ES2246588T3 - Tratamiento de enfermedades que implican formacion de quistes. - Google Patents
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Abstract
El uso de un ligando de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (PTBR) para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de una enfermedad que implica la formación de quistes en un paciente que tiene o con riesgo de desarrollar dicha enfermedad, en el que el ligando de PTBR es un compuesto orgánico seleccionado entre el grupo compuesto por benzodiazepinas, isoquinolina carboxamidas, imidazopiridinas, 2-aril-3- indolacetamidas y pirrolobenzoxazepinas.
Description
Tratamiento de enfermedades que implican
formación de quistes.
La presente invención se refiere al tratamiento
de enfermedades que implican la formación de quistes, tal como la
enfermedad poliquística del riñón. La presente invención también se
refiere a diversos ligandos endógenos y exógenos de receptores de
benzodiazepina de tipo periférico, y en particular, su uso en la
prevención o tratamiento de la formación de quistes.
Hay varias enfermedades humanas que dan lugar a
la formación de quistes de material semisólido o líquido. Los
quistes benignos pueden producirse, por ejemplo, en el ovario,
bazo, pulmones, riñón e hígado, donde a menudo son hereditarios. Los
quistes pueden adquirirse, como en la diverticulosis de los
intestinos, o adquirirse como causa secundaria de una enfermedad
hereditaria, como en la fibrosis quística, o heredarse directamente
como en la enfermedad poliquística del riñón, que también puede
afectar al hígado y al cerebro.
Los quistes renales se originan en el parénquima
renal y comienzan como dilataciones o evaginaciones de las nefronas
o de los túbulos colectores existentes o de los equivalentes de
estas estructuras en desarrollo. Los quistes renales contienen un
líquido que presumiblemente deriva de su nefrona parental y/o es una
secreción local. Pueden ser hereditarios, aparecer durante el
desarrollo o adquirirse, y pueden producirse en la corteza, médula
o ambas y pueden estar asociados o no con otras anomalías renales o
sistémicas. Para más detalles véase, por ejemplo, Brenner y Rector,
The Kidney, Cuarta Edición, 1991, vol. II, Pág.
1657-1659.
La enfermedad poliquística del riñón (PKD) es un
subgrupo de trastornos quísticos renales en la que los quistes se
distribuyen por toda la corteza y médula de ambos riñones. La PKD
es generalmente el distintivo de un único trastorno autosómico
dominante (enfermedad poliquística autosómica dominante del riñón,
ADPKD) o autosómico recesivo (enfermedad poliquística autosómica
recesiva del riñón, ARPKD), pero también pueden encontrarse en
asociación con una diversidad de estados clínicos o adquirirse en
algún momento de la vida por un paciente con una enfermedad renal
no quística subyacente. La PKD es el trastorno renal hereditario de
mayor prevalencia, siendo responsable de más del 5 por ciento de
pacientes en hemodiálisis crónica.
La ADPKD, la enfermedad renal hereditaria
dominante más común, generalmente aparece a mediana edad y se
caracteriza morfológicamente por un agrandamiento quístico masivo,
infiltración intersticial moderada con células mononucleares y
fibrosis extensiva. Los síntomas característicos incluyen
proteinuria, dolor abdominal y riñones palpables, seguido por
hematuria, hipertensión, piuria, uremia y cálculos. En
aproximadamente el 15% de los pacientes, la muerte se debe a un
aneurisma cerebral. La ADPKD está causada por mutaciones en uno de
tres genes: PKD1 en el cromosoma 16 es responsable de
aproximadamente el 85% de los casos, mientras que PKD2 en el
cromosoma 4 es responsable de aproximadamente el 15%. Las
mutaciones en el gen PKD3, hasta ahora sin mapear, son raras.
(Reeders y col., Nature 317:542-544
[1985]; Kimberiing y col., Genomics
18:467-472 [1993]; Daoust y col.,
Genomics 25:733-736 [1995]; Koptides
y col., Hum. Mol. Genet. 8:509-513
[1999]).
La ARPKD es un trastorno hereditario raro que
generalmente se manifiesta clínicamente en la infancia temprana,
aunque también se ha observado en muchos casos la aparición de
ARPKD a edades más tardías y supervivencia en la madurez. La ARPKD
se estudió primero en ratones C57BL/6J en los que aparece
espontáneamente (Preminger y col., J. Urol.
127:556-560 [1982]). La mutación cpk
característica de esta enfermedad se ha mapeado en el cromosoma 12
del ratón (Davisson y col., Genomics
9:778-781 [1991]). El gen responsable de la
ARPKD en humanos se ha mapeado en el cromosoma 6p. Más
recientemente se ha publicado un mapeo más exhaustivo del locus de
la enfermedad poliquística autosómica recesiva del riñón (PKDH1)
(Mucher y col., Genomics 48:40-45
[1998]).
Se ha publicado que el taxol y los derivados del
taxol inhiben la progresión de la PKD y prolonga la supervivencia
de ratones cpk poliquísticos (Woo y col., Nature
368:750-753 [1994]; Publicación PCT WO
94/08041; Patente de EE. UU. Nº 5.882.881). Puesto que el taxol
induce específicamente la expresión de TNF-\alpha
en macrófagos y linfocitos, se ha sugerido también que el
TNF-\alpha es útil en el tratamiento de PKD
(Patente de EE. UU. Nº 5.750.495).
En la APKD, los quistes renales se mantienen
pequeños durante 30-40 años. Entonces, comienzan a
expandirse, reemplazando progresivamente el parénquima renal que
funciona con normalidad. Los factores implicados en la expansión de
los quistes incluyen pérdida de diferenciación epitelial,
proliferación y apoptosis aumentadas, secreción de cloro y otros
iones en el líquido quístico y el desarrollo de inflamación
alrededor de la circunferencia externa de la pared del quiste
(Grantham, J, Am. J. Kid. Dis.
28:788-803 [1996]).
Existe la necesidad de la identificación de
factores endógenos y exógenos que sean útiles para la prevención y
tratamiento de enfermedades que implican formación de quistes y
expansión de quistes. En vista de la gravedad y frecuencia de la
presencia de PKD, hay una particular necesidad de encontrar agentes
terapéuticos útiles en la prevención y tratamiento de esta
enfermedad.
Los ligandos de los PTBR se conocen desde hace
muchos años y los efectos antiansiedad en el SNC de los agonistas de
PTBR (por ejemplo, el valium) son ampliamente conocidos. Con
respecto a los receptores de benzodiazepina fuera del SNC (PTBR) la
mayoría de lo que se conoce se refiere a la función de estos
receptores como mediadores de la relajación muscular, en
particular, la relajación del músculo esquelético. Se ha encontrado
que el tono vagal disminuye tras la administración intravenosa de
diazepam. (Adinoff y col., Psychiatry Research
41:89-97 [1992]). Hay evidencias del control del
tono vagal cardiaco por receptores de benzodiazepina (DiMicco,
Neuropharmacology 26:533-559 [1987]). Se ha
descrito que los ligandos de PTBR Ro5-4864 y
PK11195, pero no el diazepam, reducen la función cardiaca en un
modelo de corazón de rata que funciona aislado (Edoute y col.,
Pharmacology 46:224-230 [1993]). También se ha
informado de que Ro5-4864 aumenta el flujo
coronario en un corazón de rata de Langendorf aislado y perfundido
sin afectar a la frecuencia cardiaca ni a la contractibilidad
ventricular izquierda. PK11195 no contrarresta este efecto
vasodilatador (Grupp y col., Eur. J. Pharm.
143:143-147 [1987]). En una preparación de corazón
de rata aislado, el diazepam inducía un efecto ionotrópico negativo
transitorio seguido de una respuesta ionotrópica positiva. La
ionotropía positiva era contrarrestada por PK11195 (Leeuwin y col.,
Eur. J. Pharm. 299:149-152 [1996]). El diazepam
aumentaba la fuerza contráctil en el corazón de rata de Langendorf.
(Leeuwin y col., Arch. Int. Pharmacodyn, 326:5-12
[1993]). Se ha demostrado que Ro5-4864 tiene un
pequeño (20%) efecto depresivo en la amplitud de contracción
(efecto ionotrópico positivo) de las bandas atriales humanas que no
se contrarresta con PK11195 (Shany y col., Eur. J. Pharm.
253:231-236 [1994]). En una preparación de corazón
de cobaya, Ro5-4864 disminuía la duración del
potencial de acción intracelular y de la contractibilidad. El
diazepam era menos eficaz y el clonazepam ineficaz. Los efectos de
Ro5-4864 se invertían por PK11195, pero no por un
antagonista específico de BZR del SNC (Mestre y col., Life Sciences
35:953-962 [1984]). Se demostró in vivo la
presencia de sitios de unión de PTBR en corazones de perro y humanos
mediante tomografía por emisión de positrones usando
[^{11}C]-PK11195. (Charmonneau y col.,
Circulation 73:476-483 [1986]). Se ha informado
también de que Ro5-4862 y dipiridamol pueden
competir con la unión de [^{3}H]diazepam al tejido
cardiaco. El diazepam potencia las acciones de adenosina sobre
músculo cardiaco y esquelético aislado y la acción vasodilatadora
coronaria de la adenosina en perros. Hay evidencias de que el
diazepam puede actuar de una manera similar al dipiridamol
inhibiendo la captación de adenosina. (Davies y Huston, Eur. J.
Pharm. 73:209-211 [1981]).
Más recientemente, se ha demostrado que los PTBR
juegan un papel en las rutas celulares subyacentes a la apoptosis.
Los PTBR expresados en mitocondrias sirven como receptores de
anclaje para Bcl_{2}, una proteína que inhibe la apoptosis. Las
rutas biológicas en la apoptosis moduladas por las interacciones de
ligandos de PTBR no se conocen específicamente.
La presente invención se basa en el
reconocimiento de que ligandos que interaccionan con los PTBR son
útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas con la formación
de quistes, y en particular, retrasan o previenen la progresión de
la enfermedad poliquística del riñón (PKD) a una insuficiencia
renal, y/o retrasan o previenen la tendencia acompañante a la
hipertensión.
El objeto de la invención se define en las
reivindicaciones.
La invención es útil para el tratamiento de una
enfermedad, que implica la formación de quistes, que comprende
administrar a un paciente que tiene o está en riesgo de desarrollar
esta enfermedad una cantidad eficaz de un ligando de un receptor de
benzodiazepina de tipo periférico (PTBR). El paciente
preferiblemente es un mamífero, más preferiblemente humano. En una
realización particular, la enfermedad a tratar es la enfermedad
poliquística del riñón (PKD). En una realización preferida, la
administración de un ligando de PTBR previene o retrasa la
progresión de la PKD. En otra realización preferida, la
administración de un ligando de PTBR previene o retrasa el
desarrollo de un síntoma de la PKD, tal como la hipertensión
asociada con PKD, la hemorragia en el quiste o el dolor asociado
con la expansión del quiste.
En un aspecto adicional, la invención puede
usarse para el tratamiento de la insuficiencia renal progresiva
asociada con la progresión de la enfermedad quística.
En otro aspecto, la invención es útil para el
tratamiento de la hipertensión que acompaña a la enfermedad
poliquística renal (PKD) que comprende administrar a un paciente
una cantidad eficaz de un ligando de un receptor de benzodiazepina
de tipo periférico (PTBR).
Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un
a composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad
que implica la formación de quistes o la expansión de quistes, que
comprende una cantidad eficaz de un ligando de un receptor de
benzodiazepina de tipo periférico (PTBR) en una mezcla con taxol o
un derivado de taxol y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En todos los aspectos, la enfermedad a tratar es
preferiblemente la enfermedad poliquística del riñón (PKD), que
incluye tanto la enfermedad poliquística autosómica dominante del
riñón (ADPKD) como la enfermedad poliquística autosómica recesiva
del riñón (ARPKD). El tratamiento específicamente incluye la
prevención y retardo de la progresión de la enfermedad. Si el
objetivo es prevenir o retrasar la progresión de la PKD, puede
diagnosticarse a los pacientes susceptibles a la enfermedad
identificando mutaciones en los genes PKD1, PKD2 o PKD3 que están
asociados con la PKD.
En todos los aspectos, el agonista de PTBR puede
ser, por ejemplo, un ligando de PTBR de secuencia nativa o un
fragmento o una subunidad funcional del mismo, una molécula o
péptido orgánico pequeño, una variante polipeptídica de un ligando
de secuencia nativa, un anticuerpo, un glicopéptido, un
glicolípido, un polisacárido, un oligosacárido, un ácido nucleico,
un peptidomimético, un agente farmacológico o un metabolito del
mismo, una secuencia control de la transcripción o de la traducción
y similares. De forma similar, el antagonista de PTBR puede ser un
polipéptido, un péptido o una molécula orgánica pequeña, una
variante polipeptídica de un ligando de secuencia nativa, un
anticuerpo, un glicopéptido, un glicolípido, un polisacárido, un
oligosacárido, un ácido nucleico, un peptidomimético, un agente
farmacológico o un metabolito del mismo, una secuencia control de
la transcripción o traducción y similares. Por ejemplo, los
antagonistas de PTBR incluyen variantes polipeptídicas de un ligando
de PTBR de secuencia nativa, variantes de un PTBR de secuencia
nativa que retienen la capacidad para unir un ligando endógeno,
pero que son deficientes en cuanto a su capacidad para mediar
actividad biológica, anticuerpos anti-PTBR o
anti-ligando de PTBR e inhibidores selectivos de la
producción in vivo de un ligando de PTBR endógeno. Las
moléculas orgánicas pequeñas se seleccionan entre las clases
químicas de benzodiazepinas, isoquinolina carboxamidas,
imidazopiridinas,
2-aril-3-indolacetamidas
y pirolobenzoxazepinas. Un agonista particularmente preferido es
Ro5-4864, mientras que un antagonista
particularmente preferido es PK 11195.
Los ligandos de PTBR pueden administrarse en
combinación con un agente terapéutico adicional, preferiblemente con
un agente conocido por ser útil para tratar la enfermedad blanco o
una dolencia relacionada. Por ejemplo, los ligandos de PTBR de la
presente invención pueden administrarse en combinación con uno o más
agentes terapéuticos que inhiben el suministro de proteínas de
membrana a la membrana de una célula del paciente tratado. Estos
agentes incluyen, por ejemplo, taxol,
citocalasina-B, citocalasina-D,
faloidina y derivados de cualquiera de los anteriores, y
TNF-\alpha. Los ligandos de PTBR pueden también
administrarse en combinación con inhibidores genéricos de la
progresión de la insuficiencia renal, tales como terapéuticos
antihipertensión, que incluyen inhibidores ECA.
La administración puede realizarse por diversas
rutas conocidas en la técnica, que incluyen, sin limitación, la
administración por vía intravenosa, intraperitoneal, intraarterial,
subcutánea, oral o intramuscular.
La figura 1 muestra los datos de alineamiento
comparando el ADNc que codifica el gen del receptor de
benzodiazepina de tipo periférico de rata expresado diferencialmente
(P0268) con el correspondiente ADNc humano para PTBR (SEC ID Nº: 1 y
2).
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
del PTBR humano (SEC ID Nº: 3).
La figura 3 muestra los datos de alineamiento
comparando el ADNc que codifica el gen del inhibidor de la unión de
diazepam (DBI) de rata expresado diferencialmente con el
correspondiente ADNc humano para DBI (SEC ID Nº: 4 y 5).
La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos
del DBI humano (SEC ID Nº: 6).
La figura 5 muestra la estructura química de los
ligandos de PTBR seleccionados, incluyendo el agonista de PTBR
Ro5-4864 y el antagonista PK 11195.
La figura 6 es una ilustración gráfica del efecto
del agonista de PTBR Ro5-4864 sobre la proliferación
de células de ADPKD humanas. En la Figura, "A" representa
Ro5-4864, y los números siguientes representan las
concentraciones molares del agonista. De este modo, "-12"
después de "A" significa que el agonista
Ro5-4864 se usó a una concentración de 10^{-12}
M.
Siempre que no se defina otra cosa, los términos
técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo
significado normalmente entendido por cualquier experto en la
materia a la que pertenece esta invención. Singleton y col.,
Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2ª Edición, J.
Wiley e Hijos (Nueva York, NY 1994), y March, Advanced Organic
Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ª Edición, John Wiley
e Hijos (Nueva York, NY 1992) proporcionan a cualquier experto en la
materia una guía general de muchos de los términos usados en la
presente solicitud.
Un experto en la materia reconocerá muchos
procedimientos y materiales similares o equivalentes a los
descritos en este documento, que podrían usarse en la práctica de
la presente invención. De hecho, la presente invención no está de
ningún modo limitada por los procedimientos y materiales descritos.
Para los fines de la presente invención, a continuación se definen
los siguientes términos.
Las expresiones "receptor de benzodiazepina de
tipo periférico", "PTBR" y "polipéptido de PTBR",
usados en singular o en plural, se usan indistintamente y abarcan
cualquier polipéptido de PTBR de secuencia nativa. Estos
polipéptidos de PTBR pueden aislarse de diversas fuentes, tales
como diversos tipos de tejidos humanos o no humanos, o prepararse
mediante procedimientos de recombinación y/o de síntesis. Todos
estos polipéptidos están específicamente dentro del alcance de la
definición, independientemente de su modo de preparación, e incluye
variantes de los mismos. De este modo, las expresiones "receptor
de benzodiazepina de tipo periférico", "PTBR" y
"polipéptido de PTBR", usadas en singular o plural, se
refieren a polipéptidos del receptor que se unen a moléculas de
benzodiazepina, pero son distintos de los asociados con receptores
de benzodiazepina de tipo central y que tienen la misma secuencia
de aminoácidos que el respectivo polipéptido de origen natural.
Estos polipéptidos PTBR pueden aislarse de la naturaleza o pueden
producirse por medios de recombinación o sintéticos. El término
"PTBR" abarca específicamente formas truncadas o secretadas
naturales (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), así
como formas variantes naturales (por ejemplo, formas de ayuste
alternativo) y variantes alélicas naturales. Los PTBR representan
un subgrupo de la familia del receptor de benzodiazepina que se
localiza fuera del sistema nervioso central. Kruger y col., en
GABA and Benzodiazepine Receptor Subtypes, Biggio y Costa
editores, pág. 1-14 (1990) publicaron la
purificación, clonación y expresión de un receptor de
benzodiazepina de tipo periférico. El ADNc de un polipéptido de PTBR
de 18 kDa, identificado originalmente en tejido cardiaco, se ha
clonado posteriormente a partir de diversas fuentes, tales como
adrenal de rata (Sprengel y col., J. Biol. Chem.
264:20.415-20.421 [1989]); adrenal bovina
(Parola y col., J. Biol. Chem.
266:14.082-14.087 [1991]); una línea celular
de linfoma humano (Riond y col., Eur. J. Biochem.
195:305-311 [1991]); y una línea celular de
tumor de Leydig de ratón (Garnier y col., Mol. Pharmac.
45:201-211 [1993]). Esta proteína de 169
aminoácidos tiene aproximadamente el 80% de homología entre
especies. Diversas células transfectadas con estos ADNc exhiben
características de unión para los ligandos de PTBR
Ro5-4864 y PK 11195. Se ha sugerido que PTBR es un
complejo multimérico en el que el sitio de unión de PK 11195 está
en la subunidad de 18 kDa y la expresión del sitio de unión de
benzodiazepina requiere otra subunidad, denominada VDAC. Se ha
intentado también identificar otra proteína de 10 kDa, asociada con
PTBR, como un componente más del complejo PTBR (Véase, por ejemplo,
Zisterer y Williams, supra). Todos estos polipéptidos, solos
o en cualquier combinación funcional, están específicamente dentro
de la definición de "PTBR". En una realización particular, el
receptor de benzodiazepina de tipo periférico tiene la secuencia de
aminoácidos del PTBR humano (SEC ID Nº: 3).
Las expresiones "ligando", "ligando de
PTBR" y "ligando de un PTBR (de secuencia nativa)" se usan
indistintamente y se usan en el sentido más amplio para incluir
factores endógenos y exógenos que interaccionan con un PTBR,
incluyendo ligandos de PTBR de secuencia nativa y sus variantes,
así como ligandos de polipéptidos sintéticos o moléculas pequeñas.
La "interacción" se define como la capacidad para afectar a la
función de un PTBR puede, pero no necesariamente, implicar la unión
específica del PTBR de secuencia nativa. El término "ligando de
PTBR" incluye antagonistas y agonistas, como se define a
continuación.
Las expresiones "ligando de secuencia
nativa", "ligando de PTBR de secuencia nativa", "ligando
de secuencia nativa de un PTBR" y equivalentes gramaticales de
ellos, se usan indistintamente, y se refieren a ligandos endógenos
de un PTBR, conocidos o descubiertos en lo sucesivo. Estos
polipéptidos de secuencia nativa se pueden aislar de la naturaleza
o se pueden producir por medios recombinantes y/o sintéticos. La
expresión "secuencia nativa" conjuntamente con la designación
de un polipéptido particular abarca específicamente las formas
truncadas o secretadas naturales (por ejemplo, una secuencia del
dominio extracelular), así como formas variantes naturales (por
ejemplo, formas de ayuste alternativo) y variantes alélicas
naturales del polipéptido mencionado.
El término "antagonista" se usa en el
sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea parcial
o totalmente, inhibe o neutraliza una actividad biológica mediada
por un PTBR de secuencia nativa mediante la prevención de la unión
de un agonista al PTBR de secuencia nativa, bloqueando, de ese modo,
la actividad biológica del agonista mediada por el PTBR. De manera
similar, el término "agonista" se usa en el sentido más amplio
e incluye cualquier molécula que mimetiza una actividad biológica
mediada por un PTBR, y cambia específicamente la función o
expresión de un PTBR, o la eficacia de señalización a través de un
PTBR, alterando, de ese modo, (aumentando o inhibiendo) una
actividad biológica ya existente o desencadenando una nueva
actividad biológica.
Las expresiones "variante" y "variante de
la secuencia de aminoácidos" se usan indistintamente y designan
polipéptidos a los que se añaden y/o sustituyen y/o seleccionan y/o
insertan uno o más aminoácidos en el extremo
N-terminal o C-terminal o en
cualquier lugar dentro de la secuencia nativa correspondiente y que
retiene al menos una actividad (como se define a continuación) del
correspondiente polipéptido nativo. En diversas realizaciones, un
polipéptido "variante" normalmente tiene al menos
aproximadamente el 75% de identidad de secuencia de aminoácidos, o
al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de
aminoácidos, preferiblemente al menos el 85% de identidad de
secuencia de aminoácidos, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, y
más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de
secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del
correspondiente polipéptido de secuencia nativa.
La "identidad de secuencia", se define como
el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata
que son idénticos a los restos de aminoácidos en una secuencia
polipeptídica nativa, después de alinear las secuencias e introducir
los huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de
identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución
conservativa como parte de la identidad de secuencia.
La homología local en el algoritmo de Smith y
Waterman (Smith y col., Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)) puede
conducir al alineamiento óptimo de secuencias para su comparación,
por ejemplo, por la homología de alineamiento por medio del
algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y col., J. Mol.
Biol. 48:443 (1970)), por la búsqueda de similitudes por el
procedimiento de Pearson y Lipman (Pearson y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)), por la puesta en práctica
informatizada de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en
el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group,
575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección.
En una realización preferida, se puede usar la
homología de alineamiento mediante algoritmos empleados en el
programa BLAST (Altschul y col., Nucleic Acids Res.
25:3389-3402 (1997)). La familia de programas BLAST
permite todas las combinaciones de secuencias de consulta de ADN o
de proteínas con búsquedas en bases de datos de ADN o de proteínas.
En el contexto de la presente invención, los programas BLAST
específicos que se pueden utilizar incluyen: blastp, que compara una
secuencia de aminoácidos de consulta con una base de datos de
secuencias de proteínas; blasn, que compara una secuencia de
nucleótidos de consulta con una base de datos de secuencias de
nucleótidos; blastx, que compara los seis posibles productos de
traducción en fase de una secuencia de nucleótidos de consulta
(ambas cadenas) con una base de datos de secuencias de proteínas;
tblastn, que compara una secuencia proteica de consulta con una
base de datos de secuencias nucleotídicas traducidas dinámicamente
en las seis fases de lectura abierta (ambas cadenas); y tblastx,
que compara las seis traducciones en fase de una secuencia de
nucleótidos de consulta con las seis traducciones en fase de una
base de datos de secuencias de nucleótidos. Para el programa blastn
se utilizan los siguientes parámetros y valores por defecto: -G:
valor de penalización por abrir un hueco, por defecto = 5; -E:
valor de penalización por extender un hueco, por defecto = 2; -q:
penalización por falta de coincidencia en la porción blast de
desarrollo, por defecto = -3; r: recompensa por una coincidencia en
la porción de blast de desarrollo, por defecto = 1; -e: valor
esperado (E), por defecto= 10,0; -W: tamaño de palabra, por defecto
es 11 para blastn y 3 para otros programas, -v: número de
descripciones de una línea (V), por defecto = 100 y -b: número de
alineamientos a mostrar (B), por defecto = 100.
Más preferiblemente, los valores de % de
identidad de secuencia se generan con el programa NCBI BLAST2.0
como se define en Altschul y col., (1997), "Gapped BLAST and
PSI-BLAST: a new generation of protein database
search programs", Nucleic Acids Res.,
25:3389-3402. Los parámetros se ajustan a
valores por defecto, con la excepción de la penalización por falta
de coincidencia 7, que se ajusta a -1.
"Activa" o "actividad" significa una
propiedad biológica y/o inmunológica cualitativa. En el contexto de
la presente invención, una actividad biológica preferida de un
antagonista de PTBR es la capacidad para prevenir, retrasar la
progresión o eliminar la formación del quiste o la expansión del
quiste, o tratar una enfermedad que depende o está mediada por la
formación de quistes. Incluso más preferiblemente, un antagonista
PTBR es biológicamente activo, si éste es eficaz en el tratamiento
de la enfermedad poliquística del riñón (PKD).
La expresión "propiedad inmunológica"
significa la reactividad cruzada inmunológica con al menos un
epítope de la molécula polipeptídica de referencia (secuencia
nativa), en la que "reactividad cruzada inmunológica" significa
que el polipéptido candidato es capaz de inhibir de forma
competitiva la actividad biológica cualitativa del polipéptido de
referencia (secuencia nativa). La reactividad cruzada inmunológica
es preferiblemente "específica", lo que significa que la
afinidad de unión de la molécula con reactividad cruzada
inmunológica identificada con el polipéptido correspondiente es
significativamente mayor (preferiblemente al menos aproximadamente
2 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 4 veces, más
preferiblemente al menos aproximadamente 6 veces mayor) que la
afinidad de unión de esta molécula a cualquier otro polipéptido
nativo conocido.
Las expresiones "enfermedad poliquística del
riñón", "PKD" y "enfermedad renal poliquística" se usan
indistintamente y se refieren a un grupo de trastornos
caracterizados por un gran número de quistes distribuidos a lo largo
de riñones espectacularmente atrofiados. El desarrollo de los
quistes resultantes lleva a una función renal deficiente y puede
causar finalmente una insuficiencia renal. "PKD"
específicamente incluye la enfermedad poliquística autosómica
dominante del riñón (ADPKD) y la enfermedad poliquística autosómica
recesiva del riñón (ARPKD), en todos las etapas del desarrollo, sin
tener en cuenta la causa subyacente.
Los términos "tratar" y "tratamiento"
se refieren tanto a tratamientos terapéuticos como a medidas
profilácticas o preventivas, en las que el objeto es prevenir o
retrasar (aliviar) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, o
la expansión de este trastorno, tal como el desarrollo de la
enfermedad poliquística del riñón. Para los fines de esta
invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen,
pero no de forma limitante, la mejora de los síntomas, disminución
del alcance de la enfermedad, estado estabilizado de la enfermedad
(es decir, sin empeoramiento), retraso o ralentización de la
progresión de la enfermedad, mejora o paliación de la patología y
remisión (bien parcial o total), detectable o indetectable.
"Tratamiento" también puede significar prolongar la
supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se
recibe tratamiento. Entre los que necesitan tratamiento se incluyen
los que ya sufren la dolencia o el trastorno, así como los propensos
a sufrir la dolencia o el trastorno o en los que se tiene que
prevenir la dolencia o el trastorno.
La administración "crónica" se refiere a la
administración del agente(s) de un modo continuo a
diferencia del modo agudo, para mantener de este modo el efecto
deseado durante un periodo prolongado de tiempo.
La administración "intermitente" es el
tratamiento que no se da de forma consecutiva sin interrupción,
sino más bien de naturaleza cíclica.
La administración "en combinación con" uno o
más agentes terapéuticos adicionales incluyen la administración
simultánea (concomitante) y consecutiva en cualquier orden.
Un "individuo" es un vertebrado,
preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano.
"Mamífero" para los fines del tratamiento se
refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo
humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico,
deportivos o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas,
etc. Preferiblemente el mamífero en este documento es humano.
Una "cantidad efectiva" es una cantidad
suficiente para proporcionar resultados clínicos beneficiosos o
deseados. Puede administrarse una cantidad eficaz en una o más
administraciones. Para los fines de esta invención, una cantidad
eficaz de un ligando de PTBR es una cantidad que es suficiente para
llevar a cabo el tratamiento, como se ha definido
anteriormente.
El término "recombinante" cuando se usa con
referencia a una célula, animal o virus indica que la célula,
animal o virus codifica un ADN o ARN extraño. Por ejemplo, células
recombinantes que opcionalmente expresan ácidos nucleicos (por
ejemplo, ARN) no encontrados en la forma nativa (no recombinante) de
la célula.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido
más amplio y especialmente abarca anticuerpos monoclonales
anti-PTBR (incluyendo anticuerpos agonistas,
antagonistas y neutralizantes), anticuerpos policlonales,
anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos
biespecíficos) así como fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos
monoclonales específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos"
en los que una porción de la cadena ligera y/o pesada es idéntica u
homóloga a secuencias correspondientes a anticuerpos derivados de
una especie en particular o pertenece a una clase o subclase de
anticuerpo en particular, mientras que el resto de la
cadena(s) es idéntica u homóloga a las secuencias
correspondientes de anticuerpos derivados de otra especie o
pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como
fragmentos de estos anticuerpos siempre que muestren la actividad
biológica deseada (Patente de EE. UU. Nº 4.816.567; Morrison y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855
(1984)). Adicionalmente, los anticuerpos monoclonales incluyen
anticuerpos o fragmentos de los mismos "humanizados" (tales
como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias del
anticuerpo de unión al antígeno) que contienen secuencias mínimas
derivadas de inmunoglobulinas no humanas. En su mayor parte, los
anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpos
receptores) en los que se han sustituido restos de un CDR del
receptor por restos del CDR de una especie no humana (anticuerpo
donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad,
afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los restos FR del
Fv de la inmunoglobulina humana han sido sustituidos por los
correspondientes restos no humanos. Además, los anticuerpos
humanizados pueden comprender restos que no se encuentran ni en el
anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o de regiones
estructurales importadas. Estas modificaciones se hacen para
refinar y maximizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo.
En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente
todos los dominios variables de al menos uno, y típicamente dos, en
los que todas o sustancialmente todas la regiones CDR corresponden
con las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente
todas las regiones FR son de una secuencia de inmunoglobulina
humana. Óptimamente, el anticuerpo humanizado también comprenderá
al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina
(Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles
adicionales, véase Jones y col., Nature
321:522-525 (1986) y Reichmann y col., Nature
332:323-329 (1988). El anticuerpo humanizado
incluye un anticuerpo PRIMATIZED® en el que la región de unión al
antígeno del anticuerpo deriva de un anticuerpo producido
inmunizando monos macacos con el antígeno de interés.
"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una
porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión
al antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos
de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab',
F(ab')_{2} y Fv; dianticuerpos, anticuerpos lineales
(Zapata y col., Protein Eng.
8(10):1057-1062 (1995)); moléculas de
anticuerpo de cadena única y anticuerpos multiespecíficos formados
a partir de fragmentos de anticuerpo.
Hay varios polipéptidos nativos que supuestamente
se han identificado como ligandos endógenos de PTBR o como
componentes de estos ligandos. Un posible ligando endógeno es el
inhibidor de la unión de diazepam (DBI) (Berkovich y col., Mol.
Pharmac. 37:164-172 [1990]; Guidotti y
col., Nature 257:533-535 [1978]), un
polipéptido endógeno de 11 kDa de 86 aminoácidos (Besman y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:4897-4901 [1989]). El mismo ligando
también se denomina en la bibliografía como proteína de unión al
acil coenzima A (Knudsen y col., Biochem. J. 26:
513-519 [1989]). Este no es un ligando selectivo ya
que tiene la misma afinidad (intervalo \muM) tanto para el
receptor GABA_{A}/benzodiazepina como para PTBR. Un fragmento
corto de DBI (fragmento 17-50 también denominado
como tricontetraneuropéptido) es más selectivo para PTBR.
Otro conjunto de ligandos endógenos son
porfirinas naturales de las que se ha informado que tienen alta
afinidad por el PTBR (Taketani y col., J. Biochem.
117:875-880 [1995] y Zisterer y Williams,
supra).
También se conocen y se han caracterizado bien
ligandos sintéticos. Estos ligandos sintéticos incluyen
benzodiazepinas, tales como, por ejemplo, Ro5-4864
y clonazepam; isoquinolina carboxamidas, por ejemplo, PK 11195
[1-(2-clorofenil)-N-metil-N-(1-metilpropil)-3-isoquinolina
carboxamida]; y PK 14105
[(2-fluoro-5-nitro-fenil)-N-metil-N-(1-metilpropil)-3-isoquinolina
carboxamida]; imidazopurinas, por ejemplo Alpidem y Zolpidem y
Z-amil-3 indoleacetamidas, por
ejemplo, FGIN-1-27 y
pirolobenoxapinas, por ejemplo, NF 182. Las estructuras químicas de
algunos ligandos de PTBR sintéticos seleccionados se muestran en la
figura 5. Otros ligandos de PTBR sintéticos también son bien
conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Zister y
Williams, supra; Anzini y col., J. Med. Chem 4275
(1996), Cappelli y col., J. Med Chem. 2910 (1997) (análogos
conformacionalmente restringidos de Ro5-4864);
documento WO 96132383 [derivados de
(2-fenil-pirimidil-4-il)(oxi
o amino) acetamida]; documento FR 2.678.269 [derivados de
1-(4-clorofenil)-2-(1-piperidinil)-etanol];
documento EP 524.846 [derivados de
2-(1-piperidinil)-2-(6-(3,4-quinolin-2-(1H)-ona))-etanol),
documento FR 2.669.926 (derivados de fenilurea); documentos US
5.128.338 y EP 446.141 [derivados de
imidazol(1,2-c)quinazolina], documento
US 5.026.711 (derivados de amino-quinolina
4-sustituido o del ácido
naftiridin-3-carboxílico);
documentos US 4.808.599 y EP 248.734 (derivados de benzotifeno o
benzofuran carboxamida) y documento EP 210-084
(derivados de amida o carbamato de (iso)quinolina y
quinazolina).
El uso de éstos y de ligandos nativos o
sintéticos similares conocidos o descubiertos en lo sucesivo, está
específicamente dentro del alcance de la presente invención. Los
ligandos preferidos muestran alta selectividad por el PTBR, en
relación con los receptores de benzodiazepina presentes en el
cerebro (CBR) o GABA. En experimentos de unión competitiva, la
diferente en la afinidad de unión preferiblemente es de al menos 10
veces, más preferiblemente al menos de 100 veces, lo más
preferiblemente al menos de 1000 veces.
Los ligandos PTBR incluyen agonistas y
antagonistas de PTBR. Los agonistas representativos de PTBR incluyen
benzodiazepinas, por ejemplo, Ro5-4864 y sus
derivados, mientras que los antagonistas de PTBR representativos
incluyen isoquinolina carboxamidas, por ejemplo, PK 11195 y PK
14105 y derivados.
La primera etapa en la identificación de nuevos
ligandos de PTBR (agonistas o antagonistas) es el análisis in
vitro para identificar compuestos que se unen selectivamente a
los receptores de tipo periférico. La unión al receptor puede
ensayarse usando receptores de tipo periférico o derivados del
cerebro aislados a partir de sus respectivas fuentes naturales, o
producidos por tecnología de ADN recombinante y/o por síntesis
química. La afinidad de unión de los compuestos candidatos puede
ensayarse por unión directa (véase por ejemplo Schoemaker y col.,
J. Pharmacol. Exp. Ther., 285:61-69
[1983]) o indirecta, por ejemplo, unión competitiva. En
experimentos de unión competitiva, la concentración de un compuesto
necesaria para desplazar el 50% de cualquier otro compuesto unido al
receptor (CI_{50}) normalmente se usa como medida de afinidad de
unión. El otro ligando puede ser cualquier compuesto del que se
conoce que se une a PTBR con alta afinidad y selectividad, por
ejemplo, PK 11195 o Ro5-4864.
En una realización específica, para identificar
ligandos nuevos, el ADN que codifica la secuencia de longitud
completa del receptor de benzodiazepina de tipo periférico humano
(GenBank M36035) se clona en un vector de expresión que contiene un
marcador seleccionable. El vector se usa para transfectar células
hospedadoras recombinantes, por ejemplo, células de mamífero, por
ejemplo, la línea celular de riñón embrionario humano
HEK-293. Tras varios ciclos de selección, se
identifican por transferencia de tipo Western líneas estables que
expresan PTBR usando inmunoreactividad hacia un epítope marcado que
se introduce por ingeniería genética en el gen PTBR. Se preparan
fracciones de membrana a partir de las líneas celulares que
expresan en masa de forma estable y se conservaron congeladas para
la selección por HTP. La autentificación de las fracciones de
membranas que contiene PTBR se consigue reproduciendo los
coeficientes de unión de ligandos conocidos marcados
radiactivamente (tales como
[^{3}H]Ro5-4864). La selección de nuevos
ligandos se realiza en virtud de su capacidad para competir de forma
eficaz con [^{3}H]Ro5-4864 en ensayos de
competición. Los coeficientes de unión pueden determinarse de
cualquier manera conocida, por ejemplo, por análisis de
Scatchard.
También podría ser necesario distinguir entre
agonistas y antagonistas de PTBR. Esto puedo hacerse en
experimentos in vitro o in vivo, siguiendo la
respuesta de una célula tras la unión del ligando al receptor. Un
agonista producirá una respuesta celular, que dará lugar a una
actividad aumentada o nueva o a la inhibición de una actividad que
ya tenía lugar en la célula. Por el contrario, un antagonista no
tendrá efecto en la respuesta celular, sino que más bien tendrá el
efecto de prevenir la unión de agonistas a los mismos sitios
receptores. Puede ser deseable la selección de antagonistas de modo
que la lectura sea funcional para encontrar moléculas que activan
el receptor sin afectar al sitio(s) de unión del
ligando(s) nativo(s). Los antagonistas pueden
seleccionarse de modo similar.
Por ejemplo, los siguientes procedimientos son
adecuados para identificar antagonistas y agonistas de PTBR que son
útiles en los procedimientos de la presente invención:
1. La proliferación de células epiteliales renal,
fibroblastos o de músculo liso derivadas a partir de riñón normal o
riñón poliquístico de mamífero (incluyendo humano).
2. La regulación de apoptosis inducida en células
epiteliales renales o fibroblastos derivados de riñón normal o
riñón poliquístico de mamífero (incluyendo humano).
3. Seguir la formación in vitro de quistes
por células derivadas de mamíferos humanos o no humanos con
enfermedad poliquística del riñón.
4. La expresión de un fenotipo que indica la
pérdida de diferenciación de las células epiteliales renales.
5. Alteraciones en la conductancia iónica o en
los fenómenos eléctricos dependientes de la conductancia iónica en
las células epiteliales renales o de células intersticiales a
partir de riñón normal o riñón poliquístico.
6. Modulación en la secreción de las células
renales o circulantes de factores proteicos, lipídicos o de
carbohidratos asociados con la expresión o progresión de la
enfermedad poliquística del riñón, incluyendo citoquinas y factores
lipídicos producidos en los quistes o alrededor de ellos.
Los antagonistas de PTBR de la presente invención
no se limitan a ligandos de PTBR. Otros antagonistas de PTBR
incluyen (1) variantes de un PTBR nativo que retiene la capacidad
para unir un ligando endógeno de PTBR pero es deficiente en su
capacidad para mediar una respuesta biológica, (2) receptores
solubles, (3) anticuerpos que unen de forma específica un ligando
endógeno de PTBR en o cerca de su sitio de unión al receptor de
modo que bloquean la unión del ligando a su receptor nativo y (4)
inhibidores selectivos de la producción in vivo de un ligando
endógeno de PTBR, tales como reguladores transcripcionales de la
expresión de un ligando endógeno PTBR in vivo. Otro
antagonista preferido de PTBR es una molécula bioorgánica,
normalmente un compuesto activo por vía oral que se basa en
estudios de modelado sintético y/o molecular, que es capaz de
prevenir la interacción entre un receptor nativo de PTBR y su
ligando endógeno. Pueden identificarse estos antagonistas de PTBR
usando el mismo tipo de ensayos que los discutidos
anteriormente.
Los antagonistas y agonistas de PTBR de la
presente invención pueden ser pequeñas moléculas, por ejemplo,
compuestos orgánicos o péptidos que puede sintetizarse por técnicas
conocidas de síntesis química. Algunos antagonistas o agonistas de
PTBR serán polipéptidos, por ejemplo, ligandos de PTBR de secuencia
nativa, o fragmentos, variantes o derivados de los mismos, y pueden
producirse por tecnología de ADN recombinante, síntesis química o
una combinación de estas técnicas o técnicas similares. Algunos
agonistas o antagonistas de PTBR están disponibles en el mercado,
por ejemplo en Hoffmann-La Roche AG (Nutley, NJ) y
Synthelabo (Francia).
Los ligandos de PTBR, agonistas o antagonistas,
de la presente invención también pueden ser anticuerpos agonistas o
antagonistas de un PTBR. Los procedimientos de preparación de
anticuerpos monoclonales son conocidos en la técnica. Pueden
obtenerse anticuerpos policlonales en un mamífero, por ejemplo, con
una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un
adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o el adyuvante se
inyectarán en el mamífero por inyecciones múltiples subcutáneas o
intraperitoneales. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con
una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero que está
siendo inmunizado, tales como albúmina sérica o inhibidor de
tripsina de soja. Los ejemplos de adyuvantes que pueden emplearse
incluyen adyuvante completo de Freund y MPL-TDM.
De acuerdo con este enfoque, pueden prepararse
anticuerpos monoclonales usando procedimientos de obtención de
hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein,
Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de
obtención de hibridoma, un ratón, un hámster u otro animal
hospedador apropiado, típicamente se inmunizan con un agente
inmunizante para permitir que los linfocitos produzcan o sean
capaces de producir anticuerpos que se unirán de forma específica
al agente inmunizante. De forma alternativa, los linfocitos pueden
inmunizarse in vitro. Generalmente, si se desean células de
origen humano se usan linfocitos de sangre periférica ("PBL") o
si se desean fuentes de mamíferos no humanos se usan células
esplénicas o de nódulo linfático. Después, los linfocitos se
fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de
fusión adecuado, tal como polietilénglicol, para formar una célula
de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice, Academia Press, (1986) pág. 59-103].
Las líneas celulares inmortalizadas normalmente son células de
mamífero inmortalizadas, especialmente células de mieloma de origen
roedor, bovino y humano. Las células de hibridoma pueden cultivarse
en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o
más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las
células inmortalizadas no fusionadas. Las líneas celulares
inmortalizadas preferidas son las que se fusionan de forma eficaz,
mantiene la expresión estable de anticuerpo a alto nivel por parte
de las células productoras de anticuerpo seleccionadas y son
sensibles a medios tales como medio HAT.
Después, puede evaluarse la presencia de
anticuerpos monoclonales en el medio de cultivo en el que se
cultivan las células del hibridoma dirigidos contra el PTBR usado
en particular. Preferiblemente, la especificidad de unión de
anticuerpos monoclonales producidos por las células del hibridoma
se determina por inmunoprecipitación y por un ensayo de unión in
vitro, tales como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de
inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA). Estas técnicas y ensayos
son conocidos en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo
monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis de
Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem.,
107:220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma
deseadas, los clones puede subclonarse por procedimientos de
dilución límite y cultivarse por procedimientos convencionales
[Goding, supra]. Los medios de cultivo adecuados para este
fin incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y
medio RPMI-1640. De forma alternativa, las células
de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un
mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de
cultivo o del líquido ascítico por procedimientos convencionales de
purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína
A-Sepharosa, cromatografía en hidroxilapatita,
electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
De forma alternativa, los anticuerpos
monoclonales pueden hacerse por procedimientos de ADN recombinante,
tales como los descritos en la Patente de EE. UU. Nº 4.816.567. El
ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede
aislarse fácilmente y secuenciarse usando procedimientos
convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas
capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas
pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de hibridomas
analizadas anteriormente sirven como fuente preferida de este ADN.
Una vez aislado, el ADN puede situarse en vectores de expresión,
que después se transfectan en células hospedadoras tales como
células CSO, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de
mieloma que de otra forma no producen proteína de la
inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos
monoclonales en las células hospedadoras recombinante.
Pueden humanizarse los anticuerpos, incluyendo
fragmentos de anticuerpo, tales como Fv, Fab, Fab',
(F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos de unión
al antígeno. Los anticuerpos humanizados contienen una secuencia
mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Más
específicamente, los restos de anticuerpos humanizados de una
región determinante de complementariedad (CDR) de una
inmunoglobulina humana (el receptor) se sustituyen por restos de un
CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tales como ratón,
rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad
deseada. En algunos casos, también se sustituyen restos de regiones
estructurales de F_{V} de la inmunoglobulina humana por restos no
humanos correspondientes. Adicionalmente, los anticuerpos
humanizados pueden comprender restos que no se encuentran ni en el
anticuerpo receptor ni en las secuencias del CDR o de la región
estructural importadas [Jones y col., Nature,
321:522-525 (1986); Riechmann y col.,
Nature, 332:323-329 (1988)].
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un
anticuerpo humanizado tiene introducido en él uno o más restos de
una fuente no humana. Esos restos de aminoácidos no humanos a
menudo se denominan como restos "importados", que típicamente
se toman a partir de un dominio variable "importado". La
humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el
procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y col.,
Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann
y col., Nature, 332:323-327 (1988);
Verhoeyen y col., Science,
239:1534-1536 (1988)], sustituyendo CDR o
secuencias de CDR de roedores en las secuencias correspondientes de
un anticuerpo humano. Además, pueden producirse anticuerpos humanos
usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo
bibliotecas de expresión en fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol.
Biol., 227:381 (1991); Marks y col. J. Mol. Biol.,
222;581 (1991)]. Las técnicas de Cole y col., y de Boerner y
col. también están disponibles para la preparación de anticuerpos
monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) y Boerner y col.,
J. Immunol., 147(1):86-95
(1991)]. De forma similar, pueden hacerse anticuerpos humanos
introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales
transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de
inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente.
Tras la inmunización, se observa la producción de anticuerpo que
recuerda mucho en todos los sentidos a los vistos en humanos,
incluyendo reordenamiento génico, ensamblaje y repertorio de
anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes
de EE. UU. Nº 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425
y 5.661.016, y las siguientes publicaciones científicas: Marks y
col., Bio/Technology 10, 779-783
(1992); Lonberg y col., Nature 368:
856-859 (1994); Morrison, Nature 368,
812-13 (1994); Fishwild y col., Nature
Biotechnology 14, 845-51 (1996);
Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996);
Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13,
65-93 (1995).
Los anticuerpos pueden ser biespecíficos, en los
que una especificidad es para un PTBR y la otra especificidad para
otra proteína, tal como, un segundo PTBR diferente, un epítope
diferente del mismo PTBR o un ligando de PTBR.
Los agonistas y antagonistas de PTBR (ligandos y
otros) pueden administrarse a un paciente en dosis terapéuticamente
eficaces para tratar (incluyendo prevención) una enfermedad
quística específica, por ejemplo, enfermedad poliquística del
riñón. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad
de un compuesto suficiente para dar lugar al tratamiento
deseado.
La toxicidad y eficacia terapéutica de estos
compuestos puede determinarse por procedimientos farmacéuticos
convencionales en cultivos celulares o en animales de
experimentación, por ejemplo, determinando la DL_{50} (la dosis
letal para el 50% de la población) y la DE_{50}(la dosis
terapéutica eficaz en el 50% de la población). La proporción de
dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice
terapéutico y puede expresarse como la proporción
DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren los compuestos que muestran
índices terapéuticos mayores. Aunque pueden usarse compuestos que
muestran efectos tóxicos secundarios, debe tenerse cuidado al
diseñar un sistema de suministro que dirija estos compuestos al
sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial en las
células no afectadas y, por tanto, reducir los efectos
secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo
celular y de estudios en animales pueden usarse para formular un
intervalo de dosificaciones para su uso en humanos. Las
dosificaciones de estos compuestos se encuentran preferiblemente en
un intervalo de concentraciones en circulación que incluye la
DE_{50} de menor o ninguna toxicidad. La dosificación puede
variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de
dosificación empleada y de la ruta de administración utilizada. Para
cualquier compuesto usado en el procedimiento de la invención, la
dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir
de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos
animales para alcanzar un intervalo de concentración plasmático que
incluye la CI_{50} (es decir, la concentración del compuesto de
ensayo que alcanza una inhibición de la mitad del máximo de los
síntomas) según se determina en cultivo celular. Esta información
puede usarse para determinar con exactitud las dosis útiles en
humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por
cromatografía líquida de alta resolución. Una dosis diaria típica
de un agonista o antagonista de PTBR de la presente invención podría
oscilar de aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg
de peso del cuerpo del paciente o más por día, dependiendo de los
factores mencionados anteriormente, preferiblemente de
aproximadamente 10 \mug/kg/día a 10 mg/kg/día.
Las composiciones farmacéuticas para su uso de
acuerdo con la presente invención pueden formularse de manera
convencional usando uno o más vehículos o excipientes
fisiológicamente aceptables. De este modo, los compuestos y sus
sales y solvatos fisiológicamente aceptables pueden formularse para
la administración por inhalación o insuflación (a través de la boca
o de la nariz) o por administración oral, bucal, parenteral o
rectal.
Para la administración oral, las composiciones
farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o
cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes
farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por
ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o
hidroxipropril metilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa,
celulosa microcristalina, hidrógeno fosfato de calcio); lubricantes
(por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes
(por ejemplo, almidón de patata o almidón glicolato sódico); o
agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sódico). Los
comprimidos pueden recubrirse por procedimientos bien conocidos en
la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral
pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o
suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su
reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso.
Estas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios
convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como
agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de
celulosa o grasas comestibles deshidrogenadas); agentes
emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábica); vehículos no
acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos,
alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados) y conservantes
(por ejemplo, metil o
propil-p-hidroxibenzoatos o ácido
sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales
tamponadoras, agentes colorantes y edulcorantes según sea
apropiado.
Las preparaciones para administración oral pueden
formularse de forma adecuada para proporcionar la liberación
controlada del compuesto activo. Para la administración bucal, las
composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas
formuladas de manera convencional.
Para la administración por inhalación, los
compuestos para su uso de acuerdo con la presente invención se
suministran de forma conveniente en forma de una presentación de
pulverizador aerosol a partir de paquetes a presión o un
nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo,
diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En
el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede
determinarse proporcionando una válvula para suministrar una
cantidad medida. Las cápsulas y los cartuchos de, por ejemplo,
gelatina para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse
para que contenga una mezcla del compuesto en polvo y una base de
polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.
Los compuestos pueden formularse para la
administración parenteral por inyección, por ejemplo por inyección
en bolo o infusión continua. Las formulaciones por inyección pueden
presentarse en forma de unidad de dosificación, por ejemplo, en
ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido.
Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones,
soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden
contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión,
estabilizantes o dispersantes. De forma alternativa, el ingrediente
activo puede estar en forma de polvo para reconstitución con un
vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos,
antes de su uso. Los compuestos también pueden formularse en
composiciones rectales tales como supositorios o enemas de
retención, por ejemplo, que contienen base de supositorio
convencional tales como mantequilla de cacao u otros
glicéridos.
Además de las formulaciones descritas
previamente, los compuestos también pueden formularse como una
preparación de depósito. Estas formulaciones que actúan a largo
plazo pueden administrarse por implantación (por ejemplo, de forma
subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. De este
modo, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales
poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como una emulsión
en un aceite adecuado) o resinas de intercambio iónico o como
derivados ligeramente solubles, por ejemplo, como una sal
ligeramente soluble.
Las composiciones pueden, si se desea,
presentarse en un paquete o dispositivo distribuidor que pueden
contener una o más formas de unidad de dosificación conteniendo el
ingrediente activo. Por ejemplo, el paquete puede contener una hoja
de metal o de plástico, tal como un envase blister. El paquete o
dispositivo distribuidor pueden estar acompañados de instrucciones
para la administración.
Si un agonista o antagonista se administra
conjuntamente con otro agonista o antagonista, o con otro agente que
tiene similar actividad biológica, los diferentes ingredientes
activos pueden formularse conjuntamente en un vehículo transportador
apropiado para formar una composición farmacéutica. Los agonistas
de PTBR de la presente invención pueden, por ejemplo, combinarse o
administrarse conjuntamente de cualquier manera con otros agentes
terapéuticos usados en el tratamiento de la enfermedad diana, por
ejemplo, enfermedad poliquística del riñón, incluyendo taxol y
derivados de taxol, TNF-\alpha,
anti-hipertensivos, incluyendo inhibidores ACE,
factores proteicos dirigidos a terapia o sus receptores, etc.
Las enfermedades quísticas, por ejemplo, la
enfermedad poliquística del riñón, pueden tratarse de acuerdo con
la presente invención también mediante terapias de base génica,
usando transferencia ex vivo o in vivo de un gen que
codifica un polipéptido ligando de PTBR u otro polipéptido agonista
o antagonista de PTBR. En la forma ex vivo de administración
génica, las células derivadas del paciente o de otras fuentes,
primero se modifican fuera del cuerpo introduciendo un gene o genes
en particular. Después, estas células modificadas se reintroducen
en el cuerpo del paciente, alcanzando así distribución local,
regional o generalizada.
Hay una diversidad de técnicas disponibles para
introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían
dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células
cultivadas in vitro, o in vivo en las células del
hospedador deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de
ácido nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el
uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular,
DEAE-dextrano, procedimiento de precipitación con
fosfato cálcico, etc. Las técnicas de transfección in vivo
actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales
(típicamente retrovirales) y transfección mediada por proteína de la
cubierta viral-liposoma (Dzau y col., Trends in
Biotechnology 11:205-210 (1993)). En
algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido
nucleico con un agente que se dirija a las células diana, tal como
un anticuerpo específico para una proteína de membrana de la
superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor
de la célula diana, etc. Cuando se emplean liposomas, pueden usarse
como diana y/o para facilitar la captación, proteínas que se unen a
una proteína de la superficie celular asociada con endocitosis, por
ejemplo, proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas
trópicos para un tipo de célula en particular, anticuerpos para
proteínas que experimentan internalización durante el ciclo celular
y proteínas que se dirigen a una localización intracelular y
potencian la vida media intracelular. La técnica de endocitosis
mediada por receptor se describe, por ejemplo, en Wu y col., J.
Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987) y
Wagner y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:3410-3414 (1990). Para revisión de
marcadores génicos conocidos actualmente y protocolos de terapia
génica véase Anderson y col., Science
256:808-813 (1992).
Las tecnologías más avanzadas para el uso de
ácidos nucleicos en el transcurso de terapia génica usan sistemas
retrovirales para suministrar genes en la célula (Wilson y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 439-443
(1990) y Kasid y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,
473-477 (1990).
La transferencia génica eficaz en el riñón es
relativamente difícil, especialmente puesto que el rizón es un
órgano estructuralmente complejo que tiene un índice mitótico
relativamente bajo. Además, la organización arquitectónica del
riñón es crítica para la función propia del órgano. Por
consiguiente, el suministro génico eficaz a un tipo celular en
particular dentro del riñón es relativamente difícil de alcanzar. Un
procedimiento específico para transferir genes en el riñón se
describe, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. Nº 5.869.230
expedida el 9 de febrero de 1999. De acuerdo con este enfoque, se
introduce un vector que lleva el material genético de interés en la
vasculatura del riñón en condiciones que permiten la infección del
riñón pero que protege a éste de daño isquémico, por ejemplo,
manteniendo el riñón a baja temperatura (por ejemplo, en hielo)
durante la incubación con el vector de transferencia génica.
Los ejemplos siguientes ilustran, pero no
limitan, la invención. Todas las referencias citadas a lo largo de
la memoria descriptiva, incluyendo los ejemplos, se incorporan
expresamente en este documento por referencia.
El perfil de expresión de genes representativos
se valoró en tejidos normales y tejidos obtenidos de sujetos que
sufren una enfermedad, especialmente enfermedad cardiaca, renal o
inflamatoria. La identificación de los genes expresados de forma
diferencial implicaba las siguientes etapas: (1) construcción de
bibliotecas de ADNc normalizado o substraído a partir del ARNm
extraído de las células o tejidos de animales sanos y de un modelo
animal de la enfermedad; (2) purificación de ADN; (3) obtener una
micromatriz de ADN para el análisis de expresión y (4) incubar la
micromatriz de ADN con una sonda para identificar los genes de los
clones que se expresan de forma diferencial usando ADNc marcado a
partir de células o tejidos sanos o enfermos.
Como modelo in vivo de enfermedad renal,
se usó un modelo de rata de una forma hereditaria de enfermedad
poliquística autosómica dominante del riñón (ADPKD), basado en la
observación de que ADPKD se desarrolla en ratas Han:SPRD
(Kaspareit-Rittinghaus y col., Transplant
Proc. 6:2582-3 (1990); Cowley y col., Kidney
Int. 43:522-34 (1993)). Los quistes renales y la
insuficiencia renal eran evidentes en ratas macho heterocigotos de
seis meses de edad (Cy/+), mientras que las ratas control (+/+) no
mostraban signos de quistes o de insuficiencia renal. Se
sacrificaron cinco animales enfermos (Cy/+) y uno normal (+/+) y se
retiraron los riñones.
El ARNm poli A+ se aisló a partir de los riñones
de animales normales y enfermos, siguiendo las técnicas conocidas
en la técnica, tal como las descritas por Ausubel y col, eds.,
Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley e hijos
(Nueva York, NY 1993). Usando técnicas bien conocidas en la técnica
pueden procesarse grandes números de muestras de tejidos, tal como,
por ejemplo, el procedimiento de aislamiento de ARN en una única
etapa de Chomczynski (Patente de EE. UU. Nº 4.843.155) que
expresamente se incorpora a este documento como referencia en su
totalidad. Los procedimientos para hacer bibliotecas de ADNc
normalizado también son bien conocidos en la técnica, véase por
ejemplo, Soares y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91(20): 9228-32 (1994) y Bonaldo y col.,
Genome Res. 6(9): 791-806 (1996). Siguiendo
el procedimiento de Bonaldo y col., supra, se genera una
versión normalizada de biblioteca de ADNc de tejido normal y
enfermo. En particular, se purificó ARN poli A+ a partir de
muestras de tejido normal y enfermo proporcionadas por el modelo
in vivo de enfermedad renal descrito anteriormente. En primer
lugar, se generó una biblioteca de ADNc clonado direccionalmente
por procedimientos convencionales. Brevemente, se generó un ADNc de
doble cadena cebando la síntesis de la primera cadena por
transcripción inversa usando cebadores oligo dT que contenían un
sitio de restricción Not I. Tras la síntesis de la segunda cadena,
se añadieron adaptadores Xba I al extremo 5' del ADNc, se
seleccionaron los ADNc > 500 pb y se ligaron en los sitios de
restricción correspondientes del vector de fago pCR21 (Invitrogen,
San Diego, CA).
A partir de la biblioteca de ADNc total, se
generó una biblioteca normalizada como se detalla a lo largo del
texto (Bonaldo y col., supra) y se describe aquí brevemente.
El vector de fago pCR2.1 contiene un origen de replicación F1. De
este modo, la biblioteca de ADNc puede propagarse como un fago de
cadena sencilla con un virus auxiliar apropiado. El ADN circular de
cadena sencilla se extrajo de la biblioteca del fago y sirvió como
ADN "de muestra" para la etapa de hibridación de la
normalización. El otro componente de la hibridación, el ADN
"conductor", se generó a partir de la biblioteca mediante
amplificación por PCR usando un conjunto específico de cebadores
para la región del vector que flanquean las inserciones clonadas.
El ADN de muestra purificado (50 ng) y el ADN conductor (0,5
\mug) se combinaron en NaCl 120 mM, formamida al 50%, Tris 10 mM
(pH 8,0), EDTA 5 mM y SDS al 1%. En la reacción de hibridación se
incluyeron un par de oligonucleótidos (10 \mug de cada uno),
correspondientes con una secuencia polienlazadora (la misma cadena
que la del ADN de muestra) que está presente en el producto de PCR,
para bloquear la hibridación de secuencias específicas del vector
comunes entre el ADN de muestra y el conductor.
La mezcla de reacción, en aceite, se calentó 3
min a 80ºC y la hibridación se realizó a 30ºC durante 24 h
(C_{o}t calculada ''5). Los círculos de cadena sencilla se
purificaron a partir de la mezcla de reacción por cromatografía en
hidroxilapatita (HAP), se convirtió en ADN de doble cadena y se
electroporó en bacterias para producir una biblioteca de ADNc
normalizado representativa de los genes expresados en el ventrículo
izquierdo de la rata. Para evaluar la eficacia del protocolo de
normalización, se valoró la frecuencia de unos cuantos clones (ANP,
BNP, actina y miosina) tanto en la biblioteca de partida como en la
biblioteca normalizada. Se redujo la frecuencia de ADNc abundantes
(actina y miosina) y ésta era aproximadamente equivalente para los
clones de ADNc poco frecuentes (ANP y BNP). La frecuencia de un
clon en las dos bibliotecas se determinó con técnicas de selección
convencionales por inmovilización de colonias en membranas de nailon
e hibridación con sondas de ADN marcadas radiactivamente.
Ciertos genes, no expresados en tejido normal, y
activados en tejidos enfermos, pueden estar ausentes de la
biblioteca de ADNc normalizado generada a partir de tejido normal.
Para obtener clones específicos de enfermedad para incluir en la
micromatriz de ADN, puede repetirse el enfoque de normalización
resumido anteriormente usando tejido enfermo obtenido del modelo de
enfermedad apropiado. Sin embargo, puesto que la mayoría de los
genes se expresan normalmente entre el tejido normal y el tejido
enfermo, la obtención de micromatrices de bibliotecas normalizadas
de tejido enfermo y normal pueden introducir redundancia
significativa. En una realización preferida, se reduce la
redundancia de clones, todavía se obtienen ADNc que se expresan
específicamente, así como sustancialmente elevados, en tejido
enfermo. Para obtener ADNc específico de la enfermedad, puede
hacerse una biblioteca substraída usando protocolos similares a los
usados para generar bibliotecas normalizadas. Se usa una vez más el
procedimiento de Bonaido y col., supra descrito aquí
brevemente
Para hacer una biblioteca extraída, se genera una
biblioteca de ADNc total del tejido obtenido a partir del modelo de
enfermedad. La biblioteca de ADNc se clona direccionalmente en el
vector pCR2.1 y se deriva un ADN de muestra de cadena sencilla como
se ha descrito anteriormente para la normalización de la
biblioteca. El ADN conductor se genera por amplificación por PCR de
las inserciones clonadas a partir de la biblioteca de ADNc total
preparada del riñón normal. La hibridación se da entre secuencias
que son comunes en los riñones normales y enfermeros. Para esta
biblioteca substraía, la reacción se realiza más a fondo (C_{or}
calculada ''27) que para la normalización usando más conductor (1,5
\mug frente a 0,5 \mug) y tiempo de hibridación más largo (48 h
frente a 24 h). La purificación de los círculos de cadena sencilla
que no hibridan por cromatografía en HAP, la conversión en ADN de
doble cadena y la electroporación en bacterias produce una
biblioteca de ADNc substraída enriquecida en genes que se expresan
en riñones de rata enferma.
Se estableció un protocolo en placa de
microvaloración para la amplificación por PCR de ADN y su posterior
purificación, que proporciona ADN de calidad y cantidad aceptable
para la impresión en micromatrices de ADN de uso en una realización
preferida de la presente invención. De forma específica, los
cebadores de PCR se sintetizan para amplificar una inserción de ADN
del vector pCR2.1, que se usaba para la construcción de la
biblioteca. Tras 30 ciclos de amplificación, cada producto de PCR se
pasa a través de una columna de filtración en gel para retirar
cebadores no incorporados y sales. Para mantener la robustez, las
columnas se empaquetan en placas con filtro de 96 pocillos y el
manejo del líquido se realiza de forma automatizada. La producción,
por reacción de PCR, generalmente es de 2-5 \mug,
ADN suficiente para imprimir varios cientos de chips.
Para ensayar la calidad del ADN que se prepara
con este procedimiento de PCR; se produjo una micromatriz de ADN con
las 96 muestras purificadas de una única placa de microvaloración.
Usando un robot procesador de líquido (Biomek 2000, Beckman), se
tomaron alícuotas de 85 \mul de la mezcla de reacción de PCR de
cada pocillo de una placa de 96 pocillos de 0,2 ml de pared
delgada. La mezcla de reacción contenía 0,2 mM de cada dNTP, 1,25
unidades de Taq polimerasa y tampón Taq 1x (Boehringer Mannheim).
Los cebadores, 1 \mum de cada uno, son de regiones del vector que
flanquean el sito de clonación de pCR2.1 e incluyen una amina
primaria 5' con un enlace de carbono 6 para facilitar la unión del
producto de ADN a la superficie vítrea de la micromatriz. Se añadió
a cada polillo 1,0 \mul de cultivo bacteriano de clones de ADNc
individual. Las condiciones de PCR son: 2 min, 95ºC para
desnaturalizar, después 30 ciclos de 95ºC, 30 seg/65ºC, 40 seg/72ºC,
1 min, 30 seg y una extensión final de 72ºC, 5 min, usando un
termociclator PTC 100 de MJResearch.
Los productos de PCR se purificaron por
filtración en gel sobre Sephacryl 400 (Sigma). Brevemente, se
cargaron 400 \mul de Sephacryl 400 prehinchado en cada pocillo de
una placa de filtro de 96 pocillos (PallBiosupport) y se
centrifugaron en un platillo a 800g durante 1 min. Los pocillos se
lavaron 5 veces con SSC 0,2x. Las mezclas de reacción de PCR se
cargaron en la columna y el ADN purificado (flujo a través) se
recogió a 800g durante 1 min. Las muestras se secaron a 50ºC
durante la noche y se colocaron en la micromatriz de ADN.
Se sintetizaron un par de sondas fluorescentes
por transcripción inversa de ARN poli A+ usando,
independientemente, Cy3 dCTP y Cy5 dCTP (Amersham). En 16,5 \mul,
se desnatularizaron a 65ºC, 5 min, 1 \mug de ARN poli A+ y 2
\mug de oligo dT 21 mer, y se hibridaron a 25ºC, 10 min. La
transcripción inversa se realizó durante 2 horas a 37ºC con
Superscript RT (Life Technologies, Gaithersburg, MD) en tampón 1x,
10 unidades de ribonucleasa de bloqueo, dATP/dGTP/dTTP 500 \muM de
cada uno, dCTP 280 \muM, Cy5 o Cy3 dCTP 40 \muM, y 200 unidades
de RT. El ARN se degrada en NaOH 0,1 M, 65ºC durante 10 min. El
ADNc marcado se purificó por filtración sucesiva con columnas
Chroma Spin a 30 revoluciones (Clontech) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Las muestras se desecaron a
temperatura ambiente en la oscuridad usando un
Speed-Vac cubierto. Se aplicaron sondas de
hibridación al chip de ensayo y se recogieron los datos
esencialmente como se describe en Schena y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93(20):106-49 (1996). La
intensidad de la señal de hibridación de cada elemento reflejaba el
nivel de expresión del ARNm de cada gen en el ventrículo de rata.
Se almacenan los datos digitalizados y se preparan para análisis. Se
incluyen una serie de elementos de ADN de control en cada chip para
asegurar la consistencia del marcaje y de la hibridación entre
experimentos y para ayudar compensar la señal cuando se usan dos
canales de fluorescencia. Para cada elemento hibridado con sondas
marcadas dobles, se determinó la intensidad de señal absoluta y
relativa. Los resultados de estos y otros experimentos indican que
estos procedimientos para la producción de ADN molde y de sondas de
ADNc marcados son adecuados para generar micromatrices de ADN de
alta calidad dentro de una realización preferida de los
procedimientos de la presente invención. La evaluación de la
expresión de cientos de miles de genes genera una gran cantidad de
datos que pueden manejarse por medio de paquetes de programas
informáticos disponibles en el mercado que facilitan el manejo de
este tipo y cantidad de datos. Los datos de expresión pueden
almacenarse, analizarse y clasificarse a partir de cada experimento
usando estos programas. Además, la expresión de cada clon puede
seguirse de un experimento a otro usando metodologías
conocidas.
Como se ha descrito en detalle anteriormente, se
aplicaron sondas a las micromatrices de ADN para hibridación y los
datos se recogieron básicamente como se describe en Schena y col.,
supra. La intensidad de la señal de hibridación de cada
elemento reflejaba el nivel de expresión del ARNm para cada gen.
Para cada elemento hibridado con sondas marcadas dobles, se
determina la intensidad de señal absoluta y relativa, que se traduce
en los niveles de presión de los genes del sujeto. Los datos
numéricos generados reflejan el nivel de expresión relativo del gen
en la patología en comparación con el nivel de expresión del gen en
estado normal o no patológico, en el modelo de enfermedad PKD cinco
diseñado anteriormente y como determina el análisis por micromatriz.
Los datos se presentan como valores de expresión diferencial con
números positivos indicativos de los genes expresados a niveles
mayores en el tejido enfermo en relación con el tejido normal, y
valores negativos indicativos de expresión menor en la enfermedad.
Mientras que en general los datos de las micromatrices de ADN son
los valores medios de experimentos múltiples realizados con matrices
de ADN separadas, en el caso presente se realizó un experimento y
se obtuvo el ARN de un animal (n-1).
En una realización preferida, los clones que
tienen una reproducibilidad, valorada en análisis de micromatrices
de ADN, elevada o disminuida aproximadamente en al menos dos veces,
se pusieron en micromatrices de ADN en chips secundarios separados y
se determinaron sus niveles de expresión. Se entiende, sin embargo,
que también son interesantes los genes expresados de forma
diferencial que muestran un cambio en la expresión de menos de
aproximadamente dos veces, por ejemplo, menos de una, media o un
cuarto, o un cambio en la expresión mayor de aproximadamente dos
veces, por ejemplo, mayor de tres, cinco, diez, cien o mil
veces.
Usando ADNc obtenido a partir del modelo de
enfermedad renal in vivo, se construyeron micromatrices de
ADN y se incubaron con una sonda como se ha descrito anteriormente.
Se ha encontrado que un gen, originalmente denominado clon de ID
Nº: P0242_B03 e identificado posteriormente como el equivalente en
rata del gen del receptor de la benzodiazepina del tipo periférico
humano (PTBR), se sobreexpresa con un factor de 2 en el modelo de
rata de enfermedad poliquística del riñón (PKD) descrito
anteriormente, en comparación con el tejido de riñón normal.
Adicionalmente, se encontró que el gen de un ligando nativo de
PTBR, DBI se subexpresa con un factor de -1,9 en tejido de riñón
enfermo, en comparación con el tejido normal.
Los clones expresados de forma diferencial
obtenidos del análisis de la micromatriz de ADN obtenido del modelo
de enfermedad descrito anteriormente, se secuenciaron y se comparó
la coincidencia con genes humanos conocidos de bases de datos de
secuencias génicas humanas conocidas. La figura 1 muestra los datos
de alineamiento comparando la secuencia de nucleótidos del ADNc que
codifica el gen P0268 de rata expresado de forma diferencial con la
secuencia del ADNc humano correspondiente con PTBR (SEC ID Nº: 1 y
2). La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de PTBR humano
(SEC ID Nº: 3). La figura 3 muestra los datos de alineamiento
comparando la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la
proteína DBI de rata expresada de forma diferencial (ligando PTBR
nativo) con la secuencia del ADNc humano correspondiente a DBI (SEC
ID Nº: 4 y 5). La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos de
DBI humana.
En este experimento, se examinó el efecto de
concentraciones de 10^{-12} a 10^{-6} M del agonista de PTBR
conocido Ro5-4864 sobre el índice de proliferación
de células de la enfermedad poliquística autosómica dominante del
riñón (ADPKD).
Se cultivaron células epiteliales de riñones
ADPKD humanos de las cúpulas de los quistes y se mantuvieron en
cultivo primario durante varios pases. Estas células muestran
varias propiedades fenotípicas de quistes intactos, incluyendo la
orientación epitelial, la secreción de fluido en respuesta a
estimulación con AMPc y de proliferación celular y se han usado
para estudios de mecanismos celulares de secreción de fluidos y
proliferación celular.
El índice de proliferación celular se determinó
usando el procedimiento de Ensayo MTT 96 de valoración celular de
Promega. Este ensayo es una modificación del descrito por Mosmann
T, 1983 J. Immunol. Meth. 65, 55. Se encontró que este
procedimiento, que mide la densidad óptica (D.O.) de un producto de
reacción dependiente de proliferación (MTT), se correlacionaba
directamente con determinaciones directas del número de células
usando la técnica del hematocitómetro clásico. La relación entre el
número de células y la D.O. fue lineal y r^{2} era > 0,98.
Para determinar el efecto de agonistas en el índice de
proliferación, se pusieron aproximadamente 4000 células en cámaras
individuales de una placa de 96 pocillos. Las células se incubaron
inicialmente en medio DME/F12 suplementado sólo con penicilina,
estreptomicina, ITS y FBS al 1%. Después de 24 horas, se redujo el
FBS al 0,002% (ITS suprimido) para detener el crecimiento. Esta
pequeña cantidad de suero era necesaria para potenciar la unión de
la célula a la superficie del plástico. Después, se cultivaron las
células ADPKD humanas durante 48 horas tras la adición de AMPc (un
estimulador de la proliferación celular) a una concentración de 100
\muM. También se examinaron un grupo control y un grupo con
forskolin. Estudios preliminares determinaron que se mantenía el
crecimiento durante todo este intervalo completo.
Después de esto, se examinó el efecto de un
intervalo de concentraciones de 10^{-12} a 10^{-6}M del
agonista de PTBR conocido Po5-4864 sobre el índice
de proliferación de células PTBR tratadas previamente con AMPc o no
tratadas (línea de referencia de proliferación). Los resultados se
ilustran de forma gráfica en la figura 6. Cada conjunto de datos
mostrado en la figura 6 es la media y se obtiene a partir de seis
determinaciones. Por lo tanto, los resultados son, desde un punto de
vista estadístico, altamente significativos.
Los datos demuestran que para todas las
concentraciones examinadas, Ro5-4864 actuaba como un
potente inhibidor de la proliferación celular, que bloqueaba tanto
la proliferación celular basal como la proliferación celular
estimulada por AMPc. La observación visual de las células apoya la
conclusión de que el agonista de PTBR Ro5-4864
actúa deteniendo el crecimiento celular y no matando a las
células.
Claims (23)
1. El uso de un ligando de un receptor de
benzodiazepina de tipo periférico (PTBR) para la preparación de una
composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de una
enfermedad que implica la formación de quistes en un paciente que
tiene o con riesgo de desarrollar dicha enfermedad, en el que el
ligando de PTBR es un compuesto orgánico seleccionado entre el
grupo compuesto por benzodiazepinas, isoquinolina carboxamidas,
imidazopiridinas,
2-aril-3-indolacetamidas
y pirrolobenzoxazepinas.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que la
composición farmacéutica adicionalmente comprende un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que
dicho paciente es un mamífero.
4. El uso de la reivindicación 3, en el que dicho
mamífero es humano.
5. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha enfermedad es la enfermedad
poliquística del riñón (PKD).
6. El uso de la reivindicación 5, en el que dicha
PKD es una enfermedad poliquística autosómica dominante del riñón
(ADPKD).
7. El uso de la reivindicación 5, en el que dicha
PKD es una enfermedad poliquística autosómica recesiva del riñón
(ARPKD).
8. El uso de una cualquiera de la
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho tratamiento es la
prevención o inhibición de la expansión del quiste.
9. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho paciente ha sido
diagnosticado de una mutación asociada con la enfermedad
poliquística del riñón.
10. El uso de la reivindicación 9, en el que
dicha mutación está en el gen PKD1, PKD2 o PKD3.
11. El uso de una cualquiera de la
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho ligando es un agonista de
PTBR.
12. El uso de la reivindicación 11, en el que
dicho agonista de PTBR es Ro5-4864.
13. El uso de la reivindicación 11 ó 12, en el
que dicho agonista retrasa o previene el desarrollo de la
hipertensión.
14. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho ligando es para
administrar en combinación con un agente terapéutico adicional.
15. El uso de la reivindicación 14, en el que
dicho agente terapéutico adicional es un agente que inhibe el
suministro de proteínas de membrana a la membrana de una célula de
dicho paciente.
16. El uso de la reivindicación 15, en el que
dicho agente terapéutico adicional se selecciona entre el grupo
compuesto por taxol, citocalasina-B,
citocalasina-D, faloidina y un derivado de
cualquiera de los anteriores.
17. El uso de la reivindicación 16, en el que
dicho agente terapéutico adicional es
TNF-\alpha.
18. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en el que dicha composición farmacéutica
es para administrar por vía intravenosa, intraperitoneal,
intraarterial, subcutánea, oral o intramuscular.
19. Una composición farmacéutica para el
tratamiento de una enfermedad que implica la formación de quistes,
que comprende una cantidad eficaz de un ligando de un receptor de
benzodiazepina de tipo periférico (PTBR) en el que el ligando de
PTBR es un compuesto orgánico seleccionado entre el grupo compuesto
por benzodiazepinas, isoquinolina carboxamidas, imidazopiridinas,
2-aril-3-indolacetamidas
y pirrolobenzoxazepinas, mezclado con taxol o un derivado de taxol
y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
20. La composición de la reivindicación 19, en la
que dicha enfermedad es una enfermedad poliquística del riñón
(PKD).
21. Un procedimiento de diagnóstico o pronóstico
in vitro para determinar la presencia o actividad de una
enfermedad quística o la susceptibilidad para el desarrollo de una
enfermedad quística, que comprende seguir un cambio en el nivel de
expresión de PTBR o de un ligando endógeno de PTBR.
22. El procedimiento de la reivindicación 21 que
comprende seguir la tasa de expansión del quiste.
23. El procedimiento de la reivindicación 21 ó
22, en el que dicho nivel de expresión de PTBR o de un ligando
endógeno de PTBR se sigue en una muestra de biopsia, una muestra de
sangre o una muestra de orina.
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