ES2229513T3

ES2229513T3 - Sistema de rastreo de plaguicidas.

Info

Publication number: ES2229513T3
Application number: ES98932106T
Authority: ES
Inventors: Peter Boutsalis
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1997-06-04
Filing date: 1998-06-02
Publication date: 2005-04-16
Anticipated expiration: 2018-06-02
Also published as: JP2002510201A; ATE279724T1; EP0991942A1; DE69827004D1; EP0991942B1; AU745497B2; DE69827004T2; AU8212198A; CA2291617A1; WO1998055860A1

Abstract

La presente invención está en el campo del cultivo de plantas y del tamizado de pesticidas. En particular, la invención se refiere a un sistema rápido y sencillo para ensayar plantas propagadas asexualmente dentro de un programa de tamizado de pesticidas. La invención se refiere además a un kit de ensayo rápido que comprende todos los elementos que se necesitan para plantas que se propagan asexualmente a partir de una cierta planta madre y para llevar a cabo las operaciones de ensayo deseadas.

Description

Sistema de rastreo de plaguicidas.

La presente invención está dentro de la especialidad del cultivo de plantas y el rastreo de plaguicidas. En particular, la invención se refiere a un método rápido y fácil para rastrear plantas propagadas asexualmente con un programa de rastreo de plaguicidas.

Actualmente, la mayoría de los rastreos de plaguicidas se ponen en práctica con plantas enteras propagadas a partir de semillas de plantas o con material de cultivo de tejido de planta. Por ejemplo, la técnica de control de malas hierbas más común usada en la agricultura hoy en día es el control mediante herbicidas. En la especialidad de los herbicidas, por lo tanto, existe una necesidad de tener un sistema de prueba disponible para rastrear plantas de mala hierba con respecto a la resistencia a herbicidas para poder determinar rápidamente si las malas hierbas son "resistentes" al herbicida o si está implicado algún "otro" factor que afecte al (reduzca) el comportamiento del herbicida. Tales "otros" factores pueden implicar condiciones medioambientales que afectan a la planta de modo que se reduzca la eficacia del herbicida.

Para poder decidir si la reducción observada en el comportamiento del herbicida está provocada por un rasgo de resistencia o implica otros factores, según se define previamente aquí, las plantas de mala hierba supuestamente "resistentes" han de examinarse con algún detalle más. El estado actual de la tecnología disponible para probar malas hierbas con respecto a su estado de resistencia a los herbicidas es bastante pobre y consume mucho tiempo. Las pruebas disponibles actualmente son:

(1) Recogida de semillas - el sistema "más ampliamente" usado actualmente en práctica. Este sistema implica la recogida de semillas de las malas hierbas resistentes sospechadas y a continuación rastrear (pulverización con herbicida) las plantas (que crecen en macetas que contienen suelo) germinadas a partir de las semillas recogidas. Problemas asociados con esta prueba incluyen:

(a): las plantas resistentes sospechadas no se prueban directamente sino su progenie que puede ser genéticamente diferente para el rasgo resistente al herbicida,

(b): las semillas también pueden recogerse sin saberlo de plantas que germinaron después de la aplicación del herbicida que pueden ser sensibles (susceptibles) al herbicida y así confundir los resultados de la prueba,

(c): la latencia de las semillas a menudo es un problema. Si no existe al menos 70% de germinación, entonces se desconoce si las plantas probadas a partir de las semillas germinadas son representativas de toda la colección de semillas con respecto a la resistencia,

(d): el momento requerido para probar las malas hierbas puede ser varios meses después de que las semillas se recojan y por lo tanto el agricultor no tiene una respuesta sobre el estado de resistencia de las semillas antes de planear la provisión de herbicida para las siguientes estaciones.

(2) Repulverización de prueba en el campo - este sistema está siendo experimentado principalmente en Australia. Implica (después de que se sospeche la resistencia al herbicida) efectuar un pequeño experimento de campo con herbicida repulverizando macetas con herbicidas en el campo en la estación actual. Problemas asociados con esta prueba incluyen:

(a): los experimentos se someten a condiciones medioambientales que pueden afectar a los resultados

(b): también son laboriosos y consumen mucho tiempo

(c): pueden producirse errores experimentales al efectuar e interpretar el experimento

(d): el estadio de crecimiento de las malas hierbas puede ser demasiado tardío, incluso para dosis de herbicida superiores.

(3) Pruebas en agar - en este sistema, las semillas se germinan sobre agar que contiene herbicida en placas Petri. Problemas asociados con esta prueba incluyen, además de los asociados con la Prueba 1:

(a): no todos los herbicidas pueden usarse en este sistema

(b): la interpretación de resultados a menudo es difícil

Las Pruebas 1 y 2, aunque tienen desventajas asociadas, utilizan una pulverización de herbicida similar a la operación de campo.

Además, existen pruebas disponibles que usan técnicas bioquímicas o moleculares específicas para las pruebas de resistencia a herbicidas de malas hierbas recogidas en el campo. Estas pruebas dependen de un laboratorio operativo y bien equipado. Una desventaja adicional, que hace a estas pruebas inadecuadas para pruebas de resistencia a herbicidas a gran escala, es que prueban un mecanismo específico de resistencia. Sin embargo, debido a la diversidad genética, las malas hierbas (incluso dentro de un solo campo) pueden poseer más de un mecanismo que las dote de resistencia a herbicidas. Por otra parte, pueden existir múltiples mecanismos incluso dentro de una sola
planta.

Así, actualmente, las pruebas de poblaciones de malas hierbas con respecto a la resistencia a herbicidas solo pueden efectuarse exactamente pulverizando herbicidas, tal y como se realiza en el campo. Esto se debe a que solo la pulverización tiene en cuenta todos los posibles mecanismos de resistencia a herbicidas, tanto conocidos como posiblemente desconocidos.

Problemas similares también son predominantes en la especialidad de los fungicidas y herbicidas. Aquí, a menudo es difícil definir si un fenotipo de resistencia exhibido por una planta de cultivo o no cultivo se debe a un rasgo de resistencia o está provocado por algunos "otros" factores. Esto se aplica especialmente a plantas transgénicas que se han transformado con un cierto rasgo de resistencia, donde a menudo es deseable una decisión rápida y fiable en cuanto a si es probable que el fenotipo de resistencia observado representa un transformante cierto.

Por otra parte, el tratamiento de una planta de cultivo con un plaguicida puede dar como resultado un daño no deseable a la planta. En tal situación, sería altamente deseable saber si el daño observado está provocado por la acción del plaguicida o si están implicados algunos "otros factores" que afectan al comportamiento de la planta de cultivo, tales como, por ejemplo, la contaminación de la preparación de plaguicida o el suelo con substancias tóxicas para la planta, etc.

Teniendo en cuenta los problemas esbozados previamente, uno de los objetivos principales de la presente invención es proporcionar un sistema rápido y fácil para probar plantas que conduce a resultados fiables, pero no encuentra las muchas desventajas de los sistemas actualmente disponibles en la especialidad y puede así usarse adecuadamente dentro de un programa de rastreo de plaguicidas. Este objetivo podría cumplirse sorprendentemente aplicando técnicas bien conocidas en la especialidad.

Así, un objetivo principal de la invención es proporcionar un método para probar plantas de progenie, que comprende

(a): propagar asexualmente una planta o plantas de progenie a partir de una planta madre, preferiblemente una planta transgénica, pero especialmente una mala hierba o planta de cultivo cortando un segmento de una planta madre, comprendiendo dicho segmento una región meristemática que está suficientemente intacta para haber retenido su capacidad de regenerar una planta completa y morfológicamente normal, y regenerar directamente dicho segmento;

(b): incorporar la planta de progenie así obtenida a un programa de rastreo de plantas; y

(c): verificar el crecimiento de la planta de progenie.

En una modalidad preferida de la invención, la etapa de propagación se efectúa

(a): cortando un segmento corto de una planta madre, preferiblemente una planta transgénica, pero especialmente una mala hierba o planta de cultivo, de modo que dicho segmento sea capaz de regenerarse directamente en una planta entera y morfológicamente normal, preferiblemente una región que contiene una alta cantidad de células que se dividen activamente, lo más preferiblemente una región que comprende células meristemáticas;

(b): transferir dicho segmento separado a un material de anclaje adecuado;

y

(c): regenerar directamente dicho segmento transferido a una planta entera y morfológicamente normal.

En una modalidad preferida adicional de la invención, el segmento de planta separado comprende un fragmento de raíz corta y vástago.

El método de acuerdo con la invención puede usarse preferiblemente dentro de un formato de alta producción.

La invención abarca además un método que comprende

(a): cortar un segmento corto de una planta madre, preferiblemente una planta transgénica, pero especialmente una mala hierba o planta de cultivo, de modo que dicho segmento comprenda una región meristemática que esté suficientemente intacta para poder regenerarse directamente en una planta entera y morfológicamente normal,

(b): sumergir dicho segmento en una concentración o concentraciones conocidas de una solución que contiene plaguicida;

(c): transferir los explantes de planta así tratados a un material de anclaje adecuado;

(d): regenerar directamente dicho explante en una planta entera y morfológicamente normal

y

(e): verificar el crecimiento de la planta de progenie.

Un objetivo adicional de la invención es proporcionar un método para rescatar plantas que muestran un rasgo o una propiedad interesante después del tratamiento con un plaguicida para investigación adicional, que comprende

(a): propagar asexualmente una planta o plantas de progenie a partir de una planta madre tratada, preferiblemente una planta transgénica, pero especialmente una mala hierba o planta de cultivo, cortando un segmento de dicha planta madre y regenerando directamente dicho segmento, comprendiendo dicho segmento una región meristemática que está suficientemente intacta para haber retenido su capacidad de regenerar una planta completa y morfológicamente normal,

(b): incorporar la planta de progenie así obtenida a un programa de rastreo de plantas;

y

(c): verificar el crecimiento de la planta de progenie.

(a): cortando un segmento corto de una planta madre tratada de modo que dicho segmento comprenda una región meristemática que esté suficientemente intacta para poder regenerarse directamente en una planta entera y morfológicamente normal,

(b): transferir dicho segmento separado a un material de anclaje; y

(c): regenerar directamente dicho segmento transferido en una planta entera y morfológicamente normal.

La invención abarca además un método que comprende

(a): cortar un segmento corto de una planta madre tratada, preferiblemente una planta transgénica, pero especialmente una mala hierba o planta de cultivo, de modo que dicho segmento comprenda una región meristemática que esté suficientemente intacta para poder regenerarse directamente en una planta entera y morfológicamente normal,

(b): sumergir dicho segmento en una concentración o concentraciones conocidas de una solución que contiene plaguicida, preferiblemente una solución que contiene un plaguicida seleccionado del grupo que consiste en un herbicida, un insecticida y un fungicida;

y

(e): verificar el crecimiento de la planta de progenie.

También está comprendido por la invención un método para determinar si un fenotipo de resistencia observado en una planta se debe a un rasgo de resistencia o está provocado por otros factores, que comprende

(a): recoger la planta fenotípicamente resistente, preferiblemente una planta transgénica, pero especialmente una mala hierba o planta de cultivo,

(b): propagar asexualmente una planta o plantas de progenie a partir de dicha planta resistente cortando un segmento de dicha planta resistente y regenerando directamente dicho segmento, comprendiendo dicho segmento una región meristemática que está suficientemente intacta para haber retenido su capacidad para regenerar una planta completa y morfológicamente normal,

(c): incorporar la planta de progenie así obtenida a un programa de rastreo de plantas;

y

(d): verificar el crecimiento de la planta de progenie,

o, alternativamente,

(a): recoger la planta resistente fenotípicamente, preferiblemente una planta transgénica, pero especialmente una mala hierba o planta de cultivo,

(b): cortar un segmento corto de dicha planta de modo que dicho segmento comprenda una región meristemática que esté suficientemente intacta para poder regenerarse directamente en una planta entera y morfológicamente normal,

(c): sumergir dicho segmento en una concentración o concentraciones conocidas de una solución que contiene plaguicida, preferiblemente una solución que contiene un plaguicida seleccionado del grupo que consiste en un herbicida, un insecticida y un fungicida;

(d): transferir los explantes de planta así tratados a un material de anclaje adecuado;

(e): regenerar directamente dicho explante en una planta entera y morfológicamente normal;

y

(f): verificar el crecimiento de la planta de progenie.

En particular, la presente invención proporciona un método rápido y fácil para probar plantas de progenie que se han propagado asexualmente a partir de una planta madre. Las plantas de progenie que han de probarse se propagan asexualmente a partir de una planta madre, preferiblemente cortando un segmento corto de la planta madre, segmento que es capaz de regenerarse directamente en una planta entera y morfológicamente normal. Se prefieren dentro del alcance de las invenciones segmentos de planta que comprenden regiones que contienen una alta cantidad de células que se dividen activamente. Especialmente preferidos son segmentos de planta que comprenden una o más regiones que contienen una alta cantidad de células meristemáticas, tales como, por ejemplo, un segmento basal de una planta monocotiledónea, incluyendo una raíz corta y tallo, o un segmento de una planta de hoja ancha (dicotiledónea) que comprende una sección nodal aérea corta. En plantas rizomatosas, se prefieren los segmentos que comprenden un segmento de rizoma corto que contiene raíces. El tamaño mínimo del segmento usado para regenerar una planta entera debe ser tal que la región meristemática contenida en dicho segmento esté suficientemente intacta para haber retenido su capacidad de regenerar una planta completa y morfológicamente normal. Para acelerar la regeneración y el desarrollo de la planta, puede ser ventajoso que el segmento de planta separado de la planta madre contenga todavía un fragmento de raíz corta o vástago.

No se necesita un equipo especial para cortar los segmentos de la planta; en principio, puede usarse cualquier dispositivo de corte doméstico para ese propósito. El dispositivo debe estar constituido de modo que pueda evitarse un daño grave al tejido de la planta, lo que incrementa la probabilidad de contaminación. Por lo tanto, se prefieren tijeras afiladas limpias o un cuchillo o escalpelo afilado. Los dispositivos de corte que han de usarse en la presente invención se limpian preferiblemente antes de usarse, por ejemplo enjuagando en agua del grifo limpia o destilada para minimizar la transferencia de enfermedades entre plantas.

Los segmentos de planta así obtenidos se transfieren subsiguientemente a un material de anclaje para plantas adecuado, tal como, por ejemplo, un medio de cultivo comúnmente empleado en el cultivo de plantas o cualquier otro material de anclaje para plantas adecuado que soporte el desarrollo y el crecimiento del explante de planta. Si se usa un medio de cultivo, han de tomarse precauciones para evitar la contaminación del medio por contaminantes externos. Por ejemplo, el material de planta puede esterilizarse superficialmente antes de su uso incubándolo con una solución de Clorox de 5% a 10% durante aproximadamente 5-10 minutos, preferiblemente seguido por varios lavados con agua destilada estéril. Si se usa un material de anclaje para plantas inerte tal como vermiculita, perlita o cuentas de plástico, han de proporcionarse a la planta agentes de soporte y promoción del desarrollo y el crecimiento de la planta de una manera a la que pueda accederse fácilmente por el explante de planta para soportar un crecimiento y desarrollo de planta normal. Soluciones de nutrientes listas para usar que pueden usarse dentro del alcance de la invención se ofrecen comercialmente y son bien conocidas por los expertos en la técnica del cultivo de plantas. Por ejemplo, la nutrición en la forma de un fertilizante comercial completo es adecuada para el propósito de la presente invención. Cualquier fertilizante soluble completo e incluso fertilizante soluble de N:P:K será suficiente ya que la duración del experimento raramente es mayor que un mes. Agentes promotores de las plantas que estimulan la formación de raíces y vástagos del explante de planta y pueden usarse adecuadamente para el propósito de la invención también son bien conocidos por los expertos en la técnica y comprenden, por ejemplo, GA3, NAA y 6BAP, que son hormonas ampliamente usadas en el cultivo tisular para la estimulación de vástagos y raíces.

En la modalidad más fácil y más cómoda, el segmento de planta se transfiere a cualquier suelo para macetas general, que opcionalmente puede contener fertilizante añadido, o incluso a suelo de campo. Los experimentos han mostrado que los explantes de Alopercurus myosuroides crecían igualmente bien en vermiculita, arena y en limo. En suelo de campo, todo lo que se necesita es para que los segmentos de planta se rieguen según se requiera, sin fertilizante adicional necesario. Puede ser ventajoso esterilizar el suelo antes de su uso para evitar la contaminación por contaminantes externos. Esto puede realizarse aplicando medios convencionales tales como, por ejemplo, calor, preferiblemente en combinación con alta presión.

Los explantes de planta se cultivan a continuación bajo condiciones que permiten la regeneración de plantas enteras completamente desarrolladas. Han de obtenerse resultados óptimos cultivando dichos explantes bajo condiciones estandarizadas dentro de un invernadero de temperatura controlada o una cámara de crecimiento. Son preferibles condiciones de cultivo estandarizadas para acelerar el desarrollo y el crecimiento de las plantas, pero no son un requisito previo para poner en práctica el método de acuerdo con la invención. El cultivo de plantas puede realizarse en un intervalo de temperatura de entre 12ºC y 28ºC dependiendo de la especie de planta usada como una fuente para el explante que ha de regenerarse. Se prefiere una temperatura de crecimiento en el intervalo de entre 15ºC y 25ºC. Sin embargo, si la velocidad para obtener un resultado no es crítica, entonces los explantes también pueden hacerse crecer en el exterior. Las temperaturas inferiores significan que los efectos del plaguicida serán más lentos, y si predominan temperaturas altas, entonces deben mantenerse niveles de humedad correctos.

Una persona experimentada en el campo del cultivo y la regeneración de plantas apreciará ciertamente que dependiendo que las especies de plantas usadas, ciertas adaptaciones del procedimiento esbozado previamente en términos generales podrían ser necesarias para cumplir los requerimientos específicos de las especies de plantas respectivas. Las medidas específicas que han de tomarse para garantizar un crecimiento y un desarrollo ordenados de la planta son bien conocidas por los expertos en la técnica relacionada.

Plántulas regeneradas que se han desarrollado a partir de los explantes de planta separados previamente pueden incorporarse a continuación a cualquiera de los programas de rastreo de plaguicidas comúnmente aplicados. Debido a la simplicidad y la facilidad del sistema de acuerdo con la invención, el intervalo de tiempo entre el corte de los segmentos de la planta y la disponibilidad inicial de las plantas regeneradas a partir de dichos segmentos para incorporarse a un programa de rastreo es extremadamente corto. Dependiendo de la especie de planta implicada, puede estar entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 12 semanas, preferiblemente de 5 días a aproximadamente 10 semanas, más preferiblemente entre aproximadamente 7 días y aproximadamente 7 semanas y lo más preferiblemente entre aproximadamente 9 días y aproximadamente 14 días. El ensayo de rastreo que ha de aplicarse a las plántulas regeneradas puede variar dependiendo de la pregunta subyacente que ha de responderse. Si la pregunta es, por ejemplo, relativa a un asunto de resistencia a herbicidas, las plántulas se someten a un programa de pulverización. Las macetas que contienen las plántulas en uno de los materiales de anclaje descritos previamente pueden pulverizarse en una cámara de pulverización con el herbicida que ha de probarse sin la necesidad de tomar medidas preliminares.

Herbicidas que pueden probarse dentro del método para probar plantas de progenie de acuerdo con la invención comprenden, pero no se limitan a, 2,4-D, 2,4-DB, acetochlor, acifluorfen, alachlor, ametryne, amidosulfuron, amitrol, atrazine, aziprotryn, BAY FOE 5043, bensulfuron, bentazone, bifenox, bromofenoxim, bromoxynil, butylate, chlorbromuron, chloridazon, chloridazone, chlorimuron-etilo, chlorsulfuron, chlortoluron, cinosulfuron, clethodim, clodinafop opcionalmente en combinación con cloquintocet, clomazone, clopyralid, cloransulam, cyanazine, cycloate, cycloxydim, desmedipham, desmetryn, dicamba, diclofop, difenzoquat, diflufenican, diflufenzopyr, dimethachlor, dimethametryn, dimethenamide y su enantiómero S, dipropertryn, diquat, diuron, DTPA NaFE, EDDHA NaFe, endothal, EPTC, ethalfluralin, ethametsulfuron, ethofumesate, fenclorim, fenoxaprop, flamprop, fluazifop, flumetsulam, fluometuron, fluorchloridone, fluoxypyr, fluthiacet-metilo, fomesafen, glufosinate, glyphosate, halosulfuron, haloxyfop, imazamethabenz, imazapyr, imazaquin, imazethapyr, ioxynil, isoproturon, karbutilate, lactofen, lenacil, linuron, MCPA, metamitron, methabenzthiazuron, metobromuron, metolachlor y su isómero S, opcionalmente en combinación con benoxacor o asegurador de oxima, metosulam, metoxuron, metribuzin, metribuzin, metsulfuron-metilo, molinate, nicosulfuron, norflurazon, oxabetrinil, oxasulfuron, paraquat, pebulate, pendimethalin, phenmedipham, pidoram, piperophos, pretilachlor, primisulfuron, prodiamine, prometon, prometryne, propachlor, propanil, propaquizafop, propazin, prosulfuron, pyridate, pyrithiobac, quinmerac, quizalofop, rimsulfuron, sethoxydim, simazine, simetryn, sulcotrione, sulfometuron-metilo, sulfosate, tebutam, terbacil, terbumeton, terbumeton, terbuthylazine, terbutryn, thiazafluron, thiazafluron, thifensulfuron, tralkoxydim, triallate, triasulfuron, tribenuron-metilo, trifluralin y trinexapac-etilo. Se entiende que también pueden usarse en el método de la invención mezclas conocidas de dos y más de los herbicidas mencionados previamente así como mezclas conocidas de los mismos con aseguradores. Un número de tales mezclas se conoce en particular de la literatura de patentes.

Ha de entenderse que el método para probar plantas de progenie de acuerdo con la invención no está de ningún modo confinado al área de los herbicidas, sino que puede usarse siempre que exista una necesidad de un sistema rápido y fiable para probar plantas propagadas asexualmente con respecto a la resistencia, incluyendo la resistencia a insecticidas y fungicidas, la resistencia a patógenos, y similares.

Dependiendo del área en la que ha de usarse el método de acuerdo con la invención, las plantas elegidas a las que dicho sistema puede aplicarse potencialmente pueden variar. En el área de los herbicidas, es probable que el principal foco esté sobre la prueba de plantas de mala hierba con respecto a síntomas de resistencia a herbicidas, según se describe aquí previamente. Plantas de mala hierba que pueden rastrearse con respecto a la resistencia a herbicidas dentro del alcance del método de acuerdo con la invención comprenden, sin limitarse a, (Echinochloa crus-galli (Cerreig), Setaria vericillata (Almorejo verticilado), especies de Opuntia (Cactus), Bromus tectorum (Bromo aterciopelado), Festuca arundinacea (Festuca), Digitalis purpurea (Dedalera), Hordeum jubatum (Cebada de cola de zorra), Setaria faberi (Cola de zorra gigante), Setaria viridis (Cola de zorra verde gigante), Digitaria sanguinalis (Pata de gallina), Sorghastrum nutans (Hierba de la India), Sorghum halepense (Cañota), Polygonum aviculare (Ciennudos), Polygonum persicaria (Polígono pejiguera), Alopecurus pratensis (Alopecuro de los prados), Dactylis glomerata (Dactilo apelotonado), Polygonum pensylvanicum (Polígono de Pennsylvania), Thalspi arvense (Telaspio), especies de Amaranthus (Bledo), Amaranthus spinosus (Bledo espinoso), Amaranthus blitoides (Bledo rastrero), especies de Euphorbia (Euforbia rastrera), Agropyron repens (Grama), Amaranthus palmeri (Bledo de raíces rojas), Agrostis alba (Agrostide), Phalaris arundinacea (Alpiste arundináceo), especies de Juncus (Junco), Sorghum bicolor (Sorgo bicolor), Bromus inermis (Bromo liso), Digitaria ischaemum (Digitaria lisa), Amaranthus hybridus (Bledo liso), Amaranthus hybridus/retroflexus (Bledo liso/de raíces rojas), Polygonum coccineum (Polígono de los pantanos), Panicum virgatum (Mijo perenne), Amaranthus tuberculatus (Bledo tuberculado), Campsis radicans (Trompetilla), Amaranthus albus (Bledo blanco), Hibiscus trionum (Malva de Venecia), Parthenocissus quinquefolia (Viña virgen), Lepidium virginicum (Berro de Virginia), Calla palustris (Cala de agua), Ellisia nyctelea (Vainade agua), Trifolium repense (Trébol blanco), Polygonum convolvulus (Polígono trepador), especies de Vitis (Vid silvestre), Panicum miliaceum (mijo silvestre), Panicum capillare (Pasto de perdiz), Setaria lutescens (almorejo), Cyperus esculentus (Chufa), Trifolium agrarium (Trébol amarillo), Yucca glauca (Yuca), especies de Aegilops, especies de Agropyron, especies de Allium, especies de Alopecurus, especies de Avena, especies de Briza, especies de Brachiaria, especies de Bromus, especies de Cynodon, especies de Cyperus, especies de Dactylis, especies de Dactylutenium, especies de Danthonia, especies de Datura, especies de Digitaria, especies de Echinochloa, especies de Eleusine, especies de Ergrostis, especies de Eriochloa, especies de Festuca, especies de Holcus, especies de Hordeum, especies de Juncus, especies de Lolium, especies de Panicum, especies de Paspalum, especies de Pennisetum, especies de Phalaris, especies de Phragmites, especies de Poa, especies de Polypogon, especies de Puccinellia, especies de Setaria, especies de Sorghum, especies de Vulpia.

Se prefieren planta monocotiledóneas tales como especies de Allium, especies de Cyperus y especies de Juncus, más preferiblemente monocotiledóneas gramináceas y lo más preferiblemente especies de Agropyron, especies de Alopecurus, especies de Avena, especies de Bromus, especies de Dactylis, especies de Digitaria, especies de Echinochloa, especies de Festuca, especies de Hordeum, especies de Lolium, especies de Panicum, especies de Phalaris, especies de Poa, especies de Setaria, especies de Sorghum, especies de Vulpia. También está representado por la presente invención el uso de plantas dicotiledóneas, preferiblemente plantas de hoja ancha (dicotiledóneas) tales como especies de Amaranthus, especies de Chenopodium, y especies de Atriplex. Un tercer grupo de plantas que puede usarse adecuadamente dentro del método de acuerdo con la invención son plantas rizomatosas tales como algunas especies de Polygonum.

Ha de resaltarse que la presente invención en ningún modo está limitada al rastreo de plantas de mala hierba con respecto a la resistencia a herbicidas. Muy bien podría haber situaciones en las que fuera deseable tener un sistema rápido y fiable disponible para rastrear plantas de cultivo o no cultivo para determinar si los síntomas de resistencia observados en el campo o el invernadero pueden confirmarse en plantas de progenie genéticamente idénticas o al menos casi idénticas. Incluso en el caso opuesto, cuando una planta de cultivo que se sabe que es resistente a una enfermedad específica muestra síntomas de enfermedad inesperados, podría ser deseable tener un método rápido y fiable disponible para determinar si los síntomas observados están provocados por una pérdida del rasgo de resistencia o si está implicado algún "otro" factor que afecte a (reduzca) el comportamiento de la planta.

Al usar el procedimiento de acuerdo con la presente invención, plantas que muestran un rasgo o una propiedad interesante después del tratamiento con un plaguicida pueden recuperarse para una investigación adicional. En el caso de plantas que forman renuevos, las plantas recuperadas de dichos renuevos pueden usarse para estudios genéticos debido a que se supone que los renuevos son genéticamente idénticos con respecto a un rasgo particular.

Por ejemplo, pueden recogerse plantas, que pueden ser plantas de cultivo o de mala hierba, que muestran propiedades de resistencia inesperadas en el campo o el invernadero, pero especialmente resistencia hacia hongos o insectos patógenos. Las plantas se recuperan del material recogido propagando asexualmente plantas de progenie, preferiblemente cortando un segmento corto del material de planta previamente recogido de modo que sea capaz de regenerarse directamente en una planta entera, según se describe aquí anteriormente. El segmento de planta así obtenido se transfiere a continuación a un material de anclaje adecuado, pero preferiblemente a suelo, y se regenera en una planta entera y morfológicamente normal. Esta planta puede introducirse a continuación en uno de los programas de rastreo que se usan comúnmente en el área de investigación respectiva y el comportamiento de dicha planta verificarse.

En el caso de una resistencia a insectos observada, dicho programa de rastreo puede implicar un ensayo de alimentación de insectos, mientras que en el caso de una resistencia fúngica observada, las plantas así producidas pueden incorporarse en un programa de pulverización en el que la planta se somete a una o más soluciones que contienen esporas que representan diferentes patógenos fúngicos de plantas.

Dependiendo del comportamiento de la planta en el ensayo respectivo, puede determinarse inmediatamente si la resistencia previamente observada se debe probablemente a un rasgo de resistencia o está provocada por algún "otro" factor según se analiza aquí anteriormente.

El método de acuerdo con la invención también puede usarse adecuadamente para responder a la pregunta de si es probable que el daño a la planta observado después de tratar la planta, preferiblemente una planta de cultivo, con un plaguicida esté provocado por la acción de un plaguicida que se ha aplicado a la planta o por algunos "otros" factores, tales como, por ejemplo, la contaminación de la preparación plaguicida con herbicidas no deseados, condiciones medioambientales adversas que afectan a la planta de modo que se haga más susceptible al compuesto aplicado, efectos residuales provocados por suelo contaminado, etc.

En ese caso, se recuperan plantas de las plantas dañadas propagando asexualmente plantas de progenie, preferiblemente cortando un segmento corto del material de planta previamente recogido de modo que sea capaz de regenerarse directamente en una planta entera, según se describe aquí anteriormente. El segmento de planta así obtenido se transfiere a continuación a un material de anclaje adecuado, pero preferiblemente a suelo, y se regenera en una planta entera y morfológicamente normal. Esta planta puede introducirse a continuación en un programa de pulverización. Las bandejas que contienen las plántulas en uno de los materiales de anclaje descritos previamente pueden pulverizarse en una cámara de pulverización con el plaguicida respectivo que ha de probarse sin la necesidad de tomar medidas preliminares. El comportamiento de las plantas tratadas se verifica durante un período de tiempo dado y, dependiendo de los resultados obtenidos, puede tomarse una decisión en cuanto a si es probable que los daños observados estén provocados por la acción del plaguicida o por algunos "otros" factores.

Además, es ahora posible determinar rápidamente la vida útil de un compuesto plaguicida dentro de una planta después del tratamiento de la planta con una solución que contiene dicho compuesto plaguicida. Se recuperan plantas del material tratado propagando asexualmente plantas de progenie, preferiblemente cortando un segmento corto del material de planta previamente tratado que es capaz de regenerarse directamente en una planta entera, según se describe aquí previamente. El segmento de planta así obtenido se transfiere a continuación a un material de anclaje adecuado, pero preferiblemente a suelo, y se regenera en una planta entera y morfológicamente normal. Esta planta puede introducirse a continuación en uno de los sistemas de prueba que se usan comúnmente en el área de investigación respectiva.

En el caso de plantas que se han tratado con un compuesto insecticida, este puede ser un ensayo de alimentación de insectos, mientras que en el caso de una planta que se ha tratado con un compuesto fungicida, las plantas de progenie así producidas pueden incorporarse en un programa de pulverización en el que la planta se somete a una o más soluciones que contienen esporas que representan diferentes patógenos fúngicos de plantas. Dependiendo de los resultados obtenidos, puede determinarse a continuación si el compuesto plaguicida permanecía con la planta de progenie o ya se había convertido en una forma inactiva.

Insecticidas que pueden usarse dentro del método para probar plantas de progenie de acuerdo con la invención comprenden, pero no se limitan a: Aldicarb; Azinphos-metilo; Benfuracarb; Bifenthrin; Buprofezin; Carbofuran; Dibutylaminothio; Cartap; Chlorfluazuron; Chlorpyrifos; Cyfluthrin; Lambda-Cyhalothrin; alpha-Cypermethrin; zeta-Cypennethrin; Deltamethrin; Diflubenzuron; Endosulfan; Ethiofencarb; Fenitrothion; Fenobucarb; Fenvalerate; Formothion; Methiocarb; Heptenophos; Imidactoprid; Isoprocarb; Methamidophos; Methomyl; Mevinphos; Parathion; Parathion-metilo; Phosalone; Pirimicarb; Propoxur, Teflubenzuron; Terbufos; Triazamate; Abamectin; Fenobucarb; Tebufenozide; Fipronil; beta-Cyfluthrin; Silafluofen; Fenpyroximate; Pyridaben; Fenazaquin; Pyriproxyfen; Pyrimidifen; Nitenpyram; NI-25, Acetamiprid; Avermectin B_{1} (Abamectin); AC 303 630; Acephat; Acrinathrin; Alanycarb; Alphamethrin; Amitraz; AZ 60541; Azinphos A; Azinphos M; Azocyclotin; Bendiocarb; Bensultap; Betacyfluthrin; BPMC; Brofenprox; Bromophos A; Bufencarb; Butocarboxin; Butylpyridaben; Cadusafos; Carbaryl; Carbopheno-thion; Chloethocarb; Chlorethoxyfos; Chlormephos; Cis-Res-methrin; Clocythrin; Clofentezin; Cyanophos; Cycloprothrin; Cyhexatin; Demeton M; Demeton S; Demeton-S-metilo; Dichlofenthion; Dicliphos; Diethion; Dimethoat; Dimethylvinphos; Dioxathion; Edifenphos; Emamectin; Esfenvalerat; Ethion; Ethofenprox; Ethoprophos; Etrimphos; Fenamiphos; Fenbutatinoxid; Fenothiocarb; Fenpropathrin; Fenpyrad; Fenthion; Fluazinam; Flucycloxuron; Flucy-
thrinat; Flufenoxuron; Flufenprox; Fonophos; Fosthiazat; Fubfenprox; HCH; Hexaflumuron; Hexythiazox, Iprobenfos; Isofenphos; Isoxathion; Ivermectin; lambda-Cyhalothrin; Malathion; Mecarbam; Mesulfenphos; Metaldehyd; Metolcarb; Milbemectin; Moxidectin; Naled; NC 184; Omethoat; Oxamyl; Oxydemethon M; Oxydeprofos; Permethrin; Phenthoal; Phorat; Phosmet; Phoxim; Pirimiphos M; Pirimiphos A; Promecarb; Propaphos; Prothiofos; Prothoat; Pyrachlophos; Pyrada-phenthion; Pyresmethrin; Pyrethrum; RH 5992; Salithion; Sebufos; Sulfotep; Sulprofos; Tebufenpyrad; Tebupirimphos; Tefluthrin; Temephos; Terbam; Tetrachlor-vinphos; Thiafenox; Thiodicarb; Thiofanox; Thionazin; Thuringiensin; Tralomethrin; Triarthen; Triazophos; Triazuron; Trichlorfon; Triflumuron; Trimethacarb; Vami-
dothion; Xylylcarb; YI 5301/5302; Zetamethrin; DPX-MP062; RH-2485; D 2341; o XMC (3,5-Xy-Iyl-Methylcarbamat), Azamethiphos; Chlorfenvinphos; Cypermethrin, Cypermethrin con alto contenido de cis; Cyromazin; Diafen-
thiuron; Diazinon; Dichlorvos; Dicrotophos, Dicyclanil; Fenoxycarb; Fluazuron; Furathiocarb; Isazofos; Jodfenphos; Kinoprene; Lufenuron; Methacriphos; Methidathion; Monocrotophos; Phosphamidon; Profenofos; Diofenolan; eine Substanz erhältlich aus dem Baciltus thuringiensis Stamm GC91 o de NCTC11821; Pymetrozine; Bromopropylate; Methoprene; Disulfuron; Quinalphos; Tau-Fluvalinat; Thiocyclan o Thiometon.

Fungicidas que pueden usarse dentro del método para probar plantas de progenie de acuerdo con la invención comprenden, pero no se limitan a: furalaxyl, metalaxyl, R-metalaxyl, benzoylpro-etilo, benalaxyl, oxadixyl, flamprop-metilo, ofurace, difenoconazole, etaconazole, propiconazole, penconazole, triadimefon, triadimenol, epoxiconazole, tebuconazole, bromuconazole, fenbuconazole, cyproconazole, tetraconazol, metconazol, flusilazol, diniconazol, triticonazole, uniconazole, miclobutanil, fluquinconazole, kresoxim-metilo, azoxystrobin, éster metílico de ácido {2-[1-(3-trifluorometil-fenil)-etilidenaminooximetil]-fenil}-acético, aldimorph, tridemorph, dimethomorph, fenpropimorph, fenpropidin, bromoxynil, carboxin, prochloraz, propargite, dicamba, fenpiclonil, fludioxonil, pymetrozine, pyrifenox, pyriproxyfen, fluazinam, chlorothatonil, pyroquilon, bacillus thuringiensis, captan, captafol, folpet, mancozeb, maneb, zineb, compuestos de Cu, ethyrimol, fenarimol, nuarimol, cymoxanil, imazalil, pyrazophos, thiabendazol, triforine, tricyclazole, iprodione, carboxine, thiram, acibenzolar-s-metilo, famoxadone, quinoxyfen, spiroxamin, fenhexamid.

De una manera análoga, plantas tratadas con otros compuestos plaguicidas pueden probarse dentro del método para probar plantas de progenie de acuerdo con la invención, tales como, por ejemplo, molusquicidas, nematicidas, miticidas, etc.

En una modalidad adicional de la invención, pueden usarse adecuadamente dentro del procedimiento de acuerdo con la invención plantas que se han manipulado genéticamente para contener un rasgo de resistencia a plaguicidas. Por ejemplo, plantas transformadas con un gen de resistencia que muestra un fenotipo de resistencia pueden recuperarse e investigarse adicionalmente confirmando de ese modo que la planta individual o las plantas son verdaderamente resistentes.

Genes estructurales que se usan preferiblemente para conferir un rasgo de resistencia particular a una planta son los que codifican para proteínas que pueden proteger a las plantas contra patógenos (por ejemplo, hongos fitopatógenos, bacterias, virus, etc), herbicidas (por ejemplo, triazinas, sulfonilureas, imidazolinonas, triazolpirimidinas, bialaphos, glyophosates, etc.), fungicidas, insecticidas o influencias medioambientales perjudiciales (por ejemplo, calor, frío, viento, condiciones desfavorables del suelo, humedad, sequedad, etc.).

Dentro del alcance de esta invención, se prefiere particularmente el uso de plantas transformadas que comprenden genes estructurales asociados con el control de patógenos y parásitos de plantas.

Por ejemplo, puede transferirse resistencia hacia insectos mediante un gen que codifica para un polipéptido que es tóxico para los insectos y/o sus larvas, por ejemplo la proteína cristalina de Bacillus thuringiensis. Tales genes son conocidos y se describen, por ejemplo, en US-P 4.865.891, US-P 4.996.155, WO 89/07605, EP 213.318 y
EP 186.379. Una clase adicional de secuencias de DNA que codifican proteínas insecticidas vegetativas se describe en WO 94/21795 y WO 96/10083.

Los inhibidores de proteasa son una segunda clase de proteínas que median resistencia a los insectos. Los inhibidores de proteasas forman un constituyente normal de estructuras de almacenamiento de plantas y por esta razón están situados habitualmente en vacuolas o "cuerpos proteínicos". Así, es posible demostrar que el inhibidor de proteasa de Bowman-Birk, que se aisló y purificó de habas de soja, inhibe la proteasa intestinal de Tenebrio larvae (Birk Y y otros (1963) Biochim. Biophys. Acta, 67: 326-328). El gen, que codifica para un inhibidor de tripsina del caupí común, se describe en Hilder y otros (1987) Nature, 330: 160-163.

Dentro del alcance de la presente invención, plantas que comprenden cualquier proteína cristalina, proteína vegetativa, inhibidor de proteasa de Bacillus thuringiensis o cualesquiera otras secuencias de DNA que codifican proteínas insecticidas pueden usarse dentro del método de acuerdo con la invención, independientemente de su procedencia (por ejemplo, proteínas insecticidas de fuentes que no son de planta o de fuentes puramente sintéticas).

En relación con esto, también debe hacerse mención a enzimas hidrolíticas que son capaces de llevar a cabo por sí mismas la degradación de las paredes celulares de patógenos de plantas o también son capaces al menos de apoyar este proceso, en un sentido sinérgico, en combinación con otras substancias.

Por ejemplo, la mayoría de los insectos poseen un esqueleto cuticular en el que micelas de quitina, estratificadas de un modo lamelar, están embebidas en una substancia de base. Numerosos hongos patógenos de plantas, por ejemplos basidiomicetos (hongos del añublo y la roya), ascomicetos y Fungi imperfecti (incluyendo Alternaria y Bipolaris, Exerophilum turcicum, Colletotricum, Gleocercospora y Cercospora), también contienen quitina como un constituyente integral de sus estructuras de las hifas y las esporas. La quitinasa es capaz de inhibir el crecimiento micelar de ciertos patógenos in vitro. Un órgano o tejido de planta que es capaz de expresar quitinasa constitutivamente o también como una respuesta a la penetración por un patógeno puede así protegerse contra el ataque por un gran número de hongos diferentes.

Otra enzima que juega una parte importante en los mecanismos por los que las plantas se defienden contra los patógenos es la \beta-1,3-glucanasa. Las plantas transformadas con un gen que codifica \beta-1,3-glucanasa (GLB), preferiblemente en combinación con un gen que codifica una de las enzimas degradadoras de quitina mencionadas previamente, se emplean por lo tanto preferiblemente en el método de acuerdo con la invención.

Plantas que pueden usarse dentro del alcance de esta invención también abarcan las que comprenden un gen que codifica los llamados péptidos líticos. Los péptidos líticos en el sentido más amplio del término son aquellos que se entiende que son compuestos cuya capacidad para penetrar en, someter a lisis o dañar las membranas celulares se basa en la actividad enzimática, por ejemplo lisozimas y fosfolipasas. Las secuencias de aminoácidos de diversos péptidos líticos se muestra en las siguientes publicaciones: WO89/11291; WO86/04356; WO88/05826; US4.810.777; WO89/04371.

Plantas adicionales que pueden usarse ventajosamente dentro del método de acuerdo con la invención son las que comprenden una clase de genes para proteínas de transferencia de fosfolípidos descritas, por ejemplo, en
WO 92/20801.

Una planta que exhibe un fenotipo antifúngico puede prepararse transformando plantas con una clase de genes que codifican proteínas relacionadas con la patogénesis [PRPs] tales como PR-1A, PR-1B, PR-1C, PR-R principal, PR-R secundaria, PR-P, PR-Q, PR-2, PR-2', PR-2'', PR-N, PR-O, PR-O', PR-4, SAR8.2a-e, quitinasa/lisozima de pepino, peroxidasa básica de pepino, glucanasa básica de tabaco y quitinasa básica/lisozima de tabaco, quitinasa ácida/lisozima de tabaco. Ejemplos de los genes previos y proteínas que incluyen constructos genéticos quiméricos que comprenden dichos genes se proporcionan en EP-A-392.225.

De las plantas que se transforman con genes que pueden mediar resistencia a herbicidas, se prefieren las que contienen genes para 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSP sintasa) tolerante a glyphosate [EP-A 115 673; EP-A 409 815], acetolactato sintasa (ALS) y glutamina sintasa (GS) y el gen bar o PAT de streptomyces, que confieren resistencia al herbicida [White y otros (1990) Nucl Acids Res 18: 1062; Spencer y otros (1990) Theor Appl Genet 79: 625-631]. Se prefieren plantas transformadas con un gen que codifica para una enzima con una actividad de protoporfirinógeno oxidasa (protox), una actividad de adenilosuccinato sintasa y una actividad de adenilosuccinato liasa.

El método de acuerdo con la invención también puede usarse para verificar el estado de resistencia de plantas que se han transformado con un gen marcador de la selección y que muestran un fenotipo de resistencia con respecto a dicho marcador. Las planas que todavía son capaces de crecer en presencia del agente de selección respectivo pueden recuperarse e investigarse adicionalmente confirmando de ese modo que la planta individual o las plantas son verdaderamente resistentes.

Plantas que pueden usarse potencialmente dentro del alcance de la presente invención son las que se han transformado con uno de los marcadores de selección usados habitualmente en la transformación de plantas, incluyendo, pero no limitados a, el gen nptII, que confiere resistencia a kanamicina y antibióticos relacionados [Messing y Vierra (1982) Gene 19, 259-268; Beven y otros (1983) Nature 304, 184-187], el gen hph, que confiere resistencia al antibiótico higromicina [Blochinger y Diggelmann (1984) Mol Cell Biol 4, 2929-2931] y el gen dhfr, que confiere resistencia a methotrexate [Bourouis y otros (1983) EMBO J 2(7), 1099-1104].

El método de acuerdo con la invención puede aplicarse principalmente a todas las plantas de cultivo. Se prefieren plantas monocotiledóneas, pero especialmente plantas de la familia Graminaceae, que implican, pero sin estar limitadas a: Lotium, Zea, Triticum, Titticale, Sorqhum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale y Setaria.

Especialmente preferidos son maíz, trigo, cebada, sorgo, centeno, avena, céspedes, maíz dulce y arroz.

El método de acuerdo con la invención también puede aplicarse a plantas de cultivo dicotiledóneas. Tales plantas incluyen, pero sin limitarse a, cultivos de campo, hortalizas y frutos, incluyendo: algodón, tabaco, remolacha azucarera, colza de semillas oleaginosas, tomate, pimiento, melón, lechuga, coliflor, brécol, berza, coles de Bruselas, remolacha azucarera, cebolla, zanahoria, ajopuerro, pepino, tomate, alfalfa, berenjena, remolacha, haba mayor, apio, achicoria, caupí, endibias, calabaza, cacahuete, papaya, guisante, melocotón, piña, patata, cártamo, haba verde, espinaca, haba de soja, calabazas, girasol, sandía y similares; y plantas ornamentales incluyendo, Impatiens, Begonia, Petunia, Pelargonium, Viola, Cyclamen, Verbena, Vinca, Tagetes, Primula, Saint Paulia, Agreratum, Amaranthus, Arithirrhinum, Aquilegia, Chrysanthemum, Cineraria, Clover, Cosmo, Caupí, Dahlia, Datura, Delphinium, Gerbera, Gladiolus, Gloxinia, Hippeastrum, Mesembryanthemum, Salpiglossis, Zinnia, y similares.

En una modalidad específica de la invención, se cortan explantes de tallo de una planta madre, según se describe aquí anteriormente y, en un período corto, que es preferiblemente menor que aproximadamente 1 hora después de la separación, el explante se trata con un plaguicida, por ejemplo sumergiendo dicho explante en una concentración o concentraciones conocidas de un plaguicida que contiene solución o pulverizando el explante con tal solución.

En una modalidad adicional de la invención, los explantes son pulverizados inmediatamente después de cortarse de una planta madre o, preferiblemente, en primer lugar se dejan crecer durante de uno a unos pocos días antes de pulverizarse. Los explantes de tallo así tratados se transfieren a continuación a un material de anclaje para plantas adecuado, pero preferiblemente se plantan en suelo o se ponen en agar, y se verifica el crecimiento de la plántula en desarrollo.

Debido a su facilidad y simplicidad, el método de acuerdo con la invención es especialmente adecuado para usarse dentro de un formato de alta producción.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos describen adicionalmente los materiales y los métodos usados para llevar a cabo la invención y los resultados subsiguientes. Se ofrecen a modo de ilustración y su cita no debe considerarse como una limitación de la invención reivindicada.

Ejemplo 1

Un segmento basal que incluye una raíz corta y tallo se corta de plantas de A. myosuroides de 6 semanas de edad que crecen en una cámara climática controlada (20ºC día/16ºC noche; fotoperíodo de 12 horas, 67% de HR) en macetas que contienen vermiculita (VERMEX exfolliiertes (expandiertes) Vermiculit- VERMICA AG) y se riegan con solución de nutrientes elaborada a partir del fertilizante soluble disponible comercialmente [Hauert-Flory® 3
[HP-30], 1 g/l (fertilizante soluble en agua); N:P:K 1,5:1:1,5; Hauert & Co., 3257 Grossaffoltern].

Los segmentos se trasplantan a vermiculita que contiene solución de nutrientes HP-3 y se ponen en la cámara climática de nuevo. Nueve días después del trasplante las bandejas se pulverizan en una cámara de pulverización con uno de los siguientes herbicidas - clodinafop 15 y 30 g/ha, fenoxaprop 25 y 50 g/ha, sethoxydim 150 y 300 g/ha, isoproturon 500 y 1000 g/ha, chlortoluron 500 y 1000 g/ha.

La mortalidad (%) se determina 3 semanas después de la pulverización.

\vskip1.000000\baselineskip

1

\hskip0.2cm

R1, R2, R3 son biotipos resistentes conocidos y S es un tipo silvestre (susceptible a herbicidas). Ejemplo 2

Semillas de dos biotipos de A. myosuroides resistentes y uno susceptible se siembran en macetas que contienen limo para macetas estéril en un invernadero de temperatura regulada. Cuatro semanas después de la siembra, las plantas de 2-3 hojas se pulverizan con uno de los siguientes herbicidas - clodinafop 15 y 30 g/ha, fenoxaprop 50 y 80 g/ha, isoproturon 250 y 1000 g/ha. Doce días después de pulverizar, el daño por herbicida se registra y se corta un segmento basal de plantas supervivientes que incluye una raíz corta y tallo. Una semana después de trasplantar, se trata con uno de los siguientes herbicidas - clodinafop 20 y 40 g/ha, fenoxaprop 80 y 120 g/ha, isoproturon 500 y 1000 g/ha. Dos semanas después de pulverizar se registra el daño por herbicida (véase más
adelante).

El daño por herbicida (%) se determina 3 semanas después de la pulverización.

\vskip1.000000\baselineskip

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{124mm}R1, R2 son biotipos resistentes
conocidos y S es un tipo silvestre (susceptible a
herbicidas).\end{minipage} \cr}

Ejemplo 3

Un segmento basal que incluye un vástago y una raíz corta se separa de plantas que crecen en el campo A. myosuroides y Avena fatua en el Reino Unido y de biotipos de A. myosuroides resistentes a herbicidas y susceptibles que crecen en invernadero y se planta en limo estéril en un invernadero. Diez días después del trasplante, las plantas son pulverizadas con clodinafop (7,5, 15,, 30 g ha^{-1}), fenoxaprop (13,8, 27,5, 55 g ha^{-1}) o isoproturon (250, 500, 1000 g ha^{-1}).

El daño por herbicida (%) se registró 13 días después de la pulverización.

\vskip1.000000\baselineskip

3

	El biotipo 1 es una A. myosuroides de tipo silvestre conocida que crece en invernadero.
	Los biotipos 2, 3 y 7 son A. myosuroides confirmadas resistentes.
	El biotipo 4 es una A. myosuroides resistente presentada recogida en el campo.
	Los biotipos 5 y 6 son A. fatua resistente y de tipo salvaje, respectivamente, recogidas en el campo.

Ejemplo 4

Recogidas de campo de las malas hierbas dicotiledóneas Amaranthus y Chenopodium se regeneran de esquejes.

Plantas de Chenopodium de 12 cm de alto que crecen en un campo se retiran y las raíces se ponen en agua. El tallo se corta por encima de las primeras hojas, dejando solo los primeros nodos. Una parte considerable de las raíces permanecía en la tierra cuando las plantas se retiraban. No se separan raíces adicionales. Los esquejes se trasplantan en macetas de 10 cm que contienen un limo arenoso, en un invernadero.

Plantas de Amaranthus de 15 cm de diámetro se extraen del campo. Los tallos se cortan en secciones pequeñas que contienen dos regiones nodales. La región nodal más vieja se entierra en suelo en macetas (como para Chenopodium) y la más joven se expone.

Dos semanas después del trasplante es evidente un nuevo crecimiento para los esquejes de ambas especies. Plantas de Chenopodium (5-15 cm de alto) y Amaranthus (2-9 cm de alto) se pulverizan con una botella de pulverización disponible comercialmente de 500 ml con una de 5 concentraciones de chlorsulfuron. Se aplican 10 bombeos por maceta. El porcentaje de daño por herbicida se determina visualmente 3 semanas después del tratamiento. Los resultados muestran que puede alcanzarse una buena respuesta a la dosis para una concentración de herbicida creciente incluso con malas hierbas dicotiledóneas.

4

Ejemplo 5

Semillas de biotipos de A. myosuroides resistentes y susceptibles se siembran en macetas que contienen suelo para macetas estéril en un invernadero. Ocho semanas después de la siembra, se separa un segmento basal (esqueje) de las plantas que incluye una raíz corta y tallo. Una semana después de trasplantar, habían crecido nuevas hojas de 5-10 cm de largo y las plantas se tratan con herbicida con una botella de pulverización disponible comercialmente de 500 ml con los herbicidas siguientes. Se realizan diluciones a partir de 1 ml (formulación de herbicida comercial)/litro (agua del grifo). Por ejemplo, 1 x (más adelante es una concentración de 1 ml/litro que para la formulación comercial de cycloxydim es 0,61 mM de cycloxydim). Se aplican cinco bombeos por maceta. El porcentaje de daño por herbicida se determina visualmente dos semanas después del tratamiento. El experimento muestra que la resistencia al herbicida puede detectarse incluso con tal sistema de pulverización simple.

5

Ejemplo 6

Plántulas de cebada jóvenes se pulverizan con compuestos de prueba en un pulverizador de cabina y se seleccionan al no mostrar síntomas de mildiú polvoriento (es decir, los compuestos son fungicidas) una semana después de la inoculación. Un segmento basal de plantas que incluyen una raíz corta y tallo (esqueje) se separa a continuación y se trasplanta en macetas que contienen suelo para macetas estéril en un invernadero. Dos semanas después del trasplante, es evidente un nuevo crecimiento foliar y las plantas se vuelven a tratar con fungicida o no. Las plantas pulverizadas nuevamente mostraban baja infección fúngica pero las plantas no pulverizadas nuevamente tenían una infección fúngica muy alta. Esto muestra que los esquejes de plantas pretratadas no mostraban actividad duradera cuando se inoculaban dos semanas después de la primera prueba indicando que ninguno de los compuestos son activos en las plantas después de dos semanas.

6

Ejemplo 7

Semillas de 4 biotipos de A. myosuroides resistentes y uno susceptible se siembran en macetas que contienen suelo para macetas estéril en un invernadero. Ocho semanas después de la siembra, se separa un esqueje que comprende una raíz corta y tallo. Los esquejes se sumergen en una de diversas concentraciones del herbicida fenoxaprop y a continuación se trasplantan inmediatamente a macetas que contienen suelo para macetas estéril. El porcentaje de daño por herbicida se determina visualmente dos semanas después del tratamiento. Este experimento resalta el potencial no solo para pulverizar los esquejes para una prueba de resistencia sino también para sumergir los esquejes en herbicida o incluso insertar los esquejes en un medio que ya contiene herbicida.

7

Claims

1. Un método para probar plantas de progenie, que comprende

(a): propagar asexualmente una planta o plantas de progenie a partir de una planta madre cortando un segmento de una planta madre, comprendiendo dicho segmento una región meristemática que está suficientemente intacta para haber retenido su capacidad de regenerar una planta completa y morfológicamente normal, y regenerar directamente dicho segmento;

(c): verificar el crecimiento de la planta de progenie.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de propagación (a) se efectúa

(a): cortando un segmento corto de una planta madre de modo que dicho segmento sea capaz de regenerarse directamente en una planta entera y morfológicamente normal

(b): transfiriendo dicho segmento separado a un material de anclaje adecuado; y

(c): regenerando directamente dicho segmento transferido en una planta entera y morfológicamente normal.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho segmento comprende una región que contiene una alta cantidad de células que se dividen activamente.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha región comprende células meristemáticas.

5. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 3 y 4, en el que dicho segmento comprende un fragmento de raíz corta y vástago.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el material de anclaje es

(a): un material inerte tal como vermiculita, perlita o cuentas de plástico;

(b): un medio de cultivo aplicado comúnmente en el cultivo de plantas; o

(c): suelo.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde dicho método se usa dentro de un formato de alta producción.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de propagación (a) se efectúa

(a): cortando un segmento corto de una planta madre de modo que dicho segmento sea capaz de regenerarse directamente en una planta entera y morfológicamente normal,

(b)_{1}: sumergiendo dicho segmento en una concentración o concentraciones conocidas de una solución que contiene plaguicida; o, alternativamente,

(b)_{2}: pulverizando dicho segmento con una concentración o concentraciones conocidas de una solución que contiene plaguicida;

(c): transfiriendo los explantes de planta así tratados a un material de anclaje adecuado;

(d): regenerando directamente dicho explante en una planta entera y morfológicamente normal.

9. Método para recuperar plantas que muestran un rasgo o una propiedad interesante después del tratamiento con un plaguicida para investigación adicional, que comprende

(a): propagar asexualmente una planta o plantas de progenie a partir de una planta madre tratada cortando un segmento de dicha planta madre, comprendiendo dicho segmento una región meristemática que está suficientemente intacta para haber retenido su capacidad de regenerar una planta completa y morfológicamente normal, y regenerar directamente dicho segmento;

(c): verificar el crecimiento de la planta de progenie.

10. Método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la etapa de propagación (a) se efectúa

(a): cortando un segmento corto de una planta madre de modo que dicho segmento sea capaz de regenerarse directamente en una planta entera y morfológicamente normal;

11. Método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la etapa de propagación (a) se efectúa

(a): cortando un segmento corto de una planta madre tratada de modo que dicho segmento sea capaz de regenerarse directamente en una planta entera y morfológicamente normal;

12. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que comprende además la etapa de una investigación adicional del material recuperado.

13. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que el plaguicida se selecciona del grupo que consiste en un herbicida, un insecticida y un fungicida.

14. Método para determinar si un fenotipo de resistencia observado en una planta se debe a un rasgo de resistencia o está provocado por otros factores, que comprende

(a): recoger la planta fenotípicamente resistente;

(b): propagar asexualmente una planta o plantas de progenie a partir de dicha planta resistente cortando un segmento de dicha planta resistente, comprendiendo dicho segmento una región meristemática que está suficientemente intacta para haber retenido su capacidad para regenerar una planta completa y morfológicamente normal, y regenerar directamente dicho segmento;

(c): incorporar la planta de progenie así obtenida en un programa de rastreo de plantas; y

(d): verificar el crecimiento de la planta de progenie.

15. Método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la etapa de propagación (b) se efectúa

(a): cortando un segmento corto de dicha planta de modo que dicho segmento sea capaz de regenerarse directamente en una planta entera y morfológicamente normal;

(f): regenerando directamente dicho explante en una planta entera y morfológicamente normal.

16. Método de acuerdo con las reivindicaciones 14 y 15, en el que el fenotipo de resistencia se observa después de tratar la planta con un plaguicida.

17. Método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el plaguicida se selecciona del grupo que consiste en un herbicida, un insecticida y un fungicida.

18. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la planta que ha de probarse es una planta de mala hierba.

19. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la planta que ha de probarse es una planta de cultivo.

20. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la planta que ha de probarse es una planta transgénica.