ES2239470T3 - Utilizacion de materias insaponificables de aceites vegetales para la preparacion de un medicamento. - Google Patents
Utilizacion de materias insaponificables de aceites vegetales para la preparacion de un medicamento.Info
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Abstract
Utilización de por lo menos una materia insaponificable de aceite vegetal que presenta un efecto estimulante de la expresión del TGF-, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías seleccionadas de entre el grupo constituido por artritis de Lyme, artritis psoriásica y osteoporosis.
Description
Utilización de materias insaponificables de
aceites vegetales para la preparación de un medicamento.
La presente invención se refiere a la utilización
de por lo menos una materia insaponificable de aceite vegetal,
especialmente de aceites de aguacate, de soja y/o de lupino, que
presenta un efecto estimulante de la expresión del
TGF-\beta para la preparación de un medicamento
destinado al tratamiento de patologías seleccionadas de entre el
grupo constituido por artritis de Lyme, artritis soriásica y
osteoporosis, así como a una utilización cosmética según la cual se
aplica sobre la piel, las mucosas vecinas y/o los fáneros, una
composición a base de materias insaponificables de aceites
vegetales.
La solicitud de patente FR 2.231.394 da a conocer
que la materia insaponificable de soja se puede utilizar como
antilipémico.
La solicitud de patente EP 643.960 describe la
utilización de la fracción de materia insaponificable del aceite de
soja para el tratamiento de pieles mixtas por su actividad
emoliente e inhibidora de lipasa.
El artículo de H. Thiers et al., "Un
groupe d'agents thérapeutiques nouveaux: les insaponifiables des
huiles végétales, leurs caroténoïdes et leurs indéterminés
administrés en solution alcoolique", Thérapie, Vol. 16, 1961,
páginas 235-251, describe especialmente la
utilización de la materia insaponificable de palma, en forma de
pomada, por su acción eutrófica, de la materia insaponificable de
aguacate para luchar contra las lesiones disqueratósicas, o también
para luchar contra las radiodermatitis.
La solicitud de patente FR 2.762.512 describe
composiciones a base de aceite de lupino que comprenden una o
varias facciones de aceites de lupino en forma de materia
insaponificable, y sus utilizaciones cosmética o farmacéutica,
especialmente para la fotoprotección, contra el envejecimiento
(actínico o no) y para la protección de la piel contra las
agresiones oxidantes.
La solicitud de patente FR 2.678.632 se refiere a
un procedimiento de preparación de una materia insaponificable de
aceite de aguacate, a los medicamentos que la contienen, así como a
las composiciones cosméticas o aditivos alimentarios, que pueden ser
útiles para la conservación del buen funcionamiento de los
cartílagos óseos, y para la prevención del envejecimiento cutáneo,
de la artrosis o de las parondontapatías.
Finalmente, la solicitud internacional WO
99/59523, que sólo es oponible a título de novedad, describe
composiciones farmacéuticas tópicas que contienen como principio
activo una mezcla de extractos de polen y de materias
insaponificables de aceite vegetal.
Por "TGF-\beta" se
entiende, según la invención, las diferentes isoformas del
TGF-\beta, es decir, las isoformas del factor
\beta de crecimiento transformante ("Transforming Growth
Factor-\beta", en inglés). Las isoformas del
TGF-\beta constituyen una familia de polipéptidos
homodiméricos de aproximadamente 25 kD de peso molecular. Entre las
5 isoformas conocidas, las mejores caracterizadas son las
TGF-\beta1 y TGF-\beta2 (Sporn
et al. (1987), J. Cell. Biol. 105,
1039-1045; Roberts y Sporn (1990), Handbook of Exp.
Pharmacol., 35, 419-472, Springer Verlag,
Heidelberg). Aunque estas dos isoformas muestran sólo 71% de
homología, parecen tener muchas actividades comunes. El
TGF-\beta1 se ha aislado primero a partir de
plaquetas humanas, pero ya se sabe que la mayoría de las células
son capaces de expresarlo. El TGF-\beta2 se ha
purificado a partir de las plaquetas, de hueso bovino y de células
de glioblastoma.
Es conocido que el TGF-\beta
está implicado en mecanismos complejos de evolución de diversas
patologías, y que es deseable reforzar la acción del
TGF-\beta, en otras palabras, aumentar su
expresión, mediante células igualmente implicadas en los mecanismos
de dichas patologías, para una evolución favorable de éstas.
Así, por ejemplo, se conoce que el
TGF-\beta expresado por los condrocitos
articulares está implicado en los mecanismos de reacción anabólicos,
es decir de restauración, del cartílago articular, observados en las
primeras fases de la
artrosis, y que tienden a compensar la degradación del cartílago que resulta de la actividad de metaloproteasas segregadas de manera excesiva por los condrocitos bajo el efecto de las citoquinas, tales como la interleuquina-1
artrosis, y que tienden a compensar la degradación del cartílago que resulta de la actividad de metaloproteasas segregadas de manera excesiva por los condrocitos bajo el efecto de las citoquinas, tales como la interleuquina-1
\hbox{(IL-1).}
Por otra parte, se conoce que el
TGF-\beta está favorablemente implicado en los
mecanismos de remodelación óseos que intervienen durante la
osteoporosis. Esto se ha demostrado en particular por Boyce et
al., de la Universidad de Texas ((1996), Nature Med. (2),
10, 1132-1136.).
Finalmente, el TGF-\beta
presenta asimismo un papel favorable en algunos mecanismos de
diferenciación de células nerviosas inducidas por el factor de
crecimiento de los nervios (NGF o "Nerve Growth Factor", en
inglés), así como en numerosos aspectos de la reparación del
tejido, en particular cutáneo.
Por otra parte, por "inhibidor
PAI-1 del activador del plasminógeno" se
entiende, según la invención, el inhibidor específico
PAI-1 que, con el otro inhibidor
PAI-2, regula de manera conocida la actividad de la
forma del tejido (tPA) y del tipo uroquinasa (uPA) del activador
del plasminógeno PA. Las dos formas de PA, el tPA y el uPA, se
producen mediante dos genes diferentes, y tienen un pesos
moleculares así como una reactividad inmunológica diferentes (Dano
et al., (1985) Adv. Cancer Res. 44,
139-166; Hart et al., (1998), Comp. Bioch.
Physiol. 90 B, 691-708). Los inhibidores
PAI-1 y PAI-2 forman complejos
estables con el tPA y el uPA. El PAI-1 es la forma
mayoritaria en el plasma, y se produce mediante las células
endoteliales, las plaquetas y las células de la articulación, tales
como las células sinoviales y los condrocitos (Hart et al.,
1988; Campbell et al., 1991; Hamilton et al.,
1992).
Sería particularmente ventajoso poder estimular
la expresión del inhibidor PAI-1 del activador del
plasminógeno, en la medida en la que se obtendría así una
inhibición de la acción de las metaloproteasas, y por tanto, en
particular, una contribución a la acción del
TGF-\beta, para una evolución favorable de las
patologías citadas a continuación.
Se ha constatado ahora de manera muy sorprendente
e inesperada que la utilización de materias insaponificables de
aceite vegetal permite obtener no sólo un efecto de estimulación de
la expresión del TGF-\beta sino también un efecto
de estimulación de la expresión del inhibidor PAI-1
del activador del plasminógeno.
Así, la presente invención se refiere a la
utilización de por lo menos una materia insaponificable de aceite
vegetal que tiene un efecto estimulante de la expresión del
TGF-\beta, para la preparación de un medicamento
destinado al tratamiento de patologías seleccionadas de entre el
grupo constituido por artritis de Lyme, artritis soriásica y
osteoporosis.
En particular, la utilización según la invención
se caracteriza por el hecho de que el medicamento se destina a
estimular la expresión del TGF-\beta, y más
particularmente la expresión de las isoformas
TGF-\beta1 y TGF-\beta2.
Más particularmente, tal como se destaca del
ejemplo 1 siguiente, la utilización según la invención se
caracteriza por el hecho de que el medicamento se destina a
estimular la expresión del TGF-\beta mediante las
secuencias de ADN situadas entre -1132 y -732 pares de bases (pb)
del promotor del TGF-\beta, y especialmente del
promotor de la isoforma TGF-\beta1.
La utilización según la invención se caracteriza
asimismo por el hecho de que el medicamento se destina a estimular
la expresión del inhibidor PAI-1 del activador del
plasminógeno.
De manera general, la materia insaponificable es
la fracción de un cuerpo graso que, tras la acción prolongada de
una base alcalina, queda insoluble en agua y se puede extraer
mediante un disolvente orgánico. Cinco grandes grupos de sustancias
están presentes en la mayoría de las materias insaponificables de
aceites vegetales: hidrocarburos saturados o insaturados, alcoholes
alifáticos o terpénicos, esteroles (o "fitosteroles"),
tocoferoles y tocotrienoles, los pigmentos carotenoides y
xantófilos.
Preferentemente, la materia insaponificable de
aceite vegetal utilizada según la invención se selecciona de entre
el grupo constituido por materia insaponificable de aceite de
aguacate, materia insaponificable de aceite de soja, materia
insaponificable de aceite de lupino, y las mezclas de estos
últimos.
La comparación de los contenidos en materias
insaponificables de diferentes aceites vegetales: soja, algodón,
coco, oliva y aguacate, muestra un porcentaje muy importante de
materia insaponificable de aceite de aguacate, obtenida por
extracción según diversos procedimientos conocidos. Típicamente,
los contenidos obtenidos van de 2 a 7% de materia insaponificable
en el aceite de aguacate frente al 0,5% en el aceite de coco, 1% en
el aceite de soja, y 1% en el aceite de oliva.
El contenido más importante en materia
insaponificable en el aceite de aguacate, con relación a los demás
aceites vegetales, tales como los mencionados aquí arriba, se
explica en particular por la presencia, en la materia
insaponofocable de aceite de aguacate, de constituyentes que
generalmente no se encuentran en la materia insaponificable de
otros numerosos aceites vegetales, tales como compuestos furánicos y
alcoholes grasos polihidroxilados, y que, ellos solos, representan
más de 50% de la materia insaponificable. Los productos propios de
esta materia insaponificable de aguacate se pueden repartir en dos
fracciones químicas, denominadas "fracción I" y "fracción
H". Los compuestos activos para la utilización según la
invención se encuentran especialmente presentes en la fracción H y
sus precursores. La fracción H aparece en primer lugar en una
cromatografía en fase gaseosa de la materia insaponificable de
aceite de aguacate.
La materia insaponificable de aceite de aguacate
utilizada según la invención se puede obtener a partir de la fruto
fresco, pero, preferentemente, la materia insaponificable de aceite
de aguacate utilizada según la invención es la materia
insaponificable de aguacate seco (es decir, la materia
insaponificable obtenida a partir del aceite del fruto de aguacate
seco).
Según la invención, la materia insaponificable de
aguacate comprende preferentemente por lo menos su fracción
enriquecida en derivados furánicos (fracción H), su fracción
enriquecida en alcoholes grasos polihidroxilados (fracción I), o una
mezcla de estas fracciones.
En lo que se refiere a la materia insaponificable
de aceite de soja, se puede subrayas que esta materia
insaponificable está principalmente compuesta de esteroles (40 a
65%) y de tocoferoles (\geq 10%). Los principales esteroles son el
\beta-sitosterol (40 a 70% de esteroles totales),
el campesterol (15 a 30% de los esteroles totales) y el
estigmasterol (10 a 25% de los esteroles totales). Los tocoferoles
están presentes en forma de una mezcla de
\alpha-tocoferol (5 a 35% de los tocoferoles
totales), de \gamma-tocoferol (45 a 70% de los
tocoferoles totales) y de \delta-tocoferol (10 a
43% de los tocoferoles totales).
El aceite de lupino se puede extraer a partir de
harinas y/o de semillas de lupino.
El lupino es un pariente cercano del guisante, de
la haba, de la soja y de la judía. La semilla se utiliza
tradicionalmente en alimentación humana por su gran contenido en
proteínas. Se incorpora igualmente en la alimentación de los
rumiantes en forma de planta entera o de sus semillas, y se utiliza
también frecuentemente como abono verde. Más particularmente,
cuatro especies de lupino presentan un interés real agronómico: el
lupino blanco (lupinus albus), el lupino azul (lupinus
angustifolius), el lupino amarillo (lupinus luteus) y el
chocho (lupinus mutabilis).
Se ha constatado que el aceite de lupino posee un
contenido particularmente elevado en derivados polifenólicos,
carotenos (especialmente \beta-caroteno) y
tocoferoles.
Según la invención, se prefiere igualmente
utilizar cualquier materia insaponificable de aceite vegetal que
contenga fracciones ricas en fitosteroles, tocoferoles,
tocotrienoles, hidrocarburos terpénicos y tripterpénicos,
antioxidantes naturales, en particular la materia insaponificable
de aceite de cánola, de colza, de girasol, de palma, de maíz, de
sésamo, de germen de trigo, la materia insaponificable de aceite de
soja, y las mezclas de estas últimas. El experto en la técnica
comprende fácilmente que el término "rico" hace referencia a
contenidos en estos compuestos, citados respectivamente aquí arriba,
distintos de los contenidos medios respectivos obtenidos
considerando el conjunto de los aceites vegetales conocidos por el
experto en la técnica.
Se han descritos varios procedimientos en la
técnica anterior para extraer la fracción de materia
insaponificable de un aceite vegetal.
Se puede citar, en particular, el procedimiento
de preparación de materia insaponificable de aceite de aguacate tal
como se describe y se reivindica en la patente
FR-2.678.632 a nombre de los Laboratoires
Pharmascience. Este procedimiento permite obtener una materia
insaponificable de aguacate rica en fracción H, en comparación con
los procedimientos clásicos de preparación de materia
insaponificable de aguacate.
Se puede igualmente citar el procedimiento de
preparación de materia insaponificable de aceite de soja, obtenida a
partir de un concentrado de materia insaponificable de aceite de
soja. Dicho concentrado de materia insaponificable se prepara
mediante destilación molecular según un procedimiento tal como se
describe para el aceite de lupino en la solicitud de patente
FR-2.762.512, pero adaptado para el aceite de soja.
En este procedimiento, el aceite de soja se destila en un destilador
molecular de tipo centrífugo o con película rasada, a una
temperatura comprendida entre aproximadamente 210 y 250ºC, y a vacío
impelido, comprendido entre 0,01 y 0,001 milímetros de mercurio (o
sea, 0,13 a 1,3 Pa). El destilado obtenido presenta un contenido en
materia insaponificable comprendido entre 5 y 30% en peso, y
constituye por lo tanto un concentrado de materia insaponificable de
aceite de soja. Después, el mismo concentrado se saponifica según un
procedimiento clásico de saponificación, en presencia de potasa
etanólica. La mezcla obtenida se extrae con dicloroetano en una
columna a contracorriente. Finalmente, la fase del disolvente se
evapora haciéndola pasar por un evaporador con película descendente,
a fin de recuperar la materia insaponificable de soja.
Como ejemplo de procedimiento de preparación de
materia insaponificable de aceite de lupino, se puede citar el
descrito en la solicitud de patente FR-2.762.512. Se
hace referencia particularmente al ejemplo 3 de esta solicitud.
Según un modo de realización preferido de la
presente invención, la materia insaponificable de aceite vegetal es
una mezcla de materias insaponificables de aceites de aguacate y de
soja, estando la relación en peso de materia insaponificable de
aceite de aguacate a materia insaponificable de aceite de soja
comprendida entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 9, y
preferentemente comprendida entre aproximadamente 0,25 y
aproximadamente 0,6.
En particular, se puede ventajosamente utilizar
la mezcla de materias insaponificables de aceites de aguacate y de
soja, tal como se comercializa por la compañía Laboratoires
Pharmascience con la denominación "Piasclédine 300®", que
consiste en una mezcla de 33,3% en peso de materia insaponificable
de aguacate y de 66,6% en peso de materia insaponificable de soja,
con relación al peso total de la mezcla (estando los 0,1% restantes
constituidos de sílice coloidal y de butilhidroxitolueno).
Preferentemente, la materia insaponificable de
aceite vegetal se utiliza según la invención de tal manera que esté
presente en el medicamento según una proporción comprendida entre
aproximadamente 1 y aproximadamente 80% en peso, con relación al
peso total del medicamento.
El medicamento preparado para la utilización
según la presente invención puede así comprender además un
excipiente farmacéuticamente aceptable, preferentemente adaptado a
una administración por vía oral, tópica externa, entérica o
parenteral.
Más particularmente, este medicamento comprende
un excipiente adaptado a una administración por vía oral.
El medicamento preparado para la utilización
según la invención, por el hecho de su acción estimulante de la
expresión del TGF-\beta y de su acción estimulante
de la expresión del inhibidor PAI-1 del activador
del plasminógeno, se destina por lo tanto ventajosamente a los
tratamientos de las patologías citadas aquí arriba.
Finalmente, la presente invención se refiere
igualmente a una utilización, distinta del método de tratamiento
terapéutico, de por lo menos una materia insaponificable de aceite
vegetal seleccionada de entre los grupos que consisten en materia
insaponificable de aceite de aguacate, materia insaponificable de
aceite de soja, materia insaponificable de aceite de lupino y
mezclas de estas últimas, para la preparación de una composición
cosmética que comprende por lo menos un vehículo cosméticamente
aceptable, para la aplicación sobre la piel, las mucosas vecinas
y/o los fáneros, y destinada al tratamiento cosmético de las
cicatrices de la piel, de las mucosas vecinas y/o de los fáneros,
con la condición de que la composición cosmética no comprenda
extracto de polen.
Además, la presente invención se refiere a una
utilización, distinta de un método de tratamiento terapéutico, de
por lo menos una materia insaponificable de aceite vegetal
seleccionada de entre el grupo constituido por materia
insaponificable de aguacate, materia insaponificable de aceite de
soja, y mezclas de estas últimas, para la preparación de una
composición cosmética que comprende por lo menos un vehículo
cosméticamente aceptable, para la aplicación sobre la piel, las
mucosas vecinas y/o los fáneros, y destinada al tratamiento del
envejecimiento intraseco de la piel, de las mucosas vecinas y/o de
los fáneros, con la condición de que la composición cosmética no
comprenda extracto de polen.
Finalmente, se refiere a la utilización, distinta
de un método de tratamiento terapéutico, de por lo menos una
materia insaponificable de aceite vegetal seleccionada de entre el
grupo constituido por materia insaponificable de aceite de aguacate,
materia insaponificable de aceite de soja, y mezclas de estas
últimas, para la preparación de una composición cosmética que
comprende por lo menos un vehículo cosméticamente aceptable, para
la aplicación sobre la piel, las mucosas vecinas y/o los fáneros, y
destinada al tratamiento cosmético de la piel, de las mucosas
vecinas y/o de los fáneros, que hayan estado sometidos a una
irradiación actínica, con la condición de que la composición
cosmética no comprenda extracto de polen.
Por otra parte, el ejemplo 2 siguiente, ilustra
una utilización según la invención, a saber, para estimular la
biosíntesis del colágeno, especialmente por los fibroblastos
dérmicos. Más particularmente, la utilización según la invención se
caracteriza porque el medicamento se destina a la reconstrucción de
la matriz extracelular, y más particularmente se destina al
tratamiento de los trastornos de la matriz extracelular relacionados
con el envejecimiento cutáneo.
Por otra parte, se sabe que el
TGF-\beta actúa a nivel del ciclo piloso
modulando, en el sentido de una inhibición, el recrecimiento del
vello. Además, según un mecanismo todavía mal elucidado, se
comprueba que el TGF-\beta ejerce una acción sobre
los tejidos foliculares, cuyo efecto es provocar la caída del
vello. Estas dos acciones presentan por lo tanto un interés
cosmético evidente en el campo de la depilación. En particular, los
efectos depilatorios complementarios (inhibir el crecimiento del
vello y provocar la caída del vello) permiten ventajosamente al
usuario espaciar en el tiempo las sesiones de depilación clásicas
más fastidiosas y frecuentemente más costosas, incluyendo las
sesiones de afeitado mecánico, especialmente en el hombre. Esta
utilización cosmética se puede prever, por ejemplo, en forma de
bálsamo para después de la depilación o para después del afeitado,
conjugando los efectos cosméticos clásicos de este tipo de bálsamo
(hidratación, efecto calmante, etc.) y estos efectos
depilatorios.
Así, la presente invención tiene por objeto la
utilización, distinta de un método de tratamiento terapéutico, de
por lo menos una materia insaponificable de aceite vegetal
seleccionada de entre el grupo constituido por materia
insaponificable de aceite de aguacate, materia insaponificable de
aceite de soja, materia insaponificable de aceite de lupino, y sus
mezclas, para la preparación de una composición cosmética destinada
al tratamiento cosmético depilatorio de la piel, para aplicar sobre
la piel, y que comprende por lo menos un vehículo cosméticamente
aceptable.
Preferentemente, la materia insaponificable de
aceite vegetal está presente en la composición cosmética según una
proporción comprendida entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente
10% en peso, con relación al peso total de la composición
cosmética.
La presente invención se ilustrará ahora con la
ayuda de los ejemplos que no deben ser interpretados en ningún caso
como limitativos.
La figura 1 (es decir, las figuras 1.A y 1.B)
representa un modelo de un experimento de transferencia Northern
(figura 1.A) que muestra la expresión ampliada del ARNm del
TGF-\beta1 en las células tratadas con materias
insaponificables de aguacate y de soja (Piasclédine 300®;
referenciada "IAS" en las figuras 1 a 6), así como un
histograma (figura 1.B) que corresponde a una dosis proteica que
muestra la expresión proteica ampliada del
TGF-\beta1 en las células tratadas con Piasclédine
300® (el testigo está referenciado como "T", en las figuras 1
a 6).
La figura 2 (es decir las figuras 2.A y 2.B)
muestra los efectos de las materias insaponificables de aguacate y
de soja solas, del TGF-\beta1 solo y de la
combinación [materias insaponificables de aguacate y de soja, y
TGF-\beta1], sobre la expresión de los ARNm de
las isoformas TGF-\beta1 y
TGF-\beta2 como se explica al final del ejemplo 1
a continuación, párrafo 2.1. En particular, los modelos de
transferencia Northern (figura 2.A) muestran la expresión del ARNm
del TGF-\beta1, del TGF-\beta2 y
de la \beta-actina, tomada como testigo. Los
resultados de la expresión de los ARNm respectivamente de las
isoformas TGF-\beta1 y
TGF-\beta2 se representan en forma de histogramas
respectivos (figura 2.B).
La figura 3 (es decir, las figuras 3.A, 3.B, 3.C
y 3.D) ilustra los efectos a lo largo del tiempo, y según las dosis
utilizadas de las materias insaponificables de aguacate y de soja
(Piasclédine 300®), sobre la expresión del
TGF-\beta1. La figura 3.A es una fotografía de un
gel de electroforesis del producto de la amplificación
RT-PCR a partir de ARNm del
TGF-\beta1 de células tratadas con diferentes
cantidades de materias insaponificables de aguacate y de soja
(Piasclédine 300®). Los resultados se normalizan y se expresan en
forma de histograma (figura 3.B). La figura 3.C es una fotografía
de un gel de electroforesis del producto de la amplificación
RT-PCR a partir de ARNm del
TGF-\beta1 de células tratadas con tiempos
diferentes mediante las materias insaponificables de aguacate y de
soja (Piasclédine 300®). Los resultados se normalizan y se expresan
en forma de histograma (figura 3.D).
La figura 4 muestra los efectos de las materias
insaponificables de aguacate y de soja (Piasclédine 300®) sobre la
expresión de la luciferasa en función de diferentes construcciones
de promotor de TGF-\beta1.
La figura 5 es una fotografía de un gel de
electroforesis del producto de la amplificación
RT-PCR a partir de ARNm de los receptores
TGF-\beta1 y TGF-\beta2, y a
partir de ARNm de \beta-actina tomada como
testigo, que proviene de células tratadas mediante las materias
insaponificables de aguacate y de soja (Piasclédine 300®).
La figura 6 (es decir, las figuras 6.A, 6.B y
6.C) ilustra el efecto de las materias insaponificables de aguacate
y de soja (Piasclédine 300®) sobre la expresión del inhibidor
PAI-1 del activador del plasminógeno. La figura 6.A
representa una fotografía de un gel de electroforesis de proteína
obtenida por extracción a partir de células tratadas con
Piasclédine 300® o con TGF-\beta. La figura 6.B es
una fotografía de transferencia Northern que muestra la expresión
del ARNm de PAI-1 en las células tratadas con
Piasclédine 300®. Los resultados del experimento de la
transferencia Northern se normalizan y se expresan en forma de
histograma en la figura 6.C.
La figura 7 muestra el efecto de las materias
insaponificables de aguacate y de soja, y de las fracciones H e I
sobre la expresión del TGF-\beta1.
La figura 8 (es decir, las figuras 8A y 8B)
muestra el efecto de las materias insaponificables de aguacate y de
soja, y de las fracciones H e I sobre la biosíntesis de colágeno
(figura 8A) y de proteínas no colagénicas (figura 8B), mediante
fibroblastos dérmicos en cultivo.
Los condrocitos se aíslan de cartílagos de
ternera como se describe en el artículo de Benya et al.
("The progeny of articular chondrocytes synthesize collagen types
I and II trimer, but not type II. Verification by cyanogen bromide
peptide analysis", Biochemistry 1977; 16:
865-872). Se utilizan cultivos primarios de
condrocitos a fin de minimizar los cambios fenotípicos. Los
cultivos se exponen a razón de 6,0 x 10^{6} células por cajas de
175 cm^{2} (para la extracción del ARN), a razón de 5,0 x 10^{5}
células por pocillos en placas con 6 pocillos (9,6 cm^{2}) (para
la marcación del PAI-1), y a razón de 1,2 x 10^{6}
células en cajas de Petri de 100 mm (transfección). Los cultivos se
incuban en un medio completo DMEM (DMEM por "Dulbecco's modified
Eagle's medium", en inglés) que contiene 10% de suero fetal de
ternera (FCS) y antibióticos a 35ºC en un atmósfera con 5% de
CO_{2} y 95% de aire, hasta llegar a la confluencia (con la
excepción de los ensayos de transfección). Los cultivos se incuban
en presencia de materias insaponificables de aguacate y de soja en
forma del producto "Piasclédine 300®" (comercializado por la
compañía Laboratoires Pharmascience), que contiene 33,3% de materia
insaponificable de aceite de aguacate y 66,6% de materia
insaponificable de aceite de soja, siendo la concentración de
Piasclédine 300® de 10 \mug/ml y, en presencia de
TGF-\beta1, de 1 ng/ml (comercializado por la
compañía R & D Systems), durante los tiempos indicados. En la
medida en la que la Piasclédine 300® se disuelva en
dimetilformamida (DMF), se incluye en todos los ensayos de los
testigos que contengan la misma concentración de DMF.
El ARN total se extrae mediante el método de
solubilización diferencial con fenol/cloroformo utilizando el kit
comercial RNAXel de la compañía Eurobio. Las concentraciones de ARN
se determinan mediante la medida del valor de la densidad óptica a
260 nm (DO_{260}). Las relaciones DO_{260}/DO_{280} son
mayores que 1,8. La integridad de las muestras de ARN se controla
mediante electroforesis sobre gel de agarosa al 1%, en presencia de
bromuro de etidio. En el caso de una contaminación de ADN genómico,
se efectúa una precipitación suplementaria con cloruro de litio LiCl
6M para obtener muestras puras de ARN.
Se hacen pasar 10 \mug de muestras de ARN
desnaturalizado sobre un gel de
agarosa-formaldehído al 1%. El ARN se transfiere
mediante capilaridad sobre una membrana de nylon (Pall Biodyne,
Gelman Sciences), y se inmoviliza mediante irradiación con rayos
ultravioleta (Bioblock UV Crosslinker, Francia). Se utilizan tres
sondas diferentes para evaluar los valores de ARNm para el
TGF-\beta, el PAI-1, la
\beta-actina: (a) se genera una sonda de ADNc con
336 pares de bases (pb) para el TGF-\beta1
mediante RT-PCR (transcripción inversa y reacción
en cadena con polimerasa), utilizando los cebadores indicados aquí
abajo, (b) un fragmento de ADNc de 3000 pb que corresponde al
PAI-1 humano (suministrado por el laboratorio del
Doctor J-P Pelletier, Montreal, Canadá), y (c) una
sonda de 548 pb de \beta-actina generada mediante
RT-PCR con los cebadores específicos enumerados
aquí abajo. Las sondas de ADNc se radiomarcan utilizando el kit de
marcación aleatoria de los cebadores (Gibco BRL, Francia) y
[^{32}P]-dCTP como radiomarcador (Amersham,
Francia). Cada sonda se hibrida separadamente a 55ºC y se lava dos
veces durante 20 minutos a temperatura ambiente y una vez a 55ºC
con un tampón 2 x SSC que contiene SDS al 0,1%. Las señales se
detectan mediante autorradiografía de contacto de película
utilizando una película Kodak (X-OMAT AR5) con
pantallas intensificadoras. La densidad óptica relativa de las
señales autorradiográficas se normaliza frente a los valores de la
\beta-actina utilizando la técnica de
densitometría mediante barrido por láser en dos dimensiones y el
programa ImageQuaNt (Molecular Dynamics, Francia).
Se invierten muestras de 1 \mug de ARN total,
transcritas en ADNc, en presencia de un cebador antisentido 100 pM,
10 unidades de "RNasin®" (inhibidor de ribonucleasa,
comercializado por la compañía Promega), 10 mM de ditiotreitol, 0,5
mM de cada trifosfato desoxinucleótido (dNTP) (Life Technologies),
un primer tampón "Strand" 5X y 60 unidades de transcriptasa
inversa del virus de Moloney de la leucemia murina (Life
Technologies). La reacción se realiza a 42ºC durante una hora. La
amplificación del ADNc generada se realiza en un termociclador Omni
E Hybaid utilizando el kit PCR de Life Technologies, en presencia
de los cebadores sentido y antisentido:
TGF-\beta1, sentido 5'-GCC CTG
GAC ACC AAC TAT TGC-3'/antisentido
5'-GCT GCA CTT GCA GGA GGG CAC-3'
(Lupparello et al., "Transforming Growth
Factor-\beta1, -\beta2 and -\beta3, urokinase
and parathyroid hormone-related peptide expression
in 8701-Bc breast cancer cell and clones",
Differenciation, 1993; 55: 73-80);
T\betaR-1, sentido 5'-ATT GCT GGA
CCA GTG TGC TTC GTC-3'/antisentido
5'-TAA GTC TGC AAT ACA GCA AGT TCC ATT
CTT-3' (Franzen et al.), "Cloning of
TGF-\beta type I receptor that forms a heteromeric
complex with the TGF-\beta type II receptor",
Cell, 1992; 75: 681-692);
T\betaR-II, sentido 5'-CGC TTT GCT
GAG GTC TAT AAG GCC-3'/antisentido
5'-GAT ATT GGA GCT CTT GAG GTC
CCT-3' (Lin Hy et al., "Expression cloning
of the TGF-\beta type II receptor, a functional
transmembrane serine/threonine kinase", Cell, 1992; 68:
775-785); \beta-actina, sentido
5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC
CA-3'/antisentido 5'-CTC CTT AAT GCT
ACG CAC GAT TTC-3' (Lupparello et al.,
citado anteriormente). Se han efectuado 35 ciclos utilizando las
condiciones siguientes: 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30
segundos y 72ºC durante 1 minuto. Después, se incluye una etapa
suplementaria a 72ºC durante 1 minuto. Después, se incluye una
etapa suplementaria a 72ºC durante 10 minutos. El número de ciclos
se selecciona en la fase exponencial de la curva de amplificación
establecida anteriormente. Los transcritos se han analizado
mediante electroforesis sobre gel de agarosa al 2%, y se visualizan
mediante coloración con bromuro de etidio. Las reacciones de
amplificación han suministrado tamaños esperados del transcrito
(TGF-\beta1: 336 pb, T\betaR-I:
668 pb, T\betaR-II: 454 pb,
\beta-actina: 548 pb). La identidad de los
productos de la PCR se confirma igualmente mediante digestión por
endonucleasa de restricción y por transferencia Southern, utilizando
las sondas humanas respectivas que corresponden, para el
T\betaR-1 y T\betaR-II, a la
longitud total de los ADNc, y, para TGF-\beta1 y
\beta-actina, a los fragmentos generados mediante
RT-PCR. Tras la fotografía de los geles con una
película Polaroid 665, la intensidad de las bandas correspondientes
se cuantifica mediante barrido densitométrico realizado con el
programa ImageQuaNt (Molecular Dynamics), y se normaliza frente a
los valores de ARNm de \beta-actina.
A fin de medir la cantidad de
TGF-\beta1 activo en el medio acondicionado con
las células testigo de control, o con las células tratadas con
materias insaponificables de aguacate y de soja, las células
monocapas confluentes en las placas de cultivo con 6 pocillos se
incuban durante 24 horas en el medio que contiene FCS al 10%, con o
sin 10 \mug de Piasclédine 300®. Las células se lavan tres veces
con un medio libre de suero suplementado con 200 \mug/ml de BSA
(albúmina de suero bovino), durante 5, 30 y 60 minutos, y se
incuban en 1 ml de medio libre de suero durante 6 horas
suplementarias. Después, el medio acondicionado se recoge en tubos
siliconados para microcentrifugación, se centrifugan, y se
determina la cantidad de TGF-\beta1 maduro,
activado, en el sobrenadante, mediante inmunodosificación del
TGF-\beta1 utilizando el kit Quantikine®
(Quantikine® R&D Systems, U.S.A.) según las instrucciones del
fabricante.
Los cultivos confluentes en placas con 6 pocillos
(9,6 cm^{2}) se marcan con metionina [^{35}S] (40 \muCi/ml,
Amersham, Francia) en presencia de Piasclédine 300® (10 \mug/ml)
y de TGF-\beta1 (1 ng/ml) durante 24 horas. La
extracción de las proteínas radiomarcadas y la caracterización del
PAI-1 mediante electroforesis se realizan como se
describe en el artículo de Laiho M. et al. ("Transforming
Growth Factor-\beta induction of
type-1 plasminogen activator inhibitor", J. Biol.
Chem. 1987; 262: 17467-17474), con algunas
modificaciones. Poco después, los medios se retiran, y las capas de
células se rasan en 1 ml de tampón Tris-HCl 10 mM
de pH 8, que contiene 0,5% de desoxicolato de sodio y 1 mM de
fluoruro de fenilmetanosulfonilo. Las muestras se centrifugan a 4ºC,
10.000 g durante 10 minutos. Los sobrenadantes se absorben con
concanavalina A (Con A)-Sepharose (Pharmacia) (50
\mul de 50% (v/v) de suspensión en PBS). La Con
A-Sepharose se lava tres veces con una mezcla
PBS/Tween 80 (0,01%), y las proteínas fijadas se disuelven en un
tampón de Laemmli (Laemmli et al., "Cleavage of structural
proteins during the assembly of the head of bacteriophage
T_{4}", Nature, 1970; 227: 680-685), que
contiene 10% de 2-mercaptoetanol. Las proteínas
fijadas sobre la concanavalina A se someten a una electroforesis
sobre gel de policrilamida 10% en presencia de dodecilsulfato de
sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE),
seguido de una fluorografía. La ovoalbúmina (M_{r} 46.000) y la
anhidrasa carbónica (M_{r} 29.000) se utilizan como marcador de
peso molecular. Se determina que la banda de 46 kD corresponde al
PAI-1, mediante una inmunotransferencia anterior
utilizando un anticuerpo anti-PAI-1
policlonal de conejo (Dako, Copenhague, Dinamarca), tal como se
describe en el artículo de Laiho M. et al., citado
anteriormente.
Para las transfecciones transitorias, las células
se disponen en cajas de Petri de 100 mm, y se hacen crecer hasta
70-80% de confluencia. Después, las células se
cotransfectan, mediante el método de coprecipitación con fosfato de
calcio (Bradford et al., "A rapid and sensitive method for
the quantification of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding", Anal.
Biochem., 1976; 72: 248-254), con 9 \mug de
plásmidos apropiados y 3 \mug de pSV40-\beta Gal
(Promega), y un vector de expresión de la
\beta-galactosidasa utilizado como testigo interno
para normalizar la eficacia de la transfección. Después de 24
horas, el medio se sustituye por un medio que contiene DMF (1:1000)
en ausencia o en presencia de Piasclédine 300® (10 \mug/ml).
Las células se recolectan 48 horas después de la
adición de ADN, y los extractos se ensayan con respecto a la
actividad de luciferasa. Poco después, las cajas de Petri se lavan
dos veces con PBS, y las células se lisan con 300 \mul de tampón
de lisis (0,45 mM de Tris-HCl, pH 7,5). Los lisados
se someten a tres ciclos de
congelación-descongelación. Después de la
centrifugación, se mide la luminiscencia de una alícuota de 50
\mul de lisado de cada caja de Petri, en un luminómetro (Berthold
Lumat 9501) durante 20 segundos, después de la adición de
luciferina (Luciferase Assay System, Compañía Promega). A fin de
normalizar la actividad de la luciferasa, se determina la
concentración de proteína y la actividad de la
\beta-galactosidasa. La concentración de proteína
de lisados celulares de 4 \mul de cada caja de Petri se mide
según Bradford, tal como se cita aquí arriba. Los lisados celulares
se ensayan con respecto a la actividad de la
\beta-galactosidasa, utilizando
resofurina-\beta-D-galactopiranósido
como sustrato, y se mide la DO a 572 nm.
Las construcciones que contienen el promotor del
TGF-\beta1 se generan a partir del plásmido phTG2
(Kim et al., "Characterization of the promotor region of
the human transforming growth factor-\beta1
gene", J. Biol. Chem. 1989; 264: 402-408),
suministrado por el doctor S.J. Kim (Laboratoire de Chemoprevention,
NIH/NCI; Bethesda). La digestión del plásmido phTG2 con las enzimas
HindIII y Xlal, respectivamente, genera fragmentos de ADN que
corresponden a las secuencias promotoras respectivas -1132 a +11 y
-732 a +11. Después de completar los extremos cohesivos mediante el
fragmento de Klenow, los fragmentos de ADN se digieren mediante
Kpnl, y después se clonan en el plásmido informador estándar pGL2,
en el sitio SmaI/KpnI (Promega), que codifica el gen de la
luciferasa sin secuencia promotora. La construcción que contiene la
región promotora -454/+11 corresponde a la clonación de una
secuencia de ADN obtenida mediante digestión de phTG2 con HindII- y
KpnI en un sitio SmaI-KpnI del plásmido informador
estándar pGL2.
El efecto de Piasclédine 300® sobre los
condrocitos articulares bovinos se determina en cultivos primarios
confluentes incubados durante 24 horas en presencia o en ausencia
de Piasclédine 300® (10 \mug/ml), conteniendo los testigos la
misma concentración de dimetilformamida (DMF 1:1000) que se utiliza
como disolvente del extracto. No se ha observado ningún cambio
morfológico o separación celular con concentraciones hasta 100
\mug/ml, tal como se ha examinado mediante microscopia con
contraste de fase. Sin embargo, para la mayoría de los ensayos, se
ha seleccionado la concentración de 10 \mug/ml en la medida en la
que el valor de DMF en las muestras con 100 \mug/ml habría sido
demasiado elevado y potencialmente perjudicial para las células. Se
ha determinado la expresión de los TGF-\beta1 y
TGF-\beta2 después de la extracción del ARN total
mediante transferencia northern. Como se muestra en la figura 1, el
tratamiento de BAC (condrocitos articulares bovinos) con
Piasclédine 300® al 10 \mug/ml ha provocado un aumento notable
del nivel de ARNm de TGF-\beta1 con relación a los
testigos, cuando la señal apenas se podía detectar. Se han
observado dos transcritos de 1,9 y 2,4 kb en las transferencias
northern. Esta expresión aumentada del gen
TGF-\beta1, inducida por Piasclédine 300®, es
específica porque la expresión del ARNm de la
\beta-actina, que corresponde a un gen
constitutivo, no ha cambiado de manera significativa en las mismas
condiciones experimentales.
A fin de determinar si este efecto de
transcripción va acompañado de un aumento de la síntesis de las
proteínas TGF-\beta, una dosificación ELISA
permite estimar la concentración de TGF-\beta1
liberado en los medios de cultivos celulares tratados con
Piasclédine 300®. La figura 1 muestra que la producción de
TGF-\beta1 inmunodetectable aumenta mediante una
exposición de 24 horas a Piasclédine 300® 10 \mug/ml. Aunque el
ensayo no permite distinguir el TGF-\beta latente
del TGF-\beta activado, resulta claramente que
existe una correlación entre el efecto de las materias
insaponificables de aguacate y de soja sobre la transcripción y la
traducción, y sobre la expresión del
TGF-\beta1.
En una segunda serie de ensayos, se han examinado
los efectos de Piasclédine 300® sobre el valor de la expresión
tanto del TGF-\beta1 como del
TGF-\beta2, en presencia o en ausencia de
TGF-\beta1 exógeno. Como se muestra en la figura
2, la expresión del TGF-\beta2 ha sido estimulada
igualmente mediante Piasclédine 300®. De manera interesante, en el
caso del TGF-\beta1, se ha observado un efecto de
sinergia que muestra que pueden aparecer bucles de amplificación en
el sistema.
Puesto que estos resultados muestran que
Piasclédine 300® induce un aumento de la expresión del
TGF-\beta, se han querido determinar los efectos
de concentraciones diferentes de las materias insaponificables de
aguacate y de soja, y de los tiempos de incubación diferentes,
sobre el porcentaje de expresión de los ARNm de
TGF-\beta1. En la medida en la que la señal
detectada por el método de transferencia northern es relativamente
baja para los condrocitos testigos no tratados (véase la figura 1),
para realizar estos ensayos se ha preferido utilizar el método
RT-PCR. El tratamiento de condrocitos con
Piasclédine 300®, de concentraciones crecientes (5, 10 y 25
\mug/ml), permite observar una respuesta a la estimulación para
concentraciones de Piasclédine 300® de 10 y 25 \mug/ml, con un
efecto más importante para una concentración de 10 \mug/ml. La
concentración de 5 \mug/ml es probablemente demasiada baja para
producir cualquier efecto (véase la figura 3). El tratamiento de
condrocitos con Piasclédine 300® a una concentración de 10
\mug/ml, durante periodos de 12, 14 ó 48 horas, permite observar
un aumento del porcentaje de expresión de los ARNm de
TGF-\beta1 en todos los periodos de incubación,
con un máximo hasta 48 horas (véase la figura 3).
Según los resultados anteriores que muestran que
las materias insaponificables de aguacate y de soja pueden
estimular la actividad de transcripción del promotor del gen
TGF-\beta1, el objeto de este ensayo es delimitar
las secuencias en cis del gen TGF-\beta1
susceptibles de mediar este efecto. Se transfecta una serie de
fragmentos de la región 5'- del promotor del gen humano del
TGF-\beta1, fusionados al gen de la luciferasa,
en condrocitos bovinos, y después se tratan durante 24 horas con
Piasclédine 300® 10 \mug/ml. Después se ensaya para cada plásmido
la expresión de la actividad de la luciferasa. Como se muestra en
la figura 4, la construcción más larga utilizada (-1132 a +11)
induce una expresión de actividad de luciferasa 8 veces mayor que la
del testigo. Las otras secuencias, que corresponden a la región en
dirección 3' (-732 a +11), no producen ningún cambio significativo
en cuanto a la expresión de la luciferasa, en comparación con la de
los testigos.
Estos resultados muestran que las secuencias de
ADN que responden a la estimulación de las materias insaponificables
de aguacate y de soja sobre la expresión del gen de
TGF-\beta1 se sitúan entre -1132 y -732.
En la medida en la que la actividad biológica del
TGF-\beta está mediada vía su unión a los
receptores membranarios celulares, se propone estudiar los efectos
de las materias insaponificables de aguacate y de soja sobre la
expresión de los receptores del TGF-\beta
midiendo los niveles de ARNm correspondientes. Como lo muestra la
figura 5, el tratamiento con Piasclédine 300® no induce ninguna
variación del porcentaje de expresión de los ARNm de
T\betaR-I y de T\betaR-II. El
análisis de estos datos, mediante barrido densitrométrico y
normalización con relación a la señal de la
\beta-actina, muestra que la relación relativa
para el T\betaR-I, establecida con la
amplificación de 35 ciclos, es de 1,16 en los cultivos tratados, en
comparación con el valor de 1,23 en los testigos, y el valor de 0,83
para el T\betaR-II frente a 0,70 en los
testigos.
En cultivos monocapas confluentes de los
condrocitos utilizados en estos ensayos, ensayos anteriores han
mostrado que el PAI-1 producido por las células se
ha encontrado esencialmente en la capa de célula, que comprende una
matriz ambiental abundante. Se ha constatado que el medio contenía
sólo cantidades menores de PAI-1 neosintetizado.
Por lo tanto, se ha extraído el PAI-1 marcado con
metionina-^{35}S a partir de la fracción células
+ matriz, sin distinguir entre la parte intracelular y la parte
extracelular del PAI-1 total producido. Como se
muestra en la figura 6, cuando se han tratado cultivos de
condrocitos bovinos con TGF-\beta1 durante 24
horas, la fracción de PAI-1 aislada mediante
electroforesis sobre gel ha sido, significativamente, más importante
que la de los cultivos testigo. Este resultado ha suministrado la
prueba de que las células respondían al TGF-\beta1
en términos de expresión del PAI-1, y ha validado
el sistema utilizado para determinar el efecto de las materias
insaponificables de aguacate y de soja. En las mismas condiciones,
está claro que los extractos de aguacate y de soja han podido
aumentar la síntesis de PAI-1, prácticamente en el
mismo grado como lo ha hecho el TGF-\beta1 (véase
la figura 6).
A fin de determinar si el efecto de estimulación
de las materias insaponificables de soja y de aguacate sobre la
síntesis de PAI-1 se ejerce al nivel de la
transcripción, se ha realizado una transferencia northern a partir
de ARN total aislado de cultivos tratados de la misma manera que
para la marcación de la proteína PAI-1. La
hibridación con la sonda ADNc de PAI-1, marcada con
fósforo 32, ha demostrado que la cantidad de ARNm que codifica el
PAI-1 aumenta durante las 24 horas del tratamiento
con materias insaponificables de aguacate y de soja, revelando la
correlación existente entre el porcentaje de expresión del ARNm y
el nivel de proteína (véase la figura 6). Se sugiere así que las
materias insaponificables de aguacate y de soja son capaces de
aumentar la síntesis de PAI-1 a nivel
transcripcional.
Las células utilizadas para este estudio son
fibroblastos humanos que provienen de prepucio de niños. Se han
obtenido mediante la técnica de explantes y se cultivan en DMEM
("Dulbeccos Modified Eagle Medium", en inglés) al que se le ha
añadido 10% de suero fetal de ternero (SVF). Los cultivos se
mantienen en una incubadora con 5% de CO_{2}, a 37ºC, y el medio
se cambia cada tres días.
Se han sembrado fibroblastos dérmicos humanos en
cajas de seis pocillos de 9,6 cm^{2} en DMEM al que se le ha
añadido 10% de suero fetal de ternero (SVF) (3 ml). En la
confluencia, los cultivos de fibroblastos se han preincubado con
DMEM + 2% SVF durante 24 horas. La incubación propiamente dicha se
realiza en DMEM + 0% SVF, a fin de evitar que el
TGF-\beta presente en el suero interfiera con la
dosificación. A este medio se le añaden 1,5 ml de las diferentes
preparaciones ensayadas, a saber: un control (C), Piasclédine 300®
(PIAS), una materia insaponificable de soja (IS), una materia
insaponificable de aguacate (IA), y sus fracciones enriquecidas en
derivados furánicos (H) y en alcoholes grasos polihidroxilados (I).
La dosificación se realiza utilizando un kit ELISA (R&D
Systems).
La dosificación del TGF-\beta1
se realiza en el medio de cultivo siguiendo las instrucciones del
proveedor. Se obtiene un intervalo patrón utilizando cantidades
conocidas de TGF-\beta1, lo que permite trazar una
línea recta de la densidad óptica (DO) con relación a la
concentración, y determinar la ecuación de la línea recta así como
el coeficiente de correlación. La concentración de
TGF-\beta1 en las muestras se calcula utilizando
las DO obtenidas con las diferentes preparaciones ensayadas. Los
resultados se expresan en pg/ml de TGF-\beta1, y
representan la media de 3 mues-
tras.
tras.
Estos resultados presentados en la figura 7
muestran que PIAS, IS, IA, H e I estimulan la producción del
TGF-\beta1 por fibroblastos dérmicos en
cultivo.
Se preincuban cultivos confluentes de
fibroblastos dérmicos (6 pocillos de 9,6 cm^{2}) con ácido
ascórbico (3 ml). Después de 24 horas, el medio se sustituye por
1,5 ml de medio DMEM/10% de SVF al que se le añaden \beta/APN
(aminopropionitrilo), ácido ascórbico y
^{3}H-prolina (2 \muCi/ml).
La biosíntesis de colágenos se ha medido mediante
la técnica de dosificación con colagenasa bacteriana purificada,
descrita por Peterkofsky y Diegelmann (1971).
Veinticuatro horas después del tratamiento de los
cultivos con las diferentes preparaciones ensayadas, a saber, un
control (C), Piasclédine 300® (PIAS), una materia insaponificable
de soja (IS), una materia insaponificable de aguacate (IA), y sus
fracciones enriquecidas en derivados furánicos (H) y en alcoholes
grasos polihidroxilados (I), de concentración 20 \mug/ml
(solubilizadas anteriormente en etanol absoluto), la dosificación
se efectúa sobre el medio de cultivo porque, en presencia de
aminopropionitrilo, la mayor parte del colágeno sintetizado (95%)
por los fibroblastos en cultivo está presente en forma soluble.
Los resultados se presentan en las figuras 8A y
8B. Como se muestra en la figura 8A, las preparaciones PIAS, IS,
IA, H e I aumentan la biosíntesis del colágeno por fibroblastos
dérmicos humanos, para concentraciones de 20
\mug/ml.
\mug/ml.
Los efectos observados son específicos de los
colágenos puesto que no hay efecto sobre la biosíntesis de las
proteínas no colagénicas, como lo muestra la figura 8B.
El conjunto de estos resultados muestra que las
sustancias PIAS, IS, IA, H e I estimulan la biosíntesis de colágeno
por fibroblastos dérmicos en cultivo.
Los resultados de este estudio muestran que las
materias insaponificables de aguacate y de soja (PIAS, IS, IA, H e
I) estimulan la biosíntesis del colágeno por fibroblastos dérmicos
en cultivo. Además, estos efectos son específicos del colágeno en la
medida en la que no hay efecto sobre la biosíntesis de las
proteínas no colagénicas.
Por otra parte, las preparaciones utilizadas
aumentan la producción de TGF-\beta1 por
fibroblastos dérmicos.
Este último resultado indica que la estimulación
de la biosíntesis del colágeno por las diferentes preparaciones
pasaría por una vía que implica al TGF-\beta1.
Los resultados obtenidos en este estudio muestran
que las materias insaponificables de aguacate y de soja (PIAS, IS,
IA, IH e I) son capaces de aumentar la biosíntesis del colágeno,
principal molécula de la matriz extracelular (MEC) producida por los
fibroblastos dérmicos. Además, estas preparaciones aumentan la
producción del TGF-\beta1, potente estimulante de
la síntesis de las principales macromoléculas de la MEC.
Las materias insaponificables de aguacate y de
soja, por su acción sobre la biosíntesis del colágeno y del
TGF-\beta1, presentan por lo tanto un potencial
importante para la reconstrucción de la MEC, especialmente en el
fenómeno del envejecimiento cutáneo.
Claims (26)
1. Utilización de por lo menos una materia
insaponificable de aceite vegetal que presenta un efecto estimulante
de la expresión del TGF-\beta, para la preparación
de un medicamento destinado al tratamiento de patologías
seleccionadas de entre el grupo constituido por artritis de Lyme,
artritis psoriásica y osteoporosis.
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque el medicamento está destinado a
estimular la expresión de las isoformas TGF-\beta1
y TGF-\beta2, mediante las secuencias de ADN
situadas entre -1132 y -732 del promotor de la isoforma
TGF-\beta1.
3. Utilización según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizada porque dicho medicamento está destinado a
estimular también la expresión del inhibidor PAI-1
del activador del plasminógeno.
4. Utilización según las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizada porque la materia insaponificable de aceite
vegetal se selecciona de entre el grupo constituido por materia
insaponificable de aceite de aguacate, materia insaponificable de
aceite de soja, materia insaponificable de aceite de lupino, y sus
mezclas.
5. Utilización según la reivindicación 4,
caracterizada porque la materia insaponificable de aceite
vegetal es la materia insaponificable de aceite de aguacate.
6. Utilización según la reivindicación 5,
caracterizada porque la materia insaponificable de aceite
vegetal es la materia insaponificable de aceite de aguacate
seco.
7. Utilización según la reivindicación 5 ó 6,
caracterizada porque la materia insaponificable de aguacate
comprende por lo menos su fracción enriquecida en derivados
furánicos (fracción H), su fracción enriquecida en alcoholes grasos
polihidroxilados (fracción I), o una mezcla de estas fracciones.
8. Utilización según la reivindicación 4,
caracterizada porque la materia insaponificable de aceite
vegetal es la materia insaponificable de aceite de soja.
9. Utilización según la reivindicación 4,
caracterizada porque la materia insaponificable de aceite
vegetal es la materia insaponificable de aceite de lupino.
10. Utilización según la reivindicación 4,
caracterizada porque la materia insaponificable de aceite
vegetal es una mezcla de materia insaponificable de aceite de
aguacate y de materia insaponificable de aceite de soja, estando
comprendida la relación en peso de materia insaponificable de aceite
de aguacate a la materia insaponificable de aceite de soja entre
aproximadamente 0,1 y aproximadamente 9.
11. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la materia
insaponificable de aceite vegetal contiene fracciones ricas en
fitosteroles, tocoferoles, tocotrienoles, hidrocarburos terpénicos y
triterpénicos, y antioxidantes naturales.
12. Utilización según la reivindicación 11,
caracterizada porque la materia insaponificable de aceite
vegetal se selecciona de entre el grupo constituido por materia
insaponificable de aceite de cánola, de colza, de girasol, de palma,
de maíz, de sésamo, de germen de trigo, materia insaponificable de
aceite de soja, y sus mezclas.
13. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la materia
insaponificable de aceite vegetal está presente en el medicamento
según una proporción comprendida entre aproximadamente 1 y
aproximadamente 80% en peso, con relación al peso total del
medicamento.
14. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el
medicamento comprende además un excipiente, farmacéuticamente
aceptable, adaptado para una administración por vía oral, tópica
externa, entérica o parenteral.
15. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el
medicamento comprende además un excipiente, farmacéuticamente
aceptable, adaptado para una administración por vía oral.
16. Utilización, distinta de un método de
tratamiento terapéutico, de por lo menos una materia insaponificable
de aceite vegetal según la reivindicación 4, para la preparación de
una composición cosmética que comprende por lo menos un vehículo
cosméticamente aceptable, para aplicar sobre la piel, las mucosas
vecinas y/o los fáneros, y que se destina al tratamiento cosmético
de las cicatrices de la piel, de las mucosas vecinas y/o de los
fáneros, con la condición de que la composición cosmética no
comprenda extractos de polen.
17. Utilización, distinta de un método de
tratamiento terapéutico, de por lo menos una materia insaponificable
de aceite vegetal seleccionada de entre el grupo constituido por
materia insaponificable de aceite de aguacate, materia
insaponificable de aceite de soja, y sus mezclas, para la
preparación de una composición cosmética que comprende por lo menos
un vehículo cosméticamente aceptable, para aplicar sobre la piel,
las mucosas vecinas y/o los fáneros, y que se destina al tratamiento
del envejecimiento intraseco de la piel, de las mucosas vecinas y/o
de los fáneros, con la condición de que la composición cosmética no
comprenda extractos de polen.
18. Utilización, distinta un método de
tratamiento terapéutico, de por lo menos una materia insaponificable
de aceite vegetal seleccionada de entre el grupo constituido por
materia insaponificable de aceite de aguacate, materia
insaponificable de aceite de soja, y sus mezclas, para la
preparación de una composición cosmética que comprende por lo menos
un vehículo cosméticamente aceptable, para aplicar sobre la piel,
las mucosas vecinas y/o los fáneros, y que se destina al tratamiento
cosmético de la piel, de las mucosas vecinas y/o de los fáneros que
se hayan sometido a una irradiación actínica, con la condición de
que la composición cosmética no comprenda extractos de polen.
19. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque la materia
insaponificable de aceite vegetal es la materia insaponificable de
aceite de aguacate.
20. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque la materia
insaponificable de aceite vegetal es la materia insaponificable de
aceite de aguacate seco.
21. Utilización según la reivindicación 19 ó 20,
caracterizada porque la materia insaponificable de aguacate
comprende por lo menos su fracción enriquecida en derivados
furánicos (Fracción H), su fracción enriquecida en alcoholes grasos
polihidroxilados (Fracción I), o una mezcla de estas fracciones.
22. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque la materia
insaponificable de aceite vegetal es la materia insaponificable de
aceite de soja.
23. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque la materia
insaponificable de aceite vegetal es una mezcla de materia
insaponificable de aceite de aguacate y de materia insaponificable
de aceite de soja, estando comprendida la relación en peso de
materia insaponificable de aceite de aguacate y de materia
insaponificable de aceite de soja entre 0,1 y 9 aproximadamente.
24. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque la materia
insaponificable de aceite vegetal contiene fracciones ricas en
fitosteroles, tocoferoles, tocotrienoles, hidrocarburos terpénicos y
triterpénicos, y antioxidantes naturales.
25. Utilización, distinta de un método de
tratamiento terapéutico, de por lo menos una materia insaponificable
de aceite vegetal según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11,
para la preparación de una composición cosmética destinada al
tratamiento cosmético depilatorio de la piel, para aplicar sobre la
piel, y que comprende por lo menos un vehículo cosméticamente
aceptable.
26. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 25, caracterizada porque la materia
insaponificable de aceite vegetal está presente en la composición
según una proporción comprendida entre aproximadamente 0,1 y
aproximadamente 10% en peso, con relación al peso total de la
composición cosmética.
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