ES2243131B1 - Tiamidas derivadas de bifenilo como inhibidores de calpaina. - Google Patents
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Abstract
Tiamidas derivadas de bifenilo como inhibidores
de calpaína.
La presente invención se refiere a compuestos
derivados de bifenilo con actividad como inhibidores de calpaína. Un
compuesto de la presente invención es un bifenilo
2,2'-disustituido, siendo los sustituyentes en las
posiciones 2 y 2' del esqueleto de bifenilo cadenas conteniendo
estructuras relacionadas con los aminoácidos, incluyendo fragmentos
de compuestos aminocarbonílicos, dónde al menos uno de los
sustituyentes en dichas posiciones 2- ó 2'- está unido al esqueleto
de bifenilo por un grupo tiocarbonilo, siendo compuestos con
funcionalidad de tioamida. La presente invención también engloba
cualquiera de los isómeros conformacionales (atropisómeros) de dicho
compuesto de fórmula I. Los compuestos de fórmula I tienen
aplicación en el tratamiento preventivo o terapéutico de una
enfermedad degenerativa.
Description
Tiamidas derivadas de bifenilo como inhibidores
de calpaína.
La presente invención se enmarca en el campo de
los inhibidores de enzimas con actividad terapéutica, más
específicamente de los inhibidores de calpaína.
Las calpaínas, o proteasas neutras activadas por
calcio (II) (CANP, E.C. 3.4.22.17) son una familia de proteasas con
cisteína ("cysteine proteases") con un papel metabólico muy
activo. Aunque su sustrato natural no está claramente determinado,
estas enzimas catalizan la hidrólisis de una variedad de proteínas
implicadas en la transducción de señales, en la reconstrucción del
citoesqueleto, en la regulación del ciclo celular y en la apóptosis
(Adv. Pharmacol. 1996, 37, 117). En mamíferos,
la familia de calpaínas comprende diversas isoformas específicas de
tejido y dos isoenzimas ubicuas: la \mu-calpaína
(o calpaína I) y la m-calpaína (o calpaína II), que requieren
cantidades micromolares y milimolares, respectivamente, de calcio
(II) para su activación. Estudios estructurales por difracción de
rayos X han mostrado que cada isoforma está compuesta por una
subunidad grande (\sim 80 kDa), que presenta un dominio de
proteasa con cisteina del tipo de la papaína, y una subunidad
pequeña (\sim 30 kDa), que es común a cada isoenzima. Los extremos
C-terminales de cada subunidad tienen dominios
capaces de unirse a Ca (II) (dominio tipo calmodulina) (FEBS
Lett. 2001, 501, 111).
La sobreactivación de las calpaínas, lo que
puede ocurrir al aumentar la concentración intracelular de calcio
(II), está implicada en numerosas enfermedades, tales como las
isquemias cerebral y cardiaca, Alzheimer, Parkinson, distrofia
muscular, cataratas, enfermedades desmielinizantes (como la
esclerosis múltiple) y otras enfermedades degenerativas
(Pathophysiology 1999, 6, 91; Brain Res.
Rev. 2003, 42, 169).
La principal aplicación de inhibidores
selectivos de calpaína es como agentes neuroprotectores. En el área
terapéutica relacionada con la neuroprotección se han empleado
hasta ahora diversas estrategias. Se han usado a gentes que actúan
sobre la despolarización de membrana y la entrada de calcio en las
células, o que evitan la producción de radicales libres
(antioxidantes), o que son antagonistas de la acción de
neurotransmisores (J. Clinical Neurosci. 2002,
9, 4). Recientemente se ha prestado mucha atención a los
fármacos capaces de bloquear los receptores NMDA para el glutamato;
sin embargo, el bloqueo de receptores ionotrópicos de aminoácidos
excitatorios puede no ser un método ideal para impedir la acción
excitotóxica, ya que estos fármacos tienen efectos secundarios
psicotomiméticos (Pharmacol. Ther. 1999, 81,
163; Neurobiol. Disease 2003, 12, 82). Una
alternativa interesante para conseguir neuroprotección es el bloqueo
de fenómenos celulares "post-receptor" que
están silenciados fisiológicamente; es decir, la búsqueda de
bloqueantes selectivos de cascadas catabólicas inducidas por los
agentes excitotóxicos. Es previsible que estos fármacos potenciales
de acción intracelular, al actuar sobre rutas metabólicas que se
activan durante la neurodegeneración, podrían permitir una acción
neuroprotectora más eficaz y selectiva.
La sobreactivación de calpaína requiere un
aumento continuado de las concentraciones intracelulares de Ca (II),
y esta enzima está latente en las células en reposo [es decir, con
niveles de Ca (II) "normales"]. Por ello, la inhibición de
calpaína se presenta como un tratamiento adecuado en enfermedades
neurodegenerativas. En base a sus características, es previsible
que la inhibición de calpaína tenga menos efectos secundarios en
terapéutica humana que el bloqueo de procesos metabólicos previos a
su activación en los procesos patológicos, como es el caso del
antagonismo del receptor NMDA de glutamato y aspartato, debido a
que la calpaína no se activa en condiciones fisiológicas
"normales" y a que la acción de aminoácidos excitatorios es
imprescindible para el funcionamiento normal del sistema
nervioso.
Además, los inhibidores potentes y selectivos de
calpaína son muy útiles como herramientas de trabajo para estudiar
el mecanismo de acción de esta proteasa, así como su papel en
ciertos procesos fisiológicos.
Por otra parte, bifenilos diferentemente
sustituidos se han usado como farmacóforos en compuestos con
diversas actividades biológicas (J. Med. Chem. 2000,
43, 3443). Adicionalmente, los derivados de bifenilo se han
usado como fragmentos mesógenos para la preparación de cristales
líquidos (EP-743293). Por otro lado, los aminoácidos
y los compuestos relacionados, tales como, los compuestos
aminocarbonílicos, poseen diversas propiedades biológica (J. Med.
Chem. 2002, 45, 4762; Bioorg. Med. Chem.
Lett. 2000, 10, 1497).
Se han descrito inhibidores reversibles e
irreversibles de calpaína (Trends Mol. Medicine 2001,
7, 355; US-5541290). Los rasgos estructurales
más frecuentes de estos inhibidores es que son péptidos o
peptidomiméticos con pocos aminoácidos (entre 2 y 6) hidrófobos y
alguna funcionalidad electrófila, entre las que cabe mencionar
\alpha-cetofosfonatos,
\alpha-cetofosfinatos, óxidos de
\alpha-cetofosfinas,
\alpha-cetoésteres,
\alpha-cetoácidos,
\alpha-cetoamidas, trifluorometilcetonas,
aldehidos, sales de metilsulfonio, epóxidos, etc. Aparentemente,
estos compuestos actúan sobre el dominio tipo papaina de la
calpaína, lo que se traduce en una selectividad relativamente baja,
por lo que frecuentemente también son inhibidores de otras proteasas
con cisteina (por ejemplo, papaína) e incluso de proteasas con
serina (serine protease). En parte debido a estos
inconvenientes, aun no se ha encontrado un inhibidor de calpaína con
utilidad
terapéutica.
terapéutica.
Existe la necesidad de encontrar inhibidores de
calpaína con utilidad terapéutica. Un tipo de inhibidores de
calpaína no descritos previamente y que no han sido investigado
anteriormente está constituido por derivados de bifenilo
2,2'-disustituidos, dónde los sustitutentes en las
posiciones 2- y 2'- son fragmentos derivados de aminoácidos y
compuestos relacionados, tales como los compuestos
aminocarbonílicos, dónde, al menos, uno de los sustituyentes en
dichas posiciones 2,2'- está unido a través de un grupo
tiocarbonilo, formando la funcionalidad de tioamida, los cuales son
el objeto de la presente invención.
Recientemente en la solicitud española
(P-200301125) se describió la síntesis y evaluación
biológica de inhibidores de calpaína que estructuralmente son
derivados de bifenilo con sustituyentes aminocarbonil (carbamolio)
o carbonilamino, indistintamente, en posiciones 2- y 2'- del sistema
de bifenilo (Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14,
2753; Chemistry & Biodiversity 2004, 1,
442).
La presente invención se refiere a compuestos
derivados de bifenilo con actividad como inhibidores de calpaína.
Un compuesto de la presente invención es un bifenilo
2,2'-disustituido, siendo los sustituyentes en las
posiciones 2 y 2' del esqueleto de bifenilo cadenas conteniendo
estructuras relacionados con los aminoácidos, incluyendo fragmentos
de compuestos aminocarbonílicos, dónde al menos uno de los
sustituyentes en dichas posiciones 2- ó 2'- está unido al esqueleto
de bifenilo por un grupo tiocarbonilo, siendo compuestos con
funcionalidad de tioamida.
La presente invención se refiere a un compuesto
de fórmula I, que tiene estructura de bifenilo
2,2'-disustituido,
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
- -
- el grupo X es oxígeno (O) o azufre (S), indistintamente,
- -
- el asterisco (*) representa un centro estereogénico, de configuración (R) ó (S), indistintamente,
- -
- los grupos R^{1} y R^{2} son iguales o distintos, y están independientemente seleccionados entre los grupos H, alquilo entre 1 y 10 átomos de carbono, arilo, ó arilalquilo,
- -
- los grupos R^{3} y R^{4} son iguales o distintos, y están independientemente seleccionados entre los grupos
- -
- H,
- -
- alquilo entre 1 y 6 átomos de carbono,
- -
- arilo,
- -
- arilalquilo,
- -
- NH_{2},
- -
- NHR^{5} en el que R^{5} representa un grupo alquilo o arilo,
- -
- NR^{6}R^{7} en el que R^{6} y R^{7} representan dos grupos alquilo o arilo, idénticos o diferentes, o formando un sistema cíclico,
- -
- OH,
- -
- OR^{8} en el que R^{8} representa un grupos alquilo o arilo;
y cualquiera de los isómeros
conformacionales (atropisómeros) de dicho compuesto de fórmula
I.
Son compuestos especialmente preferidos:
-
(S,S)-3-Fenil-2-{[2'-(2-fenil-1-metoxicarbonil-etiltiocarbamoil)-biphenil-2-carbotioil]-amino}-propionato
de
metilo (1).
metilo (1).
-
(S,S)-3-Fenil-2-{[2'-(2-fenil-1-metoxicarbonil-etiltiocarbamoil)-bifenil-2-carbonil]-amino}-propionato
de metilo (2).
-
(S,S)-3-(1H-Indol-3-il)-2-{[2'-(2-(1H-indol-3-il)-1-metoxicarbonil-etiltiocarbamoil)-biphenil-2-carbotioil]-ami-
no}-propionato de metilo (3).
no}-propionato de metilo (3).
-
(S,S)-3-(1H-Indol-3-il)-2-{[2'-(2-(1H-indol-3-il)-1-metoxicarbonil-etiltiocarbamoil)-biphenil-2-carbonil]-ami-
no}-propionato de metilo (4).
no}-propionato de metilo (4).
-
(S,S)-2-{[2'-(1-Metoxicarbonil-2-metil-propiltiocarbamoil)-bifenil-2-carbotioil]-amino}-3-metil-butirato
de metilo (5).
-
(S,S)-2-{[2'-(1-Metoxicarbonil-2-metil-propiltiocarbamoil)-bifenil-2-carbonil]-amino
}-3-metil-butirato de metilo
(6).
-
(S,S)-3-(4-Hidroxi-fenil)-2-({2'-[2-(4-hidroxi-fenil)-1-metoxicarbonil-etiltiocarbamoil]-bifenil-2-carbotioil}-a-
mino)-propionato de metilo (7).
mino)-propionato de metilo (7).
-
(S,S)-3-(4-Hidroxi-fenil)-2-({2'-[2-(4-hidroxi-fenil)-1-metoxicarbonil-etiltiocarbamoil]-bifenil-2-carbonil}-ami-
no)-propionato de metilo (8).
no)-propionato de metilo (8).
La síntesis de los compuestos de fórmula general
I de la presente invención se ha llevado a cabo por métodos
habituales en síntesis orgánica los cuales son conocidos por los
expertos en la técnica, que implican la reacción de tionación de las
correspondientes amidas usando algunos de los métodos descritos en
la bibliografía para la síntesis de tioamida (Topics Current
Chemistry 1999, 204, 127; Comprehensive Organic
Synthesis, vol 6, pg 419, Pergamon Press, 1991), entre los que
cabe mencionar el uso del reactivo de Laweson
([2,4-bis(4-metoxifenil)-1,3-ditia-2,4-difosfetano-2,4-disulfuro]
(Bull. Soc. Chim. Belg. 1978, 87, 229). Como
sustratos de la reacción de tionación se usan las correspondientes
amidas II,
las cuales se preparan por reacción
de vacilación entre un ácido o derivado de ácido, como electróforo,
y una ramina, como cervantófilo usando metodologías habituales en
síntesis orgánica y las cuales son conocidos por los expertos
en la técnica (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, Boca Ratón, 1997;
Comprehensive Organic Synthesis, vol 6, Pergamon Press, 1991).
en la técnica (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, Boca Ratón, 1997;
Comprehensive Organic Synthesis, vol 6, Pergamon Press, 1991).
Una característica esencial de los compuestos de
la presente invención es que son inhibidores de calpaína. Existen
diversas isoformas de calpaína, las cuales son muy parecidas
estructuralmente y, por lo que es conocido, comparten el mismo
mecanismo de acción. Las dos más abundantes son la
micro-calpaína (o calpaína I) y la
mili-calpaína (o calpaína-II), las
cuales se diferencian en ensayos in vitro, en la
concentración de calcio necesaria para su activación. Como las dos
isoformas de la enzima son muy similares, se ha encontrado en
muchos ejemplos de la bibliografía que los inhibidores de calpaína
lo son de ambas isoenzimas (Adv. Synth. Catal. 2002,
344, 855). De esta forma, en la presente invención cuando
mencionemos a la calpaína, hacemos referencia a las dos isoformas
(o isoenzimas) que están incluías en la definición de calpaínas.
Por lo tanto, otro objeto de la presente invención es el uso de un
compuesto de fórmula I como inhibidor de calpaína.
La capacidad de inhibición de calpaína se ha
cuantificado por el valor de IC_{50}, que se define como la
concentración de inhibidor que reduce a la mitad la actividad
catalítica de una enzima. Cuanto más bajo sea el valor de IC_{50},
más potente es el inhibidor. Resultados de inhibición de calpaína I
(la más relevante desde un punto de vista fisiológico) de algunos
compuestos de la presente invención se indican en la tabla 1 y en
la figura 1. Dado que la calpaína II, también denominada
mili-calpaína, necesita más cantidad de calcio para
la activación, posiblemente no tenga un papel fisiológico tan
relevante; pues dicha concentración de calcio causaría la muerte
celular antes de que se pudiera activar la
mili-calpaína. Por esta razón, los ensayos de
inhibición se han realizado para calpaína I, pero son extrapolables
para calpaína II.
| Compuestos | IC_{50} |
| 1 | 94 \muM |
| 2 | 63 \muM |
| 3 | 38 pM (= 0'038 nM) |
| 4 | 69 nM |
| 5 | 71 nM |
| 6 | 52 pM (= 0'052 nM) |
| 7 | 796 nM |
| 8 | 12 \muM |
Algunas de las tioamidas representadas en la
figura 1 son los inhibidores de calpaína más potentes descritos, y
marcan un camino para el diseño de compuestos útiles
terapéuticamente. Debido a que se ha encontrado que la
sobreactivación de la calpaína está implicada en numerosas
enfermedades degenerativas, un objeto adicional de la presente
invención es el uso de un compuesto de fórmula I para el tratamiento
o prevención de enfermedades degenerativas así como para preparar
un medicamento para el tratamiento preventivo o terapéutico de una
enfermedad degenerativa, y en especial cuando la enfermedad
degenerativa está seleccionada entre isquemia cerebral, isquemia
cardíaca, Alzheimer, Parkinson, distrofia muscular, cataratas y
enfermedades desmielinizantes, y en especial si la enfermedad
desmielinizante es la esclerosis múltiple.
La figura 1 muestra resultados del estudio de
las tioamidas derivadas de bifenilo objetos de la presente invención
y su actividad biológica como inhibidores de calpaína I.
Como ejemplos ilustrativos, aunque no
limitantes, se indican los procedimientos experimentales, datos
espectroscópicos y analíticos de algunas tioamidas de fórmula I,
así como ensayos de la actividad biológica de los mismos.
Sobre una disolución de la correspondiente
bisamida derivada de bifenilo (compuestos del tipo A, 0'35 mol, 1
equiv.) en confluente (10 ml), se añadió en pequeñas porciones el
reactivo de Lawesson (0'78 mmol, 1'1 equiv.). La mezcla de reacción
se agitó a reflujo durante 2 horas. La evaporación del disolvente
dio lugar a un residuo que se purificó mediante cromatografía en
columna para dar lugar a las correspondientes ditioamidas
(compuestos del tipo B) junto con las monotioamidas (compuestos del
tipo C), las cuales se purificaron mediante cromatografía en
columna tal y como se indica en cada caso.
Siguiendo el procedimiento general, se
sintetizó, junto al compuesto 2, con un 54% de rendimiento tras
cromatografía en columna (gradiente hexano/AcOEt: 9/1 hasta
hexano/AcOEt: 1/1). Sólido amarillo pálido.
[\alpha]^{25}_{D} = -3 (c = 0'33,
MeOH).
^{1}H-RMN (300 MHz,
CDCl_{3}, 30ºC, mezcla de confórmeros A+a, 1'2:1) \delta: 9'00
(d, 1'1H, J_{NH,CH\alpha} = 7'0, NH, a), 9'89 (d, 1'1H,
J_{NH,CH\alpha} = 7'0, NH, A), 7'47-7'23 (m, 12H,
H_{arom.}, A+a), 7'23-7'05 (m, 6H, H_{arom.},
A+a), 5'40 (m, 0'9H, CH_{\alpha}-Phe, a),
5'24 (m, 1'1H, CH_{\alpha}-Phe, A), 3'67
(s, 3'2H, CO_{2}CH_{3}, A), 3'58 (s, 2'8H,
CO_{2}CH_{3}, a), 3'25 (A de ABX, 0'9H,
J_{H\alpha,H\beta} = 13'9, J_{H\alpha,CH\alpha} = 8'1,
C(H_{\alpha}H_{\beta})-Phe, a), 3'14 (B
de ABX, 0'9H, J_{H\beta,H\alpha} = 13'9, J_{H\beta,CH\alpha} =
5'2, C(H_{\alpha}H_{\beta})-Phe,
a), 2'95 (A de ABX, 1'1H, J_{H\alpha,H\beta} = 13'9,
J_{H\alpha,CH\alpha} = 8'1,
C(H_{\alpha}H_{\beta})-Phe, A), 2'81 (B
de ABX, 1'1H, J_{H\beta,H\alpha} = 13'9, J_{H\beta,CH\alpha}
=
5'2, C(H_{\alpha}H_{\beta})-Phe, A) ppm.
5'2, C(H_{\alpha}H_{\beta})-Phe, A) ppm.
^{13}C-RMN (75 MHz,
CDCl_{3}, 30ºC, mezcla de confórmeros A+a) \delta: 200'2 (s, CS,
a), 200'0 (s, CS, A), 170'8 (s, CO, A), 170'7 (s, CO, a), 141'7 (s,
C_{arom.}, a), 141'6 (s, C_{arom.}, A), 137'2 (s, C_{arom.},
A), 137'0 (s, C_{arom.}, a), 135'6 (s, 2C, C_{arom.}, A+a),
130'1 (d, C_{arom.},), 129'7 (d C_{arom.},), 129'2 (d
C_{arom.},), 129'1 (d C_{arom.},), 129'0 (d C_{arom.},), 128'6
(d C_{arom.},), 127'9 (d C_{arom.},), 127'7 (d C_{arom.},),
127'5 (d C_{arom.},), 127'4 (d C_{arom.},), 127'2 (d
C_{arom.},), 59'2 (d, CH_{\alpha}-Phe,
A), 59'0 (d, CH_{\alpha}-Phe, a), 52'5 (c,
CO_{2}CH_{3}, a), 52'3 (c, CO_{2}CH_{3}, A),
36'8 (t, CH_{2}-Phe, a), 36'4 (t,
CH_{2}-Phe, A) ppm.
IR \nu 3436, 3025, 2951, 1743, 1631, 1530,
1496, 1434, 1374, 1215, 956, 749, 700 cm^{-1}
EM (ES^{+}) m/e = 597 ([MH]^{+},
100%).
| AE Calculado para | C_{34}H_{32}N_{2}O_{4}S_{2}: | C, 68'43; H, 5'40; N, 4'69; S, 10'75. |
| Encontrado: | C, 68'25; H, 5'19; N, 4'61; S, 10'51. |
Se sintetizó, junto al compuesto 2, siguiendo el
procedimiento general indicado en el ejemplo 1. Se obtuvo con un
45% de rendimiento tras purificación en columna (gradiente
hexano/AcOEt : 9/1 hasta hexano/AcOEt : 1/1). Sólido amarillo
pálido.
[\alpha]_{D} = -10 (c = 0'11,
MeOH).
^{1}H-RMN (400 MHz,
CDCl_{3}, mezcla de confórmeros A+a, 4:3) \delta: 10'02 (d,
0'57H, J_{NH,CH\alpha} = 7'5, NH-Phe_{2}, A),
9'89 (d, 0'43H, J_{NH,CH\alpha} = 7'5,
NH-Phe_{2}, a), 7'61 (dd, 0'57H, J_{orto} = 7'7,
J_{meta} = 1'5, H_{arom.}, A), 7'49 (dd, 0'43H, J_{orto}
=
7'7, J_{meta} = 1'5, H_{arom.}, a), 7'44-7'15 (m, 15H, H_{arom.}, A+a), 7'11 (dd, 0'57H, J_{orto} = 8'1, J_{meta} = 1'5, H_{arom.}, A), 7'07 (dd, 0'43H, J_{orto} = 7'8, J_{meta} = 1'8, H_{arom.}, a), 7'05 (dd, 0'43H, J_{orto} = 7'8, J_{meta} = 1'9, H_{arom.}, a), 6'96 (dd, 0'57H, J_{orto} =
8'1, J_{meta} = 1'4, H_{arom.}, A), 6'93 (d, 0'43H, J_{NH,CH\alpha} = 7'4, NH-Phe_{1}, a), 6'93 (d, 0'57H, J_{NH,CH\alpha} = 7'4, NH-Phe_{1}, A), 5'24 (X de ABX, 0'57H, CH_{\alpha}-Phe_{2}, A), 5'12 (X de ABX, 0'43H, CH_{\alpha}-Phe_{2}, a), 4'84 (X' de A'B'X', 1H, CH_{\alpha}-Phe_{1}, A+a), 3'71 (s, 1'71H, CO_{2}CH_{3}-Phe_{2}, A), 3'66 (s, 1'29H, CO_{2}CH_{3}-Phe_{2}, a), 3'52 (s, 1'71H, CO_{2}CH_{3}-Phe_{1}, A), 3'40 (s, 1'29H, CO_{2}CH_{3}-Phe_{1}, a), 3'23 (A' de A'B'X', 0'57H, J_{H\alpha,H\beta} = 13'9, C(H_{\alpha}H_{\beta})-Phe_{1}, A), 3'04 (m, 0'57H, C(H_{\alpha}H_{\beta})-Phe_{1}, A; 0'86H, CH_{2}-Phe_{1}, a; 0'86H, CH_{2}-Phe_{2}, a), 2'43 (A de ABX, 0'57H, J_{H\beta,H\alpha} = 13'7, J_{H\beta,CH\alpha} = 7'8, C(H_{\alpha}H_{\beta})-Phe_{2}, A), 2'31 (B de ABX, 0'57H, J_{H\beta,H\alpha} = 13'7, J_{H\beta,CH\alpha} = 52, C(H_{\alpha}H_{\beta})-Phe_{2}, A) ppm.
7'7, J_{meta} = 1'5, H_{arom.}, a), 7'44-7'15 (m, 15H, H_{arom.}, A+a), 7'11 (dd, 0'57H, J_{orto} = 8'1, J_{meta} = 1'5, H_{arom.}, A), 7'07 (dd, 0'43H, J_{orto} = 7'8, J_{meta} = 1'8, H_{arom.}, a), 7'05 (dd, 0'43H, J_{orto} = 7'8, J_{meta} = 1'9, H_{arom.}, a), 6'96 (dd, 0'57H, J_{orto} =
8'1, J_{meta} = 1'4, H_{arom.}, A), 6'93 (d, 0'43H, J_{NH,CH\alpha} = 7'4, NH-Phe_{1}, a), 6'93 (d, 0'57H, J_{NH,CH\alpha} = 7'4, NH-Phe_{1}, A), 5'24 (X de ABX, 0'57H, CH_{\alpha}-Phe_{2}, A), 5'12 (X de ABX, 0'43H, CH_{\alpha}-Phe_{2}, a), 4'84 (X' de A'B'X', 1H, CH_{\alpha}-Phe_{1}, A+a), 3'71 (s, 1'71H, CO_{2}CH_{3}-Phe_{2}, A), 3'66 (s, 1'29H, CO_{2}CH_{3}-Phe_{2}, a), 3'52 (s, 1'71H, CO_{2}CH_{3}-Phe_{1}, A), 3'40 (s, 1'29H, CO_{2}CH_{3}-Phe_{1}, a), 3'23 (A' de A'B'X', 0'57H, J_{H\alpha,H\beta} = 13'9, C(H_{\alpha}H_{\beta})-Phe_{1}, A), 3'04 (m, 0'57H, C(H_{\alpha}H_{\beta})-Phe_{1}, A; 0'86H, CH_{2}-Phe_{1}, a; 0'86H, CH_{2}-Phe_{2}, a), 2'43 (A de ABX, 0'57H, J_{H\beta,H\alpha} = 13'7, J_{H\beta,CH\alpha} = 7'8, C(H_{\alpha}H_{\beta})-Phe_{2}, A), 2'31 (B de ABX, 0'57H, J_{H\beta,H\alpha} = 13'7, J_{H\beta,CH\alpha} = 52, C(H_{\alpha}H_{\beta})-Phe_{2}, A) ppm.
^{13}C-RMN (75 MHz,
CDCl_{3}, 30ºC, mezcla de confórmeros A+a, 4:3) \delta: 200'4
(s, CS, a), 199'8 (s, CS, A), 171'9 (s, CO, a), 171'6 (s, CO, A),
170'7 (s, CO, A), 170'5 (s, CO, a), 169'7 (s, CO, a), 169'6 (s, CO,
A), 142'3 (s, C_{arom.}, a), 142'2 (s, C_{arom.}, A), 139'7 (s,
C_{arom.}, a), 139'2 (s, C_{arom.}, a), 136'2 (s, C_{arom.},
a), 136'1 (s, C_{arom.}, A), 136'0 (s, 2C, C_{arom.}, A), 1 35'7
(s, 2 C, C_{arom.}, a ), 134'9 (s, C_{arom.}, a), 1 34'5 (s,
C_{arom.}, A), 1 30'4 (d, C arom.), 130'34 (d, C_{arom.}), 130'0
(d, C_{arom.}), 129'9 (d, C_{arom.}), 129'4 (d, C_{arom.}),
129'3 (d, C_{arom.}), 129'22 (d, C_{arom.}), 129'1 (d,
C_{arom.}), 128'9 (d, C_{arom.}), 128'8 (d, C_{arom.}), 128'7
(d, C_{arom.}), 128'65 (d, C_{arom.}), 128'62 (d, C_{arom.}),
128'5 (d, C_{arom.}), 128'4 (d, C_{arom.}), 128'2 (d,
C_{arom.}), 127'9 (d, C_{arom.}), 127'8 (d, C_{arom.}), 127'7
(d, C_{arom.}), 127'5 (d, C_{arom.}), 127'3 (d, C_{arom.}),
127'1 (d, C_{arom.}), 126'9 (d, C_{arom.}), 126'8 (d,
C_{arom.}), 127'6 (d, C_{arom.}), 126'4 (d, C_{arom.}), 59'6
(d, CH_{\alpha}-Phe_{2}, A), 59'5 (d,
CH_{\alpha}-Phe_{2}, a), 53'6 (d,
CH_{\alpha}-Phe_{1}, a), 53'4 (d,
CH_{\alpha}-Phe_{1}, A), 52'45 (c,
CO_{2}CH_{3}-Phe_{2}, A), 52'42 (c,
CO_{2}CH_{3}-Phe_{2}, a), 52'2 (c,
CO_{2}CH_{3}-Phe_{1}, a), 52'0 (c,
CO_{2}CH_{3}-Phe_{1}, A), 37'7 (t,
CH_{2}-Phe_{1}, a), 37'4 (t,
CH_{2}-Phe_{1}, A), 37'3 (t,
CH_{2}-Phe_{2}, a), 36'5 (t,
CH_{2}-Phe_{2},
A) ppm.
A) ppm.
IR \nu 3436, 3027, 2950, 1744, 1639, 1535,
1436, 1368, 1219, 754, 701 cm^{-1}.
EM (ES^{+}) m/e = 581 ([MH]^{+},
100%), 603 ([MH]^{+}, 36%).
| AE Calculado para | C_{34}H_{32}N_{2}O_{5}S: | C, 70'32; H, 5'55; N, 4'82; S, 5'52. |
| Encontrado: | C, 70'25; H, 5'49; N, 4'69; S, 5'81. |
Se obtuvo, junto al compuesto 4, siguiendo el
procedimiento general, con un rendimiento del 37% tras
cromatografia en columna (gradiente hexano/AcOEt : 9/1 hasta
hexano/AcOEt : 3/7). Sólido amarillo pálido.
P.f. = 125-127ºC.
[\alpha]_{D} = -31 (c = 0'25,
MeOH).
^{1}H-RMN (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta: 10'82 (s, 2H,
2-NH-Indol), 10'71 (s ancho, 2H,
2-NH-Trp), 7'46-7'20
(m, 10H, H_{arom.}, 7'10-6'97 (m, 8H,
H_{arom.}), 5'07 (m, 2H, CH_{\alpha} Trp), 3'50 (s, 6H,
CO_{2}CH_{3}), 2'97 (m, 1H,
C(H_{\alpha}H_{\beta})-Trp), 2'73 (m, 1H,
C(H_{\alpha}H_{\beta})-Trp)
ppm.
^{13}C-RMN (75 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta: 199'3 (s, 2C, CS), 170'1 (s, 2C, CO),
141'1 (s, 2C, C_{arom.}), 136'1 (s, 6C, C_{arom.}), 128'9 (d,
2C, C_{arom.}), 127'6 (d, 2C, C_{arom.}), 126'8 (d, 2C,
C_{arom.}), 123'6 (d, 4C, C_{arom.}), 121'1 (d, 4C,
C_{arom.}), 118'5 (s, 2C, C_{arom.}), 117'9 (d, 2C,
C_{arom.}), 111'5 (d, 2C, C_{arom.}), 59'1 (d, 2C,
CH_{\alpha},-Trp), 51'0 (c, 2C, CO_{2}CH_{3}),
26'5 (t, 2C, CH_{2}-Trp) ppm.
IR \nu 3413, 3012, 2949, 2846, 1737, 1621,
1513, 1457, 1434, 1373, 1216, 1095, 1009, 957, 743 cm^{-1}.
EM (ES^{+}) m/e = 675 ([MH]^{+},
100%), 697 ([MNa]^{+}, 9%).
| AE Calculado para | C_{38}H_{34}N_{4}O_{4}S_{2}: | C, 67'63; H, 5'08; N, 8'30; S, 9'50. |
| Encontrado: | C, 67'51; H, 5'32; N, 8'04; S, 9'21. |
Se obtuvo junto al compuesto 3, siguiendo el
procedimiento general, con un rendimiento del 35% tras
cromatografia en columna (gradiente hexano/AcOEt : 9/1 hasta
hexano/AcOEt : 3/7). Sólido amarillo pálido.
[\alpha]^{25}_{D} = -12 (c = 0'15,
MeOH).
^{1}H-RMN (300 MHz,
CD_{3}OD) \delta: 10'80 (s, 1H, NH-Indol), 10'72
(s, 1H, NH-Indol), 10'70 (s ancho, 1H,
NH-Trp_{2}), 8'80 (d, 1H, J_{NH,CH\alpha} = 6'8,
NH-Trp_{1}), 7'67 (m, 2H, H_{arom.}),
7'59-7'29 (m, 8H, H_{arom.}),
7'28-7'03 (m, 8H, H_{arom.}), 5'32 (m, 1H,
CH_{\alpha} Trp_{2}), 4'86 (m, 1H,
CH_{\alpha}-Trp_{1}), 3'77 (s, 3 H,
CO_{2}CH_{3}), 3'72 (s, 3 H, CO_{2}CH_{3}),
3'37 (m, 1H,
CH_{\alpha}H_{\beta}-Trp_{2}; 1H,
CH_{\alpha}H_{\beta}-Trp_{1}), 3'12 (m,
1H, CH_{\alpha}H_{\beta}-Trp_{1}), 3'02
(m, 1H, CH_{\alpha}H_{\beta}-Trp_{2})
ppm.
^{13}C-RMN (75 MHz,
CD_{3}OD) \delta: 202'0 (s, CS), 173'6 (s, CO), 172'4 (s, CO),
172'3 (s, CO), 143'4 (s, 2C, C_{arom.}), 138'0 (s, 4C,
C_{arom.}), 136'4 (s, C_{arom.}), 130'8 (d, C_{arom.}), 130'7
(d, C_{arom.}), 130'5 (d, C_{arom.}), 129'8 (d, C_{arom.}),
129'0 (d, C_{arom.}), 128'5 (d, C_{arom.}), 128'6 (d,
C_{arom.}), 124'4 (d, C_{arom.}), 122'4 (d, 2C, C_{arom.}),
119'8 (d, C_{arom.}), 119'3 (d, C_{arom.}), 119'2 (d,
C_{arom.}), 112'4 (d, 2C, C_{arom.}), 110'7 (s, C_{arom.}),
110'4 (s, C_{arom.}), 60'7 (d, CH_{\alpha},-Trp_{2}),
55'2 (d, CH_{\alpha},-Trp_{1}), 52'7 (c, 2C,
CO_{2}CH_{3}), 28'3 (t,
CH_{2}-Trp_{1}), 27'9 (t,
CH_{2}-Trp_{2}) ppm.
IR \nu 3413, 3054, 2949, 1737, 1640, 1522,
1491, 1457, 1436, 1354, 1217, 1094, 1009, 744 cm^{-1}.
EM (ES^{+}) m/e = 659 ([MH]^{+},
100%), 681 ([MNa]^{+}, 16%).
| AE Calculado para | C_{38}H_{34}N_{4}O_{5}S: | C, 69'28; H, 520;N, 8'50; S, 4'87. |
| Encontrado: | C, 69'13; H, 5'41; N, 8'58; S, 5'01. |
Se obtuvo, junto al compuesto 6, con un
rendimiento del 67% tras cromatografía en columna (gradiente
hexano/AcOEt : 9/1 hasta hexano/AcOEt : 4/6), empleando el método
general descrito. Sólido amarillo pálido.
[\alpha]^{25}_{D} = +3 (c = 0'28,
MeOH).
^{1}H-RMN (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta: 10'45 (s ancho, 2H,
2-NH-Val), 7'36 (m, 6H,
H_{arom.}), 7'11 (m, 2H, H_{arom.}), 4'72 (m, 2H,
CH_{\alpha}-Val), 3'60 (s, 6H,
CO_{2}CH_{3}), 2'03 (m, 1H, CH- Val), 0'81 (s
ancho, 6H,
CH(CH_{3})(CH_{3})-Val), 0'72 (s
ancho, 6H, CH(CH_{3})(CH_{3})-Val)
ppm.
^{13}C-RMN (75 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta: 200'3 (s, 2C, CS), 169'7 (s, 2C, CO),
141'3 (s, 2C, C_{arom.}), 136'5 (s, 2C, C_{arom.}), 129'3 (d,
2C, C_{arom.}), 128'8 (d, 2C, C_{arom.}), 128'0 (d, 2C,
C_{arom.}), 127'4 (d, 2C, C_{arom.}), 64'2 (d, 2C,
CH_{\alpha},-Val), 51'7 (c, 2C, CO_{2}CH_{3}),
29'8 (d, 2C,
CH(CH_{3})_{2}-Val), 18'8
(c, CH(CH_{3})(CH_{3})-Val), 18'5 (c,
CH(CH_{3})(CH_{3})-Val) ppm.
IR \nu 3437, 3005, 2965, 2873, 1742, 1633,
1525, 1467, 1434, 1376, 1260, 1207, 1152, 1111, 1004, 748
cm^{-1}.
EM (ES^{+}) m/e = 501 ([MH]^{+},
100%), 523 ([MH]^{+}, 35%).
| AE Calculado para | C_{26}H_{32}N_{2}O_{4}S_{2}: | C, 62'37; H, 6'44; N, 5'60; S, 12'81. |
| Encontrado: | C, 62'18; H, 6'61; N, 5'58; S, 12'68. |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo junto al compuesto 5, siguiendo el
procedimiento general, con un rendimiento del 11% tras
cromatografia en columna (gradiente hexano/AcOEt : 9/1 hasta
hexano/AcOEt : 4/6). Sólido amarillo pálido.
^{1}H-RMN (300 MHz,
CD_{3}OD) \delta: 10'57 (s ancho, 1H,
NH-Val_{2}), 8'67 (d, 1H, J_{NH,CH\alpha} =
8'3, NH-Val_{1}), 7'54 (m, 1H, H_{arom.}), 7'41
(m, 5H, H_{arom.}), 7'27-7'09 (m, 2H,
H_{arom.}), 4'85 (m, 1H,
CH_{\alpha}-Val_{2}), 4'27 (m, 1H,
CH_{\alpha}-Val_{1}), 3'69 (s, 3H,
CO_{2}CH_{3}), 3'67 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}),
2'06 (m, 2H, CH-Val), 0'87 (m, 6H,
CH(CH_{3})_{2}-Val), 0'75
(m, 6H, CH(CH_{3})_{2}-Val)
ppm.
^{13}C-RMN (75 MHz,
CD_{3}OD) \delta: 203'0 (s, CS), 173'2 (s, CO), 172'8 (s, CO),
172'0 (s, CO), 143'8 (s, C_{arom.}), 140'4 (s, C_{arom.}), ),
138'7 (s, C_{arom.}), 136'8 (s, C_{arom.}), 131'2 (d,
C_{arom.}), 130'9 (d, 2C, C_{arom.}), 130'0 (d, C_{arom.}),
128'9 (d, 2C, C_{arom.}), 128'8 (d, 2C, C_{arom.}), 65'4 (d,
CH_{\alpha},-Val_{2}), 59'8 (d,
CH_{\alpha},-Val_{1}), 52'4 (c, 2C,
CO_{2}CH_{3}), 32'1 (d,
CH(CH_{3})_{2}-Val),), 31'8
(d, CH(CH_{3})_{2}-Val),
19'4 (c, CH(CH_{3})(CH_{3})-Val), 19'2
(c, CH(CH_{3})(CH_{3})-Val), 19'1
(c, CH(CH_{3})(CH_{3})-Val), 18'6 (c,
CH(CH_{3})(CH_{3})-Val) ppm.
IR \nu 3430, 3021, 2963, 2923, 2873, 1742,
1642, 1532, 1468, 1435, 1376, 1315, 1262, 1207, 1155, 1100, 1020,
801, 756 cm^{-1}.
EM (ES^{+}) m/e = 485 ([MH]^{+},
100%).
| AE Calculado para | C_{26}H_{32}N_{2}O_{5}S: | C, 64'44; H, 6'66; N, 578; S, 6'62. |
| Encontrado: | C, 64'68; H, 6'76; N, 5'53; S, 6'65. |
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo junto al compuesto 8, siguiendo el
procedimiento general, con un rendimiento del 3% tras cromatografia
en columna (gradiente CH_{2}Cl_{2}/AcOEt : 9/1 hasta
CH_{2}Cl_{2}/AcOEt: 1/1). Sólido amarillo pálido.
P.f. = 62-65ºC.
[\alpha]^{25}_{D} = -4 (c = 0'15,
MeOH).
^{1}H-RMN (300 MHz,
CDCl_{3}, 30ºC, mezcla de confórmeros A+a, 3:2) \delta: 8'97
(d, 0'8H, J_{NH,CH\alpha} = 8'0, NH, a), 7'80
(d, 1'2H, J_{NH,CH\alpha} = 7'0, NH, A),
7'46-7'02 (m, 8H, H_{arom.}, A+a), 6'97
(d, 1'6H, J_{orto} = 8'3, H_{arom.}-Tyr,
a), 6'88 (d, 2'4H, J_{orto} = 8'3,
H_{arom.}-Tyr, A), 6'71 (d, 2'4H,
J_{orto} = 8'3, H_{arom.}-Tyr, A), 6'70
(d, 1'2H, J_{orto} = 8'3,
H_{arom.}-Tyr, A), 5'32 (m, 1'2H,
CH_{\alpha}-Tyr, A), 5'22 (m, 0'8H,
CH_{\alpha} Tyr, a), 3'67 (s, 3'6H,
CO_{2}CH_{3}, A), 3'56 (s, 2'4H,
CO_{2}CH_{3}, a), 3'15 (A de ABX, 0'8H,
J_{H\alpha,H\beta} = 14'1, J_{H\alpha,CH\alpha} =
8'1, C(H_{\alpha}H_{\beta})-Tyr, a),
3'14 (B de ABX, 0'8H, J_{H\beta,H\alpha} = 14'1,
J_{H\beta,CH\alpha} = 5'2,
C(H_{\alpha}H_{\beta})-Tyr, a),
2'92 (A de ABX, 1'2H, J_{H\alpha,H\beta} = 14'1,
J_{H\alpha,CH\alpha} = 8'1,
C(H_{\alpha}H_{\beta})-Tyr, A), 2'74 (B
de ABX, 1'2H, J_{H\beta,H\alpha} = 14'1,
J_{H\beta,CH\alpha} = 5'2,
C(H_{\alpha}H_{\beta})-Tyr, A)
ppm.
^{13}C-RMN (75 MHz,
CDCl_{3}, 30ºC, mezcla de confórmeros A+a, 3:2) \delta: 200'2
(s, CS, a), 200'0 (s, CS, A), 170'9
(s, CO, A), 170'7 (s, CO, a), 154,7 (s,
C_{arom.}, A), 153,7 (s, C_{arom.}, a), 141'6 (s,
C_{arom.}, A), 141'5 (s, C_{arom.}, a), 137'2 (s,
C_{arom.}, A), 137'0 (s, C_{arom.}, a), 130'4 (d,
C_{arom.}, A), 130'2 (d C_{arom.}, a), 129'9 (d
C_{arom.}, a), 129'8 (d C_{arom.}, A), 129'2 (d
C_{arom.}, A), 129'1 (d C_{arom.}, a), 127'8 (d
C_{arom.}, a), 127'7 (d C_{arom.}, ), 127'7 (d
C_{arom.}, A), 127'6 (d C_{arom.}, A), 127'5 (d
C_{arom.}, a), 115'5 (d C_{arom.}, A), 115'4 (d
C_{arom.}, a), 59'3 (d,
CH_{\alpha}-Tyr, a), 59'1 (d,
CH_{\alpha}-Tyr, A), 52'5 (c,
CO_{2}CH_{3}, a), 52'4 (c,
CO_{2}CH_{3}, A), 36'0 (t,
CH_{2}-Tyr, A), 35'7 (t,
CH_{2}-Phe, a) ppm.
IR \nu 3436, 3025, 2951, 1743, 1631, 1530,
1496, 1434, 1374, 1215, 956, 749, 700 cm^{-1}
EM (ES^{+}) m/e = 629 ([MH]^{+},
100%), 651 ([MNa]^{+}, 15%).
| AE Calculado para | C_{34}H_{32}N_{2}O_{6}S_{2}: | C, 64'95; H, 5'13; N, 4'46; S, 10'20. |
| Encontrado: | C, 65'21; H, 5'28; N, 4'61; S, 10'51. |
Se obtuvo junto al compuesto 7, siguiendo el
procedimiento general, con un rendimiento del 9% tras cromatografia
en columna (gradiente CH_{2}Cl_{2}/AcOEt : 9/1 hasta
CH_{2}Cl_{2}/AcOEt: 1/1). Sólido amarillo pálido.
P.f. = 87-91ºC.
[\alpha]^{25}_{D} = -12 (c = 0'51,
MeOH).
^{1}H-RMN (300 MHz,
CD_{3}OD) \delta: 10'72 (s ancho, 1H,
NH-Tyr_{2}), 8'78 (d ancho, 1H,
NH-Tyr_{1}), 7'32 (m, 8H, H_{arom.}),
7'02-6'76 (m, 4H,
H_{arom.}-Tyr), 6'68 (d, 4H,
J_{orto} = 8'0, H_{arom.}-Tyr), 5'06
(m, 1H, CH_{\alpha}-Tyr_{2}),
4'55 (m, 1H, CH_{\alpha}-Tyr_{1}),
3'57 (s, 3H, CO_{2}CH_{3} -Tyr_{2}), 3'55
(s, 3H, CO_{2}CH_{3}-Tyr_{1}),
3'02-2'59 (m, 2H,
C(H_{\alpha}H_{\beta})-Tyr_{2};
1H, C(H_{\alpha}H_{\beta})-Tyr_{1}),
2'37 (m, 1H,
C(H_{\alpha}H_{\beta})-Tyr_{1})
ppm.
^{13}C-RMN (75 MHz,
CD_{3}OD) \delta: (75 MHz, CD_{3}OD) \delta: 202'2
(s, CS), 171'3 (s, CO), 170'2 (s, CO), 170'1
(s, CO), 155'5 (s, C_{arom.}), 155'4 (s,
C_{arom.}), 1417 (s, C_{arom.}), 141'5 (s,
C_{arom.}), 138'4 (s, 3C, C_{arom.}), 136'4 (s,
C_{arom.}), 134'4 (d, C_{arom.}), 129'3 (d, 2C,
C_{arom.}), 129'0 (d, 2C, C_{arom.}), 128'7 (d,
C_{arom.}), 128'0 (d, C_{arom.}), 127'0 (d,
C_{arom.}), 126'7 (d, 2C, C_{arom.}), 114'4 (d,
2C, C_{arom.}), 59'7 (d, CH_{\alpha},-Tyr_{2}),
53'9 (d, CH_{\alpha},-Tyr_{1}), 50'8 (c,
CO_{2}CH_{3}), 50'7 (c, CO_{2}CH_{3}),
35'6 (t, CH_{2}-Tyr_{2}), 35'1
(t, CH_{2}-Tyr_{1}) ppm.
IR \nu 3427, 3014, 2949, 1735, 1635, 1515,
1437, 1363, 1223, 755, 701 cm^{-1}.
EM (ES^{+}) m/e = 613 ([MH]^{+},
100%), 635 ([MNa]^{+}, 25%).
| AE Calculado para | C_{34}H_{32}N_{2}O_{7}S: | C, 66'65; H, 526;N, 4'57; S, 523. |
| Encontrado: | C, 66'86; H, 5'39; N, 4'61; S, 5'51. |
La capacidad de inhibición de calpaína se ha
cuantificado por el valor de IC_{50}, que se define como la
concentración de inhibidor que reduce a la mitad la actividad
catalítica de una enzima. Cuanto más bajo sea el valor de
IC_{50}, más potente es el inhibidor. Resultados de inhibición de
calpaína I (la más relevante desde un punto de vista fisiológico)
de algunos compuestos de la presente invención se indican en la
tabla 1 y en la figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
| Compuestos | IC_{50} |
| 1 | 94 \muM |
| 2 | 63 \muM |
| 3 | 38 pM (= 0'038 nM) |
| 4 | 69 nM |
| 5 | 71 nM |
| 6 | 52 pM (= 0'052 nM) |
| 7 | 796 nM |
| 8 | 12 \muM |
Para realizar el ensayo de inhibición de
calpaínas, utilizamos el kit EnzCheck® Protease Assay Kit
E-338 de Molecular Probes. Este kit contiene caseína
marcada con BODIPY FL®, liofilizada desde tampón fosfato. Además se
utiliza como tampón de digestión Tris-HCl a pH 7.8,
conteniendo 2 mM de azida sódica.
La calpaína I de eritrocitos porcinos o calpaína
II de riñón porcino utilizadas son productos comerciales de
CALBIOCHEM®. La disolución stock de enzima contiene 20 mM de tampón
imidazol-HCl, PH 6.8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM
\beta-mercaptoetanol 30% en glicerol.
Los inhibidores sintéticos se disolvieron en 250
\muL de DMSO. Los ensayos se realizaron en microplacas de 96
pocillos en un volumen final de 200 \muL. Para realizar los
ensayos se añadieron alícuotas de solución stock de calpaína
a 150 \muL de solución 10 \mug/\muL en tampón de digestión
para obtener una concentración final 50 ng/mL de enzima. Se
añadieron cantidades mínimas, entre 5 y 20 \muL de solución de
inhibidor en DMSO, previamente diluidas para conseguir la
concentración final de inhibidor deseada, y se añade tampón de
digestión hasta conseguir un volumen final de 190 \muL. El ensayo
se inicia añadiendo 10 \muL de solución de CaCl_{2} 0.05 M. Para
cada inhibidor se tomó como blanco medidas separadas excluyendo,
inhibidor, calpaína y disolución de calcio. Todas las medidas se
realizaron por triplicado.
Las medidas de fluorescencia se realizan en un
espectro fluorímetro SPECTRAFLUOR TECAN Corp 93382. Excitando a 485
nm y realizando la lectura a 530 nm. La medida se realizó durante
20 ciclos hasta completar la medida de todos los pocillos. La
agitación es de tipo orbital y tiene lugar entre cada ciclo.
A continuación se indica el significado de las
abreviaturas usadas.
- -
- AE: Análisis elemental.
- -
- CANP: Proteasa neutra activada por calcio.
- -
- DMSO: Dimetilsulfóxido.
- -
- EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético.
- -
- EGTA: Ácido etilen-bis-(oxietilennitrilo)tetraacético.
- -
- EM: Espectro de masas.
- -
- ES: Electro-spray.
- -
- IR: Infrarrojo.
- -
- NMDA: N-metil-D-aspartato.
- -
- P.f.: Punto de fusión.
- -
- Tris: Tris(hidroxmetil)aminometano.
- -
- ^{1}H-RMN: Resonancia magnética nuclear de protón.
- -
- ^{13}C-RMN: Resonancia magnética nuclear de carbono-13.
Claims (6)
1. Un compuesto de fórmula I, que tiene
estructura de bifenilo 2,2'-disustituido,
en la
que:
- -
- el grupo X es oxígeno (O) o azufre (S), indistintamente,
- -
- el asterisco (*) representa un centro estereogénico, de configuración (R) ó (S), indistintamente,
- -
- los grupos R^{1} y R^{2} son iguales o distintos, y están independientemente seleccionados entre los grupos H, alquilo entre 1 y 10 átomos de carbono, arilo, ó arilalquilo,
- -
- los grupos R^{3} y R^{4} son iguales o distintos, y están independientemente seleccionados entre los grupos
- -
- H,
- -
- alquilo entre 1 y 6 átomos de carbono,
- -
- arilo,
- -
- arilalquilo,
- -
- NH_{2},
- -
- NHR^{5} en el que R^{5} representa un grupo alquilo o arilo,
- -
- NR^{6}R^{7} en el que R^{6} y R^{7} representan dos grupos alquilo o arilo, idénticos o diferentes, o formando un sistema cíclico,
- -
- OH,
- -
- OR^{8} en el que R^{8} representa un grupos alquilo o arilo;
y cualquiera de los isómeros
conformacionales (atropisómeros) de dicho compuesto de fórmula
I.
2. Un compuesto de fórmula I, que tiene
estructura de bifenilo 2,2'-disustituido,
en la
que:
- -
- el grupo X es oxígeno (O) o azufre (S), indistintamente,
- -
- el asterisco (*) representa un centro estereogénico, de configuración (R) ó (S), indistintamente,
- -
- los grupos R^{1} y R^{2} son iguales o distintos, y están independientemente seleccionados entre los grupos H, alquilo entre 1 y 10 átomos de carbono, arilo, ó arilalquilo,
- -
- los grupos R^{3} y R^{4} son iguales o distintos, y están independientemente seleccionados entre los grupos
- -
- H,
- -
- alquilo entre 1 y 6 átomos de carbono,
- -
- arilo,
- -
- arilalquilo,
- -
- NH_{2},
- -
- NHR^{5} en el que R^{5} representa un grupo alquilo o arilo,
- -
- NR^{6}R^{7} en el que R^{6} y R^{7} representan dos grupos alquilo o arilo, idénticos o diferentes, o formando un sistema cíclico,
- -
- OH,
- -
- OR^{8} en el que R^{8} representa un grupos alquilo o arilo;
y cualquiera de los isómeros
conformacionales (atropisómeros) de dicho compuesto de fórmula
I;
y por que es un inhibidor de
calpaína.
3. Un compuesto según la reivindicación 1
caracterizado porque es de fórmula I y está seleccionado
entre
-
(S,S)-3-Fenil-2-{[2'-(2-fenil-1-metoxicarbonil-etiltiocarbamoil)-biphenil-2-carbotioil]-amino}-propionato
de
metilo (1),
metilo (1),
-
(S,S)-3-Fenil-2-{[2'-(2-fenil-1-metoxicarbonil-etiltiocarbamoil)-bifenil-2-carbonil]-amino}-propionato
de meti-
lo (2),
lo (2),
-
(S,S)-3-(1H-Indol-3-il)-2-{[2'-(2-(1H-indol-3-il)-1-metoxicarbonil-etiltiocarbamoil)-biphenil-2-carbotioil]-ami-
no}-propionato de metilo (3),
no}-propionato de metilo (3),
-
(S,S)-3-(1H-Indol-3-il)-2-{[2'-(2-(1H-indol-3-il)-1-metoxicarbonil-etiltiocarbamoil)-biphenil-2-carbonil]-ami-
no}-propionato de metilo (4),
no}-propionato de metilo (4),
-
(S,S)-2-{[2'-(1-Metoxicarbonil-2-metil-propiltiocarbamoil)-bifenil-2-carbotioil]-amino}-3-metil-butirato
de me-
tilo (5),
tilo (5),
-
(S,S)-2-12'-(1-Metoxicarbonil-2-metil-propiltiocarbamoil)-bifenil-2-carbonil]-amino}-3-metil-butirato
de me-
tilo (6),
tilo (6),
-
(S,S)-3-(4-Hidroxi-fenil)-2-({2'-[2-(4-hidroxi-fenil)-1-metoxicarbonil-etiltiocarbamoil]-bifenil-2-carbotioil}-a-
mino)-propionato de metilo (7),
mino)-propionato de metilo (7),
y
-
(S,S)-3-(4-Hidroxi-fenil)-2-({2'-[2-(4-hidroxi-fenil)-1-metoxicarbonil-etiltiocarbamoil]-bifenil-2-carbonil}-ami-
no)-propionato de metilo (8);
no)-propionato de metilo (8);
y por que es un inhibidor de
calpaína.
4. Uso de un compuesto inhibidor de calpaína de
fórmula I, definido en la reivindicación 1, para preparar un
medicamento para el tratamiento preventivo o terapéutico de una
enfermedad degenerativa.
\newpage
5. Uso de un compuesto inhibidor de calpaína de
fórmula I según la reivindicación 4 en el que la enfermedad
degenerativa está seleccionada entre isquemia cerebral, isquemia
cardiaca, Alzheimer, Parkinson, distrofia muscular, cataratas y
enfermedades desmielinizantes.
6. Uso de un compuesto inhibidor de calpaína de
fórmula I según la reivindicación 5 en el que la enfermedad
degenerativa desmielinizante es la esclerosis múltiple.
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|---|---|---|---|
| ES200401104A ES2243131B1 (es) | 2004-05-07 | 2004-05-07 | Tiamidas derivadas de bifenilo como inhibidores de calpaina. |
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-
2005
- 2005-05-06 WO PCT/ES2005/070058 patent/WO2005108354A1/es active Application Filing
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- 2005-05-06 US US11/579,737 patent/US7476754B2/en not_active Expired - Fee Related
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|---|
| A. MONTERO et al. "Peptide-Biphenyl Hybrids as Calpain Inhibitors", Chemistry & Biodiversity, marzo 2004, Vol. 1, Nº 3 páginas 442-457, figura 7, compuestos 1,3,5,6. * |
| E. MANN et al. "Synthesis and Crystal Structure of peptide-2-2'-Biphenyl Hybrids", Helv. Chim. Acta, 2002, Vol, 85, Nº 11, páginas 3624-3638, compuesto 6. * |
Also Published As
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Effective date: 20170216 |