ES2236731T3 - Uso de un precursor de protoporfirina ix en el tratamiento de dermatofitosis y malaria despues de la fotoactivacion de dicha protoporfinina. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN METODOS PARA DETECTAR Y TRATAR CELULAS ENDOGENAS DE CRECIMIENTO RAPIDO, TALES COMO PROTISTA, O PARASITOS, QUE ACUMULAN PREFERENTEMENTE UNA PORFIRINA FOTOACTIVABLE EN LOS QUE SE ADMINISTRA AL PACIENTE O SE PONE EN CONTACTO CON LAS CELULAS EXOGENAS ACIDO 5 ISMO EN UNA CANTIDAD SUFICIENTE PARA INDUCIR LA SINTESIS DE CONCENTRACIONES DE FLUORESCENCIA Y/O FOTOSENSIBILIZACION DE UNA PROTOPORFIRINA IX EN LAS CELULAS ENDOGENAS, SEGUIDO DE EXPOSICION DE LAS CELULAS ENDOGENAS A LUZ DE LONGITUDES DE ONDA FOTOACTIVABLES.

Description

Uso de un precursor de protoporfirina IX en el tratamiento de dermatofitosis y malaria después de la fotoactivación de dicha protoporfinina.

Antecedentes de la invención

Las anormalidades tisulares que implican a la piel se detectan y valoran mediante una combinación de inspección visual y palpación. En ciertas situaciones clínicas la sensibilidad de la inspección visual se puede potenciar mediante el uso de luz no blanca (bien ultravioleta o bien una banda estrecha en el espectro visible), o mediante la aplicación previa de un agente potenciador del contraste tal como ácido acético diluido o ciertas tinciones. Las anormalidades tisulares que implican a superficies que no se pueden palpar (tales como los bronquios o la vejiga de la orina) se pueden visualizar por medio de un objetivo apropiado. Algunos objetivos especializados pueden detectar fluorescencia inducida. Si la anormalidad en cuestión está asociada con una diferencia bien en la extensión o bien en el patrón de vascularización de tejidos, un objetivo tal se puede usar para determinar los límites del área implicada por la anormalidad, visualizando una inyección intravenosa rápida inyectada de fluoresceína u otro material fluorescente según atraviesa la vasculatura tanto de la lesión como del tejido normal adyacente.

Además, los objetivos que detectan fluorescencia se están usando experimentalmente para identificar áreas de tejido que muestran fuerte fluorescencia de porfirina tras la inyección intravenosa de porfirinas exógenas tales como tales como hematoporfirina IX (HpIX), derivado de hematoporfirina (HpD), o "éter de dihematoporfirina". Tales porfirinas tienden a acumularse semipreferencialmente en tejidos malignos, pero se acumulan también en tejidos que se regeneran tras una herida o en los tejidos que crecen rápidamente de un embrión o feto. El hígado normal, bazo, y riñón también tiende a acumular estas porfirinas. Usando tales compuestos y objetivos de detección de fluorescencia, se han identificado áreas de tejido maligno demasiado pequeñas para identificarse por formas estándar de inspección visual se han identificado en los bronquios y en la vejiga urinaria.

Desafortunadamente, una cantidad clínicamente significativa (fotosensibilizante) de porfirina puede persistir en la piel durante al menos dos semanas (ocasionalmente durante más de dos meses) tras la inyección intravenosa de HpIX, HpD, o una preparación semipurificada de HpD, tal como Photofrin II . (Photofrin es una marca comercial registrada de Quadra Logics, Inc. Vancouver, Columbia Británica, Canadá). Esto significa que los pacientes deben evitar la exposición a la luz del sol (bien directamente, o bien a través del vidrio de las ventanas) durante un periodo de tiempo post-inyección inconvenientemente largo. Comprensiblemente, la conformidad del paciente es a menudo pobre, y la "quemadura solar" accidental fototóxica es un suceso común en las semanas tras una inyección diagnóstica o terapéutica de porfirina. La fotosensibilidad persistente es el riesgo principal asociado con esta técnica, y es la principal razón por la que no se usa más ampliamente.

Los tratamientos estándar para el cáncer comprenden cirugía, radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, se conocen también otras formas de tratamiento, incluyendo fototerapia o terapia fotodinámica (PDT), basadas en el descubrimiento realizado hace unos 90 años de que los organismos unicelulares, por ejemplo, ciertas células de crecimiento rápido (tales como las células del Reino Inferior, ahora citado como Protistas), tratadas con ciertos productos químicos morirán cuando se expongan a la luz. Así, se ha mostrado que las porfirinas sintéticas protegen in vitro a las células de infecciones tales como parásitos, por ejemplo, trypomastigotes o esferomastigotes de Trypanosoma cruzi, J. Parasitol., 75(6) 1989, páginas 970-976, y bacterias gram-positivas, micoplasma y levaduras, Malik y col. J. Photochemistry and Photobiology, B. Biology 5 281-293 (1990).

PDT se está usando actualmente, sobre una base experimental, para tratar diferentes tipos de cáncer igual que ciertas lesiones no malignas tales como psoriasis. Al paciente se le da un fármaco fotoactivable que tiene cierto grado de especificidad para el tejido que se está tratando. Un volumen de tejido que incluye el tejido diana se expone después a luz fotoactivadora tal como para destruir el tejido diana mientras que causa sólo daño suave y reversible a los otros tejidos en el mismo volumen de tratamiento.

Hay dos tipos principales de agentes fotoquimioterapéuticos en uso clínico en la actualidad. El primer tipo, metoxipsoralenos, se administra sistémicamente. La luz ultravioleta es esencial para activarlos. La exposición localizada de tejidos que contienen psoraleno a luz ultravioleta induce una reacción fotoquímica localizada que causa que el fármaco se una covalentemente al DNA de las células vivas, destruyendo así su potencial proliferativo. El segundo tipo, porfirinas y fotosensibilizantes relacionados, se administra también sistemáticamente (mediante inyección intravenosa), aunque ocasionalmente se administra bien tópicamente o bien mediante inyección intralesional. Se pueden activar mediante luz visible (roja). La exposición localizada de tejidos que contienen porfirinas a tal luz de ordinario no induce una reacción química entre los componentes celulares y las moléculas de porfirina. En lugar de eso, las porfirinas actúan como catalizadores atrapando la energía de la luz fotoactivadora y después pasándola a las moléculas de oxígeno, las cuales en cambio se llevan a un estado excitado que es capaz de oxidar moléculas o estructuras adyacentes. La muerte celular no se causa principalmente por dañar al DNA, sino por dañar estructuras esenciales de membrana. La meta de la fototerapia es en algunos casos la cura (principalmente para carcinomas de células basales), pero usualmente la meta es la paliación a través de control local cuando ninguna de las formas estándar de terapia se considera probable para ofrecer un grado significativo de beneficio al paciente.

La terapia con metoxipsoraleno (PUVA) se usa principalmente para el tratamiento de psoriasis, pero algunas veces se usa también para tratar cánceres muy superficiales que implican la piel (principalmente micosis fungoides). Sin embargo, hay dos problemas serios con tales tratamientos. Primero, el procedimiento ha demostrado ser carcinogénico en humanos. Segundo, la profundidad a la cual se puede matar dicho tejido maligno se limita a unos pocos milímetros bajo la superficie iluminada. Estos problemas limitan severamente la utilidad de los metoxipsoralenos para la fotoquimioterapia.

El ácido 5-amino-4-oxopentanoico, conocido también como ácido 5-aminolevulínico y como ácido \delta-aminolevulínico (``ALA) se ha descrito en las patentes y solicitudes de patentes de referencia cruzada expuestas primero en esta memoria descriptiva para detectar y tratar rápidamente células en crecimiento. Se ha citado también ALA para usar en atenuar el crecimiento y matar plantas e insectos cuando se aplica directamente a tales organismos seguido por exposición a la luz, en base al trabajo de Rebeiz y col.

Las porfirinas sintéticas se han usado también como agentes fotoquimioterapéuticos para tratar el crecimiento rápido, por ejemplo la división rápida o el metabolismo rápido de las células infecciosas, tales como patógenos infecciosos, incluyendo protozoos parásitos tales como Plasmodium falciparum (los cuales causan malaria en humanos), varias especies de Plasmodios, Leishmania y amebas, hongos patógenos, y micoplasma incluyendo las diversas formas parasíticas, todas las células y organismos que se refieren en el presente documento como Protistas. El término Protistas como se usa aquí y en la literatura se refiere a los órdenes inferiores de los reinos animales y vegetales, organismos de células individuales o colecciones de células individuales que incluyen: los eucariotas, incluyendo protozoos, hongos y algas, y los procariotas, los cuales son bacterias y algas verdeazules.

En la actualidad, las porfirinas más comúnmente usadas para la quimioterapia son hematoporfirina IX (HpIX), derivado de hematoporfirina (HpD) y diversas preparaciones semipurificadas de HpD tales como la Photofrin® comercialmente disponible, una forma semipurificada de HpD. Cuando las porfirinas se usan como fotosensibilizantes, la muerte celular resulta del daño a las membranas celulares. Consecuentemente, la transformación maligna no es un problema serio. Además, dado que la luz visible (roja) que se usa en las porfirinas fotoactivas penetra el tejido mucho más profundamente de que lo hace la luz ultravioleta que se debe usar para fotoactivar metoxipsoralenos, la profundidad a la cual el tejido tratado con porfirina puede eliminarse es sustancialmente mayor. Además, dado que ciertos tipos de porfirinas muestran una tendencia significativa para acumularse preferencialmente en tejidos malignizados, es algunas veces posible destruir el tejido maligno sin causar daño clínicamente significativo a los tejidos normales adyacentes.

El principal problema con el uso sistémico de HpIX, HpD y Photofrin II es que las concentraciones fotosensibilizantes persisten en la piel durante de varias semanas a varios meses tras su administración. Consecuentemente, pueden ocurrir reacciones en la piel fototóxicas accidentales severas a menos que el paciente evite la exposición a la luz solar (bien directa, o bien filtrada a través del vidrio de las ventanas) hasta que la concentración del fotosensibilizante en la piel se ha reducido a un nivel inofensivo. En la actualidad, el problema de la fotosensibilidad después de la administración de porfirinas se maneja aconsejando al paciente evitar muy prudentemente cualquier forma de exposición a la luz del sol. No todos los pacientes cumplen con estas instrucciones, dado que a menudo es bastante inconveniente hacerlas. Además, el uso de un bronceador con filtro solar con un factor altamente bloqueante se recomienda con la advertencia de que éste sólo reduce algo el riesgo, no lo elimina completamente. En unos pocos casos, a los pacientes cuya fotosensibilización persiste por más de un mes tras el tratamiento se les han administrado grandes dosis diarias de beta-caroteno durante un periodo de varios meses en un intento de prevenir daño fototóxico accidental. Finalmente, se han hecho intentos para reducir fototoxicidad aplicando el fotosensibilizante tópicamente a un área limitada.

Sin embargo, se encuentra otro tipo de problema si se aplica tópicamente HpIX o HpD en DMSO (dimetilsulfóxido), Azone, o algún otro vehículo deseado para mejorar su difusión a través del tejido. Las porfirinas tienden a llegar a inmovilizarse dondequiera que estén cuando el DMSO o Azone lleguen a diluirse mediante fluidos normales de tejido a una extensión tal que las porfirinas no se pueden difundir más a través del tejido (o incluso permanecer en disolución). Consecuentemente, la aplicación tópica de porfirinas se asocia a menudo con una perdida de especificidad para los tejidos malignos, y los tejidos normales cerca del sitio de aplicación pueden desarrollar fotosensibilización persistente a partir de la concentración localizada de porfirina.

Los términos profirina(s) y sus precursores se refieren a compuestos producidos in vivo en la síntesis de hemo y otros compuestos fotoactivables producidos endógenamente incluyendo sus fotoproductos.

Los siguientes documentos proporcionan antecedentes útiles a la invención:

El documento WO 95/07077 describe una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos o anormalidades de superficies externas o internas del cuerpo el cual es responsable de la fotoquimioterapia, que comprende ALA o un precursor de la misma, conjuntamente con al menos un agente que ayuda a la penetración de la superficie, y opcionalmente uno o más agentes quelantes como resultado de lo cual se incrementa la eficacia terapéutica del ALA.

El documento WO 93/20810 describe los medicamentos, para detectar y tratar anormalidades de tejido malignas y no malignas y lesiones de la piel; conjuntiva; respiratorio, digestivo y mucosa vaginal; endometrio y urotelio; y para cortar el tejido endometrial y tratar fluidos corporales que contienen células anormales suspendidas, y para tratar cánceres del sistema nervioso, los cuales se preparan a partir de ALA o precursor del mismo y se administran subsiguientemente al paciente en una cantidad suficiente para inducir síntesis de fluorescencia y/o concentraciones fotosensibilizantes o protoporfirina IX en las células anormales, seguido por exposición de las células anormales a la luz de longitudes de onda fotoactivadoras.

El documento WO 94/06424 describe un procedimiento de destruir o dañar células diana que han acumulado selectivamente un agente fotosensibilizante. Las células diana están en la corriente sanguínea de un animal intacto, los cuales, corriente sanguínea y animal, contienen adicionalmente células no-diana. La radiación se aplica transcutáneamente a al menos una porción del animal intacto a una intensidad efectiva para dañar o destruir selectivamente las células diana y para dejar las células no diana relativamente no dañadas. Las células diana incluyen células de leucemia, células que contienen virus, células que contienen parásitos, y microorganismos tales como bacterias, parásitos y virus libres.

El documento WO 95/31189 describe una toallita, que comprende una tela absorbente tejida o no tejida, paño o sustrato de tejido, impregnado con un agente farmacéuticamente activo, en el que el agente es una sustancia efectiva en estimular melanocitos para producir melanina y/o es efectiva en un tratamiento tópico de una afección de la piel en combinación con radiación electromagnética que cae en el intervalo de 220-700 nm.

Sumario de la invención

La invención se basa en el hallazgo de que ALA administrado exógenamente y otros precursores de PpIX se metabolizan en pacientes a PpIX y que PpIX se acumula preferencialmente en células que crecen rápidamente, en contraste con células que crecen menos rápidamente. El crecimiento rápido se correlaciona con la actividad metabólica, de tal forma que la acumulación diferencial se afecta por la actividad metabólica relativa entre diferentes células.

Se proporciona adicionalmente por lo tanto el uso de un precursor de protoporfirina IX para la preparación de un medicamento para el tratamiento de dermatofitosis o malaria en un paciente, en el que durante el tratamiento de dermatofitosis tras la administración del medicamento el paciente se expone a luz capaz de fotoactivar protoporfirina IX y en el que para el tratamiento de malaria tras la administración del medicamento los parásitos de malaria se exponen a luz capaz de fotoactivar protoporfirina IX.

En los aspectos preferidos de esta invención el precursor preferido de protoporfirina IX es el ácido 5-amino-4-oxo-pentanoico, conocido de otra manera como ácido 5-aminolevulínico, y una longitud de onda preferida de la luz fotoactivadora está en el intervalo de 625 a 670 nm, más preferiblemente una luz roja de 625 a 640 nm.

La dermatofitosis de acuerdo con la invención incluye tiña podal y Onychomicosis, mientras que los parásitos de la malaria incluyen Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae y Plasmodium vivax.

Descripción detallada de la figura

La figura 1 ilustra la duración de la supervivencia de ratones individuales tras la inyección de células del bazo infectadas con P. yoelii. En el grupo (1) se administró a los ratones células de bazo que se habían expuesto a ALA in vivo pero después se mantuvieron en la oscuridad. La supervivencia promedio de los receptores de estas células fue de 15 días. En el grupo (2) se administró a los ratones el mismo número de células a partir de la misma suspensión de células después de que se hayan expuesto a luz fotoactivadora. Todos estos ratones permanecieron con buena salud durante 90 días, tiempo al cual el experimento se terminó.

Descripción detallada de la realización preferida

La protoporfirina IX (PpIX), un fotosensibilizante que se da en la naturaleza, es el precursor inmediato de hemo en la ruta biosintética de hemo. Todas las células nucleadas tienen al menos una capacidad mínima para sintetizar PpIX, dado que hemo es necesario para la síntesis de diversas enzimas esenciales que contienen hemo. Ciertos tipos de células y tejidos pueden sintetizar cantidades relativamente grandes de PpIX. Bajo condiciones normales, la síntesis de PpIX en tales tejidos está bajo estrecho control de retroalimentación que las células lo producen en un grado justamente suficiente para encajar con sus necesidades de hemo. Sin embargo, la etapa usual que limita el intervalo en el procedimiento, la síntesis de ácido 5-aminolevulínico, se puede evitar mediante la provisión de ALA exógeno, porfobilinógeno, u otro precursor de PpIX. Ciertos tejidos y órganos acumularán después un gran exceso de PpIX tal que llegarán a ser tanto fluorescentes como fotosensibles. Al menos en el caso de la piel, el PpIX parece sintetizarse in situ. ALA, el cual está comercialmente disponible a partir de la Sigma Chemical Company y otras fuentes y el cual es soluble en agua, se puede administrar oralmente, tópicamente o mediante inyección. Las vías oral y parenteral conducen a la inducción de concentraciones clínicamente útiles de PpIX en ciertos tejidos benignos y malignos por todo el cuerpo. Sólo ciertos tipos de tejido sintetizan y acumulan cantidades clínicamente útiles de PpIX cuando se proporcionan con un exceso de ALA. Mediante la expresión "célula que crece rápidamente" se quiere decir en el presente documento cualquier lesión, célula anormal o célula normal que muestra un crecimiento celular sustancialmente mayor que aquella de los tejidos circundantes y que acumula preferiblemente protoporfirina IX a partir de ALA exógeno. Así, las células incluyen células que crecen rápidamente que son endógenas al paciente y células exógenas que crecen rápidamente tales como células de Protistas y células de parásitos. El término "células que crecen rápidamente" se usa también aquí para incluir células vivas, metabólicamente activas en contraste con células metabólicamente inactivas (muertas o inactivas) tales como las que se encuentran en las aplicaciones contra la malaria de esta invención.

Los medicamentos preparados mediante el procedimiento de la presente invención pueden ser útiles para la administración de ALA, al paciente. La administración puede aplicarse también in vitro a los tejidos de los pacientes, es decir, ex vivo. En los procedimientos ex vivo, el tejido que contiene las células que crecen rápidamente se elimina del paciente, una cantidad efectiva de ALA o porfirina endógena se añade al mismo, después la preparación se somete a luz fotoactivadora, antes de readministrarse al paciente. Las cantidades de ALA que constituyen una dosis efectiva se pueden determinar mediante alguien experto en la técnica por analogía con las dosis usadas por porfirinas sintéticas, basadas en miligramos por kilogramo de peso corporal para aplicación sistémica in vivo y las concentraciones típicas para aplicaciones tópicas o ex vivo. El compuesto se puede usar convenientemente oralmente o intravenosamente a una dosificación de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg/kg por dosis única, preferentemente como una dosificación de 40-50 mg/kg; sin embargo las dosificaciones divididas de 10 mg/kg cuatro veces al día también pueden darse. El compuesto se puede usar tópicamente a una dosis de entre un 2% y un 100%, con 100% siendo polvo seco. Las concentraciones ex vivo del compuesto se usan en suspensiones celulares en un intervalo de 1-5 mM, con un intervalo preferido de 1-2 mM; sin embargo, si el suero está presente, se debería usar una dosis mayor de aproximadamente 15 mM. Si se usa ex vivo en la sangre completa, el compuesto se usa a aproximadamente 15 mM; sin embargo, si se usa un quelante de hierro, tal como Desferol™ o desferroxamina, se puede usar una concentración menor.

Otra aplicación de esta invención es la matanza de parásitos fotosensibilizados preferencialmente mediante exposición de ALA o una porfirina endógena bien in vivo o bien ex vivo. La conjuntiva, la cual se puede tratar bien tópicamente o bien sistemáticamente con ALA, seguido, después de un periodo de tiempo apropiado, por exposición de la piel o conjuntiva a luz fotoactivadora. Los parásitos pueden estar también presentes en la sangre periférica, caso en el cual el ALA se puede administrar sistémicamente, seguido, después de un tiempo apropiado, el cual se puede determinar fácilmente experimentalmente, por exponer el área definida de la piel o la sangre que pasa a través de una vena grande a luz fotoactivadora por medio de una guía óptica con un catéter transparente que se ha insertado en la vena. Los parásitos localizados en un centímetro de la superficie de los órganos huecos que son accesibles al examen fibroscópico (tracto respiratorio, tracto digestivo, tracto urogenital, cavidad abdominal, cavidad pélvica, cavidad torácica) se pueden diagnosticar o tratar mediante administración sistémica del ALA, seguida por, después del periodo de tiempo apropiado, la exposición de la superficie del tejido diana por medio de una guía de luz apropiada. Los parásitos localizados en sitios que no son fácilmente accesibles al examen fibroscópico se pueden tratar con la luz fotoactivadora mediante una guía de luz que se ha introducido quirúrgicamente en el área diana a través de una aguja o tras la cirugía.

Otra aplicación aún de esta invención es la fotosensibilización selectiva y la matanza de los parásitos de la malaria in vivo o in vitro exponiéndoles a la luz fotoactivadora. La luz debería transmitirse a los parásitos de la malaria en la sangre circulante bien a través de la piel, por medio de un catéter permanente intravenoso o intraarterial o mediante administración de terapia fotodinámica extracorpórea de sangre, especialmente para pacientes que hayan fallado en responder a otras terapias, particularmente aquellos quienes se pueden considerar candidatos para una transfusión de intercambio terapéutico.

La longitud de onda de la luz fotoactivadora es de alguna importancia, ya que se ha mostrado que entre 1 y 10 por ciento de luz roja incidente (600-700 nm) puede pasar a través de un trozo de tejido humano de 1 centímetro de grosor, mientras que sólo un 0,001 por ciento o menos de luz azul (aproximadamente 400 nm) puede pasar a través del mismo grosor de piel humana. El fotosensibilizante, por lo tanto, será más exitoso si absorbe luz roja. PpIX absorbe luz roja fuertemente. La presente aproximación tiene varias ventajas sobre la técnica previa. Primero el PpIX endógeno tiene una vida media mucho más corta en tejidos normales (de humano y ratón, al fin) que la que tienen HpIX, HpD o Photofrin® II. Esto reduce grandemente el peligro de reacciones en la piel fototóxicas accidentales en los días después del tratamiento. Segundo, el ALA se puede aplicar tópicamente a ciertos tipos de lesiones. Esto mejora la especificidad del tratamiento, reduce el peligro de reacciones fototóxicas a un nivel muy bajo, y reduce grandemente la cantidad tanto de ALA como de PpIX al cual el cuerpo entero estaría expuesto si una dosis igualmente efectiva de ALA se fuera a administrar sistemáticamente.

Tanto ALA como PpIX son productos normales del metabolismo, y se manejan bastante fácilmente mediante la maquinaria bioquímica del cuerpo. Sin embargo, dado que dosis muy grandes de ALA (como dosis grandes de HpIX o HpD) están asociadas con un decrecimiento transitorio en la velocidad de la conducción nerviosa motora, es deseable reducir la dosis de ALA al mínimo que aún es efectivo. La aplicación tópica requiere mucha menos ALA que la administración sistémica. Tercero, PpIX se inactiva rápidamente mediante la luz fotoactivadora. Tras la exposición de los tejidos que contienen PpIX a una dosis terapéutica de luz fotoactivadora, hay un decrecimiento sustancial en la fotosensibilización de los tejidos en el volumen de tratamiento. Consecuentemente, si PpIX se induce mediante la aplicación tópica de ALA a lesiones específicas, el paciente se puede exponer a la luz del sol inmediatamente después del tratamiento sin peligro de fototoxicidad seria. Además, la dosimetría de la luz activadora está grandemente simplificada. Cuarto, ALA es un inductor efectivo de PpIX cuando se da por la boca, mediante aplicación tópica, o mediante inyección. En contraste, HpIX, HpD y Photofrin II son efectivos en la mayoría de las situaciones sólo cuando se administran mediante inyección. La versatilidad de AHA mejora su aceptabilidad para uso de rutina por la profesión médica, dado que las vías oral y tópica de administración son mucho más convenientes que la parenteral. Quinto, los tejidos normal y anormal que se pueden fotosensibilizar mediante la administración de ALA son algo diferentes de aquellos que se pueden fotosensibilizar mediante la administración de HpIX, HpD o Photofrin II. Consecuentemente, ALA sería útil en situaciones clínicas en las cuales los otros fotosensibilizantes no lo son.

Ejemplo 1 (1) Inducción selectiva de la síntesis y acumulación de protoporfirina IX y/o otras porfirinas endógenas con parásitos in vivo o in vitro

In vivo - Si los parásitos en cuestión involucran la piel, conjuntiva, mucosa oral, mucosa nasal, mucosa anal, o urotelio, ALA se puede aplicar directamente a la superficie del tejido afectado. Si los parásitos se sitúan en sitios que no son adecuados para aplicación tópica, una cantidad efectiva de ALA se administra sistemáticamente, bien por la boca, por inyección subcutánea, o por inyección intravenosa.

In vitro - El material sospechoso de contener parásitos se incuba bajo condiciones apropiadas en presencia de una concentración efectiva (generalmente alrededor de 5 mM) de ALA.

Ejemplo 2 Estudios in vivo

La inyección de una dosis efectiva del ácido 5-aminolevulínico (ALA) en ratones infectados con P. yoelii conduce a la acumulación de concentraciones fluorescentes y fotosensibilizantes de protoporfirina con parásitos metabólicamente activos. No hay tal acumulación de protoporfirina con parásitos no viables, o con eritrocitos o leucocitos normales. En los leucocitos parasitados, la acumulación de protoporfirina se localiza en el mismo parásito.

Los parásitos de malaria metabólicamente activos (viables) se pueden distinguir fácilmente de parásitos que están inactivos (muertos), dado que sólo los parásitos que están metabólicamente activos pueden sintetizar protoporfirina. Además, los parásitos de malaria metabólicamente activos (viables) se pueden matar selectivamente mediante exposición de sangre infectada o de suspensiones de células a longitudes de onda de luz fotoactivadoras. El procedimiento no causa ningún daño significativo a los eritrocitos y leucocitos normales acompañantes, dado que no acumulan suficiente protoporfirina para llegar a fotosensibilizarse.

Ejemplo 3 Demostración, cuantificación y análisis de fluorescencia inducida por ALA en eritrocitos parasitados por P. yoelii

Se administraron inyecciones intraperitoneales de sangre o células del bazo obtenidas con ratones infectados con P. yoelii a ratones normales. Cuando la malaria estuvo bien establecida, a algunos de los ratones infectados se les administró una única inyección intraperitoneal de 250 mg de ALA por kg de peso corporal. Los controles incluyeron ratones infectados a los que no se ha administrado ALA, y ratones no infectados a los que se ha administrado/no se ha administrado ALA.

A diversos intervalos a partir de ese momento, se examinaron suspensiones de células de la sangre y/o células del bazo mediante las siguientes técnicas.

Microscopia de fluorescencia: fluorescencia roja desarrollada en eritrocitos parasitados de ratones a los que se ha dado ALA, pero no con ninguno de los controles. Esta fluorescencia se localizó en los plasmodios.

Citometría de flujo de fluorescencia: grandes cantidades de eritrocitos en suspensiones de células de la sangre periférica y bazo de ratones seriamente parasitados a los que se dio ALA desarrollaron fluorescencia roja. Las células de los ratones control fueron uniformemente negativas. Esta técnica permitió la detección rápida y la enumeración de eritrocitos que contuvieron parásitos metabólicamente activos, y produjeron valores relativos para la intensidad de fluorescencia inducida por ALA en tales eritrocitos.

Espectrofotofluorometría: células sanguíneas y del bazo de ratones seriamente parasitados a los que se dio ALA se lavaron y sedimentaron por centrifugación. La protoporfirina fue el único fluoróforo que se identificó mediante espectrofotofluorometría. Como se esperaba, los sedimentos celulares de los animales control contenían sólo trazas de protoporfirina.

Demostración y cuantificación de fotosensibilización inducida por ALA del estado intraeritrocítico de P. yoelii

Se administraron inyecciones intraperitoneales de sangre o células del bazo obtenidas de ratones infectados con P. yoelii a ratones normales. Cuando la malaria estuvo bien establecida, a algunos de los ratones infectados se les administró una única inyección intraperitoneal de 250 mg de ALA por kg de peso corporal. Los controles incluyeron ratones infectados a los que no se ha administrado ALA, y ratones no infectados a los que se ha administrado/no se ha administrado ALA.

A diversos intervalos a partir de ese momento, se expusieron suspensiones de células de la sangre y/o células del bazo a dosis graduadas de luz fotoactivadora. La pérdida de viabilidad inducida por la luz del P. yoelii se demostró mediante (a) pérdida de infectividad, o (b) pérdida de capacidad para acumular el producto de escisión fluorescente de calceína-AM.

(A) Ensayo de Infectividad: se administró una dosis estándar de ALA mediante inyección intraperitoneal a ratones infectados por P. yoelii. Se recogieron células de sangre periférica y células del bazo después de un intervalo estándar, expuestas a dosis estándar de luz fotoactivadora (incluyendo un control sin ninguna luz) y después se inyectaron en ratones normales. Si los ratones control (sin ninguna luz) desarrollaron malaria y murieron mientras que los ratones a los que se administraron células que habían estado expuestas a una dosis dada de luz permanecieron libres de malaria y vivieron indefinidamente, esto se consideró ser evidencia de que las suspensiones de células tratadas con luz no contenían suficientes plasmodios viables para causar una infección.

Por ejemplo, se administró a un ratón Balb/c con malaria avanzada (P. yoelii) una inyección intraperitoneal de 250 mg de ALA por kg de peso corporal. Cuatro horas después, las células del bazo se suspendieron en disolución salina isotónica. La mitad de la suspensión celular se situó en hielo y se expuso a luz fotoactivadora (banda de ondas 600-700 nm, intensidad 100 nW/cm^{2}, dosis total 540 J/cm^{2}), mientras la otra mitad se mantuvo en hielo en la oscuridad. A los ratones Balb/c se les inyectó intraperitonealmente bien con la muestra tratada con luz o bien con la muestra no tratada. La supervivencia de los ratones se continuó durante 90 días. La figura 1 ilustra la duración de supervivencia de ratones individuales tras la inyección de células del bazo infectadas con P. yoelii.

(B) Estudios de fotosensibilización (estudios ex vivo, fotorradiación directa): se usó un grupo de 4 ratones hembra sin pelo. Se infectaron dos ratones con P. yoelii y otros dos ratones no fueron infectados. Los ratones infectados con malaria estaban usualmente en el 8º día tras su inoculación con plasmodios. Los ratones se dividieron en dos grupos: un grupo se trató con ALA, el grupo control no se trató con ALA.

Ambos grupos se mantuvieron en la oscuridad durante un periodo de tres horas. Los ratones se sacrificaron después (sobredosis de cloroformo) y las células sanguíneas infectadas se obtuvieron a partir de bazo homogeneizado. Los bazos se homogeneizaron en 3 cc de disolución salina isotónica. A partir de esta homogeneización se tomó 1 cc y se diluyó en 24 cc de disolución salina isotónica, después se tomó 1 cc de esta dilución y se situó en tubos de ensayo (un total de 8 tubos). Cuatro tubos se mantuvieron en la oscuridad y cuatro tubos se fotoirradiaron.

La fuente de luz fue una lámpara de tungsteno con un filtro de luz roja (600-700 nm). El haz fue de 10 cm de diámetro y la suma de las energías de los electrones que pasan a través de una unidad de área fue de aproximadamente 70 mW/cm^{2}. Las muestras se situaron en hielo o en una plataforma giratoria (33 rpm) para asegurar una distribución uniforme de la luz en las células diana.

Para determinar la viabilidad del plasmodio después de haberse irradiado, los contenidos de cada tubo se inocularon en ratones sin pelo, y después los ratones se sometieron a un seguimiento de su supervivencia.

Los grupos control para luz sola pero sin nada de ALA, y con ALA pero sin nada de luz, se usaron también para asegurar que la fotosensibilidad se debió a ALA más luz.

(C) Estudios espectrofotométricos: se usó un grupo de 8 ratones hembra sin pelo. Cuatro ratones estaban en el 8º día tras su inoculación con P. yoelii con 35% de parasitemia y 4 ratones normales estaban normales (no infectados). Los ratones se dividieron en 4 grupos de dos ratones en cada uno.

i)

2 ratones infectados a los que se administró una inyección intraperitonealmente (IP) de 250 mg/kg de ALA en PBS;

ii)

2 ratones normales (no infectados) que se inyectaron también IP con 250 mg/kg de ALA en PBS;

iii)

se incluyeron 2 controles de referencia: 2 ratones infectados con malaria y 2 ratones no infectados, ninguno recibió ALA.

Todos los cuatro grupos se mantuvieron a temperatura ambiente normal, en la oscuridad, durante 4 horas y después se sacrificaron. Los ratones se anestesiaron con cloroformo y después la sangre se recogió mediante punción cardiaca (jeringuilla heparinizada con aguja 20G 1'). Se recogieron aproximadamente 0,9 cc de sangre y se transfirieron a un tubo de prueba de 5 cc, se mantuvieron en hielo y en la oscuridad. Los tubos de ensayo se centrifugaron después durante 10 minutos. Usando un equipo de espectrofluorofotómetro para excitación a 410 nm y emisión de fluorescencia a 635 nm, las medidas de fluorescencia se tomaron del sobrenadante y el sedimento. La hemolisis con un 1% de saponina se llevó a cabo en muestras después de las primeras medidas de fluorescencia, y los plasmodios libres se centrifugaron para formar un sedimento. Después las medidas de fluorescencia se tomaron del sedimento y el sobrenadante. La fluorescencia de protoporfirina se detectó sólo en sedimento plasmodial derivado de ratones infectados a los que se administró ALA.

(D) Estudios de citómetro de flujo (estudios farmacocinéticos): se usó un grupo de 4 ratones hembra sin pelo. Dos ratones se infectaron con P. yoelii y otros dos ratones no se infectaron. Los ratones infectados con malaria estaban usualmente en el 8º día tras su inoculación con los plasmodios infectados. ALA se administró directamente a los ratones (250 mg/kg intraperitonealmente), después se retiraron dos gotas de sangre completa a intervalos de tiempo regulares de la cola de cada ratón y se situaron en tubos de ensayo de 5 cc de citómetro de flujo que contenían 0,5 cc de RPMI 1640 y después se analizaron por el citómetro de flujo para realizar un seguimiento de la acumulación de PpIX. Sólo los ratones infectados a los que se administró ALA desarrollaron fluorescencia en sus eritrocitos.

Para los estudios in vitro, no se administró ALA al ratón donante. Se retiraron dos gotas de sangre completa de la cola de cada ratón y se situaron en una placa de petri de 35 mm que contenía 3 cc de RPMI 1640 sin rojo fenol.

i)

una placa de petri contenía sangre completa infectada con 5 nM de ALA en RPMI;

ii)

una segunda placa de petri contenía sangre completa infectada más RPMI pero sin nada de ALA;

iii)

una tercera placa de petri contenía células de sangre completa normales con 5 nM de ALA en RPMI;

iv)

una cuarta placa de petri contenía células de sangre completa normales con RPMI pero sin nada de ALA.

Todas las placas de petri se incubaron a 37 grados Celsius y al aire ambiental. Las muestras (0,5 cm^{3}) se tomaron a intervalos regulares a partir de estas placas de petri incubadas para analizarse en el citómetro de flujo para realizar un seguimiento de la acumulación de PpIX. Sólo células de ratones infectados desarrollaron fluorescencia PpIX cuando se incubaron con ALA.

Aplicación de PDT con PpIX inducida por ALA al tratamiento de malaria

La malaria se causa por la infección del hospedador con parásitos unicelulares conocidos como plasmodios. En un estado en su ciclo celular, los plasmodios infectan y se desarrollan dentro de eritrocitos de sangre periférica, bazo, y/o médula. Pueden infectar el hígado y ciertos otros órganos también.

De las numerosas especies de plasmodios que se han identificado, sólo unos pocos pueden infectar humanos. Los plasmodios que causan malaria en ratones pero no en humanos proporcionan un modelo seguro y conveniente para estudios en laboratorio de malaria.

Estos ejemplos implican los parásitos murinos de malaria Plasmodium yoelii (cepa letal) y Plasmodium chabaudi (cepa no letal) como modelos para la malaria humana.

Fotosensibilización in vivo

Cuando los ratones infectados con los parásitos murinos de malaria P. yoelii y P. chabaudi se proporcionó una dosis de ácido 5-aminolevulínico (ALA) mediante inyección intraperitoneal,

-

que aparece espectroscópicamente para ser protoporfirina (PpIX) acumulada en muchos de los plasmodios con eritrocitos de la sangre periférica, bazo, y médula. Sin embargo, concentraciones significativas de PpIX no se acumulan dentro de los eritrocitos no infectados o dentro de la gran mayoría de los leucocitos en los ratones infectados;

-

un material fluorescente que puede haber sido un complejo de protoporfirina con un metal ligero (por ejemplo protoporfirina de cinc) acumulada algunas veces en asociación con el PpIX;

-

tras la exposición a una dosis adecuada de luz de longitud de ondas con el espectro de fotoactivación de PpIX, los plasmodios que se han expuesto a ALA pierden su capacidad normal para acumular calceína cuando se exponen a calceína-AM, y también pierden su capacidad para causar malaria cuando se inyectan en los ratones recipientes. Sin embargo, los eritrocitos no infectados y los leucocitos en las mismas suspensiones celulares no mostraron ninguna evidencia morfológica de daño tras exposición a la luz fotoactivadora.

Fotosensibilización in vitro

Cuando la sangre periférica, bazo, o médula ósea de ratones infectados con los parásitos murinos P. yoelii y P. chabaudi se incubaron bajo condiciones adecuadas en presencia de una concentración efectiva de ALA, que apareció espectroscópicamente para ser protoporfirina (PpIX) acumulada en muchos de los plasmodios en eritrocitos de la sangre periférica, bazo o médula. Sin embargo, las concentraciones significativas de PpIX no se acumulan en los eritrocitos no infectados o en la gran mayoría de los leucocitos en los ratones infectados.

La exposición de P. yoelii y P. chabaudi metabólicamente activos a una concentración efectiva de ALA bajo condiciones adecuadas in vivo o in vitro conduce a la acumulación preferencial de concentraciones fluorescentes y fotosensibilizantes de PpIX en esos plasmodios, pero no en eritrocitos no infectados o en la gran mayoría de leucocitos en suspensiones celulares de sangre periférica, bazo, o médula ósea.

La fluorescencia inducida por ALA específica de plasmodios se puede usar para detectar y cuantificar parásitos de malaria metabólicamente activos en suspensiones de células de sangre periférica, bazo, o médula.

La fotosensibilización inducida por ALA específica de plasmodios se puede usar para destruir selectivamente parásitos de malaria, exponiéndolos in vitro o in vivo a una dosis adecuadas de luz fotoactivadora.

Ejemplo 4 Infecciones fúngicas cutáneas

Históricamente, las infecciones fúngicas no han atraído tanta atención como las infecciones bacterianas. Este foco de investigación se ha debido a un número de factores, más notablemente, la alta incidencia, el grado y el efecto de las infecciones bacterianas en humanos. Sin embargo, esta tendencia ha cambiado en el pasado par de décadas. Con el número creciente de pacientes inmunocomprometidos, tanto por causas iatrogénicas (quimioterapia) como de enfermedad (SIDA), la incidencia de las infecciones fúngicas se ha incrementado. Esto ha coincidido con un incremento en las tasas de morbilidad y mortalidad debidas a infecciones fúngicas en la década pasada.

Las infecciones fúngicas se pueden dividir en tres categorías: cutáneas, subcutáneas y sistémicas. Mientras que las infecciones sistémicas (blastomicosis, candidiasis, etc.) tienen secuelas más serias, las infecciones cutáneas son mucho más prevalentes. Entre 1971 y 1974, las infecciones fúngicas tienen una tasa de notificación de 88/1000 personas en los Estados Unidos con las infecciones cutáneas no invasivas responsables del 90% de los casos. (Este es el número de casos notificados, Debido a que las secuelas de las infecciones cutáneas no ponen en peligro la vida, la tasa real de incidencia es probablemente mucho mayor). Se han citado también como la causa más probable de infección cutánea.

Las infecciones cutáneas se pueden dividir adicionalmente en tres subcategorías: superficial, dermatofitosis y dermatomicosis. Las infecciones superficiales no penetran la capa externa de la piel y no implican bien el pelo o bien uñas. Ejemplos de infecciones superficiales fúngicas son tiña negra, piedra negra y piedra blanca. Las dermatofitosis son infecciones de la piel, pelo y uñas, e incluyen todas las capas del estrato córneo. Estas infecciones se causan por dermatofitos, hongos los cuales raramente causan infecciones diseminadas. Estos organismos liberan queratinasas, lo cual probablemente explica su localización en los tejidos queratinizados. Estos hongos causan poca mortalidad, pero son una causa principal de morbilidad mundial, y en Norteamérica un gasto principal de tiempo y dinero. Estas infecciones predisponen a sus hospedadores a superinfecciones bacterianas. Las dermatomicosis son infecciones cutáneas causadas por hongos distintos a los dermatofitos y tienen un mayor riesgo de invasión y diseminación (por ejemplo, candidiasis superficial, micetoma, esporotricosis), especialmente en un hospedador inmunocomprometido. Sin embargo, como se estableció antes, la mayoría más grande de infecciones fúngicas se causan por los dermatofitos no invasivos.

Dermatofitos

Los dermatofitos incluyen los géneros Trichophyton spp., Microsporum spp., y Epidermophyton spp. Ecológicamente, estos hongos son antrofílicos (su transmisión es de humano a humano), zoofílicos (transmisión de animal a humano) y geofílicos (transmisión de suelo a humano, posiblemente por medio de un intermediario animal). Típicamente los hongos antrofílicos causan poca inflamación (incrementando la probabilidad de infección crónica) y los hongos zoofílicos causan una reacción furuncular.

Las dermatofitosis se llaman "tiña" seguida por la localización corporal (por ejemplo tiña capitis es una infección de la cabeza). La tabla 1 enumera las dermatofitosis y su dermatofito causante como se encuentran en una encuesta de visitas dermatológicas por el personal del ejército de los Estados Unidos. Estos datos se han apoyado en datos recogidos de encuestas de estudiantes, internos, y personal diferente de las fuerzas armadas en los Estados Unidos. El dermatofito mundial más común es T. rubrum (encuesta de los centros dermatológicos principales).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Presentación clínica

Estas infecciones no son amenazadoras para la vida pero pueden causar una cantidad significativa de disconfort. Típicamente causan formación de escamas, formación de fisuras, pelado de la piel, picor, eritema ardiente, y en algunas circunstancias, maceración. La tiña de la cabeza causa usualmente caída del cabello reversible. T. mentagrophytes y T. verrucosum pueden producir una reacción inflamatoria violenta. También, estas infecciones no son bonitas y pueden tener consecuencias estéticas serias. El resultado de estas infecciones es bien una cura espontánea, una cura mediante medicación, una afección crónica tratable, o bien una infección persistente a pesar de la medicación. Tanto la presentación como el resultado es función de las capacidades de virulencia del dermatofito y defensa del hospedador. Los individuos inmunocomprometidos invariablemente van peor que sus contrapartidas inmunocompetentes.

Tratamiento

La dermatofitosis se puede tratar tópicamente u oralmente. La ventaja de tratar tópicamente es que se puede emplear una terapia más agresiva (tóxica), mientras que oralmente, se requieren fármacos menos tóxicos. Sin embargo, los fármacos tópicos pueden causar picor, quemazón, enrojecimiento, y sensibilización del área infectada. La terapia oral tiene la ventaja de lograr acceder a sitios de tejido normalmente inalcanzables para la terapia tópica (por ejemplo los lechos ungueales). Para lograr acceder al sitio de acción, ambas rutas deben superar las defensas naturales del cuerpo frente a moléculas extrañas dado que ninguno de los fármacos usados son moléculas endógenas. Los imidazoles y triazoles se usan tópicamente y el ketoconazol y la griseofulvina se usan oralmente. Sin embargo, el ketoconazol tiene una gran cantidad de efectos secundarios, especialmente si se usa durante un largo periodo de tiempo, y T. rubrum y T. tonsurans han mostrado resistencia a terapia. Ambos regímenes orales requieren seguimiento cuidadoso y muchos pacientes no se pueden tratar debido a las contraindicaciones.

La terapia antifúngica depende del grosor del sitio infectado. La tiña crural y la tiña corporal requieren un tiempo de tratamiento más corto que la tiña de las manos y la tiña podal debido a que la piel es más delgada en la ingle y en el cuerpo en comparación con las manos y los pies. Las infecciones localizadas en el folículo piloso requieren de 4 a 6 semanas de tratamiento (raíz = 3-4 mm bajo la superficie de la piel, crecimiento a 1 mm/semana). Las uñas de las manos requieren de 4-9 meses de tratamiento, y las uñas de los pies, las cuales crecen incluso más despacio, requieren 9-18 meses de tratamiento. Debido a llevar zapatos, los pies y las uñas de los pies están sometidos a un ambiente el cual conduce al crecimiento de hongos (tibio, húmedo), haciendo más difícil eliminar la infección.

La tiña ungueal u onicomicosis ha sido particularmente problemática de tratar. Los regímenes de tratamiento pueden finalizar en un periodo tan largo como 18 meses, con tiempo y dinero considerables invertidos en la cura. La avulsión (eliminación) de la uña se incluye a menudo en el tratamiento pero puede causar disconfort posoperatorio considerable. Incluso así, sólo se puede obtener una tasa de cura del 75-80% con las infecciones de los dedos de las manos. Los resultados son más deprimentes para las infecciones de las uñas de los pies (25% de tasa de cura). Si está involucrada más de una uña, una cura permanente es improbable. Se ha estimado que al menos el 15-20% de la población de los Estados Unidos entre las edades de 40-60 años tienen onicomicosis.

Aplicación clínica de fotosensibilización inducida por ALA a la infección crónica de las uñas de los pies con dermatofitos (especies del género Trichophyton).

Se presentó un varón adulto con una infección dermatofítica crónica que involucraba la uña del dedo gordo del pie. La propia uña estaba mal deformada como resultado de la infección. Los tejidos circundantes mostraban evidencia de inflamación de bajo grado crónica.

Se aplicó una disolución al 20% (p/p) de ácido 5-aminolevulínico (ALA) en una emulsión de aceite en agua (Base Glaxal) a la uña del pie y los tejidos circundantes, y después se cubrió con un recubrimiento de plástico resistente al agua (Tegaderm). Cuatro horas después, el Tegaderm y la crema residual se eliminaron y el área completa se expuso a la luz fotoactivadora (roja).

El paciente experimentó una típica respuesta subjetiva mientras que el dedo del pie estuvo exponiéndose a la luz - picor, aguijonazos, y una sensación de quemazón suave. Tras la terminación del tratamiento, el pie estaba eritematoso y algo edematoso. Esto decreció gradualmente durante los pocos días siguientes.

Durante los pocos meses siguientes, toda evidencia clínica de la infección fúngica había desaparecido. La uña del pie está creciendo ahora sin deformidad.

Ejemplo 5

Los siguientes organismos acumularon concentraciones fluorescentes y/o fotosensibilizantes de PpIX cuando se exponen a ALA exógeno.

(1) Protozoos

(a)

Leishmania - L. donovani

[fluorescencia inducida por ALA]

(b)

Malaria - Plasmodium yoelii

[fluorescencia inducida por ALA]

[fotosensibilización inducida por ALA] - Plasmodium chaubadi

[fluorescencia inducida por ALA]

[fotosensibilización inducida por ALA]

(2) Gusanos

(a)

Nematodos - Lumbricus terrestris (lombriz de tierra)

[fluorescencia inducida por ALA]

[fotosensibilización inducida por ALA] - Enterobius vermicularis (oxiuro)

[fluorescencia inducida por ALA]

[fotosensibilización inducida por ALA]

Plasmodium yoelii es un parásito de malaria que puede infectar y crecer progresivamente para producir una forma letal de malaria en cepas susceptibles de ratones y ratas. Los inventores han encontrado que, cuando los ratones normales se inyectan con cifras estándar de células de la sangre o del bazo obtenidas de donantes infectados con P. yoelii, murieron de malaria 10 a 20 días después de tal inyección. Este modelo en ratón es aplicable al estudio de infecciones de malaria en humanos, incluyendo P. vivax, P. falciparum, P. malariae y P. ovale.

Claims (4)

1. El uso de un precursor de protoporfirina IX para la preparación de un medicamento para el tratamiento de dermatofitosis o malaria en un paciente, en el que para el tratamiento de dermatofitosis tras la administración del medicamento el paciente se expone a luz capaz de fotoactivar fotoporfirina IX y en el que para el tratamiento de malaria tras la administración del medicamento se exponen los parásitos de malaria a luz capaz de fotoactivar protoporfirina IX.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho precursor de protoporfirina IX es el ácido 5-aminolevulínico.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que dichas dermatofitosis se seleccionan de tiña podal u onicomicosis.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que dichos parásitos de malaria se seleccionan a partir de Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae o Plasmodium vivax.