ES2246156B1 - Uso de la anfiregulina como un agente protector en el daño hepatico agudo. - Google Patents
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Abstract
Uso de la anfiregulina como un agente protector en el daño hepático agudo. Se describe el uso de anfiregulina en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento del daño hepático agudo, que se administra por ejemplo para potenciar una reacción protectora endógena primaria del tejido hepático frente al daño hepático agudo, para promover la síntesis de DNA en hepatocitos, para prevenir la muerte de hepatocitos en tejido hepático en pacientes con daño hepático agudo, para estimular la regeneración del parénquima hepático remanente tras un daño hepático agudo de cualquier etiología, para estimular la regeneración hepática tras una hepatectomía parcial, como fármaco hepatoprotector en pacientes con daño hepático agudo de cualquier etiología y/o como fármaco hepatoprotector y estimulante de la regeneración hepatocitaria en pacientes receptores de transplante hepático de vivo, o de cadáver.
Description
Uso de la anfiregulina como un agente protector
en el daño hepático agudo.
La presente invención se encuadra dentro del
campo de la biotecnologia aplicada al sector
médico-farmacéutico para el tratamiento de las
enfermedades hepáticas y, en especial, del daño hepático agudo como
por ejemplo del fallo hepático agudo (FHA).
Más específicamente, la presente invención
proporciona un nuevo tratamiento para dicha enfermedad basado en el
uso de la anfiregulina (AR).
El daño hepático agudo es una patología
extremadamente grave que puede expresarse como fallo hepático agudo
(FHA) que se origina como consecuencia de la pérdida de masa
funcional hepática debido a la muerte del hepatocito. El FHA no es
una enfermedad en si mismo, sino un síndrome de severidad
proporcional al grado de pérdida de masa hepatocitaria. Esta es una
situación patológica dramática cuyas complicaciones tienen una
repercusión multiorgánica que incluye encefalopatía, edema
cerebral, sepsis, fallo respiratorio y renal, sangrado intestinal y
colapso cardiovascular [Sanyal, A.J., Stravitz, R.T. The liver.
Capitulo 16. Págs.: 445-496. Zakim y Boyer Eds.
Saunders. Filadelfia. 2003].
A pesar de no ser una afección muy común, da
lugar a una mortalidad comprendida entre el 40% y el 95% de los
casos [Sanyal, A.J., Stravitz, R.T. The liver. Capitulo 16. Págs.:
445-496. Zakim y Boyer Eds. Saunders. Filadelfia.
2003; y Galun, E., Axelrod, J.H. Biochim. Biophys. Acta.
1592:345-358.2002 (identificada como (15) mas
adelante)].
La etiología del FHA es diversa, presentando
variabilidad geográfica, siendo importante su correcta definición a
la hora de emitir un pronóstico y de instaurar un tratamiento.
Entre los agentes causantes de FHA pueden
mencionarse los virus de la hepatitis, ciertos fármacos y toxinas,
determinadas alteraciones metabólicas, algunos casos de isquemia
aguda y la resección masiva del parénquima hepático [Sanyal, A.J.
ibid; Galun, E. ibid].
La resolución con éxito del FHA depende tanto de
la posibilidad de inhibir el daño hepatocelular como de la
regeneración del parénquima dañado. La mayoría de los recursos
terapéuticos disponibles en la clínica actual se dirigen a paliar
las manifestaciones multiorgánicas del FHA, sin embargo no existen
estratégicas terapéuticas capaces de reducir la necrosis y
apoptosis ni de promover la regeneración de los hepatocitos, siendo
finalmente el trasplante hepático la única alternativa posible
[Sanyal, A.J. ibid; Galun, E. íbid] para curación del
paciente.
Se conoce que los mecanismos citoprotectores y
regenerativos se ponen en marcha en el hígado después de la pérdida
de masa de parénquima hepático debida a una hepatectomfa parcial
(HP) o después de una lesión o daño de origen tóxico, viral,
isquémico o inmunológico [(1) Michalopoulos, G.K., DeFrances, M.C.
1997. Liver regeneration. Science 276: 60-66. (2)
Fausto, N. 2000. Liver regeneration. J. Hepatol. 32 (suppl 1):
19-31. (3) Taub, R.A. 2003. Hepatic regeneration. In
The Liver. D. Zakim, J.L. Boyer, editores Saunders, Philadelphia.
U.S.A. 31-48]. Diferentes aproximaciones
experimentales han ayudado a perfilar los mecanismos subyacentes
que contribuyen a preservar la función hepática y a restaurar la
masa hepática funcional después de un daño hepático grave [(4)
Koniaris, L.G., McKillop, I.H., Schwartz, S.I., Zimmers, T.A. 2003.
Liver regeneration. J. Am. Coll. Surg. 197:
634-659]. Esta respuesta compleja está mediada por
una red de citoquinas, comitógenos y factores de crecimiento en un
proceso que se desarrolla en una serie de etapas de manera
coordinada [(2), (3), (5) Kosai, K., Matsumoto, K., Nagata, S.,
Tsujimoto, Y., Nakamura, T. 1998. Abrogation of
Fas-induced fulminant hepatic failure in mice by
hepatocyte growth factor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244:
683-690. (6). Éthier, C., Raymond,
V-A., Musallam, L., Houle, R., and Bilodeau, M.
2003. Antiapoptotic effect of EGF on mouse hepatocytes associated
with downregulation of proapoptotic Bid protein. Am. J. Physiol.
Gastrointest. Liver Physiol. 285: G298- G308. (7). Kanda, D.,
Takagi, H., Toyoda, M., Horiguchi, N., Nakajima, H., Otsuka, T.,
Mori, M. 2002. Transforming growth factor a protects against
Fas-mediated liver apoptosis in mice. FEBS Lett.
519: 11-15]. Se considera que muchas de las
citoquinas y factores de crecimiento que son críticos en la
respuesta regenerativa frente al daño o lesión o resección en
animales, se expresan también en humanos durante la regeneración
del hígado, lo que sugiere la conservación de los mecanismos
fundamentales entre especies (4).
A nivel experimental se ha demostrado que la
administración a animales (rata y ratón) de determinados factores
de crecimiento y citoquinas protegen frente al FHA, evitando la
muerte celular y estimulando la regeneración del parénquima
hepático. Entre dichos factores cabe citar el factor de crecimiento
de los hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento transformante
\alpha (TGF-\alpha) y el factor de crecimiento
epidérmico (EGF) . [Kosai, K., Matsumoto, K. Nagata, S., Tsujimoto,
Y., Nalamura, T. Biochem. Biohys. Res. Commun.
244:683-690.1998 identificada como (5) más
adelante; Kand, D., Takagi, H., Toyoda, M., Horiguchi, N.,
Nakajima, H., Otsuka, T., Mori, M. FEBS Lett.
519-11-15.2002; y Ethier, C.,
Raymond, V.A., Musallam, L., Houle, R., Bilodeau, M. Am. J.
Physiol. 285: G298-G308.2003]. Entre las citoquinas
pueden mencionarse la interleuquina 6 (IL-6) y la
cardiotrofina-1 (CT-1).[Kovalovich,
K., DeAngelis, R.A., Li, W., Durth, E.E, Ciliberto, G., Taub, R.
Hepatology 31:149-159.2000 identificada como (26)
más adelante; y Bustos, M.,Beraza, N., Lasarte, J.J., Baixeras, E.,
Alzuguren, P., Bordet, T.,Prieto, J. Gastroenterology
125:192-201.2003 identificada como (43) más
adelante]. La regeneración del hígado es una respuesta única
dirigida a restaurar la masa hepática después de una resección del
parénquima o de un daño hepático. Las señales de supervivencia y
proliferación son transmitidas por una compleja red de citoquinas y
de factores de crecimiento que actúan de forma ordenada. Sin
embargo, a pesar de las intensas investigaciones llevadas a cabo en
las últimas décadas, las moléculas y mecanismos implicados en la
respuesta adaptativa fisiológica frente al daño hepático no son
completamente conoci-
das.
das.
Los inventores han observado recientemente que
la expresión del gen WT1 supresor del tumor de Wilms se induce en
el hígado de pacientes con daño hepatocelular así como en el hígado
de ratas tratadas con CCl_{4} [(8) Berasain, C., Herrero, J.I.,
García-Trevijano, E.R., Avila, M.A., Esteban, J.I.,
Mato, J.M., and Prieto, J. 2003. Expression of Wilms' tumor
suppressor in the cirrhotic liver: relationship to HNF4 levels and
hepatocellular function. Hepatology 38: 148-157]. El
gen WT1 codifica para un factor de transcripción provisto de dedos
de zinc que puede regular la expresión de una diversidad de genes
relacionados con el crecimiento y la diferenciación [(9)
Scharnhorst, V., Van der Eb, A.J, and Jochemsen, A.G. WT1 proteins:
functions in growth and differentiation. 2001]. Gene
273:141-
161].
161].
Una de las principales dianas fisiológicas
directamente inducidas por WT1 es la anfiregulina (AR) [(10) Lee,
S.B., Huang, K., Palmer, R., Truong, V.B., Herzlinger, D.,
Kolquist, K.A., Wong, J., Paulding, C., Yoon, S.K., Gerald, W.,
Oliner, J.D., and Haber, D.A. 1999. The Wilms tumors suppressor WT1
encodes a transcriptional activator of amphiregulin. Cell 98:
663-673]. La AR es un factor de crecimiento
polipeptidico de la familia del EGF y un ligando del receptor de
EGF (EGF-R), que fue originalmente aislada de medio
condicionado de células de carcinoma de mama humano
MCF-7 tratadas con 12-miristato
13-acetato de forbol [(11) Shoyab, M., McDonald,
V.L., Bradley, G., and Todaro, G.J. 1988. Amphiregulin: a
bifunctional growth- modulating glycoprotein produced by the phorbol
12-myristate
13-acetate-treated human breast
adenocarcinoma cell line MCF-7. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 85: 6528-6532]. Al igual que el EGF y
TGFa, la AR se sintetiza como un precursor transmembrana que se
procesa proteoliticamente hasta la forma madura secretada [(12)
Lee, D.C., Sunnarborg, S.W., Hinkle, C.L., Myers, T.J., Stevenson,
M.Y., Russell, W.E, Castner, B.J., Gerhart, M.J., Paxton, R.J.,
Black, R.A., Chang, A., and Jackson, L.F. 2003. TACE/ADAM17
processing of EGF-R ligands indicates a role as a
physiological convertase. Ann. N.Y. Acad. Sci. 995:
22-38]. La expresión de la AR es
tejido-especifica. En humanos se ha observado que
es más predominante en el ovario y la placenta e indetectable en el
hígado [(13) Plowman, G.D., Green, J.M., McDonald, V.L., Neubauer,
M.G., Disteche, C.M., Todaro, G.J., and Shoyab, M. 1990. The
amphiregulin gene encodes a novel epidermal growth
factor-related protein with
tumor-inhibitory activity. Mol. Cell Biol. 10:
1969-
1981].
1981].
La AR muestra propiedades bifuncionales,
estimulando la proliferación de una diversidad de células normales
e inhibiendo la de numerosas líneas celulares tumorales [(10), (13)
y (14) Kato, M., Inazu, T., Kawai, Y., Masamura, K., Yoshida, M.,
Tanaka, N., Miyamoto, K., and Miyamori, I. Amphiregulin is a potent
mitogen for the vascular smooth muscle cell line, A75. 2003.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 301: 1109-1115].
La patente US-5115096 describe
las características físico-químicas de la
anfiregulina y su efecto antiproliferativo sobre células cancerosas
de origen epitelial, así como su uso en el tratamiento de heridas y
en el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Se hace referencia a
cierto nivel reducido de producción de anfiregulina en el hígado de
lo que se deduce que aparentemente "juega algún papel
funcional".
La patente US-5980885 describe
un método en el que se usa la AR, junto con el factor de
crecimiento de fibroblastos, para inducir la proliferación de
células precursoras en tejidos neuronales de mamíferos.
La patente US-6204359 describe
el uso de una nueva forma de AR producida por queratinocitos en el
tratamiento de heridas y del cáncer.
La solicitud de patente
US-20011051358 describe la obtención y el uso de
polipéptidos del factor de crecimiento epidérmico/extracelular
(EEGF = Extracellular/Epidermal Growth Factor) para, entre otras
aplicaciones, el tratamiento de trastornos hepáticos. Asimismo,
hace referencia a la posibilidad de tratamientos relativos a la
regeneración del hígado. No obstante, la AR sólo se menciona como
un producto conocido del estado de la técnica que supuestamente
queda superado por la invención descrita en ese documento.
La solicitud de patente
WO-0145697 describe un agente regulador que inhibe
la expresión de la AR y su uso para el tratamiento de la piel
humana.
Finalmente, la solicitud de patente
WO-02102319 describe polinucleótidos que codifican
para polipéptidos BGS-8 así como fragmentos y
homólogos de los mismos, útiles, entre otras aplicaciones, para el
tratamiento y la prevención de trastornos hepáticos y estados
proliferativos que afectan al hígado. Se indica además que, debido
a ``la fuerte homología con miembros de la familia de las proteínas
del factor de crecimiento epidérmico, tales como bFGF, PDGF, AR,
betacelulina, cripto y TGF-alfa), es de esperar que
el polipéptido BGS-8 comparta al menos alguna
actividad biológica con proteínas de dicha familia.
El estado de la técnica demuestra la necesidad
de poder disponer de nuevas alternativas para el tratamiento del
FHA. Por lo tanto, era deseable encontrar un tratamiento más eficaz
del FHA basado en la aplicación de un factor de crecimiento o una
citoquina, cuya administración produciría un efecto hepatoprotector
en el FHA.
Partiendo del estado de la técnica anteriormente
descrito, los inventores han encontrado en sus investigaciones que,
inesperadamente, la AR administrada externamente es útil como
agente protector en el daño hepático agudo que, por ejemplo, puede
conducir o ha conducido ya, a un fallo hepático agudo (FHA).
Por tanto, un objeto de la presente invención es
el uso de la anfiregulina en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento del daño hepático agudo.
Otro objeto de la presente invención es el uso
de tal medicamento, en que tal factor se administra, para potenciar
una reacción protectora endógena primaria del tejido hepático
frente al daño hepático agudo.
Aún otro objeto de la presente invención es el
uso de la anfiregulina, en la fabricación de un medicamento que se
administra para promover la síntesis del DNA en las células
parenquimales del hígado en el daño hepático agudo.
Otro objeto de la presente invención es el uso
de la AR en la fabricación de un medicamento que se administra para
prevenir la muerte de las células parenquimales del hígado en el
daño hepático agudo.
Todavía otro objeto es el uso de la AR en la
fabricación de un medicamento que se administra para estimular la
regeneración del parénquima remanente hepático tras un daño
hepático agudo, de cualquier etiología.
Otro objeto de la invención es el uso de la AR
en la fabricación de un medicamento útil para estimular la
regeneración hepática tras una hepatectomía parcial
Aún otro objeto de la invención es el uso de la
AR en la fabricación de un medicamento útil como fármaco
hepatoprotector y estimulante de la regeneración hepatocitaria en
pacientes receptores de transplante hepático de vivo o de
cadáver.
La anfiregulina es, por tanto, útil en el
tratamiento del daño hepático agudo por administración a un
paciente necesitado de tal tratamiento. Así, la anfiregulina puede
emplearse en un método para el tratamiento del daño hepático agudo
que comprende administrar una cantidad eficaz de AR a un paciente
que tenga necesidad de ello. Dentro de este uso, la AR puede usarse
por ejemplo en un método de tratamiento en el que dicha AR se
administra a un paciente que precisa tal tratamiento, para
* potenciar una reacción protectora endógena
primaria del tejido hepático frente al daño hepático agudo, y/o
* promover la síntesis del DNA en los
hepatocitos durante el daño hepático agudo, y/o
* prevenir la muerte de los hepatocitos durante
el daño hepático agudo, y/o
* estimular la regeneración del parénquima
hepático remanente tras un daño hepático agudo, y/o
* potenciar una reacción protectora endógena
primaria del tejido hepático frente al daño hepático agudo, y/o
promover la síntesis de DNA en hepatocitos, y/o
* prevenir la muerte de hepatocitos en tejido
hepático en pacientes con daño hepático agudo, y/o
* estimular la regeneración del parénquima
hepático remanente tras un daño hepático agudo de cualquier
etiología, y/o
* estimular la regeneración hepática tras una
hepatectomía parcial, y/o
* estimular la regeneración hepatocitaria en
pacientes receptores de transplante hepático de vivo o de
cadáver.
Los inventores han encontrado que,
sorprendentemente, la AR es un factor que cuya administración es
susceptible de inducir la supervivencia del hepatocito durante la
lesión hepática. Así, se ha podido constatar que la AR se comporta
como un factor mitogénico o proliferador. Los inventores han
demostrado que la AR tiene capacidad de actuar directamente sobre
hepatocitos aislados, fomentando su proliferación e inhibiendo la
apoptosis. Estos efectos parecen ser mediados por la activación del
EGF-R y de las quinasas 1/2 reguladas
extracelularmente (ERK1/2), del factor de transcripción activador y
transductor de señal-3 (STAT-3), de
la quinasa N-terminal de c-jun (JNK)
y de Akt. Además, la AR induce la expresión de dos mediadores de la
supervivencia, TGF\alpha y CT-1, en hepatocitos
aislados.
Asimismo, los inventores han podido demostrar
que la administración in vivo de AR a ratones sometidos a un
daño hepático agudo con anticuerpo Jo2, que activa específicamente
al receptor del ligando Fas, o con CCl_{4}, dos modelos
clfnicamente relevantes de daño hepático [(4), (15) Galun, E., and
Axelrod, J.H. 2002. The role of cytokines in liver failure and
regeneration: potential new molecular therapies. Biochim. Biophys.
Acta. 1592: 345-358], dio como resultado una
significativa protección del tejido hepático y la inhibición de la
apoptosis. Por lo tanto, los hallazgos de los inventores muestran
nuevas funciones para la AR en el hígado que demuestran su utilidad
terapéutica para reducir el daño hepatocelular en los casos de
lesiones o daños hepáticos graves.
Lo anterior pone de manifiesto las propiedades
hepatoprotectoras de la anfiregulina y su efecto mitogénico sobre
modelos de daño hepatocelular que son relevantes para la patología
humana del daño hepático agudo.
La AR puede administrarse por inyección por vía
parenteral y, especialmente, preferentemente por vía intravenosa si
bien puede ser también administrarse subcutánea o
intramuscularmente.
Las formas de administración parenteral se
pueden obtener de manera en sí convencional mezclando la AR con
tampones, estabilizantes, agentes conservantes, agentes
solubilizantes, agentes tonificantes y/o agentes de suspensión. A
fin de evitar efectos sobre los puentes disulfuro existentes en la
molécula de AR, no deben incluirse componentes capaces de modificar
(reducir) estos puentes disulfuro. Las composiciones son
esterilizadas por técnicas conocidas y envasadas para ser
administradas como inyecciones.
Como tampones se pueden usar por ejemplo sales
basadas en organofosfatos.
Ejemplos de agentes solubilizantes son aceite de
ricino solidificado con polioxietileno, polisorbato 80,
nicotinamida, y macrogol.
Como estabilizantes sulfito sódico, metasulfito
sódico; y como agentes conservantes se pueden usar ácido sórbico,
cresol, paracresol y otros.
Como forma de administración preferente la
preparación inyectable puede ser una solución, una emulsión o una
dispersión estéril. Dicha preparación inyectable se prepara por
disolución, emulsión o dispersión de la AR junto con uno o más
excipientes, en agua para inyección.
Entre los excipientes que puede comprender la
preparación inyectable para administración subcutánea se encuentran
los tampones, dependiendo de la inyección en tejidos, con poder
tamponante o sin poder tamponante, y dependiendo de la estabilidad
del, o de los ingredientes activos a pH fisiológico. Entre los
tampones se pueden citar las soluciones reguladoras como ácido
cítrico-citrato sódico, ácido
acético-acetato sódico, y carbonato
monosódico-carbonato disódico entre otras.
Otros excipientes opcionales son agentes
esterilizantes para evitar la presencia de pirógenos y/o
contaminantes.
Otro componente opcional de la composición
farmacéutica para administración por via subcutánea es uno o más
agentes vehiculizantes, tales como por ejemplo agua, hidrocarburos,
alcoholes, polioles, éteres, aceites vegetales, lanolina,
metilcetona, entre otros.
Las composiciones inyectables por vía
intravenosa o intraperitoneal pueden estar diseñadas para permitir,
en una o varias dosis, la administración de 0,5 a 1,8 mg/kg de peso
corporal del paciente por día, como por ejemplo de 0,85 a 1,55
mg/kg de peso corporal del paciente por día y más específicamente
de 1 a 1,5 mg/kg de peso corporal del paciente por día.
Figura 1A: Expresión del gen AR en cirrosis
hepática humana y experimental, medida mediante PCR en tiempo real
en muestras de hígado procedente de individuos control (n=26), y
pacientes cirróticos (cirrosis Child-Pugh A, n=7,
cirrosis Child-Pugh B+C, n=22).
Figura 1B: Expresión del gen AR en hígado de
rata control y en hígado cirrótico por CCl_{4} según se determinó
mediante RT-PCR (n=6 animales por grupo).
Figura 2A: Expresión de AR en el hígado de
ratones control y tras la inducción de daño hepático agudo por
anticuerpos Jo2 ó CCl_{4}. La expresión de AR fue evaluada por
RT-PCR 5 h después de la administración de los
mencionados tratamientos.
Figura 2B: Expresión de AR en daño hepático
agudo inducido por anticuerpos Jo2 ó CCl_{4} evaluada mediante
Western blot. Las muestras de tejido hepático fueron obtenidas tras
12 y 24 h de tratamiento con Jo2 y CCl_{4} respectivamente. Los
análisis fueron llevados a cabo con un anticuerpo
anti-AR purificado por afinidad y biotinilado. Las
puntas de flecha indican las diferentes formas de AR y se presentan
tres muestras representativas por grupo. Las membranas se
hibridaron con un anticuerpo especifico para actina como control de
carga. Se muestran imágenes representativas.
\newpage
Figura 3A: El tratamiento con AR previene el
daño hepático agudo inducido por CCl_{4}. Se muestra la
histología hepática y los niveles de transaminasas séricas en
ratones tratados con CCl_{4} (teñido H&E, magnificación
original X200). Las muestras de suero y tejido hepático fueron
tomadas 24 h después de la administración de CCl_{4}. Los valores
son medias \pmSEM de tres experimentos realizados por
triplicado.
Figura 3B: Efecto del tratamiento de AR sobre la
histología hepática y las transaminasas séricas en ratones tratados
con Jo2 (teñido H&E, magnificación original X200). Las muestras
de suero y tejido hepático fueron obtenidas 12 h después de la
administración de Jo2. Los valores son medias\pmSEM de tres
experimentos realizados por triplicado. El asterisco indica
P<0,01 vs Jo2 solo.
Figura 3C: Efecto del tratamiento con AR sobre
la actividad caspasa-3 en hígado de ratón medida 12
h después de la inyección de Jo2. Los valores son medias \pmSEM
de tres experimentos realizados por triplicado y el asterisco
indica P<0,01 vs Jo2 solo.
Figura 3D: Efecto del tratamiento con AR sobre
los niveles de la subunidad p17 de la caspasa-3
activa y de la proteína Bcl-x_{L} en hígado de
ratones control (C) y en extractos de hígado obtenidos 12 h después
de la inyección de Jo2. Las membranas se hibridaron con un
anticuerpo especifico para actina como control de carga. Se
muestran imágenes representativas.
Figura 4A: Efecto antiapoptótico de AR sobre
hepatocitos de ratón en cultivo primario. La apoptosis fue inducida
mediante tratamiento con actinomicina D y Jo2 en presencia de
concentraciones crecientes de AR. La apoptosis se evaluó midiendo
el enriquecimiento específico de mono- y oligonucleosomas liberados
en el citoplasma (factor de enriquecimiento: EF). Los valores se
normalizaron respecto a los obtenidos en hepatocitos control (C).
Los valores son medias \pmSEM de tres experimentos realizados por
triplicado y el asterisco indica P<0,05 vs Jo2.
Figura 4B: Panel izquierdo: Efecto de la AR (20
nM) sobre la actividad caspasa-3 en hepatocitos de
ratón en cultivo tratados con actinomicina D y Jo2 Los valores son
medias \pmSEM de tres experimentos realizados por triplicado y el
asterisco indica P<0,05 vs células tratadas con actinomicina D y
Jo2. Panel derecho: Análisis por Western Blot de la subunidad p17
de la caspasa-3 activa y de la proteína
Bcl-x_{L} en las mismas muestras descritas en el
panel izquier-
do.
do.
Figura 4C: Activación de las rutas de
señalización antiapoptótica por AR en hepatocitos de ratón en
cultivo. Se evaluó el estado de fosforilación de Akt, ERK1/2 y
STAT3 mediante Western blotting en extractos de hepatocitos de
ratón a diferentes tiempos después de la adición de la AR (20 nM).
Se muestran imágenes representativas de tres experimentos
realizados por duplicado.
Figura 4D: Efecto de la AR (20 nM) sobre la
apoptosis inducida por actinomicina D y Jo-2 en
hepatocitos de ratón en cultivo en presencia del inhibidor de
EGF-R PD153035 (1 \muM), el inhibidor de MEK1
PD98059 (10 \muM) o el inhibidor de PI-3K
LY-294002 (20 \muM). Los valores son medias
\pmSEM de tres experimentos realizados por triplicado y el
asterisco indica P<0,05 vs Jo2.
Figuras 5A, 5B: Expresión génica de la AR en el
hígado de rata (Fig. 5 A) y ratón (Fig. 5B) después de la HP. Los
niveles de ARNm de la AR se analizaron a diferentes tiempos tras la
HP en el parénquima hepático remanente mediante PCR en tiempo real.
Los valores son medias \pmSEM de tres animales diferentes. Los
círculos cerrados corresponden a animales hepatectomizados, los
círculos abiertos corresponden a animales sometidos a operaciones
simuladas.
Figura 6A: Estimulación de la síntesis de DNA
por la AR en hepatocitos de rata en cultivo. Los hepatocitos se
trataron con concentraciones crecientes de AR, y se midió la
síntesis de DNA determinando la incorporación de
[^{3}H]timidina. Se muestra el efecto del TGF\beta (8
ng/ml) sobre la síntesis de DNA inducida por la AR. Los valores son
medias \pmSEM de tres experimentos llevados a cabo por
cuadruplicado. Un asterisco indica P<0,05 y dos asteriscos
indican P<0,01 vs control.
Figura 6B: Estimulación de la fosforilación del
EGF-R en residuos de tirosina por la AR en
hepatocitos de rata en cultivo. El EGF-R
fosforilado en tirosina y el EGF-R total fueron
detectados mediante Western blotting. Se muestran imágenes
representativas de tres experimentos llevados a cabo por
duplicado.
Figura 6C: Activación de las rutas de
señalización relacionadas con la proliferación celular por AR en
hepatocitos de rata en cultivo. Se evaluó el estado de
fosforilación de Akt, ERK1/2 y JNK mediante Western blotting
utilizando anticuerpos específicos en extractos de hepatocitos de
rata a tiempos diferentes después de la adición de AR. Se muestran
imágenes representativas de tres experimentos realizados por
duplicado.
Figura 6D: Efecto de la AR (100 nM) sobre la
síntesis de DNA en hepatocitos de rata en presencia del inhibidor
del EGF-R PD153035 (1 \muM), el inhibidor de MEK1
PD98059 (10 \muM), el inhibidor de PI-3K LY294002
(20 \muM), el inhibidor de JNK SP600125 (20 \muM) o el
inhibidor de p38 MAPK 5E202190 (25\muM). Los asteriscos indican
P<0,05 vs AR solo. Los valores son medias \pmSEM de tres
experimentos realizados por triplicado.
Figura 7A: Expresión génica de la AR en
hepatocitos de rata en cultivo tratados con
IL-1\beta (2 ng/ml) (barras cerradas) durante
diferentes periodos de tiempo. La expresión génica de la AR fue
determinada por PCR en tiempo real. El asterisco indica P<0,05
vs controles (barras abiertas). Los valores son medias \pmSEM de
tres experimentos realizados por triplicado.
Figura 7B: Expresión génica de la AR en
hepatocitos de rata en cultivo tratados con PGE2 (10 \muM)
(barras cerradas) durante diferentes periodos de tiempo. La
expresión génica de la AR fue determinada por PCR en tiempo real.
El asterisco indica P<0,05 vs controles (barras abiertas). Los
valores son medias \pmSEM de tres experimentos realizados por
triplicado.
Figura 7C: Análisis de la expresión génica basal
de la AR en hepatocitos de rata en función del tiempo en cultivo
mediante RT-PCR. Se muestra un experimento
representativo.
Figura 7D: Expresión génica de la AR en
hepatocitos de rata en cultivo 24 h después de la transfección con
una mezcla equimolar de plásmidos pCB6 codificantes de las cuatro
isoformas de WT1 o con una cantidad equivalente del vector pCB6
vacío. La expresión génica de la AR se determinó mediante PCR en
tiempo real.
Figuras 8A, 8B: Expresión génica del TGF\alpha
(Figura 8A) o la CT-1 (Figura 8B) en hepatocitos de
rata en cultivo tratados con AR durante diferentes periodos de
tiempo. Los valores son medias \pmSEM de tres experimentos
realizados por triplicado y se expresan como el incremento de veces
vs los controles correspondientes a cada tiempo. El asterisco
indica P<0,05 vs controles.
Figura 9: Expresión génica de los ligandos del
EGF-R, AR, TGF\alpha, EGF y
HB-EGF en el hígado de ratones control (C) y en el
hígado de ratones tratados con el anticuerpo Jo2. La expresión de
estos genes se determinó mediante PCR en tiempo real. El asterisco
indica P<0,01 vs controles. Los valores son medias \pmSEM de
tres experimentos llevados a cabo por triplicado.
La expresión del gen de AR se detecta en hígado
humano cirrótico y se induce rápidamente en el daño hepático
experimental y después de una hepatectomía parcial. Los
experimentos llevados a cabo por los inventores así como un
análisis exhaustivo de los resultados obtenidos en los mismos, los
cuales constituyen el fundamento y soporte científico para el uso
de la AR objeto de la presente invención, se expondrán
seguidamente.
Los inventores ya habían demostrado con
anterioridad que la expresión del factor de transcripción WT1
estaba inducida en casi todas las muestras ensayadas de hígado
humano cirrótico y en cirrosis inducida por CCl_{4} en ratas (8).
El hecho de que la AR sea una diana transcripcional principal para
WT1 (10) llevó a los inventores a examinar la expresión de este
factor de crecimiento en el hígado de pacientes cirróticos. Aunque
el análisis por PCR en tiempo real (RTi-PCR) mostró
niveles apenas detectables de expresión de AR en hígado humano
sano, se detectaron valores de mRNA de AR elevados en
aproximadamente el 75% de los pacientes con cirrosis (Figura 1A).
Es de gran interés el hallazgo de que los niveles de expresión del
gen AR estén directamente correlacionados con los del gen WTI en el
hígado control y en sujetos cirróticos (r=0,752, P<0,001).
Coincidiendo con los datos en humanos, la expresión de AR también
se incrementó en cirrosis experimental inducida en ratas por
administración de CCl_{4} (Figura 1B), y ligadura del conducto
biliar (no mostrado).
Para evaluar si la AR podría formar parte de la
pronta respuesta del hígado frente a la agresión, se examinaron los
niveles de mRNA de AR y proteína en hígado de ratón después de la
administración de una sola inyección intraperitoneal de CCl_{4}
(1 \mul/g), o después de la inyección del anticuerpo Jo2 (4
\alphag/ratón??). La Figura 2A muestra que los niveles de mRNA de
AR estuvieron marcadamente inducidos 5 h después del inicio de los
tratamientos. Se llevó a cabo un Western blot con muestras de
hígado obtenidas 12 y 24 h después de la administración de
anticuerpo Jo2 o CCl_{4} respectivamente. Utilizando un anticuerpo
específico para la AR de ratón purificado por afinidad y
biotinilado, se detectaron un conjunto de proteínas que estaban
presentes solamente en el hígado de los ratones tratados (Figura
2B). Las cuatro bandas de aproximadamente 50, 43, 28 y 19 kDa son
consistentes con las diferentes formas de la AR descritas en
células epiteliales [(22) Brown, C.L., Meise, K.S., Plowman, G .D.,
Coffey, R.J., Dempsey, P.J. 1998. Cell surface ectodomain cleavage
of human amphiregulin precursor is sensitive to a metalloprotease
inhibitor. J. Biol. Chem. 273: 17258-17268]. Las
bandas de 50 y 28 kDa representan probablemente formas de la AR
ancladas a la membrana, mientras que las bandas de 43 y 19 kDa
pueden ser formas solubles de la AR procesadas proteolfticamente
(22).
Para evaluar si la AR puede limitar la extensión
del daño hepático, los inventores han examinado el efecto de la
administración de AR a ratones sometidos a un daño hepático agudo
por tratamiento con CCl_{4} ó anticuerpo Jo2. El CCl_{4} induce
necrosis y apoptosis hepática debida a la alteración celular,
lisosomal y permeabilidad de la membrana mitocondrial [(23) Berger,
M.L., Bhatt, H., Combes, B., Estabrook, R. 1986.
CCl_{4}-induced toxicity in isolated hepatocytes:
the importance of direct solvent injury. Hepatology 6:
36-45. (24) Kovalovich, K., Li, W., DeAngelis, R.,
Greenbaum, L.E., Ciliberto, G., and Taub, R. 2001.
Interleukin-6 protects against
Fas-mediated death by establishing a critical level
of anti-apoptotic hepatic proteins FLIP,
Bcl-2, and Bcl-x_{L}. J. Biol.
Chem. 276: 26605-26613. (25) Shi, J., Aisaki, K.,
Ikawa, Y., Wake, K. 1998. Evidence of hepatocyte apoptosis in rat
liver after the administration of carbon tetrachloride. Am. J.
Pathol. 153: 515-525. (26) Kovalovich, K.,
DeAngelis, R.A., Li, W., Furth, E.E., Ciliberto, G., Taub, R. 2000.
Increased toxin-induced liver injury and fibrosis
in interleukin-6-deficient mice.
Hepatology 31: 149-159. (27) Czaja, M.J., Xu, J.,
Alt, E. 1995. Prevention of carbon
tetrachloride-induced rat liver injury by soluble
tumor necrosis factor receptor. Gastroenterology 108:
1849-1854]. Los niveles en suero de AST y ALT se
elevaron apreciablemente 24 h después de la inyección con
CCl_{4}. Este incremento, sin embargo, fue claramente atenuado en
ratones tratados con AR (Figura 3A). Consistente con esto, el grado
de daño histológico se redujo en los ratones que se habían tratado
con AR (Figura 3A).
Los niveles en suero de AST y ALT se elevaron
considerablemente 12 h después de la inyección de Jo2 (Figura 3B).
El tratamiento con AR suprimió potentemente la elevación de
transaminasas en suero, y el análisis histopatológico confirmó que
la administración de AR casi evitó completamente el daño hepático
(Figura 3B). La muerte celular apoptótica es un determinante
principal en el daño hepático mediado por Fas [(5)-(7), (28)
Ogasawara, J., Watanabe-Fukunaga, R., Adachi, M.,
Matsuzawa, A., Kasugai, T., Kitamura, Y., Itoh, N., Suda, T.,
Nagata, S.1993. Lethal effect of the anti-Fas
antibody in mice. Nature 364: 806-809. (29) Nagata,
S. 1997. Apoptosis by death factor. Cell 88:
355-365]. Para confirmar que los efectos
hepatoprotectores de AR frente al daño hepático mediado por Fas
procede de una actividad anti-apoptótica, los
inventores midieron la activación proteolftica de la
caspasa-3 y su actividad en extractos de hígado de
ratón. Observaron que la inducción de la actividad de
caspasa-3 detectada en ratones tratados con
anticuerpo Jo2 era fuertemente inhibida por la administración de la
AR (Figura 3C). Utilizando un anticuerpo que reconoce solamente la
subunidad p17 de la caspasa-3 activa se observó que
la ruptura de caspasa-3 era evitada por el
tratamiento con AR, lo que sugiere el bloqueo especifico por AR de
la ruta apoptótica inducida por Fas (Figura 3D). Las proteínas de
la familia Bcl-2 inhiben la apoptosis inducida por
una diversidad de estímulos, incluyendo la apoptosis mediada por
Fas [(30) Shimizu, S., Eguchi, Y., Kosaka, H., Kamiike, W.,
Matsuda, H., Tsujimoto, Y. 1995. Prevention of
hypoxia-induced cell death by Bcl-2
and Bcl-x_{L}. Nature 374:
811-813. (31) Stoll, S.W., Benedict, M., Mitra, R.,
Hiniker, A., Elder, J.T., Nuñez, G. 1998. EGF receptor signalling
inhibits keratinocyte apoptosis: evidence for mediation by
Bcl-x_{L}. Oncogene 16: 1493-1499.
(32) Lacronique, V., Mignon, A., Fabre, M., Viollet, B., Rouquet,
N., Molina, T., Porteu, A., Henrion, A., Bouscary, D., Varlet, P.,
Joulin, V., Kahn, A. 1996. Bcl-2 protects from
lethal hepatic apoptosis induced by an anti-Fas
antibody in mice. Nat. Med. 2: 80-86]. Se ha
evaluado la expresión de la proteína Bcl-x_{L}
mediante Western blotting 6 h después de la inyección del
anticuerpo Jo2. Los niveles de la proteína
Bcl-x_{L} fueron superiores en el hígado de ratón
tratado con AR y anticuerpo Jo2 en comparación con los observados
en ratones tratados con anticuerpo Jo2 sólo (Figura 3D).
Para determinar si los efectos antiapoptóticos
in vivo de la AR podrían estar mediados por una acción
directa de la AR sobre las células del parénquima hepático, los
presentes inventores utilizaron hepatocitos de ratón en cultivo
primario. Se ha descrito que los hepatocitos expuestos a los
anticuerpos Jo-2 experimentan apoptosis eficazmente
en presencia de actinomicina D [(5), (6), (33) Ni, R., Tomita, Y.,
Matsuda, K., Ichiara, A., Ishimura, K., Ogasawara, J., Nagata, S.
1994. Fas-mediated apoptosis in primary cultured
mouse hepatocytes. Exp. Cell Res. 215: 332-337].
Los hepatocitos se pretrataron con diferentes concentraciones de AR
durante 3 h antes de la adición de la actinomicina D y el anticuerpo
Jo2. Se midieron la apoptosis, y los sucesos moleculares
relacionados con la apoptosis, 18 horas después. Como se muestra en
la Figura 4A, los hepatocitos fueron protegidos de la apoptosis por
la AR de forma dosis-dependiente, indicando un
efecto citoprotector directo de la AR en la prevención de la
apoptosis hepática mediada por Fas. También se observó actividad
citoprotectora de AR en la apoptosis inducida por otros agentes
tales como TNF\alpha más galactosamina, ácido okadaico y el factor
de crecimiento transformante \beta (TGF\beta) (datos no
mostrados). De acuerdo con el efecto antiapoptótico de la AR, los
inventores observaron que la proteolisis y activación de la
caspasa-3 inducida por el anticuerpo Jo2 eran
significativamente inhibidas por AR (Figura 4b). Asimismo,
encontraron que la protefna antiapoptótica
Bcl-x_{L} era inducida por tratamiento con AR en
hepatocitos de ratón tratados con Jo2 (Figura 4B). Con el fin de
conocer los mecanismos de señalización del efecto antiapoptótico de
la AR, se examinaron las rutas de PI-3K/Akt y
ERK1/2, mediadores generales de la supervivencia celular ((4),
(6)]. Los hepatocitos de ratón en cultivo tratados con AR mostraron
una fosforilación incrementada de Akt y ERK1/2 (Figura 4 C). Una
molécula señalizadora clave implicada en la protección del daño
hepático inducido por Fas es STAT3 [(34) Shen, Y., Devgan, G.,
Darnell, J.E., Bromberg, J.F. 2001. Constitutively activated Stat3
protects fibroblasts from serum withdrawal and
UV-induced apoptosis and antagonizes the
proapoptotic effects of activated Statl. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 98: 1543-1548. (35) Haga, S., Terui, K.,
Zhang, H.Q., Enosawa, S., Ogawa, W., Inoue, H., Okuyama, T.,
Takeda, K., Akira, S., Ogino, T., et al. 2003. Stat3
protects against Fas-induced liver injury by redox-
dependent and -independent mechanisms. J. Clin. Invest. 112:
989-998]. Se observó que la AR estimulaba la
fosforilación de STAT3 (Figura 4C).
La activación del EGF-R por la
AR parece ser esencial en la mediación del efecto antiapoptótico de
este factor de crecimiento sobre la muerte celular inducida por Fas.
Esto se hace evidente cuando los hepatocitos de ratón fueron
pretratados durante 1 hora con el inhibidor del
EGF-R, PD153035, antes de la adición de la AR, y se
perdió la protección proporcionada por la AR (Figura 4D). También
fue necesaria para evitar la apoptosis la activación de la ruta
PI-3K/Akt por AR, que opera por debajo del
EGF-R. Esto pudo demostrarse por el marcado efecto
inhibitorio del inhibidor de PI-3K, LY294002 sobre
la protección conferida por la AR (Figura 4D). Sin embargo, el
inhibidor de MEK1, PD98059, no interfirió con el efecto
antiapoptótico de AR (Figura 4D).
Los presentes inventores examinaron también la
expresión de AR en hígado de ratón y de rata después de una HP de
dos tercios [(1), (4)]. Como se muestra en la Figura 5A, el mRNA de
AR no era detectable en el hígado de rata antes de la HP pero su
aparición fue detectada a la media hora después de la intervención,
alcanzando su máximo valor a las 6 horas y decreciendo
uniformemente entre 15 y 24 horas. Es interesante la observación de
que la expresión del gen AR de ratas sometidas a operaciones
simuladas ("sham operated": SH) se inducía de forma
transitoria entre las 6 y las 15 h (Figura SA). La expresión del
gen AR de hígado de ratón también fue inducida prontamente después
de la HP. Los niveles de mRNA de AR se vieron incrementados 0,5 h
después de la HP, alcanzando un pico entre las 24 y 48 h y
decreciendo posteriormente (Figura 5B). La expresión del gen de la
AR también fue inducida en ratones sometidos a operaciones
simuladas, aunque con cinéticas mucho más rápidas que en ratas. En
el punto de tiempo más breve evaluado (0,5 h), los ratones
sometidos a operaciones simuladas mostraron niveles de mRNA de AR
similares a los de los animales hepatectomizados. Sin embargo, 1
hora después de la intervención los niveles de mRNA de AR se
redujeron significativamente en los ratones sometidos a operaciones
simuladas en comparación con los animales sometidos a resección, y
se mantuvieron así para todo el estudio (Figura 5B).
Una vez que los presentes inventores han
demostrado que la expresión del gen AR es inducida con prontitud en
el daño hepático y la HP, y que la AR puede jugar un papel
protector para el parénquima hepático, van a tratar de demostrar en
los siguientes párrafos que la AR puede tener también un
comportamiento mitógeno para los hepatocitos.
Como se muestra en la Figura 6A, la AR se
comporta como un mitógeno puro para el hepatocito aislado en
cultivo primario, estimulando la incorporación de
[^{3}H]timidina en el DNA de forma
dosis-dependiente. El efecto del AR sobre la
síntesis del DNA fue abrogado por el TGF(3, un factor de
crecimiento implicado en la terminación fisiológica de la respuesta
regenerativa del hígado (1).
La AR es un ligando del EGF-R,
un receptor que se expresa abundantemente en el hepatocito del
animal adulto [(36) Salomon, D.S., Brandt, R., Ciardiello, F.,
Normanno, N. 1995. Epidermal growth factor-related
peptides and their receptors in human malignancies. Crit. Rev.
Oncol. Hematol. 19: 183-232. (37) Carver, R.S.,
Stevenson, M.C., Scheving, L.A., and Russell, W.E. 2002 Diverse
expression of ErbB receptor proteins during rat liver development
and regeneration. Gastroenterology 123: 2017- 2027]. Los inventores
examinaron la señalización intracelular de la AR en hepatocitos de
rata en cultivo. El tratamiento de hepatocitos de rata aislados con
AR inducía la fosforilación rápida y transitoria del
EGF-R (Figura 6B). Se analizaron las rutas de la
proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y de la de la
fosfatidil inositol 3-quinasa
(PI-3K), como las principales cascadas
señalizadoras en la respuesta mitogénica de los hepatocitos frente
a los factores de crecimiento [(38) Band, C.J., Mounier, C.,
Posner, B. 1999. Epidermal growth factor and
insulin-induced deoxyribonucleic acid synthesis in
primary rat hepatocytes is phosphatidylinositol
3-kinase dependent and dissociated from
protooncogene induction. Endocrinology 140:
5625-5634. (39) Coutant, A., Rescan, C., Gilot, D.,
Loyer, P., Guguen-Guillouzo, C., Baffet, G. 2002.
PI3K-FRAP/mTOR Pathway is critical for hepatocyte
proliferation whereas MEK/ERK supports both proliferation and
survival. Hepatology 36: 1079-1088]. Mas
recientemente, se ha demostrado que la activación de la
c-Jun-N- terminal quinasa (JNK)
contribuye significativamente a la proliferación de los hepatocitos
después de la HP [(40) Schwabe, R.F., Bradham, C.A., Uehara, T.,
Hatano, E., Bennett, B.L., Schoonhoven, R., Brenner, D.A. 2003.
c-Jun-N-Terminal
kinase drives cyclin D1 expression and proliferation during liver
regeneration. Hepatology 37: 824-832]. Como se
observó en hepatocitos murinos, el tratamiento de hepatocitos de
rata aislados con AR induce rápidamente la fosforilación de ERK1/2
y Akt (Figura 6C). Además, los inventores han observado también la
fosforilación de JNK como respuesta al tratamiento con AR (Figura
6C).
Para evaluar la señalización de la AR en la
proliferación de los hepatocitos, los inventores midieron la
incorporación de [^{3}H]timidina en el DNA en hepatocitos
de rata tratados con AR en presencia de inhibidores de es estas
rutas señalizadoras. Como se muestra en la Figura 6D, el inhibidor
de la actividad tirosina quinasa del EGF-R,
PD153035, impide completamente la síntesis de DNA estimulada por
AR. Se observó un grado de inhibición similar para el inhibidor de
la PI-3K, LY294002, mientras que los inhibidores de
MEK1, PD98059, y de JNK, SP600125, redujeron los efectos de la AR
en un 70% (Figura 6D). Sin embargo, el tratamiento con el inhibidor
de p38-MAPK, SB202190, no tuvo un efecto
significativo sobre la síntesis de DNA estimulada por la AR (Figura
6D).
Los presentes inventores han demostrado que la
AR se expresa en el hígado bajo diferentes situaciones de daño y
regeneración del tejido hepático. Para identificar los mecanismos
responsables de la inducción de la AR se aislaron células de
parénquima de hígado de rata y se examinó la expresión del gen AR
bajo diferentes condiciones. Primeramente evaluaron el efecto de
diferentes factores implicados en los procesos inflamatorios y
regenerativos hepáticos, tales como la IL-1\beta,
la IL-6, el TNF\alpha, el HGF y la prostaglandina
E2 (PGE_{2}) [(1)-(4), (41) Rudnick, D.A., Perlmutter, D.H., and
Muglia, L.J. 2001. Prostaglandins are required for CREB activation
and cellular proliferation during liver regeneration. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 98: 8885-8890]. Entre las citoquinas
y los factores de crecimiento ensayados, la
IL-1\beta, fue la única molécula que estimuló la
expresión del gen AR (Figura 7A). De acuerdo con observaciones
previas realizadas en células de cáncer de colon [(42) Shao, J.,
Lee, S.B., Guo, H., Evers, M., and Sheng, H. 2003. Prostaglandin
E_{2} stimulates the growth of colon cancer cells via induction
of amphiregulin. Cancer Res. 63: 5218-5223], se
observó que el tratamiento de los hepatocitos de rata con PGE_{2}
daba lugar a la rápida inducción de la expresión del gen AR (Figura
7B). Se ha postulado que la estimulación por PGE_{2} de la
expresión del gen AR está inducida por la ruta cAMP/proteína
quinasa A (PKA), que actúa sobre un elemento de respuesta de cAMP
(CRE) en el promotor de AR (42). Consistentemente con este
mecanismo, los presentes inventores observaron que el agente
inductor de cAMP, forskolina, promovía la expresión del gen AR en
hepatocitos aislados (datos no mostrados). El tratamiento de
hepatocitos con diferentes agentes inductores de estrés oxidativo,
tales como el peróxido de hidrógeno y la menadiona, no tuvieron
efecto sobre la expresión del gen AR (datos no mostrados).
También se encontró que la expresión de gen AR
se inducia en hepatocitos en cultivo y que la magnitud de este
efecto aumentaba con el tiempo de cultivo (Figura 7C). El AR es un
diana bona fide para el factor transcripción WT1 (10). Los
inventores han encontrado que la transfección de hepatocitos con
una mezcla equimolar de plásmidos que codifican para las 4
isoformas de WT1 dio lugar a un aumento de los niveles de mRNA de
AR determinado por PCR en tiempo real. Aunque estos datos muestran
que el WT1 puede controlar la expresión del gen AR en hepatocitos
aislados, la inducción de AR en el hepatocito en cultivo precede a
la de WT1 (datos no mostrados), indicando que los factores
identificados previamente, IL-1b y PGE2, podrían
ser responsables de la rápida inducción inicial de la expresión del
gen AR en los hepatocitos en cultivo.
Con el fin de profundizar más en los mecanismos
de los efectos hepatoprotectores de la AR, los presentes inventores
evaluaron los efectos de este factor de crecimiento sobre la
expresión del TGF\alpha y la cardiotrofina-1
(CT-1, moléculas clave implicadas en la respuesta
endógena frente al daño hepático y la PH [(7), (43) Bustos, M.,
Beraza, N., Lasarte, J-J., Baixeras, E., Alzuguren,
P., Bordet, T., Prieto, J. 2003. Protection against liver damage by
cardiotrophin-1: a hepatocyte survival factor
up-regulated in the regenerating liver in rats.
Gastroenterology 125: 192-201. (44) Webber, E.M.,
Fitzgerald, M.J., Brown, P.I., Bartlett, M.H., Fausto, N. 1993.
Transforming growth factor-\alpha expression
during liver regeneration after partial hepatectomy and toxic
injury, and potential interactions between transforming growth
factor-a and hepatocyte growth factor. Hepatology
18: 1422-1431]. Se observó que el tratamiento con
AR de hepatocitos de rata aislados incrementó los niveles de mRNA
de TGF\alpha y CT-1 (Figura 8A y B). Estas
respuestas subrayaron la relevancia de la AR como factor
hepatotrófico.
Además de la AR, el EGF-R puede
ser activado por una familia de ligandos que junto a EGF y
TGF\alpha incluyen el factor de crecimiento tipo EGF capaz de
unirse a heparina (HB-EGF)[(36), (45) Holbro, T.,
Hynes, N.E. 2004. ErbB receptors: directing key signaling networks
throughout life. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44:
195-217]. Para profundizar en la contribución
relativa de estos ligandos del EGF-R a la pronta
respuesta hepatoprotectora y regenerativa que sigue al daño
hepático agudo, los inventores han examinado su perfil de expresión
génica en ratones tratados con anticuerpos Jo2. Como se muestra en
la Figura 9, la expresión de EGF, TGF\alpha y
HB-EGF fue detectada por PCR en tiempo real en el
hígado de ratones control, que previamente habían mostrado niveles
indetectables de mRNA de AR. Cinco horas después de la
administración del anticuerpo Jo2 los niveles de mRNA de EGF,
TGF\alpha y HB-EGF se redujeron
significativamente, mientras que la expresión del gen AR fue
apreciablemente inducida. Todas estas observaciones en conjunto
indican que la AR es el único ligando de EGF-R
examinado que es inducido en hígado de ratón durante las fases
tempranas del daño hepático agudo.
Como resumen de la exposición anterior, se ha
demostrado que la expresión del gen AR se induce de manera rápida y
consistente en diferentes modelos de daño hepático, y que la
administración exógena de la AR proporciona una hepatoprotección
significativa.
Las observaciones anteriormente expuestas,
consideradas en su conjunto, indican de forma clara y contundente
que la AR puede ser considerada como un nuevo participante activo
en el complejo proceso de la regeneración hepática. De este modo,
la AR presentaría un incalculable potencial terapéutico en el
tratamiento de situaciones patológicas producidas por lesiones
hepáticas de tipo agudo, siendo de destacar su aplicación en
situaciones especialmente criticas tales como las debidas al
FHA.
La presente invención se ilustra adicionalmente
mediante el siguiente Ejemplo, que junto con las Figuras descritas
anteriormente, ilustra la metodología experimental empleada para el
desarrollo de la presente invención. Se entiende que los expertos
en la materia serán capaces de comprender las modificaciones,
variaciones y cambios que pueden hacerse dentro del alcance de la
presente invención.
Se obtuvieron muestras de tejido hepático
procedentes de 2 grupos de sujetos: (a) Individuos control (n=26;
19 varones; edad media 50,8, intervalo 18-73 años)
con alteraciones hepáticas mínimas. Se recogieron muestras de
tejido por cirugía de tumores digestivos (16 casos) o a partir de
biopsia percutánea de hígado realizada a causa de una débil
alteración de las pruebas de función hepática (10 casos) y (b)
Cirrosis hepática (n=29; 24 varones; edad media 56, rango
36-77 años) que fueron debidos a infección por
virus de la hepatitis C (HCV) en 8 casos, alcoholismo en 13 casos,
infección por virus de la hepatitis B (HBV) en 3 casos, hepatitis
autoinmune en 3 casos, hemocromatosis en un caso y criptógeno en
otro caso. Estuvo presente el carcinoma hepatocelular asociado
(HCC) en 10 pacientes cirróticos. Este estudio fue aprobado por el
Comité de Revisión de Investigación Humana de la Universidad de
Navarra, España, y estaba de acuerdo con los principios de la
Declaración de Helsinki.
Los experimentos se realizaron de acuerdo con
las guías de la Universidad de Navarra para el uso de animales de
laboratorio. Se indujo cirrosis con CCl_{4} en ratas Wistar macho
como se describe en [(16) Castilla-Cortazar, I.,
Garcia, M., Muguerza, B., Quiroga, J., Perez, R., Santidrian, S.,
Prieto, J. 1997. Hepatoprotective effects of
insulin-like growth factor I in rats with carbon
tetrachloride-induced cirrhosis. Gastroenterology
113:1682-1691]. Se realizó una HP de dos tercios u
operaciones simuladas en ratas Wistar macho (150g) y ratones
C57/BL6 macho (20g) de acuerdo con el método de Higgins y Andersen
[(17) Higgins, G. M., Andersen, R. M. 1931. Experimental pathology
of liver: restoration of liver of the white rat following partial
surgical removal. Arch. Pathol. 12:186-202. (18)
Latasa, M. U., Boukaba, A., Garcia-Trevijano, E.
R., Torres, L., Rodriguez, J. L., Caballería, J., Lu, S. C.,
López-Rodas, G., Franco, L., Mato, J. M., et
al. 2001. Hepatocyte growth factor induces MAT2A expression and
histone acetylation in rat hepatocytes. Role in liver regeneration.
FASEB J. 10.1096/fj.00-0556fje. (19) Chen, L.,
Zeng, Y., Yang, H., Lee, T.D., French, S.W., Corrales, F.J.,
García-Trevijano, E.R., Avila, M.A., Mato, J.M., and
Lu, S.C. 2004. Impaired liver regeneration in mice lacking
methionine adenosyltransferase 1A. FASEB J. 18:
914-916]. A los animales en que se practicó una
operación simulada, después de sedarlos, se les expuso el hígado y
luego se les retornó a la cavidad abdominal. Se indujo daño agudo
en el hígado en ratones macho C57/BL6 (20 g) (n=3-5
por condición y punto de tiempo) con una única inyección
intraperitoneal de CCl_{4}4 (1 \mul/g de peso corporal en
aceite de oliva) (Sigma, St. Louis, MO, USA) o anticuerpo
monoclonal Jo2 (4 \mug/ratón en solución salina) (BD PharMingen,
San Diego, CA, USA) [(5), (20) Martínez-Chantar,
M.L., Corrales, F.J., Martinez-Cruz, A.,
García-Trevijano, E.R., Huang, Z.Z., Chen, L.X.,
Kanel, G., Avila, M.A., Mato, J.M., Lu, S.C. 2002. Spontaneous
oxidative stress and liver tumors in mice lacking methionine
adenosyltransferase 1A. FASEB J.
10.1096/fj.02-0078fje]. Los controles recibieron el
volumen equivalente de aceite de oliva o solución salina. En los
casos indicados los ratones recibieron una inyección
intraperitoneal de AR recombinante humana (9,5 \mug/ratón)
(Sigma) 6 y 0,5 h antes y 3 h después del anticuerpo Jo2, ó 0,5 h
antes y 12 h después de CCl_{4}. En los puntos de tiempo
indicados los ratones se sometieron a extracción de sangre, y se
analizaron los sueros en cuanto a las alanina y aspartato
aminotransferasas (ALT y AST) como se describe en [(16) y (21)
Lasarte, J.J., Sarobe, P., Boya, P., Casares, N., Arribillaga, L.,
López-Díaz de Cerio, A., Gorraiz, M.,
Borrás-Cuesta, F., Prieto, J. 2003. A recombinant
adenovirus encoding hepatitis C virus core and El proteins protects
mice against cytokine-induced liver damage.
Hepatology 37: 461-470]. Los ratones se
sacrificaron por dislocación cervical y los hígados se congelaron
rápidamente en nitrógeno líquido, o se fijaron mediante formalina y
se embebieron en parafina para tinción con hematoxilina y eosina
(H&E).
Se aislaron hepatocitos de ratas Wistar (150g) y
de ratones C57/BL6 (20g) mediante perfusión con colagenasa
(Gibco-BRL, Paisley, UK) como se describe en [(18),
(20)]. Las células (5x10^{5} células por pocillo) se plaquearon
sobre placas de 6 pocillos recubiertos de colágeno (colágeno de
tipo I, Collaborative Biomedical, Bedford, MA, USA). Los cultivos
se mantuvieron en medio MEM suplementado con suero de ternera fetal
(FCS) al 10%, aminoácidos no esenciales, glutamina 2 mM y
antibióticos (procedentes, todos ellos, de
Gibco-BRL). Al cabo de 2 h de incubación, se retiró
el medio y las células se volvieron a cultivar en el mismo medio
con un 5% de FCS. Cuando procedió, los hepatocitos fueron tratados
con IL-1\beta o TNF\alpha de Roche (Mannheim,
Germany), HGF o forskolina de Calbiochem (San Diego, CA, USA), IL6
de RD Systems (Wiesbaden-Nordenstadt, Germany), o
PGE_{2} de Alexis QBiogene (Carlsbad, CA, USA).
La apoptosis fue inducida en hepatocitos de
ratón en cultivo mediante tratamiento con 0,5 \mug/ml de
anticuerpo Jo2 y 0,05 \mug/ml de actinomicina D como se describe
en (5). Cuando procedió, los hepatocitos fueron tratados con AR 6 h
antes de la adición del anticuerpo Jo2 y de la actinomicina D. La
apoptosis fue estimada por la determinación de complejos solubles
de histona-DNA utilizando el Cell Death Detection
Assay (Roche). Los ensayos de ELISA para determinar la muerte
celular se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. El enriquecimiento especifico de mono- y
oligonucleosomas liberados en el citoplasma (factor de
enriquecimiento, EF) se calculó como la relación entre los valores
de absorbancia de las muestras procedentes de las células tratadas
y de las células control. También se evaluó el efecto de AR sobre
la apoptosis mediada por Fas en presencia del inhibidor de MEK1,
PD98059, el inhibidor de la PI-3K,
LY-294002, y el inhibidor de la actividad tirosina
quinasa del EGF-R, PD153035, todos ellos de
Calbiochem.
Para la síntesis de DNA se plaquearon
hepatocitos de rata a una densidad de 3x10^{4} células/pocillo en
placas de 96 pocillos recubiertas de colágeno en medio MEM
suplementado con FCS al 10%. Cinco horas después del plaqueado, se
cambió el medio y las células se mantuvieron en ausencia de suero
durante 20 horas más. Se midió la síntesis de DNA tras un
tratamiento con AR de 30 h. Se administró un pulso de
[^{3}H]timidina (l\muCi/pocillo) (Amersham Biosciences,
Piscataway, NJ, USA) 22 h después de la adición de AR. Las células
fueron cosechadas y se determinó la incorporación de timidina en
contador de centelleo. Se evaluó el efecto de la AR sobre la
síntesis de DNA en presencia del inhibidor de MEK1, PD98059, del
inhibidor de PI-3K, LY294002, del inhibidor de la
p38 MAPK, SB202190, del inhibidor de JNK, SP600125, y del inhibidor
de la actividad tirosina quinasa del EGF-R,
PD153035, todos ellos de Calbiochem.
Los hepatocitos de rata en cultivo primario se
transfectaron 24 h después de su aislamiento empleando el reactivo
Tfx^{TM}-50 (Promega, Madison, WI, USA) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron las células
con una mezcla equimolar de plásmidos pCB6 que codificaban las
cuatro isoformas del WT1 (caracterizadas por la presencia o ausencia
de los exones 5 y KTS), o con una cantidad equivalente del vector
pCB6 vacío, suministrados por gentileza del Dr. Jochemsen (Leiden
University Medical Center, Leiden, Netherlands). Se monitorizó la
eficacia de la transfección de la mezcla equimolar de las cuatro
isoformas de WT1 mediante análisis por RT-PCR
utilizando cebadores específicos que discriminan estas
isoformas.
Se extrajo el RNA total utilizando el Reactivo
TRI (Sigma). Se trataron 2 \mug de RNA con DNasaI
(Gibco-BRL) antes de la transcripción inversa para
la que se empleó el enzima M-MLV
(Gibco-BRL) en presencia de RNasaOUT
(Gibco-BRL). Se utilizó 1/10 de cada preparación de
cDNA para cada PCR. Los productos de PCR se sometieron a
electroforesis en geles de agarosa al 2%, se tiñeron con bromuro de
etidio y se cuantificaron utilizando el software Molecular Analyst
(Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Los datos se
normalizaron con respecto a los niveles de expresión del gen de la
\beta-actina. Solamente se incluyeron en el
estudio las muestras con una amplificación comparable del mRNA de
la \beta-actina. Se designaron todos los cebadores
para distinguir entre la amplificación del DNA genómico y del cDNA
y se secuenció la totalidad de los productos para confirmar la
especificidad. Los cebadores utilizados se describen en la
siguiente Tabla I:
\vskip1.000000\baselineskip
La PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando
un iCycler (BioRad) y el iQ SYBR Green Supermix (BioRad). Para
monitorizar la especificidad de los productos de PCR finales se
analizaron por curvas de fusión y electroforesis. La cantidad de
cada transcrito fue expresada como n-veces la
diferencia con respecto a la expresión del gen de referencia
(\beta-actina) (2^{\Delta Ct}, donde \DeltaCt
representa la diferencia en el ciclo umbral entre los genes diana y
el gen control).
Se midió la actividad de la
caspasa-3 en hepatocitos de ratón y lisados de
tejido hepático utilizando el Kit de evaluación colorimétrica de
Caspasa-3/CPP32 (BioVision, Palo Alto, CA, USA).
Las células en cultivo (5x10^{5} por condición) fueron lisadas
directamente en el tampón de lisis del kit después de los
correspondientes tratamientos. El tejido hepático fue homogeneizado
con un homogeneizador Dounce en tampón de lisis y se centrifugó a
15.000 rpm durante 10 min. Se utilizaron los lisados celulares y
los sobrenadantes procedentes de los homogeneizados hepáticos (200
\mug en 50 \mul) para medir la actividad de la
caspasa-3 siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Los homogeneizados procedentes de las muestras
de hígado y los hepatocitos aislados se sometieron a análisis por
Western blot como se describe en [(19, (20)]. Los anticuerpos que
se utilizaron fueron: anticuerpo policlonal biotinilado y
purificado por afinidad, especifico para la AR de ratón (BAF989)
(RD Systems); anticuerpo específicos para: la subunidad p17 de
caspasa-3 activa (9664S), la Akt (Ser^{473})
fosforilada (9271S) y STAT3 (Tyr^{705}) fosforilado (9131S) (Cell
Signaling, Beverly, MA, USA); ERK1/2 (06-182),
EGF-R fosforilado (Tyr^{1173})
(05-483) y STAT3 (06-596) (Upstate
Biotechnology, Charlottesville, VA, USA). Todos los demás
anticuerpos procedían de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA,
USA): Bclx_{L} (sc8392), Bcl2 (sc7382), EGF-R
(sc-03), ERK1/2 (Tyra^{204}) fosforilado (sc7383),
Akt (sc5298), JNK (sc571), JNK (Thr^{183}/Tyr^{185}) fosforilado
(sc6254).
Los datos que se ajustaban a una distribución
normal fueron comparados entre grupos utilizando un
test-t de Student independiente y un análisis de
varianza. Los datos que no se ajustaban a una distribución normal
fueron comparados utilizando los tests de
Kruskal-Wallis y de Mann-Whitney. Se
evaluó la correlación mediante los coeficientes de correlación de
Spearman o Pearson. Valores de P<0.05 fueron considerados
significativos. Los datos se proporcionan como medias \pmSEM o
como medianas e intervalo interquartílico.
<110> PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA,
S.L.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE LA ANFIREGULINA COMO UN
AGENTE PROTECTOR EN EL DAÑO HEPÁTICO AGUDO
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Proyecto de Biomedicina CIMA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcctcgcct ttgccga
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> RATÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgcgcttc ttgccgc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> RATA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacctcctt gcagctc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgctgtga gttttcatgg ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> RATÓN O RATA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgctggtct taggctcagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctggaaga ccaccagact g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctggatcc tattactgca c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgaagctgc tgccgtcggt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcccagattc ccacactcag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtttctcac tggtctcaga tgccg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggtgcctg gggcg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> RATÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgacgccc tggtgtc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> RATA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggtgccta gggcg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtcgctct tgatactcgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> RATÓN O RATA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaggttctc gatgtatctg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccgctcgg acaccggtag c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaagcaatc acattcccag g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggatgcagt agtccttgta tttc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggacagcca gggccac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaatcagat gaacttagga g
\hfill21
Claims (8)
1. Uso de anfiregulina, caracterizado
porque la anfiregulina se utiliza en la fabricación de un
medicamento útil para el tratamiento del daño hepático agudo.
2. Uso de anfiregulina según la reivindicación
1, caracterizado porque dicho medicamento es útil para
potenciar una reacción protectora endógena primaria del tejido
hepático frente al daño hepático agudo.
3. Uso de anfiregulina según la reivindicación
1, caracterizado porque dicho medicamento es útil para
promover la síntesis de DNA en hepatocitos.
4. Uso de anfiregulina según la reivindicación
1, caracterizado porque dicho medicamento es útil para
prevenir la muerte de hepatocitos en tejido hepático en pacientes
con daño hepático agudo.
5. Uso de anfiregulina según la reivindicación
1, caracterizado porque dicho medicamento es útil para
estimular la regeneración del parénquima hepático remanente tras un
daño hepático agudo de cualquier etiología.
6. Uso de anfiregulina según la reivindicación
1, caracterizado porque dicho medicamento es útil como
fármaco hepatoprotector en pacientes con daño hepático agudo de
cualquier etiología.
7. Uso de anfiregulina según la reivindicación
1, caracterizado porque dicho medicamento es útil para
estimular la regeneración hepática tras una hepatectomía
parcial
8. Uso de anfiregulina según la reivindicación
1, caracterizado porque dicho medicamento es útil como
fármaco hepatoprotector y estimulante de la regeneraclon
hepatocitaria en pacientes receptores de transplante hepático de
vivo o de cadáver.
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| HUANG H.L. et al. "Epidermal growth factor for enhancing DNA synthesis of hepatocytes and its protecting effect on animals with liver injury". Oct. 1992. Zhonghua yi xue za zhi. Vol. 72 (10), páginas 604-607. Resumen. * |
| ISFORT et al. "The combination of epidermal growth factor and transforming growth factor-beta induces novel phenotypic changes in mouse liver stem cell lines". Dic. 1997. Journal of Cell Science, Vol. 110 (24), páginas 3117-3129. * |
| KOMURASAKI et al. "Mechanism of growth promoting activity of epiregulin in primary cultures of rat hepatocytes". 2002. Growth Factors. Vol. 20 (2), páginas 61-69. * |
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