ES2233571T3 - Indicador de peroxido de hidrogeno que utiliza un enzima y un colorante. - Google Patents
Indicador de peroxido de hidrogeno que utiliza un enzima y un colorante.Info
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Abstract
Un método para detectar la exposición integrada del peróxido de hidrógeno en una atmósfera, comprendiendo el método las etapas de: colocar un sustrato capaz de absorber peróxido de hidrógeno en la atmósfera; poner en contacto el sustrato con el peróxido de hidrógeno; leer el peróxido de hidrógeno con un colorante intermedio y una enzima para producir un cromóforo indicativo de la exposición integrada de peróxido de hidrógeno en la atmósfera; y correlacionar el cromóforo con la exposición integrada de peróxido de hidrógeno en la atmósfera.
Description
Indicador de peróxido de hidrógeno que utiliza un
enzima y un colorante.
La presente invención se refiere a un método y
dispositivo para detectar peróxido de hidrógeno.
Existen muchas aplicaciones en las que es
deseable medir la concentración de peróxido de hidrógeno. Por
ejemplo, en la industria alimentaria el peróxido de hidrógeno se usa
para esterilizar las latas metálicas para la preparación de
alimentos enlatados. Es crítico asegurar una aplicación apropiada
del peróxido de hidrógeno a tales latas para mantener la seguridad
alimentaria apropiada. El peróxido de hidrógeno también se usa como
un agente desinfectante químico para cámaras estériles. Lo más
importante, el peróxido de hidrógeno se usa para esterilizar los
dispositivos industriales y médicos. En tal aplicación, el peróxido
de hidrógeno se puede aplicar como una disolución líquida o
preferiblemente como un vapor. El vapor de peróxido de hidrógeno se
puede combinar con la aplicación de un campo de plasma. Tales
sistemas se describen más plenamente en la Patente de EE.UU. números
4.643.876 y 4.756.882. Un sistema tal comercialmente disponible es
el esterilizador marca STERRAD® de Advanced Sterilization Products
de Irvine, California.
En el STERRAD y sistemas similares, típicamente
los instrumentos que se han de esterilizar primero se limpian, secan
y después se envuelven en una envoltura a prueba de bacterias,
transmisible al vapor tal como una bolsa de TYVEK® (olefina de
filamento continuo)/MYLAR (película de poliestireno) o envoltorio de
la sala central de suministros (envoltorio CSR). Los instrumentos se
colocan en una cámara de esterilización y se evacua el gas de la
cámara para poner la cámara a una presión de vacío. Se introduce el
vapor de peróxido de hidrógeno en la cámara y se pone en contacto
con los instrumentos para esterilizarlos. La potencia añadida a
través de radiación electromagnética u otros medios crea un plasma
de peróxido de hidrógeno, preferiblemente al final del ciclo.
Después de que se retira la fuente de energía usada para crear el
plasma, los iones del plasma se recombinan para formar oxígeno y
agua.
El procedimiento de esterilización se puede
controlar de varias maneras. Por ejemplo, se pueden colocar
indicadores biológicos en diversas posiciones por toda la cámara de
esterilización para evaluar el procedimiento de esterilización. Un
indicador biológico típico se muestra en la patente de EE.UU. número
5.552.320 por Smith. En general, un indicador biológico contiene una
cantidad conocida de un organismo vivo de ensayo. Después del
procedimiento de esterilización, el organismo se cultiva para ver si
algunos de los organismos de ensayo han sobrevivido al procedimiento
de esterilización. Un procedimiento de cultivo tal necesariamente
supone un retraso, normalmente de un día o más.
Un método alternativo de controlar la operación
del ciclo de esterilización es ensayar la presencia y cantidad de
vapor de peróxido de hidrógeno en la cámara de esterilización. Si se
alcanza la cantidad deseada de peróxido de hidrógeno en la cámara,
al menos se puede asumir que el dispositivo de esterilización
funciona como se desea. Preferiblemente, la evaluación sería
instantánea de manera que si un ciclo particular del procedimiento
de esterilización falla en alcanzar la cantidad necesaria de vapor
de peróxido de hidrógeno, se puede repetir el ciclo inmediatamente.
Existen tiras reactivas para ensayar la presencia de peróxido de
hidrógeno, pero generalmente son deficientes en evaluar el nivel de
exposición.
El documento
US-A-5.110.012 describe el uso de
sales de compuestos de hidrazona solubles en agua para la
determinación colorimétrica de peróxido de hidrógeno.
La presente invención proporciona un método y
dispositivo para determinar rápida y fácilmente la presencia de
peróxido de hidrógeno y más preferiblemente la cantidad de la
exposición integrada al peróxido de hidrógeno.
Un método, según la presente invención, detecta
la exposición integrada del peróxido de hidrógeno en una atmósfera.
El método comprende colocar un sustrato capaz de absorber el
peróxido de hidrógeno de la atmósfera, poner en contacto el sustrato
con el peróxido de hidrógeno, hacer reaccionar el peróxido de
hidrógeno con un colorante intermedio y una enzima para producir un
cromóforo indicativo de la exposición integrada de peróxido de
hidrógeno en la atmósfera, y correlacionar el cromóforo con la
exposición integrada de peróxido de hidrógeno en la atmósfera.
Preferiblemente, el colorante intermedio
comprende una pareja de colorantes de hidrocloruro de la hidrazona
del
3-metil-2-benzotiazolinona
(MBTH) y ácido 3-dimetilaminobenzoico (DMAB).
También preferiblemente, la enzima es peroxidasa.
El colorante intermedio preferiblemente comprende
un aceptor de oxígeno, tal como uno de los siguientes:
o-dianisidina, o-toluidina,
bencidina, ácido
2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico),
hidrazona del
3-metil-2-benzotiazolinona
más N,N-dimetilanilina, fenilo más
4-aminofenazona,
2,4-dicloro-fenol sulfonado más
4-aminofenazona, hidrazona de
3-metil-2-benzotiazolinona
más ácido 3-(dimetilamino)benzoico,
2-metoxi-4-alil
fenol, o
4-aminoantipireno-dimetilanilina
El sustrato preferiblemente es un receptor
poroso. El sustrato puede llevar el colorante intermedio antes de la
etapa de poner en contacto el sustrato con el peróxido de hidrógeno.
Alternativamente, el colorante intermedio se puede añadir al
sustrato después de poner en contacto el sustrato con el peróxido de
hidrógeno.
Un método para correlacionar el cromóforo con la
exposición integrada de peróxido de hidrógeno en la atmósfera
comprende leer el cromóforo con un espectrofotómetro.
Alternativamente, se puede comparar con una carta de colores.
Igualmente, la enzima puede estar en el sustrato antes o después de
poner en contacto el sustrato con el peróxido de hidrógeno.
El sustrato se puede hidratar, preferiblemente
después de la etapa de exponer el sustrato al peróxido de hidrógeno.
Se puede añadir al sustrato un agente espesante, tal como cola
blanca.
El método mencionado anteriormente es
particularmente útil en conexión con las etapas de eliminar el aire
de la atmósfera y generar el vapor de peróxido de hidrógeno en la
atmósfera.
La presente invención se puede entender más
fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada
cuando se lee junto con los dibujos adjuntos, en los que:
Fig. 1 es una vista en perspectiva de una
realización de un dispositivo de ensayo según la invención;
Fig. 2 es un diagrama esquemático de bloques de
un aparato que se puede emplear en la práctica de la invención;
Fig. 3 es una vista en perspectiva de una
realización preferida del dispositivo de ensayo de la presente
invención colocado en un sistema de medida;
Fig. 4 es una vista en planta ampliada de una
realización preferida del dispositivo de ensayo de la presente
invención colocado en un sistema de medida;
Fig. 5 es una gráfica que traza una curva de
calibración polinómica de la presente invención;
Fig. 6 es una gráfica que traza una medida de la
reflectancia de un dispositivo de ensayo según la invención frente
al volumen de peróxido de hidrógeno; y
Fig. 7 es una gráfica que muestra las cinéticas
de los reactivos con diversas cantidades de peróxido de hidrógeno
inyectado.
La presente invención proporciona un dispositivo
y metodología mejorados rápidos y simples para determinar la
exposición al peróxido de hidrógeno. Como se muestra en la Fig. 1,
un indicador 10 comprende una almohadilla matriz hidrófila 11 a la
que está ligado uno o más reactivos que cambian la reflectancia de
la matriz cuando se detecta peróxido de hidrógeno. El reactivo
comprende una enzima y un sistema colorante que produce un producto
que absorbe luz junto con la enzima. Es el producto que absorbe luz
el que cambia la señal de reflectancia del sistema matriz. Se puede
usar peroxidasa como enzima para esta invención.
El cambio en la reflectancia durante un periodo
predeterminado de tiempo como resultado de la formación del producto
de la reacción se relaciona después con la cantidad de peróxido de
hidrógeno en la matriz, que a su vez se corresponde con la
exposición integrada de peróxido de hidrógeno, es decir, la
concentración de peróxido de hidrógeno durante el tiempo de
exposición de la matriz al peróxido de hidrógeno. La exposición
integrada depende tanto de la concentración de peróxido de hidrógeno
como de la extensión del tiempo de exposición. Es el área integrada
bajo la curva de concentración frente al tiempo de exposición. Por
lo tanto, el ensayo con alta concentración de peróxido y corto
tiempo de exposición puede producir la misma exposición integrada
que el ensayo a baja concentración y largo tiempo de exposición. Por
supuesto, la intensidad de la fuente luminosa usada para analizar la
muestra es también cuidadosamente monitorizada y regulada, para
asegurar la repetibilidad de la medida.
Típicamente, la almohadilla matriz 11 estará
sujeta a un soporte con el fin de darle forma física y rigidez,
aunque esto puede no ser necesario. Por ejemplo, en el indicador 10,
un soporte o mango plástico 12 transporta la delgada almohadilla
matriz hidrófila 11 por medio de un adhesivo 13 que sujeta directa y
firmemente la almohadilla 11 al mango 12. Una apertura 14 en el
soporte plástico 12 adyacente a la almohadilla 11 permite aplicar el
líquido a un lado de la almohadilla 11 y que la luz se refleje desde
el otro lado.
La almohadilla matriz 11 debería ser absorbente
del peróxido de hidrógeno de una manera controlada. Cuando se expone
a una atmósfera de peróxido de hidrógeno durante una cantidad dada
de tiempo, la cantidad de peróxido de hidrógeno absorbido en la
almohadilla 11 indica la exposición integrada de peróxido de
hidrógeno en la atmósfera. Varios factores controlan cuanto peróxido
de hidrógeno se absorbe en la almohadilla, siendo los más
importantes: la concentración de peróxido de hidrógeno en la
atmósfera, la concentración de otras sustancias, tales como vapor de
agua, que puedan ser absorbida por la almohadilla 11 y el tiempo
durante el que la almohadilla 11 está expuesta. De ese modo, la
almohadilla 11 exhibe una función de integración que está
relacionada con la concentración de peróxido de hidrógeno durante el
tiempo. La cantidad total de peróxido absorbido en la almohadilla 11
depende en gran medida del sustrato de la almohadilla 11. Se
requiere calibración diferente para sustrato diferente. Si la
almohadilla 11 es demasiado absorbente, puede absorber demasiado
peróxido e interferir en el procedimiento de esterilización o
desinfección. Por otra parte, si la almohadilla 11 falla en absorber
el peróxido de hidrógeno o se satura fácilmente con peróxido de
hidrógeno, puede no indicar correctamente la cantidad correcta de
peróxido de hidrógeno en la
atmósfera.
atmósfera.
Un material preferido para la almohadilla 11
comprende material celulósico, nylon y otras sustancias capaces de
absorber peróxido de hidrógeno. El uso de superficies de poliamida
para formar el elemento reactivo 11 proporciona varias de las
características deseadas en la presente invención. Es hidrófilo (es
decir, absorbe vapor de peróxido de hidrógeno y disoluciones
hidratantes rápidamente), no se deforma al mojarse (con el fin de
proporcionar una superficie plana para la lectura de la
reflectancia), es compatible con enzimas (con el fin de comunicar
buena estabilidad de anaquel), absorbe un volumen de muestra
limitada por volumen unitario de membrana (necesario con el fin de
mostrar un rango dinámico extendido de medidas), y muestra
suficiente resistencia en húmedo para permitir la fabricación
rutinaria.
La Fig. 2 muestra un sistema en el que el
reactivo se aplica a un lado del indicador 10 con la abertura 14 en
el mango de apoyo 12 mientras que la luz se refleja y se mide en el
otro lado de la almohadilla 11. Se pueden emplear otras estructuras
distintas a la representada. La almohadilla 11 puede tener distintas
conformaciones y formas, sujetas a las limitaciones proporcionadas
en la presente memoria. La almohadilla 11 debería ser accesible al
menos por una superficie y preferiblemente por las dos
superficies.
Adicionalmente, la almohadilla hidrófila 11 puede
estar sujeta al soporte 12 por cualquier medio conveniente, por
ejemplo, una agarradera, grapa o adhesivos; sin embargo, en el
método preferido está unida al apoyo. La unión se puede hacer con
cualquier adhesivo no reactivo, por un método térmico en el que la
superficie del apoyo se funde lo suficiente para atrapar algo del
material usado en la capa hidrófila, o por métodos de unión por
microondas o ultrasonidos que igualmente funden las almohadillas de
muestra hidrófila al soporte.
La interacción entre el peróxido de hidrógeno y
los reactivos en la almohadilla 11 produce un cambio visual. Por
ejemplo, el peróxido de hidrógeno puede reaccionar con un colorante
intermedio o precursor, en una reacción catalizada o no catalizada,
para producir una forma oxidada del intermedio o precursor. Este
material oxidado puede producir el producto coloreado o reaccionar
con un segundo precursor para formar el colorante final. Ejemplos no
limitantes de reactivos incluyen peroxidasa y un aceptor de oxígeno
tal como: o-dianisidina;
o-toluidina; o-tolidina; bencidina;
ácido
2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico),
hidrazona del
3-metil-2-benzotiazolinona
más N,N-dimetilanilina, fenilo más
4-aminofenazona,
2,4-dicloro-fenol sulfonado más
4-aminofenazona, hidrazona del
3-metil-2-benzotiazolinona
más ácido 3-(dimetilamino)benzoico,
2-metoxi-4-alil
fenol; y
4-aminoantipireno-dimetilanilina.
Ejemplos adicionales del tipo indicador simple incluyen
3,3',5,5'-tetrametilbencidina,
o-toluidina y goma de guaica; parejas de indicadores
útiles incluyen 4-aminoantipirina con
2-metil indol,
4,5-dicloro-2-hidroxibencensulfonato
(DCHBS) o (CNSP). Una pareja corriente de colorantes es hidrocloruro
de la hidrazona del
3-metil-2-benzotiazolinona
(MBTH) y ácido 3-dimetilaminobenzoico (DMAB); tal
pareja de colorantes y su uso en un sistema de medida para medir los
niveles de glucosa en sangre se describe en la patente de EE.UU.
número 5.059.394. Se puede usar una pareja de colorantes que
comprende la hidrazona del
3-metil-2-benzotiazolinona
en forma libre o en forma ácida (MBTH) y
8-anilino-1-naftalensulfonato,
en forma ácida o de sal (ANS) en lugar del par corriente de
colorantes MBTH-DMAB. Es menos soluble después de la
oxidación y, por lo tanto, proporciona un punto final más estable,
con mínimo desteñido del colorante, comparado con la pareja de
colorantes de MBTH-DMAB
oxidados.
oxidados.
La patente de EE.UU. número 5.563.031 describe un
sistema adicional de reactivos que comprende una pareja de
colorantes capaz de formar un cromóforo después de oxidarse con
peróxido de hidrógeno u otro agente oxidante; la pareja de
colorantes comprende el compuesto:
\vskip1.000000\baselineskip
en el que R se selecciona entre el
grupo compuesto por alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo
sustituido, heterociclo, amina cuaternaria o restos de ácidos
orgánicos e Y se selecciona entre el grupo compuesto por NO_{2},
SO_{3}^{-}, H, halógeno, alquilo o SiZ_{3} en el que Z es
alquilo o arilo. Preferiblemente, Y es H. En una realización
preferida R
es:
en el que cualquiera de los
R_{1}, R_{2} y R_{3} se seleccionan independientemente entre
el grupo compuesto por H, alquilo, arilo, sililo, halógeno,
hidróxido, mercaptido, alcóxido, tioalcóxido, amina, sulfonato o
carboxilato; y X se selecciona entre el grupo compuesto por amina,
sulfonato o
carboxilato.
La sustancia peroxidativamente activa en la
composición de ensayo es preferiblemente peroxidasa obtenida de
fuentes naturales tales como rábano picante y patata. Se pueden usar
otras sustancias que tienen actividad peroxidativa, que incluyen
compuestos inorgánicos que tienen actividad peroxidasa tales como
mezclas de yoduro potásico y molibdato sódico, así como otros
yoduros, tales como yoduros sódico y amónico, y otros molibdatos,
tales como molibdatos potásico y amónico. Además, se pueden usar
urohemina y varias otras sustancias porfirinas que tienen actividad
peroxidativa. Con ellas se pueden usar diversos compuestos
formadores de complejos que activan las metaloporfirinas, pero que
no actúan por si mismas, tales como
2-aminobenzotiazol, piridina, bipiridilo,
bipiridilpiridina, ácido nicotínico o similares. Otras sustancias
que no son enzimas pero que tienen actividad peroxidativa incluyen
compuestos tales como sulfocianato de hierro, tanato de hierro,
ferrocianuro ferroso, sulfato de cromo y potasio y similares.
También se pueden añadir a la composición
componentes adicionales tales como tampones, agentes tensioactivos y
estabilizantes. El pH, y por lo tanto la adición de una sustancia
tampón, puede determinar el tono de color de una forma particular de
un componente indicador. Por ejemplo, el Naranja Ácido 8 se oxida de
naranja a un color paja pálido a pH 7,5, pero se oxida a un amarillo
(pálido) a pH 9,5. El Rojo Nitro se oxida de púrpura a un marrón
débil a pH 7,5, pero se oxida a un marrón azulado débil a pH 9,5.
Una condición de pH puede ser más deseable que otra para producir el
intervalo deseado de tonos. Se conocen muchas sustancias tampón para
los expertos en la técnica y se pueden usar, dado que no interfieren
con la acción de la peroxida y el peróxido de hidrógeno, para oxidar
los componentes indicadores. Cada uno de los colorantes y parejas de
colorantes descritos anteriormente se han descrito previamente en la
técnica anterior con respecto al análisis de analitos en muestras de
suero tales como glucosa en sangre. En tales sistemas, una enzima
adicional, tal como gluconasa, reacciona con el analito para
producir peróxido de hidrógeno en relación con la cantidad de
analito presente. Los reactivos descritos anteriormente después
miden el contenido de peróxido de hidrógeno para determinar el
contenido de analito en la muestra de suero. En ese tiempo, no eran
conocidas para la medida de la exposición de peróxido de hidrógeno
en una atmósfera.
El indicador 10 se puede construir y operar de
varias formas. Por ejemplo, se puede suministrar sin ningún reactivo
en la almohadilla 11. En esta realización, el indicador 10, sin
reactivos, se expone a la atmósfera de peróxido de hidrógeno y
después de tal exposición se aplica a la almohadilla 11 una
disolución acuosa que contiene a los reactivo, o disoluciones
separadas de cada uno de los componentes reactivos, para iniciar la
reacción. Como se mostrará más adelante, la reacción continua con el
tiempo y es preferible tomar una medida del cambio de color en un
momento específico después de hidratar la almohadilla 11 con los
reactivos. Alternativamente, uno o más de los reactivos pueden estar
en la almohadilla 11 mientras se expone el indicador 10 a la
atmósfera de peróxido de hidrógeno. Por ejemplo, la almohadilla 11
puede estar ya impregnada con el receptor de oxígeno antes de
exponer el indicador a la atmósfera de peróxido de hidrógeno, en
cuyo caso la almohadilla simplemente necesita hidratarse con una
disolución de peroxidasa para comenzar la reacción. La almohadilla
11 puede contener tanto la peroxidasa como el receptor de oxígeno
antes de exponer el indicador a la atmósfera de peróxido de
hidrógeno, en cuyo caso la almohadilla simplemente necesita
hidratarse con agua para comenzar la reacción. Dependiendo de la
cantidad disponible de peróxido de hidrógeno y agua en la atmósfera,
puede ser preferible para conseguir un control mejor omitir la
peroxida en la almohadilla 11 hasta estar listo para comenzar la
reacción. Demasiado peróxido de hidrógeno puede desactivar o inhibir
la enzima, y demasiada agua puede iniciar la reacción demasiado
pronto.
El método de análisis de esta invención
preferiblemente se atiene a un cambio en la absorbancia espectral,
medida por reflectancia difusa, que depende de la exposición
integrada del peróxido de hidrógeno presente en la almohadilla 11.
Después de que el indicador 10 se ha expuesto a una atmósfera de
peróxido de hidrógeno, la almohadilla 11 se hidrata después en
presencia de la peroxidasa y del aceptor de oxígeno, iniciándose de
ese modo la reacción. Se debe medir cuidadosamente el tiempo para la
medida desde el comienzo de la hidratación, o se puede medir la
absorbancia durante un tiempo para determinar cuando la reacción ha
alcanzado un punto predeterminado para la medida. La absorbancia en
esta aplicación se refiere no sólo a luz dentro del intervalo visual
de longitudes de onda sino también fuera del intervalo visual de
longitudes de onda, tal como radiación infrarroja y ultravioleta. De
estas medidas de absorbancia se puede calibrar una escala de
desarrollo de color en términos de nivel de peróxido de
hidrógeno.
Se puede fabricar un instrumento adecuado, tal
como un espectrofotómetro de reflectancia difusa con software
apropiado, para leer automáticamente la reflectancia a ciertos
tiempos, calcular la velocidad de cambio de la reflectancia, y,
usando factores de calibración, obtener los niveles de peróxido de
hidrógeno. Un dispositivo tal 60 se muestra esquemáticamente en la
Fig. 2, con una realización física mostrada en las Fig. 3 y 4. Al
menos una fuente de luz 5, por ejemplo, un diodo emisor de luz (LED)
de alta intensidad, proyecta un rayo de luz sobre la almohadilla 11.
Una porción sustancial de esta luz (al menos 25%, preferiblemente al
menos 35% y más preferiblemente al menos 50%, en ausencia del
producto de reacción) se refleja de forma difusa de la almohadilla
de reactivo y se detecta con un detector de luz 6, por ejemplo un
fototransmisor que produce una corriente de salida proporcional a la
luz que recibe.
La fuente de luz 5 y/o el detector 6 se pueden
adaptar para generar o responder, si se desea, a una luz de longitud
de onda particular. La salida del detector 6 pasa a un amplificador
7, por ejemplo, un circuito integrado lineal que convierte la
corriente del fototransmisor en un voltaje. La salida del
amplificador 7 puede alimentarse a un circuito de muestreo y
retención 8. Éste es una combinación de circuito integrado
lineal/digital que muestrea o sigue el voltaje analógico del
amplificador 7 y, con la orden procedente del microprocesador 20,
cierra o retiene el voltaje al nivel de ese momento.
Un convertidor analógico a digital 19 toma el
voltaje analógico procedente del circuito de muestreo y retención 8
y lo convierte a, por ejemplo, un número digital binario de doce
bits con la orden del microprocesador 20. El microprocesador 20
puede ser un circuito integrado digital. Cumple las siguientes
funciones de control: 1) cronometrar el tiempo para todo el sistema;
2) lectura de la salida del convertidor analógico/digital 19; 3)
junto con el programa y la memoria de datos 21, almacenar los datos
correspondientes a la reflectancia medida a intervalos de tiempo
específicos; 4) calcular los niveles de peróxido de hidrógeno de
las reflectancias almacenadas; y 5) emitir los datos al visualizador
22. La memoria 21 puede ser un circuito integrado digital que
almacena los datos y el programa operativo del microprocesador. El
dispositivo visualizador y generador de informes 22 puede tener
diversos formatos de copia permanente y copia transitoria.
Preferiblemente comprende un indicador visual, tal como un cristal
líquido (LCD) o visualizador LED, pero también puede ser una
impresora de cinta, señal audible, o similar. Si se desea, el
instrumento también puede incluir un interruptor de
arranque-parada y puede proporcionar una salida de
tiempos audible o visible para indicar los tiempos para aplicar las
muestras, hacer lecturas, etc.
En la presente invención, el propio circuito de
reflectancia se puede usar para iniciar el cronometraje midiendo la
disminución de la reflectancia que tiene lugar cuando la porción
acuosa de la disolución de suspensión aplicada a la almohadilla de
reactivos 11 migra a la superficie en la que se mide la
reflectancia. Típicamente, el dispositivo de medida se enciende en
el modo "listo" en el que las lecturas de reflectancia se hacen
automáticamente a intervalos estrechamente espaciados (típicamente
aproximadamente cada 0,2 segundos) de la tira reactiva sin
reaccionar, típicamente blanca grisácea, sustancialmente seca.
Típicamente, la medida inicial se hace antes de penetrar la matriz
con el fluido hidratante pero se puede hacer después de que el
fluido se haya aplicado en un lugar del elemento reactivo distinto a
donde se ha de medir la reflectancia. El valor de reflectancia se
evalúa por el microprocesador, típicamente mediante valores
sucesivos almacenados en memoria y después comparando cada valor con
el valor inicial sin reaccionar. Cuando la disolución acuosa penetra
la matriz reactiva, la disminución en la reflectancia señala el
comienzo de la medida del intervalo de tiempo. Se pueden usar las
disminuciones de reflectancia de 5-50% para iniciar
el cronometraje, típicamente una disminución de aproximadamente 10%.
De esta forma simple hay una sincronización exacta entre el medio de
ensayo que alcanza la superficie en la que se toman las medidas y la
iniciación de la secuencia de lecturas, sin requerimientos de
actividad por el usuario.
Como puede verse adicionalmente en las Fig. 3 y
4, si se desea, la tira reactiva 10 se puede guiar óptimamente en
una ranura 50 en la máquina de barrido 60 colocando una muesca 15 en
el indicador 10 en aproximadamente el punto medio de su borde
superior. Moviendo la muesca 15 contra el poste 65, el indicador 10
pivotará alrededor del poste 65 en la ranura 15, de modo que sus
bordes 16 encajarán en los lados 55 de la ranura 50. Por supuesto,
esto también alineará repetitivamente el agujero 14 sobre un centro
de ensayo 80 que comprende al menos un LED 5 en la máquina de
barrido 60. Esto asegura que el agujero 14 que contiene una muestra
tendrá una dosis uniforme de luz incidente para el análisis.
Preferiblemente se coloca sobre los sistemas
ópticos una tapa u otra cubierta retirable 90 para proteger la
unidad de la luz ambiente. Aunque el procedimiento de inicialización
puede comenzar con luz, la luz solar directa o la luz ambiente de
alta intensidad tiende a inhibir los resultados. La tapa 90 no
necesita ser hermética a la luz, es suficiente con que simplemente
proteja la almohadilla 11 de la luz directa.
La secuencia de medida se inicia después
presionando un botón en el aparato de medida que activa el
microcomputador para tomar una medida de la luz reflejada de la
almohadilla reactiva sin reaccionar, llamada una lectura R_{w}. Se
retira después la tapa 90 y se aplica una disolución hidratante al
indicador 10, típicamente mientras se registra la tira reactiva 10
con los sistemas ópticos y el dispositivo de lectura. Como se
describió anteriormente, la disolución hidratante puede contener
algunos o todos los reactivos, o los reactivos se pueden incorporar
en la almohadilla 11 haciendo uso de agua desionizada como agente
hidratante. Se prefiere que la tira reactiva se mantenga siendo
registrada por los sistemas ópticos con el fin de minimizar la
manipulación. Después se cierra la tapa 90.
Se puede hacer una evaluación particularmente
precisa del nivel de peróxido de hidrógeno usando la corriente de
fondo, es decir, la corriente procedente del fotodetector con la
energía conectada pero sin luz reflejada procedente de la
almohadilla reactiva, con el fin de hacer una corrección de
fondo.
Sin embargo, con una ligera modificación del
procedimiento este valor se puede medir (o normalizar) con cada
análisis para resultados más precisos. Cada LED se enciende antes de
la hidratación de la almohadilla 11. Se mide después un valor de
reflectancia del indicador 10, con la tapa protectora de luz 90
cerrada. Si esta medida es diferente de la medida original del valor
de reflectancia, se aumenta la potencia al LED de manera que la
reflectancia será la misma. La razón para instituir este método es
doble. Primero, la intensidad de la luz que emiten los diodos
variará en gran medida de LED a LED, incluso cuando el LED de medida
es nuevo. Segundo, la eficacia del LED variará tanto con la
temperatura como con la vida del LED. Con este método, los
resultados son repetitivos en la misma
escala.
escala.
Los datos brutos necesarios para calcular un
resultado en un ensayo de peróxido de hidrógeno son una corriente de
fondo presentada como una reflectancia de fondo R_{b}, como se
describió anteriormente; una lectura del indicador sin tratar 10,
R_{w}, que es aproximadamente 95% opaco a la luz y también se
describió anteriormente; y una medida del punto final, R_{f}.
Usando las realizaciones preferidas descritas en la presente
memoria, el punto final no es particularmente estable y debe ser
cronometrado de forma precisa desde la hidratación. La medida del
punto final, R_{f}, depende del tiempo desde la hidratación. Se
requieren curvas de calibración diferentes con tiempos de
hidratación diferentes. Los resultados experimentales indican que
una lectura de reflectancia a los 30 segundos, R_{30}, es adecuada
para determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno en la
almohadilla 11. Una vez se determina el tiempo y se establece la
calibración, el medidor descrito en la presente memoria lleva a cabo
la medida automáticamente en el tiempo predeterminado.
Los datos brutos se usan para calcular los
parámetros proporcionales a la integración del peróxido de hidrógeno
que se puede visualizar más fácilmente que las medidas de
reflectancia. Se puede usar si se desea una transformación
logarítmica de la reflectancia análoga a la relación entre la
absorbancia y la exposición integrada de peróxido de hidrógeno
observada en espectroscopía de transmisión (Ley de Beer). Ha probado
ser particularmente útil una simplificación de las ecuaciones de
Kubelka-Monk, derivadas específicamente para la
espectroscopía de reflectancia. En esta derivación K/S se relaciona
a la exposición integrada de peróxido de hidrógeno con K/S definido
por la
Ecuación 1.
Ecuación 1.
(1)(K/S)_{t} \ = \
(1-R \text{*})^{2} / (2 \ x \ R
\text{*})
R* es la reflectancia tomada en un punto temporal
final particular t, y es la fracción absorbida del rayo de luz
incidente descrito por la Ecuación 2, en la que R_{t} es la
reflectancia en el punto final, R_{30}.
(2)R \text{*}
\ = \ (R_{t} \ - \ R_{b}) \ / \ (R_{w} \ - \
R_{b})
R* varía desde 0 para luz no reflejada (Rb) a 1
para luz totalmente reflejada (Rw). El uso de la reflectividad en
los cálculos simplifica en gran medida el diseño del medidor porque
hacen innecesarios una fuente y un circuito de detección sumamente
estables, ya que estos componente se monitorizan con cada medida de
R_{w} y R_{b}.
Para una lectura a una sola longitud de onda, K/S
se puede calcular a los 30 segundos, (K/S)_{30}. Las curvas
de calibración que relacionan estos parámetros con las medidas de la
exposición integrada de peróxido de hidrógeno (HPIE) se pueden
describir de manera precisa por la ecuación polinómica de tercer
orden esbozada en la Ecuación
3.
3.
(3)HPIE \ = \
a0 \ + \ a1(K/S) \ + \ a2(K/S)^{2} \ + \
a3(K/S)^{3}
La Tabla 1 muestra la reflectancia de fondo,
R_{b}, la reflectancia del indicador sin reaccionar, R_{w}, la
reflectancia del punto final medido después de 30 segundos,
R_{30}, la reflectividad a los 30 segundos , R*, y la derivada K/S
a los 30 segundos, (K/S)_{30}, con diversas cantidades de
peróxido de hidrógeno añadido a la almohadilla 11. La Figura 5
muestra el K/S a los 30 segundos frente a la curva de calibración de
peróxido de hidrógeno con los coeficientes a0, a1, a2 y a3 iguales a
-21,567, 11,966, 12,78 y 0,1391 respectivamente.
El sistema 60 incorpora dos diodos 5. Si los
diodos 5 se seleccionan para emitir luz a diferentes longitudes de
onda, se pueden cancelar matemáticamente las interferencias en la
medida de la muestra. Esto está descrito de manera más elaborada en
la patente de EE.UU. número 5.304.468.
La invención que se ha descrito ahora de forma
general, se entenderá mejor por referencia a los siguientes ejemplos
específicos que se presentan sólo con propósitos de ilustración y
que no se han de considerar limitantes de la invención a no ser que
así se especifique.
Se procesaron tiras reactivas de la marca ONE
TOUCH™ para ensayo de glucosa en sangre en el esterilizador STERRAD®
de peróxido de hidrógeno en fase vapor/plasma de gas para intentar
cuantificar la exposición integrada del peróxido de hidrógeno
(H_{2}O_{2}) difundido en un paquete de ensayo. Estos paquetes
de ensayo comprenden dispositivos que tienen un espacio interior que
comunica fluidamente con el exterior del paquete de ensayo a través
de una restricción de difusión tal como un camino tortuoso que
simula la dificultad en difundir un vapor estéril en los
dispositivos reales. El paquete de ensayo usado para este estudio es
similar al paquete de ensayo de esterilización de la patente de
diseño de EE.UU. 325.442. La tira reactiva ONE TOUCH™ envuelta en
TYVEK/MYLAR que contenía el colorante (MBTH y DMAB) y la enzima
(peroxidasa) se colocó en el compartimiento central del paquete de
ensayo. Se colocaron en la cámara con el paquete de ensayo dos
cargas hospitalarias simuladas con dispositivos metálicos y
plásticos representativos. Todas las tiras se evaluaron a ciclos de
25 minutos de difusión y 15 minutos de plasma con diferentes
volúmenes de inyección de H_{2}O_{2} del 59%. Después de cada
procedimiento, la tira reactiva se retiró del paquete de ensayo y se
hidrató con agua que contenía aproximadamente 17% de cola blanca
marca ELMER (una emulsión de resina de acetato de polivinilo). La
lectura se tomó 30 segundos después de la etapa de hidratación. La
cola se usa como un agente espesante para que el líquido no se
extienda sobre la tira reactiva. Como se muestra en la figura 6, se
observó que las tiras reactivas estándar de la marca ONE TOUCH™ para
glucosa en sangre pueden ser demasiado sensibles para ciertos
volúmenes de peróxido inyectado. Con inyección de peróxido menor que
1250 \mul, el colorante indicador que reviste las tiras reactivas
ONE TOUCH™ reacciona con el peróxido de hidrógeno para formar un
color azul con la ayuda enzimática de peroxidasa después de la
hidratación. Con altos volúmenes de inyección de H_{2}O_{2} del
59% (> 1.250 \mul), las tiras reactivas de la marca ONE TOUCH™
experimentaron un "blanqueamiento" del reactivo que las
revisten. Se llevaron a cabo después estudios para identificar este
fenómeno de "blanqueamiento", y para diseñar una disolución más
apropiada.
Para evaluar si el mecanismo de blanqueo era una
variable dependiente de la cantidad de colorante presente, se
ensayaron tiras reactivas con doble cantidad de colorante indicador.
Con bajos volúmenes de inyección de H_{2}O_{2} del 59% (<
1.250 \mul), estas nuevas tiras reactivas produjeron
aproximadamente el doble de cambio de color que las tiras reactivas
normales (Véase la Fig. 6). Sin embargo, a niveles de peróxido de
hidrógeno más elevados, la formación de color se paró. Se observó un
punto de corte definido. Esta degradación del colorante puede
indicar otro mecanismo de desactivación entre el peróxido de
hidrógeno y los reactivos. Sin embargo, la incapacidad para leer las
tiras reactivas procesadas fue debida a insuficiente colorante
indicador.
También se evaluó la velocidad de reacción de las
tiras reactivas procesadas. Las tiras reactivas se emplearon en
ciclos medios (como en el ejemplo 1) variando los volúmenes de
inyección; y después se leyeron con un programa de medida y captura.
Como se muestra en la figura 7, se observó claramente que conforme
aumenta la exposición integrada de peróxido de hidrógeno, disminuye
la velocidad de reacción; y el mecanismo se interrumpió
completamente con 2.500 \mul de H_{2}O_{2} del 59%.
Aparentemente, con altos volúmenes de inyección de peróxido de
hidrógeno, uno de los ingredientes de las tiras reactivas debe
desaparecer, inhibirse o desactivarse durante el procedimiento con
peróxido de hidrógeno/plasma de gas. A bajos niveles de inyección de
peróxido de hidrógeno (250 \mul y 500 \mul), quedan en la tira
reactiva todavía suficiente colorante y enzima para producir el
color azul. Cuando se introdujo más peróxido de hidrógeno en la
cámara (750 \mul, 1.000 \mul y 1.500 \mul), tardó más tiempo
en producirse el color azul. Esto indica que la reducción tanto del
colorante como de la enzima disminuye el mecanismo que produce el
color azul. Cuando se inyectó en la cámara 2.500 \mul de peróxido
de hidrógeno del 59%, no se pudo producir color azul. Aparentemente,
el colorante o la enzima deben desaparecer, inhibir o desactivar en
un grado en el que no se puede formar el compuesto azul. Como se
muestra en el ejemplo 2, aumentando el nivel de colorante no mejoró
la aparición de color a altos volúmenes de inyección. Este fenómeno
apunta a la desaparición, desactivación o inhibición de la enzima
por los altos niveles de peróxido de hidrógeno.
SE colocaron diez tiras reactivas ONE TOUCH™
envueltas en TYVEX/MYLAR en diez paquetes de ensayo. Para maximizar
el efecto del procedimiento de peróxido de hidrógeno/plasma de gas,
el ciclo se llevó a cabo sin la carga simulada y se procesó con 50
minutos de difusión y 15 minutos de ciclo de plasma mediante el
esterilizador marca STERRAD de peróxido de hidrógeno/plasma de gas
con una inyección de 2.500 \mul de H_{2}O_{2} del 59%, y se
sometieron diez muestras sin procesar a un análisis por
duplicado.
Análisis uno
La cantidad de cada uno de los dos componentes
del colorante (MBTH y DMAB) se determinaron por HPLC (Cromatografía
líquida de alta resolución) en las tiras reactivas de ensayo marca
ONE TOUCH™ tratadas (2.500 \mul) y no tratadas (Tabla 2). Ambos
componentes del colorante se habían reducido aproximadamente 25% en
las tiras reactivas procesadas. Sin embargo, sobre la base de datos
anteriores esta reducción no debería tener un impacto significativo
sobre el desarrollo del color en las tiras reactivas. Parecía haber
suficiente colorante para desarrollar las tiras reactivas tratadas
al nivel dado de peróxido de hidrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Nótese que los niveles de DMAB y MBTH son áreas
de los picos relativos al patrón interno.
Análisis dos
El nivel de peroxidasa en las tiras reactivas se
analizó usando COBAS, un analizador de enzimas fabricado por Roche
Diagnostics Corporation, Indianápolis, IN. El nivel de peroxidasa se
vio afectado dramáticamente en las tiras reactivas tratadas (Tabla
3). La actividad de la peroxidasa se redujo 96,2%. Esta reducción en
la actividad de la peroxidasa significaría que la alta exposición
integrada del peróxido de hidrógeno desactiva (elimina) suficiente
enzima como para impedir el desarrollo del color azul.
Se llevaron a cabo ensayos procesando tiras
reactivas de la marca ONE TOUCH™ a cuatro volúmenes de inyección
(1.250, 1.450, 1.800 y 2.500 \mul) en el esterilizador. Se
evaluaron seis tiras reactivas por ciclo. La carga y las condiciones
del ensayo fueron las mismas que en el ejemplo 1. Se desarrollaron
dos tiras reactivas inmediatamente después de completarse el ciclo:
una con DI H_{2}O (agua desionizada) y otra con disolución de
peroxidasa (0,03% en peso). A baja exposición integrada de peróxido
de hidrógeno, ambas disoluciones desarrollaron las tiras reactivas
(véase la Tabla 4). A mayor exposición integrada de peróxido de
hidrógeno (>1.500 \mul), no se observó cambio de color en las
tiras reactivas tratadas cuando se hidrató con DI H_{2}O (toda la
peroxidasa se desactivó). Sin embargo, se formó instantáneamente un
color azul oscuro en las mismas tiras reactivas sin tratar cuando se
hidrataron con disolución de peroxidasa. Este experimento confirmó
que altos niveles de peróxido de hidrógeno desactivan la
peroxidasa.
Con el fin de entender el efecto del tiempo en
las tiras reactivas tratadas, se analizaron dos tiras reactivas a
las 24 horas y dos a las 48 horas. No hubo cambio de color en
ninguna de las tiras reactivas desarrolladas con DI H_{2}O. Pero
todas las tiras tratadas se volvieron azul oscuro en un instante
cuando se desarrollaron con disolución de peroxidasa. Esto sugiere
que con el tiempo el peróxido de hidrógeno continúa eliminando la
peroxidasa activa de las tiras reactivas, y que el peróxido de
hidrógeno es estable en las tiras reactivas al menos durante 48
horas después de completarse el ciclo.
Comentarios:
- \bullet
- Los tres primeros volúmenes de inyección a los 5 min de ensayo cambiaron de blanco a algo de tonalidad azul. Sin embargo, las tiras reactivas desarrolladas con peroxidasa cambiaron a un color azul mucho más oscuro.
- \bullet
- La velocidad de reacción para las tiras reactivas desarrolladas con peroxidasa es más rápida que con DI H_{2}O.
- \bullet
- Con altos volúmenes de inyección (2.500 \mul) las tiras reactivas no se pueden desarrollar con DI H_{2}O. Se desactiva toda la peroxidasa.
- \bullet
- El peróxido continúa eliminando a la enzima peroxidasa con el tiempo. Volúmenes de inyección más bajos (1.250 \mul, 1.440 \mul, y 1.800 \mul) no se desarrollaron con agua (no cambio de color) a las 24 y 48 horas, al contrario que después de 5 min.
- \bullet
- El peróxido no abandona la superficie de nylon de las tiras reactivas con el tiempo. Las tiras reactivas se desarrollaron con peroxidasa hasta 48 horas después del ensayo.
Se llevó a cabo también otro ensayo para medir la
velocidad de reacción en las tiras no tratadas. Se evaluaron tres
volúmenes de inyección (500, 1.450, y 2.500 \mul); dos tiras por
ciclo. Se observó que a volúmenes de inyección más bajos las tiras
reactivas que se desarrollaron con disolución de peroxidasa fueron
significativamente más rápidas que las tiras reactivas tratadas con
volúmenes de inyección mayores. Se cree que la peroxidasa remanente
en las tiras reactivas cuando se trataron con bajo nivel de peróxido
de hidrógeno potenció el desarrollo del color. La tira tratada con
alta exposición integrada de peróxido de hidrógeno sólo se puede
desarrollar con la adición de disolución de peroxidasa debido a la
desactivación de la peroxidasa en la tira reactiva durante el
procedimiento con peróxido de hidrógeno/plasma de gas.
Parece que la desactivación de la peroxidasa a
alta exposición integrada de peróxido de hidrógeno impide la
reacción de copulación del colorante en el sistema de
esterilización. Entendiendo el mecanismo real de la reacción, se
pueden hacer modificaciones a las tiras reactivas y al medidor marca
ONE TOUCH™ para obtener una lectura cuantitativa de peróxido de
hidrógeno presente en cualquier área de la cámara. El colorante y la
enzima pueden estar en la tira reactiva antes o añadirla después del
procedimiento con peróxido de hidrógeno o con peróxido de
hidrógeno/plasma de gas. La tira reactiva se puede usar para
determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno en la disolución
acuosa de peróxido de hidrógeno o en el procedimiento de peróxido de
hidrógeno en fase vapor. Para el procedimiento de peróxido de
hidrógeno en fase vapor o el procedimiento de peróxido de
hidrógeno/plasma de gas, se necesita hidratar la tira reactiva
después del procedimiento para iniciar el cambio de color. La
disolución de hidratación puede comprender al agente espesante para
evitar que el líquido se extienda en el sustrato. El agente
espesante puede comprender goma blanca o cualquier otro producto
químico que aumente la viscosidad de la disolución pero que no
interfiera la reacción química o la lectura de la reflectancia.
La invención que ahora ha sido descrita en su
totalidad, será evidente a un experto normal en la técnica que se le
pueden hacer muchas modificaciones y cambios sin salirse del alcance
de la invención como se define en las siguientes
reivindicaciones.
Claims (19)
1. Un método para detectar la exposición
integrada del peróxido de hidrógeno en una atmósfera, comprendiendo
el método las etapas de:
colocar un sustrato capaz de absorber peróxido de
hidrógeno en la atmósfera;
poner en contacto el sustrato con el peróxido de
hidrógeno;
leer el peróxido de hidrógeno con un colorante
intermedio y una enzima para producir un cromóforo indicativo de la
exposición integrada de peróxido de hidrógeno en la atmósfera; y
correlacionar el cromóforo con la exposición
integrada de peróxido de hidrógeno en la atmósfera.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que
el colorante intermedio comprende una pareja de colorantes de
hidrocloruro de la hidrazona de
3-metil-2-benzotiazolinona
(MBTH) y ácido 3-dimetilaminobenzoico (DMAB).
3. Un método según la reivindicación 1, en el que
la enzima es peroxidasa.
4. Un método según la reivindicación 1, en el que
el colorante intermedio comprende un aceptor de oxígeno.
5. Un método según la reivindicación 4, en el que
el aceptor de oxígeno se selecciona entre el grupo compuesto
por:
o-dianisidina;
o-toluidina;
o-tolidina;
bencidina;
ácido
2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)
hidrazona del
3-metil-2-benzotiazolinona
más N,N-dimetilanilina;
fenilo más 4-aminofenazona;
2,4-dicloro-fenol
sulfonado más 4-aminofenazona;
hidrazona del
3-metil-2-benzotiazolinona
más ácido 3-(dimetilamino)benzoico;
2-metoxi-4-alil
fenol; y
4-aminoantipireno-dimetilanilina
6. Un método según la reivindicación 1, en el que
el sustrato es un receptor poroso.
7. Un método según la reivindicación 1, en el que
la etapa de correlacionar el cromóforo con la exposición integrada
de peróxido de hidrógeno en la atmósfera comprende leer el cromóforo
con un espectrofotómetro.
8. Un método según la reivindicación 1, en el que
la etapa de correlacionar el cromóforo con la exposición integrada
de peróxido de hidrógeno en la atmósfera comprende comparar el
cromóforo con una carta de colores.
9. Un método según la reivindicación 1, en el que
el colorante intermedio está en el sustrato antes de poner en
contacto el sustrato con el peróxido de hidrógeno.
10. Un método según la reivindicación 1, en el
que el colorante intermedio se añade al sustrato después de poner en
contacto el sustrato con el peróxido de hidrógeno.
11. Un método según la reivindicación 1, en el
que el colorante intermedio tiene un primer color.
12. Un método según la reivindicación 1, en el
que el cromóforo es la aparición de un segundo color.
13. Un método según la reivindicación 1, en el
que el cromóforo es la desaparición del primer color.
\newpage
14. Un método según la reivindicación 1, que
adicionalmente comprende eliminar el aire de la atmósfera y generar
vapor de peróxido de hidrógeno en la atmósfera.
15. Un método según la reivindicación 1, en el
que la enzima está en el sustrato antes de poner en contacto el
sustrato con el peróxido de hidrógeno.
16. Un método según la reivindicación 1, en el
que la enzima se añade al sustrato después de poner en contacto el
sustrato con el peróxido de hidrógeno.
17. Un método según la reivindicación 1, que
adicionalmente comprende hidratar en el sustrato.
18. Un método según la reivindicación 1, que
adicionalmente comprende añadir el agente espesante al sustrato.
19. Un método según la reivindicación 19, en el
que el agente espesante comprende goma blanca.
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