ES2237921T3 - Procedimiento para la maduracion de queso. - Google Patents

Abstract

Procedimiento destinado a acelerar la maduración del queso utilizando un cultivo iniciador primario y un cultivo iniciador bacteriano atenuado, caracterizado porque el cultivo iniciador atenuado se obtiene mediante el tratamiento con un agente activo de superficie.

Description

Procedimiento para la maduración de queso.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la maduración acelerada de queso.

La maduración de queso es un término utilizado para describir el procedimiento por el cual se producen cambios en la cuajada, dando como resultado el desarrollo de sabor, textura y aroma en el queso terminado. En la fabricación comercial de queso, la maduración se inicia mediante la adición de un cultivo bacteriano iniciador y cuajo a la leche. Las bacterias del cultivo iniciador convierten la lactosa en ácido láctico, creando un ambiente acídico en el que tienen lugar las reacciones bioquímicas que resultan esenciales para la maduración del queso (Scott, R., "Cheesemaking practice", Capítulo 11, páginas 145-146, 1986, Publ. Elsevier). Adicionalmente, los enzimas liberados por las bacterias también están implicados en la degradación de proteínas para dar péptidos y aminoácidos, y en la descomposición de ácidos grasos para dar cetoácidos, cetonas y ésteres mediante lipólisis. Estos productos de descomposición resultan importantes en el desarrollo del sabor, aroma y textura (Aston et al., Aust. Journal Dairy Technology, 38:55, 1983). En total, el proceso de maduración puede durar hasta un año o más.

Las técnicas modernas para fabricar queso emplean diversos procedimientos distintos con el propósito de acelerar el proceso de la maduración, de modo que el queso resultante requiere de un tiempo de almacenamiento menor antes de que finalice la maduración y está disponible para su comercialización en un periodo de tiempo más corto.

Un procedimiento para acelerar la velocidad de maduración del queso consiste en añadir enzimas proteolíticos bacterianos purificados al queso en maduración (Fox et al., Antonie van Leeuwenhock, 70, 271-297, 1996), pero esto implica gastos elevados en el aislamiento de enzimas. Además, normalmente la mayoría de los enzimas se pierden en el suero.

Un procedimiento alternativo para aumentar la velocidad de maduración consiste en añadir un número proporcionalmente mayor de bacterias del cultivo iniciador al queso en maduración, con el propósito de proporcionar una reserva mayor de enzimas bacterianos. Sin embargo, si el número de bacterias añadidas excede cierto umbral, el nivel de ácido láctico producido por el cultivo iniciador bacteriano imparte defectos en el sabor y textura del queso. Así, el tamaño máximo de cultivo iniciador se encuentra efectivamente limitado.

Para incrementar el número bacterias del cultivo iniciador sin incrementar la acidez del queso, los procedimientos modernos para fabricar queso han empleado cultivos iniciadores atenuados, que se añaden al mismo tiempo que el cultivo primario. El cultivo primario es el responsable de establecer la acidez necesaria. Sin embargo, en el cultivo iniciador atenuado, se mata una mayoría de células, o por lo menos se hace que sean incapaces de crecer durante el procedimiento de fabricación del queso, mediante choque térmico o de congelación, lo cual evita o suprime la producción de ácido pero no daña a los enzimas proteolíticos. El pretratamiento para matar una proporción de células, evitando así los procesos metabólicos que conducen a la producción de ácido, está descrito por Frey et al. (Milchwissenschaft, 41 [11], 1986). El tratamiento también puede lisar algunas células, resultando en la pérdida de enzimas hacia el suero.

Un problema de los procedimientos basados en el choque térmico consiste en que las células bacterianas y los enzimas que contienen presentan distinta sensibilidad al tratamiento térmico. Algunas células de cultivo iniciador son estables a la temperatura del choque, mientras que los enzimas importantes para la maduración del queso son sensibles a la temperatura. En este caso, resulta difícil atenuar suficientemente el cultivo celular y al mismo tiempo retener la actividad enzimática deseada. El resultado final es tan solo un incremento muy moderado de la intensidad del sabor. El uso de células sometidas a choque térmico presenta otros problemas adicionales, tales como amargor del queso, sabor efectuoso y producción de acetaldehído. Adicionalmente, la masa de células requerida para este procedimiento puede resultar económicamente prohibitiva. Así, se ha descrito el modo de alcanzar un equilibrio satisfactorio entre una atenuación suficiente y económica del cultivo celular reteniendo al mismo tiempo una actividad enzimática adecuada, aunque en la práctica este equilibrio resulta imposible de alcanzar (Fox et al., supra).

Asimismo, los procedimientos alternativos de pretratamiento que utilizan disolventes tales como n-butanol para acelerar la maduración, también han resultado ser comercialmente impracticables (Exterkate F.A., J. Diary Res., 46, 473-484, 1979).

Choi et al. (Journal of Dairy Sciencie, Vol. 79, 1996, pp 956-963) se refiere a la extracción de enzimas de la maduración del queso, tales como aminopeptidasas (AP). Las APs se extraen, por ejemplo, resuspendiendo un pellet de células bacterianas centrifugadas en Triton® X-100. No se hace ninguna referencia a cultivos iniciadores atenuados.

Las proteinasas desempeñan un papel importante en la maduración del queso. Sin embargo, El Abboudi et al. (Milchwissenschaft vol. 47, nº 10, enero 1992, pp 625-628) mostraron que bacterias iniciadoras sometidas a choque por congelación deficientes en una peptidasa tal como la dipeptidilaminopeptidasa (DAP), presentan un escaso efecto sobre la maduración del queso, indicando que las peptidasas pueden jugar un papel más minoritario.

Somkuti et al., Enzme Microb. Technol. Vol 16, nº 7, 1994, pp 573-576, enseñan que se pueden utilizar agentes activos de superficie para incrementar la hidrólisis de lactosa en alimentos frescos bajos en lactosa para cumplir las necesidades dietéticas de los consumidores con intolerancia a la lactosa. Somkuti da a conocer la expresión de
\beta-galactosidasa en Streptococcus thermophilus. Varios agentes activos de superficie, incluyendo el SDS y el Triton® X-100, se utilizan para permeabilizar la membrana de S. thermophilus conduciendo a un incremento de la hidrólisis mediada por la \beta-galactosidasa. Sin embargo, la propuesta de aplicar \beta-galactosidasa de S. thermophilus es para la fermentación destinada a preparar alimentos con bajo contenido en lactosa. No se describen enzimas de la maduración del queso tales como lipasas o proteasas.

Se conoce el cultivo de lactobacilli con un surfactante tal como la sal de un ácido biliar, ácido bovínico en polvo o ácido desoxicólico (Resumen de la patente japonesa nº 07255467). Fox et al. (Food Biotechnology, vol. 2, nº 2, 1988, pp 133-185) da a conocer el uso de cultivos iniciadores en la maduración del queso, aunque no se realiza ninguna mención a agentes activos de superficie.

De este modo, existe la necesidad de un procedimiento comercial práctico para atenuar un cultivo bacteriano que mate suficientes células como para limitar la producción de ácido láctico pero que también retenga niveles elevados de actividad enzimática.

Sorprendentemente, los solicitantes han encontrado actualmente que el tratamiento de cultivos bacterianos iniciadores con agentes activos de superficie atenúa el cultivo iniciador de un modo tal que permite superar los problemas identificados anteriormente.

Así, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para acelerar la maduración del queso utilizando un cultivo iniciador primario y un cultivo iniciador bacteriano atenuado, caracterizado porque el cultivo iniciador atenuado se obtiene mediante el tratamiento con un agente activo de superficie aceptable.

El término "cultivo iniciador" se refiere a cualquier cultivo bacteriano que resulte apropiado para ser utilizado en la maduración del queso, tal como Bifidobacteria, Brevibacteria, Lactobacilli, Lactococci, Leuconostocs, Micrococci y Pediococci. Los presentes inventores prefieren que el cultivo sea un miembro de las bacterias ácido lácticas. Particularmente, los presentes inventores prefieren que las bacterias que se utilizan en el cultivo iniciador sean especies de Lactococcus. Se apreciará que el término "cultivo iniciador" puede comprender un cultivo que contenga una única cepa bacteriana, o más de una cepa bacteriana. El término "cultivo iniciador" puede incluir asimismo organismos genéticamente modificados (OGMs). En cualquier caso, el término "cultivo iniciador" es bien conocido en la materia, y la invención se extiende igualmente a todos los cultivos iniciadores conocidos.

La maduración del queso se basa en la conversión de la cuajada en un queso con el sabor, textura y aroma deseados. Sin estar limitado por la teoría, es sabido que en el proceso de la maduración se hallan implicadas una variedad de reacciones bioquímicas. La maduración está relacionada con la producción de péptidos y aminoácidos a partir de la caseina, así como también con la descomposición de ácidos grasos para dar cetoácidos, cetonas y ésteres mediante lipólisis. No obstante, el desarrollo del sabor del queso evidentemente implica una interacción compleja, que muy probablemente comprende principalmente los productos de descomposición de la proteolisis y lipólisis, y se conocen muchos cultivos iniciadores que expresan enzimas implicados en la maduración del queso. Son precisamente estos cultivos los que se prefiere atenuar para su utilización en la presente invención.

Los cultivos iniciadores atenuados se seleccionan por su actividad enzimática, de modo que aunque generalmente se seleccionaran según el criterio establecido anteriormente, es preferible que no generen ácido láctico, ya que ésta es la función del cultivo iniciador primario. De hecho, generalmente el cultivo iniciador primario (o cultivo primario) no empezará a producir ácido láctico hasta que haya sido añadido. Por consiguiente, puesto que lo anterior tiende a depender de la expresión génica, el cultivo atenuado no puede jugar un papel mayoritario en la acidogénesis. Por el contrario, el cultivo atenuado sirve esencialmente como fuente de enzimas de maduración, pero permite ahorrar los gastos de aislar enzimas individuales y no pierde actividad mediante termolabilidad. Resulta particularmente sorprendente que agentes activos de superficie, tales como el dodecil sulfato, no presenten un efecto significativo sobre la actividad enzimática, ya que es sabido que son extremadamente desnaturalizantes (Scopes, R. K., Protein Purification, Principles and Practice, 1982, Springer advanced texts in Chemistry, publ. Springer-Verlag).

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "atenuado" se refiere a un cultivo bacteriano tratado de un modo tal que haga que la mayoría de las células que contiene sean inviables. En el contexto de la invención, se prefiere que no se detecten células viables en el queso maduro, y más preferentemente, que no se detecten células viables en el cultivo iniciador atenuado (o cultivo atenuado).

Preferentemente, las células del cultivo atenuado se hacen inviables, o se matan, sin que se produzca disrupción. Una preparación homogenizada pierde los enzimas en el suero, tal como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, resulta aceptable cierto nivel de disrupción, siempre y cuando no sea demasiado elevada.

Cuando se utiliza un cultivo iniciador sin atenuar, se observa frecuentemente un crecimiento variable de las células del cultivo iniciador. Este hecho conduce frecuentemente a unos niveles de actividad enzimática variables y a un grado de variabilidad en el grado de maduración, lo cual resulta indeseable en una operación comercial. El problema de velocidades de crecimiento variables no existe cuando se utilizan cultivos iniciadores tratados, ya que se puede añadir una cantidad definida de células tratadas que presentan una actividad enzimática predeterminada. Esto reduce la variación en los niveles enzimáticos, y resulta en un producto final de queso más constante.

Tal como se ha establecido anteriormente, es preferible que el número de células vivas en el cultivo final se reduzca a un nivel tal que no queden células viables. La eliminación de células viables resulta ventajosa para asegurar que un queso determinado supere las pruebas de seguridad de algunos organismos reguladores de alimentos, lo cual resulta particularmente importante cuando se utilizan OGMs en el queso. La reducción hasta unos niveles tan bajos también presenta ventajas en la práctica industrial, ya que ayuda a evitar el aislamiento e identificación de cepas comercialmente valiosas a partir del producto final de queso.

El término "agente activo de superficie", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier agente que sea capaz de actuar sobre la membrana de un microorganismo para matar, incapacitar o reducir de algún modo la viabilidad de la célula. Preferentemente, el agente activo de superficie es un detergente o un surfactante. Los presentes inventores prefieren que el agente sea un detergente, tal como un alquil-carboxilato, un compuesto de amonio cuaternario, un sulfonato, una betaina, una sulfo betaina, un alquil glucósido, una sal biliar, ó un alquiletoxilato. Resultan más preferidos los detergentes específicos sal de lauroil sarcosina, óxido de lauril dimetilamina, dodecildimetilglicina, octil-\beta-d-glucósido, sales del ácido cólico, sales desoxicolato y polisorbato 20, ó mezclas de los anteriores. Los presentes inventores prefieren particularmente que el detergente sea un alquiletoxilato, tal como Triton® X-100 (t-octilfenoxipolietoxietanol), o un miembro de la clase de sulfonato, siendo el compuesto más preferido el dodecil sulfato de sodio (en lo sucesivo referido como "SDS"). Cuando en la presente memoria se hace referencia a SDS, se entenderá que también
se hace referencia a cualquier otro agente activo de superficie apropiado, a menos que se especifique lo contrario.

Se apreciará que un agente activo de superficie también es preferentemente compatible con el uso en productos comestibles o con los mismos, o que se puede extraer fácilmente de las células tratadas antes de la adición del cultivo iniciador al queso. Un agente activo de superficie aceptable es tal que pueda ser consumido de modo seguro en la dieta a los niveles encontrados en el queso terminado. En este sentido, el SDS resulta particularmente preferido. Éste se encuentra catalogado en el Food Chemicals Codex como compatible para ser usado en productos comestibles, se emplea en la industria alimenticia como surfactante y emulsionante, y está presente como ingrediente en las pastas de dientes. En general, agentes tales como sales biliares son aceptables, aunque resulta necesario tener en cuenta las consideraciones Kosher. Se entenderá que un agente activo de superficie debe estar presente únicamente en cantidades seguras en el queso terminado.

El agente que actúa en superficie puede ser utilizado a cualquier concentración apropiada, de modo que se retenga la actividad enzimática pero que la viabilidad celular se reduzca suficientemente. Los presentes inventores prefieren que la concentración del agente activo de superficie sea suficiente para reducir la viabilidad celular a niveles no superiores a 5 x 10^{4} unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro del concentrado del cultivo iniciador, o inferior, siendo preferentemente tan baja que sea efectivamente 0. Se apreciará que la concentración del agente activo de superficie que se requiere dependerá de numerosos factores, tales como la naturaleza del agente activo de superficie, el número total de células, la densidad celular, la temperatura y el tiempo de contacto con las células.

En el caso específico del SDS, los presentes inventores prefieren que el SDS se encuentre presente a una concentración final comprendida entre 0,01% y 0,5% p/v para células que estén presentes a una densidad comprendida entre 10^{9} y 10^{11} unidades formadoras de colonias (UFC)/ml, más preferentemente entre 0,02 y 0,06% p/v. En todos los casos de la presente memoria, el % SDS se expresa como peso por volumen de la muestra que se va a tratar. Particularmente, los presentes inventores prefieren que el SDS se utilice a una concentración de 0,04% para células a una densidad comprendida entre 5 x 10^{9} y 5 x 10^{10} UFC/ml. Los presentes inventores también prefieren que las células se traten a una temperatura que permita que se retenga la actividad enzimática, la cual se encuentra preferentemente comprendida entre 2ºC y 15ºC, más preferentemente es inferior a 5ºC. Bajo estas circunstancias, los presentes inventores prefieren que el cultivo celular se trate durante por lo menos una hora, aunque se apreciará que el tratamiento durante periodos más largos también resulta eficaz. Sin embargo, se apreciará que la incubación con el agente activo de superficie se puede realizar a temperatura ambiente en determinadas circunstancias, tal como con técnicas de congelación rápida (ver Ejemplo 6).

En el caso del Triton® X-100, los presentes inventores prefieren que el detergente se utilice a una concentración comprendida entre 1 y 5% p/p, preferentemente entre 1,5 y 3% p/p para células a una concentración final de 10^{11} UFC/ml.

El agente activo de superficie se puede añadir a las células del cultivo iniciador en cualquier momento adecuado antes de la adición del cultivo iniciador al queso. Los presentes inventores prefieren que el agente activo de superficie se añada a las células una vez terminada la fermentación, con las células en fase estacionaria. Lo anterior permite una interacción óptima del agente activo de superficie con las membranas celulares de las células bacterianas. Sin embargo, se apreciará que el agente activo de superficie puede ser añadido al cultivo en cualquier momento adecuado antes de que alcance la fase estacionaria, o en un estadio posterior, tal como después de que las células se hayan concentrado para formar una crema celular.

Sin estar limitado por la teoría, se cree que la disrupción de la membrana celular por el agente activo de superficie es responsable de la reducción de la viabilidad celular. Por consiguiente, es probable que la accesibilidad del agente activo de superficie a la membrana sea el factor crítico que determina la eficiencia del procedimiento de atenuación. Para el tratamiento de una crema celular, que contiene células a una densidad superior a la de un cultivo en fase estacionaria, puede resultar necesario que la concentración del agente activo de superficie sea superior y ésta estará relacionada con la concentración celular.

Los presentes inventores prefieren que la disrupción de la membrana celular por un agente activo de superficie permita el acceso del enzima intracelular a sustratos para la reacción, y permita la liberación de los productos de reacción. Asimismo, prefieren que la célula no sea permeabilizada hasta el punto de que los enzimas intracelulares sean liberados del interior de la estructura celular. De este modo, el enzima intracelular queda retenido en la cuajada del queso durante el tratamiento, teniendo acceso a los sustratos importantes, y no se produce la pérdida en el
suero.

Tras el tratamiento con el agente activo de superficie, los presentes inventores prefieren que las células se centrifuguen para formar una crema celular. Seguidamente, el cultivo atenuado se puede añadir directamente a la leche. Sin embargo, los presentes inventores prefieren que la crema celular se trate adicionalmente para reducir el número de células viables, por ejemplo, mediante congelación o secado. Particularmente, los presentes inventores prefieren que la crema celular sea tratada mediante congelación-descongelación seguido de secado. Dicho tratamiento también resulta apropiado para la preparación del cultivo atenuado en una forma que resulta apropiada para el almacenamien-
to.

Se apreciará que la presente invención requiere que el tratamiento de las células del cultivo iniciador con el agente activo de superficie no ocasione un descenso significativo de la actividad de los enzimas bacterianos implicados en la maduración del queso. Los presentes inventores prefieren que la actividad enzimática del cultivo atenuado sea de por lo menos 85% del valor de las células sin tratar, siendo particularmente preferido por lo menos 90% de actividad. Por lo que se refiere específicamente a los enzimas celulares proteolíticos, preferimos que se mantenga por lo menos el 85% de la actividad de estos enzimas.

En general, se pueden emplear procedimientos bien conocidos en la técnica, conjuntamente con el procedimiento de la invención, para preparar queso.

A continuación se ilustrará la presente invención mediante los Ejemplos siguientes, que son ilustrativos de la presente invención, pero no limitativos de la misma.

Ejemplo 1 Efecto del SDS y la temperatura sobre la viabilidad y actividad enzimática de células bacterianas

Procedimiento: se cultivaron células de Lactococcus lactis de la cepa NCDO 712 en el medio M17 (Terzaghi B.E. y Sandine W.E., 1975, Applied Microbiology 29, 807-813) que contenía un 6% p/v de lactosa, y modificado mediante la utilización de tampón fosfato sódico (100 mM) en lugar de glicerofosfato sódico. Las células se cultivaron a 30ºC a pH 6 - 7, hasta alcanzar la fase estacionaria. Se trataron muestras de 100 ml del cultivo resultante con SDS a diferentes concentraciones de SDS. Los ensayos se realizaron sobre muestras tratadas con SDS tanto a temperatura ambiente como a 4ºC. La incubación con SDS se realizó durante una hora. Tras la incubación, se realizó el ensayo de los cultivos tratados para determinar tanto el número de células viables que quedaban como la actividad enzimática aminopeptidasa.

La viabilidad celular se ensayó mediante diluciones seriadas de las células de los cultivos tratados sobre agar MRS (Oxoid Ltd.).

La actividad aminopeptidasa se ensayó mediante la utilización de un ensayo espectroscópico. La aminopeptidasa es un enzima intracelular, que normalmente requiere de la disrupción celular mediante sonicación antes de realizar el ensayo. Sin embargo, como resultado del tratamiento con SDS, no hubo necesidad de someter las células a una disrupción adicional antes del ensayo, ya que el sustrato podía entrar en las células tratadas.

Una unidad de actividad aminopeptidasa se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar p-nitroanilina a una velocidad de 1 \mumol por minuto a partir de una solución 0,7 mM de L-leucina p-nitroanilida (Sigma) a pH 7 y 30ºC, llevando a cabo la reacción en tampón fosfato 100 mM. La velocidad de liberación de p-nitroanilina puede ser determinada a partir de la velocidad del incremento de absorbancia de la solución a 410 nm, y el coeficiente de extinción de la p-nitroanilina (Aldrich Chemical Co.) disuelta en el mismo tampón bajo las mismas condi-
ciones.

Resultados

1

A partir de los resultados, se puede observar que las células tratadas con SDS a 0,04% y 0,08% a temperatura ambiente pierden una gran proporción de la actividad aminopeptidasa. Sin embargo, las células tratadas a 4ºC a una concentración final de SDS de 0,01% y 0,04% retienen más del 85% de la actividad enzimática.

Resulta evidente que únicamente los tratamientos con niveles de SDS superiores al 0,4% reducen la viabilidad celular hasta un nivel preferido de 5 x 10^{4} UFC/ml, o inferior.

La combinación de los datos sobre la viabilidad celular y los datos sobre la actividad aminopeptidasa sugiere que las condiciones óptimas para la atenuación de un cultivo de Lactococcus lactis se producen cuando un cultivo de células en fase estacionaria se trata durante una hora con SDS a una concentración final de SDS de 0,4% y a 4ºC.

Ejemplo 2

Se cultivaron células de Lactococcus lactis de la cepa NCDO 712 como en el Ejemplo 1. Se añadió SDS (0,04%) a 1200 l de un caldo de fermentación que contenía aproximadamente 10^{10} células/ml. El caldo celular se trató con SDS durante una hora, y seguidamente se concentró utilizando una centrifuga continua. La viabilidad y la actividad enzimática se determinaron en muestras del caldo celular a diferentes estadios del tratamiento.

Resultados

2

Los resultados indican que el tratamiento con SDS resulta eficaz en tratamientos a mayor escala, reduciendo la viabilidad celular hasta el nivel deseado. La actividad enzimática se mantiene. Adicionalmente, se demuestra el efecto de la centrifugación en la reducción de la viabilidad celular.

Ejemplo 3 Efecto del SDS sobre la viabilidad de un iniciador de cepa mixta

El efecto del SDS se evaluó sobre un iniciador de cepa mixta comercialmente disponible, cepa R604 (Chr. Hansen). Los pellets congelados de la cepa R604 se diluyeron con caldo fermentador exento de células para alcanzar una densidad de 1,4 x 10^{10} UFC/ml. Lo anterior se realizó para mimetizar un caldo de cultivo al final de la fermentación.

El caldo de cultivo de cepa mixta resultante se dividió en dos alícuotas y se equilibró a una temperatura comprendida entre 8ºC y 10ºC. Una vez alcanzada dicha temperatura, una muestra se trató con SDS para dar una concentración final de 0,04% p/v. La muestra sin tratar se utilizó como control. Ambas muestras se mantuvieron a una temperatura comprendida entre 8 y 10ºC durante todo el experimento. El contaje de las células viables se realizó al cabo de 1 hora y de 24 horas.

Resultados

3

Los resultados indican que el SDS resulta eficaz contra una cepa iniciadora comercialmente disponible, en términos de reducción de células viables, del mismo modo que lo es contra la cepa NCDO 712 de L. lactis.

Ejemplo 4 Maduración acelerada del queso utilizando células tratadas con SDS

Se preparó queso Cheddar en tinajas de queso de 10 litros utilizando un procedimiento estándar, utilizando la cepa R604 Ch. Hansen como iniciador y Maxiren (Gist-brocades) como coagulante. La primera tinaja se preparó con la adición de 2,5 g de células tratadas con SDS liofilizadas. La segunda tinaja se preparó del mismo modo, excepto que no se añadieron células tratadas con SDS. Esta tinaja fue el control del experimento.

Los quesos prensados resultantes se dividieron en alícuotas de 200 g y se prepararon suspensiones de cuajada. Éstas se incubaron a 30ºC durante 6 días y seguidamente se ensayó la descomposición de proteínas utilizando el procedimiento SSA y se evaluaron las características de sabor mediante un panel entrenado de expertos sensoriales. No se observaron diferencias significativas en la preparación del queso con o sin células tratadas con SDS. Las características sensoriales y los resultados del SSA se resumen a continuación.

4

Los resultados indican que las células tratadas con SDS no presentan efectos adversos en la preparación del queso, y que la adición de células tratadas con SDS estimula la descomposición de proteínas y acelera la maduración del queso. Adicionalmente, las células tratadas con SDS evitan el desarrollo de sabor amargo defectuoso en el queso debido a la descomposición de péptidos amargos por las aminopeptidasas de las células tratadas con SDS.

Ejemplo 5 Efecto del Triton X-100® sobre la viabilidad y actividad enzimática de células bacterianas

La cepa NCDO 712 de Lactococcus lactis se cultivó como en el Ejemplo 1. El caldo de fermentación se concentró mediante centrifugación y se guardó congelado para los objetivos del experimento.

Cuando se descongeló, el concentrado se mantuvo a una temperatura comprendida entre 0ºC y 5ºC y se trató con 1 mg de desoxiribonucleasa bovina (Sigma) por Kg del concentrado para reducir la viscosidad (la viscosidad incrementó a causa de la liberación de ADN a partir de una pequeña proporción de células que se lisaron como resultado del ciclo de congelación/descongelación).

El concentrado de viscosidad reducida se dividió en alícuotas para varios tratamientos tal como se indica en la tabla. Se añadió Tritón X-100®, se mezcló extensamente y se guardó a 4ºC durante 1 hora, seguidamente se congeló durante una noche.

Las alícuotas se descongelaron y se determinó la actividad aminopeptidasa mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.

5

La viabilidad celular se evaluó mediante la dilución seriada del cultivo de células tratadas sobre un agar de contaje exento de azúcar (Merck 10878), contando todas las colonias del tamaño de una punta de alfiler.

Los resultados indican que el Triton X-100 a dosis de 1% p/p aun proporciona una actividad enzimática AP viable, con una reducción apropiada de la viabilidad celular.

Ejemplo 6 Pre-tratamiento de cultivos concentrados con SDS antes de la congelación rápida

Se cultivaron células de Lactococcus de la cepa NCDO 712 como en el Ejemplo 1. El caldo de fermentación se concentró mediante centrifugación, se dividió en alícuotas y se trató inmediatamente a temperatura ambiente con SDS a los niveles indicados en la tabla siguiente.

Tras mezclar y mantener durante 1 hora, el concentrado se sumergió en nitrógeno líquido (-195ºC) para formar pellets de un tamaño comprendido entre 3 mm y 10 mm, y se guardó durante una noche a -70ºC. Se extrajo una muestra a partir de cada alícuota para ensayarla directamente tras la descongelación y el resto se secó sin descongelar mediante liofilización.

Los ensayos incluyeron la viabilidad celular, mediante dilución seriada sobre agar M17 (Oxoid Ltd.), recuperación de AP mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, actividad dipeptidilhidrolasa (DPH) y estimación de la actividad de estos enzimas que se ha desasociado a partir de las células.

La actividad DPH se midió mediante el mismo procedimiento que la actividad AP excepto que la L-glicilprolina p-nitroainilida 1,5 mM (Sigma) se sustituyó por L-leucina p-nitroanilida 0,7 mM.

La actividad enzimática desasociada se determinó preparando una suspensión de la muestra en ensayo en tampón de ensayo, sedimentando las células en una centrífuga de laboratorio y determinando el porcentaje de la actividad total en la fracción del sobrenadante. Los resultados se resumen en la tabla siguiente.

Los resultados ilustran el principio de que la congelación rápida permite utilizar una temperatura de incubación superior y elude la necesidad de refrigeración durante la incubación. Adicionalmente, el detergente (SDS) se añade después de concentrar las células y no antes, lo cual demuestra la flexibilidad del procedimiento.

Se apreciará que en los diferentes procedimientos, las condiciones óptimas deben ser deducidas para cada caso a fin de reducir el contaje de células viables hasta el nivel preferido, reteniendo al mismo tiempo una actividad enzimática apropiada.

Los ensayos también muestran que después del tratamiento, los enzimas quedaban sustancialmente retenidos en las células, lo cual resulta preferido, quedando la aminopeptidasa más retenida que la dipeptidilhidrolasa.

6

Claims (14)

1. Procedimiento destinado a acelerar la maduración del queso utilizando un cultivo iniciador primario y un cultivo iniciador bacteriano atenuado, caracterizado porque el cultivo iniciador atenuado se obtiene mediante el tratamiento con un agente activo de superficie.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las bacterias del cultivo iniciador atenuado son bacterias ácido lácticas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el agente activo de superficie es un detergente o un surfactante.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el agente activo de superficie es un alquil-carboxilato, un compuesto de amonio cuaternario, un sulfonato, una betaina, una sulfo betaina, un alquil glucósido, una sal biliar, ó un alquiletoxilato.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el agente activo de superficie es sal de lauroil sarcosina, óxido de lauril dimetilamina, dodecildimetilglicina, octal-\beta-d-glucósido, sales del ácido cólico, sales desoxicolato, polisorbato 20, ó una mezcla de cualquiera de los anteriores.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente activo de superficie es dodecil sulfato de sodio.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el dodecil sulfato de sodio se encuentra presente a una concentración final comprendida entre 0,01% y 0,5% p/v de la muestra que se va a tratar para células que se encuentran a una densidad comprendida entre 10^{9} y 10^{11} unidades formadoras de colonias (UFC/ml).

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el agente activo de superficie es Triton® X-100.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el Triton® X-100 se utiliza a una concentración comprendida entre 1 y 5% p/p para las células que se encuentran a una concentración final de 10^{11} UFC/ml.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la viabilidad del cultivo iniciador atenuado se reduce hasta no más de 5 x 10^{4} unidades formadoras de colonias (UFC) por ml del concentrado de cultivo iniciador.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la actividad enzimática del cultivo atenuado se encuentra a un nivel de por lo menos 85% del cultivo antes del tratamiento con el agente activo de superficie, preferentemente por lo menos 90%.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que se mantiene por lo menos el 85% de la actividad de los enzimas proteolíticos celulares.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células tratadas con el agente activo de superficie se tratan adicionalmente para reducir el número de células viables.

14. Queso obtenido mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.