PT698348E

PT698348E - Inibicao de clostridios com bacterias do acido lactico

Info

Publication number: PT698348E
Application number: PT95301710T
Authority: PT
Inventors: Annika Mayra-Makinen; Tarja Suomalainen
Original assignee: Valio Oy
Priority date: 1994-08-25
Filing date: 1995-03-15
Publication date: 2000-06-30
Also published as: EP0698348B1; US5908646A; GR3032933T3; DK0698348T3; FI102807B1; FI102807B; DE69514446T2; EP0698348A1; FI943905A0; DE69514446D1; ATE188598T1; NZ270721A; ES2142454T3; SI0698348T1; FI943905A

Description

DESCRIÇAΟ "INIBIÇÃO DE CLOSTRIDIOS COM BACTÉRIAS DO ACIDO LÁCTICO" Âmbito da Invenção A presente invenção refere-se à inibição de clostíidios com bactérias do ácido láctico. Em especial, a invenção refere-se à utilização na indústria alimentar de Lactobacillus rhcimnosus, para inibir o desenvolvimento e actividade de clostridios.

Antecedentes da Invenção

As clostridias são bactérias positivas ao Teste de Gram, anaeróbias, formam esporos e tem metabolismo fermentativo. As clostridias são produtores bastante eficazes de gases (H, e C02); entre outros produtos resultantes da sua fermentação incluí-se o ácido butírico, ácido acético, butanol, etanol, isopropanol, acetona e outros ácidos e álcoois orgânicos. As clostridias são também os principais agentes da decomposição anaeróbia de proteínas. Os ambientes preferidos de clostridios são o solo e a água. No entanto, podem também existir em silos de má qualidade, rações, fertilizantes e alimentos contaminados como sejam, vegetais, peixe e crustáceos, carne, leite e doces.

Alguns tipos de clostridios foram identificados como patogénicos. Estes clostridios desenvolvem-se geralmente no solo. Se por um lado, este tipo de clostridios têm um fraco poder invasivo, por outro lado, produzem uma variedade de proteínas altamente tóxicas, conhecidas por exotoxinas, sendo as doenças clostridial resultado das referidas exotoxinas. Entre as doenças provocadas pelo clostridio encontram-se o botulismo e outras intoxicações alimentares não tão perigosas que são resultado específico das exotoxinas que se formam nos alimentos. Outros exemplos de doenças provocadas pelo clostridio, e que são consequência de feridas infectadas, são o tétano e a gangrena. Algumas toxinas de clostridios, como sejam as responsáveis pelo botulismo e o tétano, são fortes inibidores da função nervosa. Outras toxinas de clostridios, como a que provoca a gangrena, são enzimas. Este tipo de enzimas incluí a lecitinase, hemolisina e uma variedade de diferentes proteases.

Para além de serem patogénicas, os clostridios são também nocivas. A validade e utilidade dos alimentos e das suas matérias-primas é frequentemente comprometida pelos estragos provocados pelos clostridios. Os clostridios levam à deterioração não só dos alimentos consumidos frescos ou utilizados como matéria-prima na indústria alimentar, mas também de produtos da indústria alimentar como. por exemplo, produtos da indústria de conservas, carne preparada, produtos lácteos, etc. Os efeitos causados pelos clostridios nos alimentos são descritos por W. C. Frazier em Food Microbiology (Microbiologia Alimentar) 2a edição, 1967, Mcgraw-Hill Book Company, Nova Iorque.

Os clostridios podem também causar problemas na produção alimentar. Em particular, na indústria dos lacticínios em que os efeitos adversos de alimentos contendo clostridios são enormes. Por esta razão, um dos maiores problemas que surge no fabrico de queijo é a falsa fermentação provocada por clostridios durante a fase de cura do queijo. Os clostridios aproveita-se, por exemplo, dos hidrocarbonetos e do ácido láctico disponíveis para a fermentação normal, para a partir destes produzir ácido butírico e gases, em especial H: e C02. A fermentação do ácido butírico irá estragar completamente o queijo. Devido a formação excessiva de gás, a textura do queijo altera-se, o queijo incha demasiado e pode até arrebentar. A formação de ácido butírico confere ao queijo um sabor muito forte e desagradável que o toma impróprio para venda. São utilizados vários métodos na tentativa de inibir o desenvolvimento do clostridios. Os nitratos e nitritos, sob a forma de vários sais alcalinos, são utilizados para inibir o crescimento de clostridios, por exemplo, em came e seus derivados e em certas variedades de queijos. No entanto, os nitratos e nitritos são tóxicos em concentrações elevadas pelo que não é desejável a sua utilização como aditivos. Tendo em conta que,

j' os consumidores demonstram uma crescente opinião desfavorável acerca da utilização de aditivos e que a legislação respeitante à alimentação varia de país para país, a indústria em geral está empenhada em descobrir bioconservantes naturais que substituam os aditivos químicos.

Na tentativa de inibir o desenvolvimento de clostridios têm também sido utilizado o tratamento térmico, como é o caso da esterilização dos alimentos ou das suas matérias-primas. No entanto, os esporos formados pelos clostridios são termoestáveis, podendo o tratamento térmico provocar, no caso mais desfavorável, o efeito oposto ao desejado. Na indústria dos lacticínios existem também problemas resultantes da pasteurização do leite matar outras bactérias provocam a formação de ácidos. Assim sendo, os clostridios que geralmente não se desenvolve muito bem a temperaturas baixas e que, por outro lado, não e muito competitiva a altas temperaturas face a outras bactérias que provocam a formação de ácidos, não têm concorrentes com quem competir após os esporos germinarem.

Para evitar os problemas causados por clostridios, tenta-se manter o teor de esporos de clostridios no leite o mais baixo possível, proibindo a utilização de silos ou utilizando apenas silos de muito boa qualidade. Os esporos de clostridios podem também ser eliminados do leite antes da sua utilização como produto final ou como matéria-prima na indústria dos lacticínios. No entanto, a remoção de bactérias e/ou esporos é realizada por centrifugação, o que acarreta várias consequências ao nível da qualidade do produto final, além de, não ser viável do ponto de vista económico.

Para inibir o crescimento de clostridios têm também sido utilizada, em vários sectores da indústria alimentar, a enzima lisozima. No entanto, a actividade da lisozima não se limita unicamente aos micróbios prejudiciais, inibindo igualmente a actividade e desenvolvimento de qualquer bactéria desejável. Assim sendo, este tratamento não é recomendado pois afecta igualmente a qualidade do produto final. 4 A bactéria do ácido láctico produz vários tipos de compostos anti-microbianos, entre os quais, ácidos orgânicos, peróxido de hidrogénio, diacetil e bacteriocidas, pelo que se têm tentado a sua utilização como aditivo para, por exemplo, aumentar a validade dos alimentos. Encontra-se disponível comercialmente o produto Nisaplin (Aplin & Barrett) que incorpora nisin purificado produzido pela bactéria Lcictococcus lactis, o qual combate as bactérias positivas ao de Teste de Gram. A utilização de nisin com o propósito de controlar o desenvolvimento de esporos de Clostridium botulinum em queijos de barrar com uma percentagem elevada de humidade é descrita na Patente U.S. 4 584 199. A patente U.S. 4 790 994 revela a utilização de Pediococcus pentosaceus para inibir o desenvolvimento de bactérias psicotróficas em produtos lácteos, e.g., queijo tipo "cottage". Nesta patente não há qualquer referência a clostridios. A publicação da patente \VO 93/09676 refere um método para a conservação de produtos alimentares por tratamento com uma estirpe bacteriana eugénica que, competindo directamente, inibe o desenvolvimento de organismos patogénicos e deteriorantes antes do produto estar embalado. Como bactérias eugénicas consideram-se as bactérias não patogénicas e/ou não deteriorantes, sendo as mais recomendadas as bactérias LactobcicUlus delbriickii e Hafnia alvei. No entanto, a publicação não apresenta os efeitos proporcionados por estas espécies. A edição europeia da aplicação 344 786 (A2) apresenta uma preparação bacterial que incluí a cultura de Lactobacillus gasseri, Lactobacdlus delbrúckii e/ou Bifidobacterium longum num meio apropriado, como por exemplo o leite de soja. De acordo com a publicação esta preparação pode ser utilizada para inibir o desenvolvimento clostridial. A publicação refere que a preparação pode ser usada tanto com uma função terapêutica, para inibir o desenvolvimento de clostridios nos intestinos, ou como conservante alimentar, aumentando a acidez do produto. No entanto, a publicação não demonstra o efeito anti-clostridial das referidas bactérias. A DE Offenlegungsschrift 31 25 797 (Al) apresenta uma preparação dietética contendo Lactobacillus casei num meio de cultura apropriado, como seja o leite de soja, <<

D í- i} a qual de acordo com a publicação pode ser utilizada para inibir o desenvolvimento clostridial nos intestinos. A publicação refere que a preparação pode também ser utilizada, tal como outras preparações de bactérias de ácido láctico, para profilaxia de, por exemplo, terapia antibiótica decorrente. No entanto, a publicação não fornece resultados experimentais dos efeitos anti-clostridio da preparação dietética ou da cultura de Lactobacillus casei aí existente, pelo que não há qualquer prova da eficácia da invenção. Na publicação também não é descrita nem sugerida qualquer outra utilização para a Lactobacillus casei. A publicação "Alimenta” 5 (1971) 167-180 examina a possibilidade de utilização de diferentes variedades de Lactobacillus, na inibição de Clostridio tyrobutyricum, com o intuito de evitar o inchaço tardio em queijos duros. Nos testes foram estudadas 180 estirpes diferentes de L. casei, incluindo algumas da variante L. casei rhamnosus. No entanto, a grande maioria das estirpes revelou-se inactiva, e apenas três estirpes apresentaram propriedades inibitórias. Em comparação, 7 estirpes demonstraram promover a actividade de Cl. tyrobutryricum, e 170 revelaram-se inactivas. As estirpes individuais de L. rhamnosus não estão identificadas. A patente EP-A-0.302.300 refere-se a métodos para retardar o desenvolvimento de leveduras e bolores na indústria alimentar, prolongando, por exemplo, a validade do queijo "cottage". O método envolve a utilização de Lactobacillus casei var. rhamnosus NRRL-B-15972 para inibir os esporos de Penicillium oxalicum. A publicação J. Food Science 55 (1990) 386-390 apresenta a utilização de inúmeras Lactobacilli no controle da acidez, durante a produção de queijo. A estirpe L2F foi o único exemplar de L. rhamnosus testada e deu origem a efeitos indesejados: acidez elevada, amargura, sabor a velho, rachas e esmigalhamento. Não qualquer referência à inibição dos clostridios. A anterior aplicação dos requerentes EP-A-0,576,780 refere-se à estirpe original Lactobacillus casei ssp rhamnosus LC-705, DMS 7061, mas esta cadeia apenas revelou 6 ser eficaz contra bolores e leveduras como, por exemplo, Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium e Candidci. Não há nenhuma referência à sua utilidade contra qualquer tipo de bactéria. i

Breve Descrição da Invenção 1 j 1

I

Com a presente invenção pretendeu-se encontrar soluções inovadores para os f j problemas provocados pelo clostridio, Assim sendo, foi dada especial atenção aos | problemas causados pelos clostridios na indústria alimentar. Em particular, procurou encontrar-se uma solução para a questão de como impedir a fermentação do ácido ; butírico. j t

Ao estudar-se os efeitos que os factores anti-microbianos de várias bactérias do \ ácido láctico e outras provocam no desenvolvimento de clostridios, descobriu-se por mero acaso que a Lactobcicillus rhamnosus LC-705, DMS 7061 possui um excelente | efeito anti-cíostridial.

Assim, a presente invenção refere-se à utilização, na indústria alimentar, da v

Laclobácillus rhamnosus LC-705, DMS 7061 para inibir o clostridio. i 1'

De preferência, a Lactobacillus rhamnosus LC-705, DMS 7061, é introduzida j nos alimentos. j i i A presente invenção refere também um método para evitar a fermentação do j ácido butírico, método esse, que se caracteriza pela utilização de Lactobacillus f rhamnosus LC-705, DMS 7061, com o intuito de inibir a actividade de clostridios. A j .... i invenção apresenta ainda um método para a preparação de queijo que se caracteriza pela utilização da Lactobacillus rhamnosus LC-705, DMS 7061 no referido processo. í

Apresentação Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se, por conseguinte, à utilização na indústria alimentar de Lactobcicillus rhamnosus LC-705, DMS 7061, com o propósito de inibir o desenvolvimento e actividade de clostridios e evitar a fermentação do ácido butírico. O conceito de indústria alimentar é, neste contexto, muito abrangente pois incluí não só a indústria alimentar convencional, como sejam a indústria de lacticínios, de conservas, o processamento de carne e a indústria de doces, e também, por exemplo, a indústria de rações, i.e., todos os ramos de indústria que dão origem a produtos ingeridos por humanos e animais. Além dos produtos ditos industriais estão também incluídos, neste contexto, as matérias-primas utilizadas nas referidas indústrias e os alimentos consumidos frescos, como sejam os vegetais, leite, etc.

Em seguida, serão descritos os fundamentos subjacentes à invenção e sua implementação prática. Para o efeito é utilizado o organismo Lactobacillus rhamnosus LC-705, disponível na colecção de microorganismos de Valio Oy, com número de produto LC-705. A estirpe foi depositada a 13 de Maio de 1992 na Deutsche Sammlung von Mikroorganism und Zellkulturen GmbH (DMS) com o número DMS 7061 e apresenta as seguintes características: com forma de filamento de cadeia curta, positivo ao Teste de Gram homo-fermentativo apresenta um bom desenvolvimento entre 15-45 °C sem actividade proteolítica não produz amónia a partir da arginina catálise negativa quando se desenvolve num caldo MRS (LAB M), a estirpe produz ácido láctico 1,6% com actividade óptica da configuração L (+); a estirpe decompõe o citrato (0,169%), produzindo diacetil e acetoína; a estirpe provoca a fermentação de, pelo menos, os seguintes hidratos de carbono (açucares e álcoois açucarados): ribose, galactose, D-glucose, D-frutose. D-manose, L-sorbose, ramnose, manitol, sorbitol, metil-D-glucosido, N-acetil-glucosamina, amigdalina, arbutina, esculina, salicina, celobiose, maltose, lactose, sucrose, trealose, melezitose, gentiobiose, D-turanose e D-tagatose. subsiste bastante bem a uma salinidade de 5% e razoavelmente bem a uma salinidade de 10 %.

De acordo com a invenção, a Lactobacillus rhamnosus LC-705 é utilizada, na indústria alimentar, para inibir o desenvolvimento de clostridios. Consoante a situação, a referida estirpe é introduzida em alimentos frescos, em víveres utilizados como matéria-prima ou em conjunto com o processo de produção alimentar. A estirpe Lactobacillus rhamnosus LC-705, DMS 7061, pode ser preparada para utilização na forma de cultura pura, diluída a partir de cultura concentrada ou pode ser utilizada na forma de um liofilizado reconstituído à priori ou sobre a sua utilização. A cultura pura pode ser preparada segundo um método convencional, por exemplo, fazendo a cultura da estirpe num meio à base de soro de leite, durante 2 a 3 dias, a uma temperatura entre 30-37°C com ou sem ajuste de pH. A preparação de Lactobacillus rhamnosus LC-705 é descrita em detalhe, por exemplo, na já referida patente EP-A-0.576.780. Um caldo de fermentação contendo as células é recuperado e pode ser utilizado nessa forma, concentrado ou liofilizado. A liofilização é realizada segundo os métodos convencionais. A concentração pode ser feita com um dispositivo de microfiltração ou por qualquer outro método semelhante.

Podem ser acrescentadas à preparação acima descrita, contendo células de Lactobacillus rhamnosus LC-705, outras bactérias ou aditivos com o intuito de inibir a clostridia. Caso haja a inclusão de bactérias, a cultura da outra estirpe bacteriana pode ser realizada em simultâneo com a estirpe Lactobacillus rhamnosus ou separadamente. A cultura simultânea das duas estirpes constituí uma vantagem pela simplicidade e facilidade que proporciona. Por outro lado, a cultura em separado das estirpes permite variar a proporção em que estas são incluídas nas preparações bacteriais. Como é lógico, t} ^ 9 é também possível utilizar preparações liofilizadas de várias bactérias, as quais podem ser reconstituídas em conjunto ou separadamente. A utilização de outras substâncias, como sejam outras substancias utilizadas em processos alimentares e outros agentes anti-clostridiais, é possível mesmo que a preparação de lactobacillus rhamnosus não contenha tais substancias. As referidas substancias podem ser utilizadas em ligação -com a Lactobacillus rhamnosus em conformidade com a invenção. Na indústria dos lacticínios, por exemplo, a estirpe de Lactobacillus rhamnosus, utilizada de acordo com a invenção, pode ser empregue num dado processo como um organismo iniciador em substituição dos organismos iniciadores usuais ou como suplemento destes. A estirpe de Lactobacillus rhamnosus LC-705 é utilizada em quantidade suficiente para se atingir o efeito desejado, i.e., inibir o clostridio. A quantidade usada depende naturalmente da aplicação. Para cada aplicação pode ser facilmente determinada a quantidade apropriada. A estirpe de Lactobacillus rhamnosus LC-705 pode ser aplicada para evitar os problemas provocados por clostridios em inúmeras áreas. Por exemplo, para impedir a deterioração por clostridios em produtos resultantes das indústrias alimentar e de forragens e, para inibir o crescimento de clostridios e evitar a falsa fermentação provocada por clostridios durante os processos de preparação de alimentos e forragens. A invenção será descrita em pormenor através dos exemplos apresentados em seguida. Os exemplos visam, única e exclusivamente, ilustrar a invenção e não constituem de forma alguma uma limitação ao âmbito da mesma.

Exemplo 1

Inibição de clostridios com a estirpe Lactobacillus rhamnosus LC-705 A série de testes foi realizada com leite preparado a partir de leite em pó 10% (em 50 ml). As amostras de leite foram inoculadas com uma suspensão de esporos da estirpe Ciostridium tyrobutyricum K8 isolada do queijo e da estirpe Lactobacillus rhamnosus LC-705. Clostridios foram adicionados ao leite em quantidade suficiente para se obter um teor inicial de clostridios de cerca de 1000 CFU/ml. Os lactobacilos incluídos são provenientes do desenvolvimento da cultura, durante 48 horas, num caldo com 1% soro de leite. As amostras contendo a inoculação de Ciostridium e lactobacilo foram processadas através de um programa que simula o processo de produção de queijo, após o qual foram transferidas para 20 °C. Os teores em clostridios foram determinados ou pelo método de placas em Agar Clostridial Reforçado (R.C.M. Lab 23) ou pela técnica do Número Mais Provável (MNP) em caldo de Tirobutiricum (Merck 11734). Foi utilizada uma amostra contendo apenas Clostridum Tyrobutyricum K8 como controlo. Os resultados são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1

Efeito anti-clostridial da estirpe Lactobacillus rhamnosus LC-705

Teor em Ciostridium tyrobutyricum K8, CFU/ml

Oh 2 dias 14 dias 23 dias 39 dias 60 dias 1. LC-705 1% 9,8x10-* 4,9x103 <TÕ <TÕ <TÕ <TÕ 2. Controle , 8,6χ!03 Ι,ΙχΙΟ3 l,8xl04 2,4xl03 2,3xl04 8,lxl04

Os resultados demonstram que a Lactobacillus rhamnosus L-705 apresenta um excelente efeito anti-clostridial.

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Exemplo 2

Inibição de clostridios com diferentes estirpes de lactobacilo

Os testes descritos no Exemplo 1 foram repetidos utilizando as seguintes cadeias de lactobacilos: 1. Laçtobacillus rhamnosus LC 705 (DMS 7061) 2. Lactobacillus rhamnosus LC-10 (Valio 706) 3. Lactobacillusplantarum NRJRL-B-193 4. Lactobacillus plantarum Lb 329-6 (Valio) 5. Controle Clostridium tyrobutyricum K8

Nestes testes, as amostras foram igualmente inoculadas com uma suspensão de esporos de Clostridium tyrobutyricum K8 isolada do queijo. Clostridios foram adicionados ao leite em quantidade suficiente para se obter um teor inicial em clostridios de cerca de 1000 CFU/ml. Como controle foi utilizada uma amostra de leite com esporos de clostridio, mas sem qualquer estirpe de lactobacilo. Os lactobacilos incorporados são provenientes do desenvolvimento da cultura, durante 48 horas, num caldo com 1% de soro de leite. As amostras contendo a inoculo de clostridio e lactobacilo foram processadas através de um programa que simula o processo de produção de queijo, após o qual foram transferidas para +20°C. Os teores em clostridios foram determinados ou pelo método de placas em Agar Clostridial Reforçado (R.C.M. Lab 23) ou pela técnica do Número Mais Provável (MNP) em caldo de Tirobutiricum (Merck 11734). Os resultados são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2

Efeito anti-clostridial de diferentes estirpes de Lactobacilo

Teor em Clostridium tyrobutyricmn K.8, CFU/ml

Oh 13 dias 26 dias 40 dias 52 dias 60 dias LC-705 1000 <10 <10 <10 <10 <10 LC-10 1000 1600 4000 5600 3,ixl04 1300 NRRL-B 1000 3,2xl04 nt 1,4x104 2,3x104 1,4x104 Lb 329-6 1800 1,2x106 nt 7,9x1 Φ 9,5x106 Ι,ΟχΙΟ7 K.-K8 800 1,4x107 5,6χ 107 6,8x 107 1,7x107 1,0x106

Os resultados demonstram que, de todas as estirpes estudadas, a Lactobacillus rhamnosus L-705 é a melhor, apresentando um excelente efeito inibitório no desenvolvimento de clostridios.

Exemplo 3

Utilização da estirpe Lactobacillus rhamnosus LC-705 como iniciador na preparação de queijo suíço.

Na preparação de queijo suíço, para além dos iniciadores usuais, foi adicionado às amostras cultura de Lactobacillus rhamnosus LC-705 a 0,3%. A quantidade introduzida pode variar consoante a qualidade do queijo e o teor em esporos de clostridios. Uma quantidade apropriada pode ser, por exemplo, 1-40 1/11000 1 de leite de queijo ou 0,01-0,4%/caldeira de queijo. A dois queijos em teste foram adicionados dez esporos de clostridio por cada litro de leite. Os esporos introduzidos eram de Clostridium tyrobutyricum, sabendo-se que a quantidade introduzida conduz à fermentação do ácido butírico. O processo utilizado para desenvolver o iniciador LC-705, na produção de queijo, foi o mesmo que o empregue com os iniciadores usuais; foi inoculado no leite 1% de cultura, a qual se desenvolveu a 37°C durante 24 h. O teor em lactobacilo era, 13

após o desenvolvimento da cultura, de cerca de 3-5 x I0s/ml e a acidez cerca de 20-25 °SH.

Os teores em clostridio, ácido láctico, ácido acético, ácido cítrico e ácido butírico e o pH nos queijos foram determinados com um dia de intervalo durante a primeira semana e, em seguida, com uma semana de intervalo. Os queijos preparados que estiveram a curar durante três meses foram igualmente avaliados, de forma convencional, através do controle de qualidade usual o qual incluiu além de análises químicas, avaliação organoléptica. Nas Tabelas 3 e 4 são apresentados os resultados obtidos após cinco dias e após 6 semanas.

Tabela 3

Efeito da Lcictobacillus rhamnosus na qualidade do queijo

Ensaio N° Adições LC-705 clostridio clostridio Queijo Suíço, 5 dias ácido ácido acético láctico % mg/lOOg ácido cítrico % PH 1. - - <3 1,19 36 0,11 5,52 2. + - <3 1,27 116 <0,02 5,46 3. - + 9 1,21 39 0,10 5,49 4. O. <3 1,27 122 <0,02 5,42

Tabela 4

Efeito da Lactobacillus rhamnosus na qualidade do queijo

Ensaio N° Adições LC-705 clostridio clostridio /g Queijo Suíço, 6 semanas ácido ácido acético ácido butírico láctico % mg/lOOg mg/lOOg pH l. - - <100 2. + - <100 -> J. - + 2800 0,70 130 15 5,95 4. U- <100 1,13 150 o J 5,62 14

I /Ρ //

Os resultados obtidos permitem concluir que nos queijos onde houve adição de clostridios e aos quais não foi adicionado o iniciador LC-705 é possível a detecção de clostridios ao fim de 5 dias. Após seis semanas, o teor em clostridio é visivelmente superior nos queijos preparados com clostridio do que nos queijos aos quais para além de clostridios foi também adicionado o iniciador LC-705. A quantidade de ácido butírico no queijo com adição de clostridios encontra-se acima do limite gustativo.

Os resultados obtidos para queijos curados são apresentados na Tabela 5.

Tabela 5

Efeito da Lactobacillus rhamnosus na qualidade do queijo

Ensaio N° AUiçòes LC-705 clostr. clostr. /g enterococci 'g ácido láctico % Queijo Suíço, 3 meses ácido ácido acético mg propiónico / 100 g mg / 100 g ácido butírico mg /100° avaliação organo- léptica 1. - - <10 5x10' 0.30 280 400 6 normal 2. + - <10 8x10' 0.55 290 300 4 normal 3. + 17000 4x10'· 0.22 290 400 60 fermentaçío do ácido butírico 4. +· A. <10 Sxl0: 0.61 300 310 5 normal

I

0 leite utilizado nos testes era de excelente qualidade e não continha clostridios ! em quantidade suficiente para induzir a fermentação natural do ácido butírico nos j queijos. Os queijos aos quais foi adicionado clostridios apenas apresentaram ψ fermentação do ácido butírico. Por outro lado, os queijos aos quais, para além de clostridios, foi também introduzido o LC-705 como iniciador, não revelaram qualquer indício de fermentação do ácido butírico. Assim sendo, o iniciador LC-705 inibe [...

claramente o desenvolvimento clostridial e evita a fermentação do ácido butírico. O

P iniciador LC-705 inibe, ainda, o desenvolvimento de enterococci no queijo. Os enterococci fazem parte da flora bacteriana que normalmente que passa do leite e das {;· · t· queijarias para o queijo. Eles são indicativos do grau de higiene e, por isso, o seu teor b' deve ser o mais baixo possível. Pelo que há que ter em conta este efeito positivo. f j ΰ

Além disso, os resultados das análises químicas e avaliação organoléptica confirmam os resultados microbiológicos já referidos.

Exemplo 4

Utilização da estirpe Lacíobacillus rhamnosus LC-705 em substituição de nitrato na produção de queijo

Neste teste, um iniciador LC-705 foi usado em substituição de nitrato na produção de queijo Edam. Por forma a garantir a fermentação do ácido butírico foi adicionado clostridios ao leite utilizado para a produção de queijo (20 esporos /1 1 leite). O iniciador LC-705 foi desenvolvido como descrito no exemplo 3 e introduzido na coalhada de leite juntamente com os iniciadores usualmente utilizados numa quantidade de 0,3-0,35%. A quantidade introduzida pode variar de acordo com as necessidades existentes. Os resultados obtidos para o leite coalhado e queijo com cinco dias são apresentados nas Tabelas 6 e 7. Na Tabela 8 são apresentados os resultados para o queijo Edam curado com seis semanas.

Tabela 6

Efeito da Lactobacillus rhamnosus na qualidade do queijo

Ensaio N°

Adições nitrato LC-705 clostridia

Leite coalhado

clostridia /g pH 1. 2. + <0,3 4,67 2,3 4,65 <0,3 4,64 3. +

Tabela 7

Efeito da Lactobacillus rhamnosus na qualidade do queijo

Ensaio N° Adições nitrato LC-705 clostridio clostridio /g Queijo Edam. 5 dias ácido láctico ácido butirico % mg / 100 g PH 1. + - - <3 1,18 0,5 5.40 2. - <3 1.19 0,5 5,39 ·> J. - + - <3 1.21 0,5 5.39 4. - + + <3 1,19 0,5 5.40

Tabela 8 Efeito da Lactobacillus rhamnosus na qualidade do queijo Adições Ensaio nitrato LC-705 clostridio clostridio Queijo Edam. curado ácido ácido butirico PH N° /% láctico % mg/ 100 g 1. -r <3 1,19 4 5.52 2. + - + <3 1.18 3 5.54 3. - + - <3 1.25 2 5,45 4. . + -i- <3 1,24 3 5,47

Ou seja, a eficácia do iniciador LC-705 na prevenção da fermentação do ácido butirico foi igual ou até superior à do nitrato, em todos os queijos testados.

Lisboa, j o MAR. 2000

Américo da Siívs Carvalho Açsr.te Olici .í tf: Fn.xtótóIrstíustrtal R. Cas:i:'f;o. 231 - 3:; f: - 1070 LISBOA fclfils. jfôp ,1.3 39 - 365 46 13

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização da Lactobcicillus rhamnosus LC-705, DMS 7061 na indústria alimentar para inibir clostridios.
2. Utilização tal como reivindicado em 1., que se distingue pela utilização da Lactobacillus rhamnosus LC-705, DMS 7061 na produção de queijo.
3. Utilização tal como reivindicado em 1. ou 2., que se distingue pela utilização da Lactobacillus rhamnosus LC-705, DMS 7061 na prevenção da fermentação do ácido butírico.
4. Utilização tal como reivindicado em qualquer das reivindicações 1-3, que se distingue pela utilização da Lactobacillus rhamnosus LC-705, DMS 7061 como iniciador.
5. Utilização tal como reivindicado em qualquer das reivindicações anteriores, que se distingue pela introdução nos alimentos de Lactobacillus rhamnosus LC-705, DMS 7061.
6. Um método para evitar a fermentação do ácido butírico, que se distingue pela utilização de Lactobacillus rhamnosus LC-705, DMS 7061 com o intuito de inibir a actividade de clostridios.
7. Um método para preparar queijo, que se distingue pela utilização de Lactobacillus rhamnosus LC-705, DMS 7061 na preparação de queijo. Lisboa, ΐ 0 MAR. 2000

Américo da Silva Carvalho

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