ES2241296T3 - Determinacion inmunologica de la proteina sp-c hidrofoba del agente tensioactivo pulmonar. - Google Patents
Determinacion inmunologica de la proteina sp-c hidrofoba del agente tensioactivo pulmonar.Info
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Abstract
Un método para determinar la proteína SP-C del agente tensioactivo pulmonar en una muestra, que comprende llevar a cabo la determinación por un método inmunológico.
Description
Determinación inmunológica de la proteína
SP-C hidrófoba del agente tensioactivo pulmonar.
La invención se refiere a métodos para determinar
la proteína SP-C del agente tensioactivo pulmonar, a
anticuerpos específicos de SP-C y a la provisión de
un kit de reactivos para llevar a cabo los métodos.
Los pulmones de todos los vertebrados contienen
una mezcla de sustancias denominada "agente tensioactivo
pulmonar". Dicha mezcla de sustancias tiene propiedades
tensioactivas y reduce la tensión superficial en la región alveolar
de los pulmones. Además de fosfolípidos tales como
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y fosfatidilglicerol (PG), el
agente tensioactivo pulmonar contiene proteínas como componentes
esenciales adicionales. Hasta la fecha, se han descrito cuatro
proteínas tensioactivas diferentes, que se designan
SP-A, SP-B, SP-C y
SP-D, correspondiendo al orden en el que se
descubrieron (Possmayer, F.: A Proposed Nomenclature for Pulmonary
Surfactant-associated Proteins. Am. Rev. Respir.
Dis. 1988, 138, 990-998). El término SP significa
proteína tensioactiva (proteína asociada al agente tensioactivo,
SP).
SP-B y en particular
SP-C son proteínas fuertemente hidrófobas. La
proporción total de proteínas hidrófobas en el agente tensioactivo
pulmonar es aproximadamente 1% (Curstedt, T., Jörnvall, H.,
Robertson, B., Bergmann, T., Bergren, P.: Two Hydrophobic
Low-Molecular-Mass Protein Fractions
of Pulmonary Surfactant. Characterization and Biophysical Activity.
Eur. J. Biochem. 1987, 168, 255-262).
La determinación (detección y, en particular,
cuantificación) de estas proteínas hidrófobas en muestras de agente
tensioactivo pulmonar (por ejemplo de lavado pulmonar) proporciona
frecuentemente resultados insatisfactorios cuando se utilizan las
técnicas empleadas para proteínas hidrófilas, si es que ello es
posible en absoluto. Los métodos que se utilizan habitualmente para
la separación y determinación de proteínas hidrófilas, tales como,
por ejemplo, las técnicas "transferencia Western" o ELISA
(Ensayo de Inmunosorbente Unido a Enzima) pueden aplicarse a
proteínas hidrófobas únicamente en ciertas condiciones, dado que por
una parte la "transferencia Western" per se es
semicuantitativa y, por otra parte, el uso de un ensayo ELISA es muy
problemático, dado que el mismo puede llevarse a cabo por regla
general únicamente con proteínas que son solubles en sistemas
acuosos. En la mayoría de los casos, únicamente están presentes
trazas de los analitos a cuantificar. Adicionalmente, en las
muestras a analizar, SP-B y SP-C
están asociadas frecuentemente con otras sustancias hidrófobas (por
ejemplo lípidos), lo que hace aún más difícil la cuantificación por
los métodos habituales. En el método ELISA, usualmente la sustancia
a examinar no se separa antes de la determinación de los otros
componentes que están contenidos en la mezcla.
Van Eijk y colaboradores (Van Eijk, M., De Haas,
C.G.M. and Haagsman, H.P.: Quantitative Analysis of Pulmonary
Surfactant Proteins B and C. Analytical Biochemistry 1995, 232,
231-237) describen un proceso para cuantificación de
SP-C y SP-B en muestras de agente
tensioactivo pulmonar. Extractos que contienen proteínas
tensioactivas se separan por cromatografía líquida a alta presión, y
se detectan y cuantifican SP-B o
SP-C por absorción a 228 nm. (Los límites de
detección están situados a 1 \mug de SP-B y 4
\mug de SP-C.)
Para SP-B, se ha descrito una
detección cuantitativa por la técnica ELISA (Krämer, H.J., Schmidt,
R., Günther, A., Becher, G., Suzuki, Y., Seeger, W.: ELlSA Technique
for Quantification of Surfactant Protein B (SP-B) in
Bronchoalveolar Lavage Fluid. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1995,
152, 1540-1544). Un inmunoensayo para la
determinación de SP-C no ha sido descrito hasta
ahora, debido al parecer a que la preparación de anticuerpos
específicos de SP-C no ha tenido éxito (Beers, M.F.,
Wali, A., Eckenhoff, M.F., Feinstein, S.I., Fisher, J.H. and Fisher,
A.B.: Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1992, 7,
368-378).
Es un objeto de la invención proporcionar
procesos que permiten la determinación de la proteína
SP-C del agente tensioactivo pulmonar en una muestra
de manera sencilla y con sensibilidad alta.
Sorprendentemente, los autores de la presente
invención han tenido éxito al proporcionar anticuerpos que son
específicos para SP-C, y permiten por tanto la
determinación de SP-C por un método
inmunológico.
De acuerdo con ello, la invención proporciona
procesos para determinar SP-C en una muestra, en los
cuales la determinación se lleva a cabo por un método
inmunológico.
Objetos adicionales se deducen de las
reivindicaciones subordinadas.
En el contexto de la invención, la determinación
de SP-C debe entenderse como detección, y, en
particular, como cuantificación de SP-C.
En el contexto de la invención, el término
"SP-C" debe entenderse, por analogía a la
nomenclatura propuesta por Possmayer (Possmayer, F.: A Proposed
Nomenclature for Pulmonary Surfactant-associated
Proteins. Am. Rev. Res-pir. Dis. 1988, 138,
990-998), como la "familia" de proteínas
tensioactivas que está presente en el agente tensioactivo pulmonar
natural del líquido amniótico de los mamíferos designada
SP-C.
Adicionalmente, el término
"SP-C" incluye también SP-C
sintetizada químicamente o preparada por medios recombinantes y
modificaciones de SP-C, por ejemplo aquellas
modificaciones en las cuales uno o más aminoácidos están ausentes o
han sido reemplazados por otros aminoácidos. SP-C
sintetizada químicamente o preparada recombinantemente y
modificaciones de SP-C se describen, por ejemplo, en
los documentos WO91/18015, WO91/00871, WO89/04326, WO93/21225 y
también en WO95/32992.
SP-C se entiende preferiblemente
con el significado de la proteína tensioactiva SP-C
que está presente en el agente tensioactivo pulmonar humano o en el
líquido amniótico humano.
En el contexto de la presente invención,
"métodos inmunológicos" se entienden con el significado de
métodos analíticos basados en inmunoquímica, en particular en una
reacción antígeno-anticuerpo. Ejemplos de métodos
inmunológicos incluyen inmunoensayos tales como radioinmunoensayo
(RIA), inmunoensayo enzimático (EIA, combinado con técnica en fase
sólida: ELISA) o incluso ensayos de inmunofluorescencia. El
inmunoensayo se lleva a cabo por exposición de la muestra a
investigar a un anticuerpo de fijación de SP-C y
detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpo que se fija
a SP-C. En estos ensayos, la detección y
cuantificación se llevan a cabo directa o indirectamente de manera
conocida. Así, la detección y cuantificación de los complejos
antígeno-anticuerpo se hace posible por utilización
de marcadores adecuados que pueden ser transportados por el
anticuerpo dirigido contra SP-C y/o por un
anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo primario.
Dependiendo del tipo de los inmunoensayos mencionados anteriormente,
los marcadores son, por ejemplo, marcadores radiactivos, colorantes
fluorescentes o bien enzimas, tales como fosfatasa o peroxidasa, que
pueden detectarse y cuantificarse con ayuda de un sustrato
adecuado.
En una realización de la invención, el método
inmunológico se lleva a cabo con ayuda de una fase sólida adecuada.
Fases sólidas adecuadas que pueden mencionarse incluyen las placas
de microtitulación comerciales habituales hechas de poliestireno o
membranas (por ejemplo hechas de poli(difluoruro de
vinilideno), PVDF) que se utilizan habitualmente para la técnica
ELISA. Sorprendentemente, se ha encontrado que incluso placas de
cromatografía son adecuadas para uso como fase sólida en el proceso
de acuerdo con la invención. En lo sucesivo se hace referencia
también a la implementación del proceso de acuerdo con la invención
utilizando placas de cromatografía como
inmuno-TLC.
Para llevar a cabo el proceso de acuerdo con la
invención, la muestra se aplica a la fase sólida. La muestra es
preferiblemente una solución de SP-C en un
disolvente adecuado, y el disolvente se evapora después que la
muestra se ha aplicado a la fase sólida. Para preparar una solución
de la muestra a investigar en un disolvente adecuado, es ventajoso
utilizar disolventes orgánicos o mezclas de disolventes que han
demostrado ser adecuadas para solubilizar proteínas hidrófobas.
Ejemplos que pueden mencionarse son alcoholes de cadena corta, en
particular metanol, etanol, 2-propanol (isopropanol)
o n-propanol. Adicionalmente, en conexión con la
inmuno-TLC, se han encontrado útiles mezclas de
disolventes no polares y polares, siendo disolventes no polares
adecuados, en particular, cloroformo, cloruro de metileno y tolueno,
y siendo disolventes polares adecuados alcoholes de cadena corta.
Pueden mencionarse como particularmente preferidas mezclas
cloroformo/metanol.
Si se desea, pueden añadirse pequeñas cantidades
de agua y/o ácido o base a los disolventes o mezclas de disolventes
arriba mencionados para mejorar las propiedades disolventes.
Si el contenido de SP-C de una
muestra de lavado broncoalveolar (BAL) o una muestra de líquido
amniótico debe determinarse con ayuda de inmuno-TLC,
es ventajoso transferir la SP-C antes de la
aplicación a la fase sólida desde la fase acuosa (muestra de BAL,
líquido amniótico) a un disolvente o mezcla de disolventes orgánicos
adecuado(a). Esto se realiza convenientemente por extracción
con disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes, por
ejemplo por el método de extracción de Bligh-Dyer
(Can. J. Biochem. Physiol. 1959, 37, 911-917) y
lavado subsiguiente según Folch (J. Biol. Chem. 1957, 226,
497-509).
Si el contenido de SP-C en una
muestra de lavado broncoalveolar (BAL) o una muestra de líquido
amniótico debe determinarse con ayuda de la técnica ELISA, es
ventajoso diluir la muestra con un disolvente o mezcla de
disolventes adecuado(a) miscibles en agua. Disolventes o
mezclas de disolventes miscibles en agua adecuados que pueden
mencionarse son, en particular, alcoholes de cadena corta, tales
como etanol e isopropanol, o mezclas de los mismos.
Además, se ha encontrado que es conveniente para
el método de acuerdo con la invención separar o eliminar los
componentes que interfieren en la muestra a investigar en la fase
sólida antes de la detección inmunológica de SP-C en
la muestra. Esto es particularmente ventajoso en casos en que están
presentes otros componentes en las muestras a investigar, tales como
otras proteínas tensioactivas o bien lípidos, además de
SP-C.
Si se utilizan placas de cromatografía como la
fase sólida en el método de acuerdo con la invención, la muestra
puede separarse por cromatografía en capa fina. A este fin, la
muestra, después de la aplicación y evaporación del disolvente, se
somete a cromatografía en capa fina. Placas de cromatografía
adecuadas son todas aquellas placas cuyo recubrimiento es adecuado
para la separación de mezclas hidrófobas en medios orgánicos. Las
placas HPTLC vendidas por Merck Darmstadt bajo el nombre comercial
Diol, que tienen una matriz de sílice modificada, han resultado
particularmente adecuadas en este contexto. Disolventes adecuados
para la cromatografía en capa fina de proteínas hidrófobas son
disolventes y mezclas de disolventes orgánicos. Es particularmente
conveniente el uso de mezclas de disolventes no polares y polares,
siendo disolventes no polares adecuados, en particular, cloroformo,
cloruro de metileno y tolueno, y siendo disolventes polares
adecuados alcoholes de cadena corta, en particular metanol, etanol e
isopropanol. Si se desea, es posible añadir pequeñas cantidades de
agua y/o ácido o base. Se da preferencia a mezclas de cloroformo y
metanol a las cuales se añaden pequeñas cantidades de agua y
amoniaco. La aplicación de las muestras a las placas y la práctica
de la separación se llevan a cabo de una manera habitual, por
ejemplo por medio de aparatos comerciales habituales. La muestra a
aplicar es preferiblemente una solución de SP-C en
un disolvente orgánico. En la preparación para la detección
inmunológica, las placas de cromatografía se secan después de la
separación por cromatografía en capa fina.
Se ha encontrado sorprendentemente que, si la
fase sólida utilizada es una placa de microtitulación de
poliestireno utilizada habitualmente en la técnica ELISA, los
componentes que interfieren en la muestra pueden eliminarse después
de la aplicación de las muestras por uno o más pasos de lavado
selectivos. A este fin, las muestras de BAL a investigar se diluyen
convenientemente antes de la aplicación con un disolvente orgánico
soluble en agua (por ejemplo un alcohol tal como isopropanol) y se
ajustan a un pH inferior a 7 (preferiblemente pH
3-4). Si se desea, la adsorción variable del
SP-C en la superficie de la placa causada por
heterogeneidades de las muestras biológicas puede minimizarse. Esto
puede efectuarse, por ejemplo, después de la aplicación y el secado
de la muestra -y antes de un lavado- por redisolución en un
disolvente adecuado, tal como, por ejemplo, trifluoroetanol, seguido
por un paso de secado. Los componentes que interfieren pueden
eliminarse, después de la aplicación de las muestras y evaporación
del disolvente, por lavado con disolventes adecuados. Así, los
lípidos que interfieren, por ejemplo, pueden eliminarse por uno o
más lavados con metanol.
En la preparación para la detección inmunológica,
la fase sólida, si se desea, se trata previamente de una manera
adecuada. Los sitios de fijación inespecífica en la fase sólida, por
ejemplo, pueden saturarse utilizando una solución bloqueante
adecuada, tal como gelatina, o una solución de proteína. La fase
sólida se incuba subsiguientemente con una solución del anticuerpo
específico de SP-C. Si este anticuerpo no está
marcado, la detección y cuantificación pueden realizarse con ayuda
de un anticuerpo secundario marcado que reconoce el anticuerpo
primario. A este fin, el exceso de anticuerpo primario se elimina
por lavado y la placa se incuba luego con un anticuerpo secundario
marcado. Después de la separación del exceso de anticuerpo por
lavado, la detección y cuantificación de los complejos
antígeno-anticuerpo se lleva a cabo con ayuda del
marcador.
Marcadores que son adecuados para el paso de
detección y cuantificación y que pueden ser transportados por el
anticuerpo primario o secundario son conocidos por las personas
expertas en la técnica. Ejemplos que pueden mencionarse incluyen
marcadores radiactivos, colorantes fluorescentes y, preferiblemente,
enzimas tales como fosfatasa o peroxidasa, que permiten la detección
colorimétrica o quimioluminiscente. Dependiendo del marcador
utilizado, la detección o cuantificación subsiguiente se lleva a
cabo de una manera conocida.
Cuando se lleva a cabo el método de acuerdo con
la invención con ayuda de la técnica ELISA, los complejos
antígeno-anticuerpo se detectan y cuantifican
preferiblemente por la vía de una reacción coloreada catalizada por
enzima utilizando un anticuerpo conjugado a peroxidasa y ABTS
(2,2'-azino-di[3-etilbenzotiazolinasulfonato])
como sustrato. Sin embargo, es posible también utilizar otros
métodos cromógenos, quimioluminiscentes o fluorógenos conocidos por
las personas expertas en la técnica para la detección.
Cuando se lleva a cabo el método de acuerdo con
la invención con ayuda de inmuno-TLC, los complejos
antígeno-anticuerpo se detectan y cuantifican
preferiblemente por la vía de una reacción de quimioluminiscencia
catalizada por enzima utilizando como sustrato Luminol®. Sin
embargo, es posible también utilizar otros métodos cromógenos,
quimioluminiscentes o fluorógenos conocidos por las personas
expertas en la técnica para la detección.
Como ya se ha mencionado, los autores de la
presente invención han tenido éxito sorprendentemente en
proporcionar anticuerpos que son específicos para
SP-C, en particular para la SP-C que
está presente en el agente tensioactivo pulmonar o líquido amniótico
humano. La invención proporciona también por consiguiente un
anticuerpo que es específico para SP-C, en
particular específico para SP-C que está presente en
el agente tensioactivo pulmonar o el líquido amniótico humano. El
anticuerpo se caracteriza además ventajosamente por el hecho de que
no exhibe reactividad cruzada alguna con otras proteínas
tensioactivas tales como SP-A y
SP-B.
Los anticuerpos específicos de
SP-C son preferiblemente anticuerpos
policlonales.
Los anticuerpos específicos de
SP-C se preparan análogamente a los procesos
conocidos por las personas expertas en la técnica (como se describe,
por ejemplo, en Antibodies: A Laboratory Manual. Compiladores E.
Harlow y D. Lane. Cold Spring Harbor Laboratory 1987).
La preparación de anticuerpos policlonales
dirigidos contra SP-C se lleva a cabo
convenientemente por métodos de inmunización conocidos. En este
caso, se ha encontrado que es ventajoso utilizar
SP-C recombinante (a la que se hace referencia
también en lo sucesivo como rSP-C) como antígeno en
el proceso de inmunización, y emplear cantidades de antígeno mayores
que las utilizadas usualmente, así como aumentar el número de
administraciones de antígeno. En el proceso de inmunización, se
emplean convenientemente entre 0,5 mg y 2 mg (preferiblemente 1 mg)
de rSP-C por cada administración de antígeno, donde
el número de administraciones de antígeno está comprendido
ventajosamente entre 5 y 7, preferiblemente en un intervalo que va
de tres a seis semanas (preferiblemente cuatro semanas).
Adicionalmente, se ha encontrado que es ventajoso utilizar la
rSP-C en la forma de partículas insolubles
(agregados o precipitados), o acoplada a una molécula portadora (por
ejemplo proteína o perlas). Los agregados y precipitados pueden
obtenerse de manera habitual, convenientemente como se describe en
la sección de
"Ejemplos".
"Ejemplos".
La rSP-C adecuada para uso en el
proceso de inmunización que se puede mencionar incluye
SP-C dipalmitoilada recombinante idéntica a la
humana (rhSP-C2Pam) o modificaciones recombinantes
de SP-C. Modificaciones recombinantes de
SP-C que pueden mencionarse incluyen, por ejemplo,
SP-C no palmitoilada idéntica a la humana
(rhSP-C) o la modificación de SP-C
(secuencia de acuerdo con SEQ ID No. 1) con 34 aminoácidos descrita
en la solicitud de patente internacional WO95/32992, en la cual los
aminoácidos en las posiciones 4 y 5 de la secuencia de aminoácidos
son fenilalanina y el aminoácido en la posición 32 de la secuencia
de aminoácidos es isoleucina (las posiciones indicadas dentro de la
secuencia de aminoácidos están basadas en la secuencia de
aminoácidos para los péptidos de la Fórmula I descrita en el
documento WO95/32992). La preparación de este péptido, que se
designa rSP-C34 (FF/I), por ingeniería genética se
describe análogamente en el documento WO95/32992.
La invención se refiere también por consiguiente
a un proceso para preparar anticuerpos policlonales dirigidos contra
SP-C por inmunización, en particular contra
SP-C humana, en el cual el componente antigénico
utilizado para la inmunización es SP-C
recombinante.
A modo de ejemplo, se describen a continuación la
preparación de anticuerpos que son específicos para
SP-C, y una determinación inmunológica de
SP-C en una muestra.
1 mg de rSP-C
[rhSP-C2Pam, rhSP-C o
rSP-C34(FF/I)], disuelto en isopropanol/agua
(95:5), pH 4, se evaporó en un concentrador de vacío (Speedvac®) y
se resuspendió en 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato
(PBS) por incubación con ultrasonidos (5 minutos) en un baño
ultrasónico. Este proceso proporciona rSP-C
agregada, que se utilizó como antígeno. La suspensión se mezcló
luego con 0,2 ml de adyuvante completo de Freund para la
inmunización básica y con 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund
para las inyecciones de refuerzo. Para conseguir esto, la solución
se impulsó alternativamente hacia atrás y adelante
5-10 veces entre dos jeringuillas unidas por una
cánula. Se inyectaron luego subcutáneamente porciones de 0,2 ml de
la emulsión en conejos. El esquema de inmunización siguió protocolos
estándar: después de la primera inmunización, se administraron cinco
inyecciones de refuerzo a intervalos de 4 semanas. Se tomaron
muestras de sangre en cada caso 10 días después de la última
inyección para monitorizar el desarrollo del título. Tan pronto como
el título fue satisfactorio, se tomaron 50 ml de sangre y se preparó
suero por métodos estándar.
Es posible también utilizar ABM-S
(Multiplicador Especial de Anticuerpos) para la inmunización básica
y AMB-N (Multiplicador Normal de Anticuerpos) para
las inyecciones de refuerzo, o utilizar otros adyuvantes conocidos,
para la inmunización. El uso de adyuvante de Freund da como
resultado, por una parte, un título de anticuerpos considerablemente
mayor que cuando se utiliza adyuvante ABM, y por otra parte, el
adyuvante de Freund induce una respuesta inmune en el 100% de los
animales, y cuando se utiliza ABM, esto sucede sólo aproximadamente
en el 50% de los animales. Adicionalmente, la rSP-C
puede acoplarse a un material portador adecuado, tal como, por
ejemplo, CH Sepharose® activada, después de lo cual puede
administrarse subcutáneamente a los conejos, con o sin adyuvante,
preferiblemente con adyuvante de Freund.
Pueden emplearse todas las especies animales
adecuadas para preparar anticuerpos. Así, además de conejos, es
posible también utilizar pollos.
En los sueros individuales, se determinó el
título a diluciones diferentes utilizando análisis por transferencia
Western por métodos estándar. Para la electroforesis en gel, se
utilizó el método SDS/tricina de Schägger y Jagow (Analyt. Biochem.
1987, 166: 368-379). En este caso, se separó 0,1
\mug de la rSP-C apropiada en un gel de
poliacrilamida de concentración 15%, se transfirió a membranas de
PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)) y se incubó con los
sueros a diluciones de 1:1.000, 1:5.000, 1:90.000 y 1:25.000,
1:50.000, 1:100.000 y 1:200.000. Los anticuerpos primarios fijados
fueron detectados por anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa
(IgG anti-conejo o IgY anti-pollo)
por quimioluminiscencia utilizando el sistema ECL
(Quimioluminiscencia Mejorada) de Amersham (Brunswick). Los títulos
variaban desde 1:10.000 a > 1:200.000. Los límites de
detección en la transferencia Western variaban desde <10 a 100
ng.
Todos los antisueros/anticuerpos reaccionaban con
la rSP-C empleada en cada caso como antígeno.
Sorprendentemente, aquéllos reaccionaban cruzadamente con la
SP-C dipalmitoilada natural
(hSP-C2Pam; aislada de lavado pulmonar humano o
animal), y también con otras rSP-Cs naturales o
modificadas.
Los antisueros/anticuerpos no reaccionan con
otras proteínas del agente tensioactivo pulmonar tales como
SP-A o SP-B. Los antisueros son por
consiguiente adecuados para detectar SP-C, en
particular SP-C humana, en soluciones que tienen un
contenido desconocido de SP-C, tales como lavado
pulmonar o líquido amniótico, o para la realización de la detección
en secciones de tejidos utilizando inmunohistoquímica e
inmunocitoquímica.
0,8 ml de BAL, 2,0 ml de metanol y 1,0 ml de
cloroformo se pipetean en un tubo de centrífuga y se mezclan
concienzudamente utilizando un agitador turbulento. La adición de
1,0 ml más de cloroformo da como resultado separación de fases.
Después de mezcla renovada, se añade 1,0 ml de agua ultrapura, y las
muestras se mezclan una vez más con el agitador turbulento durante
aproximadamente 30 segundos. Las muestras se centrifugan a 2400 rpm
durante 5 minutos. Las fases del fondo se transfieren (si es
necesario en dos pasos) a cápsulas Eppendorf y se evaporan a
sequedad utilizando la combinación Speed-Vac.
Entretanto, las fases superiores se lavan con 2,0 ml de
cloroformo/metanol/agua (86/14/1 en volumen). Las segundas fases del
fondo se transfieren en cada caso a las mismas cápsulas Eppendorf de
la primera fase, se centrifugan como anteriormente y se evaporan
también a sequedad. Las fases superiores se desechan. Los extractos
se recogen en cloroformo/metanol 70:30 (v/v).
Para la cromatografía en capa fina, se utilizaron
placas HPTLC que tenían una matriz de sílice modificada, tales como
las vendidas por Merck Darmstadt bajo el nombre comercial Diol. Las
muestras se aplicaron automáticamente sobre las placas HPTLC
utilizando un instrumento Lingomat IV (Camag, Berlín). Después que
se hubieron aplicado las muestras, las placas se secaron al aire y
se cromatografiaron utilizando una mezcla CHCl_{3}:MeOH
[CHCl_{3}/MeOH/NH_{4}OH de 25% de concentración/H_{2}O =
32,5/15/1/2 (en volumen)] como fase líquida. Después de la
cromatografía, se secaron las placas.
Para saturar los sitios de fijación
inespecíficos, las placas HPTLC secadas se incubaron durante 4 horas
con gelatina de pescado de 3% de concentración en PBS que contenía
NaCl 150 mM, Na_{2}HPO_{4} 12 mM y NaH_{2}PO_{4} 3 mM (pH
7,4). Las placas se incubaron luego durante una noche, en presencia
del anticuerpo primario específico de SP-C, y se
agitaron suavemente, usualmente a una dilución de 1:10.000. Los
anticuerpos no fijados se separaron por lavado repetido con TBS/T a
partir de Tris-HCl 4 mM, NaCl 100 mM, y
Tween-20 al 0,05% (pH 7,4). Para la hibridación con
el anticuerpo primario, las placas se incubaron durante 2 horas con
anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rábano picante, a
una dilución de 1:100.000 en TBS/T. Los anticuerpos no fijados se
separaron como se ha descrito arriba por lavado repetido de las
placas con TBS/T. Los complejos inmunorreactivos se visualizaron
utilizando sistemas de detección ECL (constituidos por Luminol® e
intensificador) de Amersham Buchler. Las placas se expusieron a una
película de rayos X (Hyperfilm Amersham) durante
1-10 minutos.
Para cuantificar los inmunocomplejos, las
películas de rayos X se digitalizaron utilizando un instrumento
Video-Imager (Cybertech, Berlín, Alemania). Las
intensidades de señal en las películas de rayos X se evaluaron con
ayuda de un ordenador utilizando el soporte lógico densitométrico
Diana (Raytest).
Para determinar la proteína SP-C
del agente tensioactivo pulmonar, se extrajeron las fracciones BAL.
A fin de cuantificar las pequeñas cantidades de
SP-C, es necesario separar la proteína diana de la
gran proporción de lípidos. Esto se consigue por cromatografía en
capa fina. La SP-C contenida en las fracciones
aplicadas se cuantifica con ayuda de patrones.
El material soporte utilizado para la técnica
ELISA fueron placas de microtitulación con 96 pocillos hechas de
poliestireno (Polysorp® F96) con certificado, Nunc, Wiesbaden). El
patrón (rSP-C idéntica a la humana, c = 300
\mug/ml) se diluyó con isopropanol/agua (80/20, pH 3,0) en una
serie de concentraciones desde 40 ng/pocillo a 312,5 pg/pocillo (v =
100 \mul/pocillo, correspondiente a c =
0,4-0,003125 \mug/ml de rSP-C).
Las muestras a medir (lavados broncoalveolares, BAL) se diluyeron
con isopropanol/agua (80:20, pH 3,0). Usualmente, se pipetearon en
los pocillos 10 \mul o 20 \mul de BAL en un volumen total de 100
\mul. Cada placa llevaba también un patrón interno (BAL con una
concentración definida de SP-C). Todas las muestras
y los patrones se midieron por duplicado. Todas las diluciones se
llevaron a cabo en recipientes de reacción de 2 ml hechos de
polipropileno (Eppendorf, Hamburgo).
Después del pipeteado de las muestras y los
patrones, las placas de microtitulación se incubaron en una vitrina
de secado ventilada a 37ºC durante 6 horas a sequedad. La adsorción
variable de SP-C en la superficie de las placas, que
está causada por heterogeneidades de las muestras biológicas, se
minimizó por reabsorción en 100 \mul de trifluoroetanol. Después
de un paso de secado adicional (37ºC, 3 horas), los fosfolípidos,
que estaban presentes en un exceso de aproximadamente
50-100 veces con relación a SP-C, se
eliminaron selectivamente por dos pasos de lavado sucesivos. En el
primer paso, se añadieron 200 \mul de metanol y la placa se incubó
a la temperatura ambiente con agitación mediante sacudidas (20
minutos). Los disolventes se separaron por decantación, y las placas
se lavaron luego una vez más con 200 \mul de metanol, y el metanol
se separó inmediatamente por decantación. Las placas se lavaron
luego tres veces con 200 \mul de PBS/0,5% Tween 20.
Todas las soluciones patrón y las muestras
acuosas de SP-C se mezclaron con 80%
2-propanol/20% agua (v/v) pH 3,5. Los patrones de
SP-C (rSP-C humana, c = 300
\mug/ml) se diluyeron a concentraciones finales de
0,4-0,003125 \mug/ml. Las muestras acuosas
(líquidos de lavado broncoalveolar, BALF) se mezclaron en relación
1:5 (v/v) con 80% 2-propanol/20% agua (v/v pH 3,5).
Todas las diluciones se realizaron en viales de polipropileno de 20
ml (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) a fin de evitar la adsorción de
la SP-C a la pared del recipiente, antes de
transferir un volumen de 100 \mul de cada muestra o patrón a
placas de microtitulación de poliestireno (Polysorp® F96, con
certificado, Nunc proteínas tensioactivas pulmonares, Wiesbaden,
Alemania). Las muestras BALF con contenido conocido de
SP-C se coprocesaron en cada placa de
microtitulación. Todos los patrones y las muestras se procesaron por
duplicado.
La separación del líquido se realizó por
evaporación durante una noche a 37ºC. La adición subsiguiente de 100
\mul/pocillo de 1,1,1-trifluoroetanol, seguida de
nuevo por evaporación a 37ºC (3 h), optimizó la adsorción de las
muestras biológicas a la placa. Los fosfolípidos se separaron
selectivamente por dos procedimientos de lavado subsiguientes con
metanol. Para este propósito, se aplicaron 200 \mul/pocillo de
metanol a las placas y se incubaron durante 20 min a la temperatura
ambiente con agitación suave mediante sacudidas. Después de la
decantación del disolvente orgánico, se repitió este paso sin
incubación ulterior. Inmediatamente después de la decantación, los
pocillos se lavaron tres veces con Tris-Cl 50 mM, pH
7,6 + 0,5% Tween 20 (Sigma, Deisenhofen, Alemania).
El sistema ELISA descrito a continuación está
basado en el método desarrollado por Reinke et al.
(Prostaglandins 1989, 37: 577-586). Para bloquear el
exceso de sitios de fijación, la muestra se incubó durante 2 horas
con PBS/1% de seroalbúmina bovina (BSA). Después de enjuagar tres
veces con PBS/0,5% Tween 20, se aplicó el antisuero
SP-C. A este fin, el antisuero se diluyó en relación
1:2.000 en PBS/1% BSA, se pipetearon 200 \mul de esta solución en
cada pocillo, y se incubó la placa a la temperatura ambiente durante
12-15 horas y subsiguientemente se lavó de nuevo
tres veces (véase arriba). Se aplicaron luego 200 \mul de una
dilución 1:1.000 de anticuerpo biotinilado
anti-conejo (de burro,
Amersham-Buchler, Brunswick) en PBS/1% BSA, y la
placa se incubó a la temperatura ambiente durante 2 horas. Para
eliminar el exceso de anticuerpo, se lavó la placa 3 veces. La
sensibilidad del ensayo se mejoró luego utilizando la técnica
avidina/biotina-peroxidasa
(AB-Komplex, Dako, Hamburgo). A este fin, se
añadieron una gota de solución de avidina y una gota de solución de
peroxidasa de rábano picante biotinilada a 5 ml de PBS, y la mezcla
se equilibró durante 30 minutos. Se incubaron 200 \mul de una
dilución 1:50 de esta solución stock en PBS/1% BSA en las placas
durante 2 horas, y las placas se lavaron subsiguientemente de nuevo
tres veces (véase arriba).
El desarrollo del color enzimático se inició por
la adición del sustrato
2,2'-azino-di-[3-etilbenzotiazolinasulfonato]
(ABTS) [NGO, T.T.: Chromogenic substrates for enzyme immunoassay in
nonisotopic immunoassay. New York: Plenum Publishing Corporation,
1988, p. 57-84]. A este fin, 20 mg de ABTS y 10
\mul de H_{2}O_{2} al 30% se disolvieron en 30 ml de tampón
sustrato (acetato de sodio trihidratado 60 mM,
dihidrogeno-fosfato de sodio monohidratado 50 mM, pH
4,2) [PETERS, H.J.; BAUMGARTEN, H.; SCHULZE, M.: Monoklonale
Antikorper-Herstellung und Charakterisierung.
Berlín: Springer Verlag, 1985], y se pipetearon 200 \mul de ésta
solución en los pocillos. Después del revelado del color (2 horas, a
la temperatura ambiente o durante una noche a 4ºC), las muestras se
evaluaron espectrofotométricamente a 405 o 450 nm en un fotómetro
ELISA (Reader 400 V.1.1, SLT, Crailsheim).
La fijación inespecífica de proteína a los
pocillos se bloqueó con 200 \mul de Tris/Cl 50 mM tampón de pH 7,6
que contenía 1% (p/v) de seroalbúmina bovina (BSA, Paesel y Lorei,
Frankfurt/Main, Alemania). Después de 2 horas de incubación a la
temperatura ambiente, los pocillos se lavaron tres veces con Tris/Cl
50 mM de pH 7,6 + 0,5% Tween 20 y se añadió una dilución 1:2.000
(v/v) de antisuero anti-SP-C en
Tris/Cl 50 mM de pH 7,6 + 1% BSA. Después de 12-15
horas de incubación a la temperatura ambiente, los pocillos se
lavaron concienzudamente como se ha descrito arriba y se incubaron
durante 2 h con 200 \mul de anticuerpo anti-conejo
biotinilado (Amersham Buchler, Braunschweig, Alemania; 1:1.000 en
Tris/Cl 50 mM de pH 7,6 + 1% de BSA). Después de separación del
anticuerpo libre, se realizó la incubación con 200 \mul de
complejo avidina-biotina-peroxidasa
de rábano picante (ABComplex, Dako, Glostrup, Dinamarca; solución
stock de acuerdo con la especificación del suministrador, solución
de trabajo 1:50 Tris/Cl 50 mM de pH 7,6 + 1% de BSA) durante 2 h más
con lavado subsiguiente. La conversión enzimática del colorante se
inició cargando los pocillos con 200 \mul de
2,2'-azino-di-[3-etilbenzotiazolinsulfonato]
(ABTS, Boehringer, Mannheim, Alemania; 20 mg en 30 ml de tampón
sustrato (acetato de sodio 60 mM + NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 4,2)
+ 10 \mul de H_{2}O_{2} al 30%). Después de incubación durante
una noche a 4ºC, se midió la absorbancia a 450 nm.
La SP-C en las muestras de BAL se
cuantificó construyendo una curva estándar por interpolaciones
cúbicas mediante tira flexible ("cubic-spline")
soportadas por ordenador utilizando patrones de
rSP-C que se habían arrastrado.
El presente método de acuerdo con la invención
permite la determinación cuantitativa del contenido de
SP-C de una muestra de una manera ventajosa. Por
ejemplo, es posible determinar el contenido de SP-C
en el agente tensioactivo pulmonar o el líquido amniótico humano, o
bien detectar SP-C en secciones de tejidos por
inmunohistoquímica e inmunocitoquímica. El método de acuerdo con la
invención puede emplearse por tanto ventajosamente para diagnosticar
condiciones de enfermedad asociadas con un déficit de agente
tensioactivo pulmonar o un cambio en la composición del agente
tensioactivo pulmonar (Günther et al: Surfactant Alterations
in Severe Pneumonia, Acute Respiratory Distress Syndrome and
Cardiogenic Lung Edema. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1996, 153,
176-184; Seeger et al.: Alveolar Surfactant
and Adult Respiratory Distress Syndrome. Clin. Investig. 1993, 71,
177-190; Cosmi et al.: Respiratory Distress
Syndrome: Requirements of Perinatal Diagnosis, Prevention and
Treatment. In Lachmann B. Ed.: Surfactant Replacement Therapy in
Neonatal and Adult Respiratory Distress Syndrome, Springer Verlag
1988). Condiciones de enfermedad que pueden mencionarse como
ejemplos son el Síndrome de Dificultad Respiratoria Infantil (IRDS)
o el Síndrome de Dificultad Respiratoria de los Adultos (ARDS).
La invención proporciona también un método para
diagnosticar IRDS o ARDS que comprende determinar el contenido de
SP-C en agente tensioactivo pulmonar o líquido
amniótico humano por un método inmunológico.
La invención se refiere también a un kit de
reactivos para la realización del método de acuerdo con la
invención, en el cual el kit de reactivos comprende un anticuerpo
específico de SP-C. Dependiendo del modo en que se
lleva a cabo el método, el kit comprende otros componentes. Otros
componentes que pueden mencionarse como ejemplos son anticuerpos
secundarios marcados, soluciones tampón, soluciones de lavado,
reactivos que se requieren para el paso de detección, placas de
cromatografía o placas de microtitulación y disolventes o mezclas de
disolventes orgánicos.
<110> ALTANA Pharma AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Determinación de la proteína
hidrófoba SP-C del agente tensioactivo pulmonar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 99932850.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 1101118
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-07-08
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Un método para determinar la proteína
SP-C del agente tensioactivo pulmonar en una
muestra, que comprende llevar a cabo la determinación por un método
inmunológico.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el cual el método inmunológico es un inmunoensayo enzimático.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el cual el inmunoensayo enzimático se lleva a cabo sobre una fase
sólida adecuada.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el cual, en el inmunoensayo enzimático, la muestra se expone a un
primer anticuerpo de fijación de SP-C, y la cantidad
de anticuerpo fijado se mide utilizando un segundo anticuerpo que
lleva un marcador enzimático, llevándose a cabo la medida por una
reacción coloreada catalizada por enzima o quimioluminiscencia.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el cual la fase sólida es una placa de cromatografía y la muestra
se separa sobre la placa de cromatografía antes de llevar a cabo el
inmunoensayo enzimático.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el cual la fase sólida es una placa de microtitulación y el
inmunoensayo enzimático se lleva a cabo con ayuda de la técnica
ELISA.
7. Un anticuerpo policlonal que es específico
para la proteína SP-C del agente tensioactivo
pulmonar.
8. Un anticuerpo, que puede obtenerse por un
proceso de inmunización en el cual se utiliza rSP-C
como componente antigénico y el anticuerpo es específico para
SP-C que está presente en el agente tensioactivo
pulmonar humano.
9. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación
8, en el cual se utiliza como componente antigénico
SP-C no palmitoilada idéntica a la humana
(rhSP-C).
10. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 8, en el cual se utiliza como componente antigénico
SP-C dipalmitoilada recombinante idéntica a la
humana (rhSP-C2Pam).
11. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 8, en el cual se utiliza como componente antigénico
rSP-C34 (FF/I).
12. Un kit de reactivos para llevar a cabo un
método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el kit
comprende un anticuerpo específico de SP-C.
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