ES2246715A1 - Modelo animal de enfermedades neurodegenerativas, procedimiento de obtencion y aplicaciones. - Google Patents
Modelo animal de enfermedades neurodegenerativas, procedimiento de obtencion y aplicaciones.Info
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Abstract
Modelo animal de enfermedades neurodegenerativas, procedimiento de obtención y aplicaciones. Se describe un animal no humano útil como modelo experimental de enfermedades neurodegenerativas. Este modelo animal presenta una alteración de la actividad biológica del receptor del factor trófico IGF-I localizada en las células del epitelio del plexo coroideo de los ventrículos cerebrales. Dicho modelo animal puede obtenerse mediante un proceso de transgénesis. Este modelo animal es útil para el estudio de los mecanismos etiopatogénicos de enfermedades neurodegenerativas, entre ellas las que cursan con demencia, tal como la enfermedad de Alzheimer, o para la identificación y evaluación de compuestos terapéuticos frente a dichas enfermedades.
Description
Modelo animal de enfermedades neurodegenerativas,
procedimiento de obtención y aplicaciones.
La invención se relaciona, en general, con el
tratamiento de enfermedades neurodegenerativas; y, en particular,
con el desarrollo de animales no humanos útiles como modelos de
enfermedades humanas neurodegenerativas.
El desarrollo de modelos experimentales de
enfermedades neurológicas es de gran importancia para la
investigación biomédica (Cenci MA, Whishaw IQ, Schallert T (2002)
Animal models of neurological deficits: how relevant is the rat? Nat
Rev Neurosci 3: 574-579). Para el caso de las
enfermedades neurodegenerativas el desarrollo de modelos que se
aproximan a las características de la enfermedad en seres humanos
ha supuesto un gran avance metodológico. Sin embargo, al ser todos
ellos obtenidos por manipulación genética convencional, los
recursos económicos, de personal, y de instalaciones necesarios
suelen ser muy elevados. Aunque a pesar de ello su uso se está
generalizando, su alto coste genera una enorme carga en los recursos
dedicados a la investigación.
La enfermedad de Alzheimer, un caso típico de
enfermedad neurodegenerativa que cursa con demencia, es la cuarta
causa de mortalidad en los países industrializados, con alrededor
de 13 millones de individuos afectados, número que podría ser mayor
al existir aproximadamente un 25% de casos que no se diagnostican.
El pronóstico para los próximos años es un crecimiento vertiginoso
de la cifra de afectados que podría superar los 40 millones en los
países industrializados donde se observa un envejecimiento de la
población (Dekosky et al. (2001) Epidemiology and
Pathophysiology of Alzheimer's disease, Clinical Cornestone 3 (4):
15-26). Actualmente existen pocos medicamentos
efectivos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y el
coste del tratamiento de esta enfermedad por paciente es bastante
caro actualmente, estimándose entorno a los 225.000 dólares US,
según datos de la Asociación Americana de Alzheimer. La existencia
de este grave problema de salud con un número muy limitado de
medicamentos útiles ha impulsado el desarrollo de investigación
encaminada a conocer el mecanismo etiopatogénico de dicha
enfermedad neurodegenerativa con el objetivo de identificar y
evaluar compuestos potencialmente terapéuticos frente a dicha
enfermedad.
En el caso de la enfermedad de Alzheimer, uno de
los principales avances ha venido precisamente al poderse
identificar las proteínas implicadas en el Alzheimer familiar, que
no está asociado con el envejecimiento como el Alzheimer esporádico,
que es con mucho, la forma más frecuente de la enfermedad (Mayeux R
(2003) Epidemiology of neurodegeneration. Annu Rev Neurosci 26:
81-104).
Se han desarrollado modelos transgénicos
portadores de las distintas mutaciones encontradas en pacientes de
Alzheimer familiar, tales como presenilinas y \beta amiloide
(Hock BJ, Jr., Lamb BT (2001) Transgenic mouse models of Alzheimer's
disease. Trends Genet 17: S7-12). Un inconveniente
muy importante es que si bien estos animales mutantes presentan
varios de los síntomas de la enfermedad de Alzheimer, ninguno de
ellos exhibe todo el espectro de cambios patológicos asociados a la
misma (Richardson JA, Burns DK (2002) Mouse models of Alzheimer's
disease: a quest for plaques and tangles. ILAR J 43:
89-99). En un intento de solucionar este problema se
han cruzado entre sí cepas de ratones transgénicos con las
distintas mutaciones que recrean cada una distintos aspectos de la
enfermedad para así lograr un modelo que se asemeje mejor a la
patología humana (Phinney AL, Horne P, Yang J, Janus C, Bergeron C,
Westaway D (2003) Mouse models of Alzheimer's disease: the long and
filamentous road. Neurol Res 25: 590-600). Por
ejemplo, el cruce de ratones que expresan grandes cantidades de una
de las formas mutadas de la proteína precursora de \beta amiloide
humano (APP-Swe695) con ratones que expresan formas
mutadas de presenilinas generan híbridos que presentan placas de
amiloide junto con ovillos neurofibrilares y déficits cognitivos
(Duff K, Eckman C, Zehr C, Yu X, Prada CM, Perez-tur
J, Hutton M, Buee L, Harigaya Y, Yager D, Morgan D, Gordon MN,
Holcomb L, Refolo L, Zenk B, Hardy J, Younkin S (1996) Increased
amyloid-beta42(43) in brains of mice
expressing mutant presenilin 1. Nature 383: 710-713;
Richards JG, Higgins GA, Ouagazzal AM, Ozmen L, Kew JN, Bohrmann B,
Malherbe P, Brockhaus M, Loetscher H, Czech C, Huber G, Bluethmann
H, Jacobsen H, Kemp JA (2003) PS2APP Transgenic Mice, Coexpressing
hPS2mut and hAPPswe, Show Age-Related Cognitive
Deficits Associated with Discrete Brain Amyloid Deposition and
Inflammation. J Neurosci 23: 8989-9003).
A continuación se indican, a título ilustrativo,
algunas de las patentes relacionadas con modelos animales de
enfermedad de Alzheimer: US20030229907, Transgenic
non-human mammals with progressive neurologic
disease; US20030167486, Double transgenic mice overexpressing human
beta secretase and human APP-London;
US200301
45343, Transgenic animals expressing human p25; US20030131364, Method for producing transgenic animal models with modulated phenotype and animals produced therefrom; US20030101467, Transgenic animal model for Alzheimer disease; US20030093822, Transgenic animal model of neurodegenerative disorders; US6,717,031, Method for selecting a transgenic mouse model of Alzheimer's disease; US6,593,512, Transgenic mouse expressing human tau gene; US6,563,015, Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof; US6,509,515, Transgenic mice expressing mutant human APP and forming congo red staining plaques; US6,455,757, Transgenic mice expressing human APP and TGF-beta demonstrate cerebrovascular amyloid deposits; US6,452,065, Transgenic mouse expressing non-native wild-type and familial Alzheimer's Disease mutant presenilin 1 protein on native presenilin 1 null background; WO03053136, Triple transgenic model of Alzheimer disease; WO03046172, Disease model; US6563015, Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof; WO0120977, Novel animal model of Alzheimer disease with amyloid plaques and mitochondrial dysfunctions; EP1285578, Transgenic animal model of Alzheimer's disease.
45343, Transgenic animals expressing human p25; US20030131364, Method for producing transgenic animal models with modulated phenotype and animals produced therefrom; US20030101467, Transgenic animal model for Alzheimer disease; US20030093822, Transgenic animal model of neurodegenerative disorders; US6,717,031, Method for selecting a transgenic mouse model of Alzheimer's disease; US6,593,512, Transgenic mouse expressing human tau gene; US6,563,015, Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof; US6,509,515, Transgenic mice expressing mutant human APP and forming congo red staining plaques; US6,455,757, Transgenic mice expressing human APP and TGF-beta demonstrate cerebrovascular amyloid deposits; US6,452,065, Transgenic mouse expressing non-native wild-type and familial Alzheimer's Disease mutant presenilin 1 protein on native presenilin 1 null background; WO03053136, Triple transgenic model of Alzheimer disease; WO03046172, Disease model; US6563015, Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof; WO0120977, Novel animal model of Alzheimer disease with amyloid plaques and mitochondrial dysfunctions; EP1285578, Transgenic animal model of Alzheimer's disease.
En la actualidad estos modelos animales
transgénicos son los únicos aceptados para el estudio de mecanismos
patogénicos de la enfermedad de Alzheimer y para el cribaje a nivel
farmacéutico de nuevas drogas. Dada la disparidad de modelos que se
han generado con el fin de recrear y analizar cada una de las
posibles causas de la enfermedad, la disponibilidad de los mismos
en muchos casos está restringida por cuestiones de derechos de
propiedad y sobretodo, por la falta de los recursos materiales
necesarios para generar híbridos complejos (Oddo S, Caccamo A,
Shepherd JD, Murphy MP, Golde TE, Kayed R, Metherate R, Mattson MP,
Akbari Y, LaFerla FM (2003) Triple-transgenic model
of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular
A\beta and synaptic dysfunction. Neuron 39:
409-421). Esto significa limitaciones severas en el
uso generalizado de estos modelos.
Merece la pena destacar, además, que los
medicamentos existentes actualmente para el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer son poco eficaces y que los modelos basados
en animales transgénicos existentes presentan carencias al no
reflejar perfectamente la patología de la enfermedad de Alzheimer.
Por tanto, sigue existiendo un grave problema de salud con un muy
limitado número de medicamentos útiles por lo que existe la
necesidad de desarrollar modelos experimentales alternativos a los
existentes que permitan estudiar el mecanismo etiopatogénico de
dicha enfermedad neurodegenerativa y/o identificar y evaluar
compuestos potencialmente terapéuticos frente a dicha
enfermedad.
Por otro lado, el receptor del factor de
crecimiento similar a la insulina de tipo I (IGF-I)
es una proteína de membrana perteneciente a la familia de receptores
con actividad enzimática tirosín-quinasa, muy
similar al receptor de insulina (Ullrich A, Gray A, Tam AW,
Yang-Feng T, Tsubokawa M, Collins C, Henzel W, Le
Bon T, Kathuria S, Chen E. (1986) Insulin-like
growth factor I receptor primary structure: comparison with insulin
receptor suggests structural determinants that define functional
specificity. EMBO J 5: 2503-2512). Sus amplias y muy
relevantes funciones biológicas han hecho que sea intensamente
estudiado de forma que la ruta de señalización intracelular se
conoce relativamente bien (LeRoith D, W erner H, B
eitner-Johnson D, Roberts CT, Jr. (1995) Molecular
and cellular aspects of the insulin-like growth
factor I receptor. Endocr Rev 16:143-163). Su papel
en patologías como cáncer, diabetes y neurodegeneración le hacen
diana en la búsqueda de moduladores farmacológicos de utilidad
clínica, aunque no se conoce el papel etiopatogénico, en patologías
como la enfermedad de Alzheimer, que su alteración funcional puede
inducir.
La invención se enfrenta al problema de
proporcionar nuevos modelos animales de enfermedades
neurodegenerativas humanas, tales como enfermedades
neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, entre las que se
encuentra la enfermedad de Alzheimer.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que los inventores han observado que la anulación de la
actividad funcional del receptor de IGF-I en las
células epiteliales de los plexos coroideos de los ventrículos del
cerebro de un animal permite el desarrollo de un animal modelo de
enfermedades neurodegenerativas, en general, y, en particular,
animal modelo de enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan
con demencia, tal como la enfermedad de Alzheimer, que reúne las
principales características de dicha enfermedad humana, que es
sencillo de obtener y que se puede utilizar en animales de
laboratorio con cualquier fondo genético. Para ello, y entre otras
posibilidades técnicas, se inyectó mediante cirugía estereotáxica en
los ventrículos laterales del cerebro un vector que contenía una
forma mutada del receptor de IGF-I que elimina la
actividad funcional de este factor trófico a nivel del plexo
coroideo al actuar como dominante negativo (Ejemplo 1). Pocos meses
después el animal presentaba todos los síntomas asociados a la
enfermedad de Alzheimer: acúmulo de péptido amiloide en el cerebro,
depósitos de proteína tau hiperfosforilada junto con ubiquitina,
pérdida de proteínas sinápticas y déficits cognitivos severos
(aprendizaje y memoria). El desarrollo de la patología tipo
Alzheimer aparece de 3 a 6 meses después de la inyección del vector
dependiendo del fondo genético del animal huésped, de tal forma que
los animales con modificaciones genéticas que potencialmente pueden
modular la aparición de la enfermedad de Alzheimer la
neuropatología tipo de dicha enfermedad aparece más temprana
(Ejemplos 2 y 3).
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con un animal no humano útil como modelo experimental
caracterizado porque presenta una alteración de la actividad
biológica del receptor de IGF-I localizada en las
células del epitelio del plexo coroideo de los ventrículos
cerebrales. Dicho animal no humano es útil como modelo experimental
de enfermedades neurodegenerativas, en particular, enfermedades
neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, tal como la
Enfermedad de Alzheimer.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
procedimiento para la obtención de dicho animal no humano útil como
modelo experimental que comprende la anulación de la actividad
funcional del receptor de IGF-I en las células
epiteliales del plexo coroideo de dicho animal no humano mediante
un proceso de transgénesis. Para ello, es necesario el desarrollo
de construcciones génicas y vectores los cuales, junto con sus
aplicaciones, constituyen aspectos adicionales de la presente
invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el
uso de dicho animal no humano como modelo experimental para el
estudio del mecanismo etiopatogénico de una enfermedad
neurodegenerativa o para la identificación y evaluación de
compuestos terapéuticos frente a dicha enfermedad. En una
realización particular, dicha enfermedad neurodegenerativa es una
enfermedad neurodegenerativa humana que cursa con demencia, tal
como la enfermedad de Alzheimer.
Una de las ventajas del modelo experimental
desarrollado por esta invención radica en que refleja perfectamente
la patología de la enfermedad de Alzheimer, por lo que dicho modelo
representa un salto cualitativo en el estudio del mecanismo
etiopatogénico de dicha enfermedad neurodegenerativa así como en el
desarrollo de herramientas eficaces para la identificación y
evaluación de compuestos terapéuticos frente a dicha
enfermedad.
La Figura 1 es una foto que muestra que el vector
lentiviral HIV/GFP permite la expresión del transgén en las células
del plexo coroideo, observándose la expresión de proteína
autofluorescente verde GFP (verde) en células del plexo coroideo
(flechas) de rata adulta tras inyección intracerebroventricular
(icv) del vector HIV/GFP. La foto muestra células del plexo
coroideo de un animal que recibió, 3 meses antes de ser
sacrificado, una única inyección icv del vector lentiviral
HIV/GFP.
La Figura 2 pone de manifiesto que la
administración del vector HIV/IGF- IR.KR (HIV/KR) a células
epiteliales en cultivo obtenidas del plexo coroideo de ratas
postnatales genera una pérdida de respuesta al
IGF-I. Sólo en células infectadas con KR
(HIV+KR+A\beta y HIV+KR+IGF+A\beta, pero no en las transfectadas
con un vector HIV vacío (HIV), el IGF-I no promueve
transcitosis de péptido A\beta1-40. *P<0,05 vs
todos los demás grupos.
La Figura 3 muestra que el aprendizaje (A) y la
memorización espacial (B) se encuentran disminuidos en ratas
HIV/IGF-IR.KR ya que estas últimas aprenden más
despacio y peor que las ratas control (HIV) en el test de Monis,
consistente en memorizar la posición de una plataforma cubierta por
el agua en una piscina donde el animal nada sin poder reposar más
que en la plataforma. Ratas HIV/IGF-IR.KR:
r^{2}=0,8516 vs ratas control r^{2}=0,9884,
*P<0,05.
La Figura 4 muestra los niveles de A\beta en
corteza cerebral (A) y en líquido cefalorraquídeo (LCR) (B) de
ratas inyectadas con el vector HIV/IGF-IR.KR
(HIV/KR). Mientras que se produce un incremento en los niveles
cerebrales de A\beta hay un decremento en paralelo en el LCR,
indicativo de una disminución en el aclaramiento de A\beta. Los
niveles se determinaron por densitometría de inmunoblots utilizando
anticuerpos anti-A\beta. Se muestran inmunoblots
representativos. Se valoran también niveles de calbindina, una
proteína neuronal, para mostrar que las diferencias no se deben a
la cantidad de proteína total en cada grupo experimental. *P<0,05
vs control (ratas inyectadas con HIV vacío).
La Figura 5 muestra los niveles de tau
hiperfosforilado (HPF-tau) en la corteza cerebral
de ratas inyectadas con el vector HIV/IGF-IR.KR
(HIV/KR). La Figura 5A muestra los niveles de
HPF-tau en la corteza cerebral de ratas inyectadas
con el vector HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR) y con el
vector control (HIV-control). Los niveles se
determinaron por densitometría de inmunoblots con anticuerpos
anti-HPF-tau. *P<0,05 vs
control. La Figura 5B muestra los resultados de un análisis por
microscopía confocal de la localización tisular de los depósitos de
HPF-tau. L os animales HIV/IGF-IR.KR
(HIV/KR) (panel derecho), pero no los control (tratados con HIV,
panel izquierdo), presentan acúmulos de HPF-tau
(rojo) tanto dentro (flecha) como fuera (asterisco) de las neuronas
(inmunopositivas para \beta tubulina, en verde) en zonas del
telencéfalo. La señal intracelular amarilla-roja
delata la colocalización de HPF-tau en neuronas. La
Figura 5C muestra que los acúmulos extracelulares de
HPF-tau contienen también ubiquitina. Se produce
una colocalización (acúmulos amarillos, flecha) de depósitos
HPF-tau (rojo) con ubiquitina (verde). Los animales
control no presentan estos depósitos (datos no mostrados).
La Figura 6 muestra una neuropatología tipo
Alzheimer en ratones con fondo genético modificado. La Figura 6A
muestra que los ratones LID viejos (más de 15 meses) tratados con
el vector HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR)
[LID-HIV/IGF-IR.KR] prácticamente
no aprendieron en el test de Morris. Mientras que ratones control
viejos o LID que reciben sólo el vector viral control
[LID-HIV] aprenden y retienen lo aprendido de forma
similar, los ratones
LID-HIV/IGF-IR.KR, donde la
señalización del receptor de IGF-I en el plexo
coroideo ha quedado anulada, aprenden significativamente peor
(*P<0,001 vs controles).
LID-HIV/IGF-IR.KR (n=5): r^{2}=
0,6320, LID-HIV (n=7): r^{2}= 0,7379, Controles
de la misma edad (n=6), r^{2}= 0,7909. La Figura 6B muestra que
los animales LID-HIV/IGF-IR.KR
presentan acúmulos de A\beta (inmunopositivos para A\beta,
marcados con asteriscos en el panel a mayor aumento) en zonas
telencefálicas que apenas se observan en los ratones controles
LID-HIV (panel inferior).
Un aspecto de la presente invención se relaciona
con un animal no humano útil como modelo experimental, en adelante
animal modelo de la invención, caracterizado porque presenta una
alteración de la actividad biológica del receptor del factor de
crecimiento similar a la insulina de tipo I (IGF-I)
localizada en las células del epitelio del plexo coroideo de los
ventrículos cerebrales.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "animal no humano" se refiere a un animal mamífero no
humano de cualquier fondo genético, preferentemente animales de
laboratorio como roedores, más preferentemente ratas y ratones, o
primates no humanos.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "cualquier fondo genético" se refiere tanto a un
animal no humano normal como a un animal no humano transgénico.
El término "normal", aplicado a animal, tal
como se utiliza en la presente invención, se refiere a animales que
carecen de transgenes que podrían estar implicados en la
etiopatogenia de enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo,
enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia,
tal como la enfermedad de Alzheimer.
El término "transgénico", aplicado a animal,
tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a animales
que contienen un transgén que podría estar implicado en la
etiopatogenia de enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo,
enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia,
tal como la enfermedad de Alzheimer, e incluye, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, a
animales transgénicos del siguiente grupo: ratones LID (Yakar S, Liu
JL, Stannard B, Butler A, Accili D, Sauer B, LeRoith D (1999)
Normal growth and development in the absence of hepatic
insulin-like growth factor I. Proc Natl Acad Sci
USA 96:7324-7329), animales transgénicos portadores
de mutaciones en presenilinas y \beta amiloide (Hock BJ, Jr.,
Lamb BT (2001) Transgenic mouse models of Alzheimer's disease.
Trends Genet 17: S7-12), animales portadores de
otras mutaciones y alteraciones (US20030229907, Transgenic
non-human mammals with progressive neurologic
disease; US20030145343, Transgenic animals expressing human p25;
US20030131364, Method for producing transgenic animal models with
modulated phenotype and animals produced therefrom; US20030101467,
Transgenic animal model for Alzheimer disease; US20030093822,
Transgenic animal model of neurodegenerative disorders;
US6,717,031, Method for selecting a transgenic mouse model of
Alzheimer's disease; US6,593,512, Transgenic mouse expressing human
tau gene; US6,563,015, Transgenic mice
over-expressing receptor for advanced glycation
endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof;
US6,509,515, Transgenic mice expressing mutant human APP and
forming congo red staining plaques; US6,455,757, Transgenic mice
expressing human APP and TGF-beta demonstrate
cerebrovascular amyloid deposits; US6,452,065, Transgenic mouse
expressing non-native wild-type and
familial Alzheimer's Disease mutant presenilin 1 protein on native
presenilin 1 null background; WO03053136, Triple transgenic model
of Alzheimer disease; WO03046172, Disease model; US6563015,
Transgenic mice over-expressing receptor for
advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and
uses thereof; WO0120977, Novel animal model of Alzheimer disease
with amyloid plaques and mitochondrial dysfunctions; EP1285578,
Transgenic animal model of Alzheimer's disease) y animales
transgénicos obtenidos mediante el cruce de cepas de ratones
transgénicos con las distintas mutaciones que tienen lugar en la
enfermedad de Alzheimer (Phinney AL, Horne P, Yang J, Janus C,
Bergeron C, Westaway D (2003) Mouse models of Alzheimer's disease:
the long and filamentous road. Neurol Res 25:
590-600; Duff K, Eckman C, Zehr C, Yu X, Prada CM,
Perez-tur J, Hutton M, Buee L, Harigaya Y, Yager D,
Morgan D, Gordon MN, Holcomb L, Refolo L, Zenk B, Hardy J, Younkin
S (1996) Increased amyloid-beta42(43) in
brains of mice expressing mutant presenilin 1. Nature 383:
710-713; Richards JG, Higgins GA, Ouagazzal AM,
Ozmen L, Kew JN , B ohrmann B, M alherbe P , B rockhaus M,
Loetscher H , C zech C, H uber G , Bluethmann H, Jacobsen H, Kemp
JA (2003) PS2APP Transgenic Mice, Coexpressing hPS2mut and hAPPswe,
Show Age-Related Cognitive Deficits Associated with
Discrete Brain Amyloid Deposition and Inflammation. J Neurosci 23:
8989-900; US20030167486 Double transgenic mice
overexpressing human beta secretase and human
APP-London).
La alteración de la actividad biológica de la
función del receptor de IGF-I en las células
epiteliales del plexo coroideo de los ventrículos cerebrales del
animal modelo de la invención consistirá, en general, en la
anulación funcional de su actividad biológica (anulación
biológica).
Dicha alteración de la actividad biológica de la
función del receptor de IGF-I en las células
epiteliales del plexo coroideo de los ventrículos cerebrales puede
ser debida a la anulación de la actividad funcional del receptor de
IGF-I debido a la expresión de un polinucleótido
cuya secuencia de nucleótidos codifica una forma mutada no funcional
dominante del receptor de IGF-I. En una realización
particular, dicho polinucleótido codifica una forma mutada no
funcional dominante del receptor de IGF-I humano. A
modo ilustrativo, dicha forma mutada no funcional dominante del
receptor de IGF-I humano se selecciona entre la
forma mutada no funcional del receptor de IGF-I
denominada IGF-IR.KR que presenta la mutación
K1003R, en la que el residuo de lisina de la posición 1003 de la
secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I
humano ha sido sustituido por un residuo de arginina y la forma
mutada no funcional del receptor de IGF-I
denominada IGF-IR.KA que presenta la mutación
K1003A, en la que el residuo de lisina de la posición 1003 de la
secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I
humano ha sido sustituido por un residuo de alanina (Kato H, Faria
TN, Stannard B, Roberts CT, Jr., LeRoith D (1993) Role of tyrosine
kinase activity in signal transduction by the
insulin-like growth factor-I
(IGF-I) receptor. Characterization of
kinase-deficient IGF-I receptors and
the action of an IGF-I-mimetic
antibody (alpha IR-3). J Biol Chem 268:
2655-2661). El sistema de numeración utilizado para
numerar los residuos de aminoácidos del receptor de
IGF-I humano es el seguido por Ullrich et al.
(Ullrich A. et al. (1985) Human insulin receptor and its
relationship to the tyrosine kinase family of oncogenes. Nature
313:756-761; Ullrich A. et al. (1986)
Insulin-like growth factor I receptor primary
structure: comparison with insulin receptor suggests structural
determinants that define functional specificity. EMBO J. 1986 Oct;
5(10): 2503-2512).
Alternativamente, dicha alteración de la
actividad biológica de la función del receptor de
IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo
de los ventrículos cerebrales puede ser debida a la anulación de la
actividad funcional del receptor de IGF-I debido a
la expresión de un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos
codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor
de IGF-I capaz de anular su actividad funcional.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "elemento
inhibidor de la expresión del gen del receptor de
IGF-I capaz de anular su actividad funcional" se
refiere a una proteína, actividad enzimática o secuencia de
nucleótidos, RNA o DNA, de cadena sencilla o doble, que inhibe la
traducción a proteína del mRNA del receptor de
IGF-I. A modo ilustrativo, dicho polinucleótido
puede ser un polinucleótido que codifica una secuencia de
nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del
mRNA del receptor de IGF-I, o bien un polinucleótido
que codifica una ribozima específica del mRNA del receptor de
IGF-I, o bien un polinucleótido que codifica un
aptámero específico del mRNA del receptor de IGF-I,
o bien polinucleótido que codifica un RNA de interferencia
("small interference RNA" o siRNA ) específico del mRNA del
receptor de IGF-I.
El animal modelo de la invención puede tener
cualquier fondo genético; no obstante, en una realización
particular dicho animal modelo de la invención proviene de un
animal normal, ventajosamente, de un animal normal sano, es decir,
que carece de una patología diagnosticada, tal como una rata sana
(Ejemplo 2), mientras que en otra realización particular dicho
animal modelo de la invención proviene de un animal transgénico,
tal como de un ratón transgénico LID (Ejemplo 3).
El animal modelo de la invención es un animal
útil como modelo experimental de enfermedades neurodegenerativas,
por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas que cursan con
demencia. Preferentemente, dichas enfermedades neurodegenerativas
son enfermedades neurodegenerativas humanas, más preferentemente,
enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia. En
una realización particular, dicha enfermedad neurodegenerativa
humana que cursa con demencia es la enfermedad de Alzheimer. La
enfermedad de Alzheimer representa el 60% de los casos de demencia
mientras que la enfermedad microvascular o
multi-infarto representa un 20% de los mismos.
Otras causas menores de demencia son el abuso crónico de alcohol y
drogas y enfermedades neurológicas de muy baja incidencia como las
enfermedades de Pick y Creutzfeldt-Jacob.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el uso del animal modelo de la invención como modelo
experimental de enfermedades neurodegenerativas, tales como
enfermedades neurodegenerativas que cursan con demencia;
preferentemente, dichas enfermedades neurodegenerativas son
enfermedades neurodegenerativas humanas, tales como enfermedades
neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, por ejemplo, la
enfermedad de Alzheimer.
Asimismo, el uso del animal modelo de la
invención para el estudio de los mecanismos etiopatogénicos de
enfermedades neurodegenerativas, en particular, enfermedades
neurodegenerativas humanas y, más particularmente, enfermedades
neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, tal como la
enfermedad de Alzheimer, así como el uso del animal modelo de la
invención para la identificación y evaluación de compuestos
potencialmente terapéuticos frente a dichas enfermedades
constituyen aspecto adicionales de la presente invención.
El animal modelo de la invención puede obtenerse
mediante un proceso de transgénesis que permite la anulación
funcional del receptor de IGF-I en las células
epiteliales del plexo coroideo de dicho animal modelo de la
invención.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un procedimiento para la obtención del animal modelo
de la invención, en adelante procedimiento de la invención, que
comprende la anulación de la actividad funcional del receptor de
IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo
de dicho animal modelo de la invención mediante un proceso de
transgénesis.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "proceso de transgénesis" se refiere a cualquier
técnica o procedimiento que permita la integración en una serie de
células de un organismo vivo de un gen exógeno, o "transgén",
sin afectar a la totalidad de las células de dicho organismo, y que
confiere a dichas células y al organismo que las porta una nueva
propiedad biológica. Dicho transgén o gen exógeno se refiere a un
ADN normalmente no residente, ni presente en la célula que se
pretende transformar.
Por otro lado, el proceso de transgénesis para
obtener el animal modelo de la invención puede ser aplicado tanto a
animales completamente desarrollados como a embriones del mismo
siempre que permita la anulación de la actividad funcional del
receptor de IGF-I en las células epiteliales del
plexo coroideo de dicho animal modelo completamente
desarrollado.
En una realización particular, dicho proceso de
transgénesis que conduce a la anulación de la actividad funcional
del receptor de IGF-I comprende la transformación
de células epiteliales del plexo coroideo de un animal no humano
completamente desarrollado, de manera que expresen una forma mutada
no funcional dominante del receptor de IGF-I. Este
objetivo puede conseguirse mediante la administración a células
epiteliales del plexo coroideo de dicho animal no humano de una
construcción génica que comprende un polinucleótido cuya secuencia
de nucleótidos codifica una forma mutada no funcional dominante del
receptor de IGF-I con el fin de transformar dichas
células epiteliales del plexo coroideo de manera que expresen dicha
forma mutada no funcional dominante del receptor de
IGF-I. Ventajosamente, dicha construcción génica
está incluida dentro de un vector, tal como, por ejemplo, un vector
de expresión o un vector de transferencia.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "vector" se refiere a sistemas utilizados en el
proceso de transferencia de un gen exógeno o de una construcción
génica exógena al interior de una célula, permitiendo de este modo
la vehiculación estable de genes y construcciones génicas exógenas.
Dichos vectores pueden ser vectores no virales o vectores virales,
preferentemente, vectores virales ya que la transgénesis con
vectores virales tiene la ventaja de poder dirigir con relativa
precisión la expresión de un gen foráneo en tejidos adultos y es una
de las razones por las que se plantea su uso general para terapia
génica (Pfeifer A, Verma IM (2001) Gene therapy: promises and
problems. Annu Rev Genomics Hum Genet 2:
177-211).
La invención se ha ejemplificado mediante el
empleo de vectores lentivirales. Estos vectores son de fácil manejo
y entre sus principales ventajas destaca su eficaz transducción, su
integración genómica y su expresión persistente o prolongada. Otros
vectores virales apropiados incluyen vectores retrovirales,
adenovirales o adenoasociados (Consiglio A, Quattrini A, Martino S,
Bensadoun JC, Dolcetta D, Trojani A, Benaglia G, Marchesini S,
Cestari V, Oliverio A, Bordignon C, Naldini L (2001) In vivo
gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors:
correction of neuropathology and protection against learning
impairments in affected mice. Nat Med 7: 310-316;
Kordower JH, Emborg ME, Bloch J, Ma SY, Chu Y, Leventhal L, McBride
J, Chen EY, Palfi S, Roitberg BZ, Brown WD, Holden JE, Pyzalski R,
Taylor MD, Carvey P, Ling Z, Trono D, Hantraye P, Deglon N,
Aebischer P (2000) Neurodegeneration prevented by lentiviral vector
delivery of GDNF in primate models of Parkinson's disease. Science
290: 767-773). Ejemplos de vectores lentivirales
incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1
(HIV-1), del que se han desarrollado numerosos
vectores apropiados. Otros lentivirus adecuados para su empleo como
vectores incluyen el grupo de lentivirus de primates incluyendo el
virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 2
(HIV-2), el virus de la inmunodeficiencia humana de
tipo 3 (HIV-3), el virus de la inmunodeficiencia de
los simios (SIV), el retrovirus del SIDA de los simios
(SRV-1), el virus linfotrópico de células T humanas
tipo 4 (HTLV4), así como los grupos de lentivirus bovinos,
lentivirus equinos, lentivirus felinos, lentivirus ovinos/caprinos
y lentivirus murinos.
La invención proporciona un vector, tal como un
vector viral, específicamente, un vector lentiviral, útil para
obtener un animal modelo de la invención, el cual es útil como un
modelo experimental de enfermedades neurodegenerativas,
concretamente, como modelo de enfermedades neurodegenerativas
humanas que cursan con demencia, tal como la enfermedad de
Alzheimer. Dicho vector así como su obtención se describirá de
forma detallada más adelante.
La administración de dicha construcción génica
que comprende un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos
codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de
IGF-I, o de dicho vector que comprende dicha
construcción génica, a las células epiteliales del plexo coroideo
del animal no humano a transformar puede llevarse a cabo por
cualquier método convencional; no obstante, en una realización
particular, la administración de dicho vector a dichas células
epiteliales del plexo coroideo se lleva a cabo mediante inyección
intracerebroventricular (icv).
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "una forma mutada no funcional dominante del receptor de
IGF-I" incluye cualquier forma mutada del
receptor de IGF-I que actúe como dominante negativo
por recombinación con el receptor de IGF-I normal
endógeno, anulando su función biológica, en el curso del
procedimiento desarrollado por la presente invención. Dicha forma
mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I
es expresada por células epiteliales del plexo coroideo del animal
modelo de la invención como consecuencia de su transformación con
una construcción génica que comprende un polinucleótido cuya
secuencia de nucleótido codifica dicha forma mutada no funcional
dominante del receptor de IGF-I. En una realización
particular, dicho polinucleótido codifica una forma mutada no
funcional dominante del receptor de IGF-I humano.
En otras realizaciones particulares, dicho polinucleótido codifica
una forma mutada no funcional dominante del receptor de
IGF-I de una especie animal distinta a la humana,
tal como un mamífero, por ejemplo, un roedor o un primate no
humano.
Aunque prácticamente cualquier forma mutada no
funcional dominante del receptor de IGF-I puede ser
utilizada con el fin de conseguir la anulación funcional de la
actividad biológica (anulación biológica) del receptor de
IGF-I, en una realización particular, dicha forma
mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I
se selecciona entre las formas mutadas no funcionales del receptor
de IGF-I humano denominadas
IGF-IR.KR e IGF-IR.KA en esta
descripción, definidas previamente.
El animal no humano cuyas células epiteliales del
plexo coroideo de los ventrículos cerebrales van a ser
transformadas mediante la administración del transgén puede tener
cualquier fondo genético.
El procedimiento de la invención se materializa,
en una realización concreta, en un procedimiento para la obtención
de un animal modelo de la invención en el que el vector utilizado
es el vector lentiviral derivado de HIV-1 denominado
HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR) en esta descripción, la
forma mutada no funcional dominante del receptor
IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor
de IGF-I humano denominada IGF-IR.KR
y el animal no humano cuyas células epiteliales del plexo coroideo
han sido transformadas es una rata normal adulta sana (Ejemplo
2).
Adicionalmente, el procedimiento de la invención
se materializa, en otra realización concreta, en un procedimiento
para la obtención de un animal modelo de la invención en el que el
vector utilizado es el vector lentiviral denominado HIV/IGF- IR.KR
(HIV/KR), la forma mutada no funcional dominante del receptor
IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor
de IGF-I humano denominada IGF-IR.KR
y el animal no humano cuyas células epiteliales del plexo coroideo
han sido transformadas es un ratón transgénico LID (Ejemplo 3).
Alternativamente, tal como se mencionó
previamente, la alteración de la actividad biológica de la función
del receptor de IGF-I en las células epiteliales del
plexo coroideo de los ventrículos cerebrales puede ser debida a la
anulación de la actividad funcional del receptor de
IGF-I debido a la expresión de un polinucleótido
cuya secuencia de nucleótidos codifica un elemento inhibidor de la
expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de
anular su actividad funcional.
Por tanto, en otra realización particular, dicho
proceso de transgénesis de anulación de la actividad funcional del
receptor de IGF-I comprende la transformación de
células epiteliales del plexo coroideo de un animal no humano
mediante la introducción de una construcción génica que comprende
un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica un
elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de
IGF-I capaz de anular su actividad biológica,
seleccionándose dicho elemento inhibidor entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido
especifica de la secuencia del gen o del mRNA del receptor de
IGF-I,
b) una ribozima específica del mRNA del receptor
de IGF-I,
c) un aptámero específico del mRNA del receptor
de IGF-I, y
d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del
mRNA del receptor de IGF-I.
Ventajosamente, dicha construcción génica está
incluida dentro de un vector, tal como, por ejemplo, un vector de
expresión o un vector de transferencia. Las características de
dicho vector han sido definidas previamente.
Las secuencias de nucleótidos
a)-d) mencionadas previamente impiden la expresión
del gen en mRNA o del mRNA en la proteína del receptor de
IGF-I, y, por tanto, anulan su función biológica, y
pueden ser desarrolladas por un experto en el sector de ingeniería
genética en función del conocimiento existente en el estado del arte
sobre transgénesis y anulación de la expresión génica (Clarke, A.R.
(2002) Transgenesis Techniques. Principles and Protocols, 2ª Ed.
Humana Press, Cardiff University; Patente US20020128220. Gleave,
Martin. TRPM-2 antisense therapy;
Puerta-Ferández E et al. (2003) Ribozymes:
recent advances in the development of RNA tools. FEMS Microbiology
Reviews 27: 75-97; Kikuchi, et al., 2003. RNA
aptamers targeted to domain II of Hepatitis C virus IRES that bind
to its apical loop region. J. Biochem. 133,
263-270; Reynolds A. et al., 2004. Rational
siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology 22 (3):
326-330).
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
vector útil para la puesta en práctica del procedimiento de
obtención del animal modelo de la invención. Dicho vector puede ser
un vector no viral o, ventajosamente, un vector viral, tal como se
ha mencionado previamente, y comprende un polinucleótido cuya
secuencia de nucleótidos codifica una forma mutada no funcional
dominante del receptor de IGF-I o bien un
polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica un elemento
inhibidor de la expresión del gen del receptor de
IGF-I capaz de anular su actividad funcional, junto
con, opcionalmente, los elementos necesarios para permitir su
expresión en células de animales no humanos. Dichos vectores pueden
estar en forma de partículas virales artificiales o quiméricas.
En una realización particular, dicho vector, es
un vector lentiviral que comprende un polinucleótido cuya secuencia
de nucleótidos se seleccionada entre una secuencia de nucleótidos
que codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor
de IGF-I y una secuencia de nucleótidos que codifica
un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de
IGF-I capaz de anular su actividad funcional.
En una realización particular, la secuencia de
nucleótidos que codifica una forma mutada no funcional dominante
del receptor de IGF-I se selecciona entre las formas
mutadas no funcionales del receptor de IGF-I humano
denominadas IGF-IR.KR e IGF-IR.KA en
esta descripción, definidas previamente.
En otra realización particular, la secuencia de
nucleótidos que codifica un elemento inhibidor de la expresión del
gen del receptor de IGF-I capaz de anular su
actividad funcional se selecciona entre una secuencia que codifica:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la
secuencia del gen o del mRNA del receptor de IGF-I,
b) una ribozima específica del mRNA del receptor de
IGF-I, c) un aptámero específico del mRNA del
receptor de IGF-I, y d) un RNA de interferencia
(iRNA) específico del mRNA del receptor de
IGF-I.
La invención proporciona, en una realización
concreta, un vector lentiviral obtenible mediante transfección
transitoria en células empaquetadoras de:
un plásmido (i) que comprende una secuencia de
nucleótidos seleccionada entre:
- -
- una secuencia de nucleótidos que codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I, y
- -
- una secuencia de nucleótidos que codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad funcional;
un plásmido (ii) que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína Rev;
un plásmido (iii) que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica el elemento de respuesta a Rev (RRE);
y
un plásmido (iv) que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica la envoltura heteróloga del vector.
Aunque prácticamente cualquier célula
empaquetadora apropiada puede ser utilizada, en una realización
particular, dichas células empaquetadoras pertenecen a la línea
celular 293T, una línea de células epiteliales renales humanas
transformadas disponibles comercialmente.
El plásmido (i) es un vector, tal como un vector
de transferencia o de expresión, que lleva una construcción génica
que comprende el transgén en cuestión y un promotor funcional en
las células empaquetadoras que permite que el vector que se
transcribe se genere de forma eficiente en las células
empaquetadoras. En una realización particular, dicho plásmido (i)
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una forma
mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I
seleccionada entre las formas mutadas no funcionales del receptor
de IGF-I humano denominadas
IGF-IR.KR e IGF- IR.KA en esta descripción,
definidas previamente. En otra realización particular, dicho
plásmido (i) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un
elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de
IGF-I capaz de anular su actividad funcional
seleccionada entre una secuencia que codifica: a) una secuencia de
nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del
mRNA del receptor de IGF-I, b) una ribozima
específica del mRNA del receptor de IGF-I, c) un
aptámero específico del mRNA del receptor de IGF-I,
y d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA del
receptor de IGF-I.
El plásmido (ii) es un vector no solapante que,
virtualmente, puede contener la secuencia de nucleótidos que
codifica cualquier proteína Rev, la cual promueve la acumulación
citoplasmática de los transcritos virales; no obstante, en una
realización particular, dicho plásmido (ii) es el plásmido
identificado como RSV-Rev, que comprende la
secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Rev del virus del
sarcoma de Rous (RSV).
El plásmido (iii), es un vector de empaquetado
condicional, y contiene la secuencia de nucleótidos que codifica
cualquier elemento de respuesta a Rev (RRE) apropiado, al que se
une, de forma que el genes e exprese y se produzcan las nuevas
partículas virales.
El plásmido (iv) contiene la secuencia de
nucleótidos que codifica la envoltura heteróloga del vector, por lo
que puede contener la secuencia de nucleótidos que codifica
cualquier proteína de la envuelta de un virus apropiada, con la
condición de que dicho virus no sea un lentivirus; no obstante, en
una realización particular, dicho plásmido es el denominado
p-VSV, que comprende la secuencia de nucleótidos que
codifica la envuelta del virus de la estomatitis vesicular
(VSV).
Dicho vector lentiviral puede obtenerse por
métodos convencionales conocidos por los expertos en la
materia.
En una realización particular, dicho vector
lentiviral es el denominado HIV/IGF- IR.KR (HIV/KR) (Ejemplo 1) que
permite la expresión de la forma mutada no funcional del receptor
de IGF-I denominada IGF-IR.KR que
tiene la mutación K1003R en la secuencia de aminoácidos del
receptor IGF-I humano, en células animales no
humanas, y la anulación biológica del receptor de
IGF-I y el desarrollo de un animal no humano útil
como modelo experimental de enfermedades neurodegenerativas humanas
que cursan con demencia, tal como la enfermedad de Alzheimer.
En otra realización particular, dicho proceso de
transgénesis que conduce a la anulación de la actividad funcional
del receptor de IGF-I en las células epiteliales del
plexo coroideo del animal modelo de la invención comprende un
proceso de transgénesis convencional en la fase embrionaria de
dicho animal de tal forma que las futuras células del plexo
coroideo de dicho animal son transformadas genéticamente y pierden
la capacidad de responder al IGF-I. El desarrollo de
este tipo de animal transgénico puede ser llevado a cabo por un
experto en el sector de ingeniería genética en función del
conocimiento existente en el estado del arte sobre animales
transgénicos (Bedell MA, Jenkins NA, Copeland NG. Mouse models of
human disease. Part 1: techniques and resources for genetic
analysis in mice. Genes Dev. 1997 Jan 1; 11(1):
1-10. Bedell MA, Largaespada DA, Jenkins NA,
Copeland NG. Mouse models of human disease. Part II: recent
progress and future directions. Genes Dev. 1997 Jan 1; 11(1):
11-43).
Una posibilidad de la presente invención es un
procedimiento de ransgénesis convencional por la cual se dirige la
expresión de un transgén que comprende un promotor específico de
tejido (como por ejemplo el promotor del gen de la transtirretina,
Ttr^{1}) (Schreiber,G. The evolution of transthyretin synthesis in
the choroid plexus. Clin. Chem. Lab Med. 40,
1200-1210 (2002)) y un polinucleótido cuya
secuencia de nucleótidos codifica una forma mutada no funcional
dominante del receptor de IGF-I. De esta forma la
forma mutada no funcional dominante del receptor de
IGF-I únicamente se expresará en las células del
plexo coroideo obteniéndose así el animal modelo de la presente
invención. En una realización particular, dicho polinucleótido
codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de
IGF-I humano. A modo ilustrativo, dicha forma
mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I
humano se selecciona entre la forma mutada no funcional del receptor
de IGF-I denominada IGF-IR.KR que
presenta la mutación K1003R, en la que el residuo de lisina de la
posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de
IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de
arginina y la forma mutada no funcional del receptor de
IGF-I denominada IGF-IR.KA que
presenta la mutación K1003A, en la que el residuo de lisina de la
posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de
IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de
alanina (Kato H, Faria TN, Stannard B, Roberts CT, Jr., LeRoith D
(1993) Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by
the insulin-like growth factor-I
(IGF-I) receptor. Characterization of
kinase-deficient IGF-I receptors and
the action of an IGF-I-mimetic
antibody (alpha IR-3). J Biol Chem 268:
2655-2661).
Alternativamente, dicha alteración de la
actividad biológica de la función del receptor de
IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo
de los ventrículos cerebrales de dichos animales transgénicos puede
ser obtenida por la anulación de la actividad funcional del
receptor de IGF-I debido a la expresión de un
polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica un elemento
inhibidor de la expresión del gen del receptor de
IGF-I capaz de anular su actividad funcional. Tal
como se utiliza en la presente invención y, se ha comentado
anteriormente, el término "elemento inhibidor de la expresión del
gen del receptor de IGF- I capaz de anular su actividad
funcional" se refiere a una proteína, actividad enzimática o
secuencia de nucleótidos, RNA o DNA, de cadena sencilla o doble,
que inhibe la traducción a proteína del mRNA del receptor de
IGF-I. A modo ilustrativo, dicho polinucleótido
puede ser un polinucleótido que codifica una secuencia de
nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del
mRNA del receptor de IGF-I, o bien un polinucleótido
que codifica una ribozima específica del mRNA del receptor de
IGF-I, o bien un polinucleótido que codifica un
aptámero específico del mRNA del receptor de IGF-I,
o bien polinucleótido que codifica un RNA de interferencia
("small interference RNA" o siRNA) específico del mRNA del
receptor de IGF-I.
Igualmente, se puede obtener un animal modelo de
la invención por transgénesis convencional en el que la anulación
de la actividad funcional del receptor de IGF-I
pueda ser regulada por distintos mecanismos lo que permitiría un
mejor control y uso del animal. Así, una técnica de transgénesis
regulada, puede consistir en el uso del sistema "Cre/Lox"
mediante el cruce de animales con secuencias transgénicas
Lox-IGF-IR (sistemas de "knock
in") que sustituyan a la secuencia IGF-IR
endógena, con animales que tengan a la recombinasa bacteriana Cre
dirigida por un promotor específico de tejido, de nuevo por ejemplo
el de la transtirretina (Isabelle Rubera, Chantal Poujeol,
Guillaume Bertin, Lilia Hasseine, Laurent Counillon, Philippe
Poujeol and Michel Tauc (2004) Specific Cre/Lox Recombination in
the Mouse Proximal Tubule. J Am Soc Nephrol. 15 (8):
2050-6; Ventura A, Meissner A, Dillon CP, McManus M,
Sharp PA, Van Parijs L, Jaenisch R, Jacks T. (2004)
Cre-lox-regulated conditional RNA
interference from transgenes. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (28):
10380-5). Otro ejemplo para generar otro modelo
animal transgénico regulable consistiría en el uso del sistema
"tet-off"(Rennel E, Gerwins P. (2002) How to
make tetracycline-regulated transgene expression go
on and off. Anal Biochem. 309 (1): 79-84; Schonig,
K, Bujard H. (2003) Generating conditional mouse mutants via
tetracycline-controlled gene expression. In:
Transgenic Mouse Methods and Protocols, Hofker, M, van Deursen, J
(eds.) Humana Press, Totowa, New Jersey, pp.
69-104). Una realización ejemplarizante de la
presente invención consistirá en un ratón
Lox-IGF-IR que se cruza con un
ratón Tre-Cre - donde Tre es el promotor regulable
por la proteína Tta (tetracycline-controlled
transactivator protein); posteriormente este híbrido se cruza con
un ratón Ttr-Tta de tal manera que el ratón
resultante:
Lox-IGF-IR/Tre-Cre/Ttr-Tta
eliminará la función IGF-IR en respuesta a la
administración de tetraciclina, compuesto que elimina la acción de
la proteína Tta.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el
uso de un vector de la invención en un procedimiento para la
obtención de un animal no humano útil como modelo experimental, tal
como un modelo experimental de enfermedades neurodegenerativas, en
particular, enfermedades neurodegenerativas humanas, especialmente,
como modelo de enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan
con demencia, tal como la enfermedad de Alzheimer.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
invención y no deben ser considerados en sentido limitativo del
alcance de la misma.
Se generó un vector viral como vehículo genético
para introducir en las células epiteliales del plexo coroideo la
forma mutada del receptor de IGF-I denominada
IGF-IR.KR. Esa forma mutada del receptor de
IGF-I, IGF-IR.KR, presenta la
mutación K1003R en la que el residuo de lisina en la posición 1003
ha sido sustituido por un residuo de arginina, y actúa como
dominante negativo por recombinación con el receptor normal
endógeno, anulando su función (Kato H, Faria TN, Stannard B, Roberts
CT, Jr., LeRoith D (1993) Role of tyrosine kinase activity in signal
transduction by the insulin-like growth
factor-I (IGF-I) receptor.
Characterization of kinase-deficient
IGF-I receptors and the action of an
IGF-I-mimetic antibody (alpha
IR-3). J Biol Chem 268:
2655-2661).
Se ha utilizado un vector lentiviral que presenta
características de expresión prolongada (Consiglio A, Quattrini A,
Martino S, Bensadoun JC, Dolcetta D, Trojani A, Benaglia G, M
archesini S , C estari V , O liverio A , B ordignon C , N aldini L
(2001) In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy
by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection
against learning impairments in affected mice. Nat Med 7:
310-316; Kordower JH, Emborg ME, Bloch J, Ma SY, Chu
Y, Leventhal L, McBride J, C hen EY, Palfi S, Roitberg BZ, Brown
WD, Holden JE, Pyzalski R, Taylor MD, Carvey P, Ling Z, Trono D,
Hantraye P, Deglon N, Aebischer P (2000) Neurodegeneration
prevented by lentiviral vector delivery of GDNF in primate models
of Parkinson's disease. Science 290: 767-773),
derivado del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1
(HIV-1), utilizando como envoltura viral la del
virus de la estomatitis vesicular (VSV), producido por transfección
transitoria y empaquetado de vectores plasmídicos en células 293T
seguido de la concentración de dichas partículas virales mediante
ultracentrifugación. Se ha generado un virus HIV de tercera
generación mediante modificaciones de métodos ya publicados (Dull HB
(1988) Behind the AIDS mailer. Am J Prev Med 4:
239-240). Para ello se emplearon cuatro
construcciones de forma similar a lo descrito anteriormente (Bosch
A, Perret E, Desmaris N, Trono D, Heard JM. Reversal of pathology
in the entire brain of mucopolysaccharidosis type VII mice alter
lentivirus-mediated gene transfer. Hum Gen Ther 8:
1139-1150,
2000):
2000):
- (i)
- un vector no solapante, RSV-Rev, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Rev del virus del sarcoma de Roux (RSV);
- (ii)
- un vector de empaquetado condicional, p-RRE, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el elemento de respuesta a Rev (RRE);
- (iii)
- un vector, p-VSV, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la envoltura heteróloga del vector, en concreto, la envuelta del virus de la estomatitis vesicular (VSV); y
- (iv)
- un vector de transferencia, que lleva una construcción génica para el transgén en cuestión, en este caso, el IGF-IR.KR, y el promotor de la fosfogliceroquinasa, que permite que el vector que se transcribe se genere de forma eficiente en las células empaquetadoras (293T).
Los tres primeros vectores
[1)-3)] son conocidos (véanse las referencias
mencionadas previamente). La construcción de este último vector se
llevó a cabo introduciendo un fragmento HincII-XbaI
del cDNA del receptor de IGF-I que codifica una
forma mutada del receptor de IGF-I, concretamente la
forma mutada del receptor denominada IGF-IR.KR que
contiene la mutación K1003R en la que el residuo de lisina de la
posición 1003 ha sido sustituido por un residuo de arginina (Kato H,
Faria TN, Stannard B, Roberts CT, Jr., LeRoith D (1993) Role of
tyrosine kinase activity in signal transduction by the
insulin-like growth factor-I
(IGF-I) receptor. Characterization of
kinase-deficient IGF-I receptors and
the action of an IGF-I-mimetic
antibody (alpha IR-3). J Biol Chem 268:
2655-2661), en el vector HIV-lacZ
(Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma
IM, Trono D (1996) In vivo gene delivery and stable
transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science
272: 263-267). Brevemente, el cDNA que codifica la
forma mutada del receptor de IGF-I que tiene la
mutación K1003R (IGF-IR.KR) se introdujo en
HIV-lacZ, mediante un intercambio del cassette lacZ
por el cDNA que codifica IGF-IR.KR según metodología
descrita (Desmaris N, Bosch A, Salaun C, Petit C, Prevost MC, Tordo
N, Perrin P, Schwartz O, de Rocquigny H, Heard JM (2001) Production
and neurotropism of lentivirus vectors pseudotyped with lyssavirus
envelope glycoproteins. Mol Ther 4: 149-156). Para
ello, el vector HIV-lacZ se cortó con
SmaI/XbaI para eliminar el cDNA de lacZ y se ligó con el
cDNA que codifica IGF-IR.KR cortado con
HincII/XbaI. Los sitios de restricción son homólogos. De
este modo se obtuvo el vector de transferencia que lleva el transgén
IGF-IR.KR.
El vector lentiviral, denominado
HIV/IGF-IR.KR o HIV/KR en esta descripción, se
obtuvo por transfección transitoria en las células 293T. Los
plásmidos RSV-Rev, A-RRE,
p-VSV y el vector de transferencia que lleva el
transgén IGF-IR.KR son empaquetados de forma
episomal en dichas células 293T (Desmaris N, Bosch A, Salaun C,
Petit C, Prevost MC, Tordo N, Perrin P, Schwartz O, de Rocquigny H,
Heard JM (2001) Production and neurotropism of lentivirus vectors
pseudotyped with lyssavirus envelope glycoproteins. Mol Ther 4:
149-156). La línea celular 293T (obtenible
comercialmente a través de American Type Culture Collection) es una
línea de células epiteliales renales humanas transformadas que
expresan el antigeno T de SV40 lo que permite la replicación
episomal de los plásmidos y de la región del promotor. Previamente,
se sembraron dichas células, en una densidad de 1-5
x 10^{6} en placas de 10 cm de diámetro 24 horas antes de la
transfección en un medio DMEM con 10% de suero fetal y penicilina
(100 IU/ml). En la transfección se utilizó un total de 32,75 \mug
de DNA plasmídico por plato: 3 \mug del plásmido
p-VSV, 3,75 \mug del plásmido
RSV-Rev y 13 \mug tanto del plásmido
p-RRE como del plásmido de transferencia que lleva
el transgén IGF-IR.KR. El precipitado se obtuvo
añadiendo dichos plásmidos a 250 \mul de H_{2}O y 250 \mul de
CaCl_{2} 0,5M, mezclando bien y añadiendo gota a gota a 5 00
\mul de tampón salino-HEPES 2X (NaCl 280 mM,
HEPES 100 mM, Na_{2}HPO_{4} 1 ,5 mM, pH 7,12). A la vez que se
agitaba, inmediatamente se añadió el precipitado a cada plato de
cultivo. Se cambiaron 10 ml de medio a las 24 horas y finalmente se
recogió al cabo de otras 24 horas, limpiándose con una
centrifugación de baja velocidad y pasándose por filtros de acetato
de celulosa (0,22 \mum). Finalmente, y tras una serie de
ultracentrifugaciones las partículas o vectores lentivirales,
HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR), se resuspendieron en tampón
salino-fosfato (PBS/BSA) para su posterior uso.
Brevemente, en primer lugar se filtró el medio de cultivo de las
placas con las células 293T a través de un filtro de 0,45 \mum.
Ese medio se centrifugó a 4°C durante 1 hora y media a 19.000 rpm.
El precipitado se resuspendió en 1% de PBS/BSA, se dejó 1 hora en
hielo y se centrifugó de nuevo a 4°C durante 1 hora y media a 19.000
rpm. Se volvió a resuspender en 1% de PBS/BSA, se dejó otra hora en
hielo y se centrifugó a 4°C durante 5 minutos a 14.000 rpm. El
sobrenadante final se congeló inmediatamente y se almacenó a -80°C.
Esta misma metodología se utilizó para purificar las partículas de
HIV vacías y las partículas de HIV/GFP. Las partículas de HIV vacías
(o vector HIV vacío), que corresponden a HIV-lacZ
cortado con SmaI/XbaI, y las partículas de HIV/GFP ya han
sido descritas previamente (Desmaris N, Bosch A, Salaun C, Petit C,
Prevost MC, Tordo N, Perrin P, Schwartz O, de Rocquigny H, Heard JM
(2001) Production and neurotropism of lentivirus vectors
pseudotyped with lyssavirus envelope glycoproteins. Mol Ther 4:
149-156).
Para analizar la expresión de vectores lentiviral
en células epiteliales del plexo coroideo se procedió a construir
un vector lentiviral HIV/GFP que contenía el gen codificante de la
GFP como transgén. Brevemente, el cDNA del gen de la proteína GFP
(Clontech) fue subclonado en un vector de transferencia
HIV-1 [(pHR'CMV)-PGK en Desmaris N,
Bosch A, Salaun C, Petit C, Prevost MC, Tordo N, Perrin P, Schwartz
O, de Rocquigny H, Heard JM (2001) Production and neurotropism of
lentivirus vectors pseudotyped with lyssavirus envelope
glycoproteins. Mol Ther 4: 149-156], en los sitios
de restricción BamHI/SalI, siguiendo la descripción detallada
del Ejemplo 1, con lo que se obtuvo el vector lentiviral denominado
HIV/GFP.
A continuación, los animales, ratas macho de
5-6 meses de edad (n=7), se sometieron a una
inyección mediante cirugía estereotáxica con jeringa Hamilton, bajo
anestesia con tribromoetanol, de 6 \mul del vector HIV/GFP en cada
ventrículo lateral (coordenadas estereotáxicas: 1 mm posterior al
bregma, 1,2 mm lateral y 4 mm de profundidad), a un 1 \mul por
minuto. A los 6 meses se les sacrificó y se observó la presencia
del transgén mediante fluorescencia. Para ello, el animal se
perfundió transcardialmente con 4% de paraformaldehído.
Posteriormente, el cerebro se cortó en vibratomo en cortes de 50
\mum, los cortes se montaron seguidamente sobre portas
gelatinizados y la fluorescencia de la proteína GFP se observó
directamente al microscopio de fluorescencia (Leica).
De este modo se determinó que la administración
en ratas adultas mediante inyección intracerebroventricular (icv)
del vector lentiviral HIV/GFP (vector usado en la invención con el
gen codificante de la proteína autofluorescente GFP como transgén)
resulta en la expresión sostenida de la proteína GFP en el plexo
coroideo (Figura 1).
La monocapa de células epiteliales se obtuvo
mediante un protocolo ya descrito (Strazielle,N. &
Ghersi-Egea,J.F. (1999) Demonstration of a coupled
metabolism-efflux process at the choroid plexus as
a mechanism of brain protection toward xenobiotics. J.
Neurosci. 19: 6275-6289). Se sacrificaron ratas
de entre 5 y 7 días y los plexos coroideos de los ventrículos
laterales y cuarto se extrajeron rápidamente colocándose en un
medio DMEM de cultivo sobre hielo. Seguidamente se procedió a su
digestión enzimática con 1 mg/ml pronasa (Sigma) y 12,5 \mug/ml
DNase I (Boehringer Mannheim), con dispersión mecánica simultánea
durante 15 minutos. Finalmente, se centrifugó (1.000 rpm) y las
células se resuspendieron en DMEM suplementado con 10% de suero de
ternera fetal (FCS), 10 ng/ml de EGF (Epidermal Growth Factor)
(Sigma), 5 ng/ml de FGF (Fibroblast Growth Factor) (Boehringer
Mannheim) y gentamicina. Estas células se transformaron con el
vector lentiviral HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR) y con el
vector HIV vacío, de la forma que se indica a continuación.
Brevemente, tras 24 horas en cultivo, se cambió el medio por DMEM
fresco conteniendo el virus (al menos 50 \mug/ml, diluido entre
10^{-2} y 10^{-3}) y 8 \mug/ml de polybrene (Sigma). Este
medio infectivo se remplazó a las 24 horas, se mantuvieron las
células durante un día más y, finalmente, tras aspirar el medio, las
células se lisaron y procesaron.
De este modo se observó que la administración del
vector lentiviral HIV/IGF- IR.KR (HIV/KR) a células epiteliales en
cultivo obtenidas del plexo coroideo de ratas postnatales generó
una pérdida de respuesta al factor trófico IGF-I.
Sólo en células infectadas con el vector HIV/KR, pero no en las
transfectadas con el vector HIV vacío, el IGF-I no
promovió transcitosis del péptido A\beta1-40
(Figura 2). La transcitosis se cuantificó determinando la cantidad
de A\beta1-40 que pasa desde la cámara superior
del cultivo a la inferior, para lo cual tiene que atravesar una
monocapa de células epiteliales (Carro E, Trejo JL,
Gomez-Isla T, LeRoith D,
Torres-Aleman I (2002) Serum
insulin-like growth factor I regulates brain
amyloid-beta levels. Nat Med 8:
1390-1397).
Se infectaron ratas adultas sanas de la cepa
Wistar con el vector HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR). Para
ello, se inyectó mediante cirugía estereotáxica con jeringa
Hamilton, bajo anestesia con tribromoetanol, 6 pi del vector
HIV/IGF-IR.KR en ratas macho de 5-6
meses de edad en cada ventrículo lateral (coordenadas
estereotáxicas: 1 mm posterior al bregma, 1,2 mm lateral y 4 mm de
profundidad), a 1 \mul por minuto. Los animales controles
recibieron, en las mismas condiciones, igual cantidad de vector
viral HIV vacío (HIV). A los 5 meses se les analizó su capacidad
cognitiva mediante el test de Monis de aprendizaje espacial en el
que participa el hipocampo, estructura típicamente afectada en
Alzheimer (Clark CM, Karlawish JH (2003) Alzheimer disease: current
concepts and emerging diagnostic and therapeutic strategies. Ann
Intern Med 138: 400-410), siguiendo metodología
estandarizada (Trejo JL, Carro E, Torres-Aleman I
(2001) Circulating insulin-like growth factor I
mediates exercise-induced increases in the number of
new neurons in the adult hippocampus. J Neurosci 21:
1628-1634). Este test, conocido como "laberinto
acuático" (o test de Monis) determina la memorización espacial
(van der Staay FJ (2002) Assessment of
age-associated cognitive deficits in rats: a tricky
business. Neurosci Biobehav Rev 26: 753-759), que es
uno de los déficits característicos de la enfermedad de Alzheimer.
Al finalizar el test se le sacrificó (6 meses después de la
inyección del vector viral) y se perfundieron a través de la arteria
aorta con tampón salino, e, inmediatamente, se extrajo el cerebro,
conservándose a -80°C un hemisferio para su posterior procesamiento
por "western blot" y el otro hemisferio se fijó mediante
inmersión 24 horas en 4% de paraformaldehido para su estudio
inmunohistoquímico.
Se determinaron los niveles de amiloide
(A\beta) cerebral y en el líquido cefalorraquídeo (LCR) por
técnicas de western blot, ELISA y por inmunocitoquímica, siguiendo
metodología ya descrita (Carro E, Trejo JL,
Gomez-Isla T, LeRoith D,
Torres-Aleman I (2002) Serum
insulin-like growth factor 1 regulates brain
amyloid-beta levels. Nat Med 8:
1390-1397) y niveles de tau hiperfosforilada
(HPF-tau) en corteza también por western blot e
inmunocitoquímica (Carro E, Trejo JL, Gomez-Isla T,
LeRoith D, Torres-Aleman I (2002) Serum
insulin-like growth factor I regulates brain
amyloid-beta levels. Nat Med 8:
1390-1397). Asimismo, se evaluó la presencia de
depósitos de HPF-tau y de amiloide por técnicas
inmunocitoquímicas (Carro E, Trejo JL, Gomez-Isla
T, LeRoith D, Torres-Aleman I (2002) Serum
insulin-like growth factor I regulates brain
amyloid-beta levels. Nat Med 8:
1390-1397).
Los animales con la señalización de
IGF-I bloqueada en el plexo coroideo por
administración del vector HIV/IGF-IR.KR presentaron
déficits cognitivos significativos en el aprendizaje y en
memorización espacial (Figuras 3A y 3B).
Además, se observó un incremento significativo en
los niveles de A\beta del parénquima cerebral comparado con los
animales controles y en paralelo, una disminución de los niveles de
AP en el LCR (Figuras 4A y 4B). Ambas alteraciones son típicas de
la enfermedad de Alzheimer (Selkoe DJ (2001) Clearing the Brain's
Amyloid Cobwebs. Neuron 32: 177-180; Sunderland T,
Linker G, Mirza N, Putnam KT, Friedman DL, Kimmel LH, Bergeson J,
Manetti GJ, Zimmermann M, Tang B, Bartko JJ, Cohen RM (2003)
Decreased beta-amyloidl-42 and
increased tau levels in cerebrospinal fluid of patients with
Alzheimer disease. JAMA 289: 2094-2103). Junto a
esta amiloidosis se apreció un acúmulo intra y extracelular de
HPF-tau en regiones telencefálicas (Figura 5). Los
acúmulos extracelulares contienen también ubiquitina (Figura 5C) y
son también característicos de la enfermedad de Alzheimer (Clark CM,
Karlawish JH (2003) Alzheimer disease: current concepts and
emerging diagnostic and therapeutic strategies. Ann Intern Med 138:
400-410). Además, los animales padecieron
alteraciones celulares tipo Alzheimer ya que presentaron gliosis
reactiva en asociación a los depósitos proteicos y déficits
significativos de proteínas sinápticas (Masliah E, Mallory M,
Alford M, D eTeresa R, Hansen L A, McKeel DW, Jr., Monis JC (2001)
Altered expression of synaptic proteins occurs early during
progression of Alzheimer's disease. Neurology 56:
127-129).
En resumen, los animales inyectados con el vector
lentiviral de expresión prolongada HIV/IGF-IR.KR
(HIV/KR) presentaron características neuropatológicas asociadas a
la enfermedad de Alzheimer: altos niveles cerebrales de amiloide,
presencia de agregados intra y extracelulares de tau
hiperfosforilado y ubiquitina y déficits cognitivos.
Otro ejemplo de la invención consistió en generar
cambios patológicos tipo Alzheimer en ratones de origen
transgénico. Los ratones elegidos son, además, viejos, para imitar
mejor las condiciones normales donde se desarrolla la patología de
Alzheimer en seres humanos.
Se inyectó el vector
HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR) a ratones transgénicos LID de
más de 15 meses y con genotipo manipulado. Los ratones transgénicos
empleados en este ejemplo son deficientes en IGF-I
sérico por haber sido anulado el gen hepático del
IGF-I por el sistema Cre/Lox (ratones LID) (Yakar S,
Liu JL, Stannard B, Butler A, Accili D, Sauer B, LeRoith D (1999)
Normal growth and development in the absence of hepatic i
nsulin-like growth factor I. Proc Natl Acad Sci US
96: 7 324-7329). Los ratones LID ya presentan,
per se, algunas de las características de la enfermedad de
Alzheimer ya que el déficit de IGF-I genera
amiloidosis y gliosis (Carro E, Trejo JL,
Gomez-Isla T, LeRoith D,
Torres-Aleman I (2002) Serum
insulin-like growth factor I regulates brain
amyloid-beta levels. Nat Med 8:
1390-1397). Además, al ser viejos, presentan
déficits cognitivos y amiloidosis (Bronson RT, Lipman RD, Harrison
DE (1993) Age-related gliosis in the white matter
of mice. Brain Res 609: 124-128; van der Staay FJ
(2002) Assessment of age-associated cognitive
deficits in rats: a tricky business. Neurosci Biobehav Rev 26:
753-759). El objetivo de este ensayo fue obtener
unas condiciones más favorables a la producción de amiloidosis con
el fin de determinar si el sistema proporcionado por esta invención
llega a generar depósitos de amiloide, una de las características
de la enfermedad de Alzheimer. Los procedimientos y reactivos
utilizados se describen en los ejemplos anteriores. Los animales
fueron sacrificados a los 3 meses de la inyección de los vectores
virales.
Tan sólo 3 meses después de la administración del
vector HIV/KR los ratones LID viejos presentan déficits cognitivos
severos (Figura 6A), y amiloidosis y taupatia similares a los
observados en ratas adultas tras 6 meses de exposición al vector
viral (resultados similares a los descritos en Figuras 4 y 5, datos
no mostrados). Lo importante es que en este modelo se consigue un
estado más avanzado de la enfermedad: los animales presentan
acúmulos de amiloide, que aún no siendo congofilicos (no se tiñen
con el marcador de placas insolubles "Rojo Congo") presentan
características típicas de placas difusas (Figura 6B).
Claims (39)
1. Un animal no humano útil como modelo
experimental caracterizado porque presenta una alteración de
la actividad biológica del receptor del factor de crecimiento
similar a la insulina de tipo I(IGF-I)
localizada en las células del epitelio del plexo coroideo de los
ventrículos cerebrales.
2. Animal según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicha alteración de la actividad
biológica del receptor de IGF-I consiste en su
anulación biológica.
3. Animal según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque es un
mamífero.
4. Animal según la reivindicación 3,
caracterizado porque se selecciona entre un roedor y un
primate.
5. Animal según la reivindicación 4,
caracterizado porque es una rata o un ratón.
6. Animal según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicha
alteración de la función del receptor de IGF-I en
las células epiteliales del plexo coroideo es debida a la expresión
de una forma mutada no funcional dominante de dicho receptor
IGF-I.
7. Animal según la reivindicación 6,
caracterizado porque dicha forma mutada no funcional
dominante del receptor IGF-I es la forma mutada no
funcional del receptor de IGF-I denominada
IGF-IR.KR que presenta la mutación K1003R, en la que
el residuo de lisina de la posición 1003 de la secuencia de
aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido
sustituido por un residuo de arginina.
8. Animal según la reivindicación 6,
caracterizado porque dicha forma mutada no funcional
dominante del receptor IGF-I es la forma mutada no
funcional del receptor de IGF-I denominada
IGF-IR.KA que presenta la mutación K1003A, en la que
el residuo de lisina de la posición 1003 de la secuencia de
aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido
sustituido por un residuo de alanina.
9. Animal según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque es un animal
normal.
10. Animal según la reivindicación 9,
caracterizado porque dicho animal es una rata normal
sana.
11. Animal según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque es un animal
transgénico.
12. Animal según la reivindicación 11,
caracterizado porque dicho animal transgénico es un ratón
transgénico LID.
13. Animal según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, útil como modelo experimental de una
enfermedad neurodegenerativa.
14. Animal según la reivindicación 13, en el que
dicha enfermedad neurodegenerativa es la Enfermedad de
Alzheimer.
15. Un procedimiento para la obtención de un
animal no humano útil como modelo experimental según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 14, que comprende la anulación de la
actividad funcional del receptor de IGF-I en las
células epiteliales del plexo coroideo de dicho animal no humano
mediante un proceso de transgénesis.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que dicho proceso de transgénesis de anulación de la actividad
funcional del receptor de IGF-I comprende la
administración a células epiteliales del plexo coroideo de un animal
no humano desarrollado de una construcción génica que comprende un
polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica una forma
mutada no funcional dominante del receptor de
IGF-I, o de un vector que comprende dicha
construcción génica, para transformar dichas células epiteliales
del plexo coroideo de manera que expresen dicha forma mutada no
funcional dominante del receptor de IGF-I.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que la administración de dicha construcción génica o de dicho
vector a dichas células epiteliales del plexo coroideo se lleva a
cabo mediante inyección intracerebroventricular (icv).
18. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que dicho vector se selecciona entre un vector viral y un vector
no viral.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que dicho vector viral es un vector lentiviral.
20. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que dicha forma mutada no funcional dominante del receptor
IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor
de IGF-I denominada IGF-IR.KR que
presenta la mutación K1003R, en la que el residuo de lisina de la
posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de
IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de
arginina.
21. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que dicha forma mutada no funcional dominante del receptor
IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor
de IGF-I denominada IGF-IR.KA que
presenta la mutación K1003A, en la que el residuo de lisina de la
posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de
IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de
alanina.
22. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que dicho animal no humano es un animal no humano normal.
23. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que dicho animal no humano es un animal no humano
transgénico.
24. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que dicho proceso de transgénesis de anulación de la actividad
funcional del receptor de IGF-I comprende la
transformación de células epiteliales del plexo coroideo de un
animal no humano mediante la introducción de una construcción
génica que comprende un polinucleótido cuya secuencia de
nucleótidos codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen
del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad
biológica, o un vector que comprende dicha construcción génica, en
donde dicho elemento inhibidor se selecciona entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido
especifica de la secuencia del gen o del mRNA del receptor de
IGF-I,
b) una ribozima específica del mRNA del receptor
de IGF-I,
c) un aptámero específico del mRNA del receptor
de IGF-I, y
d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del
mRNA del receptor de IGF-I.
25. Un vector lentiviral obtenible mediante
transfección transitoria en células empaquetadoras de:
un plásmido (i) que comprende una secuencia de
nucleótidos seleccionada entre:
- -
- una secuencia de nucleótidos que codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I, y
- -
- una secuencia de nucleótidos que codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad funcional;
un plásmido (ii) que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína Rev;
un plásmido (iii) que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica el elemento de respuesta a Rev (RRE);
y
un plásmido (iv) que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica la envoltura heteróloga del vector.
26. Vector según la reivindicación 25, en el que
dicho plásmido (i) es un plásmido que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica una forma mutada no funcional del receptor
de IGF-I seleccionada entre la secuencia de
nucleótidos que codifica la forma mutada no funcional del receptor
de IGF-I denominada IGF-IR.KR que
presenta la mutación K1003R, en la que el residuo de lisina de la
posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de
IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de
arginina y la secuencia de nucleótidos que codifica la forma mutada
no funcional del receptor de IGF-I denominada
IGF-IR.KA que presenta la mutación K1003A, en la
que el residuo de lisina de la posición 1003 de la secuencia de
aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido
sustituido por un residuo de alanina.
27. Vector según la reivindicación 25, en el que
dicho plásmido (i) es un plásmido que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica un elemento inhibidor de la expresión del
gen del receptor de IGF-I capaz de anular su
actividad funcional seleccionada entre una secuencia de nucleótidos
que codifica: a) una secuencia de nucleótidos antisentido
especifica de la secuencia del gen o del mRNA del receptor de
IGF-I, b) una ribozima específica del mRNA del
receptor de IGF-I, c) un aptámero específico del
mRNA del receptor de IGF-I, y d) un RNA de
interferencia (iRNA) específico del mRNA del receptor de
IGF-I.
28. Vector viral según la reivindicación 25, en
el que:
dichas células empaquetadoras son células
293T;
dicho plásmido (i) es el plásmido definido en la
reivindicación 27 ó 28;
dicho plásmido (ii) es el plásmido identificado
como RSV-Rev, que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína Rev del virus del sarcoma de
Rous (RSV);
dicho plásmido (iii) es el plásmido identificado
como p-RRE, que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica el elemento de respuesta a Rev (RRE); y
dicho plásmido (iv) es el plásmido identificado
como pVSV, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica
la proteína de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular
(VSV).
29. Uso de un vector según cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 28, en un procedimiento para la obtención de
un animal no humano útil como modelo experimental según cualquiera
de las reivindicaciones 15 a 24.
30. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que dicho proceso de transgénesis de anulación de la actividad
funcional del receptor de IGF-I en las células
epiteliales del plexo coroideo comprende la administración de una
construcción génica que comprende promotor específico de plexo
coroideo y un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica
una forma mutada no funcional dominante del receptor de
IGF-I, o de un vector que comprende dicha
construcción génica, a células embrionarias de dicho animal no
humano.
31. Procedimiento según la reivindicación 30, en
el que dicha forma mutada no funcional dominante del receptor
IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor
de IGF-I denominada IGF-IR.KR que
presenta la mutación K1003R, en la que el residuo de lisina de la
posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de
IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de
arginina.
32. Procedimiento según la reivindicación 30, en
el que dicha forma mutada no funcional dominante del receptor
IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor
de IGF-I denominada IGF-IR.KA que
presenta la mutación K1003A, en la que el residuo de lisina de la
posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de
IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de
alanina.
33. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que dicho proceso de transgénesis de anulación de la actividad
funcional del receptor de IGF-I en las células
epiteliales del plexo coroideo comprende la administración de una
construcción génica que comprende promotor específico de plexo
coroideo y un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica
un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de
IGF-I capaz de anular su actividad biológica, o un
vector que comprende dicha construcción génica a células
embrionarias de dicho animal no humano, en donde dicho elemento
inhibidor se selecciona entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido
especifica de la secuencia del gen o del mRNA del receptor de
IGF-I,
b) una ribozima específica del mRNA del receptor
de IGF-I,
c) un aptámero específico del mRNA del receptor
de IGF-I, y
d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del
mRNA del receptor de IGF-I.
34. Procedimiento según la reivindicaciones 30 a
la 33, en el que dicho promotor específico de tejido es el promotor
del gen transtirretina.
35. Procedimiento según la reivindicaciones 30 a
la 34, en el que dicho proceso de transgénesis es inducible.
36. Uso de un animal según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14 como modelo para el estudio del mecanismo
etiopatogénico de una enfermedad neurodegenerativa o para la
identificación y evaluación de compuestos terapéuticos frente a
dicha enfermedad.
37. Uso, según la reivindicación 36, en el que
dicha enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad
neurodegenerativa que cursa con demencia.
38. Uso, según la reivindicación 36 ó 37, en el
que dicha enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad
neurodegenerativa humana.
39. Uso, según la reivindicación 36, de un animal
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 como modelo para el
estudio de los mecanismos etiopatogénicos de la enfermedad de
Alzheimer o para la identificación y evaluación de compuestos
terapéuticos frente a dicha enfermedad.
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