ES2226626T3 - Capa de sensores controladora de difusion. - Google Patents
Capa de sensores controladora de difusion.Info
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Abstract
Capa de sensores (3) para la detección de la actividad biológica de sustancias (2), estando formada la capa de sensores (3) por una matriz controladora de difusión y sensores (7) suspendidos en la misma, caracterizada porque 50 ml de masa de capa de sensores contienen 2 a 8 ml, preferiblemente 3 a 5 ml, de suspensión de células de gen indicador y porque las células de gen indicador son bioluminescentes.
Description
Capa de sensores controladora de difusión.
Las informaciones acerca de la actividad
biológica de sustancias son esenciales para el desarrollo y la
aplicación de sustancias activas, en particular en el área
farmacéutica. Las comprobaciones de actividad representan etapas
decisivas en la valoración de los resultados de la química
combinatoria, así como la evaluación de sustancias naturales o de
bibliotecas de sustancias sintéticas. La invención trata de una capa
de sensores controladora de difusión, un dispositivo y un
procedimiento para la detección de la actividad biológica de
sustancias.
Para la comprobación de actividades biológicas se
usan generalmente formatos de placas de microvaloración o formatos
derivados de éstos. Una característica común de estas técnicas es
la realización del ensayo de actividad en compartimentos cerrados
(pocillos de placas de microvaloración, vial, punto del sensor en
disposición de sensores). Aquí, la sustancia a comprobar se pone en
contacto con el sistema de sensores en volúmenes discretos de
líquido, por ejemplo dentro de los pocillos de las placas de
microvaloración. La actividad biológica se detecta en los distintos
pocillos de las placas de microvaloración mediante la reacción
correspondiente del sistema de sensores, por ejemplo, cambio de
color en presencia de sustancias bioactivas [High Throughput
Screening, John P. Devlin, Marcel Dekker INC, Nueva York, 1997].
Según el estado de la técnica, los organismos sensores se encuentran
en una suspensión, en la que se pueden difundir libremente. En una
suspensión puede llegar a producirse una sedimentación de los
organismos sensores durante el proceso de detección. Además, no se
consigue un recubrimiento homogéneo de distintos materiales
(vidrio, plástico, metal) y superficies (lisas, rugosas,
porosas).
Si bien se consiguen informaciones acerca de la
actividad de una muestra en su conjunto mediante los procedimientos
de comprobación que corresponden al estado de la técnica, debido a
su modo de trabajo discontinuo, éstos no son capaces de representar
la distribución local de actividad biológica en la superficie de
objetos a comprobar.
Otra restricción para procedimientos de ensayo
según el estado de la técnica consiste en la sensibilidad a
interferencias, que conducen a afirmaciones falsamente negativas.
En los ensayos convencionales basados en células interfieren las
sustancias citotóxicas, mientras que en los ensayos enzimáticos
influyen, por ejemplo, sustancias desnaturalizantes. Estos
componentes perturbadores pueden estar presentes como contaminación
en la muestra a comprobar o forman parte de la mezcla de
sustancias, como frecuentemente ocurre en el caso de las sustancias
naturales.
Las comprobaciones de actividad establecidas
presentan el problema de ajustar las concentraciones o actividades
óptimas de las sustancias a comprobar en las condiciones de
medición. En condiciones de ensayo reales, es muy costoso cumplir
los requisitos resultantes de ello para las preparaciones de las
muestras de sustancias en parte desconocidas.
Los ensayos de actividad que están basados en un
proceso de varias etapas (por ejemplo basados en la expresión
\beta-galactosidasa con reacción de color
posterior), requieren según el estado de la técnica un modo de
trabajo de varias etapas con el consiguiente aumento de costes para
la realización de los ensayos.
Las muestras adecuadas para las comprobaciones de
actividad según los procedimientos conocidos son sustancias puras.
No obstante, en la práctica se presentan en la mayoría de los casos
mezclas de sustancias.
Respecto a ello se describe en el documento EP
588 139 como se comprueba la actividad biológica de sustancias
mediante una combinación de separación cromatográfica de las
sustancias a comprobar en zonas cromatográficas con un ensayo
posterior de la actividad biológica (toxicidad) de las distintas
fracciones separadas. Para ello, las distintas fracciones se ponen
en contacto con microorganismos luminosos, que mediante un cambio
local de su bioluminescencia en las distintas fracciones indican la
actividad biológica de esta fracción.
La separación de las sustancias en las fracciones
se realiza, por ejemplo, mediante cromatografía de capa fina o
cromatografía en columna (HPLC). En caso de la cromatografía de
capa fina, se humedece la placa de cromatografía de capa fina con
una suspensión de microorganismos luminosos y se analiza la
bioluminescencia local, asignada a las distintas fracciones. En el
caso de la separación con ayuda de la cromatografía en columna, la
suspensión de microorganismos luminosos se adiciona continuamente
al eluido de la columna cromatográfica y se mide la bioluminescencia
de la mezcla.
En P.D. Shaw et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
EEUU, Vol. 94, 1997, 6036- 6041 se describe un método de
cromatografía de capa fina, en el que se realiza la detección de
homoserinalactona mediante un sistema de gen indicador en una capa
de agar de un grosor de 3 mm como medio de cultivo. Este
procedimiento se usa exclusivamente para la detección analítica de
la homoserinalactona. El sistema de detección descrito para
detectar homoserinalactona está basado en un Agrobacterium
tumefaciens modificado y la actividad cromógena. Con el elevado
grosor de capa aquí descrito sólo puede conseguirse una capacidad de
representación relativamente baja, con unos límites de
detección
elevados.
elevados.
En el documento WO 97/16569 está descrita la
detección de la actividad de sustancias que se obtienen
exclusivamente mediante síntesis en fase sólida, por ejemplo en
perlas polímeras. Para la detección de la actividad se indican
ensayos enzimáticos y ensayos de enlace. No se habla de una
aplicación general a sustancias a comprobar de cualquier origen.
Tampoco pueden realizarse con el procedimiento descrito en el
documento WO 97/16569 las posibilidades para el acoplamiento
directo con técnicas cromatográficas de separación con métodos de
detección espectroscópicos de la estructura, que son importantes
para la aplicación práctica.
El documento WO 94/02515 también describe la
liberación de sustancias de perlas polímeras, así como una
posterior detección de la actividad (ensayos basados en células).
Tampoco aquí se habla de aplicaciones más generales.
En el documento EP 063 810 A1 se describe una
realización especial de ensayos inmunológicos para aplicaciones
diagnósticas. La solicitud trata de la preparación y aplicación de
tiras reactivas para ensayos relevantes en la medicina.
En el documento US 5,766,963 se da a conocer un
ensayo enzimático con una enzima como sensor, en el que las
sustancias a comprobar se aplican mediante síntesis en fase sólida
en soportes sólidos, por ejemplo perlas, y se ponen en contacto con
una matriz coloidal, por ejemplo agarosa. Bajo la radiación de luz,
las sustancias difunden de los soportes sólidos en la matriz y
forman zonas de una elevada concentración de sustancia cerca de los
soportes. En la matriz, las sustancias entran en contacto con la
enzima. La interacción de sustancia y enzima genera un efecto
fotométrico medible, por ejemplo la emisión de fluorescencia. Esta
emisión de fluorescencia puede detectarse en una gran superficie con
un fluorímetro o una cámara CCD.
El objetivo de la invención es encontrar una
posibilidad para la detección de la actividad biológica de
sustancias que en comparación con el estado de la técnica sea más
sencilla, más sensible, más rápida, tenga aplicaciones más amplias
y conlleve un menor riesgo de artefacto.
La solución del objetivo según la invención es
una capa de sensores para la detección de la actividad biológica de
sustancias que se ponen en contacto con la muestra, formada por una
matriz controladora de difusión y sensores allí suspendidos,
estando incluidos en 50 ml de masa de capa de sensores 2 a 8 ml,
preferiblemente 3 a 5 ml, de suspensión de células de gen indicador,
siendo bioluminescentes las células de gen indicador.
La matriz puede ser un gel de valencia
secundaria, por ejemplo agarosa, o un gel polímero, por ejemplo
acrilato o una solución viscosa, por ejemplo polietilenglicol en
agua. El agar no es muy adecuado debido al punto de gelificación
relativamente elevado, en particular al tratarse de sensores
inestables a temperaturas elevadas.
La capa de sensores forma una barrera de difusión
para las sustancias que están en contacto con la misma. Las
distintas sustancias difunden con diferentes velocidades y recorren
distintas distancias al penetrar en la capa de sensores, puesto que
el transporte de masa en la matriz de sensores tiene lugar de forma
específica para cada sustancia, dependiendo entre otras cosas de la
polaridad y el tamaño de las moléculas. De este modo, en la capa de
sensores se forma un gradiente de concentración para las distintas
fracciones o sustancias a comprobar. Para cada principio de
detección con el sensor correspondiente existe a una distancia
determinada del soporte una concentración óptima de la sustancia o
fracción a comprobar. Dentro del perfil también puede observarse la
actividad en función de la concentración. Además, las sustancias
perturbadoras, como impurezas, se separan mediante el proceso de
difusión dentro de la capa de sensores de las sustancias activas,
quedando a distancia de éstas.
Además, pueden introducirse aditivos en la capa
de sensores, que controlan directamente el proceso de detección
influyendo en la sensibilidad de detección, la selectividad y la
cinética de la capa de sensores. Un aditivo de este tipo es, por
ejemplo, un tampón para la regulación del estado de vitalidad de las
células de sensores.
En la capa de sensores controladora de difusión
también pueden suspenderse sustancias indicadoras (por ejemplo
indicadores del valor pH, colorantes redox), que permiten
informaciones acerca del lugar respecto a valores pH o propiedades
redox en superficies de objetos a analizar.
La introducción de sustratos bioluminescentes en
la capa de sensores, que desempeñan un papel en determinados
procedimientos de comprobación, permite realizar procesos de
detección de varias etapas en la capa de sensores en una etapa de
trabajo.
El grosor de capa de la capa de sensores es
preferiblemente de 0,1 a 10 mm, de forma especialmente preferible
de 0,5 a 3 mm, de forma aún más preferible de 0,5 a 0,8 mm.
La suspensión de células de gen indicador usada
tiene preferiblemente una densidad óptica de 0,6 a 1,4 a una
longitud de onda de 660 nm.
La propia capa de sensores puede estar formada
por varias capas. Las distintas capas sirven para distintas
finalidades y pueden tener distintos grosores, según su finalidad.
Las diferentes capas pueden tener las siguientes funciones:
- -
- suspensión de distintas líneas celulares de gen indicador para detección múltiple
- -
- suspensión de aditivos para controlar y favorecer el proceso de detección
- -
- efecto como barrera de difusión o capa filtrante selectiva de sustancias.
También pueden suspenderse en la matriz varias
líneas celulares de gen indicador distintas con diferentes
especifidades de actividad, para detectar de esta forma
simultáneamente distintas actividades biológicas. Así resulta una
capa de sensores múltiples. Para distinguir qué líneas celulares de
gen indicador muestran una actividad biológica en una capa de
sensores múltiples de este tipo, las señales emitidas por las
distintas líneas celulares de gen indicador deben ser diferentes.
Ejemplos para ello son una capa de sensores múltiples con varias
líneas celulares de gen indicador que indican distintas actividades
biológicas con señales diferentes. En lugar de varias líneas
celulares de gen indicador diferentes, también pueden usarse líneas
celulares de gen indicador que indican simultáneamente varias
actividades diferentes. Las señales de la capa de sensores
múltiples pueden valorarse paralelamente.
La solución del objeto según la invención es,
además, un procedimiento para la comprobación de la eficacia
biológica de sustancias con las características de la
reivindicación 10. La muestra se aplica en primer lugar en o en el
interior de la superficie de un soporte, siempre que no forme ya
parte de un soporte. Como soporte puede servir la propia capa de
sensores o un soporte adicional. Si no es la propia capa de
sensores la que sirve de soporte, el soporte se recubre a
continuación con la capa de sensores según la invención. Acto
seguido se determina el efecto de la sustancia en las líneas
celulares de gen indicador en la capa de sensores.
Además de la propia capa de sensores, como
soporte también pueden servir objetos lisos, estructurados o
porosos de vidrio, plásticos, metal o de otro materiales orgánicos
o inorgánicos. En particular, son adecuados papel, membranas,
películas, láminas o perlas polímeras. También puede servir de
muestra directamente material biológico, como recortes de tejido u
hojas de plantas, de modo que aquí, la muestra forma ya parte del
soporte.
La capa de sensores puede aplicarse en el soporte
mediante vertido, inmersión, laminación, pulverización o como
película.
Cuando la propia capa de sensores sirve de
soporte, la sustancia a ensayar se aplica directamente en la capa
de sensores, por ejemplo mediante sistemas de microdosificación o
procedimientos de la técnica de imprenta, en los que las sustancias
se aplican en la capa. Un procedimiento de la técnica de imprenta
consiste, por ejemplo, en sumergir las agujas de un punzón en las
sustancias a ensayar, que se encuentran, por ejemplo, en los
pocillos de una placa de microvaloración. Durante este proceso,
cada sustancia diferente humedece una punta de aguja. El punzón con
las agujas se mete a continuación a presión en la capa de sensores.
Como alternativa, también pueden aplicarse las sustancias de la
muestra en papel, presionándose este papel con el lado recubierto
con las sustancias de la muestra en la capa de sensores.
Antes de la determinación del efecto de las
sustancias contenidas en la muestra en las células de gen indicador
puede tener lugar una etapa de incubación. Para ello, la capa de
sensores o el soporte recubierto con la capa de sensores se
almacena durante un tiempo predeterminado según los requisitos de
las células usadas en condiciones definidas respecto a la
temperatura, humedad y gasificación. Después, se determina el
efecto de las sustancias a ensayar en las células de gen
indicador.
El procedimiento según la invención permite unir
directamente el procedimiento de enriquecimiento con el ensayo de
actividad. Los enriquecimientos son necesarios, por ejemplo, cuando
se trata de sustancias de poca actividad. Las sustancias contenidas
en una solución de muestra pueden enriquecerse mediante adsorción
no específica o específica en soportes adecuados, como membranas,
matrices intercambiadoras de iones, matrices de afinidad, placas de
cromatografía de capa fina o papel. El enriquecimiento puede
conseguirse mediante un contacto directo del soporte con un volumen
suficientemente grande de la solución de muestra. Para ello pueden
usarse también técnicas de aplicación de muestra especiales de la
cromatografía con un efecto enriquecedor, por ejemplo, capas de
concentración de la cromatografía de capa fina o gradientes
pronunciados de disolventes. Después del recubrimiento con la capa
de sensores activa, puede comprobarse directamente la actividad
biológica de las sustancias enriquecidas e inmovilizadas en la
matriz soporte.
El efecto de las sustancias de la muestra en las
células de gen indicador en la capa de sensores se registra
preferiblemente con ayuda de procedimientos de generación de
imágenes, como procedimientos fotográficos, transmisión de video o
también como dibujo hecho a mano. Reacciones típicas de células de
gen indicador en una sustancia son, por ejemplo, la inducción o la
extinción de la emisión de luz de procesos de bioluminescencia. La
actividad biológica se indica para las posiciones en el soporte en
las que se encuentra una sustancia determinada debido al mecanismo
de sensor correspondiente.
La bioluminescencia permite la observación
repetida de la actividad detectada en distintos momentos, de modo
que también se obtienen resultados cinéticos detallados respecto al
desarrollo de la actividad. Son preferibles los procedimientos de
detección mediante la medición de emisión de luz en comparación con
mediciones del cambio espectral de la absorción de luz, puesto que
de esta forma pueden conseguirse sensibilidades claramente mayores,
pudiendo detectarse, además, en la medición de la emisión de luz
señales después de un tiempo fundamentalmente más corto.
La valoración de los datos de las imágenes puede
realizarse en cuanto a la calidad en el sentido de una afirmación
sí/no respecto a la actividad biológica y en cuanto a la cantidad
para la valoración de intensidades de la actividad y la
distribución local de la actividad. Para ello pueden usarse
programas para el procesamiento de imágenes o también
procedimientos para realizar comparaciones visuales, que se
calibran con actividades de referencia conocidas,
respectivamente.
En la separación cromatográfica de las fracciones
mediante una columna cromatográfica, el eluido de la columna
cromatográfica se aplica sucesivamente, o bien de forma continua o
bien en intervalos, en distintos puntos del soporte, por ejemplo en
forma de una serie de manchas o mediante pulverización.
La separación en las fracciones puede acoplarse a
un análisis estructural de las sustancias individuales presentes en
las fracciones, de modo que una actividad biológica de una fracción
detectada por la capa de sensores pueda vincularse con la
información estructural por medio de la sustancia individual. La
información estructural sólo se obtiene mediante un análisis
espectroscópico. Es ventajoso no valorar los resultados del
análisis espectroscópico hasta que se haya determinado la actividad
biológica de las sustancias individuales con la capa de sensores. La
valoración de los resultados del análisis espectroscópico se
realiza preferiblemente sólo para las sustancias individuales
biológicamente activas.
Si la separación cromatográfica de las fracciones
se realiza mediante cromatografía en columna, una parte del eluido
se aplica sucesivamente, o bien de forma continua o bien en
intervalos, en distintos puntos del soporte, mientras se deriva al
mismo tiempo otra parte del eluido, sometiéndose a una
espectroscopia en un espectrómetro de masas o un espectrómetro RMN o
un espectrómetro IR (por ejemplo, mediante las técnicas de
acoplamiento cromatográfico HPLC/EM, HPLC/RMN, HPLC/IR). Es
preferible, detectar el eluido de la columna cromatográfica mediante
un detector UV antes de la derivación de la parte a someter a una
espectroscopia.
Si la separación cromatográfica de la mezcla de
sustancias se realiza en distintas zonas de sustancias mediante
cromatografía de capa fina o electroforesis en el soporte, pueden
grabarse espectros, por ejemplo, de las distintas zonas de
sustancias, mediante espectroscopia de masas con ionización por
desorción mediante láser asistida por matriz (MALDI) o
espectroscopia Raman u otros procedimientos espectroscópicos
(UV-VIS, IR), antes de aplicarse la capa de
sensores en el soporte.
Además, la solución del objetivo según la
invención se presenta en forma de un dispositivo formado por una
capa de sensores según la invención, que está en contacto con la
sustancia a comprobar y un sistema de generación de imágenes, en
cuya área de detección se encuentra una parte o toda la capa de
sensores.
Las células de gen indicador de la capa de
sensores muestran su actividad mediante emisión o extinción de
emisión de luz, que se detecta posteriormente mediante un sistema
correspondiente de generación de imágenes.
La capa de sensores según la invención, el
procedimiento según la invención y el dispositivo según la
invención ofrecen una serie de ventajas en comparación con el
estado de la técnica, en particular para comprobaciones de
actividad basadas en células:
- 1.
- La capa de sensores controla el proceso de detección, tanto mediante control de difusión como mediante aditivos reguladores y coadyuvantes. Además, la estructura de la capa de sensores permite el recubrimiento homogéneo de distintos materiales (vidrio, plástico, metal) y superficies (lisas, rugosas, porosas). Aparte de ello se evita la sedimentación de los organismos sensores durante el proceso de detección.
- 2.
- En los análisis de sustancias bioactivas existe frecuentemente el peligro de que el ensayo sea perturbado cuando la concentración de la sustancia a ensayar es demasiado elevada. Este riesgo de artefacto es claramente menor gracias al gran intervalo de concentraciones detectado en la capa de sensores controladora de difusión. El gradiente de concentración de una sustancia en la capa de sensores permite detectar zonas de actividad biológica por debajo de las concentraciones citotóxicas de sustancias. Esto es una ventaja para los ensayos de actividad de sustancias con concentraciones desconocidas para hacer análisis. Los costes para la determinación y estandarización de las concentraciones de las sustancias pueden reducirse o suprimirse del todo.
- 3.
- En las mezclas de sustancias que contienen componentes citotóxicos u otros componentes que interfieren en los ensayos de actividad, puede comprobarse la actividad biológica con un menor riesgo de obtener resultados falsamente negativos en comparación con las técnicas convencionales. La capa de sensores controladora de difusión genera distintos perfiles de concentración para distintas sustancias y separa de esta forma los componentes perturbadores de los componentes a ensayar de la mezcla de sustancias.
- 4.
- Puesto que en un soporte se encuentran distintas sustancias separadas en el espacio, por ejemplo en zonas cromatográficas, en la técnica convencional existe el peligro de que las sustancias se mezclen en distintas posiciones del soporte, en particular en caso de largos tiempos de incubación. La capa de sensores controladora de difusión impide una difusión demasiado fuerte, incluso en el caso de tiempos de incubación largos, de modo que las zonas de sustancias activas en los soportes puedan detectarse gracias a su actividad, incluso después de tiempos de incubación largos.
- 5.
- El procedimiento según la invención permite una elevada resolución de localización.
- 6.
- Al usar una capa de sensores múltiples, pueden analizarse en poco tiempo actividades de sustancias en un gran número de sensores. Pueden establecerse fácilmente perfiles de actividad de sustancias activas.
- 7.
- La combinación directa de la técnica de separar las mezclas de sustancias en el soporte en fracciones y de analizar las fracciones mediante espectroscopio comprobando la estructura de las sustancias individuales con la detección de la actividad biológica de las sustancias individuales mediante la capa de sensores permite obtener informaciones acerca de la estructura química de sustancias biológicamente activas, desconocidas, directamente a partir de las mezclas.
El procedimiento según la invención puede usarse
para analizar actividades biológicas y para establecer perfiles de
bioactividad en "programas de detección de drogas".
Las figuras muestran:
La fig. 1, la estructura esquemática de un
dispositivo según la invención.
La fig. 2, el resultado de una medición de la
distribución local de la actividad biológica en una superficie con
la capa de sensores según la invención.
La fig. 3, la comparación entre procedimientos
convencionales y según la invención en la medición de una mezcla de
sustancias con componentes tóxicos.
La fig. 4, el modelo de ensayo para el
acoplamiento de una separación cromatográfica y una
espectroscopia.
La fig. 1 muestra una representación esquemática
de un dispositivo según la invención. En el soporte 1 se encuentra
una sustancia 2 adsorbida como muestra. En el soporte 1 con la
sustancia 2 se encuentra la capa de sensores 3 controladora de
difusión. Por encima de la capa de sensores 3 se encuentra un
sistema de generación de imágenes 4, que detecta la señal óptica 5.
La sustancia 2 que se encuentra en el soporte 1 difunde 6 en la
capa de sensores 3 y dispara en los sensores 7 la señal óptica
5.
El ejemplo 1 muestra una representación de
estructuras biológicamente activas en un soporte sólido con la capa
de sensores según la invención.
Para comprobar la capacidad de representación de
una capa de sensores, la sustancia activa ciprofloxacino se aplicó
mediante una impresora de chorro de tinta (HP DeskJet 870 Cxi) en
forma de un gráfico de ensayo en un soporte (fig. 2, lado derecho).
Como soporte servía una lámina de aluminio recubierta con gel de
sílice 60 de Merck (Art. Nº 1.05553). Para la detección de la
actividad, la capa de sensores contenía células de gen indicador
preparadas mediante técnica de genes, que indican la actividad
biológica de ciprofloxacino mediante bioluminescencia de forma
específica según la actividad. La distribución local de la
actividad determinada por la aplicación de ciprofloxacino en el
soporte de papel fue registrada con un sistema de transmisión de
video mediante la bioluminescencia inducida en la capa de
sensores.
El resultado está representado en la fig. 2, lado
izquierdo, y muestra para todo el proceso de transmisión de
imágenes de bioluminescencia una resolución gráfica de aprox. 20
lpp (líneas por pulgada). Esto es suficiente para realizar, por
ejemplo, comprobaciones de actividad como ensayos por gota con una
densidad de gotas de más de 25 gotas/cm^{2}.
A continuación, se indicarán datos detallados y
las condiciones experimentales del ejemplo 1:
La célula de gen indicador es una Escherichia
coli de la cepa SM101, que porta el plásmido recombinante
pEBZ181. Este plásmido codifica una fusión entre el promotor
recA de E. Coli y los genes estructurales de la
luminescencia bacteriana de Vibrio fischeri (genes lux C,
D, A, B, E y G). Para la construcción del plásmido se
clonó el fragmento BamH I que porta el promotor recA
del plásmido pUA80 [Barbe J., Fernández de Henestrosa AR, Calero S.
y Gibert I. (1991) Chromogenic Method for rapid isolation of
recA-like mutants of Gram-negative bacteria.
J. Bacteriol. 173: 404-406] en un derivado del
vector pEBZ112 [Peitzsch N., Eberz G. y Nies D. (1998)
Alcaligenes eutrophus as a bacterial chromate sensor. Appl.
Environm. Microbiol. 64: 453-458], que insertado en
la posición Nco I del gen luxG porta un cassette
lacZ [Becker A. (1993) Analyse der Succinoglycan-
Biosyntheseregion von Rhizobium meliloti 2011: Untersuchungen
zur Identifizierung des bakteriellen Infektionssignals in der
Symbiose mit Luzerne. Tesis doctoral, Universidad de Bielefeld,
Alemania]. El plásmido pEBZ181 fue transformado mediante métodos
estándar [Sambrook J., Fritsch EF and Maniatis T. (1989) Molecular
cloning: A laboratory manual (2^{nd} edn.), Cold Spring Harbor
Laboratory Press] en la cepa Escherichia coli cepa SM101
(obtenida del E. Coli Genetic Stock Center, Yale University,
New Haven, EEUU) y usado para ensayos para conseguir
bioimágenes.
El tratamiento de bacterias con agentes
antibacterianos, como ácidos 4- quinoloncarboxílicos conduce a la
inducción del llamado mecanismo de reparación SOS [Walker CG (1984)
Mutagenesis and inducible responses to deoxyribonucleic acid damage
in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 48:
60-93; Phillips I., Culabras E., Moreno F. and
Baquero F. (1987) Induction of the SOS response by new
4-quinolones. J. Antimicrob. Chemother. 20:
631-638; Piddock LJV and Wise R. (1987) Induction
of the SOS response in Escherichia coli by
4-quinone antimicrobial agents. FEMS Microbiol.
Lett. 41: 289-294]. La proteína RecA es un
regulador principal de este mecanismo de reparación, conduciendo la
inducción SOS a una mayor expresión del gen recA. La
medición de la síntesis de la proteína RecA [Little JW and Mount DW
(1982) The SOS regulatory system of Escherichia coli. Cell
29: 11-22, Witkin EM (1976) Ultraviolet mutagenesis
and inducible DNA repair in Escherichia coli. Bacteriol. Rev.
40: 864-907] o de fusiones de gen indicador
recA [Nunoshiba T. y Nishioka H. (1991)
Rec-lac ensayo for detecting
SOS-inducing activity of environmental genotoxic
substances. Mutation Res. 254:71-77] es una
posibilidad de la inducción SOS y, por consiguiente, de medir la
actividad de ácidos 4- quinoloncarboxílicos. Puesto que la cepa
E. Coli SM101 (pEBZ181) porta un plásmido con una fusión de
gen indicador recA-lux, es adecuado para la
detección de ácidos 4-quinoloncarboxílicos u otros
compuestos inductores de SOS. La presencia de compuestos de este
tipo conduce a una mayor expresión de los genes luciferasa y, por
consiguiente, a una estimulación de la bioluminescencia.
La masa de recubrimiento presenta la siguiente
composición:
- -
- 32 ml de agarosa al 1% (Agarose MP Boehringer Mannheim GmbH Art. Nº 1388983); esta agarosa de bajo punto de fusión permite suspender las células de gen indicador sensibles a temperaturas elevadas sin dañarlas a temperatura por debajo de 40ºC.
- -
- 4 ml de medio LB 200 g/l (GIBCO BRL Art. Nº 12780-052); la introducción de medio LB sirve para mantener las funciones vitales de las células de gen indicador durante el tiempo de incubación.
- -
- 4 ml de suspensión de bacterias en medio LB 20 g/l; con ello resultó una densidad óptica de 1,2 a una longitud de onda de 660 nm.; mediante el volumen de la suspensión de bacterias introducida se controla la densidad de células, es decir, la densidad de los sensores en la capa de sensores, para optimizar la relación señal/ruido y la resolución de localización.
- -
- 10 ml de agua; la introducción de agua regula la viscosidad de la masa a verter y la estabilidad mecánica de la capa de sensores después del endurecimiento.
El gráfico de ensayo fue creado con Corel Draw
(versión 8). El grosor de línea es de 0,1 mm para la trama lineal.
La matriz de puntos contiene en ½ pulgada^{2} 50 puntos cuadrados
(longitud de canto: 1 mm). Los puntos fueron impresos con una
saturación cromática del 50%, todos los demás elementos del gráfico
de ensayo fueron impresos con una saturación cromática del 100%.
42 ml de una solución de 120 mg de monohidrato de
hidrocloruro de ciprofloxacino en agua se introdujeron en un
cartucho de tinta previamente vaciado de la impresora de chorro de
tinta HP DeskJet 87D Cxi. El gráfico de ensayo descrito bajo el
punto 3. (fig. 2, lado derecho) fue impreso con la impresora de
chorro de tinta en la capa de gel de sílice de la lámina de aluminio
(Merck Art. Nº 1.05553).
La lámina de aluminio se secó bajo una corriente
de nitrógeno, colocada en un marco de acero fino adecuado con borde
elevado, posicionado horizontalmente en una mesa de nivelación,
virtiéndose encima homogéneamente la masa de capa de sensores
obtenida bajo el punto 2., de modo que se alcanzara un grosor de
capa de 2 mm. Después de endurecer la capa de sensores a
temperatura ambiente, el soporte recubierto fue incubado durante 60
minutos a 28ºC.
El soporte incubado según el punto 5. fue medido
con un sistema de transmisión de video ("Molecular Light Imager
NightOWL" de BG&G Berthold) según las instrucciones de uso.
El tiempo de grabación era de 60 s, la posición de la cámara fue
optimizada para un formato de imagen de 10 x 20 cm. Para la
representación de los resultados, los datos de imágenes obtenidos se
convirtieron en ficheros TIFF y se formatearon posteriormente con
programas gráficos adecuados (Corel Draw versión 8, Corel Photo
Paint versión 8 o Photoshop versión 4,0), fueron provistos de
inscripciones e impresos mediante una impresora láser (HP LaserJet
5). En la fig. 2 se muestra la imagen de bioluminescencia, que
representa la actividad del ciprofloxacino impreso en el gel de
sílice/la lámina de aluminio, junto con el gráfico de ensayo
original.
El ejemplo 2 muestra una aplicación de la capa de
sensores para ensayos de actividad en presencia de sustancias
citotóxicas y una comparación con un ensayo de placas de
microvaloración análogo.
A diferencia de los formatos habituales de placas
de microvaloración, la capa de sensores controladora de difusión
puede usarse para mezclas de sustancias, que contienen componentes
perturbadores, puesto que los componentes perturbadores se separan
in situ mediante procesos de difusión y adsorción, de modo
que se reduce el riesgo de resultados falsamente negativos. Con
ayuda del ejemplo de ensayos de bioactividad con el sistema de gen
indicador SOS (véase el ejemplo 1) puede comprobarse la
superioridad de la capa de sensores en comparación con los formatos
de placas de microvaloración.
En los dos formatos de ensayo, el ciprofloxacino
sirvió para la inducción específica según la actividad de la
respuesta SOS. La bioluminescencia estimulada en el sistema de gen
indicador aquí usado ofreció la señal Read-Out, que
fue registrada mediante transmisión de video. Para comprobar la
tolerancia de los dos formatos de bioensayo frente a sustancias
perturbadoras, se realizaron ensayos en presencia de bromuro de
cetiltrimetilamonio (CTAB) citotóxico. Se mostró que para el
formato de capa de sensores, la bioluminescencia relativa se
mantenía constante como medida de la estimulación selectiva
mediante ciprofloxacino hasta concentraciones de CTAB de 500 ng/200
\mul, mientras que el formato de placas de microvaloración
presentó en este intervalo ya una reducción de la bioluminescencia
de más del 50% (fig. 3).
A continuación, se indicarán datos detallados y
las condiciones experimentales del ejemplo 2:
Se usó el mismo sistema de gen indicador SOS que
en el ejemplo 1.
Se prepararon cinco soluciones ensayoigo en una
placa de microvaloración de 96 pocillos (Dynatech microlite). Un
volumen de 200 \mul presentaba el siguiente contenido,
respectivamente:
94 \mul de medio LB al 2% (GIBCO BRL Art. Nº
12780-052)
16 \mul de suspención de células de gen
indicador (DO:1,2 a 660 nm) en medio LB al 2%
90 \mul de solución de las sustancias 1.-5. en
agua
1. 25 ng de monohidrato de hidrocloruro de
ciprofloxacino
2. 25 ng de monohidrato de hidrocloruro de
ciprofloxacino + 50 ng de CTAB
3. 25 ng de monohidrato de hidrocloruro de
ciprofloxacino +100 ng de CTAB
4. 25 ng de monohidrato de hidrocloruro de
ciprofloxacino + 200 ng de CTAB
5. 25 ng de monohidrato de hidrocloruro de
ciprofloxacino + 500 ng de CTAB
La placa de microvaloración fue incubada durante
60 min. a 28ºC, midiéndose a continuación con el sistema de
transmisión de video "Molecular Light Imager NightOWL"., de
BG&G Berthold. Para los distintos pocillos se determinaron los
grises (medios tonos). La bioluminescencia relativa fue determinada
mediante la división de estos medios tonos por el valor para la
solución de referencia sin CTAB. Para dos series de mediciones se
determinaron los valores medios de la intensidad de la
bioluminescencia relativa en función de la concentración de
CTAB.
| CTAB [ng/200 \mul] | Bioluminescencia rel. |
| 0 | 1,00 |
| 50 | 0,88 |
| 100 | 0,87 |
| 200 | 0,78 |
| 500 | 0,44 |
Para la comparación, en la figura expuesta más
adelante, los resultados se indican al lado de los resultados para
el formato de la capa de sensores.
Para la detección de la actividad de
ciprofloxacino con la capa de sensores se aplicaron mediante
micropipetas desechables las siguientes soluciones ensayoigo en una
placa de cromatografía de capa fina (Merck Art. Nº 1.15445 Si 60
F_{254s}):
- 1.
- 1 \mul de solución acuosa de 10 ng de monohidrato de hidrocloruro de ciprofloxacino
- 2.
- 1 \mul de solución acuosa de 10 ng de monohidrato de hidrocloruro de ciprofloxacino + 50 ng de CTAB
- 3.
- 1 \mul de solución acuosa de 10 ng de monohidrato de hidrocloruro de ciprofloxacino + 100 ng de CTAB
Las placas de cromatografía de capa fina secadas
bajo una corriente de nitrógeno fueron recubiertos de forma plana
con una suspensión de bacterias de sensores luminescentes (véase el
ejemplo 1) en agarosa al 0,6% con un grosor de capa de aprox. 2 mm
en una mesa de nivelación. A continuación, las placas de
cromatografía de capa fina se incubaron durante 60 min. a 28ºC. Acto
seguido, se procedió a la detección de la bioluminescencia inducida
mediante la transmisión de imágenes con el sistema CCD Low Light
Imaging de alta resolución "molecular Light Imager NightOWL",
de BG&G Berthold. Condiciones para la transmisión de imágenes:
Tiempo de grabación, 60 s, posición de la cámara optimizada para
formato de placa de cromatografía fina de 10 x 20 cm. Para los
puntos luminescentes se determinaron los grises (medios tonos).
Para realizar la comparación con los resultados arriba descritos
para el formato de placas de microvaloración, se determinaron las
concentraciones análogas a partir de las cantidades de sustancias
aplicadas en las placas de capa fina. Para esta estimación se
partió de una difusión de las sustancias en el volumen de la capa
de sensores por encima de los puntos de sustancia (diámetro de punto
5 mm, grosor de capa 2 mm). Dos series de medición dieron las
siguientes intensidades relativas de bioluminescencia (valores
medios) en función de la concentración de CTAB:
| CTAB [ng/200 \mul] | Bioluminescencia rel. |
| 0 | 1,000 |
| 250 | 1,002 |
| 500 | 1,023 |
La comparación de las mediciones con los dos
formatos muestra que, en el caso de la capa de sensores, la
medición de bioactividad no fue perjudicada por la introducción de
CTAB, mientras que en el formato de placas de microvaloración se
produjo una clara reducción (aprox. un 40% de los valores de
partida) de la bioluminescencia. Estos resultados se comparan en la
fig. 3 en un gráfico.
La figura 4 muestra en una representación
esquemática como una mezcla de sustancias se separa en fracciones
mediante cromatografía en columna, obteniéndose al mismo tiempo
datos espectroscópicos para las distintas fracciones.
La muestra 9 se separa mediante cromatografía en
columna (HPLC). El eluido de la columna cromatográfica se detecta
mediante un detector UV 46. Mediante un sistema de división, una
parte del eluido se aplica mediante pulverización o aplicación de
puntos 42 en el soporte 44. Empezando en una posición de salida 45,
el eluido de la cromatografía en columna se aplica en forma de
retícula en el soporte 44, de modo que allí queden depositadas
todas las sustancias del ciclo de cromatografía en columna de forma
separada en el espacio. Otra parte del eluido se deriva al mismo
tiempo a un espectrómetro de masas 47 o un espectrómetro RMN 48 y
se somete allí a una espectroscopia (acoplamiento HPLC/EM o
HPLC/RMN). Después de haberse aplicado todos los puntos en el
soporte 44, eventualmente después de haber secado el soporte, la
capa de sensores se aplica en el soporte 44. La capa de sensores
muestra las posiciones de las fracciones 43 biológicamente activas.
Mediante correlación con los tiempos de elución en la cromatografía
en columna, los espectros de masas o los datos RMN se asignan
claramente a los distintos puntos. Con ello se dispone
inmediatamente de informaciones estructurales detalladas respecto a
las sustancias activas una vez finalizada la comprobación de la
actividad biológica.
Claims (24)
1. Capa de sensores (3) para la detección de la
actividad biológica de sustancias (2), estando formada la capa de
sensores (3) por una matriz controladora de difusión y sensores (7)
suspendidos en la misma, caracterizada porque 50 ml de masa
de capa de sensores contienen 2 a 8 ml, preferiblemente 3 a 5 ml,
de suspensión de células de gen indicador y porque las células de
gen indicador son bioluminescentes.
2. Capa de sensores (3) según la reivindicación
1, caracterizada porque la matriz es un gel, como agarosa,
poliacrilato o una solución viscosa.
3. Capa de sensores (3) según la reivindicación 1
ó 2, caracterizada porque en la capa de sensores (3) están
suspendidos distintos tipos de células de gen indicador o un tipo
de células de gen indicador que puede indicar distintas actividades
biológicas.
4. Capa de sensores (3) según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la capa de
sensores (3) contiene aditivos que controlan o favorecen el proceso
de detección.
5. Capa de sensores (3) según la reivindicación
4, caracterizada porque los aditivos son tampones para la
regulación del estado de vitalidad de células de gen indicador.
6. Capa de sensores (3) según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la capa de
sensores (3) contiene sustratos de bioluminescencia.
7. Capa de sensores (3) según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la capa de
sensores (3) está formada por varias capas parciales, pudiendo
presentar las capas parciales distintos grosores, distinguiéndose
además por el tipo y la cantidad de células de gen indicador y/o
aditivos.
8. Capa de sensores (3) según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la suspensión de
células de gen indicador tiene una densidad óptica de 0,6 a 1,4 a
660 nm.
9. Capa de sensores (3) según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el grosor de la
capa es de 0,1 a 10 mm, preferiblemente de 0,5 a 3 mm, de forma
especialmente preferible de 0,5 a 0,8 mm.
10. Procedimiento para la detección de la
actividad biológica de sustancias (2), en el que
- a)
- se aplica la muestra (9) en o en el interior de la superficie de un soporte (1, 44), o formando la misma ya parte de una superficie a ensayar,
- b)
- se recubre el soporte (1, 44) con una capa de sensores, siempre que no sirva la propia capa de sensores (3) de soporte (1, 44), estando formada la capa de sensores (3) por una matriz controladora de difusión y sensores (7) suspendidos en la misma,
- c)
- se determina el efecto de la sustancia (2) o de las sustancias (2) contenida(s) en la muestra (9) en los sensores (7) en la capa de sensores (3)
- caracterizado porque 50 ml de masa de capa de sensores contienen 2 a 8 ml, preferiblemente 3 a 5 ml, de suspensión de células de gen indicador y porque las células de gen indicador son bioluminescentes.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque la propia capa de sensores (3) se usa
como soporte (1).
12. Procedimiento según la reivindicación 10 u
11, caracterizado porque antes de la determinación del
efecto de las sustancias (2) contenidas en la muestra (9) en las
células de gen indicador se intercala una etapa de incubación,
almacenándose la capa de sensores (3) o el soporte (1, 44)
recubierto con la capa de sensores (3) durante un tiempo
predeterminado según los requisitos de las líneas celulares usadas
en condiciones definidas respecto a la temperatura, humedad y
gasificación.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque el efecto de
la sustancia (2) en las células de gen indicador consiste en una
inducción o extinción de la emisión de luz de procesos de
bioluminescencia en función del lugar.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque las sustancias
(2) de la muestra (9) se enriquecen mediante adsorción específica o
no específica en materiales soporte adecuados, antes de ponerse en
contacto con la capa de sensores (3).
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque la muestra (9)
a ensayar es una mezcla de sustancias, que se separa de forma
cromatográfica o electroforética o con otras técnicas de separación
analíticas o preparativas en fracciones, antes de ponerse en
contacto con la capa de sensores (3).
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque la separación cromatográfica en
fracciones tiene lugar en una columna cromatográfica y el eluido se
aplica sucesivamente, o bien de forma continua o bien en intervalos,
en distintos puntos (42) del soporte (1, 44).
17. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque la separación cromatográfica en
fracciones se realiza mediante cromatografía de capa fina o
electroforesis en el soporte (1, 44), que es recubierto con la capa
de sensores (3).
18. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 10 a 17, caracterizado porque la muestra (9)
a ensayar es una mezcla de sustancias y la detección de la actividad
biológica de las sustancias individuales de la mezcla de sustancias
se vincula con una detección de la estructura de las sustancias
individuales, separándose la mezcla de sustancias de forma
cromatográfica o electroforética o con otras técnicas de separación
analíticas o preparativas en fracciones y analizándose cada fracción
de forma espectroscópica, antes de ponerse en contacto con la capa
de sensores (3).
19. Procedimiento según la reivindicación 18,
caracterizado porque una valoración de los datos del análisis
espectroscópico sólo se realiza para las fracciones en las que puede
detectarse una actividad biológica mediante la capa de sensores
(3).
20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó
19, caracterizado porque la separación cromatográfica de la
mezcla de sustancias en fracciones tiene lugar en una columna
cromatográfica y una parte del eluido se aplica sucesivamente en
distintos puntos del soporte (1, 44), mientras que se deriva al
mismo tiempo otra parte del eluido y se somete a un espectroscopia
en un espectrómetro de masas (47) o un espectrómetro RMN (48) o un
espectrómetro IR.
21. Procedimiento según la reivindicación 20,
caracterizado porque el eluido de la columna cromatográfica
se detecta mediante un detector UV (46) antes de la derivación de
la parte a someter a una espectroscopia.
22. Procedimiento según la reivindicación 18 ó
19, caracterizado porque la separación cromatográfica de la
mezcla de sustancias en distintas zonas de sustancias mediante
cromatografía de capa fina o electroforesis se realiza en el soporte
(1, 44) y porque se registran espectros de las distintas zonas de
sustancias mediante la espectroscopia de masas MALDI o la
espectroscopia Raman u otros procedimientos espectroscópicos, como
espectros UV-VIS o IR, antes de aplicarse la capa de
sensores (3) en el soporte (1, 44).
23. Dispositivo para la detección de la actividad
biológica de sustancias (2), formado por una capa de sensores (3)
según una de las reivindicaciones 1 a 9, que está en contacto con la
muestra (9) a ensayar y un sistema de generación de imágenes, en
cuya área de detección se encuentra una parte o toda la capa de
sensores (3).
24. Dispositivo según la reivindicación 23,
caracterizado porque las células de gen indicador de la capa
de sensores (3) indican su actividad mediante la emisión o
extinción de bioluminescencia y porque el sistema de generación de
imágenes detecta esta bioluminescencia.
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