferible usar el método de sándwich que usa el anticuerpo monoclonal inmovilizado ó el fragmento de anticuerpo inmovilizado sobre una microplaca que tiene muchos pocillos tales como una microplaca de 96 pocillos y el anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de anticuerpo marcado con una enzima o biotina, o el método de pote que usa el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado en perlas o cuentas con el anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de anticuerpo marcado con una enzima o biotina.

Un ejemplo específico de la realización más preferible es el método de sándwich o el un método de pote que usa las siguientes combinaciones, el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 o \alm{1} 176-1, o su F(ab')^{2} (el(la/los/las) ó Fab inmovilizado \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 o \alm{1} 176-1 o su F(ab')^{2} ó Fab marcado con una enzima o biotina sobre una microplaca, cuentas o perlas con el anticuerpo monoclonal. Aunque los anticuerpos monoclonales \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 o \alm{1} 176-1 inmovilizados también pueden ser usados en forma marcada.

Particularmente, es más preferible usar el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1 (es el anticuerpo monoclonal derivados del hibridoma que se identifican con FERM BP4944) como el anticuerpo monoclonal inmovilizado y el anticuerpo monoclonal \alm{1} 86-2 (el anticuerpo monoclonal obtenido del hibridoma asociado con FERM BP4945) como lo marcado uno. Estos hibridomas fueron depositados en el National Institute of Bioscience y Human-Technology del Japón.

Se describen los detalles del método de sándwich, un método de pote, un método de fase sólida con anticuerpo simple, método de fase fluido con anticuerpo doble.

El método de sándwich es un método descrito en la primera parte del décimo aspecto de la presente invención, es decir, un inmunoensayo que comprende al menos de los siguientes pasos:

(a) Hacer reaccionar una muestra con el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado de la presente invención; y

(b) Hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de anticuerpo marcado con el complejo anticuerpo-antígeno formado pegando CETP humana en una muestra con el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado.

Sobre la base de la presente invención, la mayoría de los métodos convencionales usando una enzima o biotina marcando la sustancia descritos en detalle abajo. Esos métodos comprenden los siguientes pasos pero no se limitan a los siguientes ejemplos. Los términos de "Microplaca de Anticuerpo Monoclonal inmovilizado" y " Anticuerpo Monoclonal-inmovilizado" usado abajo tienen el mismo significado.

Paso 1

Un paso para preparación de un anticuerpo monoclonal inmovilizado (microplaca de anticuerpo monoclonal inmovilizado) por inmovilización de los anticuerpos monoclonales \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 ó \alm{1} 176-1 que reaccionan con CETP humana de la presente invención en una microplaca;

Paso 2

Un paso en que reacciona una muestra con el anticuerpo monoclonal inmovilizado por adición a la microplaca con anticuerpo monoclonal inmovilizado de una muestra de plasma sanguíneo humano;

Paso 3

Un paso para eliminar el anticuerpo inmovilizado que no reaccionó con la muestra por lavados de microplaca con anticuerpo monoclonal inmovilizado;

Paso 4

Un paso para preparar un anticuerpo monoclonal marcado, marcando los anticuerpos monoclonales \alm{1} 72-1; \alm{1} 86-2 ó \alm{1} 176-1 que reacciona con CETP humana de la presente invención con una enzima tal como la peroxidasa ó biotina;

Paso 5

Un paso para hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal marcado con un complejo antígeno-anticuerpo (formado por la reacción del anticuerpo monoclonal inmovilizado con CETP humana en la muestra) por adición del anticuerpo monoclonal marcado en la microplaca de anticuerpo monoclonal inmovilizado lavado en el "Paso 3";

Paso 6

Un paso para eliminar el anticuerpo monoclonal marcado que no reacciona con el complejo antígeno-anticuerpo por lavado de la microplaca con anticuerpo monoclonal inmovilizado;

Paso 7

Un paso para adicionar avidina ó enzima modificada con avidina (el anticuerpo monoclonal marcado con biotina que se usa en "Paso 4"), ó para adicionar varios sustratos, dependiendo del método usado para la medición de la actividad de la enzima (cuando identificamos el anticuerpo monoclonal marcado con la enzima marcada tal como peroxidasa que se usa en "Paso 4" junto con un agente colorante (si es necesario), para las microplaca con anticuerpo monoclonal inmovilizado (lavado en el "Paso 6") y para hacer reaccionar con la sustancia de marcado sobre el anticuerpo monoclonal marcado;

Paso 8

Un paso para hacer reaccionar una enzima unida con avidina con un sustrato por adición de varios sustratos dependiendo del método para la medición de la actividad de la enzima cuando la enzima modificada avidina es usada en "Paso 7";

Paso 9

Un paso para detener reacción de coloración y reacción enzimática por adición de solución de parada sobre la microplaca con anticuerpo monoclonal inmovilizado; y

Paso 10

Un paso para medir la intensidad de la coloración, fluorescencia ó luminiscencia.

Aunque los anticuerpos monoclonales \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 ó \alm{1} 176-1 pueden ser usados en forma inmovilizada ó también en forma marcada, es preferible usar el \alm{1} 72-1 como forma inmovilizada y los \alm{1} 86-2 ó \alm{1} 176-1 preferentemente en forma marcada en la presente invención.

El método de pote es un inmunoensayo mencionados en el primero, el segundo o tercer y décimo aspecto de la presente realización. La primera parte es un inmunoensayo que incluye al menos los siguientes pasos:

(a) Muestra reaccionando con el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado de la presente invención; y

(b) Reacción del anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de anticuerpo marcado con un complejo antígeno-anticuerpo formando enlaces con CETP humana en una muestra con el anticuerpo monoclonal inmovilizado ó fragmento de anticuerpo inmovilizado.

La segunda parte es un inmunoensayo que incluye al menos los siguientes pasos:

(a) Reacción de una muestra con el anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de anticuerpo marcado de la presente invención; y

(b) Reacción del anticuerpo monoclonal inmovilizado ó fragmento de anticuerpo inmovilizado de la presente invención con el complejo antígeno-anticuerpo formando enlaces a CETP humana de una muestra con el anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de anticuerpo marcado.

La tercera parte es un inmunoensayo que comprende al menos los siguientes pasos:

(a) Reacción de una mezcla que comprende el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado de la presente invención, con el anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de anticuerpo marcado de la presente invención y una muestra.

Sobre la base de la presente invención, los tres aspectos antes mencionados son descritos en detalle describiendo el método más común usando una enzima como un agente de marca, que comprende los siguientes pasos. Sin embargo, la presente invención no está limitada a tales ejemplos dados abajo. Los términos de "Anticuerpo monoclonal inmovilizado" y "Anticuerpo monoclonal inmovilizado en perlas" tienen el mismo significado.

El primer método comprende los siguientes pasos:

Paso 1

Un paso para la preparación de anticuerpos monoclonales inmovilizados (perlas de anticuerpo monoclonal inmovilizado) por inmovilización de los anticuerpos monoclonales, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1 los que reaccionan con CETP humana de la presente invención, en las perlas;

Paso 2

Un paso para reacción de un analito en una muestra con un anticuerpo monoclonal inmovilizado por adición de ambos: el anticuerpo monoclonal inmovilizado en las perlas y la muestra como el plasma humano junto con una solución búfer dentro de un recipiente que tiene una capacidad interior tal como tubo de ensayo, placa o tubo;

Paso 3

Un paso para eliminación de la solución de los recipientes y lavado de las perlas de anticuerpo monoclonal inmovilizado;

Paso 4

Un paso para la producción de anticuerpo monoclonal marcado por marcaje de un anticuerpo monoclonal de la presente invención, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1, en el que reaccionan con CETP humana, con biotina ó una enzima como peroxidasa,

Paso 5

Un paso para reacción del anticuerpo monoclonal marcado con un complejo antígeno-anticuerpo formado por la reacción del anticuerpo monoclonal inmovilizado con CETP humana de una muestra, por adición de anticuerpo monoclonal marcado dentro de los recipientes que contienen las perlas de anticuerpo monoclonal inmovilizado lavados en el Paso 3;

Paso 6

Un paso para eliminación del anticuerpo monoclonal marcado en el que no reaccionan con el complejo en el recipiente por eliminación de la solución en el recipiente y por lavado de las perlas de anticuerpo monoclonal inmovilizado;

Paso 7

Un paso de adición de avidina ó enzima modificada con avidina (cuando se usa un anticuerpo monoclonal marcado con biotina en el "Paso 4"), ó adicionar varios sustratos, dependiendo del método usado para la medición de la actividad de la enzima (cuando se usa una enzima marcada con anticuerpo monoclonal marcado tal como peroxidasa en el "Paso 4" junto con un agente colorante (si es necesario), las perlas de anticuerpo monoclonal inmovilizado (lavadas en el "Paso 6") para hacer reaccionar con sustancia de marcaje sobre el anticuerpo monoclonal marcado;

Paso 8

Un paso para hacer reaccionar una enzima unida con avidina con un sustrato ó por adición de varios sustratos dependiendo del método de la medición de la actividad de la enzima cuando se usa la enzima modificada con avidina en el "Paso 7";

Paso 9

Un paso para finalizar la reacción de la enzima y el desarrollo del color por adición de una solución de terminación sobre la mezcla de reacción del Paso 7 ó 8; y

Paso 10

Un paso para determinación de la intensidad colorimétrica, intensidad de fluorescencia o intensidad de luminiscencia.

El segundo método comprende los siguientes pasos:

Paso 1

Un paso para la preparación del anticuerpo monoclonal marcado por el marcado de los anticuerpos monoclonales \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1 de la presente invención en el que se hacen reaccionar con CETP humana, con una sustancia de marcado tal como enzima peroxidasa ó biotina;

Paso 2

Un paso para la reacción de una muestra con el anticuerpo monoclonal marcado por adición de ambos: anticuerpo monoclonal marcado y la solución de muestra como plasma humano junto con una solución búfer dentro de un recipiente que tiene una capacidad interior tal como un tubo de ensayo, placa ó tubo;

Paso 3

Un paso para la preparación de un anticuerpo monoclonal inmovilizado (perlas de anticuerpo monoclonal inmovilizado) por inmovilización de los anticuerpos monoclonales \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1 de la presente invención en el que reacciona con CETP humana, dentro de las perlas;

Paso 4

Un paso para reacción del anticuerpo monoclonal inmovilizado con el complejo antígeno-anticuerpo formado por la reacción del anticuerpo monoclonal marcado con CETP humana, en la muestra, por adición de las perlas de anticuerpo monoclonal inmovilizado en la reacción de mezcla del Paso 2;

Paso 5

Un paso para eliminación del anticuerpo monoclonal marcado que no reacciona con el complejo por eliminación de la solución en el recipiente y por lavado de las perlas de anticuerpo monoclonal inmovilizado;

Paso 6

Un paso para adicionar avidina ó enzima modificada con avidina (cuando se usa un anticuerpo monoclonal marcado con biotina en "Paso 1"), ó para adicionar varios sustratos, dependiendo del método usado para la medición de la actividad de la enzima (cuando enzima anticuerpo monoclonal marcado con peroxidasa se usa en el "Paso 1" junto con un agente colorante (si fuera necesario), para las perlas de anticuerpo monoclonal inmovilizado (lavadas en el "Paso 5") y para hacer reaccionar con la sustancia de marcado con el anticuerpo monoclonal marcado;

Paso 7

Un paso para hacer reaccionar una enzima con avidina unida con un sustrato por adición de varios sustratos, dependiendo del método para la medición de la actividad de la enzima cuando la enzima modificada con avidina ha sido usada fuera la del "Paso 6";

Paso 8

Un paso para terminar ambos, la reacción de la enzima y desarrollo del color por adición de una solución terminadora dentro sea la mezcla de reacción del Paso 6 ó 7; y

Paso 9

Un paso para determinar la intensidad colorimétrica, intensidad de fluorescencia o intensidad de luminiscencia.

El tercer método comprende los siguientes pasos:

Un paso para la preparación del anticuerpo monoclonal inmovilizado (perlas de anticuerpo monoclonal inmovilizado) por inmovilización del anticuerpo monoclonal de la presente invención, el cual se hace reaccionar con el CETP humana, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1, sobre las perlas;

Un paso para la preparación del anticuerpo monoclonal marcado marcando el anticuerpo monoclonal, el cual es reactivo al CETP humana, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1; con biotina o con una enzima tal como la peroxidasa;

Un paso para simultáneamente hacer reaccionar la muestra tanto con el anticuerpo monoclonal inmovilizado y el anticuerpo monoclonal marcado por adición, tanto las perlas de anticuerpo monoclonal inmovilizado preparado en el Paso 1; del anticuerpo monoclonal marcado preparado en el Paso 2, y la muestra de solución tal como plasma humano junto con una solución búfer dentro de un recipiente que tiene una capacidad interior tal como la de tubo de ensayo, placa ó tubo;

Un paso para retirar el anticuerpo monoclonal marcado sin reaccionar, el cual no ha reaccionado con el complejo, al retirar la solución del recipiente y por lavado de las perlas del anticuerpo monoclonal inmovilizado;

Un paso para adicionar avidina o avidina modificada por enzima (cuando se usa el anticuerpo monoclonal marcado por biotina en el "Paso 2"), o para adicionar varios sustratos; dependiendo de los métodos usados para la medición de la actividad de la enzima (cuando se usa el anticuerpo monoclonal marcado con una enzima tal como la peroxidasa en el "Paso 2" junto a un agente colorante (si es necesario), a las perlas de anticuerpo monoclonal inmovilizado (lavado en el "Paso 4") y para hacer reaccionar con la sustancia de marcado en el anticuerpo monoclonal
marcado;

Un paso para hacer reaccionar una enzima enlazada con avidina con un sustrato por adición de varios sustratos dependientes de los métodos para la medición de la actividad de la enzima, cuando se usan la enzima modificada con la avidina del "Paso 5";

Un paso para terminar tanto, la reacción de la enzima y el desarrollo del color por adición de la solución terminadora dentro de los mezcla de reacción sea del Paso 5 o del 6; y

Un paso para determinar la intensidad colorimétrica, intensidad de fluorescencia o la intensidad de la luminiscencia.

En los métodos antes mencionados 1 a 3, cualquiera de los anticuerpos monoclonales mencionados, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, y \alm{1} 176-1 pueden ser empleados como anticuerpo monoclonal inmovilizado y marcado. Sin embargo, el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1 es preferible como el anticuerpo monoclonal inmovilizado, y tanto el anticuerpo monoclonal \alm{1} 86-2 como el anticuerpo monoclonal \alm{1} 176-1 son preferibles como marcados. El anticuerpo monoclonal \alm{1} 86-2 es más preferible como el anticuerpo monoclonal marcado.

Un método de fase sólida de un sólo anticuerpo se describe en lo adelante en el décimo aspecto de la presente invención, y es un inmunoensayo que comprende por lo menos los siguientes pasos:

(a) hacer reaccionar una muestra y un estándar de CETP humana marcado con una sustancia marcada capaz de suministrar señales detectables por separado o por la reacción de otras sustancias con el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado se de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, el método en el que se emplea la sustancia marcada, particularmente una enzima usada comúnmente o biotina como sustancia marcada, es explicado en detalle más abajo. Por ejemplo, el método que comprende los siguientes pasos. La presente invención no está limitada al ejemplo. Además "Anticuerpo monoclonal inmovilizado" y " Microplaca de anticuerpo monoclonal inmovilizado" tienen el mismo significado.

Paso 1

Un paso para la preparación del anticuerpo monoclonal inmovilizado (microplaca con anticuerpo monoclonal inmovilizado) por inmovilización del anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1 de la presente invención el cual reacciona con CETP humana, sobre la microplaca;

Paso 2

Un paso para la preparación de un estándar de CETP humana marcado, marcando los estándares de CETP humana con biotina ó una de las enzimas tales como peroxidasa;

Paso 3

Un paso para hacer reaccionar competitivamente ambas muestras tal como plasma humano y el estándar CETP humana con el anticuerpo monoclonal inmovilizado en la microplaca con anticuerpo monoclonal inmovilizado;

Paso 4

Un paso para eliminar el estándar CETP humana marcado el cual no ha reaccionado con el anticuerpo monoclonal inmovilizado por lavado de la microplaca con anticuerpo monoclonal inmovilizado;

Paso 5

Un paso para adicionar avidina ó enzima modificada con avidita (cuando se usa anticuerpo monoclonal marcado con biotina en el "Paso 2"), ó para adicionar varios sustratos, dependiendo del método usado para la medición de la actividad de la enzima (cuando se usa un anticuerpo monoclonal marcado marcando una enzima tal como peroxidasa en el "Paso 2" junto con un agente colorante (si es necesario), para las perlas de anticuerpo monoclonal inmovilizado (lavado en "Paso 4") y para hacer reaccionar con en el anticuerpo monoclonal marcado;

Paso 6

Un paso para hacer reaccionar una enzima avidina enlazada con un sustrato ó adición de varios sustratos dependiendo del método para la medición de la actividad de la enzima cuando se usa la enzima modificada avidina en el "Paso 5";

Paso 7

Un paso para terminar ambas reacciones de la enzima y el desarrollo del color por adición de una solución terminadora dentro de la microplaca con anticuerpo monoclonal inmovilizado; y

Paso 8

Un paso para determinar la intensidad colorimétrica, intensidad fluorescencia ó intensidad luminiscencia.

Los anticuerpos monoclonales \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1 pueden ser usados como anticuerpos monoclonales inmovilizados, sin embargo, el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1 es preferible para este propósito.

El método de fase fluida de anticuerpo doble es descrito en la quinta parte del décimo aspecto de la presente invención, y es un inmunoensayo que comprende los siguientes pasos (a), ó por lo menos los siguientes pasos (b) y (c):

(a) Hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo de la presente invención con una mezcla de una muestra y el estándar de CETP humana marcado a quienes se marcan con una sustancia marcada capaz de proveer las señales detectables por separado o por reacción con otras sustancias; o

(b) Hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo de la presente invención con la muestra; y

(c) seguidamente del paso (b) se hace reaccionar el estándar de CETP humana marcado, marcando con una sustancia capaz de proporcionar señales detectables junto o por separados o por la reacción con otras sustancias; o con la mezcla de reacción del paso (b).

Más específicamente, el método es un inmunoensayo que comprende por lo menos los siguientes pasos de (a) y (d), o pasos (b) para (d).

(a) Hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo de la presente invención con una mezcla de una muestra y el estándar de CETP humana marcado, a quienes se marcan con una sustancia marcada capaz de suministrar señales detectables por separado o por la reacción con otras sustancias;

(b) Hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo de la presente invención con la muestra;

(c) seguido por el paso (b), hacer reaccionar el estándar de CETP humana marcado quienes se marcan con una sustancia capaz de proporcionar señales detectables o por separado o por la reacción con las otras sustancias; con la mezcla de reacción de paso (b).

(d) Hacer reaccionar un antisuero derivado desde células de mamíferos reactiva con anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo con un complejo de antígeno-anticuerpo formado por la unión de CETP humana en la muestra o el estándar CETP humana marcado con un anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo.

De acuerdo con la presente invención, el procedimiento que se emplea la sustancia marcada, particularmente la enzima más comúnmente usada o biotina como sustancia marcada, es explicado en detalle debajo. Por ejemplo, el procedimiento comprende los siguientes pasos; sin embargo, la presente invención no está limitada al ejemplo.

Paso 1

Un paso para la preparación de un estándar de CETP humana marcado, el estándar CETP humana marcado con biotina ó una enzima tal como peroxidasa;

Paso 2

Un paso para la adición de la mezcla (1) que comprende una muestra tal como plasma humano y el estándar CETP humana marcado preparado en los pasos de arriba Paso 1 dentro de un recipiente que tiene una capacidad interior tal como un tubo de ensayo, placa, ó tubo, y la subsiguiente adición del anticuerpo monoclonal de la presente invención, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2; ó \alm{1} 176-1 el cual reacciona con CETP humana, y reaccionan competitivamente la muestra y el estándar CETP humana marcado con el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1; ó

(2) Un Paso para adición de la muestra tal como plasma humano dentro de un recipiente que tiene una capacidad interior tal como un tubo de ensayo, placa, ó tubo y la subsiguiente adición del anticuerpo monoclonal de la presente invención, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1, el cual se reacciona con CETP humana y reacciona la muestra con el anticuerpo de arriba, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1;

Paso 3

Un paso para adicionar un estándar CETP humana marcado cuando se adiciona CETP humana marcado simultáneamente en el Paso 2 arriba (particularmente, (2)) para hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal de la presente invención, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1, con el estándar CETP humana marcado;

Paso 4

Un paso para la adición de anti-suero derivado de mamíferos y otros como el ratón, el cual reacciona con anticuerpo monoclonal, tal como los sueros anti-ratón y suero \gamma-globulina de cabra para hacer reaccionar con el complejo antígeno-anticuerpo formado por enlaces con el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1, preparado en el Paso 2 a 3 con el CETP humana en la muestra o con el estándar de CETP humana marcado; y precipitando el complejo aglutinado que comprende tres componentes: el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1, la CETP humana derivada de la muestra o el estándar de CETP humana marcado, y el antisuero derivado a partir de mamífero y otros de ratón.

\newpage

Paso 5

Un paso para eliminar el complejo aglutinado precipitado por centrifugación de la mezcla de reacción en el

\hbox{Paso 4;}

Paso 6

Un paso para adicionar avidina ó enzima modificada con avidina (cuando se usa un estándar CETP marcado con biotina derivado a partir del humano en el "Paso 1"), o para adicionar varios sustratos, dependiendo del método usado para la medición de la actividad de enzima (cuando se usa el estándar CETP marcado a partir de derivados marcados de la enzima humana tales como la peroxidasa en el "Paso 1" junto con un agente colorante (si es necesario), para el complejo aglutinado (separado en el "Paso 5") y para hacer reaccionar con una sustancia marcada en el CETP estándar derivado a partir del humano;

Paso 7

Un paso para hacer reaccionar una enzima enlazada a avidina con un sustrato por adición de varios sustratos dependientes de los métodos para la medición de la actividad enzima, cuando la enzima modificada avidina usada haya sido la del "Paso 6";

Paso 8

Un paso para terminar ambas, la reacción de la enzima y el desarrollo del color por adición de una solución terminadora dentro de la mezcla de reacción tanto del Paso 6 o del Paso 7; y

Paso 9

Cualquier del anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, o \alm{1} 176-1 puede ser usado en los ejemplos antes mencionados, sin embargo, es preferido el del anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1,

El término "Cromatografía de afinidad" en la presente invención representa la cromatografía de separación o purificación de CETP humana contenido en una muestra usando la afinidad entre el antígeno y el anticuerpo. Como ejemplos de una muestra, son dados los fluidos corporales tales como el plasma, sobrenadantes de cultivos, o sedimentados de centrifugación. Específicamente, son dados como ejemplos los siguientes métodos.

1) Un método para separar la CETP humana en la muestra, comprende la aplicación la muestra al portador insoluble antes mencionado como filtro o membrana sobre las que un anticuerpo monoclonal o su fragmento de la presente invención, en el que reacciona la CETP humana que ha sido inmovilizada para separar la CETP humana.

2) Un método para separar o purificar el CETP humana en la muestra, que comprende inmovilizar un anticuerpo monoclonal o su fragmento de la presente invención, el cual reacciona la CETP humana, o para los mencionado anteriormente portadores insolubles (p. ej., portador del tipo celulosa, portador del tipo agarosa, portador del tipo poliacrilamida, portador del tipo dextrana, portador del tipo poliestireno, portador del tipo alcohol polivinilo, portador del tipo ácido poliamino y portador del tipo sílice porosa por métodos conocidos (tal como adsorción física, polimerización por reticulación, atrapamiento en la matriz portadora, o inmovilización por enlace no covalente), llenando dentro la columna el portador insoluble tal como vidrio, plástico y columna de acero inoxidable que tiene una configuración cilíndrica, y aplicando una muestra (p. ej., fluido corporal tales como plasma de sangre, cultivo sobrenadante, o centrifugación sobrenadante) dentro los columna para la elución. Particularmente, el último método (2) es referido en la presente solicitud como cromatografía de afinidad en columna.

Como los portadores insolubles para la cromatografía por afinidad, cualquier puede ser usado cualquier tipo de portador mientras que el anticuerpo monoclonal o su fragmento de la presente invención pueda ser inmovilizado sobre ellos. Como ejemplos de portadores comercialmente disponibles se presentan SEPHAROSE 2B^{TM}, SEPHAROSE 4B^{TM}, SEPHAROSE 6B^{TM}, CNBr-SEPHAROSE 4B^{TM}, AH-SEPHAROSE 4B^{TM}, CH-SEPHAROSE 4B^{TM}, ACTIVATED CH-SEPHAROSE 4B^{TM}, EPOXY-ACTIVATED SEPHAROSE 6B^{TM}, ACTIVATED THIOL-SEPHAROSE 4B^{TM}, SEPHA' DEX^{TM}, CM-SEPHADEXT^{M}, ECH-SEPHAROSE 4B^{TM}, EAH-SEPHAROSE 4B^{TM}, NHS-ACTIVATED SEPHAROSE^{TM}, THIOPROPYL SEPHAROSE 6B^{TM}, y más (Pharmacia); BIO-GEL A^{TM}, CELLEXTM. CELLEX AE^{TM}, CELLEX-CM^{TM}, CELLEX PAB^{TM}, BIO-GEL-P^{TM} HYDRAZIDE BIO-GEL P^{TM}, AMINOETHYL BIO-GEL P^{TM}, BIO-GEL CM^{TM}, AFFI-GEL 10^{TM}, AFFI-GEL 15^{TM}, AFFI-PREP 10^{TM}, AFFI-GEL Hz^{TM}, AFFI.PREP Hz^{TM}, AFFI-GEL 102^{TM}, CM BIO-GEL A^{TM}, AFFI-GEL HEPARIN^{TM}, AFFI-GEL 501 ^{TM}, o AFFI-GEL 601^{TM}, y más (Bio-Rad); CHROMA-GEL A^{TM}, CHROMA-GEL P^{TM}, ENZAFIX P-Hz^{TM}, ENZAFIX P-SH^{TM}, ENZAFIX P-AB^{TM}, y otros (Wako Pure Chemicals); Ae-CELLULOSE^{TM}, CM-CELLULOSE^{TM} y otros (Serva).

El "ADN introducido de ratones que codifica la CETP humana" puede ser producida por técnicas empleadas generalmente en el campo de la producción de ratones transgénicos (véase, The newest animal cell experiment manual, LIC press, Capítulo 7 pp. 361-408, 1990).

Tall et al. Informaron que podían producir un ratón transgénico en el que ha sido introducido un gen de CETP humana. Sin embargo, el ratón no puede secretar CETP en sangre a menos que reciba inducción extrínseca o artificial como es recibir comida complementada con zinc. Por el contrario, no había sido informada previamente sobre el ratón transgénico que constantemente secreta el CETP humana en sangre sin cualquier inducción artificial.

"La composición farmacéutica" comprende el anticuerpo monoclonal o su fragmento de la presente invención como un ingrediente activo, y puede comprender uno o más portadores aceptables farmacéuticos como excipientes, diluentes, vehículos, desintegradores, estabilizadores, conservantes, agentes búferes, emulsionantes, aromáticos, agentes colorantes, edulcorantes, agentes espesantes, agentes de fravering, agentes solubilizantes, y otros aditivos. Tal composición farmacéutica puede ser constituida en forma de pastillas, cápsulas, polvos, gránulos, inyecciones, preparados líquidos, cápsulas, comprimidos, elíxires, suspensiones, emulsiones, o jarabes. La composición farmacéutica puede ser administrada de forma oral o parenteral.

En particular, las inyecciones podrían estar preparadas disolviendo o suspendiendo el anticuerpo monoclonal o su fragmento de la presente invención en un portador aceptable farmacéutico sin toxicidad a una concentración de 0,1 \mug del anticuerpo monoclonal/ml de portador a 10 mg; del anticuerpo/ml de portador como es el suero salino fisiológico, y agua destilada para las inyecciones. Tales inyecciones pueden ser administradas a pacientes que necesitan los tratamientos en las dosis de 1 \mug a 100 miligramos/kg del peso corporal, preferentemente de 50 \mug a 50 mg/kg del peso corporal de una a varias veces por día. Esta administración es llevada a cabo vía rutas clínicamente apropiadas como la vía intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, etcétera. La preferencia es dada a la administración intravenosa.

La composición farmacéutica de la presente invención podría ser aplicable no sólo para tratar o prevenir la hiperlipemia, sino también para tratar o prevenir diversas enfermedades como la arteriosclerosis causada por la cinética anormal de CETP, hiperalfalipoproteínemia e hipercolesterolemia.

Ejemplos

La presente invención se ha explicada en detalle a continuación basada en los siguientes ejemplos básicos. Sin embargo, la presente invención no está limitada a tales ejemplos.

Ejemplo 1 Establecimiento del sistema de ensayo de la actividad CETP

En la presente invención, la determinación de la actividad CETP (éster de colesterol (abreviado como CE) actividad de transportación) fue dirigido para usar el sistema de ensayo formulado como se describir abajo, a menos que fuera dicho especialmente. El ensayo el sistema de la presente invención es uno modificado de acuerdo con el método de Alberts et al.., La arteriosclerosis, Vol. 4, 49-58 (1984). Briefly, el ensayo el sistema a saber. En primer lugar, una lipoproteína donante que comprende lipoproteína de alta densidad (HDL_{3}), para la que el éster marcado de colesterol fuera incorporado, una lipoproteína que comprende lipoproteína de baja densidad (LDL), y una muestra que contiene CETP para el ensayo es mezclado fisiológicamente reaccionan entre sí. Luego, la cantidad de CE marcado transportado desde la proteína donante a la lipoproteína aceptora se determina ya sea por la medición del decrecimiento de la radiactividad de la lipoproteína donante o el aumento de la lipoproteína aceptora para determinar la actividad transportadora de CETP en la muestra.

<1-1> Preparación de la lipoproteína donante

Se adiciona bromuro de potasio (KBr) a 20 ml de plasma de un voluntario saludable para ajustar su gravedad comparativa, d = 1,125 g/ml. Después de eso, el plasma es sometido a la centrifugación con gradiente de densidad por 227,000 x g a 4ºC durante 17 horas, y luego se obtiene una fracción en la que la gravedad comparativa es d > 1,125 g/ml (fracción HDL_{3}). Esta fracción se somete a diálisis contra TBS (0,15 M NaCl/10 mM de Tris (pH 7,4)). Entonces, 10 nM de colesterol marcado con tritio ([^{3}H]C, de actividad específica 50,3 Ci/mM) disuelto en etanol al 95% que se adiciona gradualmente con agitación lenta. La solución se incuba durante 18 horas a 37ºC. Durante la incubación, colesterol marcado con tritio ([^{3}H] C) en la superficie de HDL_{3} se esterifica por el Aciltransferasa de Lecitina Colesterol
(LCAT) y se convierte a éster de colesterol marcado con tritio ([^{3}H]CE). Entonces [^{3}H]CE se incorpora sobre HDL_{3},

KBr se adiciona a la solución para ajustar su gravedad comparativa, d = 1,21 g/ml. Después de eso, la solución se somete a la centrifugación con gradiente de densidad de 227,000 x g a 4ºC durante 20 horas, y luego una fracción se obtiene a una gravedad comparativa de d < 1,21 g/ml. La fracción obtenida se dializa contra TBS descrito antes, y luego incorporada HDL_{3} [^{3}H]CE[^{3}H](CE-HDL_{3}la gravedad comparativa es 1,125 < d < 1,21; la actividad específica obtenida es de 101,000 dpm/nm). Esta fracción se usa como una lipoproteína donante.

<1-2> Preparaciones de la lipoproteína aceptora

Bromuro de potasio (KBr) se adicionan 100 ml de plasma voluntarios saludable para ajustar su gravedad comparativa, d = 1,019 g/ml. Después de eso, el plasma se somete a la centrifugación con gradiente de densidad por 227,000 x g a 4ºC durante 20 horas, y luego de obtenida la fracción de gravedad comparativa es d > 1,019 g/ml. La fracción obtenida se hace diálisis contra TBS como es descrito arriba. Luego, KBr es adicionado otra vez para ajustar la gravedad a d = 1,063 g/ml. La solución se somete a la centrifugación con gradiente de densidad de 227,000 x g a 4ºC durante 20 horas, y luego la fracción es obtenida con d < 1,063 g/ml. La fracción obtenida fue hecha diálisis contra TBS como se describe arriba, y luego la fracción que comprende LDL (la gravedad comparativa: 1,019 < d < 1,063) es obtenida para ser usada como lipoproteína aceptora.

<1-3> Determinación de la actividad CETP

La lipoproteína donante obtenida en el ejemplo <1-1> ([^{3}H]CE-HDL_{3}, que contiene 0,21 \mug de colesterol), la lipoproteína aceptora (LDL que contiene 21 \mug de colesterol), y una muestra para ensayo se mezcla en un microtubo. Entonces, también se adiciona TBS como se describe arriba al microtubo y se ajusta la proporción del contenido de colesterol en la lipoproteína donante a quien la lipoproteína aceptora iguala a 1 : 100, y ajusta la proporción de contenido de colesterol del HDL dentro de la muestra de ensayo de la lipoproteína donante que iguala por lo menos a 1 : 10 (el volumen total es de 600 \mul/tubo). El tubo se incuba durante 15 horas en baño de agua a 37ºC. Luego, el tubo se transfiere sobre hielo durante 15 minutos. Después de eso, 400 \mul de TBS congelado y 40 ul de la solución de sulfato de dextrana 1% que contiene 0,5M de MgCl_{2} se adicionan dentro del microtubo, y el microtubo es agitado enérgicamente. El microtubo fue incubado durante 30 minutos sobre hielo. Luego, el tubo se somete a centrifugación por 8,000 x g a 4ºC durante 10 minutos, y luego se recupera sobrenadante abundante en HDL. La radiactividad en el sobrenadante de la centrifugación fue medida por medio de un contador de centelleo.

En el orden de determinar la actividad de CETP en la muestra de ensayo conteniendo CETP en la muestra, la radiactividad de la muestra control en el cual no contiene la muestra de ensayo que también fue medida tratando de la misma manera que en el procedimiento descrito arriba. La actividad de CETP se determina por el decrecimiento de la radiactividad basado en la comparación del valor medido en muestras de ensayo con la muestra control. La actividad es expresada en unidades, y la actividad CETP para la transportación de 1 nM de colesterol por una unidad de tiempo se representa como 1 unidad (U).

Ejemplo 2 Preparaciones de CETP purificado derivado de humano

El procedimiento descrito abajo se lleva a cabo a 4ºC en el baño de hielo de acuerdo con un método conocido.

<2-1> Tratamiento con Sulfato de Dextrana

La sangre periférica es obtenida desde voluntarios sanos. Glóbulos rojos en la sangre se eliminan por centrifugación por un método conocido, y luego se obtiene 1 L de plasma humano. Dos litros de agua destilada, 100 ml de sulfato de dextrana 10% de peso molecular de 500,000 Da), y 80 ml de 4 M CaCl_{2} se adicionan al plasma obtenido y se agita suavemente en el baño de hielo durante 15 minutos. La solución mezclada se centrifuga a 15,200 x g durante 1 hora para fraccionar complejo insoluble sulfato/ lipoproteína de dextrana como precipitado. El sobrenadante es recogido, y BaCl_{2} 27,2% se adiciona para ajustar la concentración final de la solución a 1,36%. La solución mezclada fue agitada durante 20 minutos, y luego se centrifuga por 15,200 x g durante 1 hora. El precipitado fue eliminado, y el sobrenadante fue recogido.

<2-2> Purificación por cromatografía en columna de SEPHAROSE^{TM} de PHENYL

Tres molar de NaCl, 0,01% de azida de sodio (NaN_{3}), 50 \mug/ml de sulfato de Gentamicina, y 0,05% de ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) se adiciona en el sobrenadante obtenido en el ejemplo <2-1>. La mezcla se ajusta a pH 7,4. PHENYL SEPHAROSE HP^{TM} columna (10 x 12,5 cm, Pharmacia Biotech) se equilibra con NaCl 3 M (pH 7,4) que contienen 0,01%, NaN_{3} 50 \mug/ml de sulfato de Gentamicina, y 0,05% de EDTA como se dijo anteriormente. La mezcla fue aplicada en la columna de SEPHAROSA de PHENYL. Después de eso, la columna se lava con 3 L de solución de NaCl 0,15 M (pH 7,4), posteriormente con 3 L de la solución sin NaCl (pH 7,4), y luego se eluye con etanol 20%. El perfil de elución se monitorea midiendo la absorbancia a 280 nm.

El resultado se muestra en la Fig. 1, sobre la base del perfil de elución se colectan fracciones conteniendo CETP derivado de humano.

<2-3> Purificación por medio de cromatografía en columna resource Q^{TM}

Las fracciones activas recogidas en el ejemplo <2-2> se dializan en un búfer (pH 7,4) que comprende 25 mM de NaCl y 10 mM de Tris-HCl. Luego, la fracción dializada fue llevada a una columna de RESOURCE Q^{TM} (3,5 x 10 cm., Pharmacia Biotech) equilibrada con el búfer. La columna se lava con 300 ml del búfer mencionado más arriba, y eluida con 2 L de NaCl de gradiente 25-250 mM (pH 7,4) con. El perfil de elución fue controlado midiendo la absorbancia a 280 nm.

El resultado es mostrado en la Fig. 2. Sobre la base del perfil de elución, fueron recogidas fracciones activas que contenían CETP humana derivadas para obtener de CETP humana purificada.

Ejemplo 3 Preparación de anticuerpos monoclonales CETP anti-humanos

Fueron preparados anticuerpos monoclonales anti-humanos CETP de acuerdo con un conocido método descrito en Experimental Medicine, suppl. "Cell Engineering Handbook" (Toshio Kuroki et al. ed., pp. 66-74, Yodo press (1992)) o Experimental Medicine, suppl. "Cell Engineering Handbook" (Toshio Kuroki et al. ed., pp. 66-74, Yodo press(1992)).

<3-1> Inmunización, fusión de células, y clonación

La CETP humana purificada preparada en el Ejemplo 2 con el adyuvante completo de Freund fue inyectada en la planta de las patas de ratones BALB/c (de sexo femenino, edad y 4-5 semanas, comprados en el centro Shizuoka Experimental Animal Center) para la primera inmunización. A los días 5º, 10º, y 15º de la primera inmunización, la CETP humana purificada se inyecta en la planta de las patas de los ratones inmunizados como una inmunización adicional. Además de CETP humana purificada se da de forma semejante a los ratones como una inmunización final uno y dos días antes de las preparaciones de híbridomas en el que se producen anticuerpos monoclonales. Nódulos linfáticos en la rodilla fueron extirpados de los ratones por una operación quirúrgica de acuerdo con los métodos conocidos. Los linfocitos obtenidos desde el nódulo linfático y células de mieloma de ratón, se mezclan en la proporción de 3 : 1, y se fusionan usando polietilenglicol 4000 como un agente de fusión (en la proporción de 3 : 1) para producir hibridomas. Luego, los hibridomas son cultivados en medio ASF104 (AGF) conteniendo HAT con aminopterina y 10% de suero fetal bovino. Luego el medio se cambia para el medio HT sin aminopterina, y cultivado para seleccionar el híbridoma preparado por la fusión de los linfocitos y las células de mieloma. El número de clones obtenidos es 169.

<3-2> Proteger de hibridoma

Hibridomas en el que se produce anticuerpo monoclonal CETP anti-humano es seguido por el sistema de ensayo de la actividad CETP establecido en el Ejemplo 1.

La CETP humana purificada preparada en el Ejemplo 2 y cada sobrenadante de cultivo obtenido del hibridoma (60 \mul) se adiciona a la mezcla de la lipoproteína donante preparada en el ejemplo <1-1> [^{3}H] (CE-HDL_{3} conteniendo 0,21 \mug de colesterol) y la lipoproteína aceptora preparada en el ejemplo <1-2> (conteniendo LDL 21 \mug de colesterol). Luego, TBS se adiciona para preparar el volumen total de 600 \mul/tubo.

La solución preparada es tratada de forma semejante al procedimiento descrito en el ejemplo <1-3>. La actividad de CETP fue determinada para cada muestra. Luego, comparándolo con la actividad de la muestra control (actividad de inhibición contra actividad de inhibición de CETP en la muestra, CE de control reescribir CETP) se determina en el sobrenadante de cultivo del hibridoma. Por esta revisión, tres clones seguros fueron obtenidos, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, y \alm{1} 176-1, que tienen actividad de inhibición de diferente CETP.

Dos hibridomas, \alm{1} 72-1 y \alm{1} 86-2 se depositan en el National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology on Dec. 20, 1994 (1-1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). Sus números de acceso son FERM BP-4944 y FERM BP-4945 respectivamente.

<3-3> Preparaciones a gran escala de anticuerpos monoclonales

Cada uno de los hibridomas \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 176-1 (10^{6} a 10^{7} células/0,5 ml/ratón) se administra a 15 ratones desnudos intraperitoneal (sexo femenino con edad de 7-8 semanas, comprado desde Charles River). Diez días después, la ascitis fue recogida de los ratones anestesiados de acuerdo a un método conocido. Luego, los anticuerpos monoclonales fueron preparados a gran escala desde ascitis.

<3-4> Isotipo

Isotipos para los anticuerpos monoclonales, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, y \alm{1} 176-1, se llevan a cabo con un conjunto de isotipos (kit Amersham) de anticuerpos monoclonales de ratones de acuerdo al protocolo complementario al conjunto. El resultado mostraba que tanto \alm{1} 72-1 como \alm{1} 86-2 son IgG1, y el \alm{1} 176-1 es IgG2b.

<3-5> Purificación del anticuerpo monoclonal

5 ml del cada anticuerpos monoclonal; \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, y \alm{1} 176-1, preparado con los sobrenadantes, que son diluidos tres veces con búfer acetato 0,06 M (pH=4.0), y el pH se ajusta a 4.8 con 1 N de HCl. Luego, 16.5 \mul de ácido de caprílico (Wako Pure Chemical) es gradualmente adicionado a la solución diluida a temperatura ambiente para hacer reaccionar por 30 minutos. Después de eso, la mezcla es centrifugada por 10,000 rpm durante 20 minutos para precipitar proteínas excepto los anticuerpos. Sobrenadantes fueron recogidos, y filtrados con un filtro (Millipore) eliminando los precipitados blancos. Filtrados se dializan contra búfer fosfato durante 2 horas.

Después de la diálisis, el sulfato de amonio (26.2 g/100 ml) se adiciona poco a poco con agitación para hacer reaccionar a 4ºC durante 120 minutos. Luego, la mezcla se centrifuga por 20 minutos a 10,000 rpm para recoger los precipitados. El búfer fosfato se adiciona al precipitado, y se hace la diálisis contra el búfer fosfato a 4ºC durante 24 horas, y luego son obtenidos los anticuerpos monoclonales purificados, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, y \alm{1} 176-1, respectivamente.

Ejemplo 4 Purificación de CETP humana por cromatografía de afinidad

La CETP humana purificada preparada en el Ejemplo 2 se purifica posteriormente por cromatografía en columna de afinidad en el que se usa el anticuerpo monoclonal, \alm{1} 72-1, y luego se caracteriza.

<4-1> Preparaciones de anticuerpo monoclonal inmovilizado (como un adsorbente llenado en columna)

HiTrap-NHS SEPHAROSA activada en columna HP^{TM} (1 ml, Pharmacia Biotech) se emplea, y el experimento se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo adjuntado. El anticuerpo monoclonal, \alm{1} 72-1, se disuelve en hidrógeno carbonato de sodio 0,2 M (pH 8,3) conteniendo NaCl 0,5 M y fue inyectado en la columna en una proporción de 5 mg/ml. Luego, el anticuerpo monoclonal se hace reaccionar con la columna durante 45 minutos para inmovilizar el anticuerpo en NHS-SEPHAROSE^{TM} activado para preparar el anticuerpo monoclonal inmovilizado \alm{1} 72-1.

<4-2> Purificación por cromatografía de afinidad

Una solución que contiene al CETP humana purificado obtenido en el Ejemplo 2 se aplicada en una columna preparada en el ejemplo <4-1>. Luego, la columna se lava con 5 ml de búfer Tris-HCl 50 mM (pH 7,6) conteniendo NaCl 500 mM, y eluir con 2 mM HCl-glicina (pH 2,8). La fracción eluida se neutraliza con Tris-HCl 2 M (pH 8,8). El perfil de elución se controla midiendo la absorbancia a 280 nm. El resultado es mostrado en la Figura 3. Sobre la base del perfil de elución son unidas fracciones activas conteniendo la CETP humana. La fracción unida se le hace diálisis contra Tris-HCl 50 mM que contiene NaCl 0,15 M (pH 7,6), y se prepara la CETP humana purificada.

<4-3> Caracterización de CETP humana purificado

Como se describe en la Fig. 3, la actividad de la enzima (actividad específica) del CETP purificado obtenido en el Ejemplo 4 es de 1,100 U/mg.

El peso molecular del CETP humana purificado se analiza usando SDS-PAGE (electroforesis de gel de poliacrilamida sulfato de dodecil de sodio).

El resultado se muestra en la Fig. 4.

Se confirma que la CETP humana purificada obtenida en el presente ejemplo comprende dos proteínas de aproximadamente 63,000 Da y 61,000 Da. Muchos de los investigadores que trataron de purificar CETP humana, y los valores de los pesos moleculares son reportados. Tales valores reportados no son idénticos debido a que son diferentes el método de purificación, la pureza de la proteína y/o el análisis del peso molecular. Sin embargo, están en el rango aproximadamente de 64,000 a 66,000 Da. Comparando tales valores, se demuestra que la pureza del CETP obtenido en el Ejemplo 4 es muy alta.

Ejemplo 5 Caracterización del anticuerpo monoclonal CETP anti-humano <5-1> reactividad para CETP humano

La reactividad de cada uno de los anticuerpos monoclonales purificados, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, y \alm{1} 176-1, preparados en el Ejemplo 3 se confirma por determinación de CETP humana transportando la actividad ensayada por el sistema de ensayo de actividad CETP establecido en el Ejemplo 1, en la misma manera como en el Ejemplo <3-2>.

La CETP humana purificada preparada en el Ejemplo 4, y 20 \mul de cada uno de los anticuerpos monoclonales, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, y el \alm{1} 176-1, esta diluido a varias concentraciones, con búfer Tris-HCl (pH 7,4) conteniendo NaCl 0,15 M se adiciona la mezcla de lipoproteína donante ([^{3}H] CE-HDL_{3} conteniendo 0,21 g de colesterol) preparado en el Ejemplo <1-1> y la lipoproteína aceptor (LDL contiene 21 \mug de colesterol) preparado en el Ejemplo <1-2>. Luego TBS se adiciona posteriormente para traer el volumen total hasta 600 \mul/tubo.

La solución preparada fue tratada de una manera similar como en el procedimiento escrito en el Ejemplo <1-3>. La actividad de CETP se determina para cada muestra tanto para la muestra control sin el anticuerpo monoclonal. Comparando los valores de la muestra correspondiente, la actividad de inhibición de CETP se determina para cada anticuerpo monoclonal. Como una referencia, se usa también IgG de ratón (sigma). El resultado es mostrado en la
Fig. 5.

El anticuerpo monoclonal, \alm{1} 72-1, demostró la inhibición dosis -dependiente de la actividad transportadora de CE de CETP humana (actividad CETP humano), particularmente, la actividad CETP humana fue inhibido por 100% a la concentración de igual o más superior a 10 \mug/ml. Por el contrario, el anticuerpo monoclonal, \alm{1} 86-2, no mostró la inhibición dependiente de la dosis. Este anticuerpo monoclonal indica la inhibición máxima (58%) en la concentración de aproximadamente 0,5 \mug/ml; sin embargo, no indicaba la inhibición a la concentración igual o superior a 17 \mug/ml. El anticuerpo monoclonal, \alm{1} 176-1, no mostró actividad de inhibición CETP dependiente de la dosis, tampoco él \alm{1} 86-2, y indica la inhibición máxima (50%) ocurriendo a una concentración aproximadamente
de 1,0 \mug/ml.

Sobre la base de los resultados de más arriba, se demuestra que hay una posibilidad alta de que el reconocimiento del epítope por el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1 es diferente que reconocía por los otros anticuerpos monoclonales, \alm{1} 86-2 y \alm{1} 176-1,

<5-2> Reactividad para CETP de conejo

La reactividad respectiva del anticuerpo monoclonal, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, y \alm{1} 176-1 preparado en el Ejemplo 3 para la CETP conejo se confirma por el sistema de ensayo de CETP de manera similar al Ejemplo 1. La CETP de conejo purificado, la lipoproteína donante y la aceptora usada por el sistema de ensayo esta preparada como se describe abajo.

<5-2-1> Preparaciones CETP de conejo purificado

Los procedimientos siguientes se llevan a cabo de acuerdo con un método conocido a 4ºC o en baño de hielo.

(1) Tratamiento de Sulfato de Dextrana

La sangre periférica fue obtenida desde varios conejos (Japan White, Kitayama rabes). La sangre se centrifuga para eliminar los glóbulos rojos de acuerdo con el método de convencional, y ciento ml de plasma de conejo se obtienen. Dos cientos de ml de agua destilada, 10 ml de 10% de sulfato de dextrana (peso molecular de 500,000 Da), y 7,9 ml de 4 M de CaCl_{2} se adiciona a los 100 ml de plasma obtenido, y la mezcla se agita suavemente en el baño de hielo durante 15 minutos. La mezcla se centrifuga por 20,000 g y luego durante 20 horas a 4ºC para fraccionar el complejo de sulfato de dextrana insoluble/lipoproteína, y luego los sobrenadantes se recogen.

(2) Purificación por cromatografía de PHENYL SEPHAROSE^{TM}

3 M NaCl, 0,01% NaN_{3}, 50 \mug/ml de sulfato de Gentamicina, y 0,05% EDTA se adicionan al sobrenadante obtenido en el anterior (1), y ajustan a pH 7,4. Antes de poner la mezcla más arriba, Hiload 26/10 (Pharmacia Biotech PHENYL SEPHAROSE^{TM}) se equilibra con la misma solución escrita de arriba. Luego, la mezcla fue aplicada a la columna, y lavada con solución 0,15 M NaCl (pH 7,4) conteniendo 0,01%, NaN_{3}, sulfato de Gentamicina (50 \mug/ml) y 0,05% EDTA. Después de eso componentes adsorbidos fueron eluidos usando la solución sin NaCl, y etanol 20%. El perfil de elución fue controlado midiendo el absorbancia a 280 nm.

El resultado es mostrado en la Fig. 6. Sobre la base del perfil elución, las fracciones activas que contienen CETP de conejo fueron unidas.

(3) Purificación de cromatografía BLUE SEPHAROSE^{TM}

Las fracciones activas obtenidas en el anterior (2) se hace diálisis contra búfer de 50 mM HEPES (ácido de N-2-hidroxietilpiperadina-n'-2-etano sulfónico) (pH 7,0). Luego, la muestra se hace diálisis se aplica sobre la columna de BLUE SEPHAROSE^{TM} (CL-6B, 1,5x8.5 cm, Pharmacia Biotech) que se equilibra con el búfer. La columna se lava con el búfer, y luego eluida con la solución que comprende 1,5 M NaCl y el búfer (pH 7,0). El perfil de elución fue controlado midiendo la absorbancia a 280 nm.

El resultado es mostrado en la Fig. 7. Sobre la base del perfil de elución, son unidas las fracciones activas que contienen CETP de conejo.

(4) Purificación en columna de SEPHAROSE^{TM} de LDL succinilada

Las fracciones activas obtenidas en el paso más arriba (3) se hacen diálisis contra la solución que contiene 60 mM de NaCl, 0,025% EDTA, y búfer 50 mM de HEPES (pH 7,4). Luego la columna de SEPHAROSE^{TM} de LDL succinilada se prepara añadiendo la LDL succinilada en SEPHAROSA 4B^{TM} activada con Bromuro de cianógeno (1,5 x 8.5 cm, Pharmacia Biotech). La columna se equilibra con 39 mM búfer fosfato (pH 7,4) y 60 mM NaCl (pH 7,4) conteniendo 0,025%. Luego, la muestra se le hace diálisis y se aplica a la columna. La columna se lava con el mismo búfer, y luego se eluye con la solución (pH 7,4) conteniendo 0,01% EDTA. El perfil de elución es de controlado midiendo la absorbancia a 280 nm.

El resultado es mostrado en la Fig. 8. Sobre la base del perfil de elución son unidas las fracciones activas que contienen CETP de conejo para obtener la CETP de conejo purificado.

<5-2-2> La lipoproteína donante y aceptora

De acuerdo con un método similar al descrito tanto en el Ejemplo <1-1> como en el <1-2>, tanto la lipoproteína donante ([^{3}H] CE-HDL_{3} conteniendo 0,21 \mug de colesterol) como la lipoproteína aceptora (LDL conteniendo 21 \mug de colesterol) se preparan usando plasma de conejo.

<5-2-3> Confirmación de la reactividad de CETP de conejo

La reactividad respectiva de los anticuerpos monoclonales, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, y \alm{1} 176-1 contra CETP de conejo se confirman por el sistema de ensayo de actividad de CETP en la que CETP de conejo purificado se prepara en <5-2-1>, y a quien la lipoproteína donante y la aceptora se preparan en <5-2-2> y se usan de la misma manera como en el Ejemplo <5-1>.

El resultado es mostrado en la Fig. 9. Ninguno de los anticuerpos monoclonales \alm{1} 86-2 y \alm{1} 176-1 inhibe la actividad de transporte de CE de conejo independiente de la concentración CETP. Por lo tanto, estos anticuerpos monoclonales no tienen reactividad específica a CETP de conejo. Además, el anticuerpo monoclonal \alm{1} 72-1 no mostró reactividad detectable a CETP de conejo en la concentración inferior o igual a aproximadamente 3 \mug/ml.

Ejemplo 6 Preparaciones de fragmentos de anticuerpos F(ab')_{2} y Fab

El F(ab')_{2} y Fab de los anticuerpos monoclonales purificados \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, y \alm{1} 176-1 preparados en el Ejemplo 3, son preparados de la siguiente manera.

Cada uno de los anticuerpos monoclonales (5 mg/ml respectivamente) se le adicionan 20 mM de búfer acetato pH 3,5, y se incuba durante 30 minutos a 37ºC. Luego, un ml de pepsina insolubilizada (Pierce) se adicionan a la solución incubada, y la mezcla se incuba posteriormente 12 horas a 37ºC mientras se rota por un rotador. Después de esto, la mezcla de reacción se centrifuga por 3,000 rpm durante 10 minutos a 4ºC para colectar los sobrenadantes como el primer sobrenadante.

El sobrenadante se somete cromatografía de afinidad de proteína A, usando un equipo de columna de proteína A (Amersham), y el procedimiento se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo anexado. Un búfer de unión se adiciona al precipitado para la suspensión, y luego la suspensión se centrifuga a 3,000 rpm durante 10 minutos a 4ºC para colectar los sobrenadantes como el segundo sobrenadante. Ambos el primero y segundo sobrenadante son unidos, y la misma cantidad del búfer de unión se adiciona. Luego, 1 N de Hidróxido de sodio se adiciona para ajustarse a pH 8,9. La columna Proteína A SEPHAROSA^{TM} se equilibra con el búfer de unión antes de aplicar la mezcla. La columna se lava dos veces con 5 ml del búfer de unión, y luego se obtienen las fracciones eluidas. Las fracciones eluidas se hacen diálisis contra 2 L de 5 mM búfer fosfato (pH 6.8) durante 24 horas a 4ºC.

La purificación posterior, de la muestra hecha diálisis es sometida a HPLC usando columna Hidroxil apatita (Bio Rad). La muestra hecha diálisis se aplica en la columna de Hidroxil apatita. Luego, la columna se lava con 5 mM de fosfato durante 15 minutos. Componentes retenidos en la columna son posteriormente eluidas, con un gradiente de elución de búfer 5 mM de fosfato hasta 0,4 M. Los eluentes son fraccionados usando un colector de fracciones. El perfil de elución es controlado por medición de la absorbancia a 280 nm para obtener las fracciones que contienen F(ab')_{2} y Fab. Las fracciones unidas se le hacen diálisis contra 2 L de búfer fosfato a 4ºC durante 24 horas para obtener F(ab')_{2} y Fab respectivo de los anticuerpos monoclonales, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2; y \alm{1} 176-1.

Ejemplo 7 Establecimiento del método de ensayo de CETP humana usando el ELISA tipo sándwich <7-1> Preparaciones de la fase sólida con anticuerpo monoclonal inmovilizado

Cada uno de los anticuerpos monoclonales purificados, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 y \alm{1} 176-1 preparados en el Ejemplo 3 se diluyen con búfer fosfato (pH 7,4) para 10 ng/pocillo a 1 \mug/pocillo. Cincuenta \mul de cada solución de anticuerpo diluido se adicionan sobre los 96 pocillos de la placa de micro titulación por ELISA (Corning). Las placas con las soluciones son incubadas a 4ºC durante 24 horas para adsorber cada anticuerpo monoclonal en el interior del pocillo. Luego, cada pocillo se lava cuatro veces con 300 \mul de la solución de fosfato que contiene 0,1% TWEEN 20, Después de descargado el búfer fosfato, 300 \mul de un agente bloqueador, BLOCK ACE^{TM} (Dainippon Pharmaceutical), se adiciona al pocillo para incubar durante 2 horas a la temperatura ambiente para bloquear los sitios desatados por el anticuerpo. Cada pocillo se lava cuatro veces con 300 \mul de la solución de fosfato que contiene 0,1% Tween 20.

<7-2> Preparaciones de anticuerpos monoclonales marcados

Un mg/ml de cada una de las soluciones del anticuerpo monoclonal purificado, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 y \alm{1} 176-1, preparado en el Ejemplo 3 se hace diálisis contra 0,1 M NaHCO_{3} (pH 8.2 a 8.3) a 4ºC durante 24 horas. Luego, 100 \mul de NHS-biotina (2 mg/ml, Funakoshi) se adiciona a la solución de anticuerpo dializada, y se agita enérgicamente. La solución de anticuerpo se incuba a 4 horas a la temperatura ambiente. Después de eso la solución de anticuerpo es dializada contra el búfer fosfato a 4ºC durante 24 horas.

<7-3> El establecimiento del método de ensayo usando el ELISA de sándwich

El método de ensayo ELISA CETP humana de sándwich establecido en la presente invención es como sigue.

Cada uno de el anticuerpos monoclonal, \alm{1} 72-1; \alm{1} 86-2, y \alm{1} 176-1 se inmoviliza respectivamente en las microplacas a la concentración de 10 ng/pocillo hasta 1 \mug/pocillo descrito en <7-1>. Las microplacas preparadas antes mencionados se refieren como microplacas inmovilizada. Las placas inmovilizadas se lavan tres veces con búfer de fosfato que contiene 0,1% TWEEN 20, El búfer fosfato que contiene 10% BOLCK ACE^{TM} (Dainippon Pharm-) se usa para diluir las muestras que fueron preparada del estándar de CETP humana purificado preparado en el Ejemplo <4-2>, la lipoproteína retirada de plasma de voluntarios sanos preparados en el Ejemplo <2-1>, o de plasma de varios pacientes preparados de la misma manera descrita en el Ejemplo <2-1>. Las placas inmovilizadas con 100 \mul de las muestras diluidas se incuban a la temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavan tres veces con búfer de fosfato que contiene 0,1% TWEEN 20 ^{TM}. Los anticuerpos monoclonales marcado con biotina, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2, o \alm{1} 176-1, preparados en el ejemplo <7-2> se diluyen con búfer fosfato que contiene 10% BOLCK ACE^{TM} a 3 ng/pocillo a 1 \mug/pocillo. Luego, a las placas se adicionan 50 \mul de anticuerpo monoclonal marcado con biotina e incuban a la temperatura ambiente durante 1 hora. Después de eso, las microplacas inmovilizadas se lavan tres veces con el búfer fosfato que contiene 0,1% TWEEN 20T^{M}, Cincuenta \mul de estreptoavidina \beta-galactosidasa (Gibco BRL) diluidas 1,000 veces con la solución que contiene 20 mM HEPES y NaCl 0,5 M (pH 7,0) contiene albúmina de suero bovino (BSA, 1 mg/ml) se adiciona a cada uno de los pocillos de la placa inmovilizada. Luego, las microplacas inmovilizadas se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora.

La microplaca inmovilizada se lava tres veces con el búfer fosfato que contiene 0,1% TWEEN 20, Después de eso, 50 \mul de 0,015% ó 0,01% de 4-metilo metillumbeliferil-\beta-D-galactosidasa (Sigma) diluida con 10 mM búfer fosfato que contiene 1 mg/ml de BSA, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl_{2} (pH 7,0) se adiciona 1 mg a cada pocillo de la microplacas inmovilizada. Luego, la microplaca inmovilizada es incubada a temperatura ambiente por 10 o 20 minutos. Después de eso, 100 \mul de la solución de Na_{2}CO_{3} se adiciona a los pocillos para poner fin a la reacción. La intensidad de fluorescencia de los pocillos es medida con Fluoroscan II microplaca fluorometer (Flow Laboratories) emisión de longitud de onda a 460 nm (355 nm para la excitación). La cantidad CETP en la muestra se determina desde la curva de calibración obtenida en los siguientes ejemplos.

Los resultados del ensayo cuando varias combinaciones de los anticuerpos monoclonales (\alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2,
y \alm{1} 176-1) inmovilizados o marcados se muestran en la Fig. 10 hasta la 12. Por consiguiente, se confirma que el ensayo cuantitativo se sucede por uso de una combinación de los diferentes anticuerpos monoclonales, \alm{1} 72-1, \alm{1} 86-2 y \alm{1} 176-1, inmovilizado o marcado, por ejemplo, \alm{1} 72-1 y \alm{1} 86-2, ó \alm{1} 72-1 y \alm{1} 176-1,

La concentración óptima del anticuerpo monoclonal inmovilizado ó marcado se determinada bajo las siguientes condiciones. Como sustrato se usa 4-metilo metilumbelliferil-\beta-D-galactosidasa, y como una muestra ensayo, se usa la lipoproteína retirada del plasma desde voluntarios sanos preparada en el Ejemplo <2-1>.

(1) El anticuerpo monoclonal inmovilizado

Anticuerpo monoclonal marcado \alm{1} 72-1 (10 ng hasta 1 \mug/pocillo):

\alm{1} 86-2 ó \alm{1} 176-1 (10 ng hasta 1 \mug/pocillo):

Concentración de sustrato de 0,01

Tiempo de reacción: 10 minutos

(2) El anticuerpo monoclonal inmovilizado

\alm{1} 72-1 (1 \mug/pocillo)

Anticuerpo monoclonal marcado

\alm{1} 86-2 (1 a 3 ng/pocillo)

Concentración de sustrato: 0,015%

Tiempo de reacción: 20 minutos

Los resultados son mostrados en las figuras 13 hasta la 17.

Como se muestran en las Fig. 13 a 17, la concentración óptima del anticuerpo monoclonal inmovilizado; \alm{1} 72-1 es 1 \mug/pocillo (20 \mug/ml), y el anticuerpo monoclonal marcado, \alm{1} 86-2, es de 100 ng/pocillo (2 \mug/ml) cuando el tiempo de reacción es de 10 minutos, y 3 ng/pocillo (60 ng/ml) cuando el tiempo de reacción es de 20 minutos. Teniendo en cuenta, la concentración óptima del anticuerpo monoclonal marcado puede ser fijada de acuerdo al tiempo de reacción ya que la concentración óptima depende del tiempo de reacción.

En los siguientes ejemplos, ELISA de sándwich se emplean, y las condiciones son como siguen:

El anticuerpo monoclonal inmovilizado:

\alm{1} 72-1 (1 \mug/pocillo (20 \mu g/ml))

El anticuerpo monoclonal marcado:

\alm{1} 86-2 (3 ng/pocillo (60 \mug/ml))

El tiempo de reacción con sustrato: 20 minutos

<7-4> Preparación de una curva de calibración y confirmación de la exactitud de los presente ensayos <7-4-1> Preparación de una curva de calibración

Una curva de calibración se prepara usando ELISA de sándwich establecido en el ejemplo <7-3>. Como un estándar, la CETP humana purificada se prepara y se usa como en <4-2>. Como un anticuerpo monoclonal inmovilizado; \alm{1} 72-1 (1 \mug/pocillo), y también se usa como uno marcado, \alm{1} 86-2 (3 ng/pocillo). El resultado es mostrado en la Fig. 18.

Como se muestra en la Fig. 18, la curva de calibración es casi lineal en la extensión en un rango de concentración muy baja entre 0,4 a 1,25 ng/ml (coeficiente de correlación: r = 0,995). El límite de cuantificación de ELISA de sándwich (el límite de detección) de la presente invención es 0,4 ng/ml. Esto es demostrado, en la comparación con el estado anterior de la técnica, que el ELISA de sándwich de la presente invención tiene una sensibilidad cuantitativa excelente, es decir la sensibilidad de detección es excelente.

<7-4-2> Cálculo del coeficiente de la variación

En orden de estudiar la exactitud del método de ensayo de la presente invención, el coeficiente de variación (c.v.) en la misma placa (en casi 48 pocillos de los 96 pocillos de la placa) sea tan bueno en 6 placas diferentes en que sean calculados. El c.v. obtenido en la misma placa es de 7,06%, y el obtenido en placas diferentes 6.13%. Por lo tanto, se demostrado que el sistema de ensayo usado ELISA de sandwich de la presente invención tiene una alta exactitud.

<7-5> Experimento preliminar para establecimiento del sistema de ensayo de CETP humana <7-5-1> Estudio de la influencia en la capacidad de cuantificación del ensayo por los componentes en el plasma humano

Para estudiar la existencia de los componentes en el plasma que pueden afectar la capacidad de cuantificación de CETP humana, se llevan a cabo las siguientes pruebas.

La CETP humana purificada preparada en el ejemplo <4-2> (0,735 \mug/ml, ó 1,469 \mug/ml) se adicionan al plasma que contiene 0,56 \mug/ml de CETP, el que se prepara de manera similar desde los voluntarios sanos en el Ejemplo <2-1>. Luego, la cantidad de CETP se determina usando el método establecido en <7-3> antes mencionado.

Cuando 0,735 \mug/ml ó 1,469 \mug/ml de CETP se adicionan, la cantidad CETP total de cada muestra antes de la incubación se calculó como 1,294 \mug/ml ó 2,029 \mug/ml, respectivamente. Por otro lado, las cantidades totales de CETP recuperado fue de 1,440 \mug/ml y 2,189 \mug/ml; y los porcentajes de recuperación son 111% y 108% respectivamente.

Por consiguiente, se demuestra que el plasma humano no contenía ningún componente que afecte la cuantificación de CETP por el método de ensayo de la presente invención. Por lo tanto; se demuestra que la cantidad de CETP en plasma humano se determina con exactitud usando el método de la presente invención.

<7-5-2> Influencia de lipoproteínas en plasma humano

En el orden de estudiar la influencia sobre la sensibilidad cuantitativa por las sustancias tales como lipoproteínas excepto CETP por la cuantificación de CETP humana en plasma, CETPs humano de diferente pureza como muestras de ensayo se estudian por uso el sistema de ensayo establecido en el <7-3> antes mencionado.

Para la determinación, los siguientes muestras son usadas;

(1) El plasma desde el que solamente hemocitos fueron retirados por centrifugación en el Ejemplo <2-1>

(2) El plasma definitivamente para obtener en el Ejemplo <2-1> en el que las lipoproteínas se retiran sin lipoproteínas

(3) La CETP purificado por una columna de FENIL SEPHAROSA en <2-2>

(4) La CETP humana purificada preparada en el Ejemplo <4-2>.

El resultado se muestra en la Fig. 19. Curvas cuantitativas (curvas de dilución) por muestras más arriba (1), (2), y (3) obtenido son paralelos respectivamente con la CETP humana purificada (4).

Por consiguiente, fue demostrado que las lipoproteínas en plasma humano no afectaron la cuantificación de CETP por el método de la presente invención. Por lo tanto, fue mostrado que el método de cuantificación de la presente invención puede ser aplicado la irrespectiva pureza de la muestra.

<7-5-3> Correlación de la cantidad CETP y la actividad de CETP

Para investigar la precisión del método de cuantificación de la presente invención, una correlación entre la cantidad CETP determinada en la muestra de plasma humano y la actividad de CETP en la muestra de plasma fue investigado.

Cuantificación de la cantidad de CETP es demostrada usando plasma sin lipoproteína como el obtenido en el Ejemplo <2-1> como una muestra de ensayo. La actividad de CETP se mide usando la misma muestra de plasma usada en la cuantificación más arriba, usando el sistema de ensayo de CETP del Ejemplo 1. El resultado es mostrado en la Fig. 20.

Desde que el coeficiente de correlación (r) obtenido es 0,953, la cantidad de CETP determinada por el método de la presente invención y las actividades de CETP de la misma muestra muy alta correlación. Como el resultado, demuestra que el sistema de ensayo de la presente invención tiene muy alta precisión.

Ejemplo 8 Determinación de CETP humana en plasma humano

Las cantidades de CETP en el plasma de varios voluntarios o pacientes sanos fueron cuantificadas usando el método de ELISA de sándwich establecido en el ejemplo <7-3>.

La actividad de CETP de plasma es medido usando la lipoproteína donante ([^{3}H] CE-HDL_{3} que contiene 6 \mug de CE) preparado de una manera similar como en el Ejemplo <1-1> y la lipoproteína aceptora (LDL que contiene 600 \mug de CE) preparada de una manera similar como en el Ejemplo <1-2> con el sistema de ensayo de CETP establecido en el Ejemplo <1-3>.

El plasma humano usado en el presente ensayo desde pacientes ó voluntarios sanos (13), y de hiperlipídemia tipo IIA (5), hiperlípidemia del tipo IIB (5), deficiencia de CETP (2), deficiencia de LCAT (2), y hiperalfalipoproteinemia (pacientes hiper HDL) (1). Los resultados se muestran en la Fig. 21.

Las muestras de los voluntarios sanos y de varios pacientes indican las altas correlaciones entre la cantidad de CETP cuantificada y su actividad de CETP. Como esperamos, que la CETP no fuese detectado en el plasma de los pacientes con la deficiencia CETP. Además, de demuestra en el método de ensayo de la presente invención puede ser aplicado no solamente al plasma de voluntarios sanos pero también a pacientes con varias enfermedades.

Ejemplo 9 Comparación con el método de cuantificación convencional

Las pruebas siguientes se llevan a cabo para confirmar la utilidad del sistema de ensayo de la presente invención sobre el método convencional que emplea ELISA de sándwich para el ensayo de CETP humana.

En el método convencional, antes mencionado de cuantificación, a simple vista los tratamientos con agentes activos (detergente) como TRITON-100^{TH} o el calentamiento han sido llevados a cabo para exponer los epítopes bloqueados por la interacción proteína-proteína ó proteína-lipoproteína. Sin embargo, tales tratamientos causan desnaturalización de las proteínas como CETP en la muestra, y la proteína pierde su estructura altamente ordenada convirtiéndose en inactivas biológicamente. Debido a que CETP detectado o determinado por el método convencional es CETP no intacto, pero solamente CETP desnaturalizado, es imposible para determinar la cantidad de CETP con exactitud en el plasma.

Las siguientes muestras fueron usadas en el experimento.

(1) El plasma de voluntarios sanos sin lipoproteínas preparado de la misma manera como en el ejemplo <2-1> (un diluente búfer fosfato con 10% BLOCK ACE^{TM}).

(2) El plasma de voluntarios sanos sin lipoproteínas en el que incuba con 0,1% TWEEN20^{TM} (detergente).

(3) El plasma de voluntarios sanos sin lipoproteínas, que fue calentado a 95ºC durante 5 minutos.

(4) El plasma de voluntarios sanos sin lipoproteínas, el que fue incubado con 1%. TRITON X-100^{TM}. El resultado es mostrado en la Fig. 22.

CETP no fue detectado para plasma tratado con 1% de TRITON X-100^{TM} o por calor. En particular, absolutamente no fue notado CETP en el plasma tratado por calor. Además, la capacidad de cuantificación fue reducida más de un 30% en el plasma tratado incluso con la concentración más baja de TWEEN 20^{TM}. Es decir se confirma que la cuantificación precisa de CETPs intactos en el plasma humano fue posible usando el método de ensayo de la presente invención, que había sido imposible por el método de determinación convencional (ensayo) "El cual requiere de tratamiento con agentes activos de detergentes o por calor" desde el anticuerpo monoclonal de la presente invención tiene reactividad específica para CETPs intacta en el plasma humano. Además, también es claro que los anticuerpos monoclonales conocidos para el CETPs humano para reaccionar específicamente con el CETPs humano desnaturalizado.

Ejemplo 10 Preparación de las composiciones farmacéuticas y su actividad de inhibición de CETP

Los anticuerpos monoclonales purificados, \alm{1} 72-1; \alm{1} 86-2, y \alm{1} 176-1 y preparados en el Ejemplo 3 a concentración de 50-150 \mug/ml son disueltos en 10 ml de agua destilada para las inyecciones.

Anticuerpo monoclonal CETP anti-conejo el que fue preparado de una forma semejante a la manera del Ejemplo 3, usando la CETP de conejo purificado preparado en el ejemplo <5-2-1> como inmunógeno. Es decir ratones BALB/c (femenino 4-5 semanas (Shizuoka Experimental Animal Center) se inmuniza con CETP de conejo purificado para obtener dos hibridomas \alm{1} 2-64 y \alm{1} 9-1, los que producen anticuerpos monoclonales anti-conejo. Cada hibridoma fue trasplantado a ratones desnudos ICR (femenino, Charles River) para preparar anticuerpos monoclonales anti-conejo de la ascitis. Los anticuerpos monoclonales \alm{1} 2-64 y \alm{1} 9-1 son obtenidos; y ambos son IgG1. El anticuerpo monoclonal; \alm{1} 2-64, fue disuelto en agua destilada y para inyecciones a una concentración de 0,13 mg/ml. El anticuerpo monoclonal, \alm{1} 9-1, esta a una concentración de 5,53 mg/ml. Por lo tanto, inyecciones preparadas que contienen cualquiera \alm{1} 2-64 ó \alm{1} 9-1 y fueron administradas a un conejo a una dosis de 1,8 mg/kg del peso corporal por vía intravenosa. La época de la administración inicial fue puesta en 0, y el anticuerpo monoclonal fue administrado a la misma dosis cada 24 horas. La sangre fue probada a las 1, 2, 24 horas a partir de la administración inicial para obtener plasma.

Las actividades CETP obtenidas en el plasma son determinadas usando el ELISA sándwich como método establecido para la cuantificación de CETP de conejo con estos anticuerpos monoclonales, \alm{1} 2-64 y \alm{1} 9-1, de forma semejante como en el Ejemplo 1. Los resultados son mostrados en la Fig. 23.

Se demuestra que los anticuerpos monoclonales, \alm{1} 2-64 y \alm{1} 9-1, inhiben significativamente CETP en plasma de conejo.

Ejemplo 11 Producción de ratones transgénicos que expresan CETP humano

Un plásmido que contiene ADNc que codifica CETP humana fue obtenido de la siguiente manera. Un fragmento de ADNc que codifica para CETP humana fue amplificado por PCR con un alargamiento 5' a una librería de ADNc del hígado humano (Clonetech) como una plantilla. Los productos de PCR se separan por electroforesis de gel de agarosa con un método conocido. El fragmento de ADNc de interés fue extirpado del gel y este gel y se disuelve por QIAEX (QUIAGEN). El fragmento obtenido fue insertado dentro de un vector pCR II (INV-ITROGEN). El vector pCR II se introduce dentro de células competentes de DH5 E.coli para obtener suficiente cantidad de plásmido para llevar a cabo la secuenciación del ADN. Después de la secuenciación, fue confirmado el ADNc CETP
humana.

El ADNc que codifica la CETP humana obtenido más arriba se trata con un conjunto de ligación de ADN (Takara), y se inserta dentro de un vector que contiene promotor \beta-actin (Mol. Cel. Inmunol., 4: 1961-1969 (1984); Ibíd., 5:2720-2732 (1985)) para obtener el plásmido, pCETP-1. Por electroporación, pCETP-1 fue introducido en células de COS, y luego después de cultivadas las células de COS transformadas, el ARN fue obtenido de acuerdo con un método conocido. RT-PCR se lleva a cabo usando el ARN para confirmar la transcripción específica de CETP humana en las células de COS introducida el pCETP-1. Otro transformante se produce de forma semejante a las células de COS usando el vector de expresión pME 18S. La expresión de CETP humana en los transformantes se ensayan usando ELISA de sándwich establecido en el Ejemplo 7. Para producir a ratones transgénico, el plásmido, pCETP-1, se linealiza por tratamiento con enzima de restricción.

Ratones ICR de sexo femenino que tenían una obturación vaginal fueron empleados como ratones madres adoptivas. Estos ratones son obtenidos apareando ratones ICR blancos de sexo femenino (Japan Crea) con ratones machos blancos ICR con ligazón en el conducto seminal (Japan Crea). Ratones hembras negros C57BL/6J (Japan Crea) se emplean como ratones para obtener embriones para la introducción de gen CETP humana. Estos ratones son obtenidos uniendo a ratones negros C57BL/6J ((Japan Crea) con ratones hembras negra C57BL/6J (Japan Crea), las hembras dan 5 unidades de PEAMEX y 5 unidades de PUBEROGEN para súper ovulación (ambos de Sankyo). Después de la unión, el oviducto es extirpado de los ratones de C57BL/6J de sexo femenino tratado con hialuronidasa para obtener embriones, que son almacenados en un medio.

La introducción de un gen de CETP humana dentro de los embriones fue llevada a cabo usando un manipulador bajo un microscopio de acuerdo con un método conocido. El embrión es conservado sujetando una aguja a 37ºC y la solución que contiene el gen lineal de CETP humana diluida en un búfer Iris-EDTA y es introducido dentro del pronúcleo macho del embrión usando una aguja introducida ADN.

Después de introducido el gen, se almacenan solamente embriones a las condiciones normales seleccionadas. Luego, son insertados óvulos fecundados en los que el gen de CETP humana ha estado integrado y en oviductos dentro del ovario de las ratones madre adoptivas, es decir de los ratones blancos ICR.

Colas de los ratones de progenie llamados los heteroratones provenientes de los ratones de madres adoptivas, y se cortan para investigar si el gen de CETP humana ya esta integrado en el gen genómico del ratón. Usando el método de PCR, esta integración dentro el gen genómico de ratón se confirma, y la expresión de CETP humana es también confirmada usando el ELISA de sándwich establecido en el Ejemplo 7,

Apareando a dos heteroratones descritos de arriba, ratones transgénicos que altamente expresan CETP humana y se produjeron como homoratones.

Ejemplo 12 Inhibición CETP en vivo por anticuerpo monoclonal antiCETP

Dos tipos de anticuerpos monoclonales CETP anti-humanos purificados, \alm{1} 72-1 y \alm{1} 86-2, preparados en el Ejemplo 3 se disolvieron en agua destilada para inyecciones en una proporción de concentración de 29:1 para preparar las inyecciones.

La solución de mezcla inyectable es administrada vía intraperitoneal. Para 3 ratones transgénicos femeninos que expresan altamente CETP producido en el Ejemplo 11 a una dosis de 100 miligramos/kg por simple inyección. Estos ratones se alimentan libremente de una comida tipo pastilla para la procreación por 4 meses.

El tiempo justo antes de la administración del anticuerpo fue fijado en 0, y la sangre oftálmica fue probada a los tiempos de 1, 3, 6, y 24 horas y el plasma es separado por centrifugación. La actividad CETP en el plasma obtenido (actividad de inhibición CETP por un anticuerpo CETP anti-humano) determinado por medición de la cantidad de CE (éster de colesterol) transportado desde HDL a LDL usando un sistema de cuantificación de actividad CETP establecido en el Ejemplo 1.

El resultado se muestra en la Fig. 24.

Se confirmó que el anticuerpo monoclonal de la presente invención inhibe completamente la actividad de CETP humana en vivo. Además, tal efecto de inhibición para la actividad de CETP humana en vivo fue aclarado por la presente invención.

Ejemplo 13

Prevención de la arteriosclerosis por el anticuerpo monoclonal anti-CETP

Dos tipos de anticuerpos monoclonales CETP anti-humanos purificados, 72-1 y \alm{1} 86-2, preparados en el Ejemplo 3 y se disuelven en agua destilada para inyecciones en una proporción de concentración de 29:1 para preparar las inyecciones.

La solución de mezcla inyectable es administrada vía intraperitoneal. Para 3 ratones transgénicos femeninos que expresan altamente CETP producido en el Ejemplo 11 a una dosis de 75 miligramos/kg por día durante 4 días. Estos ratones se alimentan libremente de una comida tipo pastilla para la procreación por 6 semanas. Fue administrado PBS (fosfato protegido salino) a otros ratones como control.

El tiempo justo antes de la administración del anticuerpo fue fijado en 0, y la sangre oftálmica fue probada a los días 2, 4, 8, y 11 y el plasma es separado por centrifugación. Las cantidades de colesterol HDL en el plasma obtenido fueron determinadas usando el conjunto de determinación de lipoproteínas (Liquitec TC1/TC2, Boehringer Mannheim). Para el fraccionamiento del HDL, fue empleado reactivo de separación de colesterol de HDL (Boehringer Mannheim). El resultado es mostrado en la Fig. 25.

Se demostró que el estándar de colesterol HDL en sangre aumentó significativamente cuando el anticuerpo monoclonal CETP anti-humano de la presente invención fue administrado en vivo. El HDL es considerado una importante lipoproteína que tiene efecto antiarteriosclerosis. A decir verdad, es mostrado que el desarrollo de arteriosclerosis se previene ó recesa por el aumento de HDL en sangre (J. Clin. Invest., 85: 1234-1241 (1990)).

La observación de que la administración del anticuerpo CETP anti-humano en vivo incrementa el estándar de colesterol HDL en sangre fue aclarado primero por la presente invención. Por lo tanto, el resultado de la prueba mencionada anteriormente revela que el anticuerpo monoclonal de la presente invención es muy útil para la prevención y/ó tratamiento de la arteriosclerosis.

Desde la alta actividad inhibidora de CETP humana por el anticuerpo monoclonal de la presente invención mostrada en el Ejemplo 5-1 y de los resultados obtenidos en los Ejemplos 10 al 13, se muestra evidentemente que el anticuerpo monoclonal de la presente invención es útil en el tratamiento y prevención de los trastornos causados por la cinética anormal de CETP en el cuerpo tales como hiperlipidemia o arteriosclerosis.

Utilidad industrial

Debido a que el anticuerpo monoclonal CETP anti-humano de la presente invención tiene una alta especificidad de unión a CETP humana (actividad de inhibición CETP), particularmente al CETP intacta en el fluido corporal humano como plasma y puede ser determinado convenientemente y con la sensibilidad alta. Tal método de determinación (ensayo) no ha sido establecido antes.

Particularmente, sobre la base de las características antes mencionadas de cualquiera de los tres anticuerpos monoclonales CETP anti-humanos de la presente invención, la CETP intacta en un cuerpo humano puede más conveniente cuantificado y sensiblemente cuando en ELISA sándwich es empleada cualquier combinación de los dos anticuerpos monoclonal descritos arriba.

En el método de cuantificación empleando el anticuerpo monoclonal de la presente invención, la cantidad de CETP en el fluido corporal como plasma es cuantificada convenientemente con alta sensibilidad sin cualquier pre-tratamiento tales como ésos agentes por la superficie activo o calor.

Ya que el anticuerpo monoclonal CETP anti-humano de la presente invención tiene excelente actividad de inhibición. CETP, es útil para la preparación de fármacos y/o tratamiento de diversas enfermedades como arteriosclerosis, hiperlipidemia, y de hiperalfalipoproteínemia causadas por la cinética anormal de CETP.

Claims

1. Una línea de célula de hibridoma que segrega un anticuerpo monoclonal CETP anti-humano, en la que dicha la línea de célula hibridoma es seleccionada entre el grupo que consta de la línea de célula depositada con el Número de Acceso FERM BP-4944 y la línea de célula depositada con el Número de Acceso FERM BP-4945.

2. Un anticuerpo monoclonal CETP anti-humano, en el que dicho anticuerpo monoclonal es segregado por una línea de célula hibridoma seleccionada del grupo que consta de la línea de célula depositada con el Número de Acceso FERM BP-4944 y la línea de célula depositada con el Número de Acceso FERM BP-4945.

3. Un anticuerpo monoclonal quimérico recombinante que comprende una región variable proveniente del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 2 y una región constante de una inmunoglobulina humana.

4. Un anticuerpo monoclonal recombinante humanizado que comprende una parte o el total de las regiones que condicionan la complementariedad de la región hipervariable proveniente del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 2, regiones del esqueleto de la región hipervariable proveniente de una inmunoglobulina humana y una región constante proveniente de una inmunoglobulina humana.

5. Un fragmento F(ab')_{2} o Fab proveniente de un anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

6. Un anticuerpo monoclonal inmovilizado o un fragmento de anticuerpo inmovilizado que es preparado por inmovilización del anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 o del fragmento de anticuerpo de la reivindicación 5 sobre un portador insoluble.

7. El anticuerpo monoclonal inmovilizado o un fragmento de anticuerpo inmovilizado de la reivindicación 6, en el que dicho portador insoluble es seleccionado del grupo que consta de una placa, una probeta, un tubo, unas cuentas, una pelota, un filtro y una membrana.

8. El anticuerpo monoclonal inmovilizado o un fragmento de anticuerpo inmovilizado de la reivindicación 6, en el que dicho portador insoluble es aquel usado para cromatografía de afinidad en columna.

9. Un anticuerpo monoclonal marcado o un fragmento de anticuerpo marcado que es preparado marcando el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 o el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 5 con una sustancia de marcado capaz de proporcionar una señal detectable sola o por reacción con otra sustancia.

10. El anticuerpo monoclonal marcado o un fragmento del anticuerpo marcado de la reivindicación 9, en el que dicha sustancia marcadora es seleccionada entre el grupo que consta de una enzima, un material fluorescente, un material químico luminoso, biotina, avidina o un radioisótopo.

11. Un conjunto para un inmunoensayo de detección de CETP humana que comprende cualquiera seleccionado entre el grupo que consiste de los siguientes (a) a (e):

(a): El anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, y el anticuerpo monoclonal marcado o un fragmento de anticuerpo marcado de la reivindicación 9 o la reivindicación 10;

(b): El anticuerpo monoclonal inmovilizado o un fragmento de anticuerpo inmovilizado de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, el anticuerpo monoclonal marcado o un fragmento del anticuerpo marcado de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, y un estándar de CETP humana;

(c): El anticuerpo monoclonal inmovilizado o un fragmento de anticuerpo inmovilizado de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, y un estándar de CETP humana marcado con una sustancia de marcado capaz de proporcionar una señal detectable sola o en reacción con otra sustancia;

(d): El anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 o el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 5, y el estándar de CETP marcado con una sustancia de marcado capaz de proporcionar una señal detectable de detección sola o reaccionando con otra sustancia; y

(e): El anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 o el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 5, y el estándar de CETP marcado con una sustancia de marcado capaz de proporcionar una señal detectable de detección sola o reaccionando con otra sustancia, y antisuero derivado de un mamífero que es reactivo a dicho anticuerpo monoclonal o a dicho fragmento de anticuerpo.

12. El conjunto de la reivindicación 11 que comprende el anticuerpo monoclonal inmovilizado o un fragmento de anticuerpo inmovilizado de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, el anticuerpo monoclonal marcado o un fragmento de anticuerpo marcado de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, y un estándar de CETP humana.

13. Un método para un inmunoensayo de detección de CETP humana que comprende poner en contacto una muestra con cualquiera seleccionada entre el grupo que consta del anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones de la 2 a 4, el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 5, el anticuerpo monoclonal inmovilizado de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, el fragmento de anticuerpo inmovilizado de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, el anticuerpo monoclonal marcado de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10, y el fragmento de anticuerpo marcado de la reivindicación 9 o la reivindicación 10.

14. El método de la reivindicación 13 que comprende por lo menos los siguientes pasos:

(a): Hacer reaccionar una muestra con el anticuerpo monoclonal inmovilizado o un fragmento de anticuerpo inmovilizado de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7; y

(b): Hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal marcado o un fragmento de anticuerpo marcado de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10 con un complejo antígeno-anticuerpo formado al unir la CETP humana en dicha muestra y dicho anticuerpo monoclonal inmovilizado o un fragmento de anticuerpo inmovi- lizado.

15. El método de la reivindicación 13 que comprende al menos los siguientes pasos:

(a): Hacer reaccionar una muestra con el anticuerpo monoclonal marcado o un fragmento de anticuerpo marcado de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10; y

(b): hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal inmovilizado o un fragmento de anticuerpo inmovilizado de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7 con un complejo antígeno-anticuerpo formado al unir la CETP humana en dicha muestra y dicho anticuerpo monoclonal marcado o un fragmento de anticuerpo marcado.

16. El método de la reivindicación 13 que comprende por lo menos los siguientes pasos:

(a): hacer reaccionar una mezcla que comprende el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, el anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de anticuerpo marcado de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10, y una muestra.

17. El método de la reivindicación 13 que comprende por lo menos los siguientes pasos:

(a): Hacer reaccionar una muestra y un estándar de CETP humana marcado con una sustancia de marcado capaz de proporcionar una señal detectable sola o por reacción con otra sustancia, con el anticuerpo monoclonal inmovilizado o un fragmento de anticuerpo inmovilizado de la reivindicación 6 o la reivindicación 7.

18. El método de la reivindicación 13 que comprende por lo menos el siguiente paso (a), o los siguientes pasos de (b) y (c):

(a): hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 4 o el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 5 con una mezcla de una muestra y un estándar de CETP humana marcado con una sustancia de marcado capaz de proporcionar una señal detectable o reaccionando con otra sustancia; o

(b): hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 4 o el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 5 con una muestra; y

(c): Posterior al paso (b), hacer reaccionar un estándar de CETP humana marcado con una sustancia de marcado capaz de proporcionar una señal detectable sola o reaccionando con otra sustancia, con la mezcla de reacción del paso (b).

19. El método de la reivindicación 13 o la reivindicación 18 que comprende los siguientes pasos de (a) y (d), o los pasos de (b) a (d):

(a): hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 4 o el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 5 con una mezcla de una muestra y un estándar de CETP humana marcado con una sustancia de marcado capaz de proporcionar una señal detectable sola o reaccionando con otra sustancia;

(b): Hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 4 o el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 5 con una muestra;

(c): Posterior al paso (b), hacer reaccionar un estándar marcado de CETP humana con una sustancia de marcado capaz de proporcionar una señal detectable sola o reaccionando con otra sustancia, con la mezcla de reacción del paso (b);

(d): El hacer reaccionar antisuero de un mamífero es reactivo a dicho anticuerpo monoclonal o a dicho fragmento de anticuerpo con un complejo antígeno-anticuerpo formado por la unión de dicho anticuerpo monoclonal o dicho fragmento de anticuerpo monoclonal y de CETP humana en dicha muestra o dicho estándar de CETP humana marcado.

20. Un conjunto para la separación o la purificación de CETP humana que comprende el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado de la reivindicación 6 o de la reivindicación 8, y un búfer de elución.

21. Un método para la separación o la purificación de CETP humana por cromatografía de afinidad que comprende poner en contacto el anticuerpo monoclonal inmovilizado o el fragmento de anticuerpo inmovilizado de la reivindicación 6 o la reivindicación 8 con una muestra que contiene CETP humana.

22. El método de purificación de la reivindicación 21 en el que dicha cromatografía de afinidad es cromatografía de afinidad en columna.