ES2243926T3 - Proteina de union de fibronectina; anticuerpo monoclonal y su uso para prevenir la adhesion bacteriana. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN ANTICUERPO MONOCLONAL (MAB), O UN FRAGMENTO DEL MISMO, QUE SE UNE A UNO O MAS EPITOPOS DE UNA MATRIZ DE UNION A LA PROTEINA Y UN POLIPEPTIDO D1-D4 AISLADO A PARTIR DE UN "STAPHYLOCOCCUS AUREUS" FBP Y SU USO EN LA PREVENCION DE LA ADHESION DE BACTERIAS, EN PARTICULAR BACTERIAS GRAM POSITIVAS, A PROTEINAS DE MATRIZ EXTRACELULARES SOBRE DISPOSITIVOS DE RESIDENCIA O A PROTEINAS DE MATRIZ EN HERIDAS.

Description

Proteína de unión de fibronectina; anticuerpo monoclonal y su uso para prevenir la adhesión bacteriana.

La presente invención se refiere a los novedosos polipéptidos y anticuerpos monoclonales, su preparación y su uso para combatir la infección en el sitio de las heridas, implantes quirúrgicos, y otros dispositivos residentes como catéteres. La presente invención se refiere también a los ácidos nucleicos aislados que codifican los polipéptidos, y a las células huésped recombinantes transformadas con ADN codificante del polipéptido.

Una de las mayores complicaciones asociadas al uso clínico de materiales implantados y dispositivos residentes, es la infección bacteriana. En particular los estafilococos han estado frecuentemente implicados en infecciones relacionadas con dispositivos médicos (Dankert et al. 1986, CRC Rev Biocompatability 2, 219-301). Una vez establecida la infección, es virtualmente imposible de tratar, dando lugar al fallo del implante.

Se ha sugerido que la adhesión de un microorganismo a una superficie, es un paso inicial en el desarrollo de dichas infecciones (Quie and Belani, 1987, J. Infec. Dis. 156: 543-547) y ahora hay evidencia para sugerir que un mecanismo de adhesión específica está relacionado con la patogénesis de las infecciones de cuerpos extraños (Vaudaux et al. 1990, J. Biomat. Appl. 5: 134-153). Poco después de entrar en contacto con la sangre, los materiales inertes, tales como los usados en cánulas intravenosas e implantes prostéticos, son casi inmediatamente recubiertos por una capa de una matriz de proteínas extracelulares (Cottanaro et al. 1981, Transactions of the American Society for Artificial Internal Organs 27: 391-395). En particular, esta capa incluye la proteína del plasma fibronectina, y se cree que los estafilococos son capaces de unirse a fibronectina, a través de proteínas receptoras de la superficie celular de la bacteria, conocidas como proteína de unión a fibronectina (Fbp). Sin embargo, algunos estudios han sugerido que las proteínas de la sangre no promueven la adherencia de los estafilococos al bio-material (p.e. Muller et al. 1991, Infect. Immun. 59: 3323-3326), desaconsejando por tanto, la investigación de la interacción de esas bacterias con esas proteínas como una aproximación a la prevención de la adhesión a bio-materiales.

Las proteínas de unión a fibronectina han sido aisladas a partir de Staphylococcus aureus, y la secuencia de nucleótidos ha sido establecida posteriormente [Signas, C. et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 699-703; Jonsson, K. et al. (1991) Eur. J. Biochem. 202, 1041-1048] (FbpA y FbpB respectivamente). El dominio primario de unión a fibronectina de esta proteína, ha sido identificado como una unidad homóloga (usualmente de 38 aminoácidos) que se repite tres veces (región D1-D3), y aparece parcialmente repetida una cuarta vez (región D4).

Los intentos previos de combatir la adhesión de estafilococos a implantes, han estado unidos a la modificación de la superficie del material prostético, para disminuir la adhesión de proteínas; p.e. recubriendo con un material anti-adhesivo como es el PTFE, o acoplando antibióticos a la superficie (Kamal et al. 1991, J. Amer. Med. Assoc. 265, 2364-2368).

Ha habido también propuestas para usar fármacos anti-inflamatorios no-esteroideos para prevenir la adhesión de estafilococos a polímeros médicos (Farber and Wolff 1992, J. Infect. Dis. 166: 861-865).

EP0163623, EP0294349, EP0397633 y WO92/02555 desvelan ciertos polipéptidos de unión a fibronectinas, de S. aureus.

Una aproximación adoptada en la presente invención es el uso de un anticuerpo monoclonal que se una a la matriz de proteína de unión, la proteína de unión a fibronectina, para bloquear la adhesión de bacterias a la matriz de proteí-
nas.

Por consiguiente, la presente invención va dirigida en un amplio aspecto al uso de anticuerpos monoclonales (Mab), o fragmentos de los mismos, que se unen a uno o más epítopos, de D1-D4, de proteína de unión a fibronectina, para combatir la infección bacteriana, en particular la infección bacteriana por gram positivas, en el sitio de heridas, implantes quirúrgicos y otros dispositivos residentes. La invención se refiere particularmente a la fabricación de un medicamento con esos usos.

El efecto de los Mab o sus fragmentos, es bloquear el sitio de la proteína de unión a la matriz, que está asociado con la fusión a la proteína de la matriz.

Los dispositivos residentes incluyen implantes quirúrgicos, dispositivos prostéticos y catéteres, p.e., dispositivos que son introducidos en el cuerpo de un paciente, y se mantienen en esa posición durante largo tiempo. Estos dispositivos incluyen, por ejemplo, articulaciones artificiales, válvulas cardiacas, marcapasos, injertos vasculares, catéteres vasculares, drenajes de fluido cerebroespinal, catéteres urinarios, catéteres de diálisis peritoneal continua en ambulatorios, etc.

La invención está relacionada particularmente con el uso de anticuerpos monoclonales, que prevendrán la adhesión de estafilococos como el S. aureus, y estafilococos coagulasa-negativos como el S. epidermidis, en esos dispositivos residentes. Por consiguiente, el anticuerpo monoclonal se dirige preferiblemente contra los epítopos D1-D4 de la proteína de unión a fibronectina, derivada de esas bacterias.

La proteína de unión a la matriz que ha de ser reconocida por el anticuerpo monoclonal, es una proteína de unión a fibronectina. Se sabe que en la proteína de unión a fibronectina, una región identificada como el dominio D1-D4 es especialmente relevante en el enlace a fibronectina (Signas. C et al. 1989 op. cit).

Por lo tanto, el anticuerpo monoclonal es dirigido contra un epítopo presente en el dominio D1-D4 de la proteína de unión a fibronectina, o una unidad componente de la misma.

Los novedosos anticuerpos monoclonales descritos más arriba, y sus fragmentos, son otra parte de la invención.

El anticuerpo puede ser bien un anticuerpo intacto con M_{r} aproximadamente de 150.000, o bien un derivado del mismo, por ejemplo un fragmento Fab, o un fragmento Fv, tal como los descritos en Skerra, A. and Pluckthun, A. (1988) Science 240, 1039-1040. Si están presentes dos dominios de unión a antígeno, cada dominio puede ser dirigido contra un epítopo distinto, denominándose anticuerpos "biespecíficos".

El anticuerpo, o el derivado del mismo, puede ser preparado mediante medios convencionales, como por ejemplo mediante tecnología de anticuerpo monoclonal ya establecida (Kohler, G. and Milstein, C. (1975), Nature 256, 495-497), o usando medios recombinantes, p.e. bibliotecas combinatorias, tal como las descritas por ejemplo en Huse, W.D. et al., (1989) Science 246, 1275-1281.

Preferiblemente, el anticuerpo, o derivado, es preparado mediante la expresión de un polímero del ADN que codifica dicho anticuerpo, en un sistema de expresión adecuado. La elección del vector para el sistema de expresión será determinada en parte por el huésped, el cual puede ser una célula procariótica, como E.coli (preferiblemente de la cepa B) o Streptomyces sp., o una célula eucariótica, como la célula C127 de ratón, el mieloma de ratón, la HeLa humana, el ovario de hámster chino, hongos filamentosos o unicelulares, o célula de insecto. El huésped puede ser también un animal transgénico o una planta transgénica [tal como describen, por ejemplo, Hiatt, A. et al., (1989) Nature 34, 76-78]. Los vectores apropiados incluyen plásmidos, bacteriófagos, cósmidos y virus recombinantes, derivados de, por ejemplo, bacilovirus y virus de la viruela.

El fragmento Fab puede ser preparado también a partir del anticuerpo monoclonal "padre", mediante tratamiento enzimático, usando por ejemplo papaína para cortar la porción Fab de la porción Fc.

El anticuerpo monoclonal puede ser generado inicialmente, usando proteína de unión a fibronectina como inmunógeno, o la región D1-D4 de la proteína de unión a fibronectina.

Se sabe que la proteína de unión a fibronectina de Staphylococcus aureus existe en al menos dos variantes, FbpA y FbpB [Jonsson et al. (1991), op. cit.].

El dominio de unión de cualquiera de las proteínas de unión a fibronectina mencionadas arriba, puede ser usado como inmunógeno para generar una Mab de esta invención.

Creemos que ya tenemos identificado como un novedoso compuesto, una nueva proteína de unión a fibronectina a partir de S. aureus J2385 (ver Ejemplo 2 en particular).

En particular, hemos aislado como un novedoso compuesto, un polipéptido que comprende esencialmente la región D1-D4 del Fbp de S. aureus J2385.

El Staphylococcus aureus J2385 ha sido depositado en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), Aberdeen, Scotland, bajo el número NCIMB 40532, el 18 de diciembre de 1992.

La región D1-D4 tiene la secuencia de aminoácidos representada más abajo, en la Tabla 2.

Este nuevo polipéptido D1-D4, y sus derivados equivalentes inmunológica y antigénicamente, representan otro aspecto de esta invención.

El término "derivado antigénicamente equivalente", tal como es usado aquí, abarca un péptido, o su equivalente, que puede ser reconocido específicamente por ciertos anticuerpos los cuales, una vez elevados a péptidos de acuerdo con la presente invención, bloquean la adhesión de estafilococos a los dispositivos médicos residentes.

El término "derivado inmunológicamente equivalente" tal como es usado aquí, abarca un péptido, o su equivalente, que cuando es utilizado en una formulación apropiada para aumentar los anticuerpos en un vertebrado, los anticuerpos actúan bloqueando la adhesión de estafilococos a los dispositivos médicos residentes.

En particular, pueden ser usados los derivados que son ligeramente más largos o ligeramente más cortos que el péptido de la presente invención. Adicionalmente, pueden ser usados los péptidos en los que uno o más de los residuos de aminoácidos son modificados antes o después de que el péptido sea sintetizado. Estos péptidos pueden, por ejemplo, ser preparados mediante sustitución, adición, o reorganización de aminoácidos, o por modificación química de los mismos. Todas estas sustituciones y modificaciones son generalmente bien conocidas por los expertos en la materia de la química de péptidos.

El polipéptido D1-D4 puede ser obtenido por expresión del plásmido pBROC520 dentro de Escherichia coli. La preparación de este plásmido, y la expresión y purificación de los polipéptidos D1-D4, son descritos más abajo, en los Ejemplos.

El ADN codificante de este polipéptido es otro aspecto de esta invención. La secuencia de nucleótidos es mostrada más abajo, en la Tabla 1.

Otros polipéptidos D1-D4, p.e. de FbpA o de FbpB, pueden ser expresados similarmente mediante preparación análoga de plásmidos apropiados a partir del ADN cromosómico.

El ADN codificante del polipéptido D1-D4 de FbpA es mostrado abajo, en la Tabla 1.

El polipéptido D1-D4, o un polipéptido equivalente antigénica o inmunológicamente, o una proteína de fusión de los mismos, se usa para inmunizar a un ratón, u otro animal como una rata o una gallina. La proteína de fusión puede proporcionar estabilidad al polipéptido. El antígeno puede estar asociado, por ejemplo por conjugación, con una proteína transportadora inmunogénica, por ejemplo la albúmina de suero bovino (BSA) o la hemocianina de lapa (KLH). Alternativamente, un péptido antigénico múltiple que comprenda múltiples copias del polipéptido D1-D4, o un polipéptido antigénica o inmunológicamente equivalente del mismo, puede ser suficientemente antigénico como para mejorar la inmunogenicidad, de tal modo que se pueda obviar el uso de un transportador.

Utilizando el procedimiento de Kohler y Milstein (1975, Nature 256, 495-497), las células que contienen anticuerpos, provenientes de mamífero inmunizado, son fusionadas con células de mieloma, para crear células hibridoma que secretan anticuerpos monoclonales.

Los hibridomas son monitorizados para seleccionar una línea celular con una alta afinidad de unión y reacción cruzada favorable con otras especies de estafilococos, usando uno o más de los Fbp originales, polipéptidos D1-D4 y/o proteína de fusión. La línea celular seleccionada es cultivada para obtener la Mab deseada.

Las líneas celulares de hibridoma que secretan el anticuerpo monoclonal son otro de los aspectos de esta invención.

La tecnología alternativa de despliegue de fagos podría ser utilizada para seleccionar los genes de los anticuerpos con actividad de enlace a Fbp o D1-D4, tanto a partir de repertorios de PCR amplificada de v-genes de linfocitos de humanos, revisados para ver si tenían anti-Fbp, o bien a partir de bibliotecas primitivas (McCafferty, J. et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, J. et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de esos anticuerpos puede ser mejorada también mediante barajado de cadena (Clackson, T. et al., (1991) Nature 352, 624-
628).

Preferiblemente, el anticuerpo o derivado del mismo, es modificado para hacerlo menos inmunogénico en el paciente. Por ejemplo, si el paciente es humano, puede ser más preferible que el anticuerpo sea "humanizado"; la/s región/es del anticuerpo derivado del hibridoma, que determinan la complementariedad, han sido transplantadas a un anticuerpo monoclonal humano, tal como se describe, por ejemplo, en Jones, P. et al. (1986), Nature 321, 522-525, o Tempest et al. (1991) Biotechnology 9, 266-273.

La modificación no necesita estar restringida a la "humanización": pueden ser usadas otras secuencias de primates (por ejemplo Newman, R. et al. 1992, Biotechnology 10, 1455-1460).

El anticuerpo debería ser revisado una vez más, para lograr la alta afinidad por Fbp, por el polipéptido D1-D4, y/o la proteína de fusión.

Tal como se mencionó antes, puede prepararse un fragmento del anticuerpo final.

El anticuerpo monoclonal humanizado, o sus fragmentos con actividad enlazadora, representan un aspecto más de esta invención.

En otro aspecto amplio, la invención proporciona un polipéptido D1-D4 aislado a partir de un Fbp de Staphylococcus aureus, y su uso para combatir la infección bacteriana, en particular la infección bacteriana con gram positivas, en el sitio de: heridas, implantes quirúrgicos, y otros dispositivos residentes. La invención incluso se refiere a la fabricación de un medicamento para esos usos.

En particular, las bacterias gram positivas incluyen estafilococos como S. aureus, y estafilococos coagulasa-negativos como S. epidermidis.

El término polipéptido D1-D4 aislado, se refiere a un polipéptido constituido por las regiones enteras D1, D2, D3 y D4, terminando opcionalmente en PIVP, y opcionalmente de una a cinco regiones de pared (WR) de Fbp de Staphylococcus auereus, por secuencia.

Dependiendo del sistema de expresión del huésped, el polipéptido puede incluir un residuo metionina N-terminal.

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Las regiones nombradas arriba, corresponden a las siguientes regiones de FbpA, tal como se describe en Signas et al. (1989), op. cit.:

D1 \hskip0.2cm G709-H746	WR1 \hskip0.2cm P843-T856
D2 \hskip0.2cm G747-H784	WR2 \hskip0.2cm P857-T870
D3 \hskip0.2cm G785-S823	WR3 \hskip0.2cm P871-T884
D4 \hskip0.2cm G824-P838	WR4 \hskip0.2cm P885-K898
	WR5 \hskip0.2cm P899-K912

En un aspecto preferido, el polipéptido contiene hasta tres regiones de pared. Formas de realización preferidas, consisten en residuos correspondientes a los residuos G709 a T886, y G709 a P838 (opcionalmente donde P838\rightarrowT), de FbpA de Staphylococcus aureus. El Fbp proviene preferiblemente de Staphylococcus aureus J2385, con la secuencia dada en la Tabla 2.

Esta invención también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas, que codifican el péptido, incluyendo mARNs, ADNs y cADNs.

Esta invención también proporciona vectores recombinantes, tales como plásmidos de clonación y expresión, útiles como reagentes en la producción recombinante de los polipéptidos, además de células huésped procariotas y/o eucariotas que contienen la nueva secuencia de ácido nucleico.

Un "replicón" es cualquier elemento genético (p.e. plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo; es decir, capaz de replicación bajo su propio control.

Un "vector" es un replicón, como un plásmido, fago o cósmido, al cual puede unírsele otro segmento de ADN, y comenzar la replicación del mismo.

Una "molécula de ADN de doble hebra" se refiere a la forma polimérica de los desoxirribonucleótidos (las bases adenina, guanina, timina, o citosina) en una hélice de doble hebra, ambas relajadas y sobre-enrrolladas. Este término se refiere solamente a las estructuras primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria en particular. Por tanto, este término incluye ADN de doble hebra encontrado, entre otras cosas, en moléculas de ADN lineal (p.e. fragmentos de restricción), viruses, plásmidos, y cromosomas. Al discutir la estructura de las moléculas particulares de ADN de doble hebra, las secuencias pueden ser descritas aquí, de acuerdo con la convención normal de dar solamente la secuencia en la dirección 5' a 3', a lo largo de la hebra no-transcrita de ADN (es decir, la hebra que tiene la secuencia homóloga al mARN).

Una "secuencia codificante de" ADN, o una secuencia de nucleótidos codificantes de una proteína en particular, es una secuencia de ADN que es transcrita y traducida a un polipéptido una vez que se sitúa bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas.

Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unir ARN polimerasa en una célula, y de iniciar la transcripción de una secuencia codificante en dirección inferior (dirección 3'). Con el propósito de definir la presente invención, la secuencia promotora se une al término 3' mediante un codón de comienzo de la traducción (p.e. ATG) de una secuencia codificante, y se extiende en dirección superior (dirección 5') para incluir el mínimo número de bases, o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables sobre el trasfondo. Junto con la secuencia promotora, se encontrará un sitio de iniciación de la transcripción (definida convenientemente mediante mapeo con nucleasa S1), además de dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucarióticos a menudo, aunque no siempre, contienen cajas "TATA" y cajas "CAT". Los promotores procarióticos contienen secuencias Shine-Dalgarno, en adición a las secuencias consenso -10 y -35.

Las "secuencias de control" de ADN se refieren colectivamente a secuencias promotoras, sitios de unión a ribosomas, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios de regulación del sentido superior, mejoradores, y similares, los cuales proporcionan de manera colectiva la expresión (es decir, la transcripción y traducción) de una secuencia codificante en una célula huésped.

Una secuencia de control "dirige la expresión" de una secuencia codificante en una célula, cuando la ARN polimerasa se una a la secuencia promotora y transcriba la secuencia codificante a mARN, el cual es entonces traducido al polipéptido codificado por la secuencia codificante.

Una "célula huésped" es una célula que ha sido transformada o transfectada, o que es capaz de transformación o transfección mediante una secuencia de ADN exógeno.

Una célula ha sido "transformada" por ADN exógeno cuando este ADN exógeno ha sido introducido dentro de la membrana celular. El ADN exógeno puede estar, o no, integrado (unido covalentemente) en el ADN cromosómico, ensamblándose al genoma de la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, el ADN exógeno puede estar mantenido en un elemento episomal, como es un plásmido. Con respecto a células eucarióticas, una célula transformada o transfectada establemente es aquella en la cual el ADN exógeno se ha integrado en el cromosoma, de tal manera que será heredado por las células hijas a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad es demostrada por la capacidad de las células eucarióticas de establecer líneas celulares o clones, constituidas por una población de células hijas que contienen el ADN exógeno.

Un "clon" es una población de células derivadas de una célula única, o ancestro común, por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria, capaz de crecimiento in vitro estable durante muchas generaciones.

Una región "heteróloga" de una construcción de ADN, es un segmento identificable de ADN al cual está unida otra molécula de ADN, a la cual no encontramos en la naturaleza en asociación con la otra molécula.

Esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada, que codifica al polipéptido. Los ácidos nucleicos aislados, particularmente los ADNs, pueden ser introducidos en vectores de expresión, enlazando operativamente el ADN a las regiones de control de expresión necesarias (p.e. regiones reguladoras) requeridas para la expresión de los genes. Los vectores pueden ser introducidos en las células huésped indicadas, ya sean células procarióticas (p.e. bacterias) o células eucarióticas (p.e. levaduras, de insecto, o de mamífero), mediante métodos bien conocidos en el oficio (Ausubel et al., supra). Las secuencias codificantes para las proteínas deseadas, que han sido preparadas o aisladas, pueden ser clonadas en un vector o replicón apropiado. Son conocidos numerosos vectores de clonación, por parte de los expertos en la materia, y la selección de un vector de clonación apropiado es una cuestión de elección. Ejemplos de vectores de ADN recombinante para la clonación, y de células huésped a las que puedan transformar, incluyen al bacteriófago \lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacteria gram-negativa), pGV1106 (bacteria gram-negativa), pLAFR1 (bacteria gram-negativa), pME290 (bacteria gram-negativa no-E. coli), pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), un sistema de bacilovirus de célula de insecto, YCp9 (Saccharomyces). Ver generalmente, "DNA Cloning": Vols. I & II, GLover et al ed. IRL Press Oxford (1985) (1987) y; T. Maniatis et al. ("Molecular Cloning" Cold Spring Harbor Laboratory (1982)).

Los genes pueden ser puestos bajo el control de un promotor, sitio de unión a ribosomas (para expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador (aquí referido colectivamente como elementos de "control"), de tal modo que la secuencia de ADN codificante de la proteína deseada, es transcrita a ARN dentro de la célula huésped transformada por un vector que contiene esta construcción para la expresión. La secuencia codificante puede, o no, contener un péptido señal o secuencia guía. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser expresados usando, por ejemplo, el promotor tac de E. coli, o el promotor y secuencia señal del gen (spa) de la proteína A. La secuencia guía puede ser eliminada por el huésped bacteriano durante el procesamiento post-traducción. Ver, p.e., U.S. Patent Nos. 4,431,739; 4,425,437; 4,338;397.

En adición a las secuencias de control, puede ser deseable el añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de las secuencias de la proteína relacionadas con el crecimiento de la célula huésped. Los expertos en la materia conocen esas secuencias reguladoras, y sus ejemplos incluyen a aquellas que causan la activación o la inactivación de la expresión de un gen, en respuesta a un estímulo físico o químico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Otros tipos de elementos reguladores pueden estar presentes también en el vector, por ejemplo, secuencias mejoradoras.

Un vector de expresión es construido de tal modo que la secuencia codificante particular está situada en el vector junto con las secuencias reguladoras apropiadas, siendo tal el posicionamiento y la orientación de la secuencia codificante con respecto a las secuencias de control, que la secuencia codificante es transcrita bajo el "control" de las secuencias de control (es decir, la ARN polimerasa que se une a la molécula de ADN en las secuencias de control, transcribe la secuencia codificante). La modificación de las secuencias codificantes puede ser deseable para conseguir este fin. Por ejemplo, en algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia de tal modo que pueda ser fijada a las secuencias de control con la orientación apropiada; es decir, para mantener el marco de lectura. Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras, pueden estar ligadas a la secuencia codificante anteriormente a la inserción en un vector, tal como sucede con los vectores de clonación descritos más arriba. Alternativamente, la secuencia codificante puede ser clonada directamente en un vector de expresión que ya contenga las secuencias de control, y un sitio de restricción apropiado.

En algunos casos, puede ser deseable añadir secuencias que causen la secreción del polipéptido a partir del organismo huésped, con la posterior escisión de la seña de secreción.

Se conocen varios vectores de expresión procarióticos en el oficio. Ver, p.e., U.S. Patent Nos. 4,578,355; 4,440,859; 4,436,815; 4,431,740; 4,431,739; 4,428,941; 4,425,437; 4,418,149; 4,411,994; 4,366,246; 4,432;832; ver también U.K. Patent Applications GB 2,121,054; GB 2,008,123; GB 2,007,675; y la European Patent Application 103,395. Los vectores de expresión en levadura son también conocidos en el oficio. Ver, p.e., U.S. Patent Nos. 4,446,235; 4,443,539; 4,430,428; ver también European Patent Applications 103,409; 100,561; 96,491. pSV2neo (tal como se describe en J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341), el cual usa el promotor tardío SV40 para conducir la expresión en células de mamífero, o pCDNA1neo, un vector derivado de pCDNA1 (Mol. Cell Biol. 7:4125-29), el cual usa el promotor CMV para dirigir la expresión. Estos dos últimos vectores pueden ser empleados para una expresión transitoria o una estable (usando la resistencia a G418) en células de mamífero. Los sistemas de expresión en célula de insecto, p.e. Drosophila, son también muy útiles, ver por ejemplo las PCT applications WO 90/06358 y WO 92/06212, además de la aplicación EP0290261.

Dependiendo del sistema de expresión y del huésped seleccionado, el polipéptido de la presente invención puede ser producido por crecimiento de las células huésped transformadas por un vector de expresión descrito más arriba, bajo condiciones en las cuales el polipéptido que interesa, sea expresado. El polipéptido es entonces aislado de las células huésped, y purificado. Si el sistema de expresión secreta al polipéptido al medio de crecimiento, el polipéptido puede ser purificado directamente a partir del medio. Si el polipéptido no es secretado, entonces es aislado a partir de los lisados celulares, o recuperado de la fracción de membrana celular. La selección de las condiciones de crecimiento apropiadas, y de los métodos de recuperación, están incluidas en el conocimiento del oficio.

Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende el polipéptido D1-D4, o Mab, o fragmentos activos, y un transportador farmacéuticamente aceptable.

En terapia, o como un profiláctico, el polipéptido D1-D4, o Mab, o fragmento, puede ser administrado al paciente como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

Alternativamente, la composición puede ser formulada para aplicación tópica, por ejemplo en forma de pomadas, cremas, lociones, pomadas oculares, gotas para los ojos, gotas para los oídos, enjuague bucal, paños impregnados, y suturas y aerosoles, y puede contener aditivos convencionales apropiados, incluyendo por ejemplo, preservadores, solventes para ayudar a la penetración del fármaco, y emolientes en las pomadas y cremas. Estas formulaciones tópicas pueden contener también transportadores convencionales, por ejemplo bases de crema o pomadas, y etanol u alcohol oleico para las lociones. Estos transportadores pueden constituir entre el 1% y el 98% por peso de la formulación; mas usualmente, constituirán hasta el 80% en peso de la formulación.

La composición de la invención puede ser administrada por inyección, para alcanzar un efecto sistémico contra bacterias relevantes poco antes de la inserción de un dispositivo residente. El tratamiento puede ser continuado tras la cirugía, durante en tiempo que el dispositivo esté dentro del cuerpo. Adicionalmente, la composición podría ser usada también para una amplia cobertura peri-operativa en cualquier técnica quirúrgica, o para prevenir infecciones de estafilococos en heridas.

Muchos cirujanos ortopédicos consideran que los pacientes con articulaciones protésicas deberían ser tratados con profilaxis antibiótica antes del tratamiento dental que podría producir una bacteriemia. Una posterior infección profunda es a veces una seria complicación, que lleva a la pérdida de la articulación protésica, y es acompañada de una significativa morbidez y mortalidad. Por tanto puede ser posible extender el uso del polipéptido D1-D4, o un anticuerpo monoclonal terapéutico como reemplazo para antibióticos profilácticos en esta situación.

Para la administración a pacientes humanos, se espera que el nivel de dosis diario del agente activo esté entre los 0,01 y los 10 mg/kg, típicamente alrededor de 1 mg/kg. El médico, en cualquier caso, determinará la dosis real que será más indicada para un paciente individual, y variará con la edad, el peso, y la respuesta del paciente particular. Las dosis mencionadas arriba, son ejemplares del caso medio. Puede haber, por supuesto, casos particulares en donde sean necesarias escalas mayores o menores de dosis, y esto está incluido en el alcance de esta invención.

Con la escala indicada de dosis, con los compuestos de la invención no se observarán efectos toxicológicos adversos, lo cual podría excluir su administración a pacientes apropiados.

Adicionalmente a la terapia descrita más arriba, las composiciones de esta invención pueden ser utilizadas generalmente como un agente para el tratamiento de heridas, para prevenir la adhesión de bacterias a la matriz de proteínas, especialmente fibronectina, expuesta en el tejido dañado, y para uso profiláctico en el tratamiento dental, como alternativa a, o en conjunción con, profilaxis antibiótica. Alternativamente, la composición de la invención puede ser utilizada para lavar un dispositivo residente, inmediatamente antes de la inserción. Para el lavado de heridas o dispositivos residentes, el agente activo estará presente preferiblemente a una concentración de entre 1 \mug/ml y 10 mg/ml.

Los Mabs o fragmentos descritos arriba, pueden ser utilizados también como reagentes diagnósticos, para detectar la presencia de bacterias que contengan Fbp, de Fbp en si mismo, o del polipéptido D1-D4 del Fbp.

También, mientras los aspectos de anticuerpo monoclonal de esta invención han sido descritos primariamente en términos de utilización del polipéptido D1-D4 o de Fbp para generar los anticuerpos, el Fbp en si mismo puede ser usado claramente como antígeno en el programa de inmunización inicial.

Los siguientes Ejemplos ilustran la preparación de polipéptidos D1-D4 para su uso como antígenos, y como agentes anti-adhesivos.

Ejemplos Reagentes clave usados en la preparación, aislamiento y análisis de polipéptidos D1-D4, y referencias a, en los Ejemplos a) Construcción del vector pBROC413

El plásmido pT7-7 [Tabor, S (1990), Current Protocols in Molecular Biology, F.A.Ausubel, Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, and K.Struhl, eds.] pp.16.2.1-16.2.11. Greene Publishing and Willey-Interscience, New York.] contiene AND correspondiente a los nucleótidos 2065-4362 del pBR322, y al igual que el pBR322, puede ser movilizado por un plásmido conjugativo, en presencia de un tercer plásmido ColK. Una proteína de movilidad codificada por ColK actúa sobre el sitio nic, en el nucleótido 2254 del pBR322, iniciando la movilización a partir de este punto. pT7-7 fue digerido con LspI y BglII, y los finales 5' fueron rellenados con el fragmento Klenow de ADN polimerasaI. El fragmento de ADN del plásmido fue purificado mediante electroforesis de gel de agarosa, los finales romos se ligaron juntos, y se transformaron en un DH1 de E. coli mediante electroporación, usando un Gene Pulser de Bio-Rad, y siguiendo las condiciones recomendadas por el fabricante. El plásmido pBROC413 resultante (Fig. 1) fue identificado mediante análisis de enzima de restricción del ADN del plásmido.

La supresión en pBROC413, a partir del sitio LspI inmediatamente por encima, en sentido superior, del promotor \phi10, hasta el sitio BglII en el nucleótido 434 del pT7-7, elimina el ADN correspondiente a los nucleótidos 2065-2297 del pBR322. El sitio nic y las secuencias adyacentes son por tanto eliminadas, haciendo no movilizable al pBROC413.

b) Preparación de la sonda de fibronectina biotinilada

La fibronectina (FN) fue purificada a partir de una fracción de plasma humano (una donación del Dr. D.Pepper, Scottish Blood Transfusion Service) en gelatina de sefarosa, esencialmente tal como describe Miekka et al. (1982) Thromb. Res. 27, 1-14.

11,2 mg FN (2,0 ml) en Tris 0,05 M/NaCl 0,1 M pH 7.5, fueron hechos 1,0 mg/ml mediante la adición de 9,2 ml de tampón Na_{2}B_{4}O_{7} 0,05 M pH 8.6. A la mezcla se le añadió 80 \mul de N-hidroxisuccinimidobiotin (Amersham UK), a partir de una reserva de 5,0 mg/ml en dimetilformamida seca, y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora, con agitación constante. La reacción se finalizó mediante intercambio de tampón en un tampón fosfato salino A de Dulbecco, conteniendo 0,1% (peso/volumen) de albúmina de suero bovino (BSA), usando cinco columnas de Sephadex G25 (PD10, Pharmacia).

c) Síntesis de Sefarosa CL4B de fibronectina

100 mg de fibronectina humana, purificados tal como se describe arriba, fueron unidos a 7 g de Sefarosa CL4B cianógena, activada por bromuro, (Pharmacia), a temperatura ambiente de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes, para producir 25 ml de matriz en gel. Antes de usarla, la FN-Sefarosa fue lavada con todos los tampones utilizados en la purificación posterior.

Numeración de los residuos de aminoácidos en los Ejemplos

En los siguientes ejemplos, la numeración de los residuos de aminoácidos se corresponde a los residuos de FbpA, de acuerdo con Signas et al. (1989) op. cit. Los residuos 709-838 de FbpA se corresponden a los residuos 1-130 de la secuencia de S. aureus J2385 dada en la Tabla 2, y los residuos 709-886 se corresponden a los residuos 1-174.

Ejemplo 1 Aislamiento del ADN de Staphylococcus aureus J2385 codificante para los dominios de unión a fibronectina, de la proteína de unión a fibronectina

S. aureus J2385 es una cepa B descrita en Cookson et al. [1987] THE LANCET of August 15th, page 387. Esta es una cepa clínica derivada de una lesión de piel. El ADN cromosómico fue preparado mediante el tratamiento con lisostafina, de las células recolectadas de un frasco de cultivo agitado durante toda una noche, para lisarlas, y con fenol/cloroformo para eliminar la proteína celular. A partir de esta preparación de ADN sin purificar, el fragmento de ADN codificante de los dominios de unión a fibronectina, de la proteína de unión a fibronectina, fue obtenido mediante una reacción de amplificación PCR. Los oligonucleótidos cebadores usados en la reacción PCR fueron:

FIB 1

\hskip0.7cm

5'-GGGAATTCATATGGGCCAAAATAGCGGTAACCAGTC-3'

FIB 2

\hskip0.7cm

5'-GCGGATCCTTACGTTGGTGGCACGATTGGAGGTG-3'

La amplificación PCR fue llevada a cabo usando ADN cromosómico de S. aureus J2385 (10 ng), FIB 1 (1 micromolar), FIB 2 (1 micromolar), Tris-HCl pH 8.3 (10 mM), KCl (50 mM), MgCl2 (1,5 mM), gelatina (0,001%), Na dGTP (200 micromolar), Na dATP (200 micromolar), Na dTTP (200 micromolar), Na dCTP (200 micromolar) y ADN polimerasa Taq (2,5 unidades), en un volumen final de 100 microlitros compuestos de agua destilada. La solución acuosa fue recubierta con 80 microlitros de parafina líquida, y sometida a 30 ciclos de 94ºC (1 minuto), 60ºC (1 minuto), y 72ºC (2 minutos), para permitir que ocurriera la amplificación. Cuando se examinaron 10 microlitros de la reacción acuosa, tras la amplificación, mediante electroforesis en gel de agarosa 1,5%, en presencia de bromuro de etidio (0,5 microgramos/ml), se observó por comparación con una muestra de fragmentos de ADN de tamaño conocido, que se obtuvo una única especie de fragmento de ADN de aproximadamente 500 pares de bases.

Ejemplo 2 Obtención de la secuencia del fragmento de ADN obtenido por amplificación PCR del ADN cromosómico de S. aureus J2385, usando cebadores FIB 1 y FIB 2

El tamaño del fragmento PCR obtenido (aproximadamente 500 pb), usando condiciones descritas en el Ejemplo 1, fue inesperado, puesto que los cebadores FIB 1 y FIB 2 fueron diseñados para ser homólogos a los sitios en el gen de la proteína de union a fibronectina (tal como se describe en Signas C., et al. [1989] P.N.A.S. USA vol 86,699-703) de S. aureus, los cuales, según se había informado, tenían aproximadamente 400 pb aparte. Para autentificar la naturaleza del fragmento de ADN, este fue clonado en un pUC19, y luego secuenciado. El ADN de una reacción PCR fue incubado con enzimas de restricción Eco RI y Bam HI, y luego clonado en un pUC19 tratado similarmente [Yanisch-Perron, C. et al. (1985) Gene 33, 103], y después secuenciado para crear pBROC519a. Como el proceso PCR introduce, de manera ocasional, supresiones y sustituciones de bases en el ADN amplificado, se mantuvieron clones similares de ADN J2385 para co-secuenciar junto con pBROC519a, para confirmar los resultados. pBROC519a fue secuenciado en ambas hebras usando el kit SEQUENASE II obtenido de United States Biochemical. La secuencia obtenida, desveló que el fragmento clonado codificaba 525 pb. del ADN J2385 de S. aureus. Cuando la secuencia fue comparada con la publicada por Signas et al. (loc. cit.), fue evidente que era extensivamente homóloga a la región 2350-2885 de aquel gen de S. aureus (usando la numeración de Sigmas et al.), pero tenía diferencias significativas (ver Tabla 1). En particular, la secuencia de aminoácidos derivada, mostraba diferencias en los aminoácidos respecto a la secuencia publicada, en los residuos 752 (ASN\rightarrowASP), 803 (SER\rightarrowASN), 821 (LYS\rightarrowGLN), 825 (GLN\rightarrowHIS), y una supresión de cuatro aminoácidos (838\rightarrow841), ver Tabla 2. Estas diferencias fueron confirmadas mediante secuenciación de clones independientes de ADN amplificado por PCR. Cuando la secuencia de aminoácidos derivados, obtenida del ADN de S. aureus J2385, fue comparada con las regiones correspondientes de la proteína de unión a fibronectina, tipo A, de S. aureus (Signas et al. [1989]), y de la proteína tipo B de S. aureus (Jonsson et al. [1991] EUR. J. BIOCHEM. vol 202, pages 1041-1048), fue claro que los dominios de unión a fibronectina de la proteína J2385 de S. aureus, eran muy similares a los respectivos dominios tanto de la proteína A como de la proteína B, pero no eran idénticas a ninguna de ellas (Tabla 2). Esto sugirió que la proteína J2385 de S. aureus debería ser denominada
Tipo C.

Ejemplo 3 Preparación de pBROC520 en BL21 (DE3) de E. coli

Para expresar el fragmento de proteína codificado por el ADN J2385 de S. aureus clonado, se usó el sistema de expresión polimerasa/promotor T7, tal como se describe en Tabor, S. (ver Current Protocols in Molecular Biology [F. A. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith and K. Struhl, eds.] pp.16.2.1-16.2.11. Green Publishing and WiIley-Interscience, New York). El huésped fue BL21 (DE3) de E. coli, el cual expresa de modo provocado, el gen de la polimerasa T7 (ver Studier F.W. and Moffat B.A. [1986] J. Mol. Biol. vol. 189, 113-130).

El fragmento BamHI/NdeI de 0,5 kb, del ADN derivado del J2385 de S. aureus, fue aislado del pBROC 519a (3 microgramos) mediante digestión por enzima de restricción, y electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión. Este material (100 nanogramos) fue usado en una reacción de ligado con el ADN pBROC 413 digerido con BamI/NdeI (500 nanogramos). El ADN ligado fue electrotransformado en Delta M15 de E. coli (ver Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. editors [1989] Molecular Cloning, A Laboratory Manual (second edition) page 2.57, para detalles de la mutación lacZ Delta M15), y los transformantes fueron seleccionados sobre agar LB con ampicilina (50 microgramos/ml).

Las preparaciones de ADN de plásmido fueron hechas a partir de cinco colonias resistentes a ampicilina, y todas fueron mostradas mediante mapeo de los sitios de restricción de enzimas, para el pBROC 413 que llevara el fragmento de ADN derivado, de S. aureus. Una de las preparaciones de plásmido (denominada pBROC 520) fue utilizada para transformar la BL21 (D3) de E. coli, para dar la combinación huésped/construcción de expresión deseada. pBROC 520 codifica el péptido mostrado en la SEC ID NO:6, referida más adelante como D1-D4 (709-886).

Ejemplo 4 Expresión, aislamiento y purificación del polipéptido D1-D4 (709-886) de J2385, expresado a partir de pBROC 520 en BL 21 (D3) de E. coli a) Expresión

Las colonias individuales de BL21 (DE3) de E. coli que tienen tanto el plásmido pBROC 413 (no-codificante) como el pBROC 520 (codificante de D1-D4 (709-886)) fueron inoculadas en contenedores tapados (universales) de 30 ml, conteniendo 10 ml de medio NZCYM (1% (p/v) de Bactotriptona, 0,5% (p/v) de extracto de levadura Bacto, 0,5% (p/v) de NaCl, 0,1% (p/v) de ácidos casamino, y 0,2% (p/v) de MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O pH 7.0) y 75 \mug/ml de ampicilina. Los cultivos fueron incubados a 37ºC, 230 rpm, durante toda la noche. Los cultivos que permanecieron toda la noche, fueron utilizados para inocular 250 ml de medio NZCYM que contenía 150 \mug/ml de ampicilina. Los cultivos fueron incubados a 37ºC, 230 rpm, hasta que la A_{600} alcanzó las 0,5 unidades de absorbancia. Los cultivos fueron entonces inducidos con IPTG (Isopropiltio-\beta-D-galactosida) 1 mM, e incubados bajo las mismas condiciones, durante las siguientes 4 horas. Se extrajeron muestras de 1 ml antes de la inducción, y 1,2,3 y 4 horas después de la inducción. Cada muestra fue girada en una centrifugadora eppendorf durante 1 minuto, después de lo cual el sobrenadante fue extraído. Los sedimentos fueron entonces resuspendidos en 100 \mul de tampón reducido (Tris HCl pH 6.8 50 mM, ditiotreitol (DTT) 100 mM, azul de bromofenol 0,1% (p/v), SDS 2% (p/v), glicerol 10% (v/v)), o tampón no-reducido (el DTT es omitido). Las muestras fueron calentadas durante 3 minutos a 90ºC, antes de ser almacenadas a -40ºC.

b) Detección del producto expresado

Los sedimentos de E. coli resuspendidos, conteniendo tanto pBROC 413 (plásmido no-codificante) como pBROC 520 (codificante de D1-D4 (709-886)), fueron separados en dodecil sulfato sódico con 4-20% de geles de poliacrilamida (Novex, British Biotechnology Ltd.), esencialmente tal como lo describen los fabricantes. Las proteínas separadas fueron transferidas a Immobilon (Millipore (UK) Ltd.) usando un aparato de transferencia Sartoblot II de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los sitios sin reaccionar en la transferencia fueron bloqueados mediante incubación en NaH_{2}PO_{4} 10 mM/NaCl 0,15 M/Ficoll 0,02% (p/v)/polivinilpirrolidona 0,02% (p/v)/albúmina de suero bovina (BSA) 0,1% (p/v) pH 7.4, durante 1 hora a temperatura ambiente, con agitación constante. La transferencia fue sondeada con fibronectina bio-tinilada a 200 \mug/ml en NaH_{2}PO_{4} 0,02 M/NaCl 0,3 M/Tween 80 0,5% (p/v)/BSA 1,0% (p/v) pH 7.4 durante 4 horas a temperatura ambiente, con agitación constante. Las bandas fueron visualizadas usando un sistema de teñido Streptavidin Gold/Silver (Amersham UK), de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El polipéptido D1-D4 (709-886) putativo fue identificado como una nueva banda en el carril del pBROC
520.

c) Aislamiento de la D1-D4 (709-886) solubilizada

Se dejaron derretirse, a 4ºC durante 2 h, los sedimentos congelados del BL21 DE3 (pBROC 520) de E. coli (a partir de 300 ml de cultivo), preparados esencialmente tal como se describían en a), más arriba, y usando un período de inducción de 3 h, y entonces se resuspendieron en Tris 50 mM/NaCl 50 mM/EDTA 1 mM/fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) 0,1 mM pH 8.0 (30 ml). La suspensión fue transferida a un vaso de precipitados de 100 ml, y sometida a ultrasonidos (Heat Systems - Ultrasonics W380; 70 Watts, 50 x 50% pulso, tiempo de pulso = 5 seg.). El resultado de este proceso, fue inmediatamente centrifugado (6000 g/4ºC/10 min), y se descartó el sedimento. EL sobrenadante, conteniendo la D1-D4 (709-886) solubilizada, fue ajustado a pH 7.4 y mantenido a -40ºC.

d) Purificación del producto D1-D4 (709-886)

(i) La D1-D4 (709-886) sobrenadante, preparado tal como se describe arriba, fue aplicado a una columna FN-Sefarosa (1,6 x 13,2 cm) equilibrada en tampón salino fosfato (PBS) "A" de Dulbecco/NaCl 0,4 M/PMSF 0,1 mM. La D1-D4 (709-886) fue eluida de la columna con PBS/Guanidina HCl 2 M, y luego concentrada con ultrafiltración celular removida, usando una membrana de filtrado a M_{r} de 10.000 (Amicon), a un retentado de 4,0 ml. El retentado de D1-D4 (709-886) fue formulado en un producto mediante intercambio de tampón a un PBS, usando dos columnas Sephadex G25 (PD10, Pharmacia). Se obtuvo 1,5 mg del producto D1-D4 (709-886), con más del 90% de pureza, determinada mediante RP-HPLC y SDS PAGE; el material fue confirmado como D1-D4 (709-886) mediante secuenciado del N-terminal, y mediante transferencia Western (sondeada con fibronectina biotinilada). El peso molecular del polipéptido aislado y purificado, determinado por espectrometría de masas de tipo electrospray, fue de 19,970. El peso molecular teórico es de 19,969. Los análisis del peso molecular, de acuerdo con el SDS PAGE, indicaron que el polipéptido D1-D4 (709-886) tenía una movilidad correspondiente a la de una proteína de aproximadamente 35.000 (no reducida) o aproximadamente 40.000 (reducida); los marcadores de proteína utilizados para esto, fueron el Kit Low Molecular Weight (Pharmacia).

(ii) Se desarrolló también un método alternativo de purificación

La D1-D4 (709-886) sobrenadante (del cultivo 5L), preparada esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 4c, fue diluida 1:1 en NaH_{2}PO_{4} 0,1 M pH 7.6 (pH final ajustado a 7.6), y aplicada sobre una columna Q Sepharosa (Pharmacia) (7,8 x 5 cm) equilibrada con NaH_{2}PO_{4} 0,1 M pH 7.6. La D1-D4 (709-886) fue adsorbida a la columna y después eluida, usando NaH_{2}PO_{4} 0,1 M/NaCl 0,5 M pH 7.6. Después fue concentrada mediante ultrafiltración celular removida, usando una membrana de filtro con M_{r} de 10.000 (Amicon), para producir un retentado de 30 ml. En este paso, la D1-D4 (709-886) era pura en un 50% aproximadamente. El retentado de D1-D4 (709-886) fue sometido a intercambio de tampones, en ácido fórmico 50 mM, usando una columna Sephadex G25 (Pharmacia) (2,6 x 21 cm), para dar 40 ml del producto. El producto de D1-D4 (709-886) fue aún más purificado, mediante repetición de cuatro pasos a través una HPLC de fase inversa. De este modo, se aplicaron 10 ml de D1-D4 (709-886) sobre una columna Aquapore C4 (Applied Biosystems) (1 x 10 cm), equilibrada con ácido trifluoroacético (TFA) 0,1%. La D1-D4 (709-886) fue eluida de la columna utilizando un gradiente lineal de 0 a 100% de TFA 0,085%/acetonitrilo 70%, sobre 4-5 volúmenes de la columna. La D1-D4 (709-886) apropiada, conteniendo fracciones de las cuatro repeticiones pasadas, fue reunida y concentrada por ultrafiltración (tal como se explicó más arriba), para dar 30 ml de retentado. El retentado de D1-D4 (709-886) fue formulado en un producto final mediante intercambio de tampones en ácido fórmico 50 mM (al igual que arriba), seguido de liofilización.

Se obtuvo 50 mg de un producto de D1-D4 (709-886) de \geq 95% de pureza, determinada mediante HPLC de fase inversa y SDS PAGE analíticas; el material se confirmó como D1-D4 (709-886) mediante secuenciado N-terminal, y mediante transferencia Western (sondeada con fibronectina biotinilada). La solubilidad del producto liofilizado de D1-D4 (709-886) fue de 35-40 mg/ml cuando se reconstituyó en H_{2}O o ácido fórmico 50 mM.

(iii) Se desarrolló un segundo método alternativo de purificación, para reemplazar el paso C4 de fase inversa

La D1-D4 (709-886) (48 ml) que había sido eluida de la columna Q Sepharose tal como se había descrito en (ii), fue mezclada con (NH_{4})_{2}SO_{4} 4 M (16 ml), y aplicada sobre una columna Toyopearl Butyl (TosoHaas) (1,6 x 15 cm) equilibrada con (NH_{4})_{2}SO_{4}0,1 M/NaH_{2}PO_{4} 0,1 M pH 7.0 (Tampón A). La columna fue lavada entonces con aproximadamente 3 volúmenes de lecho de Tampón A. La D1-D4 (709-886), que se había adsorbido a la matriz, fue eluida de la columna utilizando un gradiente lineal de 30 a 100% de NaH_{2}PO_{4} 0,1 M pH 7.0 en Tampón A, sobre 3 volúmenes de columna. La D1-D4 (709-886) apropiada, conteniendo fracciones identificadas mediante SDS PAGE, fue reunida y entonces concentrada por ultrafiltración, usando una membrana de filtro con M_{r}10.000 (Amicon), para dar 20 ml de retentado. El retentado de D1-D4 (709-886) fue formulado en un producto final mediante intercambio de tampones en ácido fórmico 50 mM, usando una columna Sephadex G25 (Pharmacia) (2,6 x 21 cm), seguido de liofilización.

Se obtuvo 50 mg de un producto de D1-D4 (709-886) con \geq del 98% de pureza, determinada mediante HPLC de fase inversa y SDS PAGE.

Ejemplo 5 Fermentación en biorreactor del polipéptido D1-D4 (709-886)

Las colonias individuales de BL21 (DE3):pBROC 520 de E. coli fueron recuperadas del medio LB agar, que contenía ampicilina a 50 \mug/ml, y se usaron para inocular 2 x 100 ml de medio de sembrado (NCYZM), que contenía ampicilina a 75 \mug/ml. Las fermentaciones primaria y secundaria de las fases sembradas fueron realizadas en matraces agitados de 500 ml rellenados con partes alícuotas de 100 ml de medio NCYZM. Las condiciones de las fermentaciones de los sembrados primario y secundario fueron las siguientes: 37ºC, 230 rpm en un agitador orbital con un tiro de 50 mm. El tiempo de incubación del sembrado primario fue de 9 horas. El cultivo sembrado primario fue utilizado para inocular 6 x 100 ml (0,1% v/v) partes alícuotas de medio en la fase sembrada secundaria (NCYZM). El sembrado secundario fue incubado durante 14,5 horas.

Se rellenaron dos fermentadores Biolafitte de 15 litros, cada uno con 10 litros de medio NCYZM, y con antiespumante Dow Corning DC1510 0,01% (v/v). Las vasijas más el medio fueron esterilizadas usando vapor a 121ºC durante 45 minutos. Se añadió de manera aséptica a la vasija con el medio, ampicilina esterilizada por microfiltración (0.2 \mum), a una concentración final de 150 \mug/ml. Los fermentadores fueron inoculados a un nivel del 2,5% (v/v) a partir del cultivo sembrado secundario. Las condiciones de la fase final de incubación fueron 37ºC, agitador a 300 rpm, ventilación de 5 l/min (0,5 vvm). Las últimas fases de la fermentación fueron muestreadas asépticamente antes de la inoculación, a las 0 horas, y a partir de entonces aproximadamente cada hora. Las muestras fueron controladas para observar incrementos en la densidad óptica (550 nm). Cuando la OD 550 fue \geq 1,0, se añadió IPTG para dar una concentración final de 1 mM. Las fermentaciones fueron incubadas durante aproximadamente algo más de
3 horas.

Las células fueron recuperadas mediante centrifugación por lotes, usando 7.000 g durante 35 minutos, o centrifugación continua a 15.000 g. La producción total de células fue de 73,5 gramos. Las células fueron lavadas una vez con un total de 1,0 litros de tampón salino fosfato Oxoid ("A" de Dulbecco) con pH 7.2. Las células centrifugadas lavadas fueron mantenidas entonces a -20ºC, a la espera de un procesamiento posterior.

Composición del medio NCYZM:

Bacto-Triptona de Difco:	10 g/l
AR NaCl de Fisons:	5 g/l
Bacto-Extracto de levadura de Difco	5 g/l
Bacto-Acidos Casamino de Difco	1 g/l
AR MgSO_{4}\cdot7H_{2}O de Fisons	2 g/l
Agua destilada	950 ml
pH ajustado a 7.0 con NaOH 5 M, y se lleva el volumen a 1000 ml

Ejemplo 6 Construcción de pBROC 533, un plásmido que expresa un polipéptido constituido predominantemente por los dominios D1-D4 de la proteína de unión a fibronectina J2385 de S. aureus

El siguiente polinucleótido oligomérico (A) y su complemento, fueron sintetizados en un sintetizador de ADN, Pharmacia LKB Gene Assembler Plus:

CGGAATTCGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGACG

TAAGATCTGG ATCCGCATGC GAATTCCG

Se mezclaron muestras de las dos preparaciones de oligonucleótidos (0,14 microgramos de cada una), se calentó a 94ºC durante 5 minutos, y se dejó templar a 37ºC durante 10 minutos. El ADN de doble hebra se digirió con la enzima EcoRI, y posteriormente se clonó en el sitio EcoRI del pUC19 (2 microgramos de vector/ligado digerido con EcoRI), para dar pBROC 528 en Delta M15 de E. coli.

El marcador de resistencia a kanamicina de pUC4K (obtenido de Pharmacia, número de código 27-4958-01), digerido con BamHI, fue entonces clonado en el sitio único BglII del plásmido construido resultante, pBROC 528, para dar pBROC 529.

El ADN del plásmido pBROC 529 (5 microgramos) desarrollado en Delta M15 de E. coli fue digerido doblemente con HincII/SphI y el fragmento de ADN, de aproximadamente 1,4 Kb, que codifica el gen de resistencia a la kanamicina, y se aisló el segmento de proteína de unión a fibronectina codificada por el oligonucleótido originalmente sintetizado, usando agarosa/agarasa de bajo punto de fusión. Este ADN fue usado en una reacción de ligado con ADN de plásmido (1 microgramo) de pBROC 519a parcialmente digerido con HincII, completamente digerido con SphI (ver Ejemplo 2). Los productos del ligado fueron electrotransformados dentro de Delta M15 de E. coli, seleccionando las resistencia a kanamicina. En este sentido, se probó que era posible aislar el pBRCO 530, un plásmido establecido mediante secuenciado a través de los sitios HincII de ADN de estafilococos, y mediante mapeo de restricción, transportando un fragmento de ADN codificante de las regiones D1-D2-D3-D4 (residuos 1-129 en la Tabla 2) de la proteína de unión a fibronectina de J2385 de S. aureus. El fragmento de ADN codificaba adicionalmente un residuo de treonina en el carboxi terminal del polipéptido.

A continuación, el ADN de estafilococo de pBROC 530 fue extraído del vector plásmido mediante digestión con NdeI/BamHI de una preparación de ADN de plásmido, y se clonó en un pBROC413 digerido de manera similar (ver Reagentes clave a), para dar pBROC 531.

pBROC531 fue cultivado en una cepa transformada de Delta M15 de E.coli, y después fue digerido con SalI para eliminar el gen de resistencia a kanamicina, y posteriormente fue re-ligado para crear pBROC 533. Este paso fue llevado a cabo para prevenir una sobre-expresión innecesaria del gen de resistencia a la kanamicina a partir del promotor T7 en pBROC 531, puesto que se consideró que esto sería en detrimento para la expresión máxima del ADN de estafilococo.

pBROC 533 fue transformado en BL21 (DE3) de E.coli para suministrar BL21 (DE3), pBROC 533 de E.coli.

Una variante del plásmido pBROC 531 puede ser construido alternativamente, usando el siguiente polinucleótido oligomérico (B), y su complemento:

CGGAATTCGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGCCG

TAAGATCTGG ATCCGCATGC GAATTCCG

Esto da el mismo polipéptido que el explicado más arriba, con la treonina terminal reemplazada por prolina.

Ejemplo 7 Expresión, aislamiento y purificación del polipéptido D1-D4 (709-838(P838T)) expresado a partir de pBROC 533 en BL21 (DE3) de E. coli a) Expresión

Fue llevada a cabo usando los métodos descritos en el Ejemplo 4 a), excepto que el plásmido pBROC 533 del Ejemplo 6, fue sustituido por pBROC 520.

b) Detección del producto expresado

Fue llevado a cabo usando los métodos descritos en el Ejemplo 4 b). D1-D4 (709-838(P838T)) fue identificado como una nueva banda en el carril de pBROC 533.

c) Aislamiento

Fue llevado a cabo esencialmente tal como se describió en el Ejemplo 4 c), excepto que fueron usados los sedimentos celulares de BL21 (DE3)(pBROC 533) de E.coli, el volumen inicial del cultivo fue de 1,2 litros, y el sedimento celular fue resuspendido en 32 ml de tampón. El volumen final de sobrenadante fue de 40 ml.

d) Purificación

El sobrenadante de D1-D4 (709-838(P838T)), preparado tal como se describió mas arriba, se diluyó 1:1 con NaH_{2}PO_{4} 0,1 M pH 7.6, siendo ajustado el pH a 7.6 usando HCl, y se aplicó a una columna Q Sepharose (Pharmacia) (4,1 x 4,7 cm) equilibrada con NaH_{2}PO_{4} 0,1 M pH 7.6. El polipéptido se adsorbió a la columna, y se eluyó usando NaH_{2}PO_{4} 0,1 M/NaCl 0,5 M pH 7.6. La solución de polipéptido (50 ml) que se había eluido de la columna Q Sepharose, fue mezclada con (NH_{4})_{2}SO_{4} 4 M (16 ml), y se aplicó a una columna Toyopearl Butyl (TosoHaas) (1,6 x 1,5 cm) equilibrada con (NH_{4})_{2}SO_{4}0,1 M/NaH_{2}PO_{4} 0,1 M pH 7.0 (Tampón A). Entonces se lavó la columna con aproximadamente 3 volúmenes del lecho, con Tampón A. El polipéptido, que se había adsorbido a la matriz, fue eluido de la columna usando un gradiente lineal de 30 a 100% de NaH_{2}PO_{4} 0,1 M pH 7.0 en Tampón A sobre 3 volúmenes de la columna. El polipéptido apropiado, con fracciones que fueron identificadas mediante SDS PAGE, fue reunido y concentrado mediante ultrafiltración, usando una membrana de filtro de M_{r} 10.000 (Amicon), para dar 20 ml de retentado. El retentado fue formulado en el producto final mediante intercambio de tampones, en ácido fórmico 50 mM, usando una columna Sephadex G25 (Pharmacia) (2,6 x 21 cm), seguido de liofilización.

Se solubilizó una parte alícuota del liofilizado; el material mostró una única banda grande, de aproximadamente M_{r}=22.000, en SDS PAGE bajo condiciones no-reductoras.

Evaluación biológica A. Efecto de D1-D4 (709-886) sobre la adhesión in vitro de estafilococos a los cubreobjetos recubiertos de polimetilmetacrilato (PMMA) (i) Cepas bacterianas

Staphylococcus aureus 8325-4 (cepa estándar de laboratorio)

Staphylococcus aureus J-2385

Staphylococcus epidermidis (SE 902 y SE 903, dos aislados clínicos a partir de infección por cuerpo extraño)

(ii) Ensayo de adhesión

El ensayo de adhesión in vitro descrito por Vaudaux et al., Infection and Immunity 45:768-774, 1984, fue utilizado para medir la adhesión de estafilococos a las superficies cubiertas con fibronectina, y para evaluar las propiedades antiadhesivas del polipéptido D1-D4 (709-886).

(iii) Preparación de la bacteria

Las cepas de estafilococos fueron cultivadas durante toda la noche, a 37ºC, en caldo de Mueller-Hinton (MHB, Difco Laboratories). Un total de 2 x 10^{7} ufc provenientes del cultivo nocturno, fueron incubadas con 100 \muCi [metil-^{3}H]-timidina (Amerham), en 1 ml de MHB, y se cultivaron durante 3 horas a 37ºC, hasta llegar a las 1 x 10^{8} - 2 x 10^{8} ufc/ml. Tras eliminar la radioactividad sin unir mediante dos lavados (3.000 x g, 10 minutos), la cepa etiquetada fue suspendida en 1 ml de NaCl 0,15 M.

(iv) Adsorción de fibronectina a los cubreobjetos con PMMA

Todos los cubreobjetos con PMMA (0,75 x 0,75 cm) fueron sumergidos en etanol 95% durante 10 minutos, a 37ºC, fueron escurridos y calentados a 120ºC durante 30 minutos. Los cubreobjetos fueron entonces pre-incubados con gelatina (1 mg/ml, Difco-Laboratories) durante 60 minutos a temperatura ambiente, y enjuagados con PBS (sin Ca^{2}+-Mg^{2}+, Gibco Laboratories). Los cubreobjetos fueron sumergidos en soluciones que contenían fibronectina humana purificada a dos concentraciones, 0,5 \mug/ml para cepas de S. aureus, y 4 \mug/ml para cepas de S. epidermidis, durante 60 minutos, a 37ºC. Los cubreobjetos fueron transferidos a tubos frescos con PBS, y luego lavados.

(v) Ensayo de adhesión

El polipéptido D1-D4 (709-886) fue diluido hasta la concentración requerida (con una escala de 100 \mug/ml a 10 \rhog/ml) en PBS complementado con cationes (Gibco Laboratories) y albúmina (20%, Sigma) (PBS^{++}/HSA). Se añadió el cultivo radioetiquetado lavado, a 960 \mul del polipéptido D1-D4 diluido, en tubos de plástico. Los cubreobjetos recubiertos con fibronectina fueron añadidos a las suspensiones bacterianas, y se incubó a 37ºC, durante 60 minutos, con agitación (100 ciclos/minuto).

Después se escurrieron los fluidos, se transfirió los cubreobjetos a tubos frescos, se lavó dos veces con tampón salino (1 ml) a temperatura ambiente, 1 x 5 y 1 x 30 minutos. Se escurrieron los fluidos, y se transfirió los cubreobjetos a viales de centelleo, complementados con 5 ml de fluido de centelleo, y se contabilizó.

(vi) Evaluación de cpm y ufc para cada cepa

Se contaron porciones de los cultivos radioetiquetados durante 3 horas (10 \mul), en viales de centelleo. Partes alícuotas de 100 \mul fueron diluidas 1 en 10.000, y se colocaron 20 \mul en agar Mueller-Hinton, y se contaron las viables. Adicionalmente, se revisó también el contenido cpm de los 100 \mul de la cepa diluida usada en el ensayo de adhesión, para habilitar el cálculo del número de ufc adheridos a los cubreobjetos PMMA recubiertos con fibronectina.

(vii) Resultados

Concentración de D1-D4 (709-886)	Cepas evaluadas y % de inhibición de la adherencia
	S. aureus 8325.4 *	S. aureus J2385 *	S. epidermidis SE902 **
100 \mug/ml	97,5	78,4	95,7
10 \mug/ml	96,1	79,9	93,4
1 \mug/ml	95,8	n/d	91,9
100 ng/ml	84,8	n/d	42,5
10 ng/ml	94,4	n/d	0
1 ng/ml	28,7	n/d	0
* Cubreobjetos recubiertos con 0,5 \mug/ml de fibronectina
** Cubreobjetos recubiertos con 4,0 \mug/ml de fibronectina

La 8325-4 de S. aureus es una cepa estándar que ha sido ampliamente estudiada por su capacidad de adherirse a distintos materiales recubiertos con fibronectina humana. La adhesión de esta cepa a superficies recubiertas con fibronectina es promovida cuando la superficie está recubierta por concentraciones de fibronectina en incremento. Por tanto, la 8325-4 de S. aureus fue elegida por ser una cepa apropiada para evaluar los efectos de los agentes que podrían bloquear la interacción entre los estafilococos y las superficies recubiertas de fibronectina.

El D1-D4 (709-886) es un potente inhibidor de la adhesión de la 8325-4 de S. aureus a los cubreobjetos recubiertos de fibronectina. Hasta un 95% de la inhibición de la adhesión podía ser todavía detectada, cuando la concentración de D1-D4 (709-886) se había reducido a los 10 ng/ml. La IgG de humano purificada (Pierce) se usó como control, puesto que se había demostrado previamente que inhibía la adhesión de S. aureus a superficies recubiertas de fibronectina, usando este ensayo (Vaudaux et al. J. Invest. Surg., 2:397-408 1989), y dio una inhibición del 70% a 1 mg/ml.

Adicionalmente, la adhesión de J-2385 de S. aureus a los cubreobjetos recubiertos de fibronectina también es elevada, cuando se usan concentraciones de fibronectina en incremento para recubrir los cubreobjetos con PMMA. Sin embargo, el pre-tratamiento de los cubreobjetos con gelatina, descrito en el protocolo estándar, fue omitido desde que dio como resultado algunas uniones no específicas que interfirieron con el ensayo de adhesión. Demostrar la adhesión de esta cepa a la fibronectina inmovilizada es significativo, desde el momento en que el polipéptido recombinante D1-D4 (709-886) usado en este estudio, se derivó del J-2385 de S. aureus. El polipéptido D1-D4 (709-886) es capaz de inhibir la adhesión de J-2385 de S. aureus a las superficies recubiertas con fibronectina.

La adhesión de S. epidermidis fue aumentada también cuando se incrementó la concentración de fibronectina usada para recubrir el cubreobjetos. Se notó que se requirieron mayores concentraciones de fibronectina (4 \mug/ml) para permitir que se adhiriera un mayor número de organismos, cuando se comparó con 8325-4 (0,5 \mug/ml) de S. aureus. El polipéptido D1-D4 (709-886) también inhibió la adhesión de S. epidermidis a la fibronectina (95% de adhesión a 1 \mug/ml), sugiriendo que el D1-D4 (709-886) podía tener actividad anti-adhesiva como un agente terapéutico contra los estafilococos coagulasa-negativos.

B. Inhibición de la adhesión de S. aureus a sustratos dérmicos (i) Introducción

Los tejidos dérmicos usados en este estudio fueron obtenidos como un kit (Skin^{2}) de Advanced Tissue Sciences (La Jolla, California, USA). Los detalles completos sobre el cultivo de la dermis artificial son proporcionados con el kit. La dermis artificial se formó mediante sembrado de fibroblastos neonatales humanos, en una malla de nylon médico inerte. Los fibroblastos se adhieren a la malla y proliferan entre los intersticios de la malla. Durante este proceso, secretan de manera natural factores de crecimiento, y depositan una matriz de proteínas extracelulares, como la fibronectina y el colágeno, que desarrollan en la dermis humana. Este modelo ha sido usado exitosamente para representar los tejidos dérmicos expuestos en las heridas.

(ii) Ensayo in vitro de adhesión dérmica con 8325-4 de S. aureus

El procedimiento fue esencialmente idéntico al descrito más arriba en A. excepto que la muestras de dermis artificial reemplazaron a los cubreobjetos recubiertos con fibronectina. La 8325-4 de S. aureus fue cultivada durante toda la noche en caldo de Mueller-Hinton (MHB, Difco). Un total de 2 x 10^{7} ufc procedentes del cultivo nocturno, fueron incubadas con 100 \muCi [metil-^{3}H]-timidina en 1 ml de MHB, y se cultivaron durante 3 horas, a 37ºC, hasta que hubo de 1 x 10^{8} a 2 x 10^{8} ufc/ml. Tras extraer los libres de radioactividad mediante dos centrifugaciones (3.000 x g, 10 minutos), la cepa etiquetada fue suspendida en HSA al 0,5% (Sigma), para prevenir uniones no específicas a las proteínas celulares y de la matriz. Los sustratos dérmicos fueron lavados con medio libre de suero, y con PBS, antes de la adición de la bacteria radioetiquetada.

(iii) Efecto de la D1-D4 (709-886) en la adhesión a los sustratos dérmicos

El polipéptido D1-D4 (709-886) fue diluido hasta la concentración requerida, en PBS complementado con cationes (Gibco Laboratories) y en albúmina de suero humano (20%, Sigma) (PBS^{++}-HSA). Las bacterias lavadas (40 \mul) fueron añadidas a las muestras diluidas de D1-D4 (709-886) (960 \mul). Los tejidos dérmicos fueron añadidos entonces a las suspensiones bacterianas con D1-D4 (709-886), y se incubó a 37ºC, con agitación (100 ciclos/minuto). Los fluidos se escurrieron, los tejidos dérmicos fueron transferidos a tubos frescos, lavados con tampón salino (1 ml) a temperatura ambiente, durante 5 y 30 minutos respectivamente. Los fluidos fueron escurridos, y se transfirieron los tejidos dérmicos a viales de centelleo complementados con 5 ml de fluido de centelleo, y se realizó el conteo.

(iv) Resultados

El D1-D4 (709-886) tiene un efecto inhibidor de la adhesión de la 8325-4 de S. aureus a los tejidos dérmicos, dependiente de la concentración. La inhibición significativa de la adhesión fue alcanzada (> 50%) a concentraciones de D1-D4 (709-886) por debajo de 1 \mug/ml. Estos resultados muestran una buena correlación con los obtenidos en el ensayo de adhesión a cubreobjetos con PMMA recubiertos de fibronectina. Adicionalmente, los resultados confirman la importancia de la interacción entre S. aureus y la fibronectina presente en los tejidos dérmicos. Como consecuencia de esta observación, el polipéptido D1-D4 (709-886) puede ser también útil profilácticamente como una aplicación tópica, en la prevención de infecciones de heridas durante la cirugía.

C. Inhibición de la adhesión de estafilococos a cánulas de nylon durante implantación subcutánea en la rata (i) Modelo in vivo de infección experimental por cuerpo extraño

En este estudio se usaron ratas macho CD (Charles River (U.K.) Limited), con un peso de 230-250 g. En cada rata fueron implantadas subcutáneamente, bajo condiciones estériles, tres o cuatro cánulas flexibles de vinilo (1,5 mm x 2 cm). Los animales fueron anestesiados con Hypnorm (0,05 ml) i.m., seguido de 0,05 ml de valium i.m. Se hizo una incisión de 1 cm en el centro de la espalda, hacia un costado de la espina, y se abrió un área subcutánea mediante disección roma. Las cánulas fueron implantadas, y la incisión fue cerrada con clips. Se pulverizó sobre la herida con Xilocaina antes de la recuperación de la anestesia. Los clips fueron eliminados tras 6 días. El sitio del implante fue infectado mediante administración del cultivo celular (ver más abajo) en la herida, durante la inserción de la cánula.

(ii) Preparación de las bacterias para su uso en el modelo de infección

Las bacterias fueron cultivadas durante toda la noche en MHB (Difco). El cultivo nocturno (20 \mul) fue utilizado para inocular MHB fresco (1 ml), y el cultivo se mantuvo a 37ºC durante 3 o 16 horas (cultivo de fase exponencial). Las células fueron lavadas dos veces (9.000 x g, 10 minutos), y resuspendidas en PBS 0,85% (1 ml), para dar 8,3 log_{10} ufc/ml. Las suspensiones de bacterias fueron diluidas 1 en 10, para dar aproximadamente 7 log_{10} ufc/ml, y se usó 0,1 ml de esta suspensión para infectar a las ratas. Por tanto, cada herida fue infectada con aproximadamente 6 log_{10} ufc.

Para evaluar el efecto del D1-D4 (709-886) sobre la adhesión in vivo, se añadió el polipéptido D1-D4 (709-886) a la suspensión bacteriana, para dar una concentración final de 500 \mug/ml antes de la adición al sitio de la herida. Por tanto, cada herida fue dosificada con 50 \mug de D1-D4 (709-886).

(iii) Evaluación de la adhesión/colonización bacteriana in vivo en presencia del polipéptido D1-D4 (709-886)

En los tiempos, p.e., 1, 6, 24, 72, 168, 192 y 240 horas tras la infección, una rata de cada grupo fue sacrificada, usando una inyección i.p. de 0,5 ml de Expiral. Se extrajeron todas las cánulas, se enjuagaron en PBS esterilizado, y cada una fue colocada en 1 ml de PNS fresco (tampón fosfato salino, 0,9%), y se sometieron a ultrasonidos durante 2 minutos, en un baño de agua con ultrasonidos, para extraer las bacterias adherentes. Las muestras fueron colocadas en agar Mueller-Hinton, para contar el número de bacterias adherentes viables.

(iv) Resultados

El polipéptido D1-D4 (709-886) inhibe la adhesión de la 8325-4 de S. aureus a las cánulas, durante la implantación subcutánea en la rata. De las cánulas extraídas tras las seis horas de implantación, tres de cuatro estaban completamente libres de organismos adherentes, y el número de organismos adherentes en la cuarta cánula era considerablemente menor que en los controles donde no se había añadido D1-D4 (709-886). Aunque se detectaron algunas bacterias adherentes sobre las cánulas tras 8 días de implantación, el número de organismos asociados con las cánulas tratadas con D1-D4 (709-886) (3,0 \pm 1,3 log_{10} ufc) fue mucho mas bajo que en los controles sin tratar (5,4 \pm 1,4 log_{10} ufc). Considerando que el número de organismos utilizados para infectar la herida fue de 10^{6}, esto debería exceder el número de organismos contaminantes presentes en el teatro de operaciones durante la cirugía.

El D1-D4 (709-886) inhibió la adhesión de I20 de S.aureus (un aislado clínico virulento) durante al menos 10 días tras la infección. Las cánulas fueron extraídas a las 6, 24, 72, 168 y 240 horas tras la infección, y el conteo de bacterias fue de entre 4 y 6 log_{10} ufc detectables, durante la duración del estudio, en las cánulas sin tratar. Sin embargo, muy pocas o ninguna bacterias fueron detectables en las cánulas tratadas con D1-D4 (709-886), en ningún momento.

Se observaron resultados similares con dos cepas de S. epidermidis. A pesar de un evidente retraso en la adherencia de esas cepas, se detectaron elevados números, entre 5 y 6 log_{10} ufc, a los 10 días tras la infección en cánulas sin tratar. No se detectaron bacterias en las cánulas tratadas con D1-D4 (709-886) en ese mismo momento. Por lo tanto, D1-D4 (709-886) es potencialmente eficaz en el bloqueo de la adhesión de estafilococos sobre dispositivos médicos residentes, cuando es utilizado profilácticamente como un agente tópico.

D. Efecto de D1-D4 (709-838(P838T)) sobre la adhesión de estafilococos (i) Ensayo de adhesión in vitro

Las condiciones del ensayo fueron idénticas a las descritas para la evaluación del polipéptido D1-D4 (709-886) en A.

(ii) Resultados

El polipéptido D1-D4 (709-838(P838T)) fue capaz de inhibir la adhesión a cubreobjetos recubiertos con fibronectina, tanto de 8325-4 de S. aureus como de SE 902 de S. epidermidis. La inhibición de la adhesión alcanzada con D1-D4 (709-838(P838T)) fue equivalente a la observada con D1-D4 (709-886). En este estudio, la adhesión de 8325-4 de S. aureus fue inhibida en un 95% con 100 ng/ml del polipéptido, y la adhesión de SE 902 de S. epidermidis fue inhibida en un 85% con 100 \mug/ml del polipéptido.

(iii) Ensayo de adhesión in vivo

Las condiciones del ensayo fueron idénticas a las descritas para la evaluación del polipéptido D1-D4 (709-886) en C.

(iv) Resultados

El polipéptido D1-D4 (709-838(P838T)) fue capaz de inhibir la adhesión de I20 de S. aureus y de SE 902 de S. epidermidis a cánulas de vinilo, durante la implantación subcutánea en la rata. No se detectaron organismos adherentes en las cánulas tratadas con D1-D4 (709-838(P838T)) durante 10 días que duró el tiempo de estudio, en contraste con los controles sin tratar, donde se detectaron 4,5 log10 ufc de I20 de S. aureus, y 6 log10 ufc de SE 902 de S. epidermidis.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Una comparación del ADN codificante de los dominios de unión a fibronectina de la proteína de unión a fibronectina, tipo A, de S. aureus, y de la secuencia de ADN J2385 de S. aureus

1

TABLA 2 Una comparación de las secuencias de aminoácidos derivados de las regiones de unión a fibronectina, de las proteínas de unión a fibronectina de Staphylococcus aureus (tal como se publicó), y J2385 de Staphylococcus aureus. La secuencia a de Staphylococcus aureus comprende los residuos de aminoácidos 709-886 (tal como se ve en Signas et al. loc. cit.)

2

Figura

La Fig.1. es una representación diagramática del plásmido pBROC413. Bla indica el gen de resistencia a la ampicilina, \phi10 el promotor T7 de la ARN polimerasa, y rbs el sitio de unión al ribosoma. Las flechas para \phi10 y bla dan la dirección de la transcripción. Se ha indicado el sitio del poli-ligador. El plásmido no se ha dibujado a escala, y el tamaño es aproximado.

4

5

Claims (28)

1. Un polipéptido aislado, constituido por las regiones enteras D1, D2, D3 y D4, de una proteína de unión a fibronectina (fbp) de Staphylococcus aureus.

2. Un polipéptido aislado, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de la región D4 termina con la secuencia de aminoácidos PIVP.

3. Un polipéptido aislado, de acuerdo con la reivindicación 1 o la 2, constituido, además, por de una a cinco regiones de pared (WR) de la proteína de unión a fibronectina de Staphylococcus aureus, en secuencia.

4. Un polipéptido aislado, de acuerdo con la reivindicación 1 o la 2, constituido, además, por hasta tres regiones de pared de la proteína de unión a fibronectina de Staphylococcus aureus, en secuencia.

5. Un polipéptido aislado, de acuerdo con la reivindicación 1, constituido por residuos correspondientes a los residuos G709 hasta P838, o G709 hasta T838, de FbpA de Staphylococcus aureus.

6. Un polipéptido aislado, de acuerdo con la reivindicación 3, constituido por residuos correspondientes a los residuos G709 hasta T886, terminando en la secuencia de aminoácidos PPIVPPT de FbpA de Staphylococcus aureus.

7. Un polipéptido aislado, de acuerdo con la reivindicación 6, de la cepa J2385 de S. aureus, y codificado por la secuencia de ADN ID SEC NO:5.

8. Un polipéptido aislado, de acuerdo con la reivindicación 6, que tiene la secuencia ID SEC NO:6.

9. Un polipéptido aislado, de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia ID SEC NO:7 o la secuencia ID SEC NO:8.

10. Un ácido nucleico aislado, que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9.

11. Un ácido nucleico aislado, de acuerdo con la reivindicación 10, cuando depende de la reivindicación 7, de secuencia ID SEC NO:5.

12. Un vector recombinante que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 10 o de la 11.

13. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 12.

14. Un método de preparación del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, que comprenda la expresión del ADN que codifica dicho polipéptido, y la recuperación del producto de la expresión.

15. Un anticuerpo monoclonal que se une al polipéptido de las reivindicaciones de la 1 a la 9.

16. Un anticuerpo monoclonal, de acuerdo con la reivindicación 15, obtenible usando Fbp presente en la J2385 (NCIMB 40532) de S. aureus, o un polipéptido constituido por las regiones enteras D1, D2, D3 y D4 del Fbp, como antígeno.

17. Un anticuerpo monoclonal, de acuerdo con las reivindicaciones 15 o 16, el cual ha sido humanizado.

18. Un fragmento de un anticuerpo monoclonal, de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 17, que comprende la región de unión del Mab.

19. Un proceso de preparación de anticuerpos monoclonales, en el cual un animal es inmunizado con un polipéptido, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, las células productoras de anticuerpos del animal, se fusionan con células de una línea celular continua, y las células hibridoma son clonadas y revisadas para seleccionar los clones productores de anticuerpos, de acuerdo con la reivindicación 15 o 16.

20. Una línea celular hibridoma que secreta un anticuerpo, de acuerdo con la reivindicación 15 o 16.

21. Un método de purificación de un polipéptido, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, a partir de una muestra, que comprende anticuerpos monoclonales de inmovilización capaces de unirse específicamente a dicho polipéptido sobre un sustrato, contactando la muestra con los anticuerpos monoclonales inmovilizados, bajo condiciones apropiadas, de tal modo que el polipéptido se une a dichos anticuerpos, separando la muestra sin unir, y eluyendo el polipéptido de los anticuerpos monoclonales inmovilizados.

22. El uso de un anticuerpo monoclonal, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 17, o el fragmento de la reivindicación 18, para la determinación cualitativa o cuantitativa de un polipéptido, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9.

23. Un kit de ensayo para la determinación de un polipéptido, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, que comprende un anticuerpo monoclonal, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 17, o el fragmento de la reivindicación 18.

24. El kit de ensayo, de acuerdo con la reivindicación 23, que comprende, además, otros anticuerpos monoclonales o policlonales, y/o los adjuntos, en un paquete apropiado.

25. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal, o un fragmento activo del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 18, o un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, y un vehículo farmacéutico aceptable.

26. El uso de un polipéptido, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, o un Mab o fragmento, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 18, en la fabricación de un medicamento para combatir la infección bacteriana en el sitio de: heridas, implantes quirúrgicos, y otros dispositivos residentes.

27. Un uso, de acuerdo con la reivindicación 26, en el que las bacterias son bacterias gram positivas.

28. El polipéptido, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, o el Mab o fragmento, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15-18, para su uso en terapia, o como un profiláctico.