ES2225992T3 - Nuevos complejos polimericos para la transfeccion de acidos nucleicos, con residuos que desestabilizan unas membranas celulares. - Google Patents
Nuevos complejos polimericos para la transfeccion de acidos nucleicos, con residuos que desestabilizan unas membranas celulares.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN COMPLEJO ENTRE AL MENOS UN ACIDO NUCLEICO (CARGADO NEGATIVAMENTE) Y AL MENOS UN CONJUGADO POLIMERICO CARGADO POSITIVAMENTE, SIENDO EL ENLACE ENTRE EL ACIDO NUCLEICO Y EL CONJUGADO POLIMERICO DE NATURALEZA ELECTROSTATICA, CONTENIENDO EL CONJUGADO POLIMERICO UN POLIMERO FORMADO DE UNIDADES MONOMERAS QUE TIENE FUNCIONES NH 3 + LIBRES, Y SIENDO TAL QUE: LAS FUNCIONES NH 3 + LIBRES DE DICHAS UNIDADES MONOMERAS ESTAN SUSTITUIDAS EN UNA RELACION DE LA MENOS 10 % POR RESIDUOS QUE ARRASTRAN EN MEDIO ESCASAMENTE ACIDO UNA DESESTABILIZACION DE LAS MEMBRANAS CELULARES, PARTICULARMENTE LA MEMBRANA DE LAS VESICULAS DE ENDOCITOSIS Y/O DE LOS ENDOSOMAS; TENIENDO DICHOS RESIDUOS TAMBIEN LAS SIGUIENTES PROPIEDADES: ESTOS COMPRENDE UN GRUPO FUNCIONAL QUE LE PERMITE FIJARSE A DICHO POLIMERO; NO SON ACTIVO COMO SEÑAL DE RECONOCIMIENTO RECONOCIDA POR UN RECEPTOR DE MEMBRANA CELULAR; PUEDEN COMPRENDEN AL MENOS UNA FUNCION NH 3 + LIBRE; TENIENDO DICHOS RESIDUOS NO CARGADOS TAMBIEN LASSIGUIENTES PROPIEDADES: COMPRENDEN AL MENOS UN GRUPO HIDROXILO; NO SON ACTIVOS COMO SEÑAL DE RECONOCIMIENTO RECONOCIDA POR UN RECEPTOR DE MEMEBRANA CELULAR; PUDIENDO LOS GRUPOS HIDROXILO DE DICHOS RESIDUOS NO CARGADOS SER SUSTITUIDOS POR AL MENOS UNA MOLECULA QUE CONSTITUYE UNA SEÑAL DE RECONOCIMIENTO RECONOCIDA POR UN RECEPTOR DE MEMBRANA CELULAR, SIEMPRE QUE EL CONJUNTO DE LAS FUNCIONES NH 3 + LIBRE SEA AL MENOS DE UN 30 % DEL NUMERO DE LAS UNIDADES MONOMERAS DE LA RED POLIMERICA DE DICHO CONJUGADO POLIMERICO.
Description
Nuevos complejos poliméricos para la transfección
de ácido nucleicos, con residuos que desestabilizan unas membranas
celulares.
La presente invención tiene por objeto unos
nuevos complejos de ácidos nucleicos y de polímero substituido por
unos residuos que provocan la desestabilización de las membranas
celulares.
La introducción de un gen del exterior en una
célula es la base de la terapia génica. Se puede obtener la
transferencia de genes utilizando o bien material viral modificado
(virus de la viruela bovina, retrovirus, adenovirus o virus del
herpes), o bien utilizando unos vectores no virales (lípidos
catiónicos, liposomas). Los primeros aunque eficaces, presentan
problemas de seguridad. En cuanto a los últimos, su eficacia se ve
fuertemente disminuida en presencia de suero y por ello su
utilización está restringida al in vitro o al ex
vivo.
La polilisina, que puede formar unos complejos
electroestáticos estables con un ADN plasmático, está en la base del
desarrollo de unos vectores no virales para transferir genes a unas
células animales.
Los complejos del ADN y de polilisina no
sustituida no son generalmente eficaces para transfectar células
debido a la gran estabilidad de los complejos (por lo tanto
disociación y relargado del ADN débiles) en las condiciones
fisiológicas debido a la gran cooperatividad de las interacciones
policatión-polianión.
La eficacia de la transfección puede ser mejorada
cuando se disminuyen el número de cargas presentes en el polipéptido
con la finalidad de reducir las fuerzas de interacción entre el ADN
y la polilisina. Por ejemplo, cuando el 40% de las funciones
\varepsilon-NH_{3}^{+} de los residuos lisina
de la polilisina son neutralizadas parcialmente por unos derivados
polihidroxialcanoilos tales como la
\delta-gluconolactona, los complejos
ADN/polilisina parcialmente gluconoilada son más eficaces que los
complejos ADN/polilisina para transfectar las células.
La polilisina puede ser sustituida por unos
ligandos específicos de unos receptores presentes en la superficie
de las células y capaces de inducir una endocitosis específica de
unos complejos con un ADN plasmídico por unas células huésped.
Se han propuesto como vectores guía de unos
plásmidos unos conjugados obtenidos sustituyendo la polilisina por
el asialoorosomucoide, la transferrina, la insulina, unas
inmunoglobulinas y unos factores de crecimiento. De todas formas,
estos ligandos proteínicos hacen que los complejos sean muy
inmunogénicos.
La polilisina puede ser sustituida por unos
ligandos de pequeña masa molecular menos inmunogénicos tales como
unos ósidos y unos oligósidos reconocidos por unos receptores de la
membrana específicos (lectinas de la membrana) en la superficie de
las células huésped. La polilisina glicosilada ha sido propuesta
como vectores no virales perfectamente definidos para transferir
unos genes.
Numerosas células animales poseen unas lectinas
de membrana que reconocen unos oligósidos de estructuras variadas y
que inducen la endocitosis de sus ligandos. Por ejemplo, la lectina
de membrana de las células del parénquima hepático reconoce unas
estructuras glucídicas que comprenden un residuo galactosa en
posición terminal, lo que es así en el caso de las glicoproteinas
séricas desialiladas. La especificidad de las lectinas de membrana
depende del tipo celular y del estado de diferenciación de las
células.
La eficacia de la transfección de unos complejos
ADN/polilisina glicosilada depende de la tasa de sustitución de la
polilisina por unos ósidos: las transfecciones más eficaces son
obtenidas cuando de 30 a 40% de las funciones
\varepsilon-NH_{3}^{+} libres de unos residuos
lisina de la polilisina son sustituidas por unos mono- o
disacáridos.
En la patente francesa nº 2,719,316 se ha
mostrado que la utilización de la polilisina parcialmente
gluconoilada que comprende un número de cargas positivas ya reducido
permite disminuir en un factor de 5 a 10 el número de ósidos que es
necesario fijar al polímero para obtener una buena eficacia de
transfección de unos complejos ADN/polilisina glicosilada y
gluconoilada. La utilización de la polilisina parcialmente
gluconoilada permite aumentar la solubilidad de los complejos y
reducir su tamaño a aproximadamente 50 nm.
El transporte: unos plásmidos para unos vectores
no virales susceptibles de ser reconocidos específicamente por unos
compuestos de la membrana plasmática de las células revela un paso
que imita el mecanismo de entrada del material genético viral en una
célula. En todos los casos descritos, los complejos ADN/polímero
policatiónico son arrastrados en unas vesículas de endocitosis, en
unos endosomas y probablemente en otros compartimientos
intracelulares más profundos, alejados de la membrana
plasmática.
Por ello, el paso a través de la membrana del ADN
plasmídico es por ello una etapa crítica con respecto a la
liberación de dicho ADN en el citosol por su paso en el núcleo, en
dónde el gen será expresado.
En todos los casos descritos, se utilizan unos
auxiliares de paso a través de la membrana para favorecer el paso
del ADN en el citosol. Se trata:
- -
- de la cloroquina
- -
- de unos adenovirus defectivos
- -
- de unos pépticos permeabilizantes y/o fusiógenos
- a)
- la cloroquina es una base débil utilizada a 50 \muM o 100 \muM en cultivo in vitro, para ciertas células estas concentraciones son tóxicas. La cloroquina, que es permeante atraviesa la membrana y se acumula en los compartimientos ácidos, porque comprende unas aminas de un pK bajo que captan unos protones; la cloroquina protonada es catiónica y menos permeante. La acidificación de los endosomas y de los lisosomas es debida a una enzima de la membrana que inyecta unos H+ a partir del citosol, en las vesículas; para restablecer la electroneutralidad esta acumulación de protones se acompaña con una entrada de iones cloruro Cl-. A medida que la cloroquina se acumula, los protones y los cloruros se acumulan también, lo que provoca un aumento de la fuerza iónica intravesicular que induce la llegada de agua, de ahí el hinchamiento de las vesículas y su desestabilización. Después de algunas horas, la concentración intracelular de la cloroquina puede ser 100 veces superior a su concentración en el medio. Puede por lo tanto sobrepasar los 10 mM. Este fenómeno es comparable a lo que ocurre en las personas que utilizan una dosis cotidiana de 300 mg de cloroquina al día. Después de algunos días la concentración plasmática es de aproximadamente 0,7 \muM, la concentración tisular es de 200 a 700 veces más elevada, es decir de 140 a 500 \muM. En el interior de las células, los compartimientos ácidos pueden alcanzar unas concentraciones varias decenas de veces mayores. Se sabe por otra parte que unas concentraciones de cloroquina de 10 mM (concentración obtenida tras unas horas habiendo utilizado una concentración inicial de cloroquina de 100 \muM) favorece la disociación de los complejos ADN/polosina.
- La cloroquina, en asociación con los complejos ADN/polilisina en la transferencia del gen, sólo se puede utilizar en aplicaciones in vivo o ex vivo debido a su toxicidad y a su rápida dilución tras ser inyectado en el individuo. En efecto, in vivo, para alcanzar las concentraciones citadas anteriormente, son necesarios varios días. Ahora bien, se ha mostrado in vitro que en las células pretratadas con cloroquina, la expresión de los genes transferidos era muy débil. Por otra parte, si la cloroquina es añadida más de tres horas después de la incubación de las células en presencia de los complejos, la transfección es muy débil. Es por estas razones que la cloroquina, que es un muy buen auxiliar in vitro no es eficaz in vivo.
- b)
- Las propiedades fusiógenas en medio ácido de las partículas de adenovirus defectivos son utilizadas para favorecer el paso del ADN en el citosol a partir de las vesículas de endocitosis. Los adenovirus poseen proteínas de fusión activas en medio ligeramente ácido. Los adenovirus defectivos pueden ser utilizados libres o fijados a los complejos ADN/polilisina.
- La utilización de partículas virales incluso defectivas plantea de todas formas problemas de seguridad. Los adenovirus inducen una respuesta inmunitaria muy fuerte tras la inyección con los complejos.
- c)
- Unos péptidos permeabilizantes y/o fusiógenos en medio levemente ácido son utilizados como auxiliares para favorecer el paso del ADN en el citosol. Se trata principalmente de péptidos de 20 ácidos aminados que derivan de las proteínas de fusión de virus como por ejemplo el péptido N-terminal de la subunidad HA2 de la hemaglutinina del virus de la gripe, o de péptidos sintéticos tales como el GALA, un oligómero que contiene varias unidades de repetición Glu-Ala-Leu-ala. Estos péptidos son utilizados muy a menudo en estado libre (es decir no fijados covalentemente) con los complejos ADN/polilisina. La eficacia de los péptidos es disminuida en gran manera en presencia de suero en los medios de cultivo celular, lo que restringe su utilización a los experimentos in vitro o ex vivo. Ciertos péptidos fijados covalentemente a unos complejos ADN/polilisina son también eficaces para favorecer el paso a través de la membrana del ADN, otros pierden su poder permeabilizante tras la fijación.
Se sabe, por otra parte, que existen otras
moléculas capaces de desestabilizar unas membranas y en particular
unas moléculas que contienen el núcleo imidazol de la histidina
(pK=6,04) que protoneandose en medio ligeramente ácido se vuelve
catiónico. La polihistidina posee propiedades fusiógenas y
permeabilizantes con respecto a las bicapas lipídicas. A un pH<6,
la polihistidina adopta una estructura en hélice \alpha (Norland
K.S. et al. (1963) biopolymers
1:277-278; Beychok S. et al. (1965)
J.Amer. Chem. Soc. 87: 3990-3991). Se ha
demostrado que la polihistidina en un medio ligeramente ácido es un
policatión que agrega unos liposomas cargados negativamente e induce
su fusión (Wang C. -Y. y Huang L. (1984) Polyhistidine mediates an
acid-dependent fusion of liposomes. Biochemistry
23:4409-4416; Uster P.S. y Deamer D.W. (1985)
pH-dependent fusion of liposomes using titrable
polycations. Biochemistry 24:8-14).
Se sabe que un polímero sintético (la
cetilacetil(imidazol-4-ilmetil)polietileimina)
a un pH ligeramente ácido induce la fusión de los liposomas (Oku N.
et al. (1987) Low pH induced membrane fusion of lipid
vesicles containing proton-sensitive polymer.
Biochemistry 26:8145-8150).
Se sabe también que un polímero neutro
hidrosoluble sustituido por unos residuos histidilo (utilizado en
lugar de la polihistidina que es muy poco soluble en medio acuoso)
interactúa únicamente en un medio ligeramente ácido con un polianión
del tipo ácido poliaspártico y es capaz de permeabilizar la membrana
plasmática de las células en un test de citometría en flujo
utilizando bromuro de etidio como marcador (Midoux et al.
1995).
Unos resultados preliminares han demostrado que
la polihistidina (muy poco soluble en medio acuoso a pH neutro) no
puede ser utilizada para transfectar células puesto que no siendo un
policatión a pH neutro, es incapaz de formar con el ADN unos
complejos estables que tengan una solubilidad suficiente para poder
ser utilizados a un pH neutro, en particular a un pH de 7,4 que es
el pH del plasma.
La solicitud de patente europea EP/0941/123,
publicada con el número WO98/19710 el 14 de Mayo de 1998
reivindicando la prioridad GB/97 02 965 del 6 de Noviembre de 1996,
solo se ha de considerar a título de novedad. Divulga la formación
de un complejo de ADN y de una poliamina modificada, más
particularmente una polilisina, en la que se ha injertado una
molécula de polietilenglicol por medio de un enlace disulfuro
introducido por reacción con el ácido N-succinimidil
3-(2-piridilditio)propionato. Este documento
describe también la utilización de estos complejos en las
terapias.
De todas formas, estos complejos utilizados para
permitir la transferencia del ADN a unas células huésped no
contienen residuos que provoquen la desestabilización de unas
membranas celulares en medio débilmente ácido.
El documento titulado Carrier design Biopolymers,
vol. 33, 873-885 (1993) Mezö et al. se
refiere a unos estudios de conformación sobre la
poli(L-lisina), sustituida por unos
aminoácidos y unos oligopéptidos.
De todas formas, este documento no trata de los
problemas de desestabilización de las membranas celulares en medio
débilmente ácido, para permitir la transferencia del ADN a unas
células huésped.
Los nuevos complejos de ácido nucleico y de
polímero sustituido son susceptibles de transfectar varios tipos
celulares.
Un nuevo tipo de polímero catiónico comprende,
además de las cargas positivas del polímero, unos sustitutos que
favorecen el paso a través de la membrana del ácido nucleico
transportado y, en caso necesario, de los sustituyentes que actúan
como señales de reconocimiento. Los sutituyentes que favorecen el
paso a través de la membrana están enlazados al polímero y son unos
derivados que no son catiónicos en medio ligeramente alcalino, pero
se convierten en catiónicos en medio neutro y en medio ácido.
Los nuevos complejos de ácido nucleico y de
polímero sustituido son susceptibles de favorecer el paso a través
de la membrana del ADN tras la endocitosis de los complejos.
Los nuevos complejos de ácido nucleico y de
polímero sustituido no presentan señales de reconocimiento
reconocidas por unos receptores de membrana en la superficie de las
células.
Los nuevos complejos de ácido nucleico y de
polímero sustituido presentan además unas señales de reconocimiento
reconocidas por unos receptores de membrana en la superficie de las
células, confiriendo un carácter selectivo a la transfección con
respecto a los diferentes tipos celulares.
Se describe un procedimiento de transfección
específico in vitro e in vivo.
Los nuevos conjugados de polilisina sustituida no
presentan señales de reconocimiento reconocidas por unos receptores
de membrana en la superficie de las células, susceptibles de ser
complejados con un ácido nucleico con vistas a la transfección de
una célula.
Los nuevos conjugados de polilisina presentan por
otra parte unas señales de reconocimiento reconocidas por unos
receptores de membrana en la superficie de las células, susceptibles
de ser complejados con un ácido nucleico con vistas a la
transfección selectiva de una célula.
El interés de la invención es que estos nuevos
complejos de ácido nucleico y de polímero son susceptibles de
transfectar las células en ausencia de auxiliares de paso a través
de la membrana (cloroquina o péptidos permeabilizantes y/o
fusiógenos). Son aquí los grupos débilmente básicos, protonizables
(catión) en medio ligeramente ácido, fijados sobre el polímero los
que desempeñan la función de auxiliares de paso a través de la
membrana.
El interés de la invención es que estos nuevos
complejos de ácido nucleico y de polímero sustituido son tanto o más
eficaces sin auxiliares de paso a través de la membrana que los
complejos de ácido nucleico y de polímero no sustituido o sustituido
por unos agentes que reducen el número de cargas del polímero (por
lo tanto su interacción con el ácido nucleico) en presencia de
auxiliares de paso a través de la membrana.
En el caso de la cloroquina y de los péptidos
permeabilizantes y/o fusiógenos, estos últimos son unas pequeñas
moléculas que se difunden rápidamente si no están ligadas
covalentemente a los complejos de ácido nucleico y de polímero
sustituido.
\newpage
El interés de la invención es que estos nuevos
complejos de ácido nucleico y de polímero sustituido son tan
eficaces (incluso más eficaces) en presencia de suero como en
ausencia de suero para transfectar las células.
La invención se refiere a un complejo entre al
menos un ácido nucleico (cargado negativamente) y al menos un
conjugado polimérico cargado positivamente, siendo el enlace entre
el ácido nucleico y el conjugado polimérico de naturaleza
electroestática, el conjugado polimérico contiene un polímero
formado por unidades monoméricas que llevan unas funciones
NH_{3}^{+} libres, y siendo tal que:
- -
- las funciones NH_{3}^{+} libres de las arriba mencionadas unidades monoméricas son sustituidas en una proporción de al menos un 10%, por unos residuos protonizables en un medio cuyo pH es inferior al del plasma o al del suero, provocando dichos residuos en un medio cuyo pH es inferior al del plasma o del suero, una desestabilización de las membranas celulares, en particular la membrana de las vesículas de endocitosis, y/o de los endosomas,
- -
- por otra parte dichos residuos poseen las siguientes propiedades:
- \bullet
- comprenden un grupo funcional que les permite ser fijados al arriba mencionado polímero,
- \bullet
- no son activos como señal de reconocimiento reconocida por un receptor de membrana celular,
- \bullet
- pertenecen a la familia de los compuestos que comprenden un núcleo imidazol,
- \bullet
- pertenecen a la familia de las quinolinas,
- \bullet
- pertenecen a la familia de las pterinas,
- \bullet
- pertenecen a la familia de las piridinas,
a condición de que el conjunto de
funciones NH_{3}^{+} libres sea al menos un 30% del número de
unidades monoméricas del esqueleto polimérico del arriba mencionado
conjugado polimérico, y a condición de que el conjugado polimérico
sea diferente del conjugado
polilisina-(ditiopiridil)propionato.
Según un modo de realización, los complejos de la
invención son tales que los residuos protonizables, en un medio cuyo
pH es inferior al del plasma o del suero, comprenden al menos una
función NH_{3}^{+} libre.
Según otro modo de realización, los complejos de
la invención son tales que están presentes unas moléculas que
constituyen una señal de reconocimiento reconocida por un receptor
de la membrana celular:
- \bullet
- o bien por sustitución de algunas de las funciones NH_{3}^{+} libres de las unidades monoméricas,
- \bullet
- o bien en algunos de los residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares,
- \bullet
- o bien por sustitución de la función NH_{3}^{+} libre de los residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares.
Según otro modo de realización, los complejos de
la invención son tales que las funciones NH_{3}^{+} libres de
las unidades monoméricas son sustituidas en una proporción de
aproximadamente un 15% a un 45%.
Por desestabilización de las membranas, se
entiende una modificación de la membrana que conduce, o bien a un
aumento de su permeabilidad con respecto a las moléculas de soluto
de baja masa molecular y eventualmente de alta masa molecular
(incluidos unos ácidos nucleicos, unos plásmidos o unos complejos),
o bien a la fusión con otra membrana.
La permeabilidad de la membrana se puede medir
por microscopía de fluorescencia de la siguiente forma:
Las células adherentes son incubadas a 37ºC
durante 15 a 30 minutos con 0,5 ml de medio de cultivo DMEM con un
suero que contiene 5 mg/ml de dextrano (Mw 4000) marcado con
isotiocianato de fluoresceína (FTC-Dextran) y un
complejo de ADN/polilisina histidilada. Las células son a
continuación lavadas e incubadas a 37ºC durante 15 a 30 minutos con
un medio de cultivo que contiene un 10% de suero bovino fetal. Las
células son a continuación fijadas durante 5 minutos en una solución
tampón de fosfato salino que contiene 4% de p-formaldehído y
la fluorescencia es analizada con un microscopio de fluorescencia de
plano confocal (MRC600 BioRad). En ausencia de permeabilización de
la membrana, la fluorescencia proveniente del
FTC-Dextran está localizada exclusivamente en las
vesículas. En presencia de un agente de permeabilización de la
membrana, la fluorescencia proveniente del
FTC-Dextran es además observada de forma difusa en
el citosol y el núcleo de las células.
La fusión de las membranas en presencia de
complejos ADN/polilisina histidilada se mide fácilmente en unos
sistemas modelo tales como los liposomas utilizando un
procedimiento de mezcla lipídica como el descrito en Struck D.K.
et al. (Use of resonante energy transfer to monitor membrane
fusion. (1981) Biochemistry 20: 4093-4099).
Brevemente, se utilizan unos liposomas constituidos por
dioleoil-fosfatidilcolina (DPOC) en la que están
insertados en su membrana
N-(7-nitrobez-2-oxa-1,3-diazol-4-il)
fosfatidil etanolamina (NBD-PE) y octadecilrodamina
(R18) como marcador fluorescente y unos liposomas sin marcadores
fluorescentes. Se mide la fluorescencia del
NBD(\lambdaex=470 nm; \lambdaem=530 nm) en ausencia y en
presencia de unos complejos de ADN/polilisina histidilada a
diferentes pH. La fusión de los liposomas induce una disminución de
la fluorescencia del NBD debida a una disminución de la
transferencia de energía entre la rodamina y el NBD.
Estos nuevos complejos de ácido nucleico y de
polímero sustituido que contienen unos grupos débilmente básicos,
protonizables (catión) en un medio ligeramente ácido en presencia de
suero, están por lo tanto mejor adaptados para una transferencia de
genes in vivo que los complejos de ADN/polilisina o
ADN/polilisina gluconoilada que sólo son activos en presencia de
auxiliares tales como la cloroquina o unos péptidos fusiógenos y/o
permeabilizantes.
Los residuos provocan la desestabilización de las
membranas celulares gracias a su propiedad de ser protonizables en
medio ácido.
Los residuos que provocan la desestabilización de
las membranas celulares son unos captadores de protones que limitan
la acidificación de los endosomas y, por lo tanto, desfavorecen la
fusión entre los endosomas tardíos y los liposomas. Se ha de
recordar que los lisosomas son unas vesículas que contienen un gran
número de hidrolasas y que estos lisosomas son muy eficaces para
degradar las macromoléculas biológicas en general y los ácidos
nucleicos en particular.
La expresión "medio débilmente ácido"
designa un medio cuyo pH es inferior al del plasma o del suero, por
ejemplo un pH inferior a 7,4.
La expresión según la cual los residuos "no son
activos como señal de reconocimiento reconocida por un receptor de
la membrana celular" significa que, por un lado, hasta hoy, no
existen receptores conocidos que sean específicos de estos residuos
y, por otro lado, que estos residuos no son utilizados como
ligandos.
Una molécula o un complejo molecular es activo
como señal de reconocimiento, si puede ser reconocido selectivamente
por un receptor, es decir si desempeña la función de un ligando, de
un agonista o de un antagonista.
Por señal de reconocimiento reconocida por un
receptor de la membrana celular, se designa generalmente un ligando
(molécula o complejo molecular) capaz de ser reconocido
selectivamente por dicho receptor (afinidad
ligando-receptor = 10^{3} l/mol).
La invención se refiere en particular a un
complejo entre al menos un ácido nucleico (cargado negativamente) y
al menos un conjugado polimérico cargado positivamente, siendo el
enlace entre al ácido nucleico y el conjugado polimérico de
naturaleza electroestática, el conjugado polimérico contiene un
polímero formado por unidades monoméricas que llevan las funciones
NH_{3}^{+} libres; y siendo tales que:
- -
- las funciones NH_{3}^{+} libres de las arriba mencionadas unidades monoméricas son sustituidas en una proporción de al menos un 10%, ventajosamente un 15% a aproximadamente un 45%, en particular un 35%, determinándose por ejemplo esta proporción por resonancia magnética nuclear, por unos residuos protonizables en un medio débilmente ácido que provocan en un medio débilmente ácido una desestabilización de las membranas celulares, en particular la membrana de las vesículas de endocitosis y/o de los endosomas,
- -
- los arriba mencionados residuos poseen además las siguientes propiedades:
- \bullet
- son unas bases cuyo pK en medio acuoso es inferior a 8, de tal forma que una proporción de estas bases, superior al 50%, unida a un polímero catiónico no sea protenizada en un medio neutro de un pH de 7,4,
- \bullet
- comprenden un grupo funcional que les permite ser fijados al arriba mencionado polímero,
- \bullet
- no son activos como señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular,
- \bullet
- pueden comprender al menos una función NH_{3}^{+} libre,
- \bullet
- pertenecen a la familia de los compuestos que comprenden un núcleo de imidazol
- \bullet
- pertenecen a la familia de las quinolinas,
- \bullet
- pertenecen a la familia de las uterinas,
- \bullet
- pertenecen a la familia de las piridinas
- -
- las funciones NH_{3}^{+} libres de las mencionadas unidades monoméricas pueden ser también sustituidas por unos residuos no cargados que provocan una disminución de las cargas positivas con respecto al mismo conjugado polimérico no sustituido, facilitando el relargado del ácido nucleico durante la disociación del complejo,
- -
- los mencionados residuos no cargados poseen además las siguientes propiedades:
- \bullet
- comprenden al menos un grupo hidroxilo,
- \bullet
- no son activos como señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular,
- -
- estando eventualmente presentes unas moléculas que constituyen una señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular:
- \bullet
- o bien por sustitución de ciertas funciones NH_{3}^{+} libres de las mencionadas unidades monoméricas (por ejemplo el \varepsilon-NH_{3}^{+} de la lisina),
- \bullet
- o bien sobre algunos de los residuos no cargados que provocan una disminución de carga (por ejemplo gluconoilo), y en particular sobre los grupos hidroxilo de los mencionados residuos no cargados que provocan una disminución de carga;
- \bullet
- o bien sobre algunos de los mencionados residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares (por ejemplo imidazol acetil), o bien por sustitución de la función NH_{3}^{+} eventual, libre de las arriba mencionadas unidades monoméricas que provocan una desestabilización de las membranas celulares (por ejemplo la histidina).
a condición de que el conjunto de
las funciones NH_{3}^{+} libres sea al menos un 30% del número
de unidades monoméricas del esqueleto polimérico del arriba
mencionado conjugado
polimérico.
La invención se refiere también a un complejo
entre al menos un ácido nucleico (cargado negativamente) y al menos
un conjugado polimérico cargado positivamente, siendo el enlace
entre el ácido nucleico y el conjugado polimérico de naturaleza
electroestática, el conjugado polimérico contiene un polímero
formado por unidades monoméricas que llevan las funciones
NH_{3}^{+} libres, y son tales que:
- -
- las funciones NH_{3}^{+} libres de las arriba mencionadas unidades monoméricas están sustituidas en una proporción de al menos un 10%, ventajosamente aproximadamente de un 15% a un 45%, en particular de un 35%, determinándose esta proporción por ejemplo por resonancia magnética nuclear, por unos residuos protonizables en un medio débilmente ácido que provocan en un medio débilmente ácido una desestabilización de las membranas celulares, en particular la membrana de las vesículas de endocitosis,
- -
- poseyendo además los arriba mencionados residuos las siguientes propiedades:
- \bullet
- pertenecen a la familia de los compuestos que comprenden un núcleo imidazol,
- \bullet
- pertenecen a la familia de las quinolinas,
- \bullet
- pertenecen a la familia de las pterinas,
- \bullet
- pertenecen a la familia de las piridinas
- \bullet
- los arriba mencionados residuos comprenden un grupo funcional que les permite ser fijados al arriba mencionado polímero,
- \bullet
- pueden comprender al menos una función NH_{3}^{+} libre
- \bullet
- no son activos como señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular,
- -
- las funciones NH_{3}^{+} libres de las arriba mencionadas unidades monoméricas pueden ser también sustituidas por al menos una molécula que constituye una señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular y/o por unos residuos no cargados que provocan una disminución de las cargas positivas con respecto al mismo conjugado polimérico no sustituido, facilitando el relargado del ácido nucleico durante la disociación del complejo, a condición de que el conjunto de los arriba mencionados residuos contenga al menos un 30% de las funciones NH_{3}^{+} libres,
- -
- las funciones NH_{3}^{+} libres de las arriba mencionadas unidades monoméricas pueden ser también sustituidas por al menos una molécula que constituye una señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular, y/o por unos residuos no cargados que provocan una disminución de las cargas positivas con respecto al mismo conjugado polimérico no sustituido, facilitando el relargado del ácido nucleico por la disociación del complejo,
- -
- los arriba mencionados residuos no cargados poseen además las siguientes propiedades:
- \bullet
- comprenden al menos un grupo hidroxilo,
- \bullet
- no son activos como señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular,
- -
- estando presentes de forma eventual unas moléculas que constituyen una señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular:
- \bullet
- o bien por sustitución de algunas de las funciones NH_{3}^{+} libres de las arriba mencionadas unidades monoméricas (por ejemplo \varepsilon-NH_{3}^{+} de la lisina),
- \bullet
- o bien sobre algunos de los residuos no cargados que provocan una disminución de carga (por ejemplo gluconoilo), y en particular sobre los grupos hidroxilo de los arriba mencionados residuos no cargados que provocan una disminución de carga,
- \bullet
- o bien sobre algunos de los residuos de los mencionados más arriba que provocan una desestabilización de las membranas celulares (por ejemplo el imidazol acetil),
- \bullet
- o bien por sustitución de la función NH_{3}^{+} eventual, libre de los arriba mencionados resíduos que provocan una desestabilización de las membranas celulares (por ejemplo la histidina).
a condición de que el conjunto de
las funciones NH_{3}^{+} libres sea al menos un 30% del número
de unidades monoméricas del esqueleto polimérico del arriba
mencionado conjugado
polimérico.
Las señales de reconocimiento pueden también
provocar una disminución de las cargas positivas del conjugado
polimérico cuando son, ellas mismas, neutras o ácidas y están
enlazadas al polímero por sustitución de una función NH_{3}^{+}
que provoca la perdida de la carga +.
Las señales de reconocimiento son unas moléculas
de pequeña masa molecular (<5000 daltons).
El número de moléculas de señal de reconocimiento
fijado sobre el polímero modificado puede ser:
- -
- para una molécula señal de muy alta afinidad respecto a su receptor (ka>10^{7} l/mol), de aproximadamente 0,5 a 5, ventajosamente 1 molécula para aproximadamente 10 000 unidades monoméricas de polímero sustituido es decir 1 molécula por aproximadamente 50 moléculas de polímero sustituido;
- -
- para una molécula señal de alta afinidad respecto a su receptor (ka entre 10^{5} l/mol y 10^{7} l/mol), de aproximadamente 0,5 a 10, ventajosamente 1 molécula para aproximadamente 200 unidades monoméricas de polímero sustituido es decir 1 molécula para aproximadamente 1 molécula de polímero sustituido;
- -
- para una molécula señal de mediana afinidad respecto a su receptor (ka<10^{5} l/mol), de aproximadamente 10 a 100, ventajosamente 50 moléculas para aproximadamente 200 unidades monoméricas de polímero sustituido es decir 50 moléculas para aproximadamente 1 molécula de polímero sustituido;
La familia de las quinolinas está representada
por la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que n vale de 1 a 10,
preferentemente de 1 a
3
La familia de las pterinas está representada por
la siguiente fórmula:
La familia de las piridinas está representada por
las siguientes fórmulas:
La invención se refiere también a un complejo en
el que los residuos que provocan en un medio débilmente ácido una
desestabilización de las membranas celulares son:
- -
- unos alquilimidazoles en los que el radical alquilo comprende de 1 a 10, en particular de 2 a 6 átomos de carbono, y en el que está sustituido uno solo de los átomos de nitrógeno del núcleo imidazol,
- -
- o unas quinolinas de fórmula:
en la que R_{1} representa H y
R_{2} representa
(CH_{2})n-CO_{2}-H,
siendo n un número entero que varía de 1 a 10, y vale
preferentemente de 1 a
3.
La invención se refiere también a un complejo en
el que los residuos que provocan una desestabilización de las
membranas celulares son escogidos entre: la histidina, el
4-carboximetil-imidazol, la
3-(1-metil-imidazol-4il)-alanina,
la
3-(3-metil-imidazol-4il)-alanina,
el 2-carboxi-imidazol, la histamina,
el ácido
3-(imidazol-4il)-L-láctico,
la
2-(1-metil-imidazol-4il)etilamina,
la
2-(3-metil-imidazol-4il)etilamina,
la
\beta-alanil-histidina-(carnosina),
la
7-cloro-4(amino-1-metilbutilamino)-quinolina,
la
N^{4}-(7-cloro-4-quinolinil)-1,4-pentanodiamina,
la
8-(4-amino-1-metilbutilamino)-6-metoxi
quinolina (primaquina), la
N^{4}-(6-metoxi-8-quinolinil)-1,4-pentanodiamina,
el ácido quinínico, el ácido quinolín carboxílico, el ácido
pteroico, el ácido nicotínico, el ácido quinolínico, y en el que
- -
- la función NH_{3}^{+} eventual, libre de los arriba mencionados residuos (por ejemplo la histidina) puede ser también sustituida por una molécula que constituye una señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular,
a condición de que el conjunto de
las funciones NH_{3}^{+} libres sea al menos un 30% del número
de unidades monoméricas del esqueleto polimérico del arriba
mencionado conjugado
polimérico.
La invención se refiere a un complejo entre al
menos un ácido nucleico (cargado negativamente) y al menos un
conjugado polimérico cargado positivamente, siendo el enlace entre
el ácido nucleico y el conjugado polimérico de carácter
electroestático el conjugado polimérico contiene un polímero formado
por unidades monoméricas que llevan unas funciones NH_{3}^{+}
libres, en particular unos residuos de lisina o de ornitina, y
siendo tal que:
- -
- las funciones NH_{3}^{+} libres de las arriba mencionadas unidades monoméricas están sustituidas en una proporción de al menos un 10%, ventajosamente aproximadamente de un 15% a un 45%, en particular de un 35%, por unos residuos que provocan en un medio débilmente ácido una desestabilización de las membranas celulares,
- -
- los mencionados resíduos poseen además las siguientes propiedades:
- \bullet
- comprenden un núcleo imidazol
- \bullet
- pueden comprender al menos una función NH_{3}^{+} libre,
- \bullet
- no son activos como señal de reconocimiento,
- -
- siendo las restantes funciones NH_{3}^{+} libres de dichas unidades monoméricas sustituidas a razón de aproximadamente 1% a aproximadamente 60% por una molécula que constituye una señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular, teniendo esta señal de reconocimiento una masa molecular inferior a 5000, pudiendo estar presente esta señal de reconocimiento a razón de una molécula para aproximadamente 200 unidades del conjugado polimérico o aproximadamente 60 moléculas para aproximadamente 200 unidades de conjugado polimérico.
a condición de que el conjunto de
las funciones NH_{3}^{+} libres sea de al menos un 30% del
número de unidades monoméricas del esqueleto polimérico del arriba
mencionado conjugado
polimérico.
La expresión "no activos como señal de
reconocimiento" significa que, por un lado, hasta hoy, no existen
receptores conocidos que sean específicos de estos residuos y, por
otro lado, que estos residuos no son utilizados como ligandos.
La invención se refiere también a un complejo en
el que el polímero contiene un grupo polimérico de fórmula (I)
siguiente:
en la
que:
- -
- p es un número entero que varía de 15 a 900, preferentemente de 100 a 300,
- -
- n es un número entero que varía de 1 a 6, y vale preferentemente 4,
- -
- este grupo polimérico contiene unos radicales R entre los cuales:
- \bullet
- 10% a 45% del número de radicales R representan un residuo que contiene un núcleo imidazol y eventualmente una función NH_{3}^{+} libre, en particular un residuo histidilo, pudiendo ser representado R por la fórmula:
- pudiendo ser también sustituida la función NH_{3}^{+} eventual de los arriba mencionados residuos por una molécula que constituye una señal de reconocimiento,
- \bullet
- 10% a 90% del numero de los radicales R, que representan los ^{-}\omega-amino NH_{3}^{+}, y siendo eventualmente sustituido a razón de 0 a 50% por una molécula que constituye un señal de reconocimiento, en particular a razón de 0 a 60, ventajosamente de 1 molécula para aproximadamente 200 motivos, o a razón de 2 a 100, ventajosamente de 50 moléculas para aproximadamente 200 motivos, y/o
- \bullet
- pudiendo R además estar constituido de 0 a 45% por un grupo NH-CO-(CHOH)_{m}-R_{1}, en particular por un resto de dihidroxipropionoilamido, eritronoilamido, treonoilamido, ribonoilamido, arabinoilamido, xilonoilamido, lixonoilamido, gluconoylamido, galactonoilamido, manonoilamido, glicoheptonoilamido, glicooctonoilamido, m es un número entero de 2 a 15, preferentemente de 2 a 7, R_{1} representa H o un radical alcohilo de 1 a 15 átomos de carbono, en particular CH_{3}, pudiendo ser sustituidos estos radicales por una molécula que constituye una señal de reconocimiento, a condición de que el conjunto de las funciones NH_{3}^{+} libres sea al menos un 30% del número de unidades monoméricas del esqueleto polimérico del arriba mencionado conjugado polimérico.
En esta clase de complejos de la invención, el
polímero es polisina o poliornitina.
Como muestran los ejemplos, las células HepG2
(hepatocarcinoma humano) son eficazmente transfectadas por
polilisina sustituida por 70 residuos histidilo.
La polilisina sustituida por 30\pm10% de
histidina ha permitido transfectar diferentes células (humanas y
murinas) con una gran eficacia, modulada según el tipo celular y el
promotor utilizado.
La invención tiene también por objeto un complejo
en el que el polímero comprende un grupo polimérico que tiene la
siguiente fórmula (II):
en la
que:
- -
- p tiene las significaciones indicadas más arriba,
- -
- 10% a 45% del número de radicales R representan un residuo que comprende un núcleo imidazol y eventualmente una función NH_{3}^{+} libre, en particular un residuo histidilo, pudiendo R ser representado por la fórmula
- pudiéndose sustituir también las funciones NH_{3}^{+} de los arriba mencionados residuos por una molécula que constituye una señal de reconocimiento,
- -
- el resto de los radicales, es decir 30% a 90% del número de radicales R, que representan los ^{-}\omega-amino NH_{3}^{+}, y de 0% a 45% de los radicales R pueden ser sustituidos por una molécula que constituye una señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular,
a condición de que el conjunto de
las funciones NH_{3}^{+} libres sea un 30% del menos del número
de unidades monoméricas del esqueleto polimérico del arriba
mencionado conjugado
polimérico.
La invención tiene también por objeto un complejo
que se caracteriza porque la señal de reconocimiento es escogida
entre:
- A)
- - unos ósidos simples o complejos reconocidos por unas lectinas de membrana, y escogidos entre:
- a.
- Asialo-oligósido del tipo triantenado lactosamina: receptor de la asialoglicoproteina
- b.
- Asialo oligósido del tipo lactosamina tetraantenada: receptor de la asialoglicoproteina
- c.
- Lewis x:
- d.
- Lewis x sialil: LECAM 3/2
- e.
- Derivado de Lewis x sulfatado (HNK1):
- f.
- Oligomannosido: receptor de mannosa
- g.
- Oligomannósido fosforilado: receptor de mannosa 6 fosfato
- h.
- Oligosacárido del tipo lactosamina sulfatada: receptor del GalNAc 4 sulfatado
- B)
- unos péptidos
- a.
- péptidos antiinflamatorios o algunos de sus fragmentos reconocidos por unos receptores de la pared vascular, tales como
- -
- polipéptido vasodilatador intestinal (VIP) HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH_{2}
- -
- polipéptido artrial natriurético (ANP) SLRRSSCFGGRMDRIGAAQSGLGCNSFRY
- -
- lipocortina HDMNKVLDL
- -
- bradiquinina RPPGFSPFR;
- b.
- péptidos ligandos de las integrinas, tales como los péptidos que contienen la secuencia RGD, ligando de la fibronectina;
- c.
- factores quimiotácticos tales como los formilpéptidos y sus antagonistas: FMLP, (N-formil-Met-Leu-Phe);
- d.
- hormonas peptídicas tales como la \alpha-MSH; Ac-SYSMEHFRWGKPV-NH_{2} y sus antagonistas.
- C)
- Metabolitos naturales tales como:
- -
- la biotina,
- -
- la carnitina
- -
- el tetrahidrofolato y el ácido fólico que pueden ser a la vez una señal de reconocimiento con respecto a ciertas células que poseen los receptores apropiados y un desestabilizador de las membranas celulares.
La invención se refiere también a un complejo que
se caracteriza porque el ácido nucléico puede ser escogido
entre:
- a)
- unos genes marcadores tales como
- -
- los genes que contienen la luciferasa,
- -
- la proteína verde de la medusa Aequorea victoria,
- -
- los genes que contienen la \beta-galactosidasa,
- -
- los genes que contienen la cloranfenicol acetil transferasa
- -
- los genes que confieren la resistencia a un antibiótico, tales como la higromicina, la neomicina, etc..;
- b)
- unos genes del tipo terapéutico, tales como
- -
- unos receptores de las lipoproteínas de baja densidad, deficiente en los casos de hipercolesterolemia,
- -
- unos factores de coagulación: factores VIII y IX,
- -
- la fenilalanina-hidroxilasa (fenilcetonuria),
- -
- la adenosindesaminasa (inmunodeficiencia ADA),
- -
- unos enzimas lisosómicos tales como la \beta-glucosidasa en el caso de la enfermedad de Gaucher,
- -
- la distrofina y la minidistrofina (miopatía),
- -
- la tirosinhidroxilasa (Parkinson),
- -
- unos factores de crecimiento de las neuronas (Alzheimer),
- -
- el CFTR cystic-fibrosis transmembrane conductance regulator (mucoviscidiosis),
- -
- la alfalantitripsina,
- -
- unas citoquinas (interleucinas, TNF factor de necrosis de los tumores),
- -
- la timidinquinasa del virus Herpes simplex
- -
- unas proteínas del MHC, sistema mayor de histocompatibilidad, en particular los HLA-B7,
- -
- la citosindesaminasa
- -
- unos genes codificantes para los ARN sentido y antisentido,
- -
- unos genes codificantes para las ribozimas,
- c)
- unos genes para vacunas
- -
- genes codificantes para unos antígenos virales (vacunación), por ejemplo:
- -
- gen que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe.
La invención tiene también por objeto un complejo
en el que:
- -
- el polímero, en particular la polilisina presenta un grado de polimerización de aproximadamente 15 a aproximadamente 900, preferentemente 200,
- -
- siendo sustituidas las funciones NH_{3}^{+} libres de los motivos lisina en una proporción del 35% por unos residuos histidilo y eventualmente por una molécula que constituye una señal de reconocimiento para 1 a 50 residuos de lisina cuando la mencionada molécula señal posee una afinidad de al menos 10^{5} l mol^{-1}con respecto al receptor de la célula que la compleja debe hospedar o eventualmente por 20 a 100 moléculas de señal de reconocimiento para 200 residuos de lisina cuando la mencionada molécula señal posee una afinidad inferior a 10^{5} l mol^{-1} con respecto al arriba mencionado receptor,
- -
- el ácido nucleico presenta una masa molecular de aproximadamente 10^{6} a aproximadamente 10^{8}, en particular de 3.106 a 30.106
- -
- la relación entre el número medio de pares de bases del ácido nucleico por molécula de unidad monomérica, en particular la lisina es de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 6, preferentemente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,6.
Tratándose de las afinidades:
- -
- para una molécula señal de muy alta afinidad respecto a su receptor (ka>10^{7} l/mol), de aproximadamente 0,5 a 5, ventajosamente 1 molécula para aproximadamente 10 000 unidades monoméricas del polímero sustituido es decir 1 molécula para aproximadamente 50 moléculas de polímero sustituido;
- -
- para una molécula señal de alta afinidad respecto a su receptor (ka entre 10^{5} l/mol y10^{7} l/mol), de aproximadamente 0,5 a 10, ventajosamente 1 molécula para aproximadamente 200 unidades monoméricas del polímero sustituido es decir 1 molécula para aproximadamente 1 molécula de polímero sustituido;
- -
- para una molécula señal de mediana afinidad respecto a su receptor (ka <10^{5} l/mol), de aproximadamente 10 a 100, ventajosamente 50 moléculas para aproximadamente 200 unidades monoméricas del polímero sustituido es decir 50 moléculas para aproximadamente 1 molécula de polímero sustituido;
La invención tiene también por objeto un
conjugado polimérico cargado positivamente, que contiene unas
unidades que llevan las funciones NH_{3}^{+} libres, y siendo
tal que:
- -
- las funciones NH_{3}^{+} libres de las arriba mencionadas unidades monoméricas son sustituidas en una proporción de al menos 10%, ventajosamente aproximadamente de 15% a aproximadamente 45%, en particular 35%, siendo esta proporción determinada por ejemplo por resonancia magnética nuclear, para unos residuos protonizables en un medio débilmente ácido que provoca en un medio débilmente ácido una desestabilización de las membranas celulares, en particular de la membrana de las vesículas de endocitosis,
- -
- los arriba mencionados residuos poseen además otras propiedades que son las siguientes:
- \bullet
- comprenden un grupo funcional que les permite ser fijados al arriba mencionado polímero,
- \bullet
- no son activos como señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular,
- \bullet
- pueden comprender al menos una función NH_{3}^{+} libre,
- \bullet
- pertenecen a la familia de los compuestos que comprenden un núcleo imidazol
- \bullet
- pertenecen a la familia de la quinolinas,
- \bullet
- pertenecen a la familia de las uterinas,
- \bullet
- pertenecen a la familia de las piridinas
- -
- las funciones NH_{3}^{+} libres de las arriba mencionadas unidades monoméricas pueden ser también sustituidas por unos residuos no cargados que provocan una disminución de las cargas positivas con respecto al mismo conjugado polimérico no sustituido, facilitando el relargado del ácido nucleico por la disociación del complejo,
- -
- dichos residuos no cargados poseen además las siguientes propiedades:
- \bullet
- comprenden al menos un grupo hidroxilo,
- \bullet
- no son activos como señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular,
- \bullet
- los grupos hidroxilo de los arriba mencionados residuos no cargados pueden ser sustituidos por al menos una molécula que constituye una señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular,
- -
- eventualmente están presentes unas moléculas que constituyen una señal de reconocimiento reconocida por un receptor de la membrana celular:
- \bullet
- o bien por sustitución de ciertas funciones NH_{3}^{+} libres de las arriba mencionadas unidades monoméricas (por ejemplo \varepsilon-NH_{3}^{+} de las lisinas),
- \bullet
- o bien en algunos de los arriba mencionados residuos no cargados que provocan una disminución de la carga (por ejemplo el gluconoilo), y en particular en los grupos hidroxilo de los arriba mencionados residuos no cargados, que provocan una disminución de la carga,
- \bullet
- o bien en algunos de los arriba mencionados residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares (por ejemplo el imidazol acetil),
- \bullet
- o bien por sustitución de la función NH_{3}^{+} eventualmente, libre de los arriba mencionados residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares (por ejemplo la histidina),
a condición de que el conjunto de
las funciones NH_{3}^{+} libres sea al menos 30% del número de
unidades monoméricas del esqueleto polimérico del arriba mencionado
conjugado
polimérico.
La invención se refiere también a un conjugado
polimérico del tipo definido más arriba o que contiene un grupo
polimérico del tipo definido más arriba.
Según un modo de realización ventajoso de la
invención, el conjugado polimérico es escogido entre la polilisina
histidilada sustituida por lactosa, la polilisina histidilada
sustituida por un oligósido complejo del tipo Lewis^{b}, la
polilisina histidilada sustituida por el péptido ANP o la polilisina
histidilada sustituida por la biotina.
La preparación de los conjugados poliméricos de
la invención puede llevarse a cabo según una de las formas descritas
en las siguientes tablas:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los residuos responsables de la desestabilización
de las membranas son escogidos entre: la histidina, el
4-carboximetil-imidazol, la
3-(1-metil-imidazol-4il)-alanina,
la
3-(1-metil-imidazol-4il)-alanina,
el 2-carboxi-imidazol, la histamina,
el ácido
3-(imidazol-4il)-L-láctico,
la
2-(1-metil-imidazol-4il)etilamina,
la
2-(3-metil-imidazol-4il)etilamina,
la \beta-alanil-histidina, la
7-cloro-4(amino-1-metilbutilamino)-quinolina,
la
N^{4}-(7-cloro-4-quinolinil)-1,4-pentanodiamina,
la
8-(4-amino-1-metilbutilamino)-6-metoxi
quinolina, la
N^{4}-(6-metoxi-8-quinolinil)-1,4-pentanodiamina,
el ácido quinínico, el ácido quinolín carboxílico, el ácido
pteróico, el ácido nicotínico, el ácido quinolínico,
Los residuos responsables de la disminución de
carga son escogidos entre: el dihidroipropionilo, el eritronoilo, el
treonoilo, el ribonoilo, el arabinoilo, el xilonoilo, el lixonoilo,
el gluconoilo, el galactonoilo, el mannonoilo, el glicoheptonoilo,
el glicooctonoilo.
Se escogen unas señales de reconocimiento entre:
unos ósidos, unos oligósidos, unos péptidos, unos metabolitos, unos
agonistas, unos antagonistas.
A título de ejemplo se describen diferentes
procedimientos de las tablas;
A) Procedimiento
I
- a)
- Las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} libre son sustituidas parcialmente por unos residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares. Por ejemplo, la polilisina (en particular en forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base (en particular la diisopropiletilamina), de unas moléculas que provocan una desestabilización de las membranas celulares (en particular el ácido nicotínico) y de un agente de acoplamiento (en particular el hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio).
- b)
- Las señales de reconocimiento están enlazadas a ciertos grupos \varepsilon-aminados de unos residuos lisilos del polímero.
A título de ejemplo de fijación de las señales de
reconocimiento sobre la polilisina nicotinilada, se indican a
continuación la fijación de los ósidos o de los oligósidos.
Unos ósidos simples bajo la forma de unos
derivados fenilisotiocianatos son fijados sobre ciertas funciones
\varepsilon-aminadas de los residuos lisilos
libres de la polilisina como se ha descrito anteriormente en
MIdoux et al., (Nucleic Acids res. 1993, 21:
871-878).
Los oligósidos complejos tales como los
asialo-oligósidos bi-, tri- o tetraantenados o Lewis
son obtenidos en forma de unos derivados fenilisotiocianatos de los
glicopéptidos según un procedimiento descrito en Monsigny et
al., (patente francesa 9407738 (Monsigny, M., Sdiqui, N., Roche,
A.C. and Mayer, R. 1994 Nuevos derivados de oligósidos, su
procedimiento de preparación y sus aplicaciones) y Sdiqui et
al., (1995 New síntesis of glyco-amino acid
conjugates. Carbohyd. Letters 1, 269-275). Los
glicopéptidos bajo la forma de derivados fenilisotiocianatos son
fijados sobre ciertas funciones
\varepsilon-aminadas de los residuos lisilos
libres de la polilisina como se ha descrito anteriormente en
Midoux et al. (Nucleic Acid Res. 1993, 21:
871-878).
- a)
- Las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} libre son sustituidas parcialmente por unos residuos que comprenden una función que permite la fijación posterior de otras moléculas tales como las que constituirán una señal de reconocimiento, por ejemplo, tras reaccionar en medio orgánico con un éster N-hidroxisuccinimida del ácido ditiopiridinpropianato o de sus derivados.
- b)
- Las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} libre son a continuación sustituidas parcialmente por unos residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares, por ejemplo, tras reaccionar en medio orgánico con la histidina cuyo grupo \alpha NH_{3}^{+} y el grupo NH del núcleo imidazol son protegidos por el tertiobutiloxicarbonilo en presencia de un agente de acoplamiento del tipo hexafluorurofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio. Tras la reacción y la purificación, se desprotegen las funciones aminas de los residuos histidilos del polímero obtenido.
- c)
- Las señales de reconocimiento están unidas a los agrupamientos ditiopiridilos del polímero.
A título de ejemplo de fijación de unas señales
de reconocimiento sobre la polilisina histidilada, se indican a
continuación las fijaciones de los ósidos o los oligósidos.
Los ósidos simples derivados en glicopéptidos con
una función ditiopiridilo
(piroglutamil-NH-(CH2)_{2}-S-S-piridina)
según un procedimiento descrito en Monsigny et al., (Patente
francesa 9407738 (Monsigny, M., Sdiqui, N., Roche, A.C. and Mayer,
R. 1994 Nuevos derivados de oligósidos, su procedimiento de
preparación y sus aplicaciones) y Sdiqui et al., (1995 News
síntesis of glico-amino acid conjugates. Carbohyd.
Letters 1:269-275) son reducidos y fijados en
medio acuoso tamponado a pH neutro sobre las funciones ditiopiridilo
del polímero.
Los oligósidos complejos tales como los
asialo-oligósidos bi-, tri- o tetraantenados o Lewis
derivados en glicopéptidos con una función ditiopiridilo
(piroglutamil-NH-(CH2)_{2}-S-S-piridina)
según un procedimiento descrito en Monsigny et al., (Patente
francesa 9407738 (Monsigny, M., Sdiqui, N., Roche, A.C. and Mayer,
R. 1994 Nuevos derivados de oligósidos, su procedimiento de
preparación y sus aplicaciones) y Sdiqui et al., (1995 News
síntesis of glico-amino acid conjugates. Carbohyd.
Letters 1:269-275) son reducidos y fijados en
medio acuoso tamponado a pH neutro sobre las funciones ditiopiridilo
del polímero.
B) Procedimiento
II
- a)
- Las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} libre son sustituidas parcialmente por unos residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares. Por ejemplo la polilisina gluconoilada es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base (en particular la diisopropiletilamina), de unas moléculas que provocan una desestabilización de las membranas celulares (en particular el ácido nicotínico) y de un agente de acoplamiento (en particular el hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio).
- b)
- Las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} aún libre son a continuación sustituidas parcialmente por unos residuos no cargados que provocan una disminución de carga. Tratándose de la fijación de los residuos que provocan la disminución de carga, por ejemplo una sal de polilisina (en particular en forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base (en particular la diisopropiletilamina) y de un ácido orgánico hidroxilado activado (en particular la \delta-gluconolactona)
- c)
- Las señales de reconocimiento están enlazadas a ciertos grupos \varepsilon-aminados de los residuos lisilo del polímero.
A título de ejemplo de fijación de las señales de
reconocimiento sobre la polilisina histidilada, se indican a
continuación las fijaciones de los ósidos u oligósidos.
Unos ósidos simples en forma de derivados
fenilisotiocianatos son fijados en ciertas funciones
\varepsilon-aminadas de los residuos lisilos
libres de la polilisina como se ha descrito anteriormente en Midoux
et al. (Nucleic Acids Res. 1993,
21:871-878).
Los oligósidos complejos tales como los
asialo-oligósidos bi-, tri- o tetraantenados o Lewis
son obtenidos en forma de derivados fenilisotiocianatos de
glicopéptidos según un procedimiento descrito en Monsigny et
al., (Patente francesa 9407738 (Monsigny, M., Sdiqui, N., Roche,
A.C. and Mayer, R. 1994 Nuevos derivados de oligósidos, su
procedimiento de preparación y sus aplicaciones) y Sdiqui et
al., (1995 News síntesis of glico-amino acid
conjugates. Carbohyd. Letters 1:269-275). Los
glicopéptidos en forma de derivados fenilisotiocianatos son fijados
sobre ciertas funciones \varepsilon-aminadas de
los residuos lisilos libres de la polilisina como se ha descrito
anteriormente en Midoux et al. (Nucleic Acids Res. 1993,
21:871-878).
C) Procedimiento
V
- a)
- Las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} libre son sustituidas parcialmente por unos residuos que comprenden una función que permite la fijación posterior de otras moléculas. Tratándose de la fijación de señales de reconocimiento, por ejemplo una sal de polilisina(en particular en forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base(en particular la diisopropiletilamina) y del éster N-hidroxisuccinimida del ácido ditiopiridinpropionato o de sus derivados.
- b)
- Las unidades monoméricas del polímero que comprenden la función NH_{3}^{+} aún libre son a continuación sustituidas parcialmente por unos residuos no cargados que provocan una disminución de carga. Tratándose de la fijación de los residuos que provocan la disminución de carga, por ejemplo una sal de polilisina (en particular en forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfoxido) en presencia de una base (en particular la diisopropiletilamina) y de un ácido orgánico hidroxilado activado (en particular la \delta-gluconolactona).
- c)
- Las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} aún libre son a continuación sustituidas parcialmente por unos residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares. Tratándose de la fijación de residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares, por ejemplo una sal de polilisina (en particular en forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfoxido) en presencia de una base (en particular la diisopropiletilamina), de moléculas que provocan una desestabilización de las membranas celulares (en particular la histidina cuyo grupo \alphaNH_{3}^{+} y el grupo NH del núcleo de imidazol están protegidos por tertiobutiloxicarbonilo) y un agente de acoplamiento (en particular el hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio). Tras la purificación, las funciones aminadas protegidas de los residuos histidilo son desprotegidas.
- d)
- Las señales de reconocimiento están enlazadas a los grupos ditiopiridilos del polímero.
A título de ejemplo de fijación de las señales de
reconocimiento sobre la polilisina histidilada, se indican a
continuación la fijación de los ósidos u oligósidos.
Los ósidos simples derivados en glicopéptidos con
una función ditiopiridilo
(piroglutamil-NH-(CH2)_{2}-S-S-piridina)
según un procedimiento descrito en Monsigny et al., (Patente
francesa 9407738 (Monsigny,M., Sdiqui, N., Roche, A.C. and Mayer, R.
1994 Nuevos derivados de oligósidos, su procedimiento de preparación
y sus aplicaciones) y Sdiqui et al., (1995 News síntesis of
glico-amino acid conjugates. Carbohyd. Letters
1:269-275) son reducidos y fijados en medio
acuoso tamponado a pH neutro sobre las funciones ditiopiridilos del
polímero.
Los oligósidos complejos tales como los como los
asialo-oligósidos bi-, tri- o tetraantenados o Lewis
derivados en glicopéptidos con una función ditiopiridilo
(piroglutamil-NH-(CH2)_{2}-S-S-piridina)
según un procedimiento descrito en Monsigny et al., (Patente
francesa 9407738 (Monsigny, M., Sdiqui, N., Roche, A.C. and Mayer,
R. 1994 Nuevos derivados de oligósidos, su procedimiento de
preparación y sus aplicaciones) y Sdiqui et al., (1995 News
síntesis of glico-amino acid conjugates. Carbohyd.
Letters 1:269-275) son reducidos y fijados en
medio acuoso tamponado a pH neutro sobre las funciones
ditiopiridilos del polímero.
- a)
- Las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} aún libre son sustituidas parcialmente por unos residuos no cargados que provocan una disminución de carga. Tratándose de la fijación de residuos que provocan la disminución de carga, por ejemplo una sal de polilisina (en particular en forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base (en particular la diisopropiletilamina) y de un ácido orgánico hidroxilado activo (en particular la \delta-gluconolactona).
- b)
- Las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} libre son a continuación sustituidas parcialmente por unos residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares. Por ejemplo la polilisina gluconoilada es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base(en particular la diisopropiletilamina), unas moléculas que provocan una desestabilización de las membranas celulares (en particular el ácido nicotínico) y de un agente de acoplamiento (en particular el hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio).
- c)
- Las señales de reconocimiento están enlazadas a ciertos grupos \varepsilon-aminados de los residuos lisilos del polímero.
A título de ejemplo de fijación de las señales de
reconocimiento sobre la polilisina histidilada, se indican a
continuación la fijación de los ósidos u oligósidos.
Unos ósidos simples en forma de derivados
fenilisotiocianatos son fijados sobre ciertas funciones
\varepsilon-aminadas de los residuos de lisilos
libres de la polilisina como se ha descrito anteriormente en Midoux
et al. (Nucleic Acids Res. 1993,
21:871-878).
Los oligósidos complejos tales como los
asialo-oligósidos bi-, tri- o tetraantenados o Lewis
son obtenidos en forma de derivados fenilisotiocianatos de
glicopéptidos según un procedimiento descrito en Monsigny et
al., (Patente francesa 9407738 (Monsigny, M., Sdiqui, N., Roche,
A.C. and Mayer, R. 1994 Nuevos derivados de oligósidos, su
procedimiento de preparación y sus aplicaciones) y Sdiqui et
al., (1995 News síntesis of glico-amino acid
conjugates. Carbohyd. Letters 1:269-275). Los
glicopéptidos en forma de derivados fenilisotiocianatos son fijados
sobre ciertas funciones \varepsilon-aminas de los
residuos lisilos libres de la polilisina como se ha descrito
anteriormente en Midoux et al. (Nucleic Acids Res. 1993,
21:871-878).
A) Procedimiento
II
Estas sustituciones siguen cualquiera de los
protocolos conocidos por el experto en la materia.
- a)
- A título de ejemplo de fijación de señales de reconocimiento sobre la polilisina (en particular en forma de p-toluensulfonato) disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base (en particular la diisopropiletilamina), se indica seguidamente la fijación de los ósidos o de los oligósidos.
Unos ósidos simples en forma de derivados
fenilisotiocianatos son fijados sobre ciertas funciones
\varepsilon-aminadas de los residuos lisilos
libres de la polilisina como se ha descrito anteriormente en Midoux
et al. (Nucleic Acids Res. 1993,
21:871-878).
Los oligósidos complejos tales como los como los
asialo-oligósidos bi-, tri- o tetraantenados o Lewis
son obtenidos en forma de derivados fenilisotiocianatos de
glicopéptidos según un procedimiento descrito en Monsigny et
al.,(Patente francesa 9407738 (Monsigny, M., Sdiqui, N., Roche,
A.C. and Mayer, R. 1994 Nuevos derivados de oligósidos, su
procedimiento de preparación y sus aplicaciones) y Sdiqui et
al., (1995 New syntesis of glico-amino acid
conjugates. Carbohyd. Letters 1:269-275). Los
glicopéptidos en forma de derivados fenilisotiocianatos son fijados
sobre ciertas funciones \varepsilon-aminadas de
los residuos lisilos libres de la polilisina como se ha descrito
anteriormente en Midoux et al. (Nucleic Acids Res. 1993,
21:871-878).
- b)
- Tratándose de la fijación de los residuos que provocan la desestabilización de las membranas, por ejemplo la polilisina sustituida por unos ósidos o oligósidos es disuelta en una solvente orgánico(en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base (en particular la diisopropiletilamina), de moléculas que provocan una desestabilización de las membranas celulares (en particular el ácido nicotínico) y de un agente de acoplamiento (en particular el hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio).
B) Procedimiento
VI
Estas sustituciones siguen cualquiera de los
protocolos conocidos por el experto en la materia.
- a)
- las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} aún libre son sustituidas parcialmente por unos residuos no cargados que provocan una disminución de carga. Tratándose de la fijación de residuos que provocan la disminución de carga, por ejemplo una sal de polilisina (en particular en forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base (en particular la diisopropiletilamina) y de un ácido orgánico hidroxilado activado (en particular la \delta-gluconolactona)
- b)
- A título de ejemplo de fijación de las señales de reconocimiento sobre la polilisina gluconoilada disuelta en una solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base (en particular la diisopropiletilamina), se indican a continuación la fijación de ósidos u oligósidos.
Unos ósidos simples en forma de derivados
fenilisotiocianatos son fijados sobre ciertas funciones
\varepsilon-aminadas de los residuos de lisilos
libres de la polilisina como se ha descrito anteriormente en Midoux
et al. (Nucleic Acids Res. 1993,
21:871-878).
Los oligósidos complejos tales como los como los
asialo-oligósidos bi-, tri- o tetraantenados o Lewis
son obtenidos en forma de derivados fenilisotiocianatos de
glicopéptidos según un procedimiento descrito en Monsigny et
al.,(Patente francesa 9407738 (Monsigny, M., Sdiqui, N.,Roche,
A.C. and Mayer, R. 1994 Nuevos derivados de oligósidos, su
procedimiento de preparación y sus aplicaciones) y Sdiqui et
al., (1995 New syntesis of glico-amino acid
conjugates. Carbohyd. Letters 1:269-275). Los
glicopéptidos en forma de derivados fenilisotiocianatos son fijados
sobre ciertas funciones \varepsilon-aminadas de
los residuos lisilos libres de la polilisina como se ha descrito
anteriormente en Midoux et al. (Nucleic Acids Res. 1993,
21:871-878)
- c)
- tratándose de la fijación de residuos que provocan la desestabilización de las membranas, por ejemplo la polilisina sustituida por unos ósidos o unos oligósidos es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base(en particular la diisopropiletilamina), de moléculas que provocan una desestabilización de las membranas celulares (en particular el ácido nicotínico) y de un agente de acoplamiento (en particular el hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio).
III) Las señales de reconocimiento son fijadas
sobre ciertos residuos desestabilizantes.
A) Procedimiento
IX
- a)
- las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} libre son sustituidas parcialmente por unos residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares. Por ejemplo, tras la reacción en medio orgánico con la histidina cuyos grupos NH_{3}^{+} y NH del núcleo de imidazol son protegidos por tertiobutiloxicarbonilo en presencia de un agente de acoplamiento del tipo hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio. Tras la reacción y la purificación, las funciones aminadas de los residuos histidilo del polímero obtenido son desprotegidas.
- b)
- Unas señales de reconocimiento están enlazadas a ciertos grupos NH_{3}^{+} de los residuos que provocan una desestabilización de las membranas.
A título de ejemplo de fijación de las señales de
reconocimiento sobre la polilisina histidilada, se indica a
continuación la fijación de los oligósidos.
Los oligósidos complejos tales como los como los
asialo-oligósidos de los tipos triantenado o
tetraantenado o Lewis son obtenidos en forma de derivados
fenilisotiocianatos de glicopéptidos según un procedimiento descrito
en Monsigny et al.,(Patente francesa 9407738 (Monsigny, M.,
Sdiqui, N.,Roche, A.C. and Mayer, R. 1994 Nuevos derivados de
oligósidos, su procedimiento de preparación y sus aplicaciones) y
Sdiqui et al., (1995 New syntesis of
glico-amino acid conjugates. Carbohyd. Letters
1:269-275). Los glicopéptidos bajo la forma
de derivados fenilisotiocianatos son fijados en medio acuoso
tamponado a pH neutro sobre ciertas funciones NH2 de los residuos
histidilos. A este pH, la fijación sobre las NH_{3}^{+} lisinas
es más débil, incluso imposible.
\newpage
B) Procedimiento
XII
- a)
- las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} libre son sustituidas parcialmente por unos residuos no cargados que provocan una disminución de carga. Tratándose de la fijación de residuos que provocan la disminución de carga, por ejemplo una sal de polilisina (en particular en forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base (en particular la diisopropiletilamina) y de un ácido orgánico hidroxilado activado (en particular la \delta-gluconolactona)
- b)
- las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} aún libre son a continuación sustituidas parcialmente por unos residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares. Tratándose de la fijación de residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares, por ejemplo una sal de polilisina (en particular bajo la forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base(en particular la diisopropiletilamina), de unas moléculas que provocan una desestabilización de las membranas celulares (en particular la histidina cuyos grupos \varepsilon-NH_{3}^{+} y NH del núcleo de imidazol son protegidos por tertiobutiloxicarbonilo) y de un agente de acoplamiento (en particular el exafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio). Tras la purificación, las funciones aminadas protegidas por los residuos histidilos son despro- tegidas.
- c)
- Las señales de reconocimiento están unidas a ciertos grupos NH_{3}^{+} de los residuos que provocan una desestabilización de las membranas.
A título de ejemplo de fijación de unas señales
de reconocimiento sobre la polilisina histidilada, se indica a
continuación la fijación de los oligósidos.
Los oligósidos complejos tales como los como los
asialo-oligósidos bi-, tri- o tetraantenados o Lewis
son obtenidos en forma de derivados fenilisotiocianatos de
glicopéptidos según un procedimiento descrito en Monsigny et
al.,(Patente francesa 9407738 (Monsigny, M., Sdiqui, N., Roche,
A.C. and Mayer, R. 1994 Nuevos derivados de oligósidos, su
procedimiento de preparación y sus aplicaciones) y Sdiqui et
al., (1995 New synthesis of glico-amino acid
conjugates. Carbohyd. Letters 1:269-275). Los
glicopéptidos bajo la forma de derivados fenilisotiocianatos son
fijados en medio acuoso tamponado a pH neutro sobre ciertas
funciones a NH2 de los residuos histidilos, a este pH, la fijación
sobre las NH_{3} + lisinas es más débil, incluso imposible.
C) Procedimiento
IX
- a)
- las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} libre son sustituidas parcialmente por unos residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares. Tratándose de la fijación de residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares, por ejemplo una sal de polilisina (en particular bajo la forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico(en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base(en particular la diisopropiletilamina), de moléculas que provocan una desestabilización de las membranas celulares (en particular el 4-caboximetil-imidazol) y de un agente de acoplamiento (en particular el exafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio).
- b)
- Las señales de reconocimiento están enlazadas a ciertos núcleos imidazol de los residuos que provocan una desestabilización de las membranas.
A título de ejemplo de fijación de unas señales
de reconocimiento sobre la polilisina imidazolada, se indican a
continuación las fijaciones de péptidos o de los glicopéptidos.
Los residuos imidazol pueden ser fácilmente
alquilados en medio neutro por unos compuestos que poseen un grupo
activado tal como por ejemplo, la iodoacetamida o sus derivados;
esto se conoce desde los trabajos de Korman S., y Clarke H.T. en
1956 (J.Biol.Chem. 113:133). La alquilación de los imidazoles
por un derivado de la iodoacetamida se lleva a cabo a un pH cercano
a la neutralidad, por ejemplo 7,0. A este pH, los grupos
\varepsilon-aminados de la lisina no son
afectados, lo serían a un pH mucho más alcalino, de 9 en adelante.
Las señales de reconocimiento de naturaleza peptídica o
glicopeptídica (Monsigny et al. patente francesa 9407738.
1994 Nuevos derivados de oligósidos, su procedimiento de preparación
y sus aplicaciones y Sdiqui et al., 1995 New synthesis of
glico-amino acid conjugates. Carbohyd. Letters
1:269-275) pueden ser fácilmente sustituidas por un
grupo iodoacetamida. Los derivados del tipo ICH_{2}CONHR:
I-CH_{2}-CO-NH-péptido
o
I-CH_{2}-CO-NH-glicopéptido,
son fijados en medio acuoso tamponado a un pH neutro sobre Nitrógeno
3 y con una eficacia menor sobre el Nitrógeno 1, lo que lleva a unos
derivados N-carboximetil estables. Se pueden también utilizar
unos derivados de bromoacetamida que son también unos excelentes
reactivos para alquilar unos residuos imidazol (ver por ejemplo
Henrikson et al., 1965 J.Biol.Chem. 240: 2921). Este
tipo de sustitución, a condición de sustituir un número pequeño de
residuos imidazol por una señales de reconocimiento que tengan una
alta afinidad, suficiente para su receptor, no hace perder al
polímero sustituido, por unos residuos imidazol, su capacidad
desestabilizadora de las membranas a un pH levemente ácido.
IV) Las señales de reconocimiento son fijadas
sobre ciertos residuos neutralizantes.
A) Procedimiento
XIII
- a)
- las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} libre son sustituidas parcialmente por unos residuos no cargados que provocan una disminución de carga. Tratándose de la fijación de residuos que provocan la disminución de carga, por ejemplo una sal de polilisina(en particular en forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base (en particular la diisopropiletilamina) y por dos ácidos orgánicos hidroxilados activados (en particular la 6-desoxi-6-yodo-\delta-gluconolactona por un parte y la \delta-gluconolactona para 10 a 50 partes).
- b)
- Las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} libre son sustituidas parcialmente por unos residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares. Tratándose de la fijación de residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares, por ejemplo una sal de polilisina (en particular bajo la forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base (en particular la diisopropiletilamina), de moléculas que provocan una desestabilización de las membranas celulares (en particular el 4-caboximetil-imidazol) y de un agente de acoplamiento (en particular el exafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio).
- c)
- Las señales de reconocimiento están enlazadas a algunos de los residuos neutralizantes.
A título de ejemplo de fijación de las señales de
reconocimiento sobre la polilisina gluconoilada e histidilada, se
indica a continuación la fijación de unos oligósidos.
Los oligósidos complejos tales como los como los
asialo-oligósidos bi-, tri- o tetraantenados o Lewis
derivados en glicopéptidos con una función ditiopiridilo
(piroglutamil-NH-(CH2)_{2}-S-S-piridina)
según un procedimiento descrito en Monsigny et al.,(Patente
francesa 9407738 (Monsigny, M., Sdiqui, N., Roche, A.C. and Mayer,
R. 1994 Nuevos derivados de oligósidos, su procedimiento de
preparación y sus aplicaciones) y Sdiqui et al., (1995 News
synthesis of glico-amino acid conjugates. Carbohyd.
Letters 1:269-275) son reducidos por la
triscarboxietilfosfina en medio neutro (pH cercano a 7,0) por
ejemplo y fijados en medio acuoso tamponado a pH ligeramente
alcalino (a un pH cercano a 8,5) sobre los residuos
6-desoxi-6-yodo-gluconoilos
del polímero. Este tipo de su sustitución, a condición de sustituir
un número pequeño de residuos imidazol por unas señales de
reconocimiento que tengan una alta afinidad para su receptor, no
hace perder al polímero sustituido, por unos residuos imidazol, su
capacidad desestabilizadora de las membranas a un pH levemente
ácido.
B) Procedimiento
XIII
- a)
- las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} libre son sustituidas parcialmente por unos residuos no cargados que provocan una disminución de carga. Tratándose de la fijación de residuos que provocan la disminución de carga, por ejemplo una sal de polilisina (en particular en forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base(en particular la diisopropiletilamina) y por dos ácidos orgánicos hidroxilados activados (en particular la 6-bromoacetamida-L-gulono-1,5 lactona por un parte y la \delta-gluconolactona para 10 a 50 partes). La 6-bromoacetamida-L-gulono-1,5 lactona es obtenida tras reducir mediante el cianoborohidruro la imina obtenida mezclando una solución amoniacal NH_{4}OH o (NH_{4})2CO_{3} y una solución de ácido urónico, por ejemplo el ácido glucurónico, a continuación por acilación de la amina por un bromoacetato activado, por ejemplo el anhídrido bromoacético o el bromo acetato de succinimidilo.
- b)
- Las unidades monoméricas del polímero que comprenden una función NH_{3}^{+} libre son sustituidas parcialmente por unos residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares. Tratándose de la fijación de residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares, por ejemplo una sal de polilisina (en particular bajo la forma de p-toluensulfonato) es disuelta en un solvente orgánico (en particular el dimetilsulfóxido) en presencia de una base(en particular la diisopropiletilamina), de moléculas que provocan una desestabilización de las membranas celulares (en particular el 4-caboximetil-imidazol) y de un agente de acoplamiento (en particular el exafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio).
- c)
- Las señales de reconocimiento están enlazadas a algunos de los residuos neutralizantes.
A título de ejemplo de fijación de las señales de
reconocimiento sobre la polilisina gluconoilada e histidilada, se
indica a continuación la fijación de unos oligósidos.
Los oligósidos complejos tales como los
asialo-oligósidos bi-, tri- o tetraantenados o Lewis
derivados en glicopéptidos con una función ditiopiridilo
(piroglutamil-NH-(CH2)_{2}-S-S-piridina)
según un procedimiento descrito en Monsigny et al., (Patente
francesa 9407738 (Monsigny, M., Sdiqui, N., Roche, A.C. and Mayer,
R. 1994 Nuevos derivados de oligósidos, su procedimiento de
preparación y sus aplicaciones) y Sdiqui et al., (1995 New
synthesis of glico-amino acid conjugates. Carbohyd.
Letters 1:269-275) son reducidos por la
triscarboxietilfosfina en medio neutro (pH cercano a 7,0) por
ejemplo y fijados en medio acuoso tamponado a pH ligeramente
alcalino (a un pH cercano a 8,5) sobre los residuos bromoacetamido
gulonilo del polímero. Este tipo de su sustitución a condición de
sustituir un número pequeño de residuos imidazol por unas señales de
reconocimiento que tengan una alta afinidad para su receptor, no
hace perder al polímero sustituido, por unos residuos imidazol, su
capacidad desestabilizadora de las membranas a un pH levemente
ácido.
El complejo ácido nucleico/conjugado polimérico
es obtenido mezclando una solución del ácido nucleico interesado y
una solución del conjugado polimérico. Preferentemente, las
mencionadas soluciones son preparadas a partir de suero fisiológico
o de solución tampón o de un medio citocompatible.
Según un modo de realización ventajoso de la
invención, se utiliza un complejo del tipo descrito más arriba o un
conjugado como el descrito anteriormente par la transfección in
vitro, ex vivo ó in vivo de células con ayuda de
un gen, en particular los que han sido definidos anteriormente.
Según un modo de realización ventajoso de la
invención, se utiliza un complejo o un conjugado como los escritos
más arriba, que se caracterizan porque las células son escogidas
entre:
- -
- unas células cepas hematopoyéticas;
- -
- unas células dendríticas;
- -
- células del hígado;
- -
- células de los músculos esqueléticos;
- -
- células de la piel:
- \bullet
- fibroblastos
- \bullet
- queratinocitos
- \bullet
- células dendríticas
- \bullet
- melanocitos.
- -
- células de las paredes vasculares;
- \bullet
- endoteliales;
- \bullet
- musculares lisas;
- -
- células epiteliales de las vías aéreas;
- -
- células del sistema nervioso central;
- -
- células cancerosas;
- -
- células del sistema inmunitario, tales como unos linfocitos, unos macrófagos, unas células NK etc..
Según un modo de realización ventajoso de la
invención, el procedimiento de transfección in vitro o ex
vivo, se caracteriza porque se pone en presencia un complejo tal
como el descrito anteriormente en un medio que contiene unas células
a transfectar, en unas condiciones tales que hay:
- -
- un paso del complejo a partir del medio al citoplasma de las células,
- -
- relargado del ácido nucleico implicado en el arriba mencionado complejo en el citosol y/o el núcleo de las células,
- -
- transcripción y expresión del ácido nucleico en las células transfectadas,
- -
- expresión de la proteína correspondiente al gen transfectado.
La invención se refiere también a una composición
farmacéutica, que se caracteriza porque comprende, a título de
sustancia activa, uno al menos de los complejos descritos más
arriba, o uno al menos de los conjugados descritos más arriba, en
asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Según un modo de realización ventajoso de la
invención, se utiliza un complejo como el descrito más arriba o un
conjugado como el descrito más arriba para la preparación de un
medicamento destinado por ejemplo al tratamiento de deficiencias
metabólicas congénitas o adquiridas, o al tratamiento de tumores, o
para la preparación de vacunas, por ejemplo la vacuna contra la
gripe.
La invención tiene también por objeto un estuche
o kit que comprende:
- -
- un conjugado polimérico como el descrito más arriba, tal como la polilisina, sustituida por un residuo que provoca en un medio débilmente ácido una desestabilización de las membranas celulares, siendo apto este conjugado para comprender eventualmente una señal de reconocimiento, que es peviamente fijada o no sobre el arriba mencionado conjugado polimérico, siendo la mencionada señal de reconocimiento función de la célula a hospedar,
- -
- eventualmente un plásmido que contiene al menos un gen a transferir, y eventualmente el sistema de regulación de la expresión del gen arriba mencionado,
- -
- unos reactivos que permiten la fijación eventual de la señal de reconocimiento sobre el arriba mencionado conjugado polimérico,
- -
- unos reactivos que permiten formar un complejo como el descrito más arriba, o entre el conjugado polimérico y el gen a transferir, o entre el conjugado polimérico y un plásmido que contiene el gen a transferir,
- -
- unos reactivos que permiten la transfección de la células por el arriba mencionado complejo.
Representa un fragmento de polilisina (DP 190)
sustituida parcialmente por unos residuos histidilo.
Representa el espectro RMN a 300 MHz en D_{2}O
de la polilisina (DP 190) sustituida por 70 residuos histidilo:
1,28 a 1,88 ppm: 6 protones de los carbonos 3, 4
y 5 de las lisinas sustituidas o no.
2,39 ppm: protones del grupo CH_{3} del
p-toluensulfonato
2,75 ppm: trazas de DMSO
2,99 ppm: 2 protones del carbono 6 de un residuo
lisilo no sustituido
3,15 ppm: 2 protones del carbono 6 de un residuo
lisilo sustituido
3,35 ppm: 2 protones del carbono 9 de un residuo
histidilo
4,36 ppm: 2 protones de los carbonos 2 y 8
4,78 ppm: pico del agua
7,36 ppm: 2 protones (doblete, constante de
acoplamiento en orto=8,01 Hz) de los carbonos 2 y 6 del ciclo
aromático del p-toluensulfonato
7,42 ppm: 1 protón del carbono 11 de un residuo
histidilo
7,71 ppm: 2 protones (doblete, constante de
acoplamiento en orto=8,0/Hz) de los protones de los carbonos 3 y 5
del ciclo aromático del p-toluensulfonato
8,7 ppm: 1 protón del carbono 12 de un residuo
histidilo.
Se refiere a la preparación de la polilisina (DP
190) sustituida parcialmente por 70 residuos histidilo.
La poli-L-lisina
bajo forma de bromohidrato (masa de molecular media de 40 000; grado
de polimerización medio 190) (1 g en 200 ml de H_{2}O) que
proviene de Bachem Feinchemikalien (Budendorf, Suiza) es
inicialmente pasada por una columna de intercambio de aniones (Dowex
2 x 8, forma OH-; 35 x 2,5 cm) con el objetivo de extraer el bromuro
que es tóxico para las células. La solución de polilisina es
neutralizada con una solución de ácido p-toluensulfónico al
10% en agua y a continuación liofilizada.
La polilisina es parcialmente sustituida con unos
residuos histidilo como sigue: la polilisina bajo forma de
p-toluensulfonato (50 mg; 0,96 \mumoles) disuelta en 3 ml
de DMSO (dimetilsulfoxido) en presencia del diisopropiletilamina (42
\mul; 288 \mumoles), es puesta a reaccionar durante 24 horas a
20ºC con 32 mg de (Boc)His(Boc)-OH (96
\mumoles) en presencia de 43 mg de hexafluorofosfato de
benzotriazolil N-oxitrisdimetilaminofosfonio (BOP)
(97 \mumoles). Los residuos histidilo son a continuación
desprotegidos en presencia de 20 ml de una mezcla de agua y ácido
trifluoroacético (TFA) (50/50 V/V) durante 24 horas a 20ºC. El agua
y el TFA son eliminados por evaporación a presión reducida. El
polímero es precipitado adicionando 10 volúmenes de isopropanol.
Tras la centrifugación (1800 g x 15 minutos), el culote es lavado
con isopropanol y recuperado tras una nueva centrifugación. El
culote es tomado de nuevo con agua destilada y la solución es
liofilizada. El número x de residuos histidilo fijados por molécula
de polilisina es determinado por RMN del protón como sigue:
X=6(h_{8.7}/h_{Lys})DP
en dónde h_{8.7} es la integral
del pico a 8,7 ppm que corresponde al protón del carbono 12 de un
residuo histidilo, h_{Lys} es la integral de unos picos entre 1,28
y 1,88 ppm que corresponden a los 6 protones de los carbonos 3, 4 y
5 de los residuos lisina y DP es el grado de polimerización de la
polilisina (DP=190). El número de residuos histidilo fijados por
molécula de polilisina es x, x=70 en la preparación descrita más
arriba.
Representa la transferencia de genes a las
células HepG2 utilizando la polilisina (DP 190) sustituida por unos
residuos histidilo (HispLK).
Los complejos ADN/HispLK se forman mezclando el
plásmido pCMVLUC (10 \mug en 0,7 ml de DMEM) y la polilisina
sustituida por 70 residuos histidilo (40 \mug en 0,3 ml de DMEM).
Tras 30 minutos a 20ºC, la solución que contiene los complejos es
diluida una vez con DMEM y completada con 5% de suero bovino
fetal.
Los complejos ADN/pLK se forman mezclando el
plásmido pCMVLUC (10 \mug en 0,7 ml de DMEM) y la polilisina (5
\mug en 0,3 ml de DMEM). Tras 30 minutos a 20ºC, la solución que
contiene los complejos es diluida un vez con DMEM y completada con
5% de suero bovino fetal y eventualmente 100\muM de cloroquina
(+cloro) o 20 \muM de un péptido fusiógeno (+ E5CA)
(GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCA). El medio en el que las células HepG2
(3x10^{5} células/4 cm^{2}) han crecido durante 24 horas, es
eliminado y reemplazado por una solución (1 ml) que contiene un
complejo ADN/polímero (5 \mug/ml de ADN). Después de 4 horas de
incubación a 37ºC, el medio de las células es de nuevo eliminado y
las células son incubadas en un medio de cultivo en presencia de 10%
de suero bovino fetal. La expresión del gen de la luciferasa ha sido
determinada 48 horas después de la transfección, midiendo, durante 4
segundos la luminiscencia emitida (RLU: valores relativos de la luz
emitida expresados en unidades arbitrarias)en los lisados
celulares.
En estas condiciones, 1 pg/ml de luciferasa
produce 2000 RLU.
Yendo de izquierda a derecha sobre el eje de
abcisas, el primer rectángulo corresponde al complejo ADN/polilisina
histidilada, el segundo rectángulo corresponde al complejo
ADN/polilisina, el tercer rectángulo corresponde al complejo
ADN/polilisina con cloroquina, el cuarto rectángulo corresponde al
complejo ADN/polilisina con péptido fusiógeno E5CA.
Encuadrado: variación de la eficacia de
transfección en función de la cantidad de plásmido.
Se refiere a la transferencia de unos genes a las
células HepG2 utilizando la polilisina (DP 190) sustituida
parcialmente por unos residuos histidilo. Representa la influencia
del número de residuos histidilo fijado por molécula de polilisina
sobre la eficacia de la transfección.
Yendo de izquierda a derecha sobre el eje de
abcisas, el primer rectángulo corresponde al complejo ADN/polilisina
no sustituido, el segundo rectángulo corresponde al complejo
ADN/polilisina sustituido por 19 residuos histidilo, el tercer
rectángulo corresponde al complejo ADN/polilisina sustituido por 30
residuos histidilo, el cuarto rectángulo corresponde al complejo
ADN/polilisina sustituido por 46 residuos histidilo, el quinto
rectángulo corresponde al complejo ADN/polilisina sustituido por 63
residuos histidilo, el sexto rectángulo corresponde al complejo
ADN/polilisina sustituido por 70 residuos histidilo y el séptimo
rectángulo corresponde al complejo ADN/polilisina sustituido por 84
residuos histidilo.
Los complejos ADN/HispLK se forman mezclando el
plásmido pCMVLUC (10 \mug en 0,7 ml de DMEM) y la polilisina
sustituida por un número variable de residuos histidilo (40 \mug
en 0,3 ml de DMEM). Tras 30 minutos a 20ºC, la solución que contiene
los complejos es diluida una vez con DMEM y completada con suero
bovino fetal (concentración final 10%). El medio en el que las
células HepG2 (3 x 10^{5} células/4 cm^{2}) han crecido durante
24 horas, es eliminado y reemplazado por una solución (1 ml) que
contiene un complejo ADN/polímero (5 \mug de ADN). Tras 4 horas de
incubación a 37ºC, el medio de las células es de nuevo eliminado y
las células son incubadas en un medio de cultivo en presencia de 10%
de suero bovino fetal. La expresión del gen luciferasa ha sido
determinada 48 horas después de la transfección, midiendo, durante 4
segundos la luminiscencia emitida (RLU: valores relativos de la luz
emitida expresados en unidades arbitrarias) en los lisados
celulares.
En estas condiciones, 1 pg/ml de luciferasa
produce 2000 RLU.
Se refiere a la transferencia de genes a las
células HOS utilizando la polilisina (DP 190) sustituida
parcialmente por unos residuos histidilo. Representa la influencia
sobre la eficacia de la transfección de la proporción ADN/polímero
(expresado en las abcisas en \mug de polímero para 10 \mug de
ADN) en los complejos pCMVLUC/His_{84}pLK.
Los complejos ADN/HispLK se forman mezclando el
plásmido pCMVLUC (10 \mug en 0,7 ml de DMEM) y diferentes
cantidades de polilisina sustituida por 84 residuos histidilo en 0,3
ml de DMEM). Tras 30 minutos a 20ºC, la solución que contiene los
complejos es diluida una vez con DMEM y completada con 1% de suero
bovino fetal. El medio en el que las células HOS (2 x 10^{5}
células/4 cm^{2}) han crecido durante 24 horas, es eliminado y
reemplazado por una solución (1 ml) que contiene un complejo
ADN/polímero (5 \mug de ADN). Tras 4 horas de incubación a 37ºC,
el medio de las células es de nuevo eliminado y las células son
incubadas en un medio de cultivo en presencia de 10% de suero bovino
fetal. La expresión del gen luciferasa ha sido determinada 48 horas
después de la transfección, midiendo durante 4 segundos la
luminiscencia emitida (RLU: valores relativos de la luz emitida
expresados en unidades arbitrarias)en los lisados
celulares.
En estas condiciones, 1 pg/ml de luciferasa
produce 2000 RLU.
Se refiere a la transferencia de gens a las
células HepG2 utilizando la polilisina (DP 190) sustituida
parcialmente por unos residuos histidilo. Representa la influencia
del tiempo de incubación (expresado en horas en el eje de abcisas)
de los complejos pCMVLUC/His_{70}pLK con las células sobre la
eficacia de la transfección. Los complejos ADN/HispLK se forman
mezclando el plásmido pCMVLUC (10 \mug en 0,7 ml de DMEM) y la
polilisina sustituida por 70 residuos histidilo (40 \mug en 0,3 ml
de DMEM). Tras 30 minutos a 20ºC, la solución que contiene los
complejos es diluida una vez con DMEM y completada al 10% con suero
bovino fetal. El medio en el que las células HepG2 (3 x 10^{5}
células/4 cm^{2}) han crecido durante 24 horas, es eliminado y
reemplazado por una solución (1 ml) que contiene un complejo
ADN/polímero (5 \mug de ADN). Tras los diferentes tiempos de
incubación a 37ºC, el medio de las células es de nuevo eliminado y
las células son incubadas en medio de cultivo en presencia de 10% de
suero bovino fetal. La expresión del gen luciferasa ha sido
determinada 48 horas después de la transfección, midiendo durante 4
segundos la luminiscencia emitida (RLU: valores relativos de la luz
emitida expresados en unidades arbitrarias) en los lisados
celulares.
En estas condiciones, 1 pg/ml de luciferasa
produce 2000 RLU.
Se refiere a la transferencia de genes a las
células HepG2 utilizando la polilisina (DP 190) sustituida
parcialmente por unos residuos histidilo. Representa la influencia
sobre la eficacia de la transfección de la cantidad de suero bovino
(expresada en el eje de abcisas en % de suero en el medio utilizado)
presente durante la incubación de los complejos
pCMVLUC/His_{70}pLK con las células. Los complejos ADN/HispLK se
forman mezclando el plásmido pCMVLUC (10 \mug en 0,7 ml de DMEM) y
la polilisina sustituida por 70 residuos histidilo (40 \mug en 0,3
ml de DMEM). Tras 30 minutos a 20ºC, la solución que contiene los
complejos es diluida una vez con DMEM y completada con diferentes
cantidades de suero fetal. El medio en el que las células HepG2 (3 x
10^{5} células/4 cm^{2}) han crecido durante 24 horas, es
eliminado y reemplazado por una solución (1 ml) que contiene un
complejo ADN/polímero (5 \mug /ml de ADN). Tras 4 horas de
incubación a 37ºC, el medio de las células es de nuevo eliminado y
las células son incubadas en medio de cultivo en presencia del 10%
de suero bovino fetal. La expresión del gen de la luciferasa ha sido
determinada 48 horas después de la transfección, midiendo, durante 4
segundos la luminiscencia emitida (RLU: valores relativos de la luz
emitida expresados en unidades arbitrarias) en los lisados
celulares.
En estas condiciones, 1 pg/ml de luciferasa
produce 2000 RLU.
Se refiere a la transferencia de genes en
diferentes progenies celulares utilizando la polilisina (DP 190)
sustituida por 84 residuos histidilo. Los complejos ADN/HispLK se
forman mezclando el plásmido pCMVLUC (10 \mug en 0,7 ml de DMEM) y
la polilisina sustituida por 84 residuos histidilo en 0,3 ml de
DMEM. Tras 30 minutos a 20ºC, la solución que contiene los complejos
es diluida una vez con DMEM y completada a 10% con suero fetal. El
medio en el que las células (2-3 x 10^{5} células/
4 cm^{2}) han crecido durante 24 horas, es eliminado y reemplazado
por una solución que contiene un complejo ADN/polímero (5 \mug /ml
de ADN). Tras 4 horas de incubación a 37ºC, el medio de las células
es de nuevo eliminado y las células son incubadas en medio de
cultivo en presencia de 10% de suero bovino fetal. La expresión del
gen de la luciferasa ha sido determinada 48 horas después de la
transfección, midiendo durante 4 segundos la luminiscencia emitida
(RLU: valores relativos de la luz emitida expresados en unidades
arbitrarias)en los lisados celulares. HepG2= progenie de
células que derivan de un hepatocarcinoma humano; HOS= progenie de
células que derivan de un osteosarcoma humano;
MCF-7= progenie de células que derivan de un
adenocarcinoma humano; B 16= progenie de células que derivan de un
melanoma murino; COS= progenie de células que derivan de unas
células de riñones de mono transformadas por SV40; Rb1= prognie de
células que derivan de unas células musculares lisas de la aorta del
conejo; HeLa = progenie de células epiteloides humanas; 16 HBE =
progenie de células epiteliales de las vías respiratorias humanas
normales; \SigmaCFTE=descendencia de unas células epiteliales de
unas vías respiratorias humanas deficientes para el gen responsable
de la mucoviscidosis (CFTR).
La polilisina en forma de hidrobromuro (masa
molecular media 40 000; grado de polimerización medio 190)
(1 g en 200 ml de H_{2}O) proveniente de Bachem Feinchemikalien (Budendorf, Suiza) es inicialmente pasada por una columna de intercambio de aniones (Dowex 2 x 8, forma OH-; 35 X 2,5 cm) con el objetivo de extraer el bromuro que es tóxico para las células. La solución de polilisina es neutralizada con una solución de ácido p-toluensulfónico al 10% en agua y a continuación es liofilizada.
(1 g en 200 ml de H_{2}O) proveniente de Bachem Feinchemikalien (Budendorf, Suiza) es inicialmente pasada por una columna de intercambio de aniones (Dowex 2 x 8, forma OH-; 35 X 2,5 cm) con el objetivo de extraer el bromuro que es tóxico para las células. La solución de polilisina es neutralizada con una solución de ácido p-toluensulfónico al 10% en agua y a continuación es liofilizada.
La polilisina p-toluensulfonato
(50 mg; 0,91 \mumol) es disuelta en 2 ml de DMSO y es puesta a
reaccionar a 20ºC durante 12 horas con el éster
N-hidroxisuccinimida del
4-carbonil-\alpha-metil-\alpha-(2-piridinilditio)
tolueno (SMPT, Pierce, USA) (5,3 mg; 13,6 \mumol). La polilisina
sustituida por unos grupos carbonil
\alpha-metil-\alpha-(2-piridinilditio)
tolueno (=MPT-pLK) es precipitada adicionando 10
volúmenes de isopropanol. Después de centrifugación (1800 g x 15
minutos), el culote es lavado con isopropanol y recuperado tras una
nueva centrifugación. El culote es tomado de nuevo con agua
destilada y la solución es liofilizada. El número medio de moléculas
MPT enlazadas por molécula de polilisina es determinado por
absorbancia a 343 nm de la piridina tiona (\varepsilon=8080
M-1 x cm-1) liberada por reducción
cuantitativa del enlace disulfuro con ayuda de (TCEP:
tris-carboxietilfosfina): el número medio de MPT por
molécula de polilisina es 10.
La polilisina en forma de
p-toluensulfonato sustituida por 10 residuos MPT (50
mg; 0,96 \mumoles) disuelta en 3 ml de DMSO (dimetilsulfóxido) en
presencia de diisopropiletilamina (42 \mul; 288 \mumoles), es
puesta a reaccionar durante 24 horas a 20ºC con 32 mg de
(Boc)His(Boc)-OH-(80 \mumoles) en
presencia de 43 mg de hexafluorofosfato de benzotriazolil
N-oxitrisdimetilaminofosfonio (BOP) (97
\mumoles).Los residuos de histidilo son a continuación
desprotegidos en presencia de 20 ml de una mezcla de agua y ácido
trifluoroacético (TFA) (50/50 V/V) al 50% durante 24 horas a 20ºC.
El agua y el TFA son eliminados por evaporación bajo presión
reducida. El polímero es precipitado adicionando 10 volúmenes de
isopropanol. Después de la centrifugación (1800 g x 15 minutos), el
culote es lavado con isopropanol y recuperado tras una nueva
centrifugación. El culote es tomado de nuevo en agua destilada y la
solución es liofilizada. El número de residuos histidilo fijados por
molécula de polilisina, determinado por RMN del protón es 60.
El oligósido es inicialmente transformado en
glicopéptido según un procedimiento descrito en la solicitud de
patente Francesa 9407738 (Monsigny, M., Sdiqui, N.,Roche, A.C. and
Mayer, R. 1994 Nuevos derivados de oligósidos, su procedimiento de
preparación y sus aplicaciones).
El glicopéptido es fijado sobre la polilisina
parcialmente histidilada por medio de un puente disulfuro.
La
Gal\beta4Glc\beta-piroglutamil-NH-(CH2)2-S-S-piridina
(3 \mumol) es tratada con 3,5 \mumol de TCEP
(tris-carboxietilfosfina) en un tampón fosfato de
sodio 0,1 M a un pH 7 (1 ml) durante 1h a 20ºC. Esta solución es
añadida a la polilisina parcialmente histidilada sustituida por 10
residuos MPT (10 mg; 0,2 \mumoles)disuelta en el tampón
fosfato de sodio 0,1 M a pH 7 (1 ml). Tras 1 h a 20ºC, el polímero
es precipitado adicionando 10 volúmenes de isopropanol. El
precipitado es recuperado tras centrifugación (1 800 g, 15 min) y
lavado en isopropanol y a continuación disuelto en agua y
liofilizado.
El rendimiento de la reacción de acoplamiento en
las condiciones utilizadas es igual o superior al 90%.
Ejemplo de Lewis^{b}
=Fuc\alpha4(Fuc\alpha2Gal\beta3)GlcNAc\beta3Gal\beta4Glc
Los oligósidos complejos que tienen un residuo
glucosa (Glc) o N-acetil glucosamina (GlcNAc) en
posición reductora son inicialmente transformados en glicopéptidos
según un procedimiento descrito en la solicitud de patente francesa
9407738 (Monsigny, M., Sdiqui, N., Roche, A.C. and Mayer, R. 1994
Nuevos derivados de oligósidos, su procedimiento de preparación y
sus aplicaciones).
Los oligósidos complejos son fijados sobre la
polilisina parcialmente histidilada según un enlace del glicopéptido
a la polilisina histidilada por medio de un puente disulfuro.
El oligósido
Fuc\alpha4(Fuc\alpha2Gal\beta3)GlcNAc\beta3Gal\beta4Glc
es derivado en glicopéptido
Fuc\alpha4(Fuc\alpha2Gal\beta3)GlcNAc\beta3
Gal\beta4Gl\beta-piroglutamil-R-.
El grupo carboxílico del piroglutamilo es sustituido por una función
ditiopiridina para dar el glicopéptido:
Fuc\alpha4(Fuc\alpha2Gal\beta3)GlcNAc\beta3Gal\beta4Glc\beta-piroglutamil-NH-(CH2)_{2}-S-S-piridina
(solicitud de patente francesa 9407738: Monsigny, M., Sdiqui, N.,
Roche, A.C. and Mayer, R. (1994) Nuevos derivados de oligósidos, su
procedimiento de preparación y sus aplicaciones y Quétard et
al., Simple synthesis of novel glycosynthons for glycoconjugate
préparation: oligosilpiroglutamil derivates, en preparación).
El glicopéptido (2 \mumol) es tratado con 2,2
\mumoles de TCEP (tris-carboxietilfosfina) en un
tampón fosfato de sodio 0,1 M a pH 7 (1 ml) durante 1 h a 20ºC. Esta
solución es añadida a la polilisina parcialmente histidilada
sustituida por 10 residuos MPT (10 mg; 0,2 \mumoles) disuelta en
el tampón fosfato de sodio 0,1 M a pH 7 (1 ml). Tras 1h a 20ºC, el
polímero es precipitado adicionando 10 volúmenes de isopropanol. El
precipitado es recuperado tras la centrifugación (1 800 g, 15 min) y
lavado en isopropanol y después disuelto en agua y a continuación
liofilizado.
El rendimiento de la reacción de acoplamiento en
las condiciones utilizadas es igual o superior a 90%.
La polilisina en forma de bromhidrato (masa
molecular media 40 000; grado de polimerización medio 190) (1g en
200 ml de H_{2}O) proveniente de Bachem Feinchemikalien
(Budendorf, Suiza) es inicialmente pasada en una columna
intercambiadora de aniones (Dowex 2 x 8, forma OH-; 35 x 2,5 cm) con
el objetivo de extraer el bromuro que es tóxico para las células. La
solución de polilisina es neutralizada con una solución de ácido
p-toluensulfónico al 10% en agua y a continuación
liofilizada.
La polilisina p-toluensulfonato (50 mg;
0,91 \mumol) es disuelta en 2 ml de DMSO y puesta a reaccionar a
20ºC durante 12 h con el éster N-hidroxisuccinimida
del
4-carbonil-\alpha-metil-\alpha-(2-piridinilditio)tolueno
(SMPT, Pierce, USA) (5,3 mg; 13,6\mumol). El polímero
(MPT-pLK) es precipitado adicionando 10 volúmenes de
isopropanol. Después de centrifugación (1800g x 15 minutos), el
culote es lavado con isopropanol y recuperado tras una nueva
centrifugación. El culote es tomado de nuevo en agua destilada y la
solución es liofilizada. El número medio de moléculas MPT enlazadas
por molécula de polilisina es determinado por absorbancia a 343 nm
de la piridina tiona (\varepsilon= 8080 M^{-1} x cm^{-1})
liberada por reducción cuantitativa del enlace disulfuro con ayuda
de (TCEP): el número medio de MPT
es 10.
es 10.
La polilisina en forma de
p-toluensulfonato sustituida por 10 residuos MPT(50
mg; 0,96 \mumol) disuelta en 3 ml de DMSO (dimetilsulfóxido) en
presencia de diisopropiletilamina (42 \mul; 288 \mumol), es
puesta a reaccionar durante 24 horas a 20ºC con 32 mg de
(Boc)His(Boc)-OH (80 \mumol) en
presencia de 43 mg de hexafluorofosfato de benzotriazol
N-oxitrisdimetilaminofosfonio (BOP) (97 \mumol).
Los residuos histidilo son a continuación desprotegidos en presencia
de 20 ml de una solución de ácido trifluoroacético (TFA) al 50%
durante 48 horas a 20ºC. El agua y el TFA son eliminados por
evaporación a presión reducida. El polímero es precipitado
adicionando 10 volúmenes de isopropanol. Tras una centrifugación
(1800 g x 15 minutos), el culote es lavado con isopropanol y
recuperado tras una nueva centrifugación. El culote es tomado de
nuevo en agua destilada y la solución es a continuación liofilizada.
El número x de residuos histidilo fijados por molécula de
polilisina, determinado por RMN del protón es 60.
El péptido ANP (CYSLRRSSAFGGRIDRIGAQSA) que tiene
su cisteina en posición N-terminal protegida en
forma de tiopiridinilo (7,5 mg; 2 \mumol) es puesto a reaccionar a
20ºC durante 15 minutos con TCEP (0,7 mg; 2 \mumol) en 1 ml de
tampón 0,1 M Na Cl, 0,1 M tris/HCl pH 7,6.
La polilisina parcialmente histidilada
sustituida por 10 moléculas de MPT (MPT_{10-},
His_{70}pLK) (10 mg; 0,2 \mumol) en 1 ml de tampón 0,1 M Nacl,
0,1 M tris/HCl pH 7,6 es puesta a reaccionar a 20ºC durante 24 horas
con 7,5 mg (2 \mumol) de péptido ANP de la que la cisteina ha
sido reducida. El polímero (ANP-S-,
His_{70}-pLK) es precipitado adicionando 10
volúmenes de isopropanol. Tras una centrifugación (1 800 g x 15
minutos), el culote es lavado con isopropanol y recuperado tras una
nueva centrifugación. El culote es tomado de nuevo en agua destilada
y la solución es liofilizada. El número medio de moléculas de
péptido ANP fijadas por molécula de polímero es determinado por el
análisis de los ácidos aminados del polímero por cromatografía a
lata presión (HPLC) con una columna C_{18} (Supelcosil
LC-18-DB, Supelco, Bellefonte, PA,
USA) en fase inversa, después de hidrólisis del polímero en HCl 5,6
N a 105ºC durante 72 horas y transformación de los ácidos aminados
en derivados feniltiohidantoina (PTH-aa). El número
medio de ANP por molécula de polímero es 8.
La polilisina sustituida por 60 residuos
histidilos (15 mg; 0,28 \mumol) disuelta en 1 ml de DMSO en
presencia de DIEA (4 \mul; 28 \mumol) es puesta a reaccionar
durante 7 horas a 20ºC con el éster
N-hidroxisuccinimida del
6-(biotinamido) hexanoato (NHS-LC-biotina, Pierce, USA). El polímero es precipitado adicionando 10 volúmenes de isopropanol. El precipitado es recuperado después de centrifugación (1800 g, 15 min) y lavado en isopropanol y a continuación disuelto en agua y liofilizado.
6-(biotinamido) hexanoato (NHS-LC-biotina, Pierce, USA). El polímero es precipitado adicionando 10 volúmenes de isopropanol. El precipitado es recuperado después de centrifugación (1800 g, 15 min) y lavado en isopropanol y a continuación disuelto en agua y liofilizado.
Claims (24)
1. Complejo entre al menos un ácido nucleico
(cargado negativamente) y al menos un conjugado polimérico cargado
positivamente, siendo la unión entre el ácido nucleico y el
conjugado polimérico de naturaleza electroestática, el conjugado
polimérico contiene un polímero formado por unas unidades
monoméricas que llevan unas funciones NH_{3}^{+} libres, y
siendo tal que:
- -
- las funciones NH_{3}^{+} libres de las arriba mencionadas unidades monoméricas son sustituidas en una proproción de al menos 10%, por unos residuos protonizables en un medio cuyo pH es inferior al del plasma o del suero, provocando dichos residuos, en un medio cuyo pH es inferior al del plasma o del suero, una desestabilización de las membranas celulares,
- -
- los arriba mencionados residuos poseen además las siguientes propiedades:
- \bullet
- comprenden un grupo funcional que les permite ser fijados al arriba mencionado polímero,
- \bullet
- no son activos como señal de reconocimiento reconocida por un receptor de membrana celular,
- \bullet
- pertenecen a la familia de unos compuestos que comprenden un núcleo imidazol,
- \bullet
- pertenecen a la familia de las quinolinas,
- \bullet
- pertenecen a la familia de las pterinas,
- \bullet
- pertenecen a la familia de las piridinas.
a condición de que el conjunto de las funciones
NH_{3}^{+}libres sea al menos el 30% del número de unidades
monoméricas del esqueleto polimérico del arriba mencionado conjugado
polimérico,
y a condición de que el conjugado polimérico sea
diferente del conjugado
polilisina-(ditiopiridil)propionato.
2. Complejo según la reivindicación 1, en el que
los residuos protonizables en un medio cuyo pH es inferior al del
plasma o del suero comprenden al menos una función NH_{3}^{+}
libre.
3. Complejo según la reivindicación 1 ó 2, en el
que unas moléculas que constituyen una señal de reconocimiento
reconocida por un receptor de membrana celular están presentes:
- \bullet
- o bien por sustitución de algunas de las funciones NH_{3}^{+} libres, de las unidades monoméricas,
- \bullet
- o bien en algunos de los residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares,
- \bullet
- o bien por sustitución de la función NH_{3}^{+} libre de los residuos que provocan una desestabilización de las membranas celulares.
4. Complejo según la reivindicación 1 a 3,
caracterizado porque las funciones NH_{3}^{+} libres de
las unidades monoméricas están sustituidas en una proporción de
aproximadamente 15% a aproximadamente 45%.
5. Complejo según una de las reivindicaciones 1 a
4, en el que los residuos protonizables en un medio cuyo pH es
inferior al del plasma o del suero son unas bases cuyo pK en medio
acuoso es inferior a 8, de tal forma que una proporción superior al
50% de estas bases unida a un polímero catiónico no sea protonizada
en medio neutro de un pH de 7,4.
6. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que los residuos, protonizables en un
medio cuyo pH es inferior al del plasma o del suero, que provocan
una desestabilización de las membranas celulares se escogen
entre:
- la histidina, el 4-carboximetil-imidazol, la 3-(1-metil-imidazol-4il)-alanina, la 3-(3-metil-imidazol-4il)-alanina, el 2-carboxi-imidazol, la histamina, el ácido 3-(imidazol-4il)-L-láctico, la 2-(1-metil-imidazol-4il)etilamina, la 2(3-metil-imidazol-4il)etilamina, la \beta-alanil-histidina-(carnosina), la 7-cloro-4(amino1-metilbutilamino)-quinolina, la N^{4}-(7-cloro-4-quinolinil)-1,4-pentanodiamina, la 8-(4-amino-1-metilbutilamino)-6-metoxi-quinolina (primaquina), la N^{4}-(6-metoxi-8-quinolil)1,4-pentanodiamina, el ácido quinínico, el ácido quinolincarboxílico, el ácido pteroico, el ácido nicotínico, el ácido quinolínico.
7. Complejo según una de las reivindicaciones 1 a
6, caracterizado porque las funciones NH_{3}^{+} llevadas
por las unidades monoméricas son unos residuos de lisina o de
omitina, y porque:
- -
- las funciones NH_{3}^{+} libres restantes de los arriba mencionados monómeros son también sustituidas a razón de aproximadamente 1% a aproximadamente 60% por una molécula que constituye una señal de reconocimiento reconocida por un receptor de membrana celular, teniendo esta señal de reconocimiento una masa molecular inferior a 5000, a condición de que el conjunto de las funciones NH_{3}^{+} libres sea al menos 30% del número de unidades monoméricas del esqueleto polimérico del arriba mencionado conjugado polimérico.
8. Complejo según una de las reivindicaciones 1 a
5, en el que el polímero contiene un grupo polimérico con la
siguiente fórmula (I):
en la
que
- -
- p es un número entero que varía de 15 a 900
- -
- n es un número entero que varía de 1 a 6,
- -
- este grupo polimérico contiene unos radicales R entre los que:
- \bullet
- 10% a 45% de número de radicales R representan un residuo que comprende un núcleo imidazol
- \bullet
- 10% a 90% del numero de radicales R representan los ^{-}\omega-amino NH_{3}^{+} libres.
9. Complejo según la reivindicación 8,
caracterizado porque R está representado por la fórmula:
10. Complejo según la reivindicación 8 ó 9, en el
que 10% a 90% del número de radicales R, que representan los
^{-}\omega-amino NH_{3}^{+} libres, está
sustituido a razón de 0 a 50% por una molécula que constituye una
señal de reconocimiento.
11. Complejo según la reivindicación 8 a 10, en
el que el polímero comprende un grupo polimérico con la siguiente
fórmula (II):
en la
que:
- -
- p tiene las significaciones indicadas en la reivindicación 8,
- -
- 10% a 45% del número de radicales R representan un residuo que contiene un núcleo imidazol.
12. Complejo según la reivindicación 11,
caracterizado porque el resto de radicales R, es decir del
30% al 90% del número de radicales R, representan unos
^{-}\omega-amino NH_{3}^{+}.
13. Complejo según la reivindicación 12,
caracterizado porque de 0% al 45% de los radicales R están
sustituidos por una molécula que constituye una señal de
reconocimiento reconocida por un receptor de membrana celular.
14. Complejo según una de las reivindicaciones 1
a 6, caracterizado porque la señal de reconocimiento es
escogida entre:
- A)
- unos ósidos simple o complejos reconocidos por unas lectinas de membrana, y escogidos entre:
- a.
- Asialo-oligósido del tipo triantenado lactosamina: receptor de la asialoglicoproteina
- b.
- Asialo oligósido del tipo lactosamina tetrantenado: receptor de la asialoglicoproteina
- c.
- Lewis x:
- d.
- Lewis x sialil: LECAM 3/2
- e.
- Derivados de Lexis x sulfatado (HNK1):
- f.
- Oligomannósido: receptor de la mannosa
- g.
- Oligomannósido fosforilado: receptor de la mannosa 6 fosfato
- h.
- Oligomanósido de tipo lactosamina sulfatada: receptor de GalNac4 sulfatado
- B)
- unos péptidos
- a)
- péptidos antiinflamatorios o algunos de sus fragmentos reconocidos por unos receptores de la pared vascular,
- b)
- péptidos ligandos de unas integrinas,
- c)
- factores quimiotácticos,
- d)
- hormonas peptídicas
- C)
- metabolitos naturales.
15. Complejo según una de las reivindicaciones 1
a 7, caracterizado porque el ácido nucleico es escogido
entre:
- a)
- unos genes marcadores
- b)
- unos genes con finalidades terapéuticas
- c)
- unos genes para unas vacunas.
16. Complejo según la reivindicación 15,
caracterizado porque los genes marcadores son escogidos
entre: los genes que contienen la luciferasa, la proteina verde de
la medusa Aequorea victoria, los genes que contienen la
\beta-galactosidasa, los genes que contienen la
cloramfenicol-acetil transferasa y los genes que
confieren la resistencia a un antibiótico.
17. Complejo según la reivindicación 15,
caracterizado porque los genes con finalidades terapéuticas
son escogidos entre:
- -
- receptores de las lipoproteinas de baja densidad, deficiente en el caso de hipercolesterolemia,
- -
- factores de coagulación: factores VIII y IX,
- -
- fenilalanina-hidroxilasa (fenilcetonuria),
- -
- adenosindesaminasa (inmunodeficiencia ADA),
- -
- enzimas lisosómicas, tales como la \beta-glucosidasa en el caso de la enfermedad de Gaucher,
- -
- distrofina y minidistrofina (miopatía),
- -
- tirosina hidroxilasa (Parkinson),
- -
- factores de crecimiento de las neuronas (Alzheimer),
- -
- CFTR cystic-fibrosis transmembrane conductance regulator (mucoviscidiosis),
- -
- alfal-antitripsina,
- -
- citoquinas (interleucinas, TNF factor de necrosis de los tumores),
- -
- timidinquinasa del virus Herpes simplex,
- -
- proteínas del MHC, sistema mayor de histocompatibilidad, en particular los HLA-B7,
- -
- citosina desaminasa,
- -
- genes codificantes para unos ARN sentido y antisentido,
- -
- genes codificantes para unas ribozimas.
18. Complejo según la reivindicación 15,
caracterizado porque los genes para las vacunas son escogidos
entre los genes codificantes para unos antígenos virales
(vacunación).
19. Complejo según una de las reivindicaciones 1
a 10, en el que:
- -
- el polímero es la polilisina y presenta un grado de polimerización de aproximadamente 15 a aproximadamente 900,
- -
- las funciones NH_{3}^{+} libres de los elementos lisina son sustituidas en una proporción del 35% por unos residuos histidilo,
- -
- el ácido nucleico presenta una masa molecular de aproximadamente 10^{6} a aproximadamente 10^{8},
- -
- la relación entre el número medio de pares de bases del ácido nucleico por molécula de elemento de lisina es de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 6.
20. Utilización de un complejo, según una de las
reivindicaciones 1 a 19, para la preparación de un medicamento
destinado a la transfección in vitro, ex vivo o in
vivo de células con ayuda de un gen, en particular los definidos
en la reivindicación 17 ó 18.
21. Utilización de un complejo según la
reivindicación 19, caracterizado porque las células son
escogidas entre:
- -
- unas células cepa hematopoyéticas;
- -
- unas células dendríticas;
- -
- células del hígado;
- -
- células de los músculos esqueléticos;
- -
- células de la piel:
- \bullet
- fibroblastos
- \bullet
- queratinocitos,
- \bullet
- células dendítricas,
- \bullet
- melanocitos,
- -
- células de las paredes vasculares;
- \bullet
- endoteliales
- \bullet
- musculares lisas;
- -
- células epitéliales de las vías aéreas;
- -
- células del sistema nervioso central;
- -
- células cancerosas;
- -
- células del sistema inmunitario.
22. Procedimiento de transfección in vitro
o ex vivo, caracterizado porque se pone en presencia
un complejo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en
un medio que contiene unas células a transfectar, en unas
condiciones tales que hay:
- -
- paso del complejo desde el medio al citoplasma de las células,
- -
- relargado del ácido nucleico implicado en el arriba mencionado complejo en el citosol y/o el núcleo de las células,
- -
- expresión de la proteína que corresponde al gen transfectado.
23. Composición farmacéutica,
caracterizada porque comprende como sustancia activa, uno al
menos de los complejos según una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 19, en asociación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
24. Utilización de un complejo según una de las
reivindicaciones 1 a 19, para la preparación de un medicamento
destinado por ejemplo al tratamiento de la deficiencia metabólica
congénita o adquirida, o al tratamiento de tumores, o para la
preparación de una vacuna, por ejemplo la vacuna contra la
gripe.
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