ES2227771T3 - Alfa-amilasa purificada de origen fungico estable en acido. - Google Patents
Alfa-amilasa purificada de origen fungico estable en acido.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN METODO BARATO Y SENCILLO DE PURIFICACION DE ALFA-AMILASA FUNGICA ESTABLE AL ACIDO EN EL QUE LA ALFA-AMILASA SE OBTIENE SIN PERDIDA SIGNIFICATIVA DE ACTIVIDAD ENZIMATICA. LA ALFA-AMILASA PURIFICADA ESTABLE AL ACIDO QUE SE OBTIENE ESTA SUSTANCIALMENTE LIBRE DE GLUCOAMILASA. EL METODO PARA LA OBTENCION DE UNA ALFA-AMILASA ESTABLE AL ACIDO COMPRENDE LOS SIGUIENTES PASOS: - AJUSTAR EL PH DE LA SOLUCION QUE CONTIENE LA ENZIMA A UN VALOR ENTRE 1 Y 8, - CALENTAMIENTO DE LA SOLUCION A UNA TEMPERATURA Y DURANTE UN TIEMPO SUFICIENTES PARA INACTIVAR LA GLUCOAMILASA, - ELIMINACION DE LA GLUCOAMILASA DESNATURALIZADA. LA ALFA-AMILASA PURIFICADA ESTABLE AL ACIDO SE UTILIZA PARA LA CONVERSION DEL ALMIDON. LA ALFA-AMILASA PURIFICADA SE USA TAMBIEN EN UNA FORMA INMOVILIZADA.
Description
Alfa-amilasa purificada de origen
fúngico estable en ácido.
La presente invención se refiere a una
alfa-amilasa fúngica estable en medio ácido
purificada y a un proceso para obtener dicha
alfa-amilasa purificada. Además, se demuestra el uso
de la alfa-amilasa purificada en forma libre e
inmovilizada para obtener jarabes de glucosa específicos.
Las alfa-amilasas estables en
medio ácido de origen fúngico se han descubierto hace mucho tiempo.
Por ejemplo, la alfa-amilasa estable en medio ácido
de A.niger se conoce desde hace más de 30 años (Y. Minoda,
K. Yamada, Agr. Biol. Chem., 27(11),
806-811(1963)) y se ha caracterizado a fondo
por Minoda, Yamada y colaboradores. Los mismos autores mostraron la
estabilidad de la actividad enzimática en presencia de Ca^{2+}.
Se describió la presencia de una alfa-amilasa
inestable en medio ácido en preparaciones de Aspergillus
niger por los mismos autores. La enzima
alfa-amilasa estable en medio ácido tiene un pH
óptimo entre 3 y 4 y la temperatura óptima está en el intervalo de
70 a 75ºC.
Se han desarrollado varios procedimientos para
obtener alfa-amilasa estable en medio ácido en forma
purificada. Un método (Minoda y Yamada, citado anteriormente) usa
precipitación fraccional con sulfato amónico, rivanol y acetona para
obtener la enzima en forma cristalina. Se encontró que esta
alfa-amilasa cristalina estaba contaminada con una
alfa-amilasa inestable en medio ácido, mientras que
la glucoamilasa y la transglucosidasa eran eliminadas. La
alfa-amilasa inestable en medio ácido pudo
posteriormente ser eliminada mediante tratamiento de la mezcla de
alfa-amilasa a pH ácido (pH 2,5) y 37ºC, seguido
por fraccionamiento. Se llevó a cabo una purificación adicional
mediante recristalización en acetona y filtración en gel con
Sephadex G-50.
Otras publicaciones describen un método de
purificación basado en cromatografía en
DEAE-Sephadex A-25 (D.S. Chong, Y.
Tsujisaka, J. Ferment. Technol., 54(4),
264-266(1976)) o precipitación con sulfato
amónico seguido por cromatografía en DEAE-Sephadex
A-50 (N. Ramasesh, K.R. Sreekantiah, V.S. Murthy,
Starch, 34(8), 274-279(1982)).
También se ha utilizado Sephadex G-25, seguido por
cromatografía en Sepharose Q Fast Flow (Y-Y. Linko,
X.Y. Wu, Biotechnology Techniques, 7(8)).
La Solicitud de patente europea EP 0138428
describe la producción de una alfa-amilasa que está
libre de transferasa y amiloglucosidasa. Esto se consigue mediante
el tratamiento del Aspergillus niger apropiado con agentes
mutagénicos y la selección de variedades mutantes que no producen
las indeseadas actividades enzimáticas. El caldo de fermentación de
estas variedades mutantes contiene principalmente entonces la
actividad de alfa-amilasa estable en medio
ácido.
Se han dado a conocer exhaustivamente las
propiedades de dextrinación y sacarificación de la
alfa-amilasa estable en medio ácido de A.
niger. La conversión de almidón licuado en glucosa usando una
mezcla de glucoamilasa y alfa-amilasa estable en
medio ácido se describe en la Solicitud de patente europea 0140410
donde se muestra que la presencia de alfa-amilasa
estable en medio ácido reduce el tiempo de sacarificación y da
rendimientos de dextrosa más altos.
También el documento de Linko et al. (cit.
anteriormente) describe el uso de alfa-amilasa
estable en medio ácido en la producción de dextrosa.
Hansen (T.T. Hansen, New Approaches to
Research on Cereal Carbohydrates, eds. R.D Hill y L. Munck,
Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam 1985,
211-216) ha dado a conocer el uso de
alfa-amilasa estable en medio ácido para la
sacarificación de una maltodextrina de DE 12 para obtener un jarabe
con glucosa al 7%, DP2 al 48%, DP3 al 26% y DP4+ al 20% tras 96
horas. Se ha descrito en el mismo documento la producción de un
jarabe de DE 63 a partir de un jarabe licuado ácido de DE 42 por
una alfa-amilasa estable en medio ácido
inmovilizada. Este documento sin embargo no describe cómo se
purificó la alfa-amilasa estable en medio ácido que
se usa. El DE (equivalente de dextrosa) es una medida para el número
de grupos reductores que están presentes en las moléculas. La
glucosa pura tiene un DE de 100 y el almidón sin degradar tiene un
DE de 0. La licuefacción de almidón con la
alfa-amilasa estable en medio ácido a
75-85ºC dio sustratos de almidón que se
sacarificaron por glucoamilasa. Los jarabes obtenidos tenían el
rendimiento correcto de dextrosa, pero eran almidón positivo y
tenían pobres filtrabilidades.
Se ha descrito en la Solicitud de patente europea
EP 0157638 el uso de alfa-amilasa estable en medio
ácido inmovilizada obtenida a partir de cepas mutantes.
Se sometió a incubación una suspensión de
almidón, pre-licuado con
alfa-amilasa de B. licheniformis, con
alfa-amilasa estable en medio ácido a 90ºC y pH 5,
dado el potencial para ser usada como una enzima de
post-licuefacción para producción de jarabe con alto
contenido en maltosa donde se requiere un DE inicial bajo. Tras 20
minutos, la temperatura se bajó a 60ºC y se añadió
beta-amilasa de cebada junto con pululanasa. El
jarabe final contenía glucosa al 0,5% y maltosa al 71% y azúcares
fermentables al 91%. Un jarabe de referencia producido sin
alfa-amilasa tuvo la misma composición de DP1 y de
DP2, pero azúcares fermentables al 77% solamente.
Se ha descrito una alfa-amilasa
estable en medio ácido de A.niger capaz de degradar almidón
sin refinar (B.N. Okolo, L.I. Ezeogu, C.N. Mba, J. Sci. Food.
Agric., 69,109-115 (1995)). Las
alfa-amilasas estables en medio ácido pueden no sólo
ser encontradas en Aspergillus niger, también se han
encontrado en Aspergillus awamori (R.S. Bhella, I. Altosaar,
Can. J. Microbiol., 31, 149-153(1985))
se describió que estas alfa-amilasa eran estables
entre pH 3,5 y 6,5.
Aunque es evidente a partir de la literatura
mencionada que la alfa-amilasa estable en medio
ácido de Aspergillus niger, o de otras especies
Aspergillus que producen alfa-amilasa
estable en medio ácido, es de potencial importancia industrial, la
preparación de alfa-amilasa estable en medio ácido
de Aspergillus sp. no comercial está libre de actividad
secundaria de glucoamilasa. La presencia de la glucoamilasa en las
preparaciones comerciales de alfa-amilasa estable en
medio ácido reduce significativamente la gama de aplicaciones donde
estas preparaciones se pueden utilizar.
La presente invención describe un método de
purificación sencillo y económico para alfa-amilasa
fúngica estable en medio ácido en el que la
alfa-amilasa se obtiene sin pérdida significante de
actividad enzimática.
La presente invención describe una
alfa-amilasa estable en medio ácido purificada que
está sustancialmente libre de glucoamilasa. Preferiblemente, la
alfa-amilasa es de origen fúngico, en el que el
hongo preferido es una especie Aspergillus, preferiblemente
Aspergillus niger o Aspergillus awamori.
La presente invención también describe un método
para obtener una alfa-amilasa estable en medio ácido
que comprende las etapas de
- ajustar el pH de la solución que contiene la
enzima a un valor entre 1 y 8,
- calentar la solución a una temperatura
específica y durante un tiempo suficiente para inactivar la
glucoamilasa,
- eliminar la glucoamilasa desnaturalizada.
En una realización preferida de la invención el
calentamiento se lleva a cabo en presencia de iones calcio. El
calentamiento es a una temperatura de entre 40 a 80ºC
preferiblemente entre 50 y 75ºC.
La presente invención describe además el uso de
una alfa-amilasa estable en medio ácido purificada
para la conversión de almidón. La enzima purificada de la presente
invención se usa para preparar jarabes de alto contenido en maltosa
o jarabes de alto contenido en maltotriosa que contienen bajas
cantidades de glucosa, que es inferior al 10%, preferiblemente
inferior al 5%. La alfa-amilasa purificada también
se usa en forma inmovilizada.
La presente invención describe un tratamiento
térmico del caldo de cultivo que contiene
alfa-amilasa/glucoamilasa obtenida tras crecimiento
de un hongo, preferiblemente de una Aspergillus sp. a valores
de pH específicos. El pH y la temperatura se eligen para reducir o
eliminar la actividad de glucoamilasa en estas preparaciones. La
glucoamilasa desactivada flocula tras este tratamiento y se puede
filtrar fácilmente o eliminar mediante centrifugación u otra técnica
de separación y así, rendir una preparación de
alfa-amilasa estable en medio ácido pura. La
alfa-amilasa estable en medio ácido así obtenida se
puede usar como tal o tras concentración y adición de agentes
estabilizantes.
Puesto que durante este tratamiento térmico
también se destruye la actividad de alfa-amilasa
inestable en medio ácido, lo que se obtiene es una solución que
contiene sólo alfa-amilasa estable en medio ácido y
que está libre de glucoamilasa, alfa-amilasa
inestable en medio ácido y transglucosidasa. La solución se puede
usar como tal o se puede concentrar antes del uso mediante
filtración, calentamiento o liofilización. Se añaden agentes
estabilizantes si es necesario.
La presente invención describe una
alfa-amilasa estable en medio ácido purificada que
está sustancialmente libre de glucoamilasa. Preferiblemente la
alfa-amilasa es de origen fúngico, en el que el
hongo es una especie Aspergillus, preferiblemente
Aspergillus niger o Aspergillus awamori.
La presente invención también describe un método
para obtener una alfa-amilasa estable en medio ácido
que comprende las etapas de
- ajustar el pH de la solución que contiene la
enzima a un valor entre 1 y 8,
- calentar la solución a una temperatura
específica y durante un tiempo suficiente para inactivar la
glucoamilasa,
- eliminar la glucoamilasa desnaturalizada.
En una realización preferida de la invención la
solución que contiene la enzima es un caldo de fermentación.
Primero se elimina el material celular o microbiano, por ejemplo,
mediante filtración o centrifugación. Luego el caldo de fermentación
se calienta. El calentamiento es a una temperatura en la que la
glucoamilasa se inactiva mientras que al mismo tiempo la
alfa-amilasa estable en medio ácido mantiene su
actividad. La temperatura exacta depende de la fuente de la enzima y
de la composición del caldo de fermentación. Se han usado
temperaturas entre 50 y 80ºC pero las temperaturas preferidas están
en el intervalo desde 60 a 75ºC. Cuando la temperatura es demasiado
alta influye en la actividad residual de la
alfa-amilasa estable en medio ácido, por tanto se
debe tener cuidado de no sobrecalentar la preparación.
Preferiblemente el calentamiento se lleva a cabo en presencia de
iones calcio. Los iones calcio deben estar presentes en una
cantidad que sea suficiente para estabilizar la
alfa-amilasa estable en medio ácido. Se han usado
satisfactoriamente cantidades de iones calcio en el intervalo de
entre 50 y 350 ppm. Las cantidades exactas podrían depender de la
fuente de la enzima y de posibles contaminantes en el caldo de
fermentación.
Se ha encontrado que valores de entre 150 y 250
ppm eran particularmente útiles.
También es posible usar el presente método con
preparaciones enzimáticas como las suministradas por los proveedores
porque estas contienen una cantidad considerable de glucoamilasa.
En este caso está claro que el método de la presente invención no
comienza con el caldo de fermentación sino con la preparación
enzimática como la suministrada por el fabricante de la que ya se ha
eliminado el material microbiano y que está generalmente tamponada
y contiene agentes estabilizantes. Estas preparaciones también
contienen las enzimas en una forma mucho más concentrada.
La presente invención describe además el uso de
una alfa-amilasa estable en medio ácido purificada
para la conversión del almidón. Con la enzima purificada se hace
posible preparar jarabes de alto contenido en maltosa que contienen
cantidades relativamente bajas de glucosa, esto es, la cantidad de
glucosa es inferior al 10% preferiblemente inferior al 5%.
La alfa-amilasa purificada se
puede usar como tal o se puede usar en forma inmovilizada. La
inmovilización se puede llevar a cabo con técnicas de
inmovilización conocidas. La enzima se puede, por ejemplo, atrapar
en una matriz o gel (alginato, carragenano) o se puede unir a
resinas de intercambio iónico.
Se encontró que los productos de
alfa-amilasa disponibles comercialmente contenían
una cantidad considerable de contaminación enzimática.
Especialmente, se encontró que las preparaciones de
alfa-amilasa estable en medio ácido obtenidas de
origen fúngico contenían actividades considerables de glucoamilasa y
de alfa- amilasa inestable en medio ácido.
Se encontró que la enzima de partida para los
Ejemplos 1, 2 y 5 (disponible de Stern Enzyme) contenía 7,2 UGA/g y
4.500 UAA/g. Una preparación adicional vendida como
G-ZYME^{TM} G998 por Enzyme
Bio-Systems (usada en los Ejemplos 3 y 4) contenía
15,7 UGA/g y 840 UAA/g. Otras preparaciones enzimáticas que se han
investigado fueron SANACTASE (polvo, Meiji Seika Kaishi Ltd) 1.380
UAA/g y 123 UGA/g y MULTIFRESH (variante secada por pulverización de
G998, Enzyme Bio-Systems) 119 UGA/g y 9.356
UAA/g.
En el Ejemplo 1 se demuestra que la incubación a
70ºC durante 1 hora en presencia de iones calcio da inactivación
completa de glucoamilasa mientras que permanece el 74% de la
actividad de alfa-amilasa estable en medio ácido. A
65ºC la actividad residual de alfa-amilasa es
aproximadamente 10% más alta, también sin embargo, la glucoamilasa
no está completamente inactivada como se demuestra en el Ejemplo 2.
El Ejemplo 3 confirma el resultado del Ejemplo 1 para una segunda
preparación enzimática. Cuando no se añaden iones calcio a la
preparación del Ejemplo 4 la actividad de
alfa-amilasa disminuye muy fuertemente.
En el Ejemplo 5 se demuestra que el pH influye en
la velocidad y la cantidad de inactivación de la
alfa-amilasa y la glucoamilasa. En el Ejemplo 6 se
determina la cantidad de alfa-amilasa inestable en
medio ácido en la preparación enzimática G-ZYME.
El ejemplo 7 demuestra que la
alfa-amilasa estable en medio ácido purificada se
usa para obtener jarabes de alto contenido en maltosa o incluso
jarabes de alto contenido en maltotriosa que contienen menos de 10%
de glucosa preferiblemente menos de 5%. Esto no es posible con las
preparaciones enzimáticas disponibles comercialmente.
El ejemplo 8 muestra que es posible obtener
jarabe de DE 62 partiendo de un jarabe de DE 42 cuando la
alfa-amilasa estable en medio ácido purificada se
usa en una forma inmovilizada.
La determinación de actividades enzimáticas es
mediante métodos estándares.
Generalmente como los proporcionados por el
proveedor de la enzima.
La actividad de glucoamilasa se determina
mediante hidrólisis de
para-nitrofenil-alfa-D-glucopiranosido
(K.A. Holm, Analyst, 3, 927-929
(1986)). Básicamente, el procedimiento es como sigue. Se permite
reaccionar a una preparación enzimática bajo condiciones estándar
(pH 4,2 55ºC) con
para-nitrofenil-alfa-D-glucopiranosido.
En presencia de una glucoamilasa este sustrato se degrada a glucosa
y para-nitrofenolato que tiene un color amarillo.
La cantidad de para-nitrofenolato producido se
determina colorimétricamente. La actividad enzimática se calcula a
partir de una curva patrón que expresa la relación entre la
concentración de para-nitrofenolato y la
absorbancia.
La actividad de alfa-amilasa se
determina mediante reacción de la enzima con una solución de almidón
estándar. La cantidad de actividad de alfa-amilasa
se mide mediante la velocidad a la cual disminuye la capacidad de
tinción con yodo del almidón. (G.B. Manning, L.L.Campbell, J.
Biological Chemistry, 236, 2952-2957
(1961)).
Se disolvió 1g de polvo que contenía una
alfa-amilasa/glucoamilasa (4.500 UAA/g, 7,2 UGA/g,
200 mg de proteína/g de polvo), de Stern Enzyme, en 19 g de tampón
NaAc/HAc 0,05 N (Ac = acetato) de pH 4,2 que contenía 200 ppm de
Ca^{2+}. Tras filtración para obtener un líquido transparente, la
solución se incubó a 70ºC durante un cierto tiempo. A intervalos
regulares el tratamiento de calor se paró por la adicción de
muestras de 1 ml de la solución incubada a 9 ml de un tampón
NaAc/HAc 0,05 N a pH 5 y temperatura ambiente. Se determinaron las
actividades de GA y AA en estas soluciones. Los resultados se
muestran en la tabla. Típicamente el contenido proteico de la
alfa-amilasa estable en medio ácido remanente era
sólo el 20% del contenido proteico original.
| Tiempo de incubación (h) | % de actividad de AA | % de actividad de GA |
| total* remanente | remanente | |
| 0,5 | 77 | 0,015 |
| 1 | 74 | 0 |
| 1,5 | 64 | 0 |
| 2,0 | 50 | 0 |
| 3,0 | 40 | 0 |
| 4,4 | 25 | 0 |
| \begin{minipage}[t]{157mm} * actividad de AA (alfa-amilasa) total = suma de actividades de alfa-amilasas estables en medio ácido e inestables en medio ácido.\end{minipage} |
Claramente se demuestra que tras una corta
incubación a pH 4,2 y 70ºC se destruye toda la actividad de
glucoamilasa.
Se disolvió 1 g de polvo que contiene
alfa-amilasa/glucoamilasa (4.500 UAA/g, 7,2 UGA/g,
200 mg de proteína/g de polvo) de Stern Enzyme, en 19 g de tampón
NaAc/HAc 0,05 N de pH 3,5 que contenía 200 ppm de Ca^{2+}. Tras
filtración para obtener un líquido transparente la solución se
incubó a 65ºC durante un cierto tiempo. A intervalos regulares el
tratamiento térmico se paró por la filtración de muestras de 1 ml
de la solución incubada y la posterior adición a 9 ml de un tampón
NaAc/HAc 0,05 N a pH 5 y temperatura ambiente. Se determinaron las
actividades de GA y AA en estas soluciones. Los resultados se
muestran en la tabla. Típicamente el contenido proteico de la
alfa-amilasa estable en medio ácido remanente era
sólo el 20% del contenido proteico original.
| Tiempo de incubación (h) | % de actividad de AA | % de actividad de GA |
| total* remanente | remanente | |
| 0,7 | 100 | 16 |
| 1,1 | 88 | 16 |
| 1,6 | 88 | 14 |
| 2,1 | 90 | 8,2 |
| 2,5 | 90 | 8,6 |
| 3,0 | 82 | 8,1 |
| 3,5 | 84 | 8,9 |
| \begin{minipage}[t]{157mm} * actividad de AA (alfa-amilasa) total = suma de actividades de alfa-amilasas estables en medio ácido e inestables en medio ácido.\end{minipage} |
Claramente se demuestra que la incubación a pH
3,5 y 65ºC disminuye la mayoría de la actividad de glucoamilasa.
Se disolvió 1g de G998 (una preparación de
amilasa/glucoamilasa comercial estable en medio ácido líquida de
Enzyme Bio-Systems, 15,7 UGA/g, 840 UAA/g, 38 mg de
proteínas/g de solución enzimática) en 19 g de tampón NaAc/HAc 0,05
N de pH 3,5 que contenía 200 ppm de Ca^{2+}. Tras filtración para
obtener un líquido transparente la solución se incubó a 65ºC
durante un cierto tiempo. A intervalos regulares el tratamiento
térmico se paró por la adicción de muestras de 1 ml de la solución
incubada a 9 ml de un tampón NaAc/HAc 0,05 N a pH 5 y temperatura
ambiente. Se determinaron las actividades de GA y AA en estas
soluciones. Los resultados se muestran en la tabla. Típicamente el
contenido proteico de la alfa-amilasa estable en
medio ácido remanente era sólo el 20-25% del
contenido proteico original.
| Tiempo de incubación (h) | % de actividad de AA | % de actividad de GA |
| total* remanente | remanente | |
| 0,7 | 98 | 6,2 |
| 1 | 97 | 1,4 |
| 1,5 | 80 | 1,1 |
| 2 | 75 | 0,2 |
| 2,5 | 76 | 0,0 |
| 3,5 | 76 | 0,0 |
| \begin{minipage}[t]{157mm} * actividad de AA (alfa-amilasa) total = suma de actividades de alfa-amilasas estables en medio ácido e inestables en medio ácido.\end{minipage} |
También en este ejemplo la
alfa-amilasa estable en medio ácido se libera
fácilmente de la actividad de glucoamilasa contaminante.
Las condiciones experimentales usadas en el
ejemplo 4 son las mismas que las descritas en el ejemplo 3, excepto
que no se añadió Ca^{2+} al tampón NaAc/HAc a pH 3,5.
| Tiempo de incubación (min) | % de actividad de AA | % de actividad de GA |
| total* remanente sin Ca^{2+} | remanente con Ca^{2+} | |
| 10 | 49 | |
| 20 | 32 | |
| 30 | 29 | |
| 40 | 21 | 98 |
| \begin{minipage}[t]{157mm} * actividad de AA (alfa-amilasa) total = suma de actividades de alfa-amilasas estables en medio ácido e inestables en medio ácido.\end{minipage} |
A partir de estas cifras es claro que la
presencia de Ca^{2+} es necesaria para incrementar la estabilidad
térmica de la alfa-amilasa estable en medio
ácido.
Se disolvieron 0,5 g de polvo que contiene
alfa-amilasa/glucoamilasa (4.500 UAA/g, 7,2 UGA/g,
200 mg de proteína/g de polvo), de Stern Enzyme, en 2,5 ml de agua
desmineralizada. Tras filtración para obtener un líquido
transparente, se llevó a cabo una etapa de desalación en una
columna PD-10 (Pharmacia), rindiendo 3,5 ml de
solución que contenía alfa-amilasa/glucoamilasa.
Esta solución se diluyó cuatro veces con tampón NaAc/HAc 0,1 N de
pH 4,2 ó 3,5 que contenía 200 ppm de Ca^{2+}. Las soluciones así
preparadas se incubaron a 70ºC durante un cierto tiempo. Tras
intervalos regulares el tratamiento térmico se paró por la adición
de muestras de 1 ml de las soluciones incubadas a 9 ml de un tampón
NaAc/HAc 0,05 N a pH 5 y temperatura ambiente. Se determinaron las
actividades de GA y AA en estas soluciones. Los resultados se
muestran en la tabla. Típicamente el contenido proteico de la
alfa-amilasa estable en medio ácido remanente era
sólo el 20% del contenido proteico original.
| pH | Tiempo de incubación (h) | % de actividad de AA | % de actividad de GA |
| total* remanente | remanente | ||
| 3,5 | 0,08 | 84 | 0 |
| 4,2 | 0,17 | 100 | 55 |
| 4,2 | 0,25 | 80 | 10 |
| \begin{minipage}[t]{157mm} * actividad de AA (alfa-amilasa) total = suma de actividades de alfa-amilasas estables en medio ácido e inestables en medio ácido.\end{minipage} |
Para establecer la cantidad de
alfa-amilasa inestable en medio ácido en una
preparación de alfa-amilasa de Aspergillus
sp. comercial, se aplicó el siguiente método: se llevó una
solución de la enzima a pH 2,5 y se incubó a 37ºC durante 30
minutos. Entonces se enfrió y neutralizó a pH 4,8. Posteriormente,
se determinó la actividad de alfa-amilasa.
| Enzima | % de actividad de alfa-amilasa inestable en medio ácido en la preparación enzimática original |
| G998 | 5 |
| Enzima Stern | 8 |
Puesto que las actividades de AA relativas
remanentes se comparan con la actividad de AA total en los ejemplos
1-5, esto significa que la actividad de
alfa-amilasa estable en medio ácido remanente es más
alta que los valores dados en la tabla en los ejemplos
1-5.
Se sacarificó una maltodextrina secada por
pulverización de DE 5 (equivalentes de dextrosa) (C \ding{76} PUR
1904, hecha a partir de la licuefacción completa de maíz con
\alpha-amilasa termoestable de Bacillus
licheniformis) con G998 o con la
\alpha-amilasa purificada obtenida de G998 como la
descrita en el ejemplo 3.
Las sacarificaciones se realizaron a 60ºC y pH
4,5 y a una concentración de sustrato de 30 g/100 g de solución.
En el caso de la sacarificación con G998, se
añadió a la mezcla de sacarificación 0,1% sobre materia seca de
G998. Para la sacarificación con la \alpha-amilasa
purificada, se añadió el mismo equivalente de unidades
\alpha-amilasa como las presentes en 0,1% d.s
G988.
Se obtuvieron los siguientes resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
Es evidente a partir de esta tabla que la
\alpha-amilasa purificada produce un espectro de
producto diferente totalmente que el de la G998 original, que es una
mezcla de actividades de \alpha-amilasa y
glucoamilasa. Usando la alfa-amilasa purificada de
la presente invención es posible obtener jarabes de maltosa
(DP_{2}) que contienen bajas cantidades de glucosa (DP_{1}). La
cantidad de glucosa es inferior al 10%.
Se pusieron en contacto 8.900 UAA de G998 con 10
ml de un intercambiador iónico húmedo. La mezcla se agitó durante 12
h a temperatura ambiente y luego se lavó con agua desmineralizada.
El conjugado se introdujo en una columna de vidrio termostatizada
equipada con una doble camisa y un jarabe de DE 42, se llevó a pH
4,5 y se hizo pasar a través de la columna a 50ºC.
Se preparó otro conjugado por la adición de 8.900
U de \alpha-amilasa purificada, como la obtenida
en el ejemplo 3, a 10 ml del mismo intercambiador iónico húmedo
como el usado para la inmovilización de G998. La mezcla se agitó
durante 12 h a temperatura ambiente, y luego se lavó con agua
desmineralizada. El conjugado se introdujo en una columna de vidrio
termostatizada equipada con una doble camisa y un jarabe de DE 42,
se llevó a pH 4,5 y se hizo pasar a través de la columna a 50ºC.
El objetivo era producir un jarabe de DE 62. Se
obtuvieron los siguientes resultados:
Es directamente evidente a partir de la tabla que
el modelo de acción de la \alpha-amilasa estable
en medio ácido purificada inmovilizada de G998 es totalmente
diferente del modelo de acción dado por la G998 inmovilizada.
Claims (8)
1. Un método para obtener una
alfa-amilasa estable en medio ácido purificada de
origen fúngico, que comprende las siguientes etapas:
- ajustar el pH de la solución que contiene la
enzima a un valor entre 1 y 8,
- calentar la solución a una temperatura entre 40
y 80ºC para inactivar la glucoamilasa,
- eliminar la glucoamilasa desnaturalizada.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que
la solución es un caldo de fermentación.
3. Un método según la reivindicación 1, en el que
el calor se lleva a cabo en presencia de iones calcio.
4. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la solución o caldo de
fermentación se calienta a una temperatura entre 50 y 75ºC.
5. Un método según la reivindicación 1, en el que
el hongo es una especie seleccionada del género Aspergillus,
preferiblemente Aspergillus niger o Aspergillis
awamori.
6. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la alfa-amilasa
estable en medio ácido se usa para la conversión de almidón.
7. Un método según la reivindicación 6, en el que
la alfa-amilasa estable en medio ácido purificada
se usa para la preparación de jarabes de alto contenido en maltosa
o jarabes de alto contenido en maltotriosa que contienen menos de
10% de glucosa preferiblemente menos de 5% de glucosa.
8. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 y 7, en el que la alfa-amilasa
estable en medio ácido purificada se usa en forma inmovilizada.
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