ES2230729T3 - Vacunas que contienen bacterias atenuadas. - Google Patents
Vacunas que contienen bacterias atenuadas.Info
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Abstract
Una vacuna que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y una bacteria atenuada mediante mutación no reversible en un gen que codifica una proteína que promueve el plegamiento de proteínas extracitoplásmicas.
Description
Vacunas que contienen bacterias atenuadas.
La invención trata de vacunas que contienen
bacterias atenuadas.
El principio de la vacunación es inducir una
respuesta inmune en el hospedador, de manera que proporciona
protección frente a una posterior estimulación con un patógeno. Esto
se puede conseguir con una cepa viva atenuada del patógeno (es
decir, una cepa que tiene virulencia reducida de modo que no causa
la enfermedad que causa el patógeno virulento).
Clásicamente, las vacunas de cepas vivas
atenuadas de bacterias y virus, se han seleccionado usando una de
las dos metodologías diferentes. Los mutantes se han creado bien por
tratamiento del organismo usando compuestos químicos mutagénicos o
por pases repetidos del organismo in vitro. Sin embargo, el
uso de cualquier método produce un aumento de las cepas atenuadas en
las que el modo de atenuación no está claro. Estas cepas son
particularmente difíciles de caracterizar en términos de posible
reversión a la cepa de tipo silvestre ya que la atenuación puede
reflejar resultantes de mutación individual (fácilmente reversible)
o múltiple.
Usando las técnicas genéticas modernas, ahora es
posible construir genéticamente cepas de bacterias atenuadas
definidas en las que pueden crearse deleciones atenuantes estables.
Varios mutantes de sitio dirigidos de Salmonella se han creado
usando este tipo de tecnología (2, 5, 6, 12, 22, 35, 36, 37). Entre
las lesiones atenuantes más estudiadas de forma exhaustiva están
aquellas en las que se han creado mutaciones en las rutas
biosintéticas, lo que se traduce en bacterias auxótrofas (por
ejemplo los genes aro). Las mutaciones en estos genes se
describieron por primera vez en 1950 (1) como las responsables de
volver a Salmonella menos virulenta para ratones. Varias mutaciones
auxótrofas diferentes tales como galE, aroA o purA
también se han descrito previamente (6, 12). Mutantes de Salmonella
aroA ahora han sido bien caracterizadas y han mostrado ser
excelentes vacunas vivas contra la salmonelosis en varias especies
animales. Además, para reducir las oportunidades de reversión a la
virulencia por una recombinación de mutaciones resultantes, ahora se
han introducido en dos genes independientes tales como
aroA/purA y aroA/aroC. También se han dado mutaciones
idénticas en cepas de Salmonella adaptadas al hospedador tales como
S. typhi (humanos) y S. dublin (ganado vacuno) como
resultado de la creación de varias vacunas de dosis única que se han
probado con éxito en pruebas clínicas (11, 17) y prácticas (15).
En estudios animales, se han usado S.
typhimurium atenuadas como vehículo para la liberación de
antígenos heterólogos para el sistema inmune (3, 8, 32). Esto
aumenta el potencial de desarrollo de vacunas multivalentes para
su uso en el hombre (9).
El propósito original del trabajo que condujo a
la invención fue la identificación de nuevos genes que están
implicados en las rutas de virulencia de las bacterias patógenas,
la identificación y deleción de aquellos que pueden volver a la
bacteria no virulenta y apropiada para su uso como vacunas. Para
identificar las lesiones atenuantes, se introdujeron mutaciones al
azar en el cromosoma de S. thyphimurium usando el transposón
TnphoA (18). Este transposón es único en el sentido de que
está manipulado para identificar proteínas que se expresan en o
hacia la membrana exterior bacteriana; tales proteínas pueden estar
implicadas en la interacción con y la captación por los tejidos del
hospedador. Mediante el uso de la ruta oral natural de infección
para investigar estos mutantes, se identificaron aquellos con
lesiones importantes, inducidas in vivo, y atenuantes en
genes.
Uno de tales genes identificado a través de este
trabajo es surA. Se sabe que el producto del gen surA
promueve el plegamiento de proteínas extracitoplásmicas. De acuerdo
con esto, la invención proporciona una vacuna que comprende un
vehículo o diluyente y una bacteria atenuada por una mutación no
reversible en un gen que codifica una proteína que promueve en
plegamiento de proteínas extracitoplásmicas. La vacuna tiene la
capacidad de proporcionar protección frente a una estimulación oral
de tipo homólogo al silvestre con la bacteria virulenta. Además, la
bacteria usada en la vacuna puede comportarse como vehículo para
antígenos heterólogos tales como el fragmento C de la toxina del
tétanos.
Las proteínas de las membranas periplásmica y
externa se secretan a través de la membrana citoplasmática (interna)
en un estado desplegado en su mayor parte, y después se pliegan tras
la secreción. El plegamiento a menudo tiene ayuda enzimática para
catalizar la formación de los enlaces necesarios para que la
proteína alcance su estado plegado. Por ejemplo, el plegamiento a
menudo requiere la participación de enzimas que catalizan la
formación de enlaces disulfuro o enzimas que catalizan la
isomerización de los enlaces prolilo
(peptidil-prolil cis-trans
isomerasas o
PPiasas).
PPiasas).
Una PPiasa conocida es SurA. Ahora se ha mostrado
que una mutación del gen surA causa atenuación de la bacteria
virulenta y que las bacterias atenuadas son útiles como vacunas.
SurA se describió en principio como esencial para
la supervivencia de E. coli en la fase estacionaria (33). Es
una proteína periplásmica. Más recientemente, SurA se ha descrito
como una tercera y nueva familia de PPiasas (30), la familia de las
parvulinas. Estudios adicionales han mostrado que SurA está
implicada en el plegamiento correcto de proteínas de la membrana
exterior tales como OmpA, OmpF, y LamB (16, 24, 29).
Las PPiasas están divididas en tres familias, las
ciclofilinas, las proteínas de unión FK506 (FKBP) y las parvulinas.
Todos los miembros de las tres familias se han encontrado en E.
coli. A parte de SurA, la familia de las parvulinas incluye
varias proteínas tales como NifM, PrsA y PrtM.
Las bacterias que se han usado para hacer las
vacunas de la invención son generalmente aquellas que infectan
mediante la ruta oral. Las bacterias pueden ser aquellas que invaden
y crecen en células eucarióticas y/o colonizan superficies de la
mucosa. Las bacterias son generalmente
Gram-negativas.
Las bacterias pueden ser del género Salmonella,
Escherichia, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella o
Brucella. Ejemplos de tales bacterias son Salmonela
typhimurium - la causa de la salmonelosis en varias especies
animales; Salmonella typhi - la causa de la fiebre tifoidea
humana; Salmonella enteritidis - la causa de la intoxicación
alimentaria en humanos; Salmonella choleraesuis - una causa
de la salmonelosis en cerdos; Salmonella dublin - una causa
de ambas enfermedades diarreica y sistémica en ganado,
especialmente en terneros recién nacidos; Escherichia coli -
una causa de la diarrea y la intoxicación alimentaria en humanos;
Haemophilus influenzae - una causa de la meningitis;
Neisseria gonorrhoeae - una causa de la gonorrea;
Yersinia enterocolitica - la causa de un intervalo de
enfermedades que abarca desde la gastroenteritis hasta la
enfermedad septicémica mortal; Bordetella pertussis - la
causa de la tos ferina; o Brucella abortus - una causa del
aborto y la infertilidad en ganado y una enfermedad conocida como
brucelosis en humanos.
Las bacterias de Salmonella son particularmente
útiles en la invención. Así como son vacunas en sí mismas, buenas
contra la infección por Salmonella, se pueden usar bacterias de
Salmonella atenuadas como vehículos de antígenos heterólogos de
otros organismos para el sistema inmune mediante la ruta oral. Las
bacterias de Salmonella son potentes inmunógenos que son capaces de
estimular respuestas celulares locales y sistémicas. Se conocen los
sistemas para dirigir la expresión de antígenos heterólogos en
Salmonella in vivo; por ejemplo, se sabe que los promotores
de nirB y htrA son eficaces para dirigir la expresión
de antígenos in vivo.
La invención es también particularmente aplicable
a E. coli, especialmente a E. coli enterotoxigénico
("ETEC"). ETEC es una clase de E. coli que causa
diarrea. Colonizan el intestino delgado proximal. Una cepa estándar
ETEC es ATCC H10407.
Las infecciones de ETEC son la causa más
frecuente y única de la diarrea de los viajeros, que causan
3-9 millones de casos por año entre los visitantes
de países en desarrollo. En áreas endémicas, las infecciones de ETEC
son una causa importante de la diarrea deshidratante de niños y
jóvenes, que da como resultado 800.000 muertes al año en los menores
de 5 años del mundo. En países en desarrollo, la incidencia de las
infecciones de ETEC lleva a una disminución de las enfermedades
clínicas con la edad, lo que indica que la inmunidad frente a
infecciones de ETEC se puede adquirir. En contraste, los adultos
ingenuos de países industrializados que visitan áreas endémicas son
altamente susceptibles a las infecciones de ETEC. Sin embargo, con
visitas prolongadas o repetidas a las áreas endémicas, disminuye la
susceptibilidad a infecciones de ETEC, lo que sugiere que se puede
probar con éxito una propuesta de vida atenuada para vacunación de
ETEC.
La Sec. Id. Nº 1 muestra la secuencia del tramo
de lectura abierta surA en Salmonella typhimurium, y
la Sec. Id. Nº 2 muestra la secuencia del tramo de lectura abierta
de surA en E. coli.
Las bacterias usadas en la invención contienen
preferiblemente una mutación en uno o más genes además de la
mutación en el gen que codifica una proteína que promueve el
plegamiento de proteínas extracitoplásmicas. Esto es para minimizar
el riesgo de que la bacteria revierta al estado de virulencia, que
es claramente importante para el uso de la bacteria como vacuna
humana o animal. Aunque se atenúan las bacterias que contienen sólo
una mutación en una proteína que promueve el plegamiento de
proteínas extracitoplásmicas y el riesgo de reversión es pequeño,
generalmente será deseable introducir al menos una mutación
adicional para reducir el riesgo de atenuación aún más.
Se conocen varios genes que son candidatos para
mutaciones secundarias y adicionales (véase por ejemplo ref. 39).
Estos incluyen los genes aro (35), los genes pur, el
gen htrA (37), el gen ompR (36), el gen galE,
el gen cya, el gen crp o el gen phoP. El gen
aro puede ser aroA, aroC, aroD o
aroE. El gen pur puede ser purA, purB,
purE o purH. El uso de mutantes aro,
especialmente los mutantes aro dobles, se prefieren porque
tales mutantes han mostrado se particularmente eficaces como
vacunas. Combinaciones apropiadas de mutaciones aro son
aroAaroC, aroAaroD y aroAaroE.
Las mutaciones introducidas en la vacuna
bacteriana generalmente suprimen la función del gen completamente.
Esto se puede conseguir bien mediante supresión de la síntesis de
cualquier polipéptido por completo a partir del gen o bien haciendo
una mutación que da como resultado la síntesis de un polipéptido no
funcional. Para suprimir la síntesis de cualquier polipéptido, bien
se puede delecionar el gen completo o bien su extremo 5'. Una
deleción o inserción en la secuencia codificante de un gen puede
usarse para crear un gen que sintetice sólo polipéptidos no
funcionales (por ejemplo un polipéptido que contiene sólo la
secuencia N-terminal de la proteína de tipo
silvestre). En el caso de mutaciones en genes que codifican
proteínas que promueven el plegamiento de proteínas
extracitoplásmicas, la mutación generalmente suprime la capacidad de
la proteína para promover dicho plegamiento de la proteína.
Las mutaciones son mutaciones no reversibles.
Estas son mutaciones que esencialmente no muestran reversión al tipo
silvestre cuando la bacteria se usa como vacuna. Tales mutaciones
incluyen inserciones y deleciones. Las inserciones y deleciones son
preferiblemente grandes, típicamente de al menos 10 nucleótidos de
longitud, por ejemplo de 10 a 600 nucleótidos.
La bacteria usada en la vacuna contiene
preferiblemente sólo mutaciones definidas, es decir, mutaciones que
están caracterizadas. Es claramente no deseable el uso de una
bacteria que tiene mutaciones no caracterizadas en su genoma como
una vacuna porque puede ser un riesgo ya que las mutaciones no
caracterizadas pueden conferir propiedades a la bacteria que causen
efectos secundarios no deseables.
Las mutaciones atenuantes se pueden construir
mediante métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica
(véase ref. 31). Un medio para introducir mutaciones no reversibles
en proteínas extracitoplásmicas es el uso del transposón
TnphoA. Este puede introducirse en la bacteria para generar
fusiones de proteínas de fosfatasa alcalina enzimáticamente activas
como proteínas extracitoplásmicas. El transposón TnphoA lleva
un gen codificante de la resistencia a kanamicina. Se seleccionan
los transductantes que son resistentes a kanamicina mediante
colonias que crecen en un medio de selección apropiado.
Métodos alternativos incluyen la clonación de
secuencias de ADN de tipo silvestre en un vector, por ejemplo un
plásmido o un cósmido, e inserción de un marcador seleccionable en
la secuencia de ADN clonada o deleción de una parte de la secuencia
de ADN, lo que da como resultado su inactivación. Una deleción se
puede introducir mediante, por ejemplo, el corte de la secuencia de
ADN usando enzimas de restricción que cortan en dos puntos de la
secuencia codificante y ligando juntos los dos extremos de la
secuencia que queda. Un plásmido que lleva la secuencia de ADN
inactivada se puede transformar en una bacteria mediante técnicas
conocidas. Entonces, mediante selección apropiada, es posible
identificar un mutante donde la secuencia de ADN inactivada ha
recombinado en el cromosoma de la bacteria y la secuencia de tipo
silvestre se ha vuelto no funcional en un proceso conocido cono
recombinación homóloga.
La bacteria atenuada usada en la vacuna de la
invención puede manipularse genéticamente para expresar un antígeno
de otro organismo (un "antígeno heterólogo"), de modo que la
bacteria atenuada funcione como un vehículo del antígeno de otro
organismo. En este sentido es posible crear una vacuna que
proporciona protección frente al otro organismo. Se puede producir
una vacuna multivalente que no sólo proporciona inmunidad frente al
precursor virulento de la bacteria atenuada sino que también
proporciona inmunidad frente a otro organismo. Además, la bacteria
atenuada se puede manipular para que exprese más de un antígeno
heterólogo, en cuyo caso los antígenos heterólogos pueden ser de los
mismos o de diferentes organismos.
Los antígenos heterólogos pueden ser una proteína
completa o una parte de una proteína que contiene un epítopo. El
antígeno puede ser de otra bacteria, un virus, una levadura o un
hongo. Más especialmente, la secuencia antigénica puede ser de virus
del tétanos, de la hepatitis A, B o C, de rinovirus de humanos
tales como tipo 2 o tipo 14, del virus de herpes simple, de
poliovirus tipo 2 o 3, de virus de la fiebre aftosa, del virus de
la influenza, del virus coxsakie o de Chlamydia trachomatis.
Los antígenos útiles incluyen la subunidad de la toxina B inestable
al calor de E. coli (LT_B), los antígenos K88 de E.
coli, la proteína P.69 de B. pertusis y el fragmento C
de la toxina del tétanos.
El ADN que codifica el antígeno heterólogo se
expresa a partir de un promotor que es activo in vivo. Dos
buenos promotores son el promotor de nirB (38, 40) y el
promotor de htrA (40).
Una construcción de ADN que comprende el promotor
operable unido al ADN que codifica el antígeno heterólogo puede
hacerse y transformarse en la bacteria atenuada usando técnicas
convencionales. Los transformantes que contienen la construcción de
ADN se pueden seleccionar, por ejemplo, mediante selección de un
marcador seleccionable en la construcción. La bacteria que contiene
la construcción puede hacerse crecer in vitro antes de
formularla para la administración al hospedador con propósitos de
vacunación.
La vacuna se puede formular usando técnicas
conocidas para la formulación de vacunas de bacterias atenuadas. La
vacuna se presenta ventajosamente para administración oral, por
ejemplo en una forma encapsulada liofilizada. Tales cápsulas se
pueden proporcionar con un recubrimiento entérico que comprende, por
ejemplo, Eudragate "S" (Marca Comercial), Eudragate "L"
(Marca Comercial), acetato de celulosa, ftalato de celulosa o
hidroxipropilmetilcelulosa. Estas cápsulas se pueden usar como
tales, o como alternativa, se puede reconstituir el material
liofilizado antes de la administración. La reconstitución se puede
efectuar ventajosamente en un tampón a un pH apropiado para asegurar
la viabilidad de la bacteria. Para proteger la bacteria atenuada y
la vacuna de la acidez gástrica, se administra ventajosamente una
preparación de bicarbonato sódico antes de cada administración de la
vacuna. Como alternativa, la vacuna se puede preparar para
administración parenteral, administración intranasal o
administración intramuscular.
La vacuna se puede usar en la vacunación de un
hospedador, particularmente un hospedador humano pero sólo un
hospedador animal. Por lo tanto una infección causada por un
microorganismo, especialmente un patógeno, se puede prevenir
mediante administración de una dosis eficaz de una vacuna preparada
de acuerdo con la invención. La dosis empleada dependerá de varios
factores que incluyen el tamaño y peso del hospedador y el tipo de
vacuna formulada. Sin embargo, una dosis que comprende la
administración oral de 10^{7} a 10^{11} bacterias por dosis
puede ser conveniente para un hospedador adulto humano de 70 kg.
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la
invención.
Figura 1: Transferencia de Southern que confirma
la deleción creada en surA en la cepa BRD1115. Los carriles 1
y 2 se han restringido usando la enzima PstI, los carriles
3-10 se han restringido con SalI. Los filtros
se han sondeado usando un producto de PCR de 500 pb que contiene un
fragmento de 500 pb del centro del gen surA. Los carriles 2 y
4 muestran hibridación de esta sonda en una banda de 500 pb más
pequeña que la que corresponde a los carriles 1 y 3 de tipo
silvestre. El transposón mutante BRD441 muestra hibridación en 2
bandas ya que la enzima SalI corta el transposón en dos.
HB101 no muestra hibridación mientras que las otras cepas de
Salmonella de tipo silvestre muestran la misma hibridación que C5
cuando se restringen con SalI.
Figura 2: Esta figura muestra la colonización y
persistencia de BRD1115, BRD441 y el C5 de tipo silvestre en los
nódulos linfáticos mesentéricos (gráfica superior izquierda), en las
placas de Peyer (inferior derecha), en los bazos (inferior
izquierda) y los hígados (superior derecha) en ratones BALB/c
después de inoculación oral. El eje x es el tiempo en días y el eje
y es el log_{10} CFU/ml (CFU mide unidades formadoras de
colonias).
Figura 3: Se construyeron 3 cepas para evaluar la
capacidad de cepas mutantes de Salmonella para liberar el antígeno
heterólogo Fragmento C en el ratón. BRD1115 es la cepa precursora.
Se introdujeron dos plásmidos que codifican el gen del Fragmento C
de la toxina del tétanos bajo el control bien del promotor de
htrA o bien del promotor de nirB en la cepa BRD1115
para dar las cepas BRD1127 y 1126 respectivamente. La expresión del
fragmento C se determinó in vitro mediante transferencia de
Western. Estas cepas se usaron después en un experimento in
vivo usando ratones BALB/c. Grupos de 10 ratones se inmunizaron
por vía oral con log_{10}8 organismos de cada una de las 3 cepas.
Se tomaron semanalmente muestras de suero y se analizaron para
anticuerpos totales frente al fragmento C de la toxina del tétanos.
Se determinó la titulación de anti-fragmento C como
la muestra de mayor dilución que da un valor de absorbancia de 0,3
por encima del suero de ratón normal. La muestra de mayor dilución
que se analizó fue 1/6250. Todos los ratones inmunizados con BRD1126
mostraron títulos de anticuerpo mayores que 6250.
Figura 4: Esquema que muestra un mapa de plásmido
de pLG339/surA.
Figura 5: Gráfico que muestra la supervivencia de
ratones Balb/c después de estimulación oral con log_{10}8
bacterias de las tres cepas C5, BRD1115 y K2.
Este ejemplo muestra la identificación de
mutaciones en surA como mutaciones atenuantes, la
construcción de una mutación surA definida y la evaluación de
una mutación surA como vacuna (ambas frente a estimulaciones
homólogas y como vehículos para antígenos heterólogos).
Las bacterias usadas en este estudio están
enumeradas en la Tabla 1. Las bacterias se cultivaron rutinariamente
en agar-L o caldo-L que contiene 10
\mug/ml de ampicilina o 50 \mug/ml de kanamicina donde
corresponda. El bacteriófago P22HT105/1int es un bacteriófago de
alta frecuencia de transducción obtenido del Dr. Tim Foster (Trinity
College, Dublin). Se diseña el plásmido pGEM-T
(Promega Corporation, EEUU) para clonación directa de fragmentos de
PCR y pBluescriptºII SK+ (Stratagene Ltd, Cambridge, Reino Unido) es
un vector de clonación general. Los otros plásmidos se describen en
el texto.
Toda manipulación de ADN que incluye
transferencia de Southern se llevaron a cabo como lo describe
Sambrook et al (31). Las enzimas de restricción y la ligasa
de ADN T4 se adquirieron de Boerhringer Mannheim (Lewes, Reino
Unido) y se usaron de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes. La preparación del ADN cromosómico se preparó de
acuerdo con el método de Hull (13).
La secuenciación del plásmido de doble cadena se
llevó a cabo usando el equipo Sequenase (Marca Comercial, United
Sates Biochemical Corporation) de acuerdo con las instrucciones de
los fabricantes. El marcaje del ADN se llevó a cabo usando
dATP-^{35}S (Amersham, Reino Unido) y los
fragmentos se separaron en un gel de 8%
acrilamida/bis-acrilamida que contiene 7M urea,
durante 2 horas a 35 mA.
Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR)
se llevaron a cabo con la Taq polimerasa de ADN usando el
equipo GeneAmp (Marca Comercial, Perkin Elmer Cetus, EEUU) de
acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los
oligonucleótidos se adquirieron de la Unidad de Medicina Molecular,
Kings College, Londres y las secuencias se muestran en la Tabla 1.
Las mezclas de ADN y los cebadores específicos se sometieron a
múltiples rondas de desnaturalización, hibridación y extensión en
presencia de la enzima Taq polimerasa. Se añadieron 10 ng de
ADN de plásmido y 1 mg de ADN cromosómico a una mezcla que contiene
5 \mug de tampón 10 x (100 mM Tris-HCl, pH 8,3;
500 mM KCl; 15 mM MgCl_{2}; 0,01% gelatina (v/v)); 8 \mul de
mezcla de desoxinucleótidos (1,25 mM de cada desoxinucleótido
trifosfato; dATP, dCTP, dGTP y dTTP); 1 \mul de un cebador con
sentido 10 \muM; 1 \mul de un cebador antisentido 10 \muM y
2,5 unidades de Taq polimerasa. Esta mezcla se cubre con 50
\mul de aceite mineral ligero (Sigma) para prevenir la evaporación
y los tubos se incuban en un aparato de Ciclo Térmico Omnigene
(Marca Comercial, Hybaid). La amplificación del ADN se llevó a cabo
usando el siguiente programa: 1 ciclo de 95ºC durante 5 minutos,
50ºC durante 1,5 minutos, 74ºC durante 2 minutos; 19 ciclos de 95ºC
durante 1,5 minutos, 50ºC durante 2 minutos, 74ºC durante 3 minutos;
10 ciclos de 95ºC durante 2 minutos, 50ºC durante 2 minutos, 74ºC
durante 7 minutos.
Las bacterias se vuelven competentes a la
aceptación de ADN mediante el método de cloruro de calcio. Se usó un
cultivo bacteriano nocturno para sembrar 25 ml de cultivo en caldo
LB (una dilución 1:100) que creció aeróbicamente con agitación hasta
que las células alcanzaron la mitad de la fase logarítmica de
crecimiento (DO 650 nm = 0,4 a 0,6). Las células se recolectaron
mediante centrifugación a 3000 x g durante 10 minutos a 4ºC. El
sobrenadante se descartó y el precipitado se resuspendió en 25 ml de
CaCl_{2} 75 mM enfriado con hielo. El proceso se repitió y las
células se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las células se
precipitaron mediante centrifugación a 3000 x g durante 10 minutos a
4ºC. El precipitado celular se resuspendió en 1,2 ml de CaCl_{2}
74 mM enfriado con hielo y se guardó en hielo hasta que se necesitó.
Las células eran entonces competentes para la aceptación del ADN. Se
añadió un máximo de 20 \mul de mezcla de ligación a 200 \mul de
las células competentes y la mezcla se guardó en hielo durante 30
minutos. Entonces las células se sometieron a choque por calor
mediante incubación en un baño de agua a 42ºC durante 2 minutos.
Entonces las células se transfirieron de vuelta al hielo durante
otros 2 minutos. Se añadió 1 ml de caldo LB a la mezcla y las
células se incubaron a 37ºC durante al menos 60 minutos para
permitir la expresión del marcador de antibiótico en el plásmido. Se
sembraron alícuotas de células de 100 \mul en placas de agar LB
que contienen los antibióticos apropiados y se incubaron durante la
noche a 37ºC.
Se introdujo el plásmido de ADN en cepas
bacterianas usando electroporación. Se generaron cultivos en la
mitad de la fase logarítmica de crecimiento como para el método de
choque por calor y se hicieron precipitar las células mediante
centrifugación a 3000 x g durante 10 minutos a 4ºC. El precipitado
de células se lavó dos veces con un volumen igual de glicerol 10%
enfriado con hielo y se hicieron precipitar como antes. Se
resuspendió el precipitado de células en 300-500
\mug de glicerol 10% enfriado con hielo. Se añadieron
aproximadamente 100 ng de plásmido (o 1\mug de vector suicida) en
un volumen de agua estéril de no más de 6 \mul a 60 \mul de
células competentes en una cubeta preenfriada en hielo. Se
electroporó el plásmido en la bacteria usando un
Bio-Rad Gene Pulser (Marca Comercial) con las
siguientes condiciones 1,75 kV, 600 \Omega, 25 \muF. Entonces se
añadió 1 ml de caldo LB a los contenidos de la cubeta de
electroporación y la mezcla se incubó a 37ºC durante 90 minutos para
permitir a las células recuperarse. Se sembraron alícuotas de 100
\mul de la mezcla de electroporación en medio de selección y se
incubó a 37ºC durante la noche.
Los experimentos de transducción se llevaron a
cabo usando el bacteriófago P22 HT105/1 int^{-}. Los fagos líticos
se prepararon usando LB5010 como cepa donante. Se hicieron crecer 5
ml de un cultivo nocturno de LB2010 en caldo-L que
contiene glucosa 0,2% y galactosa para incrementar la expresión de
los receptores del fago en la superficie celular. Se hicieron
diluciones en serie de diez veces de la solución madre de P22 en
TMGS hasta 10^{-8} (la solución madre es de aproximadamente
10^{10} pfu/ml). Se añadieron 10 \mul de cada dilución a 100
\mul de la solución madre nocturna de células y se incubaron a
37ºC durante 30-45 minutos para permitir la
adsorción del fago a las células. Se añadieron 3 ml de agar
superior a cada incubación y se extendieron sobre las placas de
agar-L que contienen 100 \mug/ml de ampicilina.
Las placas se incubaron a 37ºC durante aproximadamente
4-5 horas hasta que las placas se hicieron visibles.
La dilución que dio placas casi confluyentes tras este espacio de
tiempo fue la que se escogió en la recolección. Las placas se
recolectaron mediante retirada del agar superior en 2 ml de tampón
de fago con un portaobjetos de vidrio de microscopio. Se añadieron
unas pocas gotas de cloroformo y la solución madre del fago se
guardó a 4ºC hasta que se necesitó. Se hizo crecer la cepa receptora
C5 durante el día en caldo-L a 37ºC hasta el final
de la fase logarítmica/estacionaria. Se añadieron alícuotas de 1
\mul, 5 \mul, 10 \mul, 20 \mul y 50 \mul de la nueva
solución madre del fago a alícuotas de 100 \mul de la cepa
receptora y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Entonces las células
se sembraron en placas de agar-L y ampicilina que
contienen EGTA 5mM (para prevenir la replicación del fago) y se
incubaron a 37ºC durante la noche. Las colonias se volvieron a
sembrar 3 veces en placas de agar-L y ampicilina que
contienen EGTA 5 mM para asegurar que estaban libres del fago. Las
colonias no tuvieron más un aspecto dentado indicando, de este modo,
una ausencia de fagos.
Se puede usar la aglutinación con antisuero
provocado frente al antígeno O de Salmonella como un ensayo rápido
no sólo para la integridad del LPS bacteriano sino también como un
diagnóstico de la cepa, por ejemplo, antisuero frente a los
antígenos 04 y 05 para S. typhimurium. Estos se obtuvieron de
Murex Diagnostics Ltd (Dartford, Reino Unido). Se recolectó una
extensión de colonias a partir de la zona de crecimiento en una
placa incubada durante la noche, y se resuspendieron en 100 \mul
de PBS. Esta muestra se mezcló con una gota de antisuero en un
portaobjetos de vidrio y la aglutinación se comparó con una muestra
positiva y una negativa.
La línea celular HEp-2 es un
carcinoma epidérmico adherente derivado de laringe humana (ATCC
CCL23). Se puede cultivar como una monocapa en medio de Eagle
modificado por Dulbecco con FCS 10%, glutamina y
penicilina/estreptomicina a 37ºC en presencia de CO_{2} 5%. Se
separaron las células confluyentes a partir de los matraces de
cultivo tisular mediante el uso de tripsina/EDTA. Primero, las
células se lavaron en PBS para retirar cualquier suero que pudiera
afectar la acción de la tripsina. Entonces, se añadió tripsina/EDTA
a la monocapa y las células se incubaron a 37ºC durante 5 minutos.
Las células se retiraron del plástico mediante punción moderada en
el borde del matraz. La tripsina se neutralizó con 1,5 volúmenes de
DMEM. Las células se recogieron mediante centrifugación a 1000 x g
durante 5 minutos. El sobrenadante se retiró y el precipitado de
células se resuspendió en DMEM. El precipitado de células se contó y
se ajustó la concentración para dar 2 x 10^{5} células por ml.
Se añadió 1 ml de la suspensión celular a un
pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos (Costar 3524), tres
pocillos para cada cepa bacteriana que se estaba investigando. Las
células se incubaron durante la noche para formar una monocapa
confluyente en el pocillo. Las células se lavaron 5 veces en PBS
para asegurar la retirada de los antibióticos y se añadió 1 ml de
DMEM (sin antibióticos). Se añadieron 1 x 10^{7} bacterias a cada
pocillo y se incubaron a 37ºC durante 3 horas. Se lavaron las
células 3 veces en PBS para retirar cualquier bacteria extracelular.
Se añadió 1 ml de DMEM que contiene 100 \mug/m de gentamicina y se
incubaron las células durante 1 hora más. Las células se lavaron 5
veces con PBS. Las células se lisaron mediante la adición de 1 ml de
Triton-X-100 0,1% a 37ºC durante 15
minutos. Las células también se lisaron mediante agitación con una
punta de pipeta azul y el lisado se transfirió a un tubo de
centrífuga de 1,5 ml. Las bacterias viables que habían invadido las
células se contaron usando el método de ensayo de gota
Miles-Misra (19).
Se descongeló en nitrógeno líquido un vial de la
cepa apropiada y se usó para inocular 250 ml de cultivo de caldo LB
que contiene el antibiótico apropiado. El cultivo se hizo crecer
durante la noche a 37ºC sin agitación. Las bacterias se recolectaron
mediante centrifugación a 3000 x g durante 10 minutos y se lavaron
una vez en PBS estéril. Las bacterias se recolectaron de nuevo
mediante centrifugación y se resuspendieron en 5 ml de PBS estéril.
La concentración de bacterias se estimó por densidad óptica a 650 nm
usando una curva de crecimiento estándar para la cepa. Basados en
esta estimación, la concentración se ajustó con el PBS que se
requería para la inmunización. Se preparó una cuenta viable para
cada inóculo para dar un número exacto de unidades formadoras de
colonias por ml (cfu/ml) administradas a cada animal.
Los ratones se anestesiaron ligeramente con una
mezcla de halotano y oxígeno y se administró la bacteria mediante
alimentación por sonda en volúmenes de 0,2 ml usando una aguja de
alimentación por sonda unida a una jeringuilla de 1 ml.
Los ratones se colocaron en una cámara templada y
se inyectaron volúmenes de 0,2 ml en la vena de la cola de cada
ratón usando una aguja de alimentación por sonda 27.
Se sacrificaron grupos de cuatro o cinco ratones
7 semanas después de la inmunización oral con tres cepas
bacterianas. Se extrajeron los bazos, hígados, nódulos linfáticos
mesentéricos y placas de Peyer y se homogeneizaron en 10 ml de PBS
estéril usando un homogeneizador tipo digestor (Colworth, Reino
Unido). Se sembraron diluciones de estos homogeneizados en agar LB
con kanamicina si se requería y se incubó durante la noche a 37ºC.
Entonces, se calculó el número de bacterias viables en cada
homogeneizado a partir de la dilución.
Las respuestas de los anticuerpos del suero
frente al fragmento C se midieron mediante ensayo con sustancias
inmunoabsorbentes unidas a enzima (ELISA) como se describió
previamente (28) usando placas EIA/RIA de 96 pocillos (Costar 3590).
Los valores de absorbancia se leyeron a A_{490} y se trazaron
como función de las diluciones (datos no mostrados). Se añadió un
control de suero de ratón normal a cada placa ELISA y se usó para
definir el nivel de respuesta antecedente.
Se estimularon los ratones con 0,05 \mug (50 x
50% dosis letales) de toxina del tétanos purificada como se
describió previamente (7), y se registraron las muertes durante 4
días.
Se identificaron previamente varios mutantes de
inserción S. typhimurium TnphoA como atenuantes
cuando se administraron oralmente a ratones BALB/c. Además varios de
estos mutantes también mostraban una capacidad reducida para invadir
líneas celulares epiteliales HEp-2 en cultivo. Para
identificar los genes que habían sido interrumpidos por la
inserción TnphoA, se digirió el ADN genómico usando
Sau3A y series de cósmidos preparados para cada cepa. Estas
series fueron seleccionadas usando sondas TnphoA y los
cósmidos que mostraban homología con las sondas 3' y 5' se
examinaron. Los fragmentos de estos cósmidos se clonaron en el
vector pBluescriptºII SK+. La secuencia de nucleótidos de alrededor
de los sitios de inserción se determinaron y se identificaron los
genes. Se encontraron dos inserciones en el gen htrA (14),
una en el gen osmZ (10) y una en el gen surA.
El tramo de lectura abierta del gen surA
de Salmonella typhimurium mostrado en Sec. Id. Nº 1 es de 1281 bases
de longitud, y codifica una proteína de 427 aminoácidos con un peso
molecular de 47,2 Kd. Esta proteína es prácticamente idéntica a la
que se encuentra en E. coli (34), y se describe como
esencial para la supervivencia en cultivos de largo periodo (33). El
gen surA contiene un sitio de escisión por peptidasa líder,
lo que indica que esta es una proteína transportada. Ahora se ha
descrito como perteneciente a una familia de
peptidilprolilisomerasas, con una función para ayudar al plegamiento
correcto de proteínas de la membrana exterior (16, 24, 29).
El análisis de restricción y la secuenciación del
ADN del gen surA pusieron de manifiesto la presencia de
sitios únicos de enzimas de restricción HpaI y SmaI
en la región codificante del gen que podría usarse para generar una
deleción de 400 bases. El plásmido pGEM-T/212/213 se
construyó para contener una región de 3 Kb que abarca todo el gen
surA y la región flanqueante. La digestión del plásmido con
las enzimas HpaI y SmaI, la purificación en gel del
fragmento extenso de 5,5 Kb y la religación dio como resultado un
plásmido que contiene una deleción de 419 pb en el gen surA.
Este plásmido se denominó pGEM-T/\DeltasurA.
Se digirió el plásmido pGEM-T con
las dos enzimas de restricción SphI y SalI. El
fragmento de 2,6 kb que contiene el gen surA delecionado se
purificó en gel y se ligó en el replicón suicida pGP704 que había
sido digerido previamente con las mismas enzimas. El replicón
suicida pGP704 se había usado previamente para introducir deleciones
en el cromosoma de S. typhi (4) y S. typhimurium (26)
que carece del gen pir, el producto del cual es esencial
para la replicación de pGP704. La mezcla de ligación se usó para
transformar la cepa SY327, una cepa de E. coli que contiene
el gen pir, y un plásmido del tamaño esperado mediante
análisis de restricción. Este plásmido se denominó
pGP704/\DeltasurA. Como los replicones suicidas no pueden
replicarse en S. typhimurium el marcador de resistencia a
fármaco sólo se expresa si hay un único suceso de recombinación
homóloga, que incorpora el plásmido en el cromosoma bacteriano.
El plásmido pGP704/\DeltasurA se usó para
transformar la cepa de S. typhimurium semielaborada LB5010 mediante
el método de cloruro de calcio. Se seleccionaron tres transformantes
en agar que contiene ampicilina. Estos tres convergentes
individuales se movieron desde la cepa intermedia a la cepa de tipo
silvestre C5 usando transducción P22 (20). Los lisados P22 se
prepararon a partir de los tres transductantes y se introdujeron en
C5. Se obtuvo una colonia resistente a ampicilina por este proceso.
Este transformante se subcultivó dos veces en
caldo-L que no contiene selección y se hizo crecer
durante 48 horas. Se hicieron diluciones en serie de este cultivo y
la dilución 10^{-6} se sembró en placas de agar-L
que no contienen selección. Se rayaron 500 colonias a mano en placas
duplicadas, una que contiene agar, la otra de agar con ampicilina.
Se encontró que una colonia era sensible a ampicilina, lo que indica
la pérdida del marcador de resistencia a fármaco del plásmido tras
un suceso de recombinación homóloga.
El mutante surA potencial se confirmó como
una cepa de S. typhimurium mediante aglutinación con
antisuero 04 y 05. La deleción se confirmó mediante PCR usando los
cebadores MGR92 y MGR93, dando un producto de 1 kb. La deleción
también se confirmó mediante clonación del producto de PCR en el
vector pGEM-T para dar el plásmido
pGEM-T/92/93, y secuenciación a lo largo de la
deleción usando cebadores MGR130y 135. La Figura 1 muestra los
resultados de sondear el ADN genómico de C5 digerido con PstI
y SalI y la cepa mutante surA con un producto de PCR
obtenido del C5 de tipo silvestre. La banda que se ve en el rastro
del mutante surA es aproximadamente 400 bases más pequeña que
la que se ve en el de tipo silvestre. Esta cepa delecionada se
denominó BRD1115.
La cepa BRD1115 se ensayó para su capacidad de
invadir la línea de células epiteliales HEp-2 en
cultivo. Se encontró que los niveles de invasión estaban reducidos
un 80% en comparación con la cepa C5 de tipo silvestre. El mutante
transposón BRD441 mostró una reducción del 90% de invasión en
comparación con C5.
Se calcularon los LD_{50} oral e i.v. de
BRD1115, C5 y BRD441 usando la cepa susceptible de ratón BALB/c. Se
inocularon 5 ratones por grupo bien por vía oral o bien i.v. con
dosis en el intervalo log_{10}4 a log_{10}10 por vía oral y
log_{10}1 a log_{10}5 i.v. Se registraron las muertes durante 28
días y se calcularon los LD_{50} mediante el método de Reed y
Meunch (27). Se determinó que BRD1115 mostraba cerca de 5 log de
atenuación por vía oral y 3,5 log i.v. comparado con C5. BRD441
mostró 4,5 log de atenuación por vía oral y 1 log i.v. Los
resultados se encuentran en la Tabla 2.
Se inocularon por vía oral grupos de 4 ratones
BALB/c con log_{10}8 organismos de las tres cepas. Se mataron los
ratones a los 0, 1, 4, 7, 10, 16, 21 y 28 días y se examinaron los
órganos para la carga bacteriana. La cepa C5 de tipo silvestre
colonizó el bazo, el hígado, los nódulos linfáticos mesentéricos y
las placas de Peyer en altas cantidades (>log_{10}4 cfu/ml),
finalmente daban como resultado la muerte de los animales. Por otro
lado, BRD1115 y BRD441 persistieron en el hígado y el bazo durante
más de 40 días en bajas cantidades (<log_{10}2 cfu/ml). Estos
resultados se encuentran en la Figura 2.
Se inmunizaron por vía oral grupos de ratones
BALB/c con log_{10}8 organismos de BRD1115 y se estimularon con la
cepa C5 de tipo silvestre a 4 semanas y 10 semanas después de la
inoculación. Los ratones fueron estimulados con log_{10}4 a
log_{10}10 organismos C5 y se calculó un nuevo LD_{50} oral.
Los niveles de protección se encuentran en la Tabla 3, que muestra
log_{10}4 de protección tras 4 semanas y log_{10}5 tras 10
semanas.
Se introdujeron dos plásmidos codificantes del
fragmento C de la toxina del tétanos en dos aislados de BRD1115
mediante electroporación. Los plásmidos son pTETnir15 (38) en
el que el fragmento C está bajo el control del promotor de
nirB, y pTEThtrA en el que el fragmento C está bajo el
control del promotor de htrA. Se encontró que los plásmidos
se mantenían a niveles mayores del 90% en BRD1115 incluso cuando la
presión de selección de la ampicilina se retiraba del medio de
crecimiento. La expresión in vitro del fragmento C se
determinó mediante transferencia de Western. Las cepas se cultivaron
tanto bajo condiciones inductoras (42ºC para BRD1126 y anaerobiosis
para BRD1127) y condiciones no inductoras (37ºC para BRD1126 y
aerobiosis para BRD1127). Se vio un alto nivel de expresión en ambas
cepas bajo condiciones inductoras con BRD1127 que muestra mayores
niveles de expresión del fragmento C que BRD1126.
Se inmunizaron grupos de 10 ratones BALB/c por
vía oral con log_{10}8 organismos y se sangraron semanalmente. Los
títulos de anticuerpos anti-fragmentos C
presentes en el suero de cada animal se determinaron mediante
ensayo ELISA. Los títulos se determinaron como el recíproco de la
muestra de mayor dilución que daba una absorbancia de 0,3 por encima
del suero de ratón normal. Los resultados se encuentran en la Figura
3.
Cuatro semanas después de la inmunización se
estimularon los ratones con 50 LD_{50} de toxina del tétanos por
vía subcutánea y las muertes se anotaron durante 4 días. Los
resultados se encuentran en la Tabla 4, que muestran que se dio una
protección del 100% tras la inmunización con BRD1127 (fragmento C
bajo el control del promotor de htrA) y una protección del
60% tras la inmunización con BRD1126 (bajo el promotor de
nirB). No sobrevivieron a la estimulación los ratones sin
tratamiento previo.
Este ejemplo confirma que la mutación en
surA es responsable de la atenuación. Esto se determinó
mediante complementación del gen delecionado con una versión intacta
del gen expresado en un plásmido. La cepa complementada era tan
virulenta como el organismo de tipo silvestre dados por vía oral a
los ratones.
pLG339 (41) es un plásmido de bajo número de
copias basado en pSC105. Se clonó un fragmento de 3 kb del plásmido
pGEM-T/212/213 (sección 2.2) que contiene el gen
surA intacto y la región flanqueante en los sitios
SphI/SalI del plásmido pLG339 para crear el plásmido
pLG339/surA. Se muestra un esquema de este plásmido en la
Figura 4.
Se electroporó el plásmido en un BRD1115
electrocompetente como se describió previamente en la sección 1.5.2.
Los transformantes que contienen el plásmido se seleccionaron
mediante siembra de la mezcla de electroporación en placas de agar
que contienen 15 \mug/ml de kanamicina. El plásmido de ADN se
recuperó a partir de una única colonia de esta transformación y se
revisaron para la identidad mediante análisis de restricción. Se
llamó a esta cepa K2.
La capacidad del gen surA intacto en el
plásmido para complementar la acción del gen surA delecionado
en el cromosoma depende de que el plásmido sea retenido en la cepa
bacteriana. El plásmido contiene el gen codificante de resistencia
al antibiótico kanamicina. Cultivar la cepa en presencia del
antibiótico debería asegurar que el plásmido es retenido. Sin
embargo, es importante que el plásmido sea retenido en ausencia del
antibiótico de selección ya que el antibiótico de selección no es
posible in vivo.
Se inoculó una única colonia de la cepa k2 en
cultivos duplicados de 10 ml de caldo-L con y sin
kanamicina. Los cultivos se hicieron crecer con agitación a 37ºC
durante un total de 72 horas. Se tomaron muestras a 30 y 48 horas
después de la inoculación y se sembraron diluciones en serie en
placas de agar-L con y sin kanamicina. Los cultivos
se diluyeron 1/100 en caldo Fresh L con y sin kanamicina y se
cultivaron durante otras 24 horas. Las diluciones del cultivo se
plaquearon de nuevo en placas de agar-L con y sin
kanamicina. Se registraron varias unidades formadoras de colonias
(cfu) y se informa acerca de ellas en la Tabla 5.
La cepa K2 se hizo crecer como se describió en
1.8. y se usó para estimular por vía oral grupos de 5 ratones Balb/c
(como se describió previamente) con un intervalo de dosis de
10^{4} a 10^{10}/dosis. Se registraron las muertes durante 28
días y se calculó el LD_{50} de acuerdo con el método de Reed y
Meunch (descrito en 2.3.2.).
Se recuperó el plásmido pLG339/surA a
partir de la cepa K2 digerida con las dos enzimas SphI y
SalI. La separación de las bandas resultantes mediante
electroforesis en gel de agarosa puso de manifiesto el tamaño
correcto de las bandas de 6,2 y 3 kb.
Se investigó la presencia del plásmido
pLG339/surA en la cepa K2. Los resultados muestran que en
ausencia de antibióticos el plásmido es retenido por las bacterias.
En estos estudios, al menos el 82% de las bacterias retienen el
plásmido cuando crece sin antibióticos. Esto sugiere que este
plásmido debería mantenerse cuando la bacteria se usa para infectar
ratones.
Se estimularon por vía oral grupos de 5 ratones
Balb/c con varias dosis de la cepa K2 supuestamente complementada.
El LD_{50} oral de la cepa K2 complementada se calculó que era
log_{10}4,35 comparado con que es log_{10}4,17 para la cepa C5
precursora.
Se encuentran representadas en la Figura 5 las
muertes de los ratones en el grupo de los ratones estimulados con
log_{10}8 bacterias de las tres cepas C5, BRD1115 y K2. Aunque el
gen surA expresado en el plásmido parece complementar la
mutación definida in vivo, el aparente retardo de la muerte
en el tiempo (cuando se compara con la cepa precursora de tipo
silvestre) sugiere que el nivel de expresión de surA puede
reducirse en la cepa K2.
| \underline{Cepas \ bacterianas} | \underline{Propiedades} | \underline{Fuente \ o \ referencia} |
| E. coli | ||
| SY327 | \lambdapir lisógeno | Miller V.L. (23) |
| S. typhimurium | ||
| LB5010 | semielaborada | laboratorio de la invención |
| C5 | tipo silvestre | C. Hormaeche, Cambridge, Reino Unido |
| BRD441 | mutante TnphoA, kan^{R} | Miller I (21) |
| BRD1115 | este estudio | |
| BRD1126 | amp^{R} | Oxer M.D. (25) |
| BRD1127 | amp^{R} | en bibliografía |
| \underline{Plásmidos} | ||
| pBluescriptºII SK+ | amp^{R} | Stratagene Ltd |
| pGEM-T | amp^{R} | Promega Corp. |
| pGP704 | amp^{R} | Miller V.L. (23) |
| pGEM-T/212/213 | amp^{R} | este estudio |
| pGEM-T/\DeltasurA | amp^{R} | este estudio |
| pGP704/\DeltasurA | amp^{R} | este estudio |
| pGEM-T/92/93 | amp^{R} | este estudio |
| pTETnir15 | amp^{R} | Oxer M.D. (25) |
| pTEThtrA | amp^{R} | en bibliografía |
| \underline{Oligocebadores} | ||
| MGR 92 | TCGGCACGCAAGAAATGT | Kings College, Londres |
| MGR 93 | AGACGACCAGTTCAATCG | \hskip0,4cm '' \hskip0,8cm '' \hskip0,8cm '' |
| MGR 130 | CGATGGGCTGAACTATTC | \hskip0,4cm '' \hskip0,8cm '' \hskip0,8cm '' |
| MGR 135 | TATGCAGCTTCGTTAGCG | \hskip0,4cm '' \hskip0,8cm '' \hskip0,8cm '' |
Se determinaron los LD_{50} oral e i.v. de las
tres cepas C5, BRD441 y BRD1115 en ratones BALB/c. Se inmunizaron
grupos de 5 ratones con dosis en el intervalo de log_{10}4 a
log_{10}10 cfu de las cepas BRD441 y BRD1115, y dosis de
log_{10}1 a log_{10}5 de la cepa C5. Los resultados se muestran
en la siguiente tabla.
| Cepa | LD_{50} oral (log_{10}cfu) | LD_{50} i.v. (log_{10} cfu) |
| C5 | 4,16 | <1,87 |
| BRD441 | 8,62 | 2,46 |
| BRD1115 | 8,98 | 5,22 |
Se determinó la capacidad de la cepa mutante de
surA definida para conferir protección frente a
estimulaciones homólogas con la cepa C5 de tipo silvestre. Se
inmunizaron por vía oral grupos de 5 ratones BALB/c con log_{10}8
organismos de la cepa BRD1115, entonces se estimularon con
log_{10}4 a log_{10}10 de la cepa C5 virulenta de ratón bien 4
o bien 10 semanas después de la inoculación. Entonces se calculó el
nuevo LD_{50} y los resultados se muestran en la tabla a
continuación.
\newpage
| Cepa inmunizante | LD_{50} oral de C5 | Protección (no de LD_{50}) | |
| 4 semanas después | 10 semanas después | ||
| de la inmunización | de la inmunización | ||
| BRD1115 | 8,58 | \sim3800 | |
| Ninguna | 4,74 | ||
| BRD1115 | 9,51 | \sim4800 | |
| ninguna | 4,68 |
Se inmunizaron tres grupos de 10 ratones con las
cepas BRD1115, BRD1126 y BRD1127 y entonces se estimularon 4 semanas
después de la inmunización con 50 dosis LD_{50} de toxina del
tétanos por vía subcutánea. Se anotaron las muertes durante 4 días.
El número de ratones supervivientes a la estimulación se muestran en
la tabla a continuación.
| Cepa | Supervivientes tras la estimulación | |
| BRD1115 | 0/10 | |
| BRD1126 (nirB) | 6/10 | |
| BRD1127 (htrA) | 10/10 |
Se calcularon las cantidades de bacterias (cfu)
presentes en los cultivos de la cepa K2 complementada tras el
cultivo en caldo-L con y sin el antibiótico
kanamicina. Entonces, los cultivos se sembraron en placas de
agar-L con y sin kanamicina para mostrar la
presencia del plásmido pLG339/surA. Los resultados se
muestran como una cantidad total y también las colonias resistentes
a kanamicina como un porcentaje del total de bacterias
presentes.
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714-24.
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10, 888-892.
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N., Charles, I., Pickard, D., Levine, M.
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53-60.
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3035-3043.
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335-341.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Medeva Europe Limited
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 10 St Jame's Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Londres
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: no aplicable
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: SW1A 1EF
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VACUNAS QUE CONTIENEN BACTERIAS ATENUADAS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release Nº1.0, Versión Nº1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1287 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO:Salmonella typhimurium
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1281
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 427 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1287 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: E. coli
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1284
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 428 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Una vacuna que comprende un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable y una bacteria atenuada
mediante mutación no reversible en un gen que codifica una proteína
que promueve el plegamiento de proteínas extracitoplásmicas.
2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la proteína codificada por el gen mutante es una proteína
periplásmica.
3. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1
o 2, donde la proteína codificada por el gen mutante promueve el
plegamiento de proteínas secretadas.
4. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1,
2 o 3, donde la proteína codificada por el gen mutante es una
peptidil-prolil cis-trans isomerasa
(PPiasa).
5. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 4,
donde la PPiasa es un miembro de la familia de las parvulinas de
PPiasas.
6. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la proteína codificada por el gen
mutante es SurA.
7. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la bacteria se atenúa
adicionalmente mediante una mutación no reversible en un segundo
gen.
8. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 7,
donde el segundo gen es un gen aro, un gen pur, el gen
htrA, el gen ompR, el gen galE, el gen
cya, el gen crp o el gen phoP.
9. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 8,
donde el gen aro es aroA, aroC, aroD o
aroE.
10. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la mutación en el gen que
codifica una proteína que promueve el plegamiento de proteínas
extracitoplásmicas y/o la mutación en el segundo gen es una mutación
definida.
11. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la bacteria no tiene mutaciones
no caracterizadas en el genoma de la misma.
12. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la bacteria es una bacteria que
infecta por vía oral.
13. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la bacteria es del género
Salmonella, Escherichia, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia,
Bortedella o Brucella.
14. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
13, donde la bacteria es Salmonella typhimurium,
Salmonella typhi, Salmonella enteritidis,
Salmonella choleraesuis, Salmonella dublin,
Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Nisseria
gonorrhoeae, Yersinia enterocolitica, Bortedella
pertusis o Brucella abortus.
15. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la bacteria está manipulada
genéticamente para expresar un antígeno de otro organismo.
16. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
15, donde el antígeno es el fragmento C de la toxina del
tétanos.
17. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
15 o 16, donde la expresión del antígeno está dirigida por el
promotor de nirB o el promotor de htrA.
18. Una bacteria atenuada mediante una mutación
no reversible como se define en cualquiera de las reivindicaciones
anteriores para su uso en un método de vacunación de un ser humano o
animal.
19. El uso de una bacteria como se define en
cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la fabricación
de un medicamento para vacunar un ser humano o animal.
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